Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние производных имидолаза на состояние клеточных мембран в условиях воздействия серосодержащих соединений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние производных имидолаза на состояние клеточных мембран в условиях воздействия серосодержащих соединений"

шшстщугво здравоохранения и медицинской промшленности

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИМ ХИМИКО-ФАВШШВТЙЧЕСКШ ИНСТИТУТ

ОА

На правах рукописи

Кузнецова Ольга Алексеевна

влияние производных имидазола на состояние

клеточных мембран в условиях воздействия серосодержащих соединении

03.00.04 - биохимия

УЦ^1

ДВТОРЕОЕРАТ \

диссертации яз соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург 1996

Работа выполнена на кафедре биохимии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И. И. Мечникова (ректор - д.м.н., профессор А.В.Шабров).

Научный руководитель:

доктор химических наук

профессор ' В. А. ДАДАЛИ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Е. Е. ДУБИНИНА

профессор

кандидат биологических наук Н. Н. ЯЫБИНА

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский институт токсикологии МЗМП РФ, лаборатория биохимической фармакологии.

на заседании специализированного совета К 084.63.01 при СПХФИ (197376, Санкт-Петербург, ул. пр. Попова, 14)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке СПХШ.

Защита состоится

\АЛ(Шл1 Х996г. в часов

Автореферат разослан « ¡¡М» Х^дАх 1996г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Антропогенно химическое загрязнение окружающей среды является одним из наиболее опасных повреждающих факторов, приводящих при хронических воздействиях на организм к глубока нарушениям обмена веществ, что лежит в основе возникновения многочисленных заболеваний. В связи с этим поиск путей фармакологической защиты организма от повреждающего действия токсикантов, особенно в условиях производства, является актуальной проблемой.

Из широкого круга синтетических фармакологически активных соединений особого внимания заслуживают производные имидазола в связи с их структурным сходством с Физиологически активными компонентами организма и в соответствии с этил низкой токсичностью и отсутствием побочного действия. Более того, среди производных имидазола тлеются официнальные препараты, обладающие адаптогенными свойствами, например, дибазол (ДБ) и др. Однако эти вещества не были изучены и не применяются как превентивная фармакологическая защита от действия токсикантов.

Изучение производных имдазола с этой точки зрения представляется заслуживающим серьезного внимания. Одним из важных компонентов защитного, а в более широком плане адаптогенного действия этих соединений является мембранопротекторный эффект, обеспечивающий стабилизацию клеточных мембран и мембранозависи-мых процессов.

Большинство имеющихся на сегодняшний день методов оценки состояния мембран дает информацию о мембране в целом, тогда как структурные изменения при ее функционировании происходят, нередко, только на отдельных, активных участках. Изучение этих аспектов требует применения.более тонких и более специфичных методов исследования, таких как хемилюминесценция (ХЛ) лишдов и изучение состояния мембран с помощью химических зондов, что позволяет определить ряд функциональных характеристик мембран и оценить их состояние на ранних стадиях повреждения.

Эффекты имидазолов были изучены на интактных мембранах и на модели токсического действия ароматических тиолов в опытах In vivo и In vitro. Известно, что SH-содержащие соединения играют исключительно вакную роль в функционировании клетки и её защите от токсического действия. Эти соединения, включающие глутатион,

цистеин, SH-гругаш белков, являются тиолами алифатического ряда не обладающими токсически?,га свойствами. Ароматические же тиолы и соответствующие им дисульфиды высокотоксичны. Однако механизм их токсического действия и мишени изучены недостаточно, в силу чего исследование биохимических механизмов действия этих соединений представляет самостоятельный интерес.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось получение данных о влиянии даидазолсодерхащих соединений на состояние клеточных мембран в условиях интактного организма и при воздействии токсических серусодержащих соединений на примере ароматических тиолов в опытах In vitro и In vivo.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование состояния свободно-радикального окисления (СРО) липидов мембран эритроцитов и микросом печени крыс при воздействии производных ищцазола.

2. Исследование физико-химических свойств мембран эритроцитов и микросом печени крыс с использованием флюоресцентных зондов при воздействии производных имидазола.

3. Исследование активности АТФазы и функции ¡з-адренорецепто-ров эритроцитов при воздействии производных имидазола.

4. Исследование состояния СРО липидов мембран эритроцитов и . микросом печени крыс при воздействии ароматических тиолов.

5. Исследование,физико-химических свойств мембраны с использованием флюоресцентных зондов при воздействии ароматических тиолов.

6. Исследование активности АТФазы и функции /?-адренорецеп'ю-ров эритроцитов,.при воздействии ароматических тиолов.

7. Изучение" возможности коррекции имидазолсодержащими соединениями состояния мембран эритроцитов и.микросом печени крыс в условиях'токсического воздействия ароматических тиолов.

Научная новизна. Впервые получены данные о действии ароматических тиосоединений и производных имидазола на физико-химические свойства интактных мембран, функцию гз-адренорецепторов и активность АТФазы эритроцитов с использованием мембранных зон-'дов и методом ХЛ.

Впервые установлено защитное действие производных имидазола, в том числе препаратов ДБ и этимизол ОТ), и изучен механизм коррекции состояния мембран и мембранозависимых белков и фер-

ме тов, в условиях токсического действия ароматических тиолоя.

Практическая значимость. В целях предотвращения повревдаадего действия токсических ароматических тколов и дисульфидов на мембранный аппарат'эритроцитов, эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и мембранных белков целесообразно использовать имидазол-содержащие соединения.

Лекарственные препараты ДБ и ЭТ являются перспективными профилактическими средствами, предупреждающей повреждающий эффект токсических серусодержащих соединений.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Влияние ароматических тиолов и дисульфидов на состояние липидного бислоя мембран эритроцитов и микросом печени крыс и функцию мембранозависимых ферментов и белков (Ма+,К+-АТФаза, Р-адренорецепторы).

2. Влияние имидазолсодержащих соединений на состояние липидного бислоя мембран эритроцитов и микросом печени крыс и функцию мембранозависимых ферментов и белков (На+,К+-АТФаза, гэ-адренорецепторы).

3. Механизмы защитного действия имидазолсодержащих соединений на состояние клеточных мембран эритроцитов и мыросом печени крыс и функцию мембранозависимых ферментов и белков (Ка+,К+-АТФаза, ^-адренорецепторы).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

- б-м Всесоюзном биохимическом съезде (С.-Петербург,1992);

- российской научной конференции "Биоэчтиоксидант" (Москва, 1993);

- итоговой научно-исследовательской конференции академии "Актуальные вопросы профилактической и клинической медицины" (С.Петербург, 1994);

-II Международном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва,1995);

По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и объеы диссертации. Диссертация состоит из введе • ния, обзора литературы, 2 глав, содержащих материалы собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 170 источников, в том числе 48 на иностранном языке. Диссертация изложена на 156 страницах маши-

нописного текста. Иллюстрирована 8 рисунками и 33 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ РАБОТЫ

С учетом цели настоящей работы экспериментальные исследования проводились но трем направлениям:

- исследование влияния имидазолсодержащих соединений на состояние клеточках мембран в условиях интакткого организма;

- исследование токсического действия ароматических тиолов на состояние клеточных мембран макросом, печени и эритроцитов;

- изучение возможности коррекции производными имидазола токсического действия ароматических тиолов;

Со стожке мембраг оценивали по интенсивности свобсдао-радикального и перекисюго окисления липидов (CP и ПОЛ), изменению их физико-химических свойств методом флюоресцентного зондирования и функции мембранозависимых белков (/»-адренорецепто-. ры) и ферментов' (К,Ка-АТФаза).

Рао_та выполнена на белых беспородных крысау-самцчх и крысах линии Бастар в опытах In vitro и in vivo. Исследовали микротомы, полученные дифференциальным центрифугированием гомогенатов печени крыс по классической схеме и тени эритроцитов, полученные с помощью гшюосмотического гемолиза клеток по методу Dodge and al.(1984).

Изучение действияПроизводных имидазола на состояние клеточных мембран проводили в экспериментах с использованием' мономерных и полимерных соединений:

- мономерные соединения: фармакопейные препараты - дибазол (ДБ), этимизол (ЭТ) и синтезированные - 2-(3'хлорфенил)бенз~, имвдазол (Т-4), 2-(3'хлорфенил)-1-(3'диэтилаьашогщроксицропил) -бензимидазол (Т-5). 2,3-диметилбензимидазол (БИ), 2-(3' хлор-фенил)-!- З'морфолингидроксипропил) бензимидазол (д-1);

-полимерные соединения на основе N-вишшшрролидона: -имида-зол (ЕШ). -бензимидазол (ПВБИ), содержание сополимеры.

In vivo эксперименты проводили по нескольким схемам. Первая основывалась на ежедневном введении крысам в течение трех суток внутрижелудочно зондом веществ в дозе 80 мг/кг веса в сутки. Через 48 час после последнего введения ткани животных брали на исследование. Вторая схема - интермиттирующая - основывалась на длительном введении per os малых доз веществ (I мкМ) в течение 28 дней по.схеме: 7 дней - дача препаратов*"7 дней - перерыв. В

двух других была изучена возможность коррекции токсического действия тиофенола (ТФ) в подостром и остром экспериментах. Животные были разделены на несколько групп. В подостром эксперименте: I группа - интактные; 2 группа - получали только ТФ в течение 12 дней в дозе 4 мг/кг (»/эо 1D,0) ежедневно, 3 - получали только ЭТ также в течение 12 дней в дозе 20 мг/кг веса; 4 группа - ТФ в дозе 4 мг/кг через 4 часа после введения соответствующей концентрации ЭТ. В остром эксперименте: I группа -интактные: 2 группа получала только ТФ в дозе 200 мг/кг (1D„0.) однократно за 24 часа до проведения исследования: 3 и 4 группы получзли только ЭТ и ДБ в дозе 80 мг/кг ежедневно в течение трех дней, отбор биологического материала на исследование на 5 день через 48 часов после последнего введения препарата; 5 и 6 группам вводили ЭТ и ДБ в таких же дозах в течение Зх дней, на четвертый день, через 24 часа после последнего введения имида-золов, животные получали ТФ (200 мг/кг); забой на 5 день, через 24 часа после введение. ТФ.

In vitro действие ароматических тиолов на мембраны исследовали на примере дифенилди-ульфида (ДФДО) после 15 мин, I часа и 2х часов инкубации при 37°С и на фоне предварительного 16 мин воздействия препаратов имидазола. Действие ДФДС исследовано в концетрациях 25, 50 и 100 мкМ, производных имидазола - в концентрации Ю^-Ю'^М.

Измерение интенсивности CP и ПОЛ проводили путем регистрации параметров кинетической кривой индуцированной ХЛ в плазме крови, модельной суспензии липосом, тенях эритроцитов и по накоплению малонового диальдегида (MEA). Регистрацию ХЛ осуществляли на Сиохемилюминометре БХЛ-06 (НИЦ "Биоавтоматика", г.Н.Новгород). В качестве индуктора применялась система Фентона.Интенсивность процесса оценивали по максимальному значению интенсивности ХЛ (ImaJ) и показателю светосуммы медленной вспышки ХЛ (S).

Микровязкость определяли по степени эксимеризации зонда пире-на (1э/1м) на спектрофлюориметре "Schlmadzu" и спектрофотометре "Specord М-40", возбуждая флюоресценцию при 336 нм. Для расчета 1э/1м использовали высоту пиков с максимумами 470 и 395 нм соответственно. Оценку связывания'зонда АНСГс мембранами проводили по изменению константы связывания (Ко) и концентрации мест

связывания зонда (N), определенных путем титрования при 480 нм, длина волны возбуждения 366 ил, на флгоориметре "Квант-7" (НПО "Химавтоматика", г.Барнаул). Полученные данные рассчитывали в координатах Скэтчарда, выражая их б двойных обратных величинах.

Функцию |7-адренорецепторов оценивали по изменению констант связывания (Кс), концентрации мест связывания (N) и концентрации связанного пропранолола (R) с суспензией эритроцитов, определяемых регистрацией флуоресценции на "Specord. М-40" с флюори-метрнчёской приставкой при длине волны возбуждения 327 нм и испускания 360 нм методом И.Э.Калниня (1990).

Активность общей АТФазы эритроцитов определяли по приросту неорганического фосфора (Elble К.,1969), а активность уабаин-чувствительнсй Ка,К-АТФазы рассчитывали по разнице между активностью АТФазы, в присутствия (уабаинрезистентная фракция) и в • отсутствие (общая) 100 мкМ уабаина. Активность фермента выражали в мкг Р1/мг белка/час.

Белок в пробах определяли по.методу Lowry О.Н.(1951).

Статистическую обработку данных проводили по методу Стьюдента с использованием программы Statgraph на компьютере 1БМ PC/XT-.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все исследованные имидазолсодеркащие соединения в концентрации 10 мкМ обладают выражения ингибирукшм действием на развитие сзободнорадикального процесса, индуцированного в модели липосом. Тормозящий эффект, регистрируемый в модельной суспензии липосом по максимальной интенсивности медленной вспышки ЗСЛ (1иах), составил для соединений Т-4 - 95%, БК - 77%, т-5 - 56%, ИМ - 45%, ЭТ - 32S, ДБ - 22%. При увеличении концентрации в 2 раза (20 мкМ) антиоксидантная активность (АОА) всех изученных соединений существенно снижалась (наиболее вкраженно для ДБ и' ИМ), однако дальнейшее увеличение концентрации до 200 мкМ вызвало нарастание антиоксидантного действия. При этой концентрации соединения Т-4, Т-5 и БИ .практически полностью препятствовали развитию СРО липидов, для КМ и ДБ ингибирование составило по величине Imax -75%, ЭТ - 49% (Рис.1). Таким образом, АОА производных имидазола в исследованной модели характеризуется повышением активности при концентрациях 10 и 200 мкМ и понижением при 20 мкМ.

Исследование действия этих соединений на интенсивность ХЛ

плазмы крови в опытах In vitro показало, что производные имидазола в плазме оказываются менее эффективными в отношении торможения свободнорадикальных процессов. Более того, в концентрации 100 мкМ все исследованные соединения оказывали прооксидантное действие. В концентрации 200 мкМ - прооксидантное действие сохраняется у имидазола, БИ, Т-4; все остальные соединения эффекта вообще не оказывали. Однако дальнейшее увеличение концентрации веществ до 500 ккМ привело к появлению АОА. Ингибируюадай эффект ЭТ по Imax составил 42«, Т-4 - 37$, ДБ - 40», БИ - Т8Ж.

Изучение антиоксидантной активности имидазолов в опытах In vivo показало, что мономерные производные, за исключением Т-5, и полимер ПВИ практически не влияют на процессы СРО в плазме крови при длительном введении малых доз (Т-5 на 28 день введения снижал интенсивность образования МДА на 21», ПВБИ - на 22%). ЭТ при введении по интермиттируюцей схеме не оказывал влияния на процессы СРО плазмы крови. Однако елодневное введение препарата в дозе 2D мг/кг в течение 12 дней оказывало выраженное прооксидантное действие. Мы полагаем, что этот факт следует учитывать при лечебном применении препарата. Для сравнения отметим значительный (44%) антиоксидантный эффсст ЭТ в микросомах печени.

Более выраженное действие все исследованные соединения при различных режимах введения оказыгали на состояние антиоксидантной системы микросомальных мембран печени. Полимерные производ-Inax

(Ж)

too

100

24

г1 А П

2S

Л

Конт- Т-4 Т-5 БИ ИУ ЭТ ДБ роль

Рис.1. АОА соединений имидазола в концентрации 200мкМ по изменению показателеВ ХЛ, индуцированной в модели липосом в X остаточной интенсивности ХЛ

ные были более эффективны при длительном введении (антиокси-дантный эффект на 28 день введения для ПВБИ - 665', ПБИ - 60%. а ЭТ - 50S>, Т-5 - 28%, ДБ - 25%), мономерные - при кратковременном. Так, при трехкратном введете: з дозе 80 мг/кг анткокси-дантное действие ДБ составило -- 73%. ЭТ - 505, а ПВБИ - 21%, ПВИ - 145.

После трех дней введокия в дозе 80 мг/кг веса у ЭТ и ДБ отмечался выраженный антиоксидантный эффект в эритроцитарных мембранах, прием у ДБ более сильный (остаточная интенсивность ХЛ по.величине Imax у ДБ составила 28% от контроля, у ЭТ - 59%).

В целом можно отметить, что при длительном введении малых доз наиболее эф^ктивнами в плазме крови оказались соединения ПЗБИ и Т-5, в микросомалышх мембранах - ПВБИ и ПБИ. При кратковременном введении - препараты ДБ и ЭТ.

Снижение антиоксидантного эффекта производных имидззола в плазме крови4 вероятно, обусловлено связыванием имидазолов с альбуминами и другая белками плазчы крови, а такх», возможно, с липопротекнами. В опытах ln vltro с плазмой крови ентиокси-•дантное действие имидазолов, по сравнению с липосомами, проявлялось лишь при концентрации в 10-15 раз более высокой.

В экспериментах ln vivo, имидазолы как антиоксидзнты были более эффективны при кратковременном введении больших доз (80 мг/кг в т&ч&ие трех дней), чем при длительном введении малых доз (20 mi'/кг в течение 12 дней). Имидазолы в плазме крови ln vivo были такке менее эффективны, чем в мпкросомгх печени крыс.

Исследование АТФазной активности эритроцитов при действии -имидазолов, показало активацию фермента при низких концентрациях имидазолоз и интибирование при высоких концентрациях. Изменение активности фермента обнаружило отрицательную корреляцию с микровязкостыо мембраны эритроцитов, найденную по степени эксимеризации гшрена (Рис.2). Тшпл образом, возрастание "структурной жесткости" белкового окружения под влиянием имида-золсодеркадих 'соединений, может затруднять хонформацаонную подвижность молекул АТФазы, препятствуя ее функционированию.

Помимо этого снижение активности эритроцитарной АТФазы под влияньем имидазслсодержащих соединений может бнть связано, по крайней мере б случае более основных кмидазолов (ИМ. ДБ), с нейтрализацией электрического заряда фосфзтидилсерина и

15(М)

Рис.2 Изменение активности АТФазы эритроцитов на фоне изменения микрозязкости мембран под действием КМ (по оси абсцисс-^ молящих концентраций Им, по оси отданат-активность фермента и микровязкость мембран в % к контролю)

♦ — * - активность АТФазы х — х - микровязкость мембран

других анионных фэсфолипвдов, которые является аллостерическими эффекторами фермента, а фосфатщщлсерин рассматривается в качестве кофактора АТФазы.

Раздельное исследование уабаинчувствительной и уабаинрезис-тентной форм АТФазы обнаружило различный характер влияния ими-дазолов к активность фермента.

Интересно отметить, что в случае дибазола (In vitro и In vivo) и соединения Д-I (In vivo), у которых степень ингибирования уабаинчувствительной АТФазы была наибольшей по сравнению с другими шедазолсодержащими соединениями, происходит активация уабаинрезистентной АТФазы. Поскольку увеличение активности уабаинрезистентной АТФазы отмечено как в экспериментах In vivo, так и In vitro, можно исключить вереи» индукции имидазолами синтеза' различных изоформ АТФазы.

Исследование функции fl-адренорецепторов суспензии эритроцитов показало, что связывание пропранолола с эритроцитами, после

воздействия ЭТ и ДБ (100 мкМ), характеризуется снижением констант связывания (Кв), повыпением концентрации связанного про-пранолола (R) и увеличением концентрации мест связывания (N).

Таким образом, ЭТ и ДБ в исследованной концентрации вызывают повышение чувствительности /з-адренорецепторов к антагонисту пропранололу.

Изучение защитного действия иыидазолрв проводилось в условиях токсического повреждения мембран, вызванных ТФ и ДФДС. В опытах ln vivo показано, что ТФ как в остром, так и в подостром опыте увеличивал интенсивность СРО. В мембранах эритроцитов проокси-дантный эффект ТФ бал более выражен, чем в плазме крови и »лик- ■ росомах печени крыс. В остром эксперименте ТФ увеличивал Imax в 2,5 раз, концентраций МДА в плазме крови - в 1,6 раз, в микросомах - в 1,3 раза, подостром опыте ТФ увеличивал Imax теней эритроцитов в 1,3 раза. Концентрация 1Щ в плазме крови практически не изменялась. Действие ТФ на микросомы печени проявлялось по-разному. В остром опыте ТФ обладал явно выраженным про-оксидантным эффектом. В подостром опыте в ответ на длительное введение ТФ в малых дозах, наблюдалось снижение интенсивности СРО даже ниже уровня контроля. Этот, на первый взгляд неожиданный эффект, по-видимому, связан с тем, что при воздействии в течение достаточно длительного времени малых доз адаптивно активировалась физиологическая система антирадикалькой и антипе-рекисной задты. Следует отметить, что и на другие системы ТФ при длительном воздействии.оказал меньший прооксидантный эффект, чем цри однократном в дозе ID00.

Сравнение прооксидантного действия ТФ в остром и подостром скитах свидетельствует о том, что антиоксидантный комплекс плазмы и макросом оказывает более существенную защиту, чем антиоксидантный комплекс мембран эритроцитов. Как при длительном введении малых доз ТФ,так и при однократном введении большой дозы, интенсивность СРО плазмы -крови остается приблизительно на одном уровне.

Таким образом, полученные данные показывают, что ТФ при длительном воздействии в мглой дозе оказал меньший прооксидантный эффект, чем при кратковременном воздействии в дозе ID^.

ЭТ и ДБ цри Зх-дневном предварительном введении оказывали антиоксидантный эффект (Рис.3). ЭТ предотвратил развитие СРО в мембранах эритроцитор - величины Imax и S ниже уровня контроля.

при этом значения Imax и S, по сравнению с действием одного ТФ снизились соответственно в 3,4 и в 2,7 раза, концентрация НДА в микросомах - в 3,5 раза. В плазме крови его действие было менее эффективным: при одновременном введении эт и ТФ произошло увеличение концентрации МДА в.плазме.

Защитное действие ЭТ и ДБ по отношению к ТФ различно. Эт как антиоксидант в эксперименте in viro, в отличие от экспериментов

1 2

1 2

1 2

Imax МДА МДА

мембран плазмы микро-эритрсцитоз сом

АТФаза

N

(АНСГ)

Рис.3 Токсическое действие тиофенола (200 мг/кг) и защитны® эффект этимизола (80 мг/кг) в остром эксперименте ln vivo:

I- тиофенол:

2 - ЭТ -тиофенол;

I тах - максимальная интенсивность медленной вспышки ХЛ; . Б - светосумма медленной вспышки ХЛ; АТФаза - активность АТФьзы эштроцитов: N - концентрация центров связывания зонда АНС в мембранах эритроцитов; Данные представлены в % к контролю.

1

на интактных мембранах, был эффективней, чем ДБ.

В подостром опыте защитный эффект ЭТ по отношению к Тф проявился только в мембранах эритроцитов, где величина S снизилась в 3,3 раза. Во всех остальных исследованных объектах совместное действие ЭТ и ТФ вызвало прооксидантный эффект. Обращает на себя внимание, что прооксидантный эффект совместного действия ЭТ и ТФ проявляется только в микросомах печени и плазме крови. В сьязи с тем, что производные имздазола являются индукторами микросомальной монооксигеназной системы, презде всего цитохрома Р-450, при функционировании которой продуцируется супероксид-анион, указанный выше эффект в микросомах может быть обусловлен этим процессом. Что же касается плазмы крови, то, вероятно, антиоксидантное действие низких доз имидазолоз ослабляется за счет их связывания с белками, прежде всего альбуминами плазмы ктови.

Выраженный прооксидантный эффект тиофенолов как таковых и на фоне протективного действия имидазолов приводит к изменению свойств мембран, что подтверждают данные по флюоресцентному зондированию мембран эритроцитов и макросом.

Исследование параметров связывания зонда АНС~ с мембранами показало достоверное снижение величины Ке при действии ТФ в мембранах эритроцитов (подострый опыт на 11%, острый - на 27%) и микросомах (подострый и острый опыт- на 30%). Концентрация центров связывания зонда (К) не изменялась, или изменялась незначительно (мембраны эритроцитов).

Добавление ДФДС в инкубационную среду во всех исследованных концентрациях вызвало резкое увеличение микровязкости как мембран эритроцитов, так и микросомалышх мембран, увеличиваясь с ростом концентрации и временем инкубвции 'Рис.4). Т#к, повышение микровязкости при 15 минутном воздёйствии ДФДО в концентрации 25 мкМ в эритроцитарных м юранах составило 35S, в микросомах - 42%; воздействие ДФДО в концентрации 100 мкМ в течение 2х часов вызвало изменение микровязкости на 60% в обеих исследованных мембранных фракциях.

Изменение, параметров связывания зонда АЖГ имело не столь выраженный характер. Воздействие ДФДС в концентрации 25 мкМ на ^рктроцитарные мембраны не вызвало достоверных изменений величин Кв и N в течение всего времени инкубации. В микросомах

л

5

%

о

юо

•п.

II

X II

*1 Н5

П

1£мин 1час 2часа 15мин г действия

~ДФДС

1час 2часа г действия ДФДС

Рис.4 Изменение степени эксимеризации (1э/1м) зонда пирена с

микросомами печени (А) и тенями эритроцитов (Б), предварительно

инкубированных с производит,и имидазола (ЮОмкМ) при воздействии ДФдС (ЮОмкМ) в опытах 1л уИго

Данные представлены в % к контролю.

I - ДФДС; 2 - ЭТ+ДФДС; 3 - ДБ+ДФДС; 4 - Г-5+ЬДС

же величина К снижалась на 30% уже после 15 минутного воздействия. Уменьшение величины N регистрировалось только после 2х часов инкубации с ДФДС.

Увеличение концентрата токсического агента привело к более выраженному изменению флуоресценции АНСГ. В микросомах наблюдали снижение как К , так и(1; в эритроцитах - только числа центров связывания (в среднем на 10 - 30%). Достоверных изменений константы связывания (К ) зонда в эритроцитах не обнаружено, отмечалась ляль некоторая тенденция к увеличению этого параметра.

Флюоресцентный зонд АНС- является чувствительным'индикатором перестроек, возникающих в клеточных мембранах. При взаимодействии с мембраной он локализуется на поверхности мембрана - водная среда. Снижение Кс зонда при действии тиофенола свидетельствует об уменьшении сродства зонда к мембране.Снижение интенсивности флюоресценции АНС" отражает уменьшение площади контакта зонда из-за уменьшения гидрофобности липидного бислоя, изменение заряда поверхностного слоя белок-липидных систем.

Кепосредствегагой причинеЯ таких изменений мембраны является

СТО мембранных липидов и белков. Пероксидация фосфолипидов приводит к образованию промежуточных продуктов, являющихся высокогидрофильными веществами, они эффективно разрыхляют бислой, увеличивая доступность гидрофобных доменов для вода, с появлением на поверхности мембран отрицательно заряженкых групп, возможно карбоксилов, вследствие чего мембрана приобретает отрицательный поверхностный заряд, который" изменяет сродство мембраны к ионам Fe1*, индуцирующего СРО.

В целом, наблюдаемые отклонения в параметрах связывания зонда АНСГ в экспериментах In vitro соответствовали данным, полученным в экспериментах In vivo. И в том, и в другом случае воздействие токсического соединения приводило к снижению интенсивности флюоресценции АНС", обусловленному либо уменьшением концентрации! мест связывания, либо изменением сродства зонда к мембране. Это свидетельствует об уменьшении гидрофобного объема мембраны и об увеличении еб отрицательного поверхностного заряда вследствие накопления продуктов СРО липидов.

Увеличение микровязкости мембраны (зонд пирен) связано, поводимому, также с развитием пероксидации липидов, которое затрагивая преимущественно ненасыщенные цепи, приводит к их выходу из глубоких слоев мембраны на поверхность, тем самым увеличивая "жесткость" мембраны, что находит отражение в уменьшении с с/отношения 1Э/1М.

Предварительное введение имидазолов снимало указанные изменения в мембранах во всех сериях опытов. При этом в остром эксперимента ЭТ увеличивал в микросомах величину Ке на 23%, ЭТ и ДБ - величину N на 19% по сравнению с контролем. Наиболее активными мембранопротекторами in vitro были ЭТ и Т-5. Эти соединения предотвращали указанные выше изменения состояния мембран, подвергнутых 16 минутной инкубации с ДФДС. На фоне действия препаратов наблюдалось даже некоторое нарастание величин Ке и N ОТ в микросомальных шмбранах, зонд АНС") и снижение микровязкости (Т-5 в эритроцитах, зонд - пирен).

При увеличении времени инкубации с ДФДС, в условиях предварительного воздействия имидазолов, наблюдались изменения флюоресценции зондов, сходные с действием самого токсиканта, но выраженность этих изменений была веб же значительно меньше. Так, микровязкость мембран микросоы и эритроцитов на фоне действия

ЭТ через I час инкубации с ДФДС была ниже таковой при действии самого ДФДС практически на одну и ту же величину - 43» и 46%, через 2 часа инкубации - микросом на 38%, эритроцитов - на 51!? (Рис.4j. Наибольший эффект проявлял Т-5. Микровязкость мембран после предварительного действия Т-5 практически не отличалась от уровня контроля. Относительне менее активным в эритроцитах оказался ИМ, а в микросомах - ДБ, хотя и в этих случаях защитный эффект проявлялся.

Защитное действие производных имидазола регистрируется и по флюоресценции АНС", хотя и менее выраженное. Практически у всех изученных препаратов на фоне токсического действия ДФДС наблюдалось увеличение сродства зонда (Ке) к мембранам, что, видимо, связано с ростом положительного заряда мембраны.

Исследование токсического действия ТФ па активность мембршго-зависимого фермента - эритроцитарной'АТФазы показало, что In vivo ТФ как в остром (Рис.3), так и подостром опытах, оказывал выраженный ингибирующий эффект, причем в подостром опыте наблюдалось практически одинаковое снижение активности как уабаин-. чувствительной, так и уабаинрезистентной форм (250%). В остром опыте наиболее чувствительной фракцией была уабаинрезистентная АТФаза (общая АТФэзная активность снизилась на 46%, уабаинрезистентная - на 73%, уабаинчувевительная - на 16%).

ДФДС (ЮСмкМ) в эксперименте In vitro проявлял ингибирущее действие на активность АТФазы подобное тиофенолу в экспериментах in vivo (Рис.5). Наиболее ингибируемой фракцией после 15 мин инкубации была уабаинрезистентная АТФаза. Так, общая АТФаз-ная активность снизилась в 1,8 раз, причем уабаинрезистентной фракция■- в 2,4 раза, уабаинчувствительной - в 1,6 раза. Через I чэс воздействия ДФДС- активность АТФазы вообще не регистрировалась.

Производные имидазола на фоне токсического влияния ТФ и ДФДС проявляют выраженное защитное действие на функции эритроцитарной АТФазы. in vivo (подострый ошт) общая АТФазная активность под действием ЭТ увеличилась в I," раза, при этом •уабаинчурст-вительная - в 2,1 раза, уабаинрезистентна? практически не изменилась. В остром опыте - общая АТФазная активность увеличилась также в 1,5 раза, не па счет активации уабаинрезистентной (в 2.7 раза), тогда кок уаСаиэтувстЕптельнпя не изменялась. При

МКГР1/МГ белка/час

12 3

I 2 3

J31

12 3

2 3

15мин

I час

Контроль

тс

15мин I час t

инкубации с ДФДС

ЗТ+ДФДС

Рис.5 Изменение активности эриттюцитарной АТФазы при воздействии ДФДС (ЮОмкМ) и ЭТ (IQmkM) в опытах In vitro

1 - общая АТФазная активность;

2 - уабаинрезистентная АТФазная активность:

3 - уабаинчувствительная АТФазная активность;

действии ДБ в остром опыте общая АТФазная активность, по сравнение с введением одного ТФ увеличилась в 2.0 раза, опять-таки за счет уабаинрезистентной формы (активность повысилась в 5,3 раза), активность уабаинчувствительной не изменилась.

Тек как сохранение активности общей АТФазы в остром опыте произошло, в основном, за счет увеличением активности уабаинрезистентной фракции, меньшая выраженность защитного эффекта ЭТ на функцию АТФазы по сравнению с ДБ, может быть связана с его собственным ингибирующим влиянием на уабаинрезистентную форму интактного фермента. Для сравнения отметим, что ДБ на интактную уабаинрезистентную форму оказывает активирующее действие.

1п vltro предварительное воздействие ЭТ сохранило активность фермента на уровне контроля после 15 мин инкубации с ДФДС' (доля уабаинрезистентной АТФазы 6056). После I часа инкубации сохраня-

лось 66% общей активности АТФазы: 47% уабаинрезистентной и 87% уэбаинчувствительной (от уровня контроля).

Защитное действие ДБ In vitro так же было менее выраженным. Активность общей АТФазы через 15 мин инкубации с ДФДС составила 81v от контроля, в том числе уабаинрезистентной - 91%, уабаин-чувствительнсй - 71%. После I часа инкубации общая АТФазная активность составила 58%, уабаинрезистентная - 39%, уабаин-чувствительная АТФазная активность - 79% от уровня контроля.

Воздействие ДФДС на мембраны эритроцитов In vitro привело к уменьшению числа функционирующих /з-адренорецепторов, о чем свидетельствует уменьшение ееличин N и R. Инкубация эритроцитов с 25 мкМ ДФДС вызвала снижение концентрации центров связывания • пропранолола (N) на 36%, с 100 мкМ ДФДС - на 42%. Концентрация связанного с эритроцитами пропранолола (R) снизилась в знаете льно меньшей степени: при 25 мкМ ДФДС - на 7%, 100 мкМ - не 14%, что связано, по-видимому, с увеличением сродства пропранолола к рецептору.

Предварительная инкубация с ЭТ значительно .низила выраженность изменений при токсическом действии ДФДС. Все исследованные параметры связывания достоверных отличий от контроля не имели.

Поведение белков-рецепторов в мембране, как и их сродство к Л1гандам, зависит от микровязкости окружения. Поэтому увеличение микровязкости эритроцитарных мембран, вызываемое развитием СРО мембранных липидов под воздействием ДФДС, приводит к снижению функциональной активности (Э-адренорецепторов. В тоже время нельзя исключить возможность непосредственной модификации ароматическими тиолами рецепторов путем восстановления их дисуль-фидных групп.

Анализ результатов биохимического исследования действия ароматических тиолов на мембранные структуры эритроцита и микросом печени крыс показывает, что в механизме токсического действия этих соединений основным эффектом является инициирование реакций свободнорадикального и перекисного окисления липидов и, возможно, белков. Особое место в этом процессе занимает окисление ТФ с образованием супероксид-радикала и ДФДС, обмен которого с GSH, поддерживает этот процесс, пока в системе имеется восстановленный глутатион. В окислении ТФ в эритроцитах важную

роль играет оксигемоглобин (МшкЗау, 1986), однако определенный вклад вносят и реакции окисления с участием переходных металлов и их комплексов, следовые количества которых всегда присутствуют в этих системах. Указанные реакции запускают процесса генерации и других активных форм кислорода, что приводит к образованию продуктов ПОЛ. Процессы СРО и перекисного окисления протекают интенсивней в эритроцитах, чем микросомах. Таким образом, действие ТФ является источником трех неблагоприятных эффектов в клетке:

1. Активизация процессов перекксного и СРО

2. Образование метгемоглобина

3. Истощение пула глутатиона

'Первый процесс приводит к деградации липидного бислоя биомембраны и повышению еб вязкостных свойств, что является причиной изменения Функций самой мембраны и активности изученных нами мембранных белков: К+,Ка+-АТФазы (интегральный белок) и А-адренорецепторов (периферический белок).

Влияние второго фактора - образование метгемоглобина и продуктов глубокого окисления гемоглобина очевидно и детально рассмотрено в работах Мипйау.

Истощение пула глутатиона в эритроцитах и микросомах печени приводит к нарушению функций всех глутатконзависимых ферментов, цитохрема Р-450 в микросомах и повышению чувствительности этих систем к перекисному окислению. Известно, что система СЗН-СББО служит буфером, защищая эритроциты от деструктивного действия окислителей. СБН может, восстанавливать дисульфошше связи, образованные в белках внешней мембраны эритроцитов при "окислительных стрессах". Кроме того. вБИ обеспечивает защиту эритроцитов от повреждающего действия гемолитиков и метгемоглобинооб-разовьтелей, регулируя уровень эндогенной Кг0г, активируя мет-гемоглобинредуктазу. Глутатион как энтиоксидант защищает от окислительного повреждения К+,Ка+-АТФазу, в активности которой важную роль играет вН-группа. Как известно, "выключение" К+,Ма+-помгш приводит.к нарушению функций и даже структуры эритроцита.

Другим аспектом токсического действия ароматических тиолов «ваяется вызываемое ими изменение активности /з-адренорецепто-ров. Модификация их функции.и торможение активности

кЧна^-АТФазы эритроцитов приводят к нарушении транспортных Функций эритроцитоз, снижению деформируемости и, наконец, нарушений ионного гсмеостаза, следствием чего в конечном итоге может быть осмотический лизис клеток.

??ким образом, токсическое действие ТФ является многоплановым и характеризуется метаболическими .«¡следствиями активации СР и ПО, и».вощения пула СБН, торможения функции На"1,К+-АТФ?зы и изменения активности А-адренорецепторов.

ГТоврездающее действие ароматических тиолов и дисульфидов на микросомы свидетельствует о структурных изменениях в ЭПР клеток печени. Эхо означает, что повреждение мембранного аппарата ЭПР под действием ароматических тиолов может стать причиной подавления детоксишрующей функции печени по отношению к другим ксенобиотикам и эндогенной синтетической функции соответствующие ферментов.

Протектизное действие- сэадкнений имидазола на эритроциты п микросомы печени связано, как следует из наших данных, прежде всего, с их антирадикальной л антиперекисной активностью. АОА . имидазолов реализуется, вероятно, нескольким путями. Во-первых, хорошо известен факт образования производными имидазола комплексов, в ряде случаев хелатных (ЭГ), с ионами переходных металлов. Удаление из гидрофобной зоны мембран, в первую очередь ионов железа и меди, являющихся катализаторами СРО, снижает возможность инициирования свободно-радикальных процессов. Во-вторых, имидазолсодержащие соединения могут выстлать в роли ловушек синглетного кислорода ('02), гидроксильных радик"лов

(НО*) и супероксидных анион-радикалов (Ор. В третьих; производные имидазола язляются сшергистами «-токоферола. Предполагают наличие редуктагы, при участии которой имидазолсодераащие соединения восстанавливают токоф?ршшион, накашквавдийся в процессе СРО, обратно в токоферол, осуществляя тем самки регенерацию витамина Е.-01изко защитное действие ш,'лц(ззольннх'производных более многоплановое. Так известно, что в.тадазолсодер-жащие соединения активируют один из ферментов глпкалитпческого метаболизма глюкозы - глицэральдегадфосфатдегидрогенззу (СеЕЭ-рин С.Е., 1954). Поскольку глжслиз является единственшг: источником АТФ в эритроците, есть все основания считать, ч-ю акттва-ция указанного фермента является вакнйм компонентом защитного

действия имидазолов на активность АТФазы эритроцитов.

Имидазольные производные, превде всего ДБ и ЭТ, являются эффективными модуляторами аденилатциклазной системы. ДБ ингибиру-ет ФДЭ, а ЭТ кроме того активирует аденилатциклазу, что приводит к накоплению в эритроцитах цАМФ. Это может компенсировать ослабление функции /?-адренорецепторов под действием ароматических дисульфидов.

Использование имидазолсодержащих соединений, в частности офи-цинальных препаратов ЭТ и ДБ является перспективным в целях предотвращения повреждающего действия токсических ароматических тиолов и дисульфидов на мембранный аппарат эритроцитов и эндо-плазматического ретикулума»клеток.

выводы

1. Установлено, что "лекарственные препараты ЭТ, ДБ и другие фегаишроизводные бензимидазола обладают антиоксидантными свойствами как in vitro, так и in vivo. Концентрационная зависимость антиоксидантной активности имидазолов не является монотонной и характеризуется понижением активности при 2,0-Ю~*М и повышением при 1,0»10~5 и 2,0-10"4М.

2. Показаж^ что низкие концентрации 'Т ,0'10~°М) производных .имидазола повышают, а высокие (1,0-Ю~4М) понижают активность Г(а+,К+-АТФазы интактных эритроцитов. Изменение активности фермента обнаруживает отрицательную корреляцию с микровязкостью мембран эритроцитов, определенную методом флюоресцентных 'зондов. _

3. Обнаружен различный характер влияния ЭТ, ДБ и других производных имидазола на активность уабаинрезистентной и уабаинчувствительной форм АТФазы. ДБ и Д-1 ингибируют уабаинчувстви-тельную, и активируют уаб&инрезистентную формы фермента.

4. Показано, что ЭТ и ДБ повышают сродство /з-адренорецепто-ров интактных эритроцитов к действию антагониста пропранолола.

5. Обнаружено защитное мембраностабилизирующее и антиокси-дантное действие ЭТ. ДБ и других производных имидазола на ли-пидный бислой мембран эритроцитов и микросом печени крыс при токсическом воздействии ароматических тиолов.

6. ПоказайЪ, что препараты ЭТ и ДБ проявляют защитное дейст вио в отношении мембранозависпмых белков и ферментов - АТФазы в ^-адренорецепторов эритроцитов при воздействии ароматических

тиолов. Сохранение активности АТФазы как в опытах In vivo, так и In vitro связано с увеличением доли активности уабаинрезис-тентной АТФазы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) К вопросу о механизме антиоксидантного действия ппроизвод-ных имидазола. // Сб.: Биоантиоксидант. М.,1993.-Т.I.-С.45-46 "(соавторы В.А.Дадали.Р.Н.Павлова).

2) Мембранная активность этимизола и дибазола при токсическом воздействии ди^енилдисульфида.//. Сб. Актуальные вопросы профи- . лактической и клинической медицины.-СПб., I994-C754-55 (соавтор Соколова Е.А.)

3) Концентрационная зависимость действия этимизола и дибазола на уровень перекисного окисления и активности АТФаз в меабранах и их моделях. // Сб. "Механизмы действия сверхмалых доз".-М., 1995. - С. 102-103. (соавторы Дадали В.А., Масевич Ц.Г., Павлова Р.Н.)

Подписано в печать 24.0 596. Заказ №19 • Тираж г50 экз. Формат бумаги 60x84^16. Усл. печ. л. 0,75. Цена договорная.

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47

Типография ТОО "Доверие