Фенотипический и генотипический полиморфизм штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans

Агеева, Светлана Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фенотипический и генотипический полиморфизм штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фенотипический и генотипический полиморфизм штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans"

На правах рукописи

Агеева Светлана Николаевна

Фенотипический и генотипический полиморфизм штаммов Ас/сШЬюЬасШиз ^тюх'и!апв

Специальность 03.00.07. - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание учбной степени кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Кондратьева Т. Ф.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Эль-Регистан Г. И.

чл.-корр. РАН, профессор, доктор биологических наук Захаров-Гезехус И. А.

Ведущая организация: Московский Государственный Университет

им. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микробиологии

Защита диссертации состоится $ декабря 2003 года в /Ужасов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии РАН по адресу:

117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН

Автореферат разослан «_» ноября 2003 г

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Никитин Л. Е.

I //'¿4 "

' Актуальность проблемы. В процессе эволюции отдельные представители филогенетически отдалённых групп микроорганизмов приобрели способность полумать энергию за счёт окисления закисного железа, элементной серы и её восстановленных соединений или сульфидных минералов в кислых условиях среды. Это грамотрицательные бактерии родов Acidithiobacillus и Leptospirillum, грамположительные бактерии рода Sulfobacillus, а также некоторые археи: представители родов Acidianus, Metallosphaera, Sulfolobus и Fer-roplasma. В природных условиях данные микроорганизмы участвуют в процессе выщелачивания металлов из сульфидных руд и горных пород, охватывая широкий диапазон физико-химических параметров среды (рН от 0,7 до 3,5; температура от 5 до 80 °С). Сообщества этих микроорганизмов используются в биогидрометаллургических технологиях извлечения цветных и благородных металлов из сульфидных руд и концентратов, в разработку научных основ переработки которых большой вклад внесли отечественные учёные [Каравайко и др., 1972; Полькин и др., 1982].

Доминирующей бактерией в мезофильном сообществе ацидофильных хемолитотроф-ных микроорганизмов является A. ferrooxidans. Использование в качестве источников энергии широкого круга окисляемых субстратов, устойчивость к ионам тяжёлых металлов и низким значениям рН, а также высокий уровень изменчивости в экстремальных условиях среды обусловливают ведущую роль A. ferrooxidans в бактериально-химических процессах вскрытия золота или выщелачивания цветных металлов. Последнее, во многом, определило характер исследований физиологии, биохимии и генетики данного микроорганизма. Изучены особенности конструктивного и энергетического метаболизма A. ferrooxidans [Ingledew, 1982], устойчивость к ионам металлов и токсичных элементов [De et al., 1997, Sampson et al., 2001]. Подробно исследованы компоненты железоокисляющей системы A. femooxidans [Rawlings, 2001], охарактеризованы отдельные ферменты пути окисления серы и её восстановленных соединений [Sugio et al., 1987, 1988, 1989]. Идентифицировано множество генов этой бактерии, изучена их регуляция, а также кодируемые белки. Много внимания было уделено созданию рекомбинантных, с улучшенными технологически значимыми свойствами штаммов A. ferrooxidans. Однако инициированные в начале 90-х годов отечественными авторами работы [Кондратьева и др., 1993] с использованием метода пульс-электрофореза для мониторинга состава микробных популяций в технологических процессах извлечения золота или выщелачивания цветных металлов позволили прийти к заключению о бесперспективности применения в биогидрометаллургии созданных генно-инженерными методами штаммов A. ferrooxidans, как не выдерживающих в переменных по субстрату и другим параметрам среды условиях технологического процесса конкуренции с природными аборигенными штаммами.

Из природных (горные породы, месторождения сульфидных руд, рудничные воды), а также технологических сред (плотные пульпы биогидрометаллургических установок по переработке руд и концентратов) исследователями разных стран выделено большое число штаммов A. ferrooxidans. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют об их значительном разнообразии как по фенотипическим, так и генотипическим признакам. Штаммы A. ferrooxidans разного происхождения различаются по размеру генома, содержанию нуклеотидных пар Г + Ц в ДНК, степени ДНК-ДНК гомологии тотальных геномов, плазмидным профилям [Harrison, 1982; 1986; Leduc, Ferrony, 1994; Rawlings, Kusano, 1994], оптимальным для роста значениям рН и температуры, устойчивости к ионам металлов и токсичных элементов, активности окисления различных субстратов [Грудев, 1985; Pichuantes et al., 1986; Frattini et al., 2000]. Как возникло это штаммовое разнообразие, чем вызывается, какими механизмами реализуется? Какова роль штаммового полиморфизма в биогидрометаллургических процессах? Отсутствие ответов на эти вопросы свидетельствует об актуальности поставленной проблемы не только в теоретическом плане, но и в плане практической значимости.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение фенотипического и генотипического полиморфизма штаммов A. forrnnyiWany фяктпцзд Р.ралк'| его вызывающих, и механизмов возникновения. 1 рос. НАЦИОНАЛЬНАЯ |

( 'библиотека |

1 I ¿rzfcm

Задачи исследования включали: 1) изучение генотипического полиморфизма штаммов А. ferrooxidans разного происхождения и оценка филогенетической гетерогенности вида; 2) изучение фенотипических особенностей штаммов А. feптюx¡dans и динамики их адаптации к разным энергетическим субстратам; 3) анализ рестрикционных профилей хромосомной ДНК у штаммов, адаптированных к разным субстратам окисления; 4) изучение штаммового полиморфизма плазмидных профилей у А. (еггоох'кЗапв 5) анализ плазмид-ных профилей у штаммов А. Теггоох1с1ап5 с экспериментально повышенной устойчивостью к ионам металлов и у адаптированных к разным энергетическим субстратам; 6) исследование возможных механизмов внутривидовой изменчивости А. feгrooxidans и оценка роли отдельных факторов среды в существующем разнообразии штаммов.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые использован комплексный подход в исследовании штаммового полиморфизма вида А. ferrooxidans, заключающийся в изучении особенностей генотипа, фенотипа и механизмов изменчивости у одних и тех же штаммов в одинаковых условиях среды. Проведён полифазный генотипический анализ 25 штаммов А. ^ггоох'^апз, выделенных в лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии РАН из различных по минералогическому составу типов субстратов; изучены ряд ключевых фенотипических признаков некоторых штаммов (скорость роста, эффективность адаптации к разным энергетическим субстратам и активность их окисления), а также штаммовая генотипическая изменчивость А. feгroox¡dans, проявляемая на уровне хромосомной и плазмидной ДНК. В результате проведённых исследований получены дополнительные сведения о роли субстрата окисления в дивергенции штаммов А. ferrooxidans в разных экологических нишах, об изменениях в последовательности нуклеотидов в хромосомной ДНК как одном из механизмов штаммовой микроэволюции. Впервые отмечено влияние некоторых факторов среды: концентрации ионов металлов и субстрата окисления на плазмидные профили ряда штаммов А. (вггоох'^апз, что позволяет предположить участие плазмид в адаптации этой .бактерии к изменяющимся факторам среды. Впервые исследована возможность взаимодействия плазмидной и хромосомной ДНК как одного из механизмов адаптационной изменчивости А. fermoxidans. Показано, что адаптация штаммов к новым энергетическим субстратам может сопровождаться изменением локализации ^-элементов в геноме и плазмидно-хромосомными рекомбинациями. Необратимость этих процесов приводит к внутривидовой изменчивости, лежащей в основе микроэволюционных процессов, результатом которых является штам-мовый полиморфизм вида А. fenxюxidans. . , _

Результаты исследования генотипических и фенотипических. признаков различных штаммов А. ferrooxidans в зависимости от факторов среды, механизмов адаптации и регуляции активности окислительных процессов могут быть использованы при разработке стратегии управления бактериально-химическими процессами выщелачивания металлов, выработке практических рекомендаций по их интенсификации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции молодых учёных «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), Всероссийской конференции по развитию концепции микробной экологии в XXI веке, посвящённой 100-летию со дня рождения Кузнецова С. И., (Москва, ИНМИ РАН, 2000), конкурсе научно-исследовательских работ (ИНМИ РАН,'2001), 1-м и 2-м Международных Конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), XV Международной молодёжной научной конференции «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003), 15-м Международном симпозиуме по биогидрометаллургии (Греция, 2003).

Публикации. По материалам диссертации, включая тезисы, опубликовано 8 работ; 2 статьи и 2 тезисов сданы в печать.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 190 страницах машинописного текста, включают 10 таблиц и 43 рисунка. Диссертация состоит из введения, трёх глав («Обзор литературы», «Объекты и методы исследований», «Результаты и обсуждений»), Заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включаю-■ *

щего 308 наименований работ, в числе которых 38 на русском и 270 на иностранных языках

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования являлись 37 штаммов A. ferrooxidans (табл. 1), выделенных из природных или технологических сред, в том числе семь штаммов с экспериментально повышенной устойчивостью к ионам металлов. Штаммы ВКМ В-458 и ВКМ В-1160 получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов, АТСС 23270т и АТСС 19859 - из Американской коллекции типовых культур, остальные были выделены и хранятся в коллекции лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов ИНМИ РАН.

Среды и условия культивирования. Периодическое культивирование штаммов проводили на среде Сильвермана и Люндгрена (9 г/л Fe2+) [Silverman, Lundgren, 1959] при температуре 28 ± 2 °С, на качалке(150 об/мин) в колбах Эрленмейера объёмом 250 мл со 100 мл среды или стационарно в бутылях объёмом 5 л с 3 л среды при принудительном аэрировании (3 л/мин). При культивировании штаммов с повышенной устойчивостью к иЪнам металлов в среду дополнительно вносили в виде соответствующих солей 20 г/л Си2+, 70 г/л Zn2+, 50 г/л Fe2+, 3 г/л As3+, 30 г/л Ni2+. Кроме закисного железа (Fe2+), в качестве источника энергии использовали элементную серу (S0), пириты (FeS2) из месторождений Акчатау и Тулун, гравитационные золото-мышьяковые концентраты, полученные из руды Нежданинского месторождения: концентрат № 1 - цианированный и дополнительно измельченный (95 % частиц размером класса 0,044 мм), № 2 - не подвергавшийся цианированию, с размером частиц 0,074 мм, два типа концентрата, полученных из руды поверхностного и глубинного горизонтов залегания Олимпиадинского месторождения, а также медную руду Удоканского месторождения.

Адаптацию штаммов к S°, FeS2 из месторождения Акчатау и концентрату № 2 проводили путем последовательных пересевов на минеральной основе среды Сильвермана и Люндгрена с соответствующим субстратом вместо Fe2+, при соотношении твёрдой и жидкой фаз (Т: Ж) 1:100 в первом пассаже и 1: 50 - в последующих; S0 вносили из расчёта 10 г/л. Выращивание культур в каждом пассаже прекращали по достижении стационарной фазы роста, а адаптацию - по достижении максимальной скорости роста и активности окисления субстрата, не изменяющихся при дальнейших пассажах.

Под скоростью адаптации понимается минимальное число пассажей, необходимое штамму для достижения максимальной скорости роста и активности окисления субстрата, под эффективностью - максимальная величина скорости роста и активности окисления субстрата, которых достигает штамм в процессе адаптации к новому энергетическому субстрату. Коэффициент использования субстратов рассчитывали по приросту числа клеток в 1 л х10 на количество окисленного субстрата (г/л), о котором судили по количеству накопленного в среде продукта окисления (S042" в случае окисления S0 и Fe3+ в случае окисления Fe2", FeS2 и концентрата).

Количественный учёт микроорганизмов. Число клеток определяли методом прямого подсчёта в микроскопе «Reichert» (Австрия) с фазово-контрастным устройством.

Аналитические методы. Концентрацию Fe /Fe3* (г/л) в жидкой фазе определяли методом комплексометрического титрования трилоном Б [Резников и др., 1970], SO42" - тур-бидиметрическим методом [Roy, Trudinger, 1970]. Измерение pH и Eh среды проводили на иономере И-130.2М1.

Генетические и молекулярно-биологические методы. Выделение ДНК. Осаждение и промывание биомассы, а также выделение нативной хромосомной ДНК проводили, как описано ранее [Кондратьева, Каравайко, 1992]. Для экспериментов по гибридизации ДНК экстрагировали и очищали по методу Мармура [Marmur, 1961]. Плазмидную ДНК выделяли по щелочной методике [Bimboim, Doly, 1979] с некоторыми модификациями. Анализ ДНК. Нуклеотидный состав ДНК * определяли методом термической денатурации [Owen et al., 1969]. Уровень ДНК-ДНК гомологии и размер генома у штаммов* определяли мето-

* Работа проводилась совместно с к. б н. Лысенко А. М., за что автор выражает благодарность.

дом оптической реассоциации [De Leu et al., 1970]. Структуру хромосомной ДНК, расщеплённой эндонуклеазами рестрикции Xba\, Smi\ и Вси\ (40 ед / 30 мкл), анализировали пульс-электрофорезом (ПФ) [Кондратьева, Каравайко, 1992]. Плазмидную ДНК анализировали методом электрофореза (ЭФ) [Маниатис и др., 1984]. Перед ЭФ препараты плаз-мидной ДНК очищали от её линейных форм обработкой Exolll (25 ед / 10 мкл) или кольцевых форм с одноцепочечным разрывом прогреванием 2 мин при 95 °С [Martin et al., 1981]. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК." Одиночные расщепления проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции EcoRI, EcoRV, Xho\, Pstt, Pvull, HincftU, BamHI, SalI, Sg/ll, Kpn\, DraI, Hpal, Xbai, Hind\\\ (10 ед / мкп). Двойные расщепления - сочетаниями ферментов: Sa/I + EcoRI, Sa/l + Psil, Sail + Bg/ll, Sa/I + Oral, Sa/I + PvuW, EcoRI + Dra I, Pst\ + Oral, Bg/ll + Dra I, Kpni + Oral, Dra I + Pvull, Xbai + Hindi II, Xho\ + EcoRI, EcoRI + Psil, EcoRI + Sg/ll, EcoR + Pvull, Psil + Бд/ll, Sg/ll + Pvull. Получение радиоактивного зонда. Плазмиду pTFK2 метили 32Р [dATP] (удельная активность 5000 Ku/mM), используя фрагмент Кпёнова ДНК-полимеразы Е. coli, как описано в [Маниатис и др., 1984]. Сау-зерн-блотт гибридизация." В экспериментах использовали гели с разделёнными методом ПФ Хйа1-фрагментами хромосомной ДНК исследуемых штаммов. Перенос ДНК на мембраны (Gene Screen Plus, Du Pont, США), предгибридизацию, гибридизацию мембран с меченым ДНК-зондом и последующую отмывку мембран проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя мембран.

Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК.*" Амплификацию и секвенирование генов 16S рРНК исследуемых штаммов проводили, используя универсальные для большинства прокариот праймеры [Edwards et al., 1989]. Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл: 94 °С - 3 мин (денатурация ДНК), 50 °С - 3 мин (отжиг праймеров), 72 °С - 3 мин (элонгация); последующие 5 циклов: 94 °С -30 с, 50 °С - 2 мин, 72 °С - 30 с; последние 30 циклов: 94 °С - 30 с, 40 °С - 30 с, 72 °С - 30 с, окончательная полимеризация: 72 °С - 7 мин. Продукты ПЦР анализировали методом ЭФ в 1 % геле легкоплавкой агарозы (ЛПА). Выделение и очистку фрагментов генов 16S рРНК из ЛПА проводили с использованием набора Wizard PCR Preps (Promega, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя. Секвенирование очищенных фрагментов генов 16S рРНК проводили по методу Сэнгера [Sanger et al., 1977].

Филогенетический анализ. Анализ последовательностей генов 16S рРНК. Секве-нированные последовательности генов 16S рРНК были выровнены с последовательностями референтных штаммов ближайших микроорганизмов с использованием программы CLUSTAL W [Thompson et al., 1994]. Построение бескорневого филогенетического дерева проводили с помощью neighbor-joining алгоритма, реализованного в пакете программ TREECON [Van de Peer, De Wachter, 1994]. Анализ сходства структуры хромосомной ДНК. Профили Xbal-рестрикции хромосомной ДНК штаммов, проанализированные методом ПФ, были формализованы по принципу наличие / отсутствие фрагментов определённой длины, и их сходство проанализировано с помощью maximum parsimony алгоритма, реализованного в пакете программ PHYLIP [Felsenstein, 1989]. Анализ сходства геномов штаммов по результатам ДНК-ДНК гибридизации. Построение дендро-граммы проводили на основании приближённой матрицы сходства, в которой недостающие значения вычислялись, исходя из средних для кластера. Дерево по приближённой матрице строили с помощью кластерного анализа UPGMA, реализованного в пакете программ PHYLIP [Felsenstein, 1989].

" Работа проводилась совместно с сотрудником института биоорганической химии РАН им М М Шемякина и Ю. А Овчинникова к. б н Данилевичем В. Н , за что автор выражает благодарность.

"" Работа проводилась совместно с к. б. н Туровой Т. П. и научным сотрудником центра «Биоинженерия» РАН Колгановой Т. В . за что автор выражает благодарность

Математико-статистический анализ данных. При анализе экспериментальных данных рассчитывали ошибку средней арифметической по Петерсу с использованием фактора Молденгауэра [Монцевичюте-Эрингене, 1964], либо по общепринятым формулам [Зайцев, 1973; Лакин, 1990]. Для рассчётов использовали программу STATIST [Сапегин, 2001]. Достоверность биометрических показателей оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, принимая достаточным 95 % доверительный уровень.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение генотипического полиморфизма штаммов A. ferrooxidans и оценка филогенетической гетерогенности вида

1.1. Экологическое разнообразие штаммов A. ferrooxidans

В работе по изучению штаммового генотипического полиморфизма A. ferrooxidans использовали 25 штаммов разного происхождения (табл. 1). Большинство из них были выделены из руд месторождений различных географических зон, концентратов сульфидных руд и продуктов их переработки или из плотных пульп биогидрометаллургических установок бактериально-химических технологий извлечения золота или выщелачивания цветных металлов. Сульфидные руды характеризуются разнообразием состава минералов, их количественных соотношений, концентраций накапливаемых в процессе их окисления в жидкой фазе ионов металлов и токсичных элементов. В связи с этим источники выделения штаммов можно разделить на три группы: золото-мышьяковые руды и концентраты, основными сульфидными минералами в которых являются пирит (FeS2), арсенопирит (FeAsS), а иногда - пирротин (FeS); медно-цинковые или медные руды и концентраты, характеризующиеся довольно сложным составом и являющиеся, преимущественно, полиметаллическими, а также другие источники (угольные месторождения, шахтные воды и др.), содержащие, в основном, пирит. Очевидно, что в природе изучаемые штаммы A. ferrooxidans находились в разных экологических условиях.

1.2. Анализ сходства хромосомной ДНК штаммов A. ferrooxidans методом пульс-электрофореза

Ранее было показано, что штаммы A ferrooxidans разного происхождения значительно различаются по структуре хромосомной ДНК, характеризуясь каждый индивидуальным образцом Xbal-рестрикции [Кондратьева и др., 1993]. Изучение методом ПФ особенностей структуры хромосомной ДНК у 20 исследуемых штаммов A. ferrooxidans с последующим анализом сходства их рестриктных профилей обнаружили генотипическую гетерогенность штаммов: изученная группа распалась на три кластера (рис. 1).

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное по результатам анализа сходства штаммов А. fer-гоохШапв по размеру фрагментов, образующихся при расщеплении их хромосомной ДНК эндонуклеазой рестрикции ХЬа{.

Таблица 1. Штаммы А. (егтохШапз и характеристика субстратов их выделения

Тип субстрата Штамм Место выделения Минералогический состав субстрата

1. Золотосодержащие пиритно- арсе-нопиритные руды и концентраты ТРВк* 4 ТРО*4 ТР1М-сГ 4 ТРМ* ТР-1292* ТР-97* ТРТ*4 ТРТ-92* ТРО*4 Казахстан, Бакырчикское месторождение Россия, Олимпиадинское месторождение Россия, Нежданинское месторождение Колыма, Майское месторождение Россия, Олимпиадинская руда Сибирь Киргизия, Кумторское месторождение Казахстан Россия, Дарасунское месторождение РеЭг, РеАэЗ, Сив, СиРеБ2 Ревг, РеАэв, ЗЬ2Зз, Рев, гпЭ, РЬБ, СиРеЭг РеЭг, РеАвЭ, глЭ, СиРеБ2, РЬЭ Ревг, РеАэБ, ЗЬ2Зэ Ревг, РеАвв, Рев, ЗЬгЭз, РЬЭ, гпв, СиРевг РеЭг, РеАэБ, Рев РеЭг, РвАвв, Рев Ревг, РеАэЭ, Рев Ревг, РеДэв, СиРевг, гпЭ, РЬЭ

2. Медно-цинковые и медные р^ды и концентраты ТРГ * ТР\/-1* 4 трьг*4 ТРЬЗ* ТРЭ*4 ТРв* 4 ВКМ В-1160* ТРЫ* 4 тру. А ТРР-15* * ТР-16* ТРКт 4 триа-2 * ТРШ-З 4 ТРисИ 4 Индия, цинковые хвосты Средний Урал, Волковское месторождение Средний Урал, хвосты цикла доводки медно- пиритного промпродукта Средний Урал, медно-цинковая руда Учалинско- го ГОКа Средний Урал, Сафьяновские блеклые руды Южный Урал, Гайское месторождение Россия, Урал, Сибайская руда, рудничные воды Алтай, Николаевское месторождение Югославия, медное месторождение Перу, медное месторождение Канада Камчатка, Шанучское месторождение Сибирь, Удоканская руда То же Россия, Урал, Учалинское месторождение РеЭг, глв, РеЭ СиРевг, Си2Э, Си5Ре34, медные оксиды 2пЗ, РеЭг, РеАвв, СиРевг, Рев, блеклая РУДа гпЭ, Ревг, РеАэЭ, СиРеЭг, Рев, блеклая РУДа Ревг, гпв, СиРевг РеЭг, СиРеЭг, Си23, Си5Ре34, оксиды гпЭ, Ревг, СиРеЭг, Сив, Си23, Си5Ре34 Ревг, СиРеЭг, гпЭ, РЬЭ, Си2Э, СиЭ, оксиды Рев, РеЭг, СиЭ, СигЭ, Си6Ре34, Си РеЭ2 СиРеЭг, Си5Ре34, СигЭ, СиЭ, РеЭг РеЭг, СиРевг, Си23, СиЭ, Си5Ре34, Рев, (N1, Ре)в38 СиРевг СиРевг Тоже гпв

3. Шахтные воды ТРИ-1 4 ТРР-2* Украина, Донбасс, шахтные воды о. Кунашир, железистый ручей на склоне вулкана РеЭг РеЭг, Ре2*

4. Пиритизирован-ные угли ВКМ В-458*4 Россия, рудничная вода угольного месторождения Яевг

5. Активный ил сточных вод ТРУУс* 4 Россия, Московский водоканал РЬ'\ Си**, гп"

Штаммы с экспериментально повышенной устойчивостью к ионам металлов

ТЯВк-Си А ТР1-Ре ж ТВМ-Си А ТРАэ2 А ТР№-3 * В-458-Си А Получен из штамма ТЯВк, устойчив к 20 г/л Си''* Мутант, получен из штамма ТЯ!, устойчив к 50 г/л Ре3* Получен из штамма ТРУ, устойчив к 70 г/л 1п2* Получен из штамма ТР\/-1, устойчив к 17,5 г/л Си2* Получен из штамма В-458, устойчив к 4 г/л Ав3* Получен из штамма В-458, устойчив к 40 г/л Получен из штамма В-458, устойчив к 15 г/л Си2+

Коллекционные штаммы

АТСС 23270т* АТСС 19859*

Примечание. Звёздочкой (*) отмечены штаммы А. Ьеггоох1с1ап5, использованные в работе по изучению штаммового генотипическо-го полиморфизма вида А. 1еггоох1с1ап8. Треугольником (А) отмечены штаммы, у которых были изучены плазмидные профили.

Таблица 2. Параметры роста и окисления закисного железа у штаммов А. /елтаох/Уалв

Штамм Конечные значения рН / ЕЬ, (мВ) Прирост числа клеток в 1 мл х108 за сутки Активность окисления Ре2", г/(лч) Удельная скорость роста ЦтаХ! Ч Время удвоения клеток (а, ч Коэффициент использования субстрата

ТР1М-с) 2,5/805 4,7 0,200 0,141 ±0,006 4,9 ±0,2 0,99

ТРЬ2 2,45/800 4,2 0,186 0,146 ±0,009 4,7 ±0,3 0,95

ТРВк 2,5/800 3,5 0,175 0,114 ±0,006 6,1 ±0,4 0,84

ТЯО 2,45/795 3,2 0,171 0,112 ±0,007 6,2 ±0,4 0,78

ТП/-1 2,5/798 2,8 0,168 0,107 ±0,004 6,5 ±0,2 0,69

1.3. Нуклеотидный состав ДНК и размер генома у штаммов А. ЪггоохШапз

Нуклеотидный состав ДНК исследуемых штаммов А. 1епх>охШап5 варьировал от 56,1 до 58,1 мол.% Г+Ц, а размер генома - от 2,2 до 2,8 хЮ9 Да. Наиболее часто встречаемый размер генома составлял 2,3 - 2,4 хЮ9 Да, содержание нуклеотидных пар Г + Ц в ДНК -порядка 57 мол.%.

1.4. Анализ сходства тотальных геномов штаммов А. ГвггоохИапв методом ДНК-ДНК гибридизации

Анализ сходства тотальных геномов 23 штаммов А. ferrooxidans с использованием в качестве реперных 17 из них выявил высокий уровень генотипической гетерогенности иламмов. По результатам межштаммовой гибридизации они разделились на четыре ге-номовара*, в каждый из которых вошли штаммы, характеризующиеся высокой степенью геномного сходства (рис. 2).

геномовар 2

Рис. 2. Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов А. Ьег-гоох!бап8, основанная на данных ДНК-ДНК гибридизации тотальных геномов. Шкала соответствует уровням геномного сходства.

геномовар 1

геномовар 3

геномовар 4

I-1-1

« so 100

Первый геномовар включал штаммы АТСС 23270т, АТСС 19859, TFBk и TF-1292, уровень геномного сходства которых составлял 59 - 96 %; второй - штаммы ВКМ В-1160, TFM, TFR-2, TFO, TFN-d и TFT, характеризующиеся 86 - 97 % геномного сходства; третий -штаммы TFL-2 и TFY, с уровнем геномного сходства 92 % и, наконец, четвёртый - штаммы TF-16, TFN, TFD, TFI и TFT-92, с уровнем сходства тотальных геномов 50 - 99 %. Штаммы TFWc, TFG, ВКМ В-458, TFV-1, TFS и TFP-15 оказались за пределами выделенных геномоваров, поскольку уровень их геномного сходства как друг с другом, так и с представителями из геномоваров, составлял от 13 до 43 %.

1.5. Филогенетический анализ генов 16S рРНК и оценка филогенетической гетерогенности вида

Для оценки филогенетической гетерогенности вида A. ferrooxidans были определены почти полные нуклеотидные последовательности (около 1450 нуклеотидов) генов 16S рРНК у пяти штаммов A. ferrooxidans - представителей каждого из геномоваров, а в сравнительном анализе - использованы данные Банка Генов (Gen Bank) о последовательнос-

' Для разграничения геномоваров [игетд й а1,1995; (ЗоввеЬ-Мога, Атапп, 2001] используется показатель сходства геномов не ниже 50 % гибридизации [\Zandamme е1 а1., 1996].

тях нуклеотидов генов 16S рРНК большой группы штаммов A. ferrooxidans и ряда других представителей рода Acidithiobacillus.

Согласно данным филогенетического анализа, большинство штаммов A. ferrooxidans, включая типовой, образовали на построенном дереве единый филогенетический кластер, что свидетельствует об их филогенетическом единстве и, следовательно, общности происхождения. Однако внутри основного кластера штаммы A. ferrooxidans разделились на четыре филогенетические группы. Представители каждого из геномоваров, войдя в состав основного филогенетического кластера, принадлежали к разным филогенетическим группам- АТСС 23270т - к группе I, TFN-d - к группе И, TFY, TFI и TFD - к группе III. Таким образом, генетическая гетерогенность вида A. ferrooxidans обнаруживается уже на уровне сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, которые в значительной степени консервативнее последовательностей тотального генома бактерий. Распределение штаммов по филогенетическим группам, в целом, коррелировало с разделением их на геномовары, за исключением случая, когда представители двух разных геномоваров (TFY и TFI, TFD) по результатам филогенетического анализа вошли в одну филогенетическую группу. Полученные данные позволяют говорить о существовании нескольких уровней генотипической гетерогенности вида A. ferrooxidans, один из которых соответствует филогенетическим группам, а другой - геномоварам.

Какие факторы среды вызывают генотипический полиморфизм штаммов А. ferrooxidans? Есть ли связь между разнообразием мест обитания и существующим многообразием штаммов? Очевидна необходимость более детальных исследований генотипи-ческих и фенотипических признаков различных штаммов A. fenooxidans во взаимосвязи с анализом субстратов их выделения.

2. Изучение фенотипических особенностей штаммов A. ferrooxidans

Для изучения фенотипических особенностей штаммов A. ferrooxidans с целью оценки корреляции фенотипических свойств с генотипическим полиморфизмом и с условиями среды, в которых протекала их микроэволюция, были взяты штаммы TFV-1, TFN-d, TFBk, TFO и TFL-2, выбор которых объяснялся следующим: 1) штаммы были выделены из разных по минералогическому составу типов субстратов, определяющих условия их жизнедеятельности в природных экологических нишах (предысторию штаммов): золото-мышьяковых высокосернистых руд, содержащих FeS2 и FeAsS (штаммы TFN-d, TFBk) или ещё FeS (штамм TFO), и характеризующихся высокой концентрацией накапливаемых в процессе их окисления в жидкой фазе ионов железа и мышьяка; медно-цинковых руд (штамм TFL-2), с преимущественным содержанием FeS2, ZnS, CuFeS2, а в растворах - ионов меди, цинка и железа; из бедных медных руд и отвалов (штамм TFV-1) с низким содержанием ионов металлов в растворах; 2) по результатам генотипического анализа штаммы входили в разные кластеры (рис. 1), либо принадлежали к разным геномоварам (рис. 2), а штамм TFV-1 относился к группе значительно дивергировавших штаммов A. ferrooxidans', 3) штаммы были выделены из технологических сред при испытаниях различных бактериально-химических технологий извлечения золота или выщелачивания цветных металлов*. Производственные штаммы являются наиболее активными в окислении сульфидных руд, и изучение их фенотипических свойств, важнейшими из которых, обеспечивающими конкурентоспособность в экстремальных условиях технологического процесса, являются скорость роста, активность окисления субстрата и эффективность переключения на окисление нового субстрата, имеет практическое значение.

2.1. Окисление Fe2*

Поскольку для A. ferrooxidans наиболее легко окисляемым источником энергии является закисное железо и оно входит в состав сульфидных минералов - субстратов выделения штаммов, была изучена динамика их роста на среде с данным субстратом. Исследуемые

' Идентичность промышленных штаммов с выделенными из соответствующих природных субстратов была установлена по структуре хромосомной ДНК

штаммы различались по скорости роста и активности окисления закисного железа (табл. 2), что указывает на их индивидуальные фенотипические особенности. Полученные данные близки к известным в литературе для аналогичных периодических условий [McGoran et al.,1969; Kelly, Jones, 1978]

2.2. Адаптация штаммов A. ferrooxidans к новым энергетическим субстратам

Штаммы TFV-1, TFN-d, TFBk, TFO и TFL-2, длительно культивировавшиеся на среде с закисным железом, были использованы в качестве инокулята при изучении динамики их адаптации к элементной сере, пириту и золото-мышьяковому концентрату, содержащему смесь сульфидных минералов. Все эти субстраты являются характерными как для сульфидных руд, так и для пульп в технологическом процессе. Однако ключевые фенотипические признаки разных штаммов А. ferrooxidans при оценке скорости и эффективности их адаптации к этим субстратам не изучены, не ясны пределы адаптации.

2.2.1. Адаптация штаммов А. ferrooxidans к элементной сере

Активность роста исследуемых штаммов на среде с элементной серой и активность окисления субстрата показаны на рис. 3(1), 4; кинетические параметры роста приведены в табл. 3. При переключении метаболизма с окисления закисного железа на окисление элементной серы скорость роста штаммов и активность окисления субстрата - низкие. Наиболее активным в первом пассаже, согласно данным по удельной скорости роста и времени удвоения клеток, оказался штамм TFO. Затем, по убыванию активности, идут штаммы TFN-d, TFL-2 и TFBk и, наконец, штамм TFV-1. С ростом штаммов коррелировала активность окисления субстрата (рис. 4а). Однако наиболее высокий коэффициент его использования был отмечен у штамма TFBk, наименьший - у TFO (табл. 3). Штамм TFO относительно меньшую часть энергии, полученной при окислении субстрата, расходовал на синтез биомассы.

При повторных пересевах скорость роста штаммов и активность окисления элементной серы закономерно возрастали и достигли для каждого из них индивидуальных максимальных значений в пятом пассаже (рис. 3(16), 46). Очевидно, это был предел адаптационных возможностей штаммов, генетически обусловленный порог адаптации, поскольку скорость их роста и активность окисления субстрата не изменялись при дальнейших пассажах. Следует отметить, что продолжительность накопления максимальной биомассы в каждом пассаже и выход культуры в стационарную фазу были индивидуальны для каждого штамма. У адаптированных штаммов резко возросла удельная скорость роста и снизилось время генерации. Активность окисления субстрата также возросла и была характерной для каждого штамма. Наибольшая эффективность адаптации к элементной сере была показана для штамма TFO, наименьшая - для TFV-1. Интересно, что у адаптированных штаммов снизился коэффициент использования субстрата, то есть возросла активность его холостого окисления. Это позволяет предположить, что увеличение активности окисления субстрата в процессе адаптации опережает увеличение активности роста культуры на новом субстрате. Наибольшей активностью холостого окисления элементной серы обладал штамм TFO, выделенный из субстрата с её высоким содержанием.

2.2.2. Адаптация штаммов А. ferrooxidans к пириту

При изменении в среде источника энергии с закисного железа на пирит наблюдался слабый рост культур, и активность окисления субстрата была низкой (рис. 3(2а), 5(1 а)). Тем не менее, в скорости роста бактерий и активности окисления пирита наблюдались штаммовые различия (табл. 4). Наибольшей активностью отличался штамм TFN-d, наименьшей - штамм TFV-1. Остальные штаммы занимали промежуточное положение. Тот же порядок в активности штаммов сохранился у адаптированных культур (рис. 3(26), 5(16)). Как и в случае окисления элементной серы, максимальная активность роста штаммов и активность окисления пирита были достигнуты в пятом пассаже. У адаптированных штаммов возросла удельная скорость роста, увеличилась активность окисления

субстрата, однако снизился коэффициент его использования для синтеза биомассы. Последнее свидетельствует о том, что адаптированные к пириту штаммы относительно большую часть субстрата, чем неадаптированные, окисляли "вхолостую".

2.2.3. Адаптация штаммов А. ТеггоохШапв к сульфидному концентрату

Гравитационный золото-мышьяковый концентрат руды Нежданинского месторождения, использовавшийся в качестве источника энергии при адаптации штаммов, содержит, преимущественно, ЯеЭг и РеАвБ. В этой электрохимической паре РеАзЭ, как минерал с более низким электродным потенциалом, а потому занимающий позицию анода, окисляется бактериями в первую очередь. В связи с этим следует говорить об адаптации штаммов, прежде всего, к арсенопириту и только затем - к пириту. При окислении концентрата в жидкой фазе накапливаются ионы Ре3+, Аэ6* и Аэ3*, последние из которых обладают для А. ferroox¡dans наибольшим токсическим действием. То есть, при адаптации к концентрату бактерии сталкиваются с большим разнообразием факторов, чем при адаптации к элементной сере или только к пириту.

Динамика роста исследуемых штаммов и активность окисления концентрата показаны на рис. 3(3) и 5(2). Параметры роста штаммов приведены в табл. 5. Как и в случае окисления пирита, на концентрате наблюдался тот же порядок в распределении штаммов по их активности. При этом кинетические параметры роста - ртах и были довольно близкими по своим значениям к параметрам роста штаммов на среде с пиритом, однако коэффициент использования концентрата был ниже коэффициента использования пирита. При повторных пересевах скорость роста клеток и активность окисления сульфидных минералов концентрата возрастали и достигли максимальных значений для штаммов ТРЫ-с!, ТР1--2, ТЯО и ТРВк через пять, а для штамма ТЯ\/-1 - через семь пассажей (рис. 3(36), 5(26)). Наибольшей эффективностью адаптации к золото-мышьяковому концентрату характеризовался штамм ТЯЫ-с! , выделенный из этого концентрата, то есть аборигенный штамм. Следует отметить, что в результате адаптации исследуемых штаммов к концентрату коэффициент его использования адаптированными культурами, по сравнению с исходными, практически не изменился. Возможно, это объясняется тем, что трёхвалентное железо, по образованию которого судили об эффективности использования концентрата, не является единственным продуктом его окисления

Таким образом, результаты исследования динамики адаптации штаммов А. ferroox¡dans к разным субстратам окисления показали, что при изменении источника энергии в среде на каждом из новых субстратов появляется свой шгамм-«лидер», характеризующийся наибольшей эффективностью адаптации к новому источнику энергии. Штаммовые различия в эффективности адаптации, вероятно, могут быть обусловлены либо различной активностью ферментов, ответственных за окисление субстрата и эффективность его использования для синтеза биомассы, либо различными уровнями регуляции соответствующих генов. ___

Анализ полученных данных позволил отметить корреляцию адаптационных возможностей штаммов с их предысторией - существованием в различных экологических нишах, на разных по минералогическому составу типах субстратов. Так, у штаммов ТР1Ч-с1, ТРВк и ТЯО, выделенных из близких по составу субстратов, скорость адаптации была одинаковой (5 пассажей), однако её эффективность - разной. На среде с элементной серой наибольшей активностью отличался штамм ТРО, выделенный из концентрата руды, богатой пирротином, при окислении которого в жццкой и твёрдой фазах накапливаются элементная сера и промежуточные серосодержащие продукты. Этот штамм оказался менее активным в окислении закисного железа, пирита и концентрата. Штамм ТЯМ-с!, выделенный из концентрата руды Нежданинского месторождения, эффективнее других штаммов переключался с окисления закисного железа на данный субстрат, характеризовался наибольшей активностью роста и активностью его окисления. И хотя штаммы ТРО и ТРВк также были выделены из золото-мышьяковых концентратов, полученных, однако, из сульфидных руд других месторождений, они уступали штамму ТР1М-с! по кинетическим па-

Прирост числа клеток (х10*) в 1 мл за сутки

35 3.0 2.5 20 1 5 10 05 00 —

Рис. 3. Рост исходных (а) и адаптированных (б) штаммов А. ¡еггоохИапв на среде с б" (1), Ревя (2) или концентратом (3).

[ЭО«2! г I (л-сут)

■ ТРУП □ ТРМ-с]

ЩТРВ-к □ ТРО

ПТЬ-2

Рис. 4. Активность окисления Э0 исходными (а) и адаптированными (б) штаммами А. fenxюxidans.

^е ], г/ (л-сут)

Рис. 5. Активность окисления Яевг (1) и концентрата (2) исходными (а) и адаптированными (б) штаммами А. fвrrooxШans.

< • ' »

Таблица 3. Параметры роста и окисления элементной серы у штаммов А. IеггоохШапв

Штамм Mm«, ч'1 Время удвоения клеток, ч Коэффициент использования субстрата

исходным штамм адаптированный штамм исходный штамм адаптированный штамм исходный штамм адаптированный штамм

TFO 0,025 ± 0,002 0,059 ± 0,002 27,7 ±2,0 11,7 ±0,4 1,39 1,13

TFN-d 0,016 ± 0,001 0,054 ± 0,003 43,3 ±1,2 12,8 ±0,7 2,01 1,38

TFL-2 0,015 ±0,001 0,052 ± 0,002 46,2 ±3,3 13,3 ±0,5 2,17 1,43

TFBk 0,012 ±0,001 0,046 ± 0,003 57,8 ±5,1 15,1 ±1,0 3,77 2,05

TFV-1 0,010 ±0,001 0,030 ±0,002 69,3 ±5,0 23,1 ±1,4 1,73 1,37

Таблица 4. Параметры роста и окисления пирита у штаммов А. Шгоох'кЗапв

Штамм Mm«, Ч"1 Время удвоения клеток, ^ ч Коэффициент использования субстрата

исходный штамм адаптированный штамм исходный штамм адаптированный штамм исходный штамм адаптированный штамм

TFN-d 0,012 ± 0,002 0,034 ± 0,002 57,8 ± 6,6 20,4 ±0,9 2,81 1,86

TFL-2 0,011 ±0,001 0,030 ± 0,001 63,0 ± 5,7 23,1 ±0,7 3,65 2,16

TFO 0,010 ±0,001 0,028 ± 0,002 69,3 ± 6,2 24,8 ±1,6 3,22 2,01

TFBk 0,009 ± 0,001 0,027 ± 0,002 77,0 ± 1,1 25,7 ±1,6 3,66 1,91

TFV-1 0,007 ± 0,001 0,026 ± 0,002 99,0 ±2,1 26,7 ± 1,9 1,51 1,14

Таблица 5. Параметры роста и окисления золото-мышьякового концентрата у штаммов А. ГеггоохМапэ

Mmax Время удвоения клеток, ч Коэффициент использования субстрата

Штамм исходный адаптирован- исходный адаптирован- исходный адаптирован-

штамм ный штамм штамм ный штамм штамм ный штамм

TFN-d 0,014 ±0,001 0,035 ± 0,002 49,5 ±3,2 19,8 ± 1,0 2,48 2,33

TFL-2 0,012 ±0,001 0,028 ±0,002 57,8 ±6,1 24,8 ±1,6 1,83 2,08

TFO 0,009 ± 0,001 0,026 ±0,001 77,0 ±4,1 26,7 ±1,2 1,85 1,85

TFBk 0,008 ± 0,001 0,025 ± 0,002 86,6 ± 4,4 27,7 ±2,0 1,61 1,78

TFV-1 0,007 ± 0,001 0,027 ± 0,002 99,0 ±4,2 25,7 ± 1,7 1,33 1,51

раметрам роста и активности окисления сульфидных минералов концентрата даже после периода адаптации. По-видимому, существуют более тонкие механизмы регуляции этих процессов, связанные с кристаллохимическими особенностями сульфидных минералов, их соотношениями и т. д. Наименьшей активностью окисления новых субстратов в процессе адаптации к ним обладал штамм TFV-1, выделенный из бедной, содержащей только сульфидные минералы меди, забалансовой руды Волковского месторождения.

Проведенные исследования показали, что каждый штамм достигал определённого, генетически обусловленного порога адаптации при переключении метаболизма с окисления закисного железа на новый энергетический субстрат. Полученные данные свидетельствуют об определенной норме реакции генома у каждого из штаммов А. ferrooxidans, прежде всего, на используемый субстрат, и, вероятно, другие факторы среды.

3. Изучение особенностей структуры хромосомной ДНК у штаммов А. ferrooxidans, адаптированных к разным энергетическим субстратам

Фенотипический полиморфизм штаммов А. ferrooxidans, как результат их адаптации к конкретным факторам среды, безусловно, является результатом активности регулятор-ных систем генома. Как в природе, так и технологических условиях, субстрат не является стабильным параметром среды. Состав его постоянно меняется, и микроорганизмы должны обладать активными механизмами регуляции процессов его окисления. Анализ методом ПФ структуры хромосомной ДНК у ряда штаммов А. ferrooxidans, адаптированных к разным энергетическим субстратам, ранее позволил выявить её лабильность под влиянием данного фактора среды [Кондратьева и др., 1996]. Интересным фактом явилось обнаружение корреляции между реакцией геномов штаммов на изменение источника энергии в среде и степенью сложности субстрата, к которому штаммы адаптировались в природе. Было высказано предположение, что в ходе эволюции на сложных многокомпонентных субстратах некоторые штаммы А. ferrooxidans могли приобрести дополнительные механизмы регуляции активности окисления различных источников энергии и большую способность изменяться под влиянием факторов среды. Один из таких механизмов, возможно, включает обратимые изменения в нуклеотидной последовательности хромосомной ДНК [Кондратьева, Каравайко, 1997]. С учётом сказанного, представляло интерес изучение структуры хромосомной ДНК у исследуемых штаммов А. ferrooxidans, адаптированных к разным энергетическим субстратам.

На рис. 6 представлены образцы Xbal-рестрикции хромосомной ДНК штаммов TFV-1, TFN-d, TFBk, TFO и TFL-2, выращенных на среде с закисным железом. Анализ изменчивости структуры их хромосомной ДНК при адаптации к новым энергетическим субстратам дал следующие результаты.

У штамма TFV-1 в процессе адаптации к элементной сере или пиритам разных месторождений изменений в структуре хромосомной ДНК, расщепленной эндонуклеазой рестрикции ХЬа\, отмечено не было. Стабильность её структуры была подтверждена рестрик-ционным анализом с применением других эндонукпеаз рестрикции: Beul и Sm/1. При адаптации штамма TFV-1 к пиритно-арсенопиритному концентрату № 2 руды Нежданинского месторождения в образце Xbal-рестрикции адаптированной культуры была выявлена новая полоса, состоящая из фрагментов ДНК размером 67 тпн (тысяч пар нуклеотидов), отсутствующая в образце рестрикции хромосомной ДНК исходного штамма, выращенного на среде с закисным железом.

Адаптация штаммов TFN-d и TFO к элементной сере, пириту из месторождения Тулун или концентрату № 2, а штамма TFL-2 к пириту и концентрату, не вызвала изменений в структуре их хромосомной ДНК. Однако длительное культивирование штамма TFN-d на среде с цианированным и дополнительно измельченным концентратом (№1) привело к видимым на электрофореграмме изменениям в структуре хромосомной ДНК адаптированной культуры. В образце Xbal-рестрикции отмечено присутствие двух новых полос, состоящих из фрагментов размером 153 и 134 тпн, а также отсутствие полос, состоящих из фрагментов размером 120, 95 и 86 тпн (рис. 7), присутствующих в образце Xbal-

рестрикции исходного штамма. Изменения носили обратимый характер, исчезая при пассировании штамма на среде с закисным железом.

У штамма TFBk, как и TFN-d, смена в процессе адаптации субстрата окисления с закис-ного железа на концентрат №2 не сопровождалась изменениями в структуре хромосомной ДНК адаптированной культуры, тогда как адаптация к концентрату №1 привела к изменениям в образце Xbal-рестрикции этого штамма. На электрофореграмме Xbal- расщеплённой ДНК адаптированной культуры была выявлена новая полоса, состоящая из фрагментов размером 177 тпн, и обнаруживалась полоса, состоящая из фрагментов размером 158 тпн (рис. 8, дорожка 2), отсутствующая в образце Xbal-рестрикции исходной культуры (рис. 8, дорожка 1). Изменения числа и размеров образующихся при Xbal расщеплении фрагментов ДНК были отмечены у штамма TFBk в процессе его длительного культивирования на среде, содержащей в качестве единственного источника энергии медную руду Удоканского месторождения. В образце Xbal-рестрикции было показано наличие новой полосы, состоящей из фрагментов размером 175 тпн. Смена в процессе адаптации окисляемого субстрата с закисного железа на пирит из месторождения Тулун не вызывала изменений в структуре хромосомной ДНК этого штамма.

Не исключено, что в инициации у A. ferrooxidans изменений в структуре хромосомной ДНК значительную роль играют физико-химические особенности окисляемого субстрата. Согласно полученным на примере штаммов TFN-d и TFBk данным, их геном неоднозначно реагирует на пиритно-арсенопиритные концентраты, полученные из руды одного и того же месторождения. Очевидно, в результате цианирования золота в химическом составе концентрата № 1 руды Нежданинского месторождения произошли изменения. Кроме того, данный концентрат был дополнительно измельчен, что привело к более быстрому и полному бактериально-химическому окислению входящих в его состав минералов. По-видимому, возможны более тонкие взаимодействия между микроорганизмом и окисляемым субстратом, а также существенная роль физико-химических или кристаллохимиче-ских особенностей субстрата в инициации генетических изменений.

Влияние изменения минерального состава пиритно-арсенопиритного концентрата на изменчивость структуры хромосомной ДНК A. ferrooxidans было показано и на примере концентрата руды Олимпиадинского месторождения. Из концентрата сульфидной руды более глубоких горизонтов залегания, характеризующейся, в отличие от руды поверхностного залегания, меньшей степенью окисленности входящих в её состав минералов и повышенным содержанием сурьмы, был выделен штамм TFO-2 с измененной, по сравнению со штаммом TFO, выделенным из смешанных поверхностных руд, структурой хромосомной ДНК (рис. 9). На электрофореграмме Xbal-рэсщепленной ДНК штамма TFO-2 отмечено появление двух дополнительных полос, состоящих из фрагментов размером 180 и 171 тпн, а также видно относительное уменьшение интенсивности свечения полосы, содержащей фрагменты размером 100 тпн.

Таким образом, анализ экспериментальной изменчивости структуры хромосомной ДНК у исследуемых штаммов A. ferrooxidans, подтвердив ранее известные данные, показал, что субстрат окисления является одним из факторов среды, вызывающих у A. ferrooxidans появление в структуре её хромосомной ДНК обратимых изменений. Те же механизмы, лежащие в основе экспериментальной изменчивости штаммов, очевидно, задействованы и в природе. В процессе микроэволюции штаммов в различных экологических нишах: на разных энергетических субстратах - рудах, различающихся качественным составом и количественными соотношениями сульфидных минералов, концентрацией накапливаемых в процессе их окисления в жидкой фазе ионов металлов и токсичных элементов, изменения в нукпеотидной последовательности хромосомной ДНК, способствующие адаптации к данным конкретным условиям среды, наследственно закреплялись. Подтверждением этому может служить выделение из горизонтов поверхностного и глубинного залегания руды Олимпиадинского месторождения двух родственных штаммов TFO и TFO-2. Возникновение необратимых изменений в хромосомной ДНК A. ferrooxidans под воздействием отдельных факторов среды является, таким образом, одним из проявлений штаммо-вой микроэволюции, приводящей к штаммовому полиморфизму вида.

1 2

1 2 3 4 5 1 2 1 2

1 2 б

Рис. 6

Рис. 7

Рис. 8

Рис. 9

Рис. в. Образцы ХЬа\-рестрикции хромосомной ДНК штаммов А. ferrooxidans, выращенных на среде с Fe2*. Обозначение штаммов: 1 - TFN-d, 2 - TFBk, 3 - TFO, 4 - TFV-1, 5 -TFL-2. Условия ПФ: напряжение 120 В, время пульса 25 с (у штамма TFV-1 - 40 с), температура 10 -13 °С, продолжительность 44 ч.

Рис. 7. Образцы ХЬа\-рестрикции хромосомной ДНК штамма А. ferrooxidans TFN-d, выращенного на среде с Fe2* (1) и цианированным концентратом № 1 руды Нежданинско-го месторождения (2). (а) условия ПФ как на рис. 6; (б) условия ПФ: напряжение 130 В, время пульса 10 с, температура 13 °С, продолжительность 68 ч. Сбоку дорожек указаны размеры фрагментов хромосомной ДНК в тпн (здесь и далее).

Рис. 8. Образцы ХЬа\-рестрикции хромосомной ДНК штамма А. ferrooxidans TFBk, выращенного на среде с Fe2* (1) и цианированным концентратом № 1 руды Нежданинско-го месторождения (2). Условия ПФ как на рис. 6.

Рис.9. Образцы ХЬа\-рестрикции хромосомной ДНК штаммов А. ferrooxidans TFO (1) и TFO-2 (2). Условия ПФ как на рис. 6.

Результаты исследования лабильности генома у штаммов А. ferrooxidans при переключении метаболизма с окисления закисного железа на новый субстрат поставили вопрос о механизмах возникновения структурных перестроек в хромосомной ДНК, что, безусловно, является частным вопросом более фундаментальной проблемы о механизмах изменчивости и высоких адаптационных способностях А. ferrooxidans. Согласно имеющимся данным, перестановки в нукпеотидной последовательности ДНК, имеющие результатом лучшее приспособление популяции к изменяющимся условиям среды, могут быть вызваны транспозицией IS-элементов, хромосомными делециями (показано для Streptomyces), дупликациями (Salmonella) или рядом других механизмов, влияющих на активность специфических генов [Kung et а!., 1992; Dybvig, 1993]. Особый интерес вызывает роль плаз-мид в изменчивости А. ferrooxidans, поскольку участие их в адаптации бактерии к неблагоприятным факторам среды не установлено: плазмиды считаются криптическими. Мы предположили, что одним из гипотетических механизмов участия плйзмид в адаптационной изменчивости А. ferrooxidans может являться взаимодействие плазмидной и хромосомной ДНК через механизм плазмидно-хромосомной рекомбинации. Не исключено, что

включение плазмидной ДНК в хромосомную будет иметь результатом переключение культуры с окисления одного энергетического субстрата на другой или же влиять на скорость использования нового субстрата. Такая гипотетическая роль плазмид в адаптации А. 1еггоохШп$ к непостоянству факторов среды ранее не исследовалась. В связи с чем представляло интерес изучение состава плазмид у штаммов, адаптированных к разным энергетическим субстратам, и, как показано нами, различающихся эффективностью адаптации к ним. С другой стороны, предполагаемое плазмидно-хромосомное взаимодействие может являться одним из механизмов возникновения наблюдаемых при адаптации некоторых штаммов А. ferrooxidans изменений в структуре их хромосомной ДНК. Интеграция плазмидной ДНК в хромосомную ДНК, ускоренная репликация плазмид или ингибирование их репликации, могут привести либо к увеличению или уменьшению размеров отдельных фрагментов хромосомной ДНК, либо к появлению или исчезновению из образца рестрикции хромосомной ДНК полос, содержащих фрагменты ДНК, соизмеримые с размерами плазмид. Изменения размеров некоторых фрагментов хромосомной ДНК сопоставимы с размерами плазмид, известными у А. ЫггоохШапз.

4. Штаммовый полиморфизм плазмидных профилей у А. ЪпоохШапв

4.1. Плазмидные профили штаммов А. ГвггоохМапэ, выделенных из природных субстратов

Плазмидные профили были проанализированы у 20 штаммов А. (егтохМапз (табл. 1), выделенных из разных по минералогическому составу типов субстратов. В клетках 16 из них были обнаружены от одной до четырёх плазмид разных размеров. Плазмиды были выявлены у всех штаммов, выделенных из золотосодержащих пиритно-арсенопиритных руд и концентратов, у 83 % штаммов, выделенных из руд и концентратов, содержащих цветные металлы (Си2*, 2п2*), и только у 50 % штаммов, выделенных из простых по составу субстратов: рудничных или шахтных вод, содержащих пирит, пиритизированных углей, активного ила городских сточных вод. Правомочно предположить наличие корреляции между типом субстрата, его минералогическим составом, определяющим качественное и количественное соотношение в жидкой фазе элементов, выделяющихся при его окислении, и наличием плазмид в клетках А. fвrrooxidans. Согласно полученным данным, чем проще по составу субстраты, тем больше доля выделяемых из них бесплазмидных штаммов А. (егтоохШапз.

4.2. Плазмидные профили штаммов А. ЪпоохМапа с экспериментально повышенной устойчивостью к ионам металлов или токсичных элементов

Влияние концентрации ионов металлов или токсичных элементов на плазмидный состав А. ferroox¡dans изучали на примере семи штаммов с экспериментально повышенной устойчивостью к ионам меди, железа, цинка, никеля или мышьяка (табл. 1). Адаптация трёх из них к высокой концентрации ионов металлов в среде вызвала изменение числа или размеров плазмид, обнаруживаемых в клетках неадаптированных культур.

У штамма TFZ, устойчивого к 70 г/л ¿п2*, была выявлена плазмида меньшего размера в сравнении с плазмидой, обнаруженной в клетках исходного штамма ТРУ. У пары родственных штаммов: ТРЛ/-1 и ТВМ-Си, устойчивого к 17,5 г/л Си2+, в клетках присутствуют по две плазмиды (рис. 10), одна из которых, более крупная, - общая, а мелкие плазмиды различаются размерами. Анализ состава плазмид у штаммов ТЯ1 и ТП-Ре, устойчивого к 50 г/л Ре3+, обнаружил отсутствие у штамма ТР1-Ре самой крупной плазмиды из трёх, присутствующих в клетках исходного штамма ТР1. Ранее было показано, что в процессе адаптации к высокой концентрации Яе3* в среде, в хромосомной ДНК штамма ТР1-Ре возникли необратимые изменения, выражающиеся в появлении в образце ХЬз1-рестрикции его хромосомной ДНК нового фрагмента 1Коп<1га1уеуа е1 а1„ 1999]. Очевиден вопрос: не связано ли повышение устойчивости мутантного штамма к 50 г/л Яе3* с плазмидно-хромосомными рекомбинациями? Полученные данные указывают на необходимость исследования возможности взаимодействия плазмидной и хромосомной ДНК у штаммов А.

ferroox¡dans в процессе их адаптации к изменяющимся факторам среды, как ещё одного пути познания роли плазмид в жизнедеятельности А. IеггоохШапв.

5. Изучение плазмидных профилей штаммов А. ЪгтоохШапв, адаптированных к разным энергетическим субстратам

В клетках всех исследуемых штаммов (ТЯ\/-1, ТРГ\1-с1, ТРВк, ТРО и ТР1.-2), выращенных на среде с закисным железом, плазмиды были обнаружены. Одна плазмида выявлена у штамма ТР1_-2, две плазмиды - у штаммов ТРО, ТРВк и ТР\/-1, три плазмиды - у штамма ТР1Ч-<1 В результате исследования влияния адаптации штаммов А. ferrooxidans к разным субстратам окисления на их плазмидные профили были получены следующие данные.

У штаммов ТР1.-2, ТРВк и ТРО смена в процессе адаптации окисляемого субстрата с за-кисного железа на элементную серу, пирит или концентрат не вызвала изменений в их плазмидных профилях. Адаптация штаммов ТР1.-2 и ТРВк к пириту и концентрату (№ 2), а штамма ТРО к элементной сере, пириту и концентрату, как отмечалось выше, не сопровождалась изменениями и в структуре хромосомной ДНК адаптированных культур.

В клетках штамма ТРЫ-с1, адаптированного к элементной сере или пириту, так же, как и в клетках исходной культуры, выращенной на среде с закисным железом, присутствуют три плазмиды (рис. 11, дорожки 2 - 4). Адаптация штамма ТР1Ч-с1 к этим субстратам, как уже было отмечено, не вызывала изменений и в структуре хромосомной ДНК адаптированных культур. Изменения числа и размеров образующихся при расщеплении ХЬа\-фрагментов хромосомной ДНК были отмечены только в результате адаптации штамма к пиритно-арсенопиритному концентрату руды Нежданинского месторождения. Анализ состава плазмид в клетках адаптированной культуры показал, что смена в процессе адаптации окисляемого субстрата с закисного железа на концентрат вызвала изменение и в плазмидном профиле. В клетках адаптированного штамма были выявлены только две плазмиды (рис. 11, дорожка 5) из трёх, присутствующих в клетках исходного штамма. Ранее мы отмечали, что штамм ТРЫ-с1 характеризовался наибольшей, в сравнении с другими исследуемыми нами штаммами, эффективностью адаптации к концентрату. Не связано ли это с предполагаемым участием плазмид в регуляции процессов окисления штаммом ТРЫ-с1 концентрата? Полученные данные, на наш взгляд, не исключают такой возможности

Наиболее яркие изменения в плазмидном профиле при адаптации А. fe^r^ooxldans к новым энергетическим субстратам были выявлены у штамма ТТХМ. В его клетках, в зависимости от окисляемого субстрата, обнаруживались от 3-х до 6-ти плазмид (рис. 12). Так, на электрофореграмме плазмидной ДНК штамма ТИМ, адаптированного к элементной сере (рис. 12, дорожка 3), показано отсутствие мелкой плазмиды, выявляемой в клетках исходного штамма, выращенного на среде с закисным железом (рис. 12, дорожка 2), а также отмечено наличие двух дополнительных, более крупных, чем у исходного штамма, плазмид-Анализ состава плазмид в клетках этого штамма, длительно поддерживавшегося на среде с элементной серой, вновь обнаружил присутствие мелкой плазмиды (рис. 12, дорожка 4), выявляемой в образце плазмидной ДНК исходного штамма, но не обнаруживаемой у адаптированного при меньшем числе пассажей. В клетках штамма ТЯ\М, адаптированного к пириту, показано наличие трёх плазмид (рис. 12, дорожка 5). Две из них присутствовали в образце плазмидной ДНК исходного штамма, а третья, более крупная, обнаруживалась только у адаптированного к элементной сере. Ранее мы отмечали, что адаптация штамма к элементной сере и пириту как единственным источникам энергии после роста на среде с закисным железом не вызывала изменений в структуре хромосомной ДНК адаптированных культур. Изменения в образце ХЬа1-рестрикции штамма ТР\Л1 были отмечены только при адаптации к концентрату руды Нежданинского месторождения. Анализ состава плазмид в клетках адаптированного штамма показал, что адаптация к концентрату вызвала наиболее яркие изменения в его плазмидном профиле. На электрофореграмме плазмидной ДНК адаптированной культуры было выявлено шесть полос плазмидной ДНК (рис. 12, дорожка 6), в то время как у исходной - только две. При обра-

2,52. г, 01

Я'/г 6.26 4,36

9,42 ■2М 6,56

1 2 3

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 6

Рис. 10

Рис. 11

Рис. 12

Рис. 10. Плазмидные профили штаммов А. ferrooxidans ТР\/-1 (1) и ТР\/-1-Си (2); 3-ДНК фага лямбда, расщеплённая зндонуклеазой рестрикции ШпсП\\. Сбоку панелей указаны размеры фрагментов ДНК в тпн (здесь и далее).

Рис. 11. Плазмидные профили штамма А. ferroox¡dans ТРЫ-д, адаптированного к разным энергетическим субстратам. Источники энергии: 2 - Ре2*; 3 - Б0; 4 - Ревг; 5 - пи-ритно-арсенопиритный концентрат № 2; 1 - ДНК фага лямбда, расщеплённая зндонуклеазой рестрикции НотсЯМ.

Рис. 12. Плазмидные профили штамма А. ferrooxidans 1¥\/-1, адаптированного к разным энергетическим субстратам. Источники энергии: 2 - Ре , 3, 4 - ¡5°; 5 - РеЭг," 6 - пи-ритно-арсенопиритный концентрат № 2; 1 - ДНК фага лямбда, расщеплённая зндонуклеазой рестрикции Н/лсЛН.

ботке препарата плазмидной ДНК культуры, выращенной на среде с концентратом, экзо-нукпеазой рестрикции БхоШ, число и интенсивность видимых на электрофореграмме полос плазмидной ДНК сохранялись. Очевидно, в клетках ТР\М присутствуют не менее шести плазмид, которые в зависимости от того, какой источник энергии в среде используется, выявляются у адаптированных культур в различных сочетаниях. Как отмечалось выше, штамм ТРУ-1, выделенный из относительно простой по составу сульфидных минералов руды, в отличие от природных субстратов выделения штаммов ТТЫ-с!, ТРВк, ТРО и ТРЬ2, характеризовался в процессе адаптации к новым энергетическим субстратам самыми низкими, в сравнении с этими штаммами, скоростью роста и активностью их окисления. Причём, если адаптация к элементной сере и пириту была достигнута за пять пассажей, то к концентрату - только за семь, сопровождаясь в последнем случае регистрируемыми методом ПФ изменениями в структуре ХЬа1-расщеплённой хромосомной ДНК адаптированной культуры. В связи с этим несомненный интерес представляют полученные данные об изменении числа плазмид, обнаруживаемых в клетках этого штамма в ответ на изменение источника энергии в среде. Не исключено, что, чем труднее А. ferroox¡-dans адаптируется к новому энергетическому субстрату, тем большую роль в этом процессе, возможно, играют плазмиды. Изменения в плазмидном профиле штамма ТРЧ/-1 были выявлены, как показано выше, и в результате его адаптации к высокой концентрации ионов меди в среде (рис. 10).

Таким образом, несмотря на то, что фенотип плазмид A. ferrooxidans до сих пор не определён, полученные результаты позволяют предположить их участие в адаптации бактерии к изменяющимся факторам среды, в регуляции процессов окисления энергетических субстратов, в обмене генетическим материалом с хромосомной ДНК как одном из возможных механизмов участия плазмид в адаптационной изменчивости A. ferrooxidans.

6. Изучение взаимодействия хромосомной и плазмидной ДНК у штаммов A. ferrooxidantf адаптированных к разным субстратам окисления

Возможностывзамйодействия плазмидной и хромосомной ДНК у A. ferrooxidans в процессе адалтацйижЧ^ШЙняющимся факторам среды была изучена на примере штаммов TFV-1, TFN-^d,,Jf3fk TFO м TFL-2, адаптированных к элементной сере, пириту и пиритно-арсенопириг+10мЛонцентрату руды Нежданинского месторождения. Для этого одна из плазмид штамА^гГ^Вк (pTFK2), меченая радиоактивным фосфором, была использована в качестве зонд&для гибридизации по Саузерну с блотами макрорестрикционных профилей хромосомной'ДНК исследуемых штаммов.

6.1. Рестрикционный анализ плазмид из штамма A. ferrooxidans TFBk

В клетках штамма TFBk присутствуют две плазмиды: малая, названная pTFK1, и большая - pTFK2. Для плазмиды pTFK1 была построена макрорестрикционная карта и определён её размер. По результатам рестрикционного анализа на карте pTFK1 были локализованы сайты рестрикции 6 эндонуклеаз рестрикции (Sa/I, EcoRI, ВдП\, PstI, Pvuti, Oral). Размер плазмиды no результатам одиночных и двойных расщеплений составил 13,5 тпн.

Использованные для расщепления малой плазмиды рестриктазы Sa/I, EcoRI, Bgltt, PstI и Oral имели сайты узнавания и в пределах плазмиды pTFK2. Их число отличалось от числа сайтов рестрикции этих ферментов для плазмиды pTFK1. По результатам рестрикционного анализа размер плазмиды pTFK2 составил около 30 тпн.

6.2. Гибридизация ДНК плазмиды pTFK2 с хромосомной ДНК штаммов A. ferrooxidans, адаптированных к разным энергетическим субстратам

Результаты гибридизации по Саузерну меченой ДНК плазмиды pTFK2 с блотами фрагментов хромосомной ДНК штаммов TFV-1, TFN-d, TFBk, TFO и TFL-2 представлены на рис. 13 -15. На радиоавтографах ХЬа1-фрагментов хромосомной ДНК всех исследуемых штаммов видны множественные слабые сигналы гибридизации, что указывает на наличие в их хромосомной ДНК множественных нуклеотидных последовательностей, комплементарных последовательности нуклеотидов в плазмиде pTFK2 штамма TFBk. Небольшие размеры этих последовательностей, о чём говорит слабая интенсивность сигналов гибридизации, их множественность, а также локализация на хромосомной и плазмидной ДНК свидетельствуют об их принадлежности к IS-элементам. Очевидно изученные штаммы A. ferrooxidans содержат в геноме одинаковые IS-элементы.

При адаптации штаммов к новым энергетическим субстратам локализация полос со слабым сигналом гибридизации в ряде случаев изменялась. Так, например, у штамма TFBk, выращенного на среде с закисным железом или адаптированного к элементной сере, слабый сигнал гибридизации виден с фрагментом хромосомной ДНК размером 214 тпн (рис. 13Б, дорожки 3-4, отмечен двойной стрелкой). В ДНК культур этого штамма, адаптированных к пириту или концентрату (рис. 13Б, дорожки 5 - 6), фрагменты указанного размера не содержат последовательностей нуклеотидов, комплементарных pTFK2. Слабый сигнал гибридизации рТРК2-зонда виден в нижней части геля с одним из фрагментов хромосомной ДНК культуры, адаптированной к концентрату (рис. 13Б, дорожка 6, отмечен двойной стрелкой). На дорожках радиоавтографа Xbal-фрэгментов хромосомной ДНК этого штамма, выращенного на среде с закисным железом или адаптированного к элементной сере и пириту, аналогичный сигнал гибридизации отсутствует. Изменение локализации IS-элементов при адаптации A. fenooxidans к новым энергетическим субстратам позволяет предположить их участие в регуляции процесса окисления новых ис-

Рис. 13. (А). Образцы ХЬа\- рестрикции хромосомной ДНК штамма TFBk, выращенного на среде с Fe2* (3) или адаптированного к S0 (4), FeS2 (5), концентрату (6); 1 -штамм В-458; 2 - плазмидная ДНК штамма TFBk. Условия ПФ: напряжение 120 В, время пульса 25 с, температура 13 °С, продолжительность 44 ч. (Б). Радиоавтограф ХЬа\-фрагментов хромосомной ДНК штамма TFBk, гибридизо-ванных с ДНК pTFK2.

2 OS 160 120

J.OS

J60 120

£5

1 2

(А)

(Б)

Рис. 14. (А). Образцы ХЬа\-рестрикции хромосомной ДНК штаммов А. Ь9гтоох1дап8, адаптированных к разным энергетическим субстратам. Обозначение штаммов: 1 - ТРЫ-&, 2, 3 - ТР\/-1; 4, 5 -ТРО. Субстраты окисления: 1, 3, 5- Ре2*; 2, 4 - ¡5°. (Б). Радиоавтограф ХЬаI- фрагментов хромосомной ДНК, гибридизованных сДНКрТРК2.

Рис. 15. (А). Образцы ХЬа\- рестрикции хромосомной ДНК штаммов А. ferrooxidans ТРО (1) и ТРЫ-б (2), адаптированных к РеЭг. (Б). Радиоавтограф ХЬа\ - фрагментов хромосомной ДНК, гибридизованных с ДНКрТРК2.

точников энергии. Ранее предположение об участии IS-элементов в механизме адаптации A. ferrooxidans к изменяющимся факторам среды, в эволюции структуры и функций генов, в регуляции экспрессии биохимических путей было высказано рядом зарубежных исследователей [Holmes, Haq, 1989; Zhao, Holmes, 1993].

Помимо сигналов слабой интенсивности гибридизации на радиоавтографах блотов макрорестрикционных профилей хромосомной ДНК штаммов TFV-1, TFN-d и TFO выявлены сильные сигналы гибридизации (рис. 14Б - 15Б, отмечены стрелками), причём их локализация у культур, выращенных на разных энергетических субстратах, в ряде случаев различна. Например, сильный сигнал гибридизации отмечен с одним из мелких фрагментов у штамма TFO, адаптированного только к пириту (рис. 15Б, дорожка 1), и отсутствует

у культур, выращенных на среде с закисным железом или элементной серой (рис. 14Б, дорожки 4, 5). У штамма ТР1\М так же, как и у штамма ТРО, сильный сигнал гибридизации ДНК рТРК2 виден с ХЬа1-фрагментом хромосомной ДНК культуры, использующей в качестве источника энергии пирит (рис. 15Б, дорожка 2). Соответствующий сигнал гибридизации с тем же фрагментом хромосомной ДНК у штамма ТР1Ч-с), выращенного на среде с закисным железом, отсутствует (рис. 14Б, дорожка 1). Сильные сигналы гибридизации, свидетельствуя о большей протяженности гомологичных нуклеотидных последовательностей отдельных фрагментов хромосомной ДНК исследуемых штаммов с ДНК рТРК2, могут быть результатом интеграции плазмидной ДНК в хромосому Наличие гомологичных нуклеотидных последовательностей в ДНК плазмиды рТРК2 с ДНК двух плазмид штаммов ТРО и ТРЫ-с1 (размер плазмид, обнаруженных в клетках этих штаммов, сопоставим с размером плазмид штамма ТРВк), на что указывают слабые сигналы гибридизации в размерной области геля, не соответствующей расположению в геле полос ХЬа\-фрагментов хромосомной ДНК штаммов ТРО и ТРЫ-с! (рис. 15Б, отмечены двойными стрелками сбоку), а также появление сильного сигнала гибридизации с одним из фрагментов хромосомной ДНК этих штаммов, адаптированных к пириту, не исключают возможности плазмидно-хромосомных взаимодействий при переключении метаболизма А ferrooxldans с окисления закисного железа на новый субстрат.

Таким образом, показано, что адаптация штаммов А. (епоохкЗапз к новым энергетическим субстратам может сопровождаться изменением локализации в геноме элементов, а также плазмидно-хромосомными рекомбинациями. Интеграция плазмидной ДНК в хромосому - не только один из путей адаптации А. feггooxidans к изменяющимся факторам среды [1поие е! а!.. 1991; настоящее исследование], но и в случае необратимости процесса - механизм внутривидовой изменчивости, лежащей в основе микроэволюционных процессов, результатом которых является генотипический и фенотипический полиморфизм штаммов А. {еггоохИапь.

Заключение

Изучение штаммового разнообразия хемолитотрофных бактерий, играющих ключевую роль в окислении закисного железа, элементной серы и сульфидных минералов в природе в экстремальных условиях и используемых в биогидрометаллургических технологиях, представляет не только теоретический интерес в плане характеристики видов этих микроорганизмов, их изменчивости, границ нормы реакции геномов на изменение факторов среды, микроэволюции, но и одну из ключевых задач в решении проблем повышения скорости и эффективности извлечения ценных металлов из сульфидных руд и продуктов их переработки. Очень важным является выбор высокоэффективных, устойчивых к экстремальным факторам среды, обладающих высоким регуляторным потенциалом штаммов бактерий, что особенно актуально в технологических процессах в условиях перманентных изменений характеристик субстрата, режимов рН и температуры, концентрации в жидкой фазе ионов металлов и токсичных элементов. Последующая адаптация к комплексу технологических факторов повышает конкурентоспособность таких штаммов и обеспечивает высокую эффективность в окислении субстрата.

В настоящей работе использован комплексный подход в изучении А feгrooxidans - доминирующей культуры в мезофильном сообществе ацидофильных хемолитотрофных бактерий, участвующих в бактериально-химических процессах выщелачивания металлов в природе и биогидрометаллургии. Развиваемая нами стратегия заключалась в изучении генотипа (генотипический полиморфизм штаммов, генотипическая изменчивость, проявляемая на уровне хромосомной и плазмидной ДНК), фенотипа (скорость роста, эффективность адаптации к разным энергетическим субстратам и активность их окисления), факторов внешней среды, вызывающих полиморфизм штаммов (характеристика энергетического субстрата, концентрация ионов металлов) и механизмов его возникновения.

Проведенные исследования показали, что вид А. ferrooxidans характеризуется значительным генотипическим разнообразием штаммов, выделенных из разных экологических ниш, отличных по ряду важнейших характеристик внешней среды (качественному составу и количественному соотношению сульфидных минералов в рудах и концентратах - субстратах выделения штаммов, концентрации накапливаемых в жидкой фазе ионов металлов и токсичных элементов, рН среды и т д ). Это разнообразие проявляется в заметной дивергенции нуклеотидных последовательностей генов 16Б рРНК, низком уровне сходства тотальных геномов, в различиях структуры хромосомной ДНК и в плазмидных профилях.

Генотипический штаммовый полиморфизм А. ¡егюох'кЗапз реализуется через фенотипи-ческое разнообразие штаммов, наиболее ярко проявляющееся в их реакции На изменение энергетического субстрата. Выделенные из разных по минералогическому составу типов субстратов штаммы А. ferrooxidans различаются по скорости роста и активности окисления закисного железа, элементной серы и сульфидных минералов, эффективности адаптации к данным субстратам, достигая при этом индивидуальных, генетически обусловленных порогов адаптации. Адаптационные возможности штаммов коррелируют с их предысторией' микроэволюцией в различных экологических нишах, на разных по минералогическому составу типах субстратов.

Корреляция фенотипических свойств штаммов А. {еггоохШапз с их предысторией предполагает высокий приспособительный потенциал этой бактерии, выработанный в ходе эволюции в условиях непостоянства параметров внешней среды. Согласно полученным данным, основой для физиологических изменений организма в процессе адаптации к новому фактору среды в условиях эксперимента являются обратимые изменения в нуклео-тидной последовательности хромосомной ДНК. Возникновение необратимых изменений в структуре хромосомной ДНК А. /еггоохМапэ под влиянием отдельных факторов среды, подтверждением чего явилось выделение из руды поверхностного и глубинного горизонтов залегания Олимпиадинского месторождения двух родственных штаммов А ferrooxi-dans, является одним из проявлений штаммовой микроэволюции, приведшей к штаммо-вому полиморфизму вида.

Изменения в структуре хромосомной ДНК могут быть результатом мутационных, реком-бинационных или инсерционных, с участием ^-элементов, транспозонов или плазмид, перестроек генома Возможность взаимодействия плазмидной и хромосомной ДНК в процессе адаптации А. fetroox¡dans к изменяющимся факторам среды, а также участия 15-элементов в адаптационной изменчивости бактерии нами была показана Это не только механизмы адаптационной изменчивости А. feгroox¡daпs, но и в случае их необратимости - механизмы внутривидовой изменчивости, лежащей в основе микроэволюционных процессов, результатом которых является генотипический и фенотипический полиморфизм штаммов А. ferгooxidans.

Выводы

1. Вид А. ferrooxldans характеризуется значительным генотипическим разнообразием штаммов, выделенных из разных экологических ниш. Штаммовая гетерогенность А Гег-гоох^апз выражается в дивергенции нуклеотидных последовательностей генов 16Э рРНК, низком уровне сходства тотальных геномов, в различиях структуры хромосомной ДНК и в плазмидных профилях

2. Отмечена составляющая не менее двух уровней генотипическая гетерогенность вида А ferrooxidans. Один уровень соответствует группированию штаммов в филогенетические группы по результатам анализа генов 16Э рРНК. Второй уровень - делению на геномова-ры по результатам анализа ДНК-ДНК гомологии их тотальных геномов.

3. Генотипический полиморфизм штаммов А. ferюoxldans реализуется через фенотипи-ческое разнообразие штаммов. Выделенные из разных по минералогическому составу типов субстратов штаммы А. feгrooxidans различаются по скорости и эффективности

адаптации к элементной сере, пириту и пиритно-арсенопиритному концентрату, кинетическим параметрам роста и активности окисления различных энергетических субстратов.

4. Основными факторами среды, вызывающими штаммовую генотипическую изменчивость А. IеттохИапз являются энергетический субстрат и ионы металлов.

5. Смена в процессе адаптации окисляемого субстрата с закисного железа на элементную серу, пирит или сульфидные концентраты вызывает в структуре хромосомной ДНК некоторых штаммов А. &гтохШап5 обратимые изменения. В инициации генетических изменений играют роль физико-химические особенности окисляемого субстрата.

6. Впервые отмечено влияние некоторых факторов среды: концентрации ионов металлов и субстрата окисления на плазмидный состав А. ferrooxidans. Показано, что адаптация штаммов А. IеггоохШпв к новым энергетическим субстратам или высокой концентрации ионов металлов в среде может сопровождаться изменениями в плазмидных профилях адаптированных культур.

7. В геноме всех исследуемых штаммов А. ferroox¡dans выявлены нуклеотидные последовательности, аналогичные ^-элементам. Показано их участие в структурных изменениях хромосомной ДНК ряда штаммов в процессе адаптации к новым энергетическим субстратам.

8. Отмеченные случаи плазмидно-хромосомных рекомбинаций являются одним из механизмов адаптации А. feгrooxidans к изменяющимся факторам среды, а в случае необратимости процесса (мутаций) - механизмом внутривидовой изменчивости, лежащей в основе генотипического и фенотипического полиморфизма штаммов.

9. Изучение фенотипического и генотипического полиморфизма штаммов ацидофильных хемолитотрофных бактерий - необходимый этап в характеристике видов этих микроорганизмов. Исследование взаимосвязи генотипических и фенотипических признаков разных штаммов в зависимости от факторов среды позволит вести отбор высокоэффективных штаммов бактерий для конкретных типов минерального сырья.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Агеева С. Н., Кондратьева Т. Ф„ Каравайко Г. И. Фенотипические особенности штаммов ТЫоЬасМиэ ferrcюxidans // Микробиология. 2001. Т. 70. № 2. С. 226 - 234. 2. Агеева С. Н., Кондратьева Т. Ф., Каравайко Г. И. Плазмидные профили штаммов Acidi-МоЬасШиэ (еггоохШапь, адаптированных к разным субстратам окисления // Микробиология. 2003. Т. 72. № 5. С. 651 -657.

3. Агеева С. Н., Кондратьева Т. Ф. Роль субстрата окисления в штаммовом полиморфизме ШоЬасШиз ferrooxidans / В сб.: Тезисы стендовых сообщений. Школа - конференция «Горизонты физико-химической биологии». Т. 1. С. 188 - 189. Пущино: 28 мая - 2 июня 2000 г.

4. Агеева С. Н., Кондратьева Т. Ф. Штаммовое разнообразие хемолитотрофных бактерий и его значение в биогидрометаллургии / В сб.: Тезисы стендовых сообщений. XV зимняя международная молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». С. 55IIИБХ РАН, Москва.Ю - 14 февраля 2003 г. 68 с.

5. Кондратьева Т. Ф., Агеева С. Н., Мунтян Л. Н„ Пивоварова Т. А., Каравайко Г. И. Штаммовый полиморфизм плазмидных профилей у АсШЫоЬасШиз ferтoox¡dans II Микробиология. 2002. Т. 71. № 3. С. 373 - 380.

6. Кондратьева Т. Ф., Агеева С. Н., Пивоварова Т. А., Каравайко Г. И. Характеристика рестрикционных профилей хромосомной ДНК у штаммов АсШЫоЬасШиз ferгooxidвns, адаптированных к разным субстратам окисления // Микробиология. 2002. Т. 71. № 4. С. 514 - 520.

7. Кондратьева Т. Ф., Данилевич В. Н., Агеева С. Н., Каравайко Г. И. Взаимодействие хромосомной и плазмидной ДНК у штаммов АсШЫоЬасШиэ feпroox¡dans, адаптированных к разным субстратам окисления II Микробиология. 2003. Т. 72. № 6 (в печати).

8. Кондратьева Т. Ф., Агеева С. Н. Роль в биогидрометаллургии штаммового разнообразия хемолитотрофных микроорганизмов как проявление микроэволюционных процессов в экстремальных условиях / В сб.: Материалы 1-го Международного конгресса по биотехнологии. С. 459. М„ 2002. 544 с.

9 Karavaiko G. I., Turova Т. P., Kondrat'eva Т. F., Lysenko А. М., Kolganova Т. V., Ageeva S. N., Muntyan L. N., Pivovarova Т. A. Phylogenetic heterogeneity of species Acidithiobacillus ferrooxidans H Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. № 1. P. 113 -119.

10. Kondrat'eva T. F., Pivovarova T. A, Muntyan L. N., Ageeva S. N., Karavaiko G. I. The strain genotypic heterogeneity of chemolithotrophic microorganisms / In Biohydrometallurgy -2003 (International 15th Biohydrometallurgy Symposium. Greece) // (in press).

11. Кондратьева Т. Ф., Тупикина О. В., Агеева С. Н., Саморукова В. Д, Каравайко Г И. Изменчивость хемолитотрофных микроорганизмов как основа регуляции их жизнедеятельности в экстремальных условиях / Тезисы 2-го Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (в печати).

12. Каравайко Г. И., Кондратьева Т. Ф., Пивоварова Т. А., Меламуд В. С., Агеева С Н Ацидофильные хемолитотрофные микроорганизмы, их особенности и роль в биогидрометаллургии / Тезисы 2-го Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (в печати).

»177 2i ^

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.5tprint.rti e-mail: zakaz@stDrint.ru теп 939-3338 Заказ № 401 тираж 100 экз. Подписано в печать 30.10.2003 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Агеева, Светлана Николаевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

2+ л ^

1. Сообщество хемолитотрофных микроорганизмов, окисляющих Бе , Б /Б " и сульфидные минералы при низких значениях рН.

2. Характеристика АЫсИМоЬасШш/еггоох1с1аю.

2.1. История открытия. Таксономическое положение.

2.2. Особенности морфологии и структурной организации клетки.

2.3. Физиология и метаболизм А./еггоох1с1ат.

2.3.1. Физиологические особенности.

2.3.2. Особенности конструктивного и энергетического метаболизмов.

2.4. Механизмы бактериального окисления Ре2+, 8°/82" и сульфидных минералов.

2.4.1. Участие клеточных структур и метаболитов в процессах окисления Ре2+, Б0 и сульфидных минералов.

2.4.2. Окисление Ре2+.

2.4.3. Окисление элементной серы и её восстановленных соединений.

2.4.4. Окисление сульфидных минералов.

2.5. Генетическая система А. /еггоох1с1ат.

2.5.1. Размер генома и нуклеотидный состав ДНК.

2.5.2. Генный состав А. /еггоох1с1ат: характеристика отдельных генов и продуктов их экспрессии.

2.5.3. Мобильные нуклеотидные повторяющиеся последовательности в геноме А. 'гггоохгйат.

2.5.4. Плазмиды А./еггоох1с1ап8.

3. Фенотипические и генотипические характеристики штаммов

А. /*гггоох1(1а№.

3.1. Штаммовый полиморфизм А. /гггоох1с1а№.

3.2. ПГтаммовый полиморфизм структуры хромосомной ДНК у А. /еггоох1с1апз.

3.3. Влияние различных факторов среды на генотипическую изменчивость

А. /еггоох1с1а№.

3.3.1. Влияние субстрата окисления.

3.3.2. Влияние концентрации ионов металлов.

3.3.3. Влияние рН среды.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фенотипический и генотипический полиморфизм штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans"

Постановка проблемы и её актуальность. В процессе эволюции отдельные представители филогенетически отдалённых групп микроорганизмов приобрели способность получать энергию за счёт окисления закисного железа, элементной серы и её восстановленных соединений или сульфидных минералов в кислых условиях среды. Это грамотрицательные бактерии родов Acidithiobacil-lus и Leptospirillum, грамположительные бактерии рода Sulfobacillus, а также некоторые археи: представители родов Acidianus, Metallosphaera, Sulfolobus и Ferroplasma. В природных условиях данные микроорганизмы участвуют в процессе выщелачивания металлов из сульфидных руд и горных пород, охватывая широкий диапазон физико-химических параметров среды (рН от 0,7 до 3,5; температура от 5 до 80 °С). В биогидрометаллургии сообщества этих микроорганизмов используются в бактериально-химических технологиях извлечения цветных и благородных металлов из сульфидных руд и концентратов, в разработку научных основ переработки которых большой вклад внесли отечественные учёные [Каравайко и др., 1972; Полькин и др., 1982].

Доминирующей бактерией в мезофильном сообществе ацидофильных хемо-литотрофных микроорганизмов является A. ferrooxidans. Использование в качестве источников энергии широкого круга окисляемых субстратов (от водорода до многокомпонентных сульфидных руд), устойчивость к ионам тяжёлых ме

А | А I Л I Л | А I таллов (Zn , Си , Ni , Со , Fe и др.), низким значениям рН, а также высокий уровень изменчивости в экстремальных условиях среды обусловливают ведущую роль A. ferrooxidans в бактериально-химических процессах вскрытия золота или выщелачивания цветных металлов. Последнее, во многом, определило характер исследований физиологии, биохимии и генетики данного микроорганизма. Изучены особенности конструктивного и энергетического метаболизма A. ferrooxidans [Ingledew, 1982; 1986], устойчивость к ионам металлов и токсичных элементов [De et al., 1997, Sampson et al., 2001]. Подробно исследованы компоненты железоокисляющей системы A. ferrooxidans [Rawlings, 2001], охарактеризованы отдельные ферменты пути окисления серы и её восстановленных соединений [Sugio et al., 1987; 1988 а; 1989]. Идентифицировано множество генов этой бактерии, изучена их регуляция, а также кодируемые белки. Много внимания было уделено созданию рекомбинантных, с улучшенными технологически значимыми свойствами штаммов A. ferrooxidans. Однако инициированные в начале 90-х годов отечественными авторами работы [Кондратьева и др., 1993] с использованием метода пульс-электрофореза для мониторинга состава микробных популяций в технологических процессах извлечения золота или выщелачивания цветных металлов позволили прийти к заключению о бесперспективности применения в б.иогидрометаллургии созданных генно-инженерными методами штаммов A. ferrooxidans, как не выдерживающих в переменных по субстрату и другим параметрам среды условиях технологического процесса конкуренции с природными аборигенными штаммами.

Из природных (горные породы, месторождения сульфидных руд, рудничные воды), а также технологических сред (плотные пульпы биогидрометаллургиче-ских установок по переработке руд и концентратов) исследователями разных стран выделено большое число штаммов A. ferrooxidans. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют об их значительном разнообразии, как по фено-типическим, так и генотипическим признакам. Штаммы A. ferrooxidans разного происхождения различаются по размеру генома, содержанию нуклеотидных пар Г + Ц в ДНК, степени ДНК-ДНК гомологии тотальных геномов, плазмидным профилям [Harrison, 1982; 1986; Leduc, Ferrony, 1994; Rawlings, Kusano, 1994], оптимальным для роста значениям рН и температуры, устойчивости к ионам тяжёлых металлов и токсичных элементов, активности окисления разных субстратов [Грудев, 1985; Pichuantes et al., 1986; Frattini et al., 2000]. Как возникло это пггаммовое разнообразие, чем вызывается, какими механизмами реализуется? Какова роль пггаммового полиморфизма в биогидрометаллургических процессах? Отсутствие ответов на эти вопросы свидетельствует об актуальности поставленной проблемы не только в теоретическом плане, но и в плане практической значимости.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение фенотипи-ческого и генотипического полиморфизма штаммов А. /еггоох[с/ат, факторов среды, его вызывающих, и механизмов возникновения. Задачи исследования включали:

1. Изучение генотипического полиморфизма штаммов А. ferrooxidans разного происхождения и оценка филогенетической гетерогенности вида.

2. Изучение фенотипических особенностей штаммов А. /еггоох1с1ат и динамики их адаптации к разным энергетическим субстратам.

3. Анализ рестрикционных профилей хромосомной ДНК у штаммов А./еггоох1-с1ат, адаптированных к разным субстратам окисления.

4. Изучение пггаммового полиморфизма плазмидных профилей у А. /еггоох1-сЬт.

5. Анализ плазмидных профилей у штаммов А. /еггоох1с1а№ с экспериментально повышенной устойчивостью к ионам металлов и у адаптированных к разным энергетическим субстратам.

6. Исследование возможных механизмов внутривидовой изменчивости А. /ег-гоохгйат и оценка роли отдельных факторов среды в существующем разнообразии штаммов.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые использован комплексный подход в исследовании пггаммового полиморфизма вида А. /еггоох1-йстя, заключающийся в изучении особенностей генотипа, фенотипа и механизмов изменчивости у одних и тех же штаммов в одинаковых условиях среды. Проведён полифазный генотипический анализ 25 штаммов А. /еггоох1(1апз, выделенных в лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии РАН из различных по минералогическому составу типов субстратов; изучены ряд ключевых фенотипических признаков некоторых штаммов (скорость роста, эффективность адаптации к разным энергетическим субстратам и активность их окисления), а также пггаммовая генотипическая изменчивость А. ferrooxidans, проявляемая на уровне хромосомной и плазмидной ДНК. В результате проведённых исследований получены дополнительные сведения о роли субстрата окисления в дивергенции штаммов А. /еггоох!с1ат в разных экологических нишах, об изменениях в последовательности нуклеотидов в хромосомной ДНК как одном из механизмов штаммовой микроэволюции. Впервые отмечено влияние некоторых факторов среды: концентрации ионов металлов и субстрата окисления на плазмидные профили ряда штаммов А. /еггоох1(1ат, что позволяет предположить участие плазмид в адаптации этой бактерии к изменяющимся факторам среды. Впервые исследована возможность взаимодействия плазмидной и хромосомной ДНК как одного из механизмов адаптационной изменчивости А. /еггоох1с1ап$. Показано, что адаптация штаммов А. /еггоох1с!ат к новым энергетическим субстратам может сопровождаться изменением локализации ^-элементов в геноме и плазмидно-хромосомными рекомбинациями. Необратимость этих процесов приводит к внутривидовой изменчивости, лежащей в основе микроэволюционных процессов, результатом которых является штам-мовый полиморфизм вида А. /еггоох1(1апз.

Полученные в работе результаты исследования генотипических и фенотипи-ческих признаков различных штаммов А. ^гггоохгйат в зависимости от факторов среды, механизмов адаптации и регуляции активности окислительных процессов могут быть использованы при разработке стратегии управления бактериально-химическими процессами выщелачивания металлов, выработке практических рекомендаций по их интенсификации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции молодых учёных «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), Всероссийской конференции по развитию концепции микробной экологии в XXI веке, посвященной 100-летию со дня рождения Кузнецова С. И. (Москва, ИНМИ РАН, 2000), конкурсе научно-исследовательских работ Института микробиологии РАН (2001), 1-ми 2-м Международных Конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), XV Международной молодёжной научной конференции - школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003), 15-м Международном симпозиуме по биогидрометаллургии (Греция, 2003).

Публикации. По материалам диссертации, включая тезисы, опубликовано семь работ; три статьи и двое тезисов сданы в печать.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Агеева, Светлана Николаевна

Выводы

1. Вид А. /еггоох1с1ат характеризуется значительным генотипическим разнообразием штаммов, выделенных из разных экологических ниш. Штаммовая гетерогенность А. /еггоох1с1а№ выражается в дивергенции нуклеотидных последовательностей генов 16Э рРНК, низком уровне сходства тотальных геномов, в различиях структуры хромосомной ДНК и в плазмидных профилях.

2. Отмечена составляющая не менее двух уровней генотипическая гетерогенность вида А. /еггоох1с1апБ. Один уровень соответствует группированию штаммов в филогенетические группы по результатам анализа генов 16Б рРНК. Второй уровень - делению на геномовары по результатам анализа ДНК-ДНК гомологии их тотальных геномов.

3. Генотипический полиморфизм штаммов А. /еггоох1с1ат реализуется через фенотипическое разнообразие штаммов. Выделенные из разных по минералогическому составу типов субстратов штаммы А. /еггоох1сктз различаются по скорости и эффективности адаптации к элементной сере, пириту и пиритно-арсенопиритному концентрату, кинетическим параметрам роста и активности окисления различных энергетических субстратов.

4. Основными факторами среды, вызывающими штаммовую генотипическую изменчивость А. /еггоох1с1а№ являются энергетический субстрат и ионы металлов.

5. Смена в процессе адаптации окисляемого субстрата с закисного железа на элементную серу, пирит или сульфидные концентраты вызывает в структуре хромосомной ДНК некоторых штаммов А. /еггоох1с1ат обратимые изменения. В инициации генетических изменений играют роль физико-химические особенности окисляемого субстрата.

6. Впервые отмечено влияние некоторых факторов среды: концентрации ионов металлов и субстрата окисления на плазмидный состав А. /еггоох1с!ат. Показано, что адаптация штаммов А. /еггоох1с1ат к" новым энергетическим субстратам или высокой концентрации ионов металлов в среде может сопровождаться изменениями в плазмидных профилях адаптированных культур.

7. В геноме всех исследуемых штаммов А. /еггоох1с1ст5 выявлены нуклеотид-ные последовательности, аналогичные 18-элементам. Показано их участие в структурных изменениях хромосомной ДНК ряда штаммов в процессе адаптации к новым энергетическим субстратам.

8. Отмеченные случаи плазмидно-хромосомных рекомбинаций являются одним из механизмов адаптации А. /егюох1с1ат к изменяющимся факторам среды, а в случае необратимости процесса (мутаций) - механизмом внутривидовой изменчивости, лежащей в основе генотипического и фенотипического полиморфизма штаммов.

9. Изучение фенотипического и генотипического полиморфизма штаммов ацидофильных хемолитотрофных бактерий - необходимый этап в характеристике видов этих микроорганизмов. Исследование взаимосвязи генотипических и фе-нотипических признаков разных штаммов в зависимости от факторов среды позволит вести отбор высокоэффективных штаммов бактерий для конкретных типов минерального сырья.

Заключение

Изучение пггаммового разнообразия хемолитотрофных бактерий, играющих ключевую роль в окислении закисного железа, элементной серы и сульфидных минералов в природе в экстремальных условиях и используемых в биогидроме-таллургических технологиях, представляет не только теоретический интерес в плане характеристики видов этих микроорганизмов, их изменчивости, границ нормы реакции геномов на изменение факторов среды, микроэволюции, но и одну из ключевых задач в решении проблем повышения скорости и эффективности извлечения ценных металлов из сульфидных руд и продуктов их переработки. Очень важным является выбор высокоэффективных, устойчивых к экстремальным факторам среды, обладающих высоким регуляторным потенциалом штаммов бактерий, что особенно актуально в технологических процессах в условиях перманентных изменений характеристик субстрата, режимов рН и температуры, концентрации в жидкой фазе ионов металлов и токсичных элементов. Последующая адаптация к комплексу технологических факторов повышает конкурентоспособность таких штаммов и обеспечивает высокую эффективность в окислении субстрата.

В настоящем исследовании использован комплексный подход в изучении А. /еггоох1с1а№ - доминирующей культуры в мезофильном сообществе ацидофильных хемолитотрофных бактерий, участвующих в бактериально-химических процессах выщелачивания металлов в природе и биогидрометаллургии. Развиваемая нами стратегия заключалась в комплексном изучении генотипа (генотипический полиморфизм штаммов, генотипическая изменчивость, проявляемая на уровне хромосомной и плазмидной ДНК), фенотипа (скорость роста, эффективность адаптации к разным энергетическим субстратам и активность их окисления), факторов внешней среды, вызывающих полиморфизм штаммов (характеристика энергетического субстрата, концентрация ионов металлов) и механизмов его возникновения.

Проведённые исследования показали, что вид A. ferrooxidans характеризуется значительным генотипическим разнообразием штаммов, выделенных из разных экологических ниш, отличных по ряду важнейших характеристик: качественному составу и количественному соотношению сульфидных минералов в рудах и концентратах - субстратах выделения штаммов, концентрации накапливаемых в жидкой фазе ионов металлов и токсичных элементов, рН среды и т. д. Штаммо-вая гетерогенность A. ferrooxidans показана по таким генотипическим признакам, как уровень ДНК-ДНК гомологии, структура хромосомной ДНК, число и состав плазмид. Изучение методом ПФ особенностей структуры хромосомной ДНК у 20 штаммов A. ferrooxidans с последующим анализом сходства рестриктных профилей обнаружили индивидуальные генотипические особенности штаммов: исследуемая группа распалась на три кластера. По результатам анализа сходства тотальных геномов изученные штаммы A. ferrooxidans разделились на четыре геномные группы - геномовара, в каждый из которых вошли штаммы, характеризующиеся высокой степенью геномного сходства. Шесть значительно дивергиро-вавших штаммов, уровень сходства тотальных геномов которых друг с другом и с представителями из геномоваров составлял от 13 до 43 %, оказались за пределами выделенных геномных групп, что позволяет предположить существование в составе вида A. ferrooxidans, по меньшей мере, десяти геномоваров. Генотипиче-ская гетерогенность вида A. ferrooxidans была показана также по результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. Согласно данным филогенетического анализа, исследуемые нами штаммы, войдя в состав единого монофилетического кластера, объединяющего большинство изученных к настоящему времени штаммов A. ferrooxidansразделились на три филогенетические группы. Распределение штаммов по филогенетическим группам, в общем, коррелировало с разделением их на геномовары. Полученные данные указывают на существование не менее двух уровней генотипической гетероген

1 В сравнительном филогенетическом анализе использовались доступные из Банка Генов (Gen Bank) данные о нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК большой группы штаммов A. ferrooxidans и ряда других представителей рода A cidithiobacillus. ности штаммов А. /еггоох1с1ат, один из которых соответствует их группированию в филогенетических группах, а другой - делению на геномовары.

Результаты анализа генов 16Б рРНК и перечисленных выше генотипических характеристик свидетельствуют, таким образом, как о филогенетическом единстве, близком филогенетическом родстве и общности происхождения штаммов А. /еггоох1с1ап8, так и о составляющей несколько уровней генотипической гетерогенности вида А./еггоох1с1а№.

Генотипический штаммовый полиморфизм А. /еггоох1(1ат реализуется через фенотипическое разнообразие штаммов, наиболее ярко проявляющееся в их реакции на изменение энергетического субстрата. Выделенные из разных по минералогическому составу типов субстратов: золото-мышьяковых руд и концентратов или руд, содержащих цветные металлы Си2+), штаммы А. /еггоох1с1ап8 различались не только по скорости роста и активности окисления закисного железа, но и эффективностью адаптации к разным энергетическим субстратам, достигая при этом индивидуальных, генетически обусловленных порогов адаптации. Адаптационные возможности штаммов коррелировали с их предысторией: существованием в-различных экологических нишах, на разных по минералогическому составу типах субстратов. Согласно полученным данным, у штаммов, выделенных из близких по составу входящих в них сульфидных минералов, богатых по окисляемым субстратам золото-мышьяковых руд и концентратов (ТТЪГ-с1, ТЬВк, ТТО), скорость адаптации была одинаковой, однако её эффективность - разной. Штамм ТРУ-1, выделенный из бедной медьсодержащей руды, характеризовался наименьшей активностью окисления новых субстратов в процессе адаптации к ним. Очевидно, штаммы А. ferrooxidans наиболее активны лишь в тех условиях, к которым они адаптировались в природе. Подтверждением этому могут служить данные о наибольшей активности роста и окисления штаммом ТТЪГ-с1 собственного концентрата - пиритно-арсенопиритного концентрата руды Нежданинского месторождения, откуда он был выделен, а штаммом ТБО - элементной серы. Природный субстрат выделения этого штамма содержит, преимущественно, пирротин, при окислении которого в среде накапливается элементная сера и серосодержащие продукты. Полученные результаты позволяют, по нашему мнению, говорить об адаптивном характере окисления А. /еггоох1с!ат различных энергетических субстратов. Мониторинг состава микробных популяций, участвующих в технологических процессах извлечения золота или выщелачивания цветных металлов из сульфидных руд и концентратов, подтверждает это. Как было показано ранее, в биотехнологических процессах доминируют аборигенные штаммы А. /Ъггоох1с1ат [Копс1га1уеуа е1 а1., 1999], являясь, будучи более адаптированными к конкретному субстрату и комплексу экстремальных факторов среды, и более конкурентоспособными в сравнении с инокулятными штаммами.

Корреляция фенотипических свойств штаммов А. ferrooxidans с их предысторией предполагает высокий приспособительный потенциал этой бактерии, выработанный в ходе эволюции в условиях непостоянства параметров внешней среды. Как в природе, так и в технологических процессах, энергетический субстрат не является стабильным фактором среды: состав его постоянно меняется, а потому микроорганизмы должны обладать активными механизмами регуляции процессов его окисления. В данной работе было изучено влияние адаптации к новым энергетическим субстратам на структуру хромосомной ДНК штаммов А. /еггоох1-йат. Полученные результаты, подтвердив уже имеющиеся данные [Кондратьева и др., 1996 а, б], показали, что ъцънт&шя А. ferrooxidans к новым энергетическим субстратам может сопровождаться структурными изменениями в хромосомной ДНК, которые исчезают при возврате культуры к первоначальным условиям роста на среде с закисным железом. Такие изменения были выявлены у трёх из пяти адаптированных к разным энергетическим субстратам штаммов А. ferrooxidans. Интересно, что в инициации генетических изменений существенную роль, по-видимому, играют физико-химические или кристаллохимические особенности окисляемого субстрата.

Те же механизмы, лежащие в основе экспериментальной изменчивости штаммов А. ferrooxidansi очевидно, задействованы в природе. Возникновение необратимых изменений в структуре хромосомной ДНК А. /еггоох1с1ат под влиянием факторов среды, подтверждением чего явилось выделение из руды Олимпиадин-ского месторождения поверхностного и глубинного слоев залегания двух родственных штаммов А. /еггоох1с1ат, является одним из проявлений штаммовой микроэволюции, приведшей к штаммовому полиморфизму вида.

Изменения в структуре хромосомной ДНК могут быть результатом мутационных, рекомбинационных или инсерционных, с участием 1Б-элементов, транспо-зонов или плазмид, перестроек генома. Нами были проанализированы плазмид-ные профили у 27 штаммов А. /еггоох1с!ат, выделенных из разных географических зон и типов субстратов, в том числе - у семи штаммов с экспериментально повышенной путём адаптации устойчивостью к ионам тяжёлых металлов или токсичных элементов, а также пяти штаммов, адаптированных к разным субстратам окисления. В клетках 80 % штаммов А. /гггоохгйат, выделенных из различных типов природных субстратов, плазмиды были обнаружены. Сопоставление полученных данных с данными по минералогической характеристике субстратов выделения штаммов показало, что чем проще по составу субстраты, тем больше доля выделяемых из них бесплазмидных штаммов А. /еггоох1с!ат. Подобной корреляции ранее отмечено не было.

Результаты анализа плазмидных профилей у штаммов А. /еггоох1с1ат с экспериментально повышенной устойчивостью к ионам металлов или токсичных элементов, а также у штаммов, адаптированных к разным энергетическим субстратам, не выявили общих фенотипических свойств плазмид. Корреляции между наличием их в клетках и устойчивостью бактерии к ионам металлов отмечено не было. Не было выявлено общих закономерностей в реакции плазмидной части генома разных штаммов А. /еггоох1с!ат на окисляемый субстрат. Тем не менее, впервые на примере нескольких штаммов А. /еггоох1с1ат было показано влияние концентрации ионов металлов на плазмидный состав А. /еггоох1(1ат; впервые получены данные об изменениях в плазмидных профилях некоторых штаммов А. /еггоох1с!ат в ответ на их адаптацию к новым энергетическим субстратам. Особый интерес, на наш взгляд, представляют данные об изменении числа плазмид в зависимости от окисляемого субстрата у штамма, выделенного из относительно простой по составу сульфидных минералов руды, и характеризующегося в процессе адаптации к новым энергетическим субстратам наименьшей скоростью роста и активностью их окисления. Не исключено, что чем труднее A. ferrooxidcms адаптируется к изменяющимся факторам среды, тем большую роль в этом процессе, возможно, играют плазмиды. Таким образом, несмотря на то, что фенотип плазмид A. ferrooxidcms не определён, полученные нами данные не исключают возможности их участия в адаптации бактерии к изменяющимся факторам среды, в регуляции процессов окисления энергетических субстратов, в обмене генетическим материалом с хромосомной ДНК как одном из механизмов предполагаемого участия плазмид в адаптационной изменчивости A. ferrooxidcms.

Возможность плазмидно-хромосомного взаимодействия у A. ferrooxidcms в процессе адаптации бактерии к изменяющимся факторам среды была нами изучена на примере штаммов, адаптированных к разным энергетическим субстратам. Результаты проведённой гибридизации по Саузерну меченой 32Р плазмиды pTFK2, выделенной из клеток штамма TFBk, с блотами макрорестрикционных фрагментов хромосомной ДНК пяти адаптированных к элементной сере, пирту и пиритно-арсенопиритному концентрату штаммов, позволили заключить, что адаптация A. ferrooxidcms к новым энергетическим субстратам может сопровождаться изменением локализации IS-элементов и, возможно, - интеграцией плаз-мидной ДНК в хромосому. Подобные механизмы могут быть задействованы не только в адаптации A. ferrooxidcms к изменяющимся факторам среды, но и в случае необратимости процессов - в механизмах внутривидовой изменчивости.

Результаты проведённых исследований позволяют заключить, что для получения наиболее полной характеристики видов ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, а также оценки их роли в природных и техногенных экосистемах, недостаточно охарактеризовать только типовые штаммы, необходимо изучение штаммового полиморфизма, знание нормы реакции генома на изменяющиеся условия среды, размаха изменчивости количественных признаков. Особенно важно это для микроорганизмов, имеющих практическое значение в биотехнологиях, основным билогическим фактором которых являются уникальные штаммы бактерий, а не виды как таковые.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Агеева, Светлана Николаевна, Москва

1. Авакян А. А., Каравайко Г. И. Субмикроскопическая организация ТЫоЪасШизеггоох1с1аж II Микробиология. 1970. Т. 39. № 5. С. 855 860.

2. Вартанян Н. С., Каравайко Г. И., Пивоварова Т. А. (а). Влияние органическихвеществ на рост и окисление неорганических субстратов 8и1/оЬасИ1из Мег-тоБифс1оох1с1ат БиЬяр. asporogenes II Микробиология. 1990. Т. 59. № 3. С. 411 -417.

3. Вартанян Н. С., Каравайко Г. И., Пивоварова Т. А., Дорофеев А. Г. (б). Устойчивость БШ/оЬасШиз хНегтозгйАйоохгйат яиЬяр. аБрого^епез к ионам Си2+, гп2+, №2+ // Микробиология. 1990. т! 59. № 4. С. 587 594.

4. Громова Л. А. Ультраструктурная организация ТЫоЬасШиБ/еггоох1с1аж в связис окислением элементарной серы: Дис. канд. биол. наук. М., 1983.

5. Громова Л. А., Переверзев Н. А., Каравайко Г. И. Пили ТЫоЬасШиБ/еггоох1ат II Микробиология. 1978. Т. 47. № 2. С. 293 296.

6. Громова Л. А., Каравайко Г. И., Севцов А. В., Переверзев Н. А. Идентификация и распределение серы в клетках ТЫоЬасШиз Ъггоох1с1аж II Микробиология. 1983. Т. 52. № 3. С. 455 460.

7. Грудев С. Н. Различия между штаммами ТЫоЬасШш/еггоох1с1аж по способности окислять сульфидные минералы // Биогеотехнология металлов / Ред. Каравайко Г. И., Грудев С. Н. М.: Центр международных проектов ГКНТ, 1985. С. 85 89.

8. Зайцев Г. Н. Методика биометрических расчётов. М.: Наука, 1973. 256 с.

9. Каравайко Г. И. Микроорганизмы и их роль в биотехнологии металлов. // Биогеотехнология металлов: практическое руководство / Ред. Каравайко Г. И. и др. М.: Центр международных проектов ГКНТ, 1989. С. 11 50.

10. Каравайко Г. И., Авакян А. А. Механизм размножения ТЫоЬасШш /еггоо:ис1ат II Микробиология. 1970. Т. 39. № 6. С. 950 952.

11. Каравайко Г. И., Кузнецов С. И., Голомзик А. И. Роль микроорганизмов ввыщелачивании металлов из руд. М.: Наука, 1972. 248 с.

12. Каравайко Г. И., Пивоварова Т. А. Окисление элементной серы ТЫоЬасШиБ /еггоохШат // Микробиология. 1973. Т. 42. № 3. С. 389 395.

13. Каравайко Г. И., Миллер Ю. М., Капустин О. А., Пивоварова Т. А. Фракционирование стабильных изотопов серы при её окислении ТЫоЬасШиБ /ег-гоохШапБ II Микробиология. 1980. Т. 49. № 6. С. 849 854.

14. Каравайко Г. И., Джансугурова Р. С., Пивоварова Т. А. Факторы, повышающие устойчивость ТЫоЬасШиБ /еггоох1с1апБ к молибдену // Микробиология. 1989. Т. 58. №3. С. 412 -418.

15. Каравайко Г. И., Кондратьева Т. Ф., Пискунов В. П., Саакян В. Г., Мунтян Л.

16. Н., Коновалова О. Е. Селекция штамма ТЫоЬасШиБ/еггоохМат с повышенной устойчивостью к ионам цинка и изучение особенностей его хромосомной ДНК методом пульс-электрофореза // Микробиология. 1994. Т. 63. № 2. С. 247-253.

17. Каравайко Г. И., Седельникова Г. В., Аслануков Р. Я., Савари Е. Е., Панин В.

18. В., Адамов Э. В., Кондратьева Т. Ф. Биогидрометаллургия золота и серебра // Цветные металлы. 2000. № 8. С. 20 26.

19. Коваленко Т. В., Каравайко Г. И. Влияние температуры и концентрации энергетического субстрата на рост и окислительную функцию ТЫоЬасШиБ /еггоохШат //Микробиология. 1981. Т. 50. № 2. С. 326 331.

20. Коваленко Т. В., Каравайко Г. И., Пискунов В. П. Влияние ионов Бе3+ наокисление ТЫоЬасШиБ /еггоохШапБ закисного железа при различной температуре // Микробиология. 1982. Т. 51. № 1. С. 156 160.

21. Кондратьева Т. Ф. Применение электрофореза для анализа ДНК микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1992. Т. 25. С. 169 184.

22. Кондратьева Т. Ф., Каравайко Г. И. Рестрикционный анализ ДНК ТЫоЬасШш /еггоох1с1ат с использованием электрофореза в пульсирующих разнонаправленных электрических полях // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1992. № 3 4. С. 9 - 12.

23. Кондратьева Т. Ф., Каравайко Г. И. Изменчивость генома ТЫоЪасШиз /еггоох1с1ап8 и её значение в биогидрометаллургии // Микробиология. 1997. Т. 66. №6. С. 735-743.

24. Кондратьева Т. Ф., Мунтян Л. Н. Каравайко Г. И. Анализ рестрикционныхобразцов хромосомной ДНК штаммов ТЫоЬасШш /еггоох1с1апБ методом пульс-электрофореза // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. №4. С. 19-22.

25. Кондратьева Т. Ф., Пивоварова Т. А., Мунтян Л. Н., Каравайко Г. И. (а). Изменение структуры хромосомной ДНК ТМоЬасШш /еггоох1с!апз на средах с разными субстратами окисления // Микробиология. 1996. Т. 65. № 1. С. 67 -73.

26. Кондратьева Т. Ф., Пивоварова Т. А., Каравайко Г. И. (б). Структурные особенности хромосомной ДНК у штаммов ТИюЬасШт /еггоох1с1а№, адаптированных к росту на средах с пиритом или элементной серой // Микробиология. 1996. Т. 65. № 5. С. 675 681.

27. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1990. 352 с.

28. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 479 с.

29. Меламуд В. С., Пивоварова Т. А., Турова Т. П., Колганова Т. В., Осипов Г. А.,

30. Лысенко А. М., Кондратьева Т. Ф., Каравайко Г. И. Новая умеренно-термофильная бактерия БиуЪЬасШш Б№тсш Бр. пох. II Микробиология. 2003 (в печати).

31. Монцевичюте-Эрингене Е. В. Упрощённые математико-статистические методы в медицинской исследовательской работе // Пат. физиология и эксперимент. терапия. 1964. № 4. С. 71.

32. Переверзев Н. А., Громова JI. А., Каравайко Г. И., Манынин А. А. Получениефрагментов клеточных стенок Thiobacillus ferrooxidans и их ультраструктурная организация // Микробиология. 1981. Т. 50. № 4. С. 683 686.

33. Пивоварова Т. А., Джансугурова Р. С., Каравайко Г. И. Роль экзометаболитовв устойчивости Thiobacillus ferrooxidans к молибдену // Микробиология. 1991. Т. 60. № 4.С. 609 615.

34. Пивоварова Т. А., Миллер Ю. М., Крашенникова С. А., Капустин О. А., Каравайко Г. И. О роли фосфолипидов в фракционировании стабильных изотопов серы при её окислении Thiobacillus ferrooxidans II Микробиология. 1982. Т. 51. №4. С. 552-554.

35. Полькин С. И., Адамов Е. В., Панин В. В. Технология бактериального выщелачивания цветных и редких металлов. М.: Недра, 1982. 287 с.

36. Резников А. А., Муликовская Е. П., Соколов И. Ю. Методы анализа природных вод. М.: Недра, 1970. С. 140 143.

37. Сапегин А. Г. Программа STATIST для Windows MS-DOS / Кафедра прикладной и экспериментальной математики МГОПУ, 2001.

38. Хесин Р. Б. Непостоянство генома. М.: Наука, 1984. 472 с.

39. Agate A. D., Korczunski М. S., Lundgren D. G. Extracellular complex from the culture filtrate of Ferrobacillus ferrooxidans II Cañad. J. Microbiol. 1969. V. 15. P.259 265.

40. Alexander B. O., Leach S., Ingledew W. J. The relationship between chemiosmoticparameters and sensitivity to anions and organic acids in the acidophile Thiobacillus ferrooxidans II J. Gen. Microbiol. 1980. V. 133. № 5. P. 1171 1179.

41. Amils R., Irazabal N., Moreira D., Abad J. P., Marin I. Genomic organizationanalysis of acidophilic chemolithoautotrophic bacteria using pulsed field gel elec-trophoretic techniques // Biochemic. J. 1998. V. 80. № 11. P. 911 921.

42. Apel W. A., Dugan P. K., Tuttle J. H. Adenosine 5'-triphosphate formation in

43. Thiobacillus ferrooxidans vesicles by H1" ion gradient comparable to those of environmental conditions // J. Bacteriology. 1980. V. 142. P. 295 301.

44. Bacon M., Ingledew W. The reductive reactions of Thiobacillus ferrooxidans onsulfur and selenium // FEMS Microbiol. Lett. 1989. V. 58. № 2 3. P. 189 - 194.

45. Barros M. E. C., Rawlings D. E., Woods D. R. Mixotrophic growth of a Thiobacillus ferrooxidans strain // Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 47. P. 593 595.

46. Barros M. E., Rawlings D. E., Woods D. R. Cloning and expression of the Thiobacillus ferrooxidans glutamine synthetase gene in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1985. V. 164. P. 1389- 1389.

47. Bengrine A., Guiliani N., Appia-Ayme C., Jadlicki E., Holmes D. S., Chippaux M.,

48. Bonnefoy V. Sequence and expression of the rusticyanin structural gene from Thiobacillus ferrooxidans ATCC 33020 strain // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V.1443. № 1 2. P. 99-112.

49. Berger D. K., Woods D. R., Rawlings D. E. Complementation of Escherichia colia54 (Ntr A) dependent format hydrogenase activity by a cloned Thiobacillus fer-rooxidans ntr A gene // J. Bacteriol. 1990. V. 172. № 8. P. 4399 - 4406.

50. Birnboim H. C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. № 6. P. 1513 1523.

51. Blake II R. C., White K. J., Shute E. A. Effect of diverse anions on the electrontransfer reaction between ion and rusticianin from Thiobacillus ferrooxidans II Biochemistry. 1991. V. 30. P. 9443 9449.

52. Blake II R. C., Shute E. A. Respiratory components in acidophilic bacteria that respire on iron // Geomicrobiology J. 1992. V. 10. № 3 4. P. 173 - 192.

53. Blake II R. C., Shute E. A., Greenwood M. M., Spencer G. H., Ingledew W. J. Enzymes of aerobic respiration on iron // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. № 1 -3. P. 9 18.

54. Booth J. E., Wiliams J. W. The isolation of a mercuric ion-reducing flavoproteinfrom Thiobacillus ferrooxidans II J. Gen. Microbil. 1984. V. 130. № 3. P. 725 -730.

55. Brierley C. L. J. Less-Common Metals. 1974. V. 36. P. 237.

56. Brierley C. L., Brierley J. A., Norris P. R., Kelly D. P. Metal-tolerant microorganisms of hot, acidic environments // Microbiol growth and survival in extremes of environment / Eds. Gould G. W., Corry J. E. L. London: Academic Press, 1980. P. 39-51.

57. Brock T. D., Brock K. M., Belly R. T., Weiss R. L. Sulfolobus: a new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature // Arch. Microbiol. 1972. V. 84. P. 54-68.

58. Brock T. D., Gustafson J. Ferric-iron reduction by sulfur- and iron-oxidizing bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1976. V. 32. № 4. P. 567 571.

59. Brown L. D., Rawlings D. E. Comparison of the structure of the ^-translocating

60. ATP synthases from Thiobacillus ferrooxidans with those of other organisms //

61. Biohydrometallurgical technologies / Eds. Torma A. E., Apel M. L., Brierley C. L. Warrendale: TMS Press, 1993. V. 2. P. 519 528.

62. Biyant R. D., McGroarty K. V., Costerton J. W., Laishley E. J. Isolation and characterization of a new acidophilic Thiobacillus species (T1 albertis) II Can. J. Microbiol. 1983. V. 29. P. 1159-1170.

63. Cadiz R., Gaete L., Jedlicki E., Yates J., Holmes D. S., Orellana O. Transpositionof IST2 in Thiobacillus ferrooxidans II Mol. Microbiol. 1994. V. 12. № 1. P. 165 -170.

64. Chakraborty R., Deb C., Lonia A., Roy P. Cloning and characterization of a highcopy-number novel insertion sequence from chemolithotrophic Thiobacillus ferrooxidans II Plasmid. 1997. V. 38. № 2. P. 129 - 134.

65. Chakravarty L., Kittle J. D., Tuovinen O. H. Insertion sequence 1ST 3091 of

66. Thiobacillus ferrooxidans II Canad. J. Microbiol. 1997. V. 43. № 6. P. 503.

67. Chakravarty L., Zupanic T. J., Baker B., Kittle J., Fiy I. J., Tuovinen O. H. Characterization of pTFI 91 family replicon of Thiobacillus ferrooxidans II Can. J. Microbiol. 1995. V. 41. № 4-5. P. 354 365.

68. Chisolm L. A., Leduc L. G., Ferrony G. D. Metal resistance and plasmid DNA in

69. Thiobacillus ferrooxidans II Ant. van Leeuwenhoek Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 1998. V. 73. №3. P. 245-254.

70. Clennel A. M., Johnston B., Rawlings D. E. Structure and function of Tn 5467, a Tn21.like transposon located on the Thiobacillus ferrooxidans broad-host-range plasmid pTF-FC2 // Appl. Env. Microbiol. 1995. V. 61. № 12. P. 4223 4229.

71. Cobley J. G., Haddock B. A. The respiratory chain of Thiobacillus ferrooxidans:the reduction of cytochromes by Fe2+ and preliminary characterization of rusti-cianin, a novel blue copper protein // FEBS Lett. 1975. V. 60. P. 29 33.

72. Colmer A. R., Hinkle M. E. The role of microorganisms in acid mine drainage: apreliminary report// Science. 1947. V. 106. P. 253 256.

73. Colmer A. R., Temple K. L., Hinkle M. E. An iron-oxidizing bacterium from theacid drainage of some bituminous coal mined // J. Bacterid. 1950. V. 59. P. 317 -328.

74. Corbet C. M. Ingledew W. J. Is Fe2+/3+ cycling an intermediate in sulfur oxidationby Fe2+-grown Thiobacillus ferrooxidans II FEMS Microbiol. Lett. 1987. V. 41. № l.p. l 6.

75. Cox J. C., Boxer D. H. 1978. The purification and some properties of rusticianin, ablue copper protein involved in iron (II) oxidation from Thiobacillus ferrooxidans II Biochem. J., V. 174. P. 497 502.

76. Cox J. C., Nicholls D. G., Ingledew W. J. Transmembrane electrical potential andtransmembrane pH gradient in the acidophile Thiobacillus ferrooxidans II Biochem. J. 1979. V. 178. P. 195 200.

77. Crundwell F. K. How do bacteria interact with minerals // Biohydrometallurgy: fundamentals technology and sustainable development / Eds. Ciminelli V. S. T., Garcia O. Ir. Elsevier Science, 2001. Part A. P. 149 157.

78. Dale J. W. Molecular genetics of Bacteria / Eds. Wiley J. and Sons. Chichester,

79. New York, Brisbane, Toronto, Singapore: School of Biological Sciences, University of Surrey, U. K. 1995. 287 p.

80. Das A., Mishra A. K., Roy P. Anaerobic growth on elemental sulfur using dissimilariron reduction by autotrophic Thiobacillus ferrooxidans II FEMS Microbiol. Lett. 1992. V. 97. P. 167.

81. Das A., Mishra A. K. Role of Thiobacillus ferrooxidans and sulfur (sulfide)dependent ferric-ion reduction activity in the oxidation of sulfide minerals I I Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V. 45. № 3. P. 377 382.

82. De G. C., Oliver D. J., Pesic B. M. Effect of heavy metals on the ferrous ironoxidizing ability of Thiobacillus ferrooxidans I I Hydrometallurgy. 1997. V. 44. № 1-2. P. 56-63.

83. De Ley J., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DNAhybridization from renaturation rates // Eur. J. Beochem. 1970. V. 12. P. 133 142.

84. Dejong G. A. H., Hazeu W., Bos P., Kuenen J. G. Polythionate degradation bytetrathionate hydrolase of Thiobacillus ferrooxidans II Microbiol. UK. 1997. V. 143. P. 499-504.

85. Di Spirito A. A., Tuovinen O. H. Oxygen uptake coupled with uranous sulfate oxidation by Thiobacillus ferrooxidans and Thiobacillus acidophilus II Geomicrobiol. J. 1981. V. 2. P. 275-291.

86. Di Spirito A. A., Tuovinen O. H. (a). Uranous ion oxidation and carbon dioxidefixation by Thiobacillus ferrooxidans II Arch. Microbiol. 1982. V. 133. № 1. P. 28 -32.

87. Di Spirito A. A., Tuovinen O. H. (b). Kinetics of uranous ion and ferrous ion oxidation by Thiobacillus ferrooxidans // Arch. Microbiol. 1982. V. 133. № 1. P. 33 -37.

88. Dominy C. N., Coram N. J., Rawlings D. E. Sequence analysis of plasmid pTF-5,19,8 kb geographically widespread member of the Thiobacillus ferrooxidans pTFI91.like plasmid family // Plasmid. 1998. V. 40. № 1. P. 50 57.

89. Dorrington R. A., Rawlings D. E. Identification and sequence of the basic replication region of a broad-host-range plasmid isolated from Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacterid. 1989. V. 171. № 3. P. 2735 2739.

90. Dorrington R. A., Rawlings D. E. Characterization of the minimum replicon of thebroad-host-range plasmid pTF-FC2 and similarity between pTF-FC2 and the IncQ plasmids // J. Bacterid. 1990. V. 172. P. 5697 5705.

91. Drobner E., Huber H., Stetter K. O. Thiobacillus ferrooxidans a facultative hydrogen oxidizer // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. № 9. P. 2922 2923.

92. Drolet M., Lau P. C. K. Mobilization protein-DNA binding and divergent transcription at the transfer origin of the Thiobacillus ferrooxidans pTF 1 plasmid // Mol. Mcrobiol. 1992. V. 6. № 8. P. 1061 1071.

93. Dybvig K. DNA rearrangement and phenotypic switching in prokaryotes // Mol.

94. Microbiol. 1993. V. 10. № 3. P. 465 471.

95. Edwards U., Rogall T., Bloeker H., Ende M. D., Boeettger E. S. Isolation and directcomplete nucleotide determination of entire genes //Nucl. Acids. Res. 1989. V. 17. P. 7843-7853.

96. Ehrlich H. L., Ingledew W. J., Salerno J. C. Iron- and manganese-oxidizing bacteria

97. Variations in autotrophic life / Eds. Shively J. M., Barton L. L. London: Academic Press, 1991. P. 147 170.

98. Felsenstein J. PHYLIP, phylogenetic inference package (Version 3.2) / Cladistics 5.1989. P.164- 166.

99. Fischer J., Quentmeier A., Kostka S., Kraft R., Friedrich C. G. Purification andcharacterization of the hydrogenase from Thiobacillus ferrooxidans II Arch. Microbiol. 1996. V. 165. № 5. P. 289 296.

100. Fowler T. A., Holmes P. R., Crundwell F. K. On the kinetics and mechanism of thedissolution of pyrite in the presence of Thiobacillus ferrooxidans II Hydrometal-lurgy. 2001. V. 59. № 2 3. P. 257 - 270.

101. Fry I. J., Garcia E. Cloning and characterization of Thiobacillus ferrooxidans genes involved in sulfur assimilation // Biohydrometallurgy / Eds. Salley J., McCready R. G. L., Wichlacz P. L Ottawa, Canada: CANMET, 1989. P. 171 -185.

102. Fukimori Y., Tano T., Sato A., Yamanaka T. Fe (II)-oxidizing enzyme purified from Thiobacillus ferrooxidans IIFEMS Microbiol. Lett. 1988. V. 50. № 2 3. P. 169-172.

103. Gale N. L., Beck J. V. Evidence of the Calvin cycle and hexose monophosphate pathway in Thiobacillus ferrooxidans Hi. Bacterid. 1967. V. 94. P. 1052 1059.

104. Gehrke T., Telegdi J., Thierry D., Sand W. Importance of ectracellular polymeric substances from Thiobacillus ferrooxidans for bioleaching // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. № 7. P. 2743 2747.

105. Gehrke T., Hallman R., Kinzler K., Sand W. The Eps of Acidithiobacillus ferrooxidans a model for structure function - relationships of attached bacteria and their phisiology // Water Science and Technology. 2001. V. 43. № 6. P. 159 - 167.

106. Gillis M., De Ley J., Cleen M. The determination of moleculae weight of bacterial DNA from renaturation rates II Eur. J. Beochem. 1970. V. 12. P. 143 153.

107. Giudici-Orticoni M. T., Leroy G., Nitschke W., Brushi M. Characterization of a new dihemic c (4) type cytochromes isolated from Thiobacillus ferrooxidans // Biochemistry. 2000. V. 39. № 24. P. 7205 - 7211.

108. Golovacheva R. S., Karavaiko G. I. A new genus of thermophilic spore-forming bacteria, Sulfobacillus II Microbiology. 1978. V. 47. P. 658 665.

109. Grinsted J., de la Cruz F., Schmidtt R. The Tn 21 subgroup of bacterial transpos-able elements // Plasmid. 1990. V. 24. P. 168 189.

110. Guiliani N., Chippaux M., Patte J. C., Bonnefoy V. Perspectives in the genetics of Thiobacillus ferrooxidans II Biohydrometallurgical technologies / Eds. Torma A. E., Apel M. L., Brierley C. L. Jackson Hole. Wyoming. USA. 1993. V. 2. P. 645 -658.

111. Hall J. F., Hasnain S. S., Ingledew W. J. The structural gene for rusticyanin from Thiobacillus ferrooxidans: cloning and sequencing of the rusticyanin gene // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 137. № 1. p. 85 89.

112. Hallberg K. B., Lindstrom E. B. Characterization of Thiobacillus caldus sp. nov., a moderately thermophilic acidophile // Microbiology. 1994. V. 140. P. 3451 3456.

113. Hansford G. S., Vargas T. Chemical and electrochemical basis on bioleaching processes. Hydrometallurgy // 2001. V. 59. № 2 3. P. 135 - 145.

114. Harahuk L., Suzuki I. Sulfite oxidation by ion-grown cells of Thiobacillus fer-rooxidans at pH 3 possible involves free-radicals, ion- and cytochromes-oxidase // Canad. J. Microbiol. 2001. V. 47. № 5. P. 424 - 430.

115. Harrison A. P. Ir. Acidiphilum cryptum gen. nov., sp. nov., heterotrophic bacteria from acidic mineral environments // Int. J. Syst. Bacteriol. 1981. V. 31. P. 327 -332.

116. Harrison A. P. Genomic and physiological diversity amongst strains of Thiobacillus ferrooxidans and genomic comparison with Thiobacillus ferrooxidans II Arch. Microbiol. 1982. V. 131. № 1. P. 68 76.

117. Harrison A. P. The acidophilic Thiobacilli and other acidophilic bacteria that share their habitat // Annul. Rev. Microbiol. 1984. V. 38. P. 265 292.

118. Harrison A. P. Characteristics of Thiobacillus ferrooxidans and other iron-oxidizing bacteria with emphasis on nucleic acid analyses // Biotechnol. Appl. Bio-chem. 1986. V. 8. № 4. P. 249 257.

119. Harrison A. P. Ir., Jarvis B. W., Johnson J. L. Heterotrophic bacteria from cultures of autotrophic Thiobacillus ferrooxidans: relationships as studied by means of deoxyribonucleic acid homology// J. Bacteriol. 1980. V. 143. № 1. P. 448 454.

120. Hightower R. C., Santi D. V. Migration properties of circular DNA using orthogonal field alternation gel electrophoresis // Electrophoresis. 1989. V. 10. № 5 6. P. 283 - 290.

121. Holmes D. S., Yates J. R., Schrader J. Mobile, repeated DNA sequences in Thiobacillus ferrooxidans and their significance for biomining // Biohydrometallurgy:

122. Science and Technology Letters / Eds. Norris P. R., Kelly D. P. United Kingdom, 1988. P. 153- 160.

123. Holmes D. S., Hag U. I. Adaptation of Thiobacillus ferrooxidans for undustrial applications // Biohydrometallurgy-1989 / Eds. Salley J., McCready R. G. L., Wichlacz P. L. Ottawa, Canada: CANMET, 1989. P. 115 127.

124. Holmes D.S., Zhao H. L., Levican G., Ratouchniak J., Bonnefoy V., Varela P., Jedlicki E. (b). ISAfel, an IS 13 family insertion sequence from Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 19859 // J. Bacterid. 2001. V. 183. № 14. P. 4323 4329.

125. Huber G., Spinnler C., Gamba-Corta A., Stetter К. O. Metallosphaera sedula of gen. and sp. nov., represents a new genus of aerobic metal-mobilizing, thermoaci-dophilic archae bacteria // Syst. Appl. Microbiol. 1989. V. 12. № 1. P. 38 47.

126. Huber G., Stettler К. O. Sulfolobus metallicus, sp. nov., a novel strictly chemolith-otrophic thermophilic archaea species of metal-mobilizers // Syst. Appl. Microbiol. 1991. V. 14. №4. P. 372-378.

127. Hutchins S. R., Davidson M. S., Brierley J. A., Brierley C. L. Microorganisms in reclamation of metals // Ann. Rev. Microbiol. 1986. V. 40. P. 311 336.

128. Inagaki К., Kawaguchi Н., Kuwata Y., Sugio Т., Tanaka Н., Tano Т. Cloning and expression of the Thiobacillus ferrooxidans 3-isopropylmalate dehydrogenase gene in Escherichia coli/fj. Ferment. Bioeng. 1990. V. 70. P. 71 74.

129. Ingledew W. J. Thiobacillus ferrooxidans, the bioenergetics of an acidophilicchemolithotroph // Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 683. № 2. P. 89 117.

130. Ingledew W. J. Ferrous iron oxidation by Thiobacillus ferrooxidans II Biotechnol. Bioeng. symp. 1986. V. 16. P. 23 33.

131. Ingledew W. J., Cox J. C., Hailing P. J. A proposed mechanism for energy conservation during Fe2+ oxidation by Thiobacillus ferrooxidans; chemiosmotic coupling to net H+ influx // FEMS Microbiol. Lett. 1977. V. 2. P. 193 197.

132. Ingledew W. J., Cobley J. G. A Potentiometrie and kinetic study on the respiratory chain of ferrous-iron-grown Thiobacillus ferrooxidans II Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 590. P. 141-158.

133. Ingledew W. J., Houston A. The organization of the respiratory chain of Thiobacillus ferrooxidans II Biotechnol. Appl. Biochem. 1986. V. 8. № 4. P. 243 249.

134. Inoue C., Sugawara K., Shiratory T., Kusano T., Kitagawa Y. Nucleotide sequence of the Thiobacillus ferrooxidans chromosomal gene encoding mercuric reductase // Gene. 1989. V. 84. № 1. P. 47 54.

135. Inoue C., Sugawara K., Kusano T. Thiobacillus mer operon: sequence analysis of the promoter and adjacent genes // Gene. 1990. V. 96. № 1. P. 115 120.

136. Inoue C., Sugawara K., Kusano T. The mer R regulatory gene in Thiobacillus ferrooxidans is spaced apart from the mer structural genes I I Mol. Microbiol. 1991. V. 5. № 11. P. 2707-2718.

137. Irazabal N., Marin I., Amils R. Genomic organization of the acidophilic chemo-lithoautotrophic bacterium Thiobacillus ferrooxidans ATCC 21834 // J. Bacteriol. 1997. V. 179. № 6. P. 1946 1950.

138. Iwahori K., Takeuchi F., Kamimura K., Sugio T. Ferrous iron-dependent volatilization of mercury by the plasma membrane of Thiobacillus ferrooxidans II Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. № 9. P. 3823 3827.

139. Jerez C. A., Seeger M., Amaro A. M. Phosphate starvation affects the synthesis of outer membrane proteins in Thiobacillus ferrooxidans II FEMS Microbiol. Lett. 1992. V. 98. P. 29 36.

140. Johnson D. B. Biodiversity and ecology of acidophilic microorganisms // FEMS

141. Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 307 317.

142. Johnson D. B., Ghauri M. A., McGinnes S. Biogeochemical cycling of iron and sulfur in leaching environments // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. № 1 3. P. 63 -70.

143. Kai T., Suenaga Y., Mabsuda K., Takahashi T. Enhancement of specific growth rate of iron-oxidizing bacteria by glucose // Biotechnol. Lett. 1996. V. 18. № 4. P. 403 406.

144. Karavaiko G. I., Smolskaja L. S., Golyshina O. K., Jagovkina M. A., Egorova E. Y. Bacterial pyrite oxidation: influence of morphological, physical and chemical properties // Fuel Proc. Technol. 1994. V. 40. P. 151 165.

145. Kawaguchi H., Inagaki K., Kuwata Y., Tanaka H., Tano T. 3-Isopropylmalate dehydrogenase from chemolithotroph Thiobacillus ferrooxidans: DNA sequence., enzyme purification and characterization // J. Biochem. 1993. V. 114. P. 370 377.

146. Kelly D. P. Evolution of the understanding of the microbiology and biochemistry of the mineral leaching habitat // Biohydrometallurgy / Eds. Norris P. R., Kelly D. P. Kew, Surry, UK: Science and Technology Letters, 1988. P. 3 14.

147. Kelly D. P. Thermodynamic aspects of energy conservation by chemolithotrophic sulfur bacteria in relation to the sulfur oxidation // Arch. Microbiol. 1999. V. 17. № 4. P. 219-229.

148. Kelly B. C., Tuovinen O. H., Nicholas D. J. D. Utilizations of 35S thiosulphate and an appraisal of the role of ATP sulfuiylase in chemolithotrophic Thiobacillus ferrooxidans II Arch. Microbiol. 1976. V. 109. P. 205 208.

149. Kelly D. P., Harrison A. P. Genus Thiobacillus II Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Statley J. T., Bryant M. P., Pfenning N., Holt J. G Baltimore: Williams & Wilkins, 1989. V. 3. P. 1842 1858.

150. Kelly D. P., Shergill J. K., Lu W. P., Wood A. P. Oxidative metabolism of inorganic sulfur compounds by bacteria // Ant. van Leeuwenhoek Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 1997. V. 71. № 1 2. P. 95 - 107.

151. Kelly D. P., Wood A. P. Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 511 -516.

152. Kondratyeva T. F., Muntyan L. N., Karavaiko G. I. Zinc and arsenic-resistens strains of Thiobacillus ferrooxidans have increased copy numbers of chromosomal resistanse genes // Microbiology. 1995. V. 141. № 5. P. 1157 1162.

153. Kulpa C. F., Roskey M. T., Mjoli N. Construction of genomic libraries and induction of iron oxidation in Thiobacillus ferrooxidans II Biotechnol. Appl. Bio-chem.1986. V. 8. №4. P. 330-341.

154. Kung S. S., Chen J., Chow W. Y. Molecular and genetic characterization of an Al-caligenes eutrophus insertion element // J. Bacterid. 1992. V. 174. № 24. P. 8023 -8029.

155. Kusano T., Ji G., Inoue C., Silver S. Constitutive synthesis of a transport functions encoded by the Thiobacillus ferrooxidans mer C gene cloned in Escherichia coli H J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 2688 2692.

156. Kusano T., Sugawara K., Inoue C., Suzuki N. (a). Molecular cloning and expression of Thiobacillus ferrooxidans chromosomal ribulose bisphosphate carboxylasegenes in Escherichia coli II Current Microbiol. 1991. V. 22. № 1. P. 35 41.

157. Kusano T., Takeshima T., Inoue C., Sugawara K. (b). Evidence for two sets of structural genes coding for ribulose bisphosphate carboxylase genes in Thiobacillus ferrooxidans I I J. Bacterid. 1991. V. 173. № 22. P. 7313 7323.

158. Kusano T., Sugawara K., Inoue C., Takeshima T., Numata T., Shiratory T. (a). Electrotransformation of Thiobacillus ferrooxidans with plasmids containing a mer-determinant // J. Bacteriol. 1992. V. 174.№20.P. 6617-6623.

159. Lane D. J., Stahl D. A., Olsen G. J., Heller D. J., Pace N. R. Phylogenetic analysis of the genera Thiobacillus and Thiomicrospira by 5S rRNA sequences // J. Bacteriol. 1985. V. 163. P. 75-81.

160. Lane D. J., Harrison A. P. Ir. Phylogeny of acidophilic bacteria associated with mineral leaching // Biohydrometallurgy 1989 / Eds. Salley J., McCready R. G. L., Whichlacz P. L. Ottava, Canada: CANMET, 1989. P. 381 - 389.

161. Lane D. J., Harrison A. P. Ir., Stahl D., Pace B., Giovanni S. J., Olsen G. J., Pace N. R. Evolutionary relationship among sulfur and iron-oxidizing bacteria // J. Bacteriol. 1992. V. 174. № 1. P. 269 278.

162. Leduc L. G., Ferroni G. D. The chemolithotrophic bacterium Thiobacillus ferrooxidans IIFEMS Microbiology Reviews. 1994. V. 14. № 2. P. 103 120.

163. Li H. M., Ke J. J. Influence of Ni2+ and Mg24" on the growth and activity of Cu2+-adapted Thiobacillus ferrooxidans II Hydrometallurgy 2001. V. 61. № 3. P. 151 -156.

164. Lorbach S. C., Shivelly J. M., Buonfiglio V. Kinetics of sulfur oxidation by Thiobacillus ferrooxidans II Geomicrobiology J. 1992. V. 10. № 3 4. P. 219 - 226.

165. Lorbach S. C., Buonfiglio V., Bauld J. M., Shivelly J. M. Oxidation of reduced sulfur compounds by Thiobacillus ferrooxidans 23270 and Thiobacillus ferrooxidans

166. FC // Biohydrometallurgical Technologies: Fossil Energy Materials, Bioremediation, Microbial Physiology / Eds. Torma A. E., Apel M. L., Brierley C. L. Jackson Hole, Wyoming, USA, 1993. V. 2. P. 443 452.

167. Lundgren D. G., Silver M. Ore leaching by bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 1980. V. 34. P. 263 283.

168. Lundgren D. G., Boucheron J., Mahony. Geomicrobiology of iron: mechanisms of ferric iron reduction // Recent Progress in Biohydrometallurgy / Eds. Rossi G., Torma A. E. Italy: Associazione Mineraria, Sarda, 1983. P. 55 69.

169. Maciag W. J., Lundgren D. G. Carbon dioxide fixation in the chemoautotrophe Ferrobacillus ferrooxidans II Biochem. Biophys. Res. Communs. 1964. V. 17. P. 603.

170. Mackintosh M. E. Nitrogen fixation by Thiobacillus ferrooxidans II J. Gen. Microbiol. 1978. V. 105. P. 215 -218.

171. Manch R., Sand W. Acid stable cytochromes in ferrous cell-free preparations from Thiobacillus ferrooxidans IIFEMS Microbiol. Lett. 1992. V. 92. P. 83 88.

172. Mao M. W. H., Dugan P. R., Martin P. A.W., Tuovinen O. H. Plasmid DNA in chemoorganotrophic Thiobacillus ferrooxidans and Thiobacillus acidophilus II FEMS Microbiol. Lett. 1980. V. 8. № 3. P. 121 125.

173. Markosyan G. E. Leptospirillum ferrooxidans, gen. nov., sp. nov., a new iron-oxidizing bacterium // Biol. J. Armenia. 1972. V. 25. P. 26 29.

174. Marmur J. A. A procedure for the isolation DNA from microorganism // J. Mol. Biol. 1961. V.3.P. 208-218.

175. Martin P. A.W., Dugan P. R., Tuovinen O. H. Plasmid DNA in acidophilic chemo-autolitrophic Thiobacilli II Can. J. Microbiol. 1981. V. 27. № 8. P. 850 853.

176. McGoran C. J., Duncan D. W., Walden C. C. Growth of Thiobacillus ferrooxidans on various substrates // Canad. J. Microbiol. 1969. V. 15. № 1. p. 135 138.

177. Merroun M. L., Selenskapobell S. Interaction of 3 eco-types of with U (VI) // Bio-metals. 2001. V. 14. № 2. P. 171 179.

178. Nestor D., Valdiva U., Chaves A. P. Mechanism of bioleaching of a refractory minerals of gold with Thiobacillus ferrooxidans // Int. J. Mineral. Processing. 2001. V. 62. №1-4. P. 187- 189.

179. Norris P. R., Burton N. P., Foulis N. A. M. Acidophiles in bioreactor mineral processing// Extremophiles. 2000. V. 4. P. 71 76.

180. Olson G. I., Iverson W. P., Brinckman F. E. Volatilization of mercury by Thiobacillus ferrooxidans II Current Microbiol. 1981. V. 5. № 2. P. 115 118.

181. Olson G. I., Porter F. D., Rubinstein I., Silver S. Mercuric reductase enzyme from a mercury volatization strain of Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1982. V. 151. №3. P. 1230- 1236.

182. Oppon J. C., Sarnovsky R. J., Craig N. L., Rawlings D. E. A Tn 7-ike transposon is present in the glm US region of the obligately chemoautolitrophic bacterium Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 11. P. 3007 3012.

183. Owen R. J., Hill L. R., Lapage S. P. Determination of DNA base compositions from melting profiles in delute buffers // Biopolymers. 1969. V. 7. P. 503-516.

184. Peck H. D. Comparative metabolism of inorganic sulfur compounds in microorganisms // Bacterid. Rev. 1962. V. 26. P. 67 94.

185. Peng J. B., Yan W. W., Bao X. Z. (a) Expression of heterologous arsenic resistance genes in the obligately autotrophic biomining bacterium Thiobacillus ferrooxidans II Appl. Env. Microbiol. 1994. V. 60. № 7. P. 2653 2656.

186. Peng J. B., Yan W. W., Bao X. Z. (b) Plasmid and transposon transfer to Thiobacillus ferrooxidans II i. Bacterid. 1994. V. 176. № 10. P. 2892 2897.

187. Pichuantes S., Cofre G., Venegas A., Rodriguez M. (a) Studies on native strains of Thiobacillus ferrooxidans. I. Growth characteristics and antibiotic susceptibility // Biotechnol. Appl. Biochem. 1986. V. 8. № 4. P. 276 283.

188. Pichuantes S., Garrido J., Leighton V., Rodriguez M. (b) Studies on native strains of Thiobacillus ferrooxidans. II. Comparative fine structure // Biotechnol. Appl. Biochem. 1986. V. 8. № 4. P. 284 291.

189. Pramila T., Rao G. R., Natarajan K. A., Rao C. D. Differential influence of ions on the copy number of plasmids in Thiobacillus ferrooxidans II Curr. Microbiol. 1996. V. 32. №1. P. 57-63.

190. Pretorius I. M., Rawlings D. E., Woods D. R. Identification and cloning of Thiobacillus ferrooxidans structural «//genes in Escherichia coli II Gene. 1986. V. 45. P. 59 65.

191. Pretorius I. M., Rawlings D. E., O'Neill E. G., Jones W. A., Kirby R., Woods D.

192. R. Nucleotide sequence of the gene encoding the nitrogenase iron protein of Thioba-cillus ferrooxidans I11987. V. 169. № 1. P. 367 370.

193. Pronk J. T., Meulenberg R., Hazen W., Bos P., Kuenen J. G. Oxidation of reduced inorganic sulfur compounds by acidophilic thiobacilli // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 75. № 2 3. P. 293-306.

194. Pronk J. T., Kiem K., Bos P., Kuenen J. G. (a). Energy transduction by anaerobic ferric iron respiration in Thiobacillus ferrooxidans II Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 2057-2062.

195. Pronk J. T., Meijer W. M., Haseu W., Dijken J. P., Bos P., Kuenen J. G. (b). Growth of Thiobacillus ferrooxidans on formic acid // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 2057-2062.

196. Ramesar R. S., Woods D. R., Rawlings D. E. Cloning and expression of a rec Alike gene from the acidophilic autotroph Thiobacillus ferrooxidans II J. Gen. Microbiol. 1988. V. 134. P. 1141 1146.

197. Ramesar R. S., Abratt V., Woods D. R., Rawlings D. E. Nucleotide sequence and expression of a cloned Thiobacillus ferrooxidans rec A gene in Escherichia coli II FEBS Lett. 1989. V. 242. № 2. P. 439 443.

198. Rawlings D. E. Sequence and structural analysis of the a- and ^-dinitrogenase sub-units of Thiobacillus ferrooxidans II Gene. 1988. V. 65. P. 337 -343.

199. Rawlings D. E. (a). The genetic manipulation of bacteria for bioleaching // Biohy-drometallurgy 1989 / Eds. Salley J., McCready R. G. Z. Ottawa: Canadian Center for Mineral and Energy Technology, 1989. P. 105-113.

200. Rawlings D. E. The molecular genetics of Thiobacillus ferrooxidans and other mesophilic, acidophilic, chemolithotrophic iron- or sulfur-oxidizing bacteria // Hy-drometallurgy. 2001. V. 59. № 2 3. P. 187 - 201.

201. Rawlings D. E., Kusano T. Molecular genetics of Thiobacillus ferrooxidans II Microbiol. Rev. 1994. V. 58. № 1. P. 39 55.

202. Rawlings D. E., Silver S. Mining with microbes // Biotechnology. 1995. V. 13. P. 773 775.

203. Rawlings D. E., Woods D. R. Mobilization of Thiobacillus ferrooxidans plasmids among Escherichia coli strains // Appl. Env. Microbiol. 1985. V. 49. № 5. P. 1323 -1325.

204. Rawlings D. E., Jones W. A., O'Neill E. G., Woods D. R. Nucleotide sequence of the glutamine synthetase gene and its controlling region from the autotroph Thiobacillus ferrooxidans II Gene. 1987. V. 53. P. 211 217.

205. Rawlings D. E., Mjoli N. M., Woods D. R. The cloning and structure of genes from the autotrophic biomining bacterium Thiobacillus ferrooxidans II Advances in Technology / Eds. Greenaway P. J. London: Press Ltd, 1991. V. 2. P. 215 237.

206. Rawlings D. E., Dorrington R. A., Rohrer J., Clennel A. M. A molecular analysis of the replication and mobilization regions of a broad-host-range plasmid, isolated from Thiobacillus ferrooxidans IIFEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. № 1 3. P. 3 -8.

207. Remsen C., Lundgren D. G. Electron microscopy of the cell envelope of Thiobacillus ferrooxidans prepared by freeze-etching and chemical fixation techniques // J. Bacterid. 1966. V. 92. P. 1765 1771.

208. Roberto F. F., Bruhn D. F. Genetic improvement of acidophilic bacteria for biohy-drometallurgical applications // Geomicrobiology J. 1992. V. 10. № 3 4. P. 249255.

209. Rodriguez-Levia, Tributsch H. Morphology of bacterial leaching patterns by Thiobacillus ferrooxidans on synthetic pyrite // Arch. Microbiol. 1988. V. 149. P. 401 -405.

210. Rohrer J., Rawlings D. E. Sequence analysis and characterization of the mobilization region of the broad-host-range plasmid pTF-FC2, isolated from Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacterid. 1992. V. 174. № 19. P. 6230 6237.

211. Rojas-Chapana J. A., Giersig M., Tributsch H. The path of sulfur during the bio-oxidation of pyrite by Thiobacillus ferrooxidans II Fuel. 1996. V. 75. № 8. P. 923 -930.

212. Rojas-Chapana, Bartels C. C., Pohlman L., Tributsch H. D. Cooperative leaching and chemotaxis of thiobacilli studied with spherical sulfur / sulfide substrates // Process Biochem. 1998. V. 33. № 3. P. 239 248.

213. Rojas-Chapana J. A., Tributsch H. Biochemistry of sulfur extraction in biocorrosion of pyrite by Thiobacillus ferrooxidans II Hydrometallurgy. 2001. V. 59. №2.3. P. 291 -230.

214. Rosselo-Mora R., Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25. P. 39 67.

215. Roy A. B., Trudinger P. A. The biochemistry of inorganic compounds of sulfur. Cambridge: Cambridge University Press, 1970. P. 61 62.

216. Sagredo B., Jedlicki E., Orellana O. Organization of the 16S 23S intergenic spacer region of the two rRNA operons from Thiobacillus ferrooxidans II Geomi-crobiology J. 1992. V. 10. № 3 - 4. P. 239 - 247.

217. Salazar O., Takamiya M., Orellana O. Characterization of the two rRNA gene operons present in Thiobacillus ferrooxidans IIFEBS Lett. 1989. V. 242. № 2. P. 439 -443.

218. Sanchez H., Hevia E., Caceres B., Venegas A. Studies on native strains of Thiobacillus ferrooxidans. IV. Isolation, physical map and partial cloning of a cryptic plas-mid // Biotechnol. Appl. Biochem. 1986. V. 8. № 4. P. 300 308.

219. Sand W. Ferric iron reduction by Thiobacillus ferrooxidans of extremely low pH values //Biogeochemistiy. 1989. V. 7. P. 195 201.

220. Sand W., Gehrke T., Hallman R., Shippers A. Sulfur chemistry, biofilm and the (in) direct attack mechanism a critical evaluation of bacterial leaching // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 43. P. 961 - 966.

221. Sand W., Gehrke T., Jozca P. G., Shippers A. Biochemistry of bacterial leaching -direct versus indirect bioleaching // Hydrometallurgy. 2001. V. 59. № 2 3. P. 159 -175.

222. Sanger F., Nicklen S., Coulsen A. R. DNA sequencing with chain-terminating ingibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 84. P. 5463 5467.

223. Segerer A. Neuner A., Kristjansson J. K., Stetter K. O. Acidianus infernos gen. nov. facultatively aerobic, extremely acidophilic thermophilic sulfur-metabolizing ar-chaebacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. № 4. P. 559 564.

224. Shaffia F., Wilkinson R. F. Growth of Ferrobacillus ferrooxidans on organic matter// J. Bacteriol. 1969. V. 97. № 1. P. 256 260.

225. Shaffia F., Brinson K. R., Heinzman M. W., Brady J. B. Transition of chemolith-otroph Ferrobacillus ferrooxidans to obligate organotrophy and metabolic capabilities of of glucose-growth cells // J. Bacteriol. 1972. V. 11. № 1. P. 56 65.

226. Shippers A., Sand W. Bacterial leaching of metal sulfides proceeds by two indirect mechanisms via thiosulphate or via polysulphides and sulfur // Appl. Env. Microbiol. 1999. V. 65. №1. P. 319 -321.

227. Shiratory F., Inoue C., Sugawara K., Kusano T., Katagama Y. Cloning end expressing of Thiobacillus ferrooxidans mercury ion resistance genes in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1989. V. 171. № 4. P. 3458 3464.

228. Shiratory T., Inoue C., Numata M., Kusano T. Characterization and cloning of plasmid from the iron-oxidizing bacterium Thiobacillus ferrooxidans II Curr. Microbiol. 1991. V. 23. P. 321 -326.

229. Schrader J. A., Holmes D. S. Phenotypic switching of Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 3915 30223.

230. Silver M., Lundgren D. G. (a). Sulfur-oxidizing enzyme of Ferrobacillus ferrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans) II Can. J. Biochem. 1968. V. 46. P. 457 461.

231. Silver M., Lundgren D. G. (b). The thiosulphate oxidizing enzyme of Ferrobacillusferrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans) II Canad. J. Biochem. 1968. V. 46. P. 1215.

232. Silver S., Walderhaug M. Gene regulation of plasmid and chromosome-determined inorganic ion transport in bacteria // Microbiol. Rev. 1992. V. 56. P. 195 228.

233. Silverman M. P., Ehrlich H. L. Microbial formation and degradation of minerals // Adv. Appl. Microbiol. 1964. V. 6. P. 153 206.

234. Silverman M. P., Lundgren D. C. Study the chemoautotrophic iron bacterium Fer-roobacillus ferrooxidans. I. An improved medium and harvesting procedure for securing high cell yieid // J. Bacterid. 1959. V. 77. № 5. P. 642 647.

235. Sinha D. B., Walden C. C. Formation of polithionates and their interrelationships during oxidation of thiosulphate by Thiobacillus ferrooxidans II Can. J. Microbiol. 1966. V. 12. P. 1041 1054.

236. Sobral B. W. S., Atherly A. G. Puis time and agarose concentration affect the elec-trophoretic mobility of ccc DNA during electrophoresis in CHEF and in FIGE // Nucleic. Acid Res. 1989. V. 17. № 18. P. 7359 7369.

237. Stevens C. J., Dugan P. R., Tuovinen O. H. Acetylene reduction (nitrogen fixation) by Thiobacillus ferrooxidans II Biotechnol. Appl. Biochem. 1986. V. 8. № 4. P. 351 -359.

238. Sugio T., Kudo S., Tano T., Imai K. Glucose transport system in a facultative iron-oxidizing bacterium Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacterid. 1982. V. 150. P. 1109 -1114.

239. Sugio T., Domatsu C., Tano T., Imai K. Role of ferrous ions in synthetic cobaltous sulfide leaching of Thiobacillus ferrooxidans II Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 48. №3. P. 461 -467.

240. Sugio T., Domatsu C., Manakata O., Tano T., Imai K. Role of a ferric iron-reducing system in sulfur oxidation by Thiobacillus ferrooxidans II Appl. Environ. Microbiol. 1985. V. 49. P. 1401 1406.

241. Sugio T., Mizunashi W., Tano T., Imai K. Production of ferrous ions as intermediates during aerobic sulfur oxidation in Thiobacillus ferrooxidans II Agric. Biol.

242. Chem. 1986. V. 50. P. 2755 2761.

243. Sugio T., Mizunashi W., Inagaki K., Tano T. Purification and some properties of sulfur: ferric ion oxidoreductase from Thiobacillus ferrooxidans I I J. Bacterid. 1987. V. 169. № 11. P. 4916-4992.

244. Sugio T., Katagiri T., Moriyama M., Zhen Y. L., Inagaki K., Tano T. (a) Existence of a new type of sulfite oxidase which utilizes ferric ions as an electron acceptor in Thiobacillus ferrooxidans II Appl. Env. Microbiol. 1988. V. 54. № 1. P. 153 175.

245. Sugio T., Tsugita Y., Katagari T., Inagaki K., Tano T. (b) Reduction of Mo6* with elemental sulfur by Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1988. V. 170. № 2. P. 5956 5959.

246. Sugio T., Katagiri T., Inagaki K., Tano T. Actual substrate for elemental sulfur oxidation by sulfur: ferric ion oxidoreductase purified from Thiobacillus ferrooxidans II Biochem. Biophys. Acta. 1989. V. 973. P. 250 256.

247. Sugio T., Hirayama K., Inagaki K., Tanaka H., Tano T. (a). Molybdenum oxidation by Thiobacillus ferrooxidans II Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 1768 -1771.

248. Sugio T., Hirose T., Ye Li-Zhen, Tano T. (b). Purification and some properties of sulfite: ferric ion oxidoreductase purified from Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 4189.

249. Sugio T., Kuwano H., Negishi A., Macda T., Takeuchi T., Kamimura K. (b).

250. Mechanism of growth-inhibition by tungsten in Acidithiobacillus ferrooxidans II Bioscience Biotechnol. Biochem. 2001. V. 65. № 3. p. 555 . 562.

251. Suzuki I. Microbial leaching of metals from sulfide minerals // Biotechnol. Adv. 2001. V. 19. №2. P. 119-132.

252. Tabita R., Silver M., Lundgren D. G. The rhodonase enzyme of Ferrobacillus ferrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans) II Can. J. Biochem. 1969. V. 47. P. 1141 -1145.

253. Torma A. E. The role of Thiobacillus ferrooxidans in hydrometallurgical processes // Adv. Biochem. Eng. 1977. V. 6. P. 1 38.

254. Tributsch H. Direct versus indirect bioleaching // Hydrometallurgy. 2001. V. 52. № 2-3. P. 177 185.

255. Trudinger P. The metabolism of inorganic sulfur compounds by Thiobacilli II Rev. Pure and Appl. Chem. 1967. V. 17. P. 1 8.

256. Tuovinen O. H., Niemela S. I., Gullenberg H. G. Tolerance Thiobacillus ferrooxidans to some metals // Ant. van Leeuwenhoek J. Microbiol. Serol. 1971. V. 37. № 4. P. 489-496.

257. Tuovinen O. H., Kelly D. P. Biology of Thiobacillus ferrooxidans in the microbiological leaching of sulfide ores // Z. Allg. Microbial. 1972. V. 12. P. 311 346.

258. Tuovinen O. H., Kelly D. P. Studies of the growth of Thiobacillus ferrooxidans. II. Toxicity of uranium to growing cultures and tolerance conferred by mutation other metal cations and EDTA // Arch. Microbiol. 1974. V. 95. № 2. P. 153 169.

259. Tuovinen O. H., Panda F. A., Tsuchiya H. M. Nitrogen requirement of iron-oxidizing Thiobacilli for acidic ferric sulfate regeneration // Appl. Environ. Microbiol. 1979. V. 37. № 5. P. 954 958.

260. Tuttle J. H., Dugan P. R. Inhibition of growth iron and sulfur oxidation in Thiobacillus ferrooxidans by simple organic compounds // Canad. J. Microbiol. 1976. V. 22. P. 719-730.

261. Tuttle J. H., Dugan P. R., Apel W. A. Leakage of cellular material from Thiobacillus ferrooxidans in the presence of organic acids in the acidophile Thiobacillus ferrooxidans II J. Gen. Microbiol. 1977. V. 33. P. 459 469.

262. Ursing J. B., Rosselo-Mora R. A., Garsia-Valdes E., Lalucat J. Taxonomic note: a pragmatic approach to the nomenclature of phenotypically similar genomic groups // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P. 604.

263. Valenti P., Polidoro M., Buonfiglio V., Visca P., Orsi N. Comparative analysis of Thiobacillus ferrooxidans strains // Biohydrometallurgy 1989 / Eds. Salley J., McCready R. G. L. Ottawa: CANMET, 1989. P. 187 - 201.

264. Valenti P., Polidoro M., Buonfiglio V., Visca P., Orsi N. Plasmid DNA profiles in Thiobacillus ferrooxidans II J. Gen. Appl. Microbiol. 1990. V. 36. P. 351 355.

265. Vandamme P., Pot B„ Gillis M., De Vos P., Swings J. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Rev. 1996. V. 60. P. 407 -438.

266. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: environment // Comput.

267. Applic. Biosci. 1994. V. 10. P. 569 570.

268. Vestal J. R., Lundgren D. G. The sulfite oxidase of Thiobacillus ferrooxidans (Ferrobacillusferrooxidans) II Can. J. Biochem. 1971. V. 49. P. 1125 1130.

269. Waksman S. A., Ioffe I. S. Microorganisms concerned with the oxidation of sulfur in soil. II. Th. thiooxidans, a new sulfur oxidizing organism isolated from the soil // J. Bacterid. 1922. V. 7. № 2. P. 239.

270. Wang W. S., Korczinski M. S., Lundgren D. G. Cell envelope of an iron oxidizing bacterium: studies of lipopolisaccharide and peptidoglycan // J. Bacterid. 1970. V. 104. №1. P. 556-565.

271. Wichlacz P. L., Unz R. E. Acidophilic heterotrophic bacteria of acid mine wastes // Appl. Environ. Microbiol. 1981. V. 41. P. 1254 1261.

272. Yamanaka T., Fukimori Y. Molecular aspects of the electron transfer system, which participates in the oxidation of ferrous ion by Thiobacillus ferrooxidans II FEMS Microbiol. Rev. 1995. V. 17. № 4. P. 401 413.

273. Yates J. R., Holmes D. S. Two families of repeated DNA sequences in Thiobacillus ferrooxidans IIBacteriol. 1987. V. 169. № 5. P. 1861 1870.

274. Yates J. R., Cunnigham R. P., Holmes D. S. IST2: An insertion sequence from Thiobacillus ferrooxidans II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 7284 -7287.

275. Yong Ng K., Oshima M., Blake R. C., Sugio T. Isolation and some properties of an iron-oxidizing bacterium Thiobacillus ferrooxidans resistant to molybdenum ion // Bioscience, Biotechnol. Biochem. 1997. V. 61. № 9. P. 1523 1526.

276. Zhao H. L., Holmes D.S. Insertion sequence IST1 and associates phenotypic switching in Thiobacillus ferrooxidans II Biohydrometallurgical technologies / Eds. Torma A. E., Apel M. L., Brierley C. L. Wyoming, 1993. V. 2. P. 667 671.

Информация о работе

Агеева, Светлана Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.07

Диссертация

Фенотипический и генотипический полиморфизм штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно