Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ THIOBACILLUS FERBOOXIDANS В СВЯЗИ С ОКИСЛЕНИЕМ ЭЛЕМЕНТАРНОЙ СЕРЫ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ THIOBACILLUS FERBOOXIDANS В СВЯЗИ С ОКИСЛЕНИЕМ ЭЛЕМЕНТАРНОЙ СЕРЫ"



АКАДЕМІЯ НАУК СССР ИШПП7Т МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

- ГРОМОВА Лариса Алексеевы а

УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ тнховасііхіб реиіоохіпшз В СВЯЗИ с 0КИСЛВДИЕ1І ЭДЕМШТАРНШ СЕРЫ

03.00.07 - шакройиология

АВТОРЕФЕРАТ

. диссертации на соискание ученой степени кандидата йиологкчвоких наук

Мооква-1984

Работа выполнена в Отделе микробиологии горшее пород Института Микробиологии АН СССР.

*

Научный руководитель - ' Доктор биологических наук Г. И. КАРАВАЙКО.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. И. ДУДА, доктор биологических ваук С. В. ЛЕТУНСВА.

Ведущее учреждение - Московский государственный универои-тет им. М.В.Ломоносова. Биологический фалультет, кафедр« микробиологии.

Автореферат разослан " " •^с^сжЛ_ 1984 г.

Защита диссертации состоится " ЛЗ " ¿¿^сусЛ 1984 г. в часов на заседании Специализированного Совета

Д 002.64.01 при Институте микробиологии АН СССР.

*

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Приглашаем Бае принять участие в обсуждении диссертации на заседании Специализированного Совзта или прислать отзыв на автореферат по адреоу: I17312, Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2. Отзывы направлять в 2-х экземплярах, заверенных печатью.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

Л.Н.МОСКАЛЕНКО

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В природных условиях элементарная вера и ее соединения неустойчивы и подвергаются окислении и воостановлещш, переходя при этой из одного геооферного резервуара в другой (тгтипаег, 1962). Окисление и восстановление неорганических соединений серы может включать как химические, так в биологические процессы, которые в совокупности осуществляют "Оиогеохишчеокий цикл серы*?. Окислять элементарную серу в ее восстановленные неорганические соединения ногут представители разных сиотематических грулд в широком диапазоне физико-химических параметров окружаххцей среды. Тионовие бактерии -{ р.ты.оЪао1Ииа) окисляют сульфиды мэталлов, элементарную серу, тиосульфат, политионаты и оульфит до сульфата. Они попользуют неорганические восстановленные соединения серн в качестве энергетических оуботратов, осуществляя хемолитотрофный споооб питания.

' физиология, биохимия и морфология тионовнх бактерий а, в. частности вида т.ГвггоохЦапа, достаточно полно изучены. Однако механизм окисления серы, которая является од^шм нэ основных продуктов окисления сульфидных минералов, еще мало изучен. Спорным остаетоя вопрсю о первичных воздействиях бактериальной кдетки на гидрофобный оуботрат. Мало известно о роли поверхностных структур в окислении серосодержащих неорганических соединений. Поскольку культура т.:Сеггоох1<1апв используется при бактериальной выщелачивании металлов из руд и концентратов и щшкекяетоя в гидрометаллургии, решение атих вогросов имеет не • только теоретическое, но и практическое значение.

I т'дльндя

Цель и задачи исследования^. Д^аатодоаЯч работа

посвящена изу-

49НИИ структуры и функций отдельных оргаяелл клетки ж, особенно поверхностных структур, в связи о окислением элементарной серы.

Сря ренегата 'этой сро&шш ва№ била поставДвш следущдае -задачи: . •

I* Изучить тонкое отроение ФЛвг^огЮаав щи охголенкв элементарной серы, обратив особое внимание на хх поверхноотыыэ отруктуры» •

2* Выяснять фувщив отдельных структур т. Гегтосд!Няп» в о вязи о окислением рлемеьх-араоЯ серы.

• разгчная новизна работы. Впервые показано» что при окисле" нии аяеиантарноЯ серы клетками т,Геггоох1Ллп» она поступает в коллоидном состояния в периплазматичеокое пространство и локализуется в ней» а также в крупных биполярно расположенных офе-ртчвакях отвуКЕтразг в в сростнх вявагинатах идтопдазматяческой иембраяы.

Установлено, что наиболее интенсивно сера накапливается в клетка! т.гвггоовЮапа в стационарную фазу роста культуры ж может использоваться-в качестве эндогенного энергетического * материала в уоловиях гшгоданая. ■ ,

. Выявлена локализация в Щетках Т.Геггоох1<ш>« ЛЗФ-азвсД активность. Оватмдаэ тоязава о пвршиазиаткчеогаш пространст-■ вой и о крупными ошолярно расположенными сферическими структурами.

Впервые также обнаружены у тионовых бштериБ пшш и изучена мшфомолеяулярная организация клеточной стенки: обнаружены аоры и еле!згалиэированннд отверстия дия выхода пшш. Предполагается« что а транспорте серы эта отруптуры участия не вринама-

"ЮГ.' , * _

Практическая ценность работы. В процессе окисления многих

оудьфадкых минералов основным промежуточный, а зачастую в конечным продуктом является адемантарная о ера. В последнем случае она шкет подавлять процесс окисления сульфидного минерала. Понимание взаимосвязи отруктуры и функции бакторьЛ цри окислении »того субстрата являатся существенным дня оптимизации уоловий выщелачивания металлов из руд а концентратов, а также для оценки физиологического оостояния бактерий как при окиодешга сульфвдншс минералов, так в при хранении или переживании неблагоприятных уо-лови:: в природных местах обитания. '

Апробация работы. Материалы диооертацан были доложат ва конференции молодых ученых н специалистов Института макробиологии АН СССР (Москва,1978), на Второй Республиканской конференции молодых ученых (ТашкентД978), вошли в курс левдвй для отудентов почвенного факультета ЫГУ, были представлены на Международном оемннаре "Современные аспекта микробиологической гидрометаллургии* (Москва,1982).

Публикации. Основные материалы дисоертацни опубликованы в

<

б статьях. *

Объем и структура работа. Диооертадая состоит не введения,• пяти глав, выводов в списка литературы• Материалы иалоканы на 191-странице машинописного текста» включая 8 рисунков и 54 микрофотографии. В списке литературы - 312 наименований работ; 68 на русаком и 244 на иноо транша языках.

ОБЪЕКТЫ И ЦЕГ0ДЫ1ССЛЕД0ВАЫШ

В качестве объекта исследования не:ли был использован штамм ВКМ В-458 Т.Геггоох1(1а11а. Эти бактерии окисляют елементарную серу, эакненое железо в сульфидные минералы в црименавтоя ори чановоы, кушем и подземном бактериальном выщелачивании мотал-

лов из руд и концентратов* Количественный учет T.ferrooxidana проводили методом предельных десятикратных разведений, посевом в жидкую среду 9К, содержащую эакисное железо (44,2 г/л) ( &11-vermaa', Lundgren, 1959) или элементарную сер; (10,0 т/л). Определение биомассы бактерий осуществляли также о помощью измерь- ' нил оптической плотности культуральной жидкости (^цвн-Пушкина о ооавт.,1974). Сульфаты в культуральноп среде определяли с BaClg во Заварову (1957).

При изучении ульграструктурной организация янтакткых клеток, ' Сферопластов и фрагментов клеточных стенок T.ferrooxidane иопольэоввли различные приемы приготовления препаратов: метод негативного контрастирования, метод оттенения интактных глеток, а такав получение препаратов ультратонких срезов (Бирюзова о ооавт.,1963; Тихоне:.ко, 196(3).

Лая получения фрагментов клеточных стенок бактерий T.far-rooxldans использовала два штода дезинтеграции: метод деструкции клетки с помощью лазерного излучения в присутствии красителя (Маныкнн о соавт.,1977) п метод ультразвуковой дезинтеграции (Кузнецов о соавт.,1963). Сферопласгы получали о помощью ферментативной дезинтеграции лизоцгмом, при этом использовали методику, предложенную для грамотрмдателышх бактерий Bordetella pertussis (Захарова о соавт.,1975). Метод вклвчаэг обработку клеток растворами НаС1(0,5 М), затем экспо зтююв сахарозе (0,5 М) и последующую инкубацию с лаэ^цдыоы.

Для выявления в клетках локализации АТФ-азы использовали кальциевый ¿ютод Падикула а Герман (Пирс, 1962).

Локализацию соединений серы в клетках определяли с помощью разных цитохимических методов. Проводили.цитохимические реакции с 2%-юш раствором AgKo_ и с 2%-тш раствором Cd(K0,)2.. Дня

опродвлекия растворимости соединений оеры, локализованных в клетка , ис польэовали органические растворители: этиловый и иетпловиК опирты. Клетки,выращенные ва среде о влешнтарной серой, оначала обрабатывали одном из спиртов, а потом прогадали цитохимическув реакцию о 2%-юм раствором АеНО^.

Идентлфнкатао химических алементов, содержащихся в Оактери-алъной клетке, осуществляли методом энергодиспорайонного микро-зондового рентгеновского анализа.

„ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ-

I. Организация поверхностных структур клеток т.1еггоох14а»в

Окисление елеме«тарной серы тионовыыи <$актерыями осуществляется при непооредо тванном контакте клетки о суйотратои. В СВЯЗИ о этим нами преяде всего бшш изучены поверхностные структуры клетки.

Пяди. На поверхности клеток 1*£еггоох1<1апв, окисдшодих алаиантарную о ару, нами впервые у тионовш бактерий Сшш обнаружены фидашнгознне выросты клетки - шш1. Ыаксишльвая дтана атих отруктур достигает 3 мкм, а минимальная составляет 0,7 Диаметр пш в среднем равен 5,0 ни. Шли расположены перитрихи-ально на поверхности клетка. Более детальное изучение поди не до вводило выявить внутренний канал л спиралевидную структуру.

Ноэле шля бидк обнаружены на поверхности к-.еток тионовых бактерий ТЫоЪа<з±11ия А2 (КогЬоаеп в« а!. ,1978) а ТЫоЪасШив каЬоЫа (ЕвупоЫв «ъ , 1981), а также на поверхноотя клеток Г.ГвггоохЫаюа, выращенных на ораде с эакисныц халезом { ш-Вр1г1ко еф а1.,1932).

Размеры шиш и отсутствие внутреннего канала ые позволяй говорить об их участии в транспорте серн в клетку. Возможно, что

: шит у T.ferrooxidans принимают участив в прикрепления клеток к оубстрагу (сере), а непосредственно окислйние о еры происходит при прямом контакте клеточной стенки с гидрофобным субстратом. Поэтому в дальнейшем нами Пола изучена макромолвкулярная структура клеточной стенки ЭТИХ бактерий.

Макромолэстлярвая организация рлеточной стенки. Изучение макромолекулярной организации клеточной стенки T.ferrooxidans проводили на отдельных ее фрагмента*. Работы по изыскании оптимальных параметров дезинтеграции бактериальных клеток показали, что лучшая сохранность отруктур обеспечивалась при дезиытегращш клеток ультразвуком при акустической мощности в рабочем сосуде 40 Вт/ом2 при рабочей поверхности кварда 10 ог? в течение 12 мин Бактериальные суспензии, подвергнутые воздействию ультразвука : при таком режиме, содержали 20% целых клеток, 5Q% поврежденных клеток и 30Í разрушенных клеток, представленных отдельными <Й>аг-ментами клеточных стенок, свободных от содержимого цитоплазма.

В клеточной стенке Т.fеггоох!валз нами впервые показано наличие маленьких и больших кольцевидных структур. Цаленькие кольцевидные структуры шноют внутренний диаметр 3,0 нм а внеш- . ннй 10,5 в» и состоят из б белковых субъедшшц. Они распределены по всей поверхности клеточной стенки, функция обнаруженных ' вами маленьких' кольцевидных структур не ясна. Однако можно предположить, что они щраот роль пор наружной мембраны клеточной стенки Т.ferrooiiaeiia i участвуя в поступление растворимых веществ в клетку виз нее*

Больше' кольцевидные структуры, обнаруженные нами в клеточной стенке T.ferrooHdaus, имеют внутренний даамотр'7,5 НМ и внешний 14-15 нм. В отЛгтае от'маленьких кольцевидных отруктур otnt встречаются в клеточной стенке значительно реке. По ра-

Buapy и морфологии oes напоминают структуры, обнаруженные другими исследователями ( Every, Skerm&a, 1980) в клеточной стенке граиотрвдатвльных бактерий B.nodoeus. Эти авторы высказали предположение о теш, что больше кольцевидные структуры У В.до-dosue служат дня выхода пили.

Поскольку внутренний диаметр больших кольцевидных структур в клеточной стенке г. f еrrooxldans равен 7,5 нм, а диаметр шиш у основания не превышает 5,0 нм, можно предположить, что боль-

4 »

те кольцевидные структуры к у тионовьег бактерий выполняют роль специализированных отверстий для выхода пшш.

Таким образом, в клеточной стенке T.ferrooxidaûs какие-либо специализированные структуры, ответственные за транспорт серы, обнаружены не били.

Тонкое отроение интактнюс клеток и ctbeporuiaofop т.ferro» orí daña. В дальнейшем более детально была научена ультраструктурная организация,иитактныж клеток в сферопластов T.ferroori-

dáaa при окислении серы. Интактные клетки, выращенные на среде • i

9К о элементарной серой, имеют палочковидную форму в характерную для них внутриклеточную организацию« описанную прежде другими авторами ( Lundgrea et al,t19&H Berns en,Lundgrea, 1966| Авакян,Каравайко,1970). Поэтому ыы уделили большое внимание получению a дзучению сферопластов этих бактерий.

□оказано, что выход сферопластов T.ferrooi'.dans зависит от используемой концентрация лнэсциыа. Тал, например, при использовании фермента в концентрациях 200 к 400 хкг/мх вихЬд сферопластов составлял соответственно 62 и 77$.

Сферопласгы T.ferrooridana имади овальную или сферическую форму, размеры их составляли 0,50-0,65 х 0.7&-0.95 мкм. В цито-пдааме сферопластов S.ferrooxid&ae была выявлены вакуолеобраз-,

нне структуры, содержащие алентронно-шотное вещество, а также округлые плотина связанные о ними внутриклеточные отруктурн неизвесткой природы. Подобные структуры обнаруживаются как в пе-риплазматичеоком пространстве клетки, так г на поверхности на- * ружной мембраны клеточной стенки. Причем наличие их отмечается у 60-70$ сферопластов. Диаметр етих структур колеблется от 35 до ТО км. Округлые плотные структуры были обнаружены также на поверхности интактных клеток т.Геггоохіаапв, выращенных «а среде о алементарноД серой, возраст которых соответствовал стационарной фазе роста. Количество клеток, имесщих такие структуры, не превышало 5-10? общего числа клеток. Диаметр втих поверхностных структур достигает 50 ым.

Из Приведенных результатов ВИДНО, ЧТО КЛеТКИ Т.ГоггоохА-йаав имеют сложное строение, однако, функция выявленных внутриклеточных структур остается' неизвестной.

2» Локализация серы и фосфорных соединений в клетках т.£еггооіі<іалв

Как ваяно из данных, приведенных выше, адектронношкрооко-шгческие исследования без применения дополнительных методов не позволяет ответить на вопрос о судьбе веры на первых етапах ее окисления клетками. Прежде всего необходимо было установить -проникает ли сера в клетки? Боли да, то в каком состоянии в где локализуется? - - '

Локализация серы в клетках. С етой целью нами было проведено сравнительное изучение внергодпсперсношшх спектров интактных меток т.зГеггоохіа&пз, выращенных на разных энергетических субстратах и напиленных затем углеродом (рио. 1а, б). Исследования показали, "что знергодислерсиошшй спектр интактноЙ клетки, выращенной на среде 9К с элементарной серой, содержит

два основных пика, осютветствупцнх энергии излучения К оерик фоофора в К серии овры. Пики стих алементов практически занимают рааиую площади, при этой соотношение сери к фоофоре. составляет 1:1 (рис. 2а). Соотношение элементов серы и фосфора в внергодиоперононном спектре клетки, выращенной на среде 9К о аа-кионым железом, составляет 1:3 (рис. 26).

: Г/л. ***

Рис. I. Интактные клетки т.гerrooxiüana. Напыление углеродом.• Среда культивирования: а - 9К о элементарной серой; ; б - 9К о закиоюш железом, КС - клеточная стенка

' Рио. 2. Энергодиошрсионныв спектры кнтактшд клеток T.ferro-oxidana. Бремя измерение 200 с. Среда культивирования: . , а - 9К о элемэнтарной серой; d - ЭК с закаокым халаэом

В результате исследований было показано, что интактные клетки T.ferrooxidajaa, выращенные на среде 9К о элементарной серой, содержат внутриклеточно значительно больше серы, чем клетки, раэвдващкеся на среде 9К о займовым железом,.

С цель» выявления внутриклеточных структур; а которых ЛО-калпзуетоя оера к происходит дальнейшее ее окислвшіе до оульфв-

; - io -

та. проводил* цитохимические исследования о использование« 2% раствора AgNCXj, Показано, что клетки, выращенные на среде 9К о ажементарной оерой, содержат бояыпое количество влектронноплот-юяс гранул положительной реакции о , в то время как клет-

ки, выращенные на среде 9К о закисним железой, их не содержат.-Размеры гранул колеблются от 40 до 20+5,0 им. Гранулы локализованы на поверхности клетки, в клеточной стенке, а также в Фтолярво расположенных в клетке крупных сферических структурах, Диаметр которых достигает 200 ни, в клеточной стеши гранулы расположены на поверхности наружной мембрани,между наружной мембраной в алектронноолотным слое«, а также между алект-ронноолотным слоем и цнтовлаэматичесхой мембраной(рис. 3- -»).

Так как ион серебра взаимодействует не только о серосодержащими анионаш, но л о фосфатной группой, ионом хлора и другими анионами, необходимо было применить метод, возводящие однозначно определить химические элементы, составляющие алектронно-плотные гранулы положительной реакции о 2% раствором-Для этого был проведен »нергодиоперсяоыяай анализ ульгратонкнх срезов меток, обработанных AgNO^. В процессе подготовки препаратов ультратоккях срезов нлтактные клетки фіксировади раствором OsO^, контрастировали 3i раствором ураннлацетета. Элементы втих соединений (осмий а Уран) вносят искаженную информацию в внергодисперсионный•спектр ультратонкого среза клетки,

Энергодисперсионный опектр ультратонкого среза клетки T.ferrooxldana, в которой гранулы продукта положительной реакция а Ж раствором AgHO^ расположены главным образом в клеточной стенке (рис. З?), представлен на рис. 4а. Пик фосфора отсутствует, Оик серы отчетливо обе значен и не перекрывается другими элементами, пик серебра также отчетливо обозначен, но чао-

- 12 - ■' , - * *

Подписи к рисункам.

Рив* 3, Ультратонкие срезы клеток Т. #еггЬох14впа * выращенных на среде 9К г элементарной серой. Локализация гранул продукта цитохимической реакции с ЭД-ным раствором

і а-б - на поверхности наружной мембраны клеточкой стенки; б-в - между наружной мембраной и электронноплот-ным слоем, а также между электронноплотным слоем и цито-плаэматической мембраной; г - в клеточной стенке; д -\ в биполярно расположенных крупных сферических структурах, НМ - наружная мембрана; СС - средний электронно штатный слой; ІДІМ - цитоплаэматичеекая мембрана;-БС - бипелярно расположенные крупные сферические структуры ' ,

Рис. 4. Энергодисперсионные спектры ультратонких срезов клеток І вггоолЫаа» ї а - спектр среза клетки, представленного на рис, Зг! б - спектр среза клетки, представленного на рис.Зц \

тичко оуммируется с двумя ыками урана*' По площади лик сера составляет около половины пика серебра, а именно, соотношение сера-„ оеребро прибяиэительно равно 1:2. Клетка T.ferrooxldans, находящиеся в стационарной фазе роста к обработанные 2% paoтвором XgHOj, часто содержат (до ЗЬ% общего числа клеток) биполярно или центрально локализованные крупный сферические структури, заполненные алектронношготкымц гранулами (рио. Зд). На енергодяо-пероионвом спектре ультратонкого среза такой клетки отчетливо виден пик серы (рио. 46), á пик серебра имеет вид аналогичный предыдущему варианту.

Таким образом, изучение ультратонких срезов клеток T.ferro-oxldans, выращенных на среде 9К о элементарной серой и обработанных 2% раствором Аело^, позвалюю установить, что.электрон-ноплотные гранулы, локализованные в клетках, содержат серун оеребро, а ато указывает на тот факт, что ион серебра взаимодействует с соединениями серы. Такие элементы как фосфор* и хлор отсутствовали. К сожалении, однозначно определить природу серосодержащего компонента о помощью этого метода невозможно.

, р^яма^ив ;шмическоЙ тнтотш ^аросодержащего компоненту р клетках о помощью цитохимических методов. Предыдущие исследования показали, что при бактериальном окнслэнии серы важное значение имеют экзогенные липиды ( Agate et al.,1969¡ UcGoraa «Ъ «1,

. *

1Э69;Каравайко,ПивовароваД973; Каравайко о соавт-,1980; Пиво-■ варова о соавт.,1982). Однако остается неясной дальнейшая судьба коллоидной серы. Встает вопрос о том, .в каком состоянии сера поступает в клэтку? '

Поскольку вышеприведенные комі» методы не позволили точно определить хшлпческую природу сероеодердащего компонента, необходимо было применить другие методы исследования. Известно, что

ноа серебра, который всегда находится в растворе в виде одновалентного катиона (Ag* ), можеи' реагировать о различными серосо-держа*эдми анионами; ШГ, а также о ало мон-

тер ной оврой.

Ионы кадмия специфически связываются с судьфгадрильными группами к эта реакция используется в качоатвошюм анализе для отделения сульфгидрильных групп от других серосодержащих анионов в растворе (Алексеев.i960). При изучении природы серосодержащего компонента, обнаруженного в клетках T.ferrooxidana, выращенных на среде 9К о элементарной серой, нами била использована цитохимическая реакция о 2% раствором С<й<ИО^)г. В этой серии ошиов гранулы продукта положительной реакции с ионами Cd2* в клетках не были обнаружены. Поскольку при окрашивании клеток т.ferro«xi-dana 2% раствором Cd(HOj)2 цитохимическая реакция отсутствует, можно предположить, что свободные' сульфгцдршгьние группы в клетках о помощь» • AgNO^ также не выявляв тся.

Так хая известно, что элементарная сора растворяется в эти" ловом спирте (растворимость 0,05 г/100 г растворителя) я в метиловом (растворимость 29,5 г/100 г растворителя) (Гороновокий а соавт.,1974), они были использованы при идентификации серосодержащего компонента. Обработку- растворителями проводили до евтохн-мичеокой реакции с 2% раствором AgHO^. -После краткосрочной обработки етиловым спиртом (25 мин) и Agiio^ клетки содержали, влектроннопяотиые гранулы, которые по локализации и количеству не отличались от таковых в клетках, ве обработанных этиловым спиртом* В клетках, обработавшее более прододжатлльное время (3 часа) 95JC раствором метилового спирта, можно наблюдать лишь > отдельные очень мелкие алектронноплотниа гранулы, расположенные ■ в клеточной стенке а в цитоплазме около овальных цустот. имеющих

размер от 80 до 100 им.

Таким обрезом, растворимость серосодержащего :юмпоаента в мотиловом спирте указывает i ta то, что о 2¡l раствором взаимодействует элементарная сера Í 3° ) м реакция может протопать по следующей схемо:

Ае+ ♦ — АЄ° ♦ в6*

В этом случае ион серебра восстанавливается. Предполагается тагасе и иная схою взаимодействия серебра с серой;

пАк+ + ю(-Б-) — АСдб^ При атом ионы серебра взаимодействует о коллоидной волиоуль^ид-ной оорой, занкгшг свободнее связи в мицолле полимера сори. Полученные дилны« позволите говорить о том, что в клетки T.ferrooxl-

сора поступает без изменения валентности, а идокко в коллоидной форма. В дачьнсйзим нами были изучены закономерности накопления серы клотками T.íerrooxidone в раэкыо стадии развития.

Локализация сори в клетках в зависимости от стадии развитид

'Культуры. Тигшялад кривая роста бактерий в периодической культуре

нкрнвая закономерности распределения серы а клетках Т.Гвггоохі-

aens представлены на рис. 5. Из данных рисунка видно, что про- -

і

■цент клеток, содержащих включения оеры в крупных биполярно или центрально расположенных сферических структурах, а таюга количество гранул в деришгаздатичеоком пространство, наибольшие в-ста-щнонарную фазу росте бактерий. Поскольку ь качестве посевного "материала использовала культуру, находящий именно в зтоЛ фазе ' роста, процент клеток; содержащих крупные сферические отруктуры, а также количество грацул в пориплаэмагическом пространстве в период лагфазы были также высоки. В экспоненциальную фазу роста •бактерий число клеток, содержащих включения серы, значительно снижается.

алементарной о врой: I - биомасса: 2 - рН; 3 - процент клоток о крупными сферическим« структурами (по оси ординат)

В различные фазы роста, культуры характер распределения се« ры в клетках Т.£вггооПОапв отличается. В период лагфаэы электронно шіотіше гранули положительной реакщш о локагшзо-_ваш как в клеточной стенке, так к в биполярно или центрально . расположенных крупных оферичеояих отруктурах в в щдв отдельных

охоплений в алектронвопрозрачиых зонах цитошгаэш. Размеры от* ґ -" дельных гранул доотигаит от .20*$ до 10+5 нм. В экспоненциальную

фаеу роста культуры содержание грагул ^ера как'в периплазиати-чеоком пространстве, так к в цитоплазме снижается; причем размори их уцениваются и ооотавляпт і 5+5 нм. В период стационарной фази развития культуры отмечается обильное отложение гранул серы в клетках.

Клетка тиогэвых бактерий длительное время не Логибает при хранении.культур. С цель» изучения возможности использования внутриклеточной овры в каїеотво ендогенного лоточника энергии

были проведеш опыты по субстратному голоданию. Клетки т.ferro-oxldana, выращенные на среде о элементарной серой, возраст которых соответствовал стационарной фазе роста, переносили в среду, лишенную единствешюго источника энергии - элементарной серы .выдерживали в ней определенный период времени, а затем проводили цитохимическую реакцию с 2^-вым раствором A&tïo^» Электронно-плотные гранулы в клетках после четырех суток голодания немногочисленны и локализованы в клеточной стенке, а также в крупных сферических структурах.. С увеличением времени экспозиции на орендо без елементарной серы количество гранул в клетках заметно снижается. После десяти суток голодания клетки содержат лишь отдельные гранулы. Часто на поверхности клеток расположены структуры, размеры которых достигают 30-60 км; в них откладываются гранулы продукта датохишпеской реакции серы с ионом серебра. Количество клеток, имеющие такие структуры, составляет 40$ общего юс числа. Бели клетки голодали по энергетическом? субстрату больший период времени, а именно, в течение тридцати суток, то после обработки их 2£-ным раствором AgHO^ алякгроннопяотные гранулы отсутствовали. Культура была представлена клоткаыя, имеющими на поверхности округлые плотные структуры, которые практически не дают положительной цитохимической реакции о AgHOj.

Таким образом, клетки T.ferrooxldans, голодающие по здер-гетическоцу субстрату в течение тридцати суток, в отличие от выше описанных вариантов (4-10 суток голодания) практически не со»

держат гранул положительной реакции при обработке их 2% раотво-ром* AgUOj.

Как видно из результатов по субстратно^ голоданию, депонированная в' клетках TjferrooxidAne сера расходуется после тридцати суток. Клетки за этот период времени практически не изменя-

t

or pH среди tor 2,42 до 2,38), количество клеток поддерживается ыа одной уровне (от 2,9'Ю7 - 2,0*107), что говорит о жизнеопо-ообыооти популяции бактерий, запасающих элементарную серу внут-риклеточно в условиях отсутствия энергетического материала в окружапцей среде.

Докаливания АТФ-азноЦ активности в клетках. Как уже пока. 8&Н0 выше, в клетках T.ferrooxld&ns, выращенных на среде SK о ; алеиентарной серой, содержащей 3,0 і/л tMgPO^, наблвдаитоя Сидо-'дярно иди центрально расположенные іфутше оферические структуры. На препаратах ультратощшх срезов интактных клеток T.ferro-oxidajiu, которые не подвергали каким-либо цитохимическим обработкам, в цитоплазме клеток расположены сферические образования, представляющие собой пустоты. Очевидно содержимое данных структур вымывается в ороцеосе обезвоживания материала клеток ори подготовке препаратов для просмотра в электронном микроскопе. Данные структуры часто имеют правильную сферическую форму. На некоторых сферических структурах прослеживается наличие трехслойной мембраны, ограничивающей их содержат.

Наличие подобных структур в клетках.тоновых бактерий было * нзвеотно и ранее, однако, химический состав содержимого этих " образований пока не установлен, хотя некоторые авторы полагали,

что данные образования представляю'!' осїой гранулы полифоофата

t '___

Авакяа,КараваНко,1970) или жировые глобулы, содержащие подифос-фаты и серу ( £паув1,1943). Как уже показано нами выше, эти гранулы содержат коллоидную серу. В следующих экспериментах проверена цитохимическая реакция на выявление локализации ATfr-азы в интактных клетках Т.Геггоoxidase,

* * »

Докаливания АТФ-азы в днтакушц Интактныэ клетки

т. Гегго widens, выращешие на среде о'элементарной оерой.

находящиеся в стационарной фазе роста, обрабатывали по методу Падикула и Герман. Продукт цитохимической реакции і-ожно было наблюдать на ультратонких срезах меток T.ferrooxld&as в виде влектронноплотшх гранул, ранулы локализованы на наружной охорона цктоплазматнческой мембраны и в области крупных сферических отруктур, расположенных в клетке чашп на полюсах.

Локализация АТФ-азы в поврежденных клерках. Для лучшего проникновения АТФ2- из инкубационной смеси в дитошіазцу предварительно провели даэинтегращш клеток T.íerrooxidana ультразвуком (40 Вт/см^). На ультратонких срезах поврежденных клеток после инкубирования с Na^TO2" в течение 30 мин отчетливо видно,-что гранулы положительной реакции распределены в виде тонкой каймы вдоль контура крупных оферичеокнх структур* При инкубировании а реакционной с моей в течение 60 мин продукт реакции откладывается в виде отдельных мелких зорен в крупник сферических структурах или окрашивает их полностью.

Поскольку известно, что АТФ-аза участвует в реакции синтеза АТФ из ЛД5 и ортофосфата: АД5 + Ф„—*АТФ, иоішо отметить, что АТФ-аза и ортофосфат локализуются в клетке как в периолаздоти-ческом пространстве, так н в'крупных сферических структурах.

0ВСУЗД2НИЕ РЕЗУЛЬТАТ03 '

Как уже отмечалось вше, задачей настоящей диссертации'было изучить ультраструктурну» организацию клеток T.ferrooxldane в связи с окислением элементарной серы и попытаться выявить взаимосвязь структуры и фунгаьш этих бактерий.

С помощью цитохимических реакций наш была установлена локализация черы и фосфорных соедснеііий в клетке. Они обнаруживаются в поритазматичзском пространстве и в крупных сферических

отруктурах. Из приведенных выше результатов видно, что наблюдается идентичность локализации в метке серосодержащего кошо-нента (рис. ба.б) н продукта цитохимической реакции АТФ-азы (ржо. 7а»б). а.

тм-

Рио. б. Схема распределения серосодержащих гранул в клетке

Т.forroохidons, выращенной на среде 9К о элементарной серой; а - интактная клетка; й - участок клеточной ооолочки, ТМ - трехслойная мембрана

сс

ЦЛГ!

Рис! 7.'Схема распределения гранул продукта цитохимической 4 реакщы АТФ-азы в клетке Т.£еггоо:к1йвпя, выращенной • на среде ЭК о элементарной оерой: а - интактная клетка; б - участок клеточной оболочки -

Ншш впервые были обнсружены у пили и поры

в клеточкой стонке. Однако функция их остается неясной.

Обобщая полученные результаты с литературными данными, можно высказать некоторые предположения о механизме транспорта и окисления оеры клетками ТИОНОВЫХ бактерий T.ferrooxidanei .

- клетки на среде о элементарно" серой синтезируют н выбрасывают экзопродукты фоофолиладной природы, которые омачивают поверхность оеры, что способствует в дальнейшем взаимодействию клетки q субстратом;

' - поступление серы в клетку осуществляется в дискретном состоянии, гидрофобный субстрат проходит через гидрофобную наружную мембрану клеточной сгонки и попадает в периготзттичоское пространство, где располагается на поверхности цитоплазматичео-кой мембраны и в ее иквагкнатах;

- окислонио сеш протекает в периплазматкческом пространства на наружной стороне цитоплаэматической мембраны с? участием локализованной здесь ферментной системы. Электроки транспортируется через цитоплазматичеокую мембрану, а синтез АТФ идет на внутренней стороне цитоплазиатической мембраны в соответствии о . • теорией Митчелла; ' *

- выброс продуктов метаболизма серы происходит через клеточную стенку посредством пор. При неблагоприятных условиях выделительную функцию могут выполнять транспортные везякулй, обнаружен-'

ные в сфероплаотах;

t .

- б стационарной фазе роста клетки запасают серу внутрикле-точно. Она резервируется в перикяазматическом пространстве, крупных сферлческта структурах и простые инвагинатах цитоплазматнчес-:toii мембраны. Депонированная сера является резервом энергетического субстрата, который при необходимости используется клеткой; *.

ВЫВОДЫ

1. Изучено тонкое отроение клеток Т.ТвГГООх1Йапа к фЗГНВЦКЯ отдельных органвлл в овязя о окислением элементарной серы*

2. При оценке взаимосвязи структуры и функции клеток_ т.Гвг-гоохШавв нами впервые показано, что сера в коллоидном оостоя-шш дохаяизуется на 'всех уровнях клеточной стенки и в оообенноо-ти в периялазматичеоком пространстве. Это позволяет говорить о том, что оера транспортируется в клетки без изменения валентности. Прохождение серы через наружную мембрану клеточной стенки происходит в результате пасоивной диффузии.

3. Электронно-микроокопичаокие исследования показали, что ' максимальное накопление серы в пориплаэматическом пространстве

■ клеток ?.г»ггоох1<1аг1в наблюдается в стационарной фазе роота, а минимальное - в экспоненциальной. Это может быть обусловлено нарушением корреляции между активностью поступления оеры в клетку н ее окислением до конечного продукта ( В042" ). Поскольку зала- > .сенная оера попользуется в энергетическом обмене, процесс накопления ее имеет важное физиологическое значение при выживании популяции в условиях отоутотви^ энергетического оубстрата.

• 4. Установлена идентичность локализации в клетке коллоидной ооры и прг-дуктов цитохимической реакции АТФ-азы, что косвенно -указывает на взаимосвязь метаболизма серы а фосфора д обусловлено сопряжением окисления коллоидной серы и синтеза АТЬ.

5. На основании собственных и литературных данных схему окислеши элементарной о еры клетками Т.£егтоох1<1апв шжиопред-отавитьв оледадцем виде: раотворенкз серы ооущеотвляотоя вне клетки о участием экзогенных фосфолнпидов, затем сера в коллоидном ооотоянии проникает в пвриплазматичео кое пространство г

. ; • - 23 -

окиолеюшеепроисходлтнанаружной стороне цито плазматической мембраны.

6. При изучении организации поверхности клеток T.fеггоохА-daña, окислявших гверднЯ гидрофобный оубстрат - элементарную оо-ру, нами впервые у этого мгскросрганизма были обнаружены шиш, а также кольцевидные структуры двух типов, локализованные в наружной мембране клеточной отенки. фуккциягшли но ясна, маленькие кольцевидные структуры, по-видашому , выполняют функцию пор. а большие кольцевидные структуры представляют о обой специализированные отверстия для выхода шиш через наружную мембрану клеточной отенкв.

, .7. Известно, что элементарная оера являетоя основным промежуточным продуктом окисления многих сульфидных минералов. Изучение механизма ее бактериального окисления ш органоидном уровне является важным для оценки активности и физиологического ооотоя-иия популяция в условиях выщелачивания металлов из руд к концентратов, а также пря ее хранении шш переживании неблагоприятных условий в природных местах обитания. '

Список работ, опубликованных по теме диссертации;

1. Громова Л.А., Переверзев U.A., Караэайко Г.И. Пали ТЫо-bacillus ferrooxldane. - ЫШфО биология, 1976, т.47, выи.2, .

0.293-295. . "

2. Громок» Л.А. Новые поверхностные структура Thlobecillua ferrooxidazue. - Материалы Второй Республиканской конференции

молодых ученых. Тез.докл. Ташкент,IS78, о.23.

3. Громова Л.А., Переверзев Н./., КараваЯко Г.И. Изучение ojepoпластов ThiobaoAllus ferrooxldana. - Микробиология, 1979, ».4а, вып.4, с.689-692.

. -24.- ■

4. Переверзев H.A., Громова Д.Д., Каравайко Г.И., Маншшн A.A. Получение фрагментов клеточных стенок Thiobaclllua ferro-oxidane и их ультраструктурная организация. - Микробиология, 1981, т.60, вып.4, 0.683-683,

5. Громова Л.А*, Каравайко Г,И., Севцов A.B., Переверзев H.A. Идентификация в распределение оеры в клетках Thlobaolllue ferrooxidans. - Микробиология, 1963, Т.52, вып.З, о.45Ö-460.

6. Каравайко,Г.И., Громова JL.A., Переверзев H.A. Оприрода серосодержащего компонента и его функции в клетках тыоЪасШив iвrrooiidane* - Мшфооиология, 1983, т.52, вш.4, 0.659-562. -

Т-10Вга от 14,0.*Ш84г." Зиш 3491 Твриж 1В0 Формат e0i8V19

Р Teno графы ВАСХНИЛ Мс mt, ВиС*ри*еньевок«* пер. '31