Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пути метаболизма сульфобацилл при различных типах питания

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Пути метаболизма сульфобацилл при различных типах питания"

003455Э0Э

На правах рукописи

Журавлева Анна Евгеньевна

ПУТИ МЕТАБОЛИЗМА СУЛЬФОБАЦИЛЛ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ПИТАНИЯ

Специальность 03.00.07. - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

*

Москва - 2008

003455989

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РЛН и на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: Чл.-корр. РАН

к.б.

Официальные оппоненты: д.б.н., проф. Г.И. Эль-Регистан

д.б.н., проф. Т.С. Калебина

Ведущая организация: Российский химико-

технологический университет им. Д.И. Менделеева

Г.И. Каравайко н. И.А. Цаплина

Защита диссертации состоится " 22 " декабря 2008 года в 12 00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу:

117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им.С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан " ноября 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сульфобациллы - уникальная группа аэробных грамположительных спорообразующих экстремально ацидофильных бактерий семейства Alicydobacillaceae, окисляющих и сульфидные минералы.

Большинство представителей рода Sulfobacillus - умеренные термофилы; оптимальный тип питания - миксотрофный, когда одновременно используются метаболические пути окисления неорганических и органических соединений (глюкоза, дрожжевой экстракт и др.); также возможен рост в течение ряда пересевов (Захарчук, 2006) при хемоорганогетеротрофном и хемолитоавтотрофном типах питания. Местами обитания сульфобацилл являются отвалы сульфидных руд, кислые гидротермы, шахтные воды, месторождения сульфидных минералов, где температура варьирует в пределах 10-60°С.

Сульфобациллы являются постоянными членами сообществ микроорганизмов в области температур до 50 С, играя важную роль в биогидрометаллургических процессах. К настоящему времени подробно исследованы экофизиология и выщелачивающая активность этих бактерий (Каравайко и др., 2006). Значительные успехи также достигнуты в изучении центрального конструктивного метаболизма умеренно термофильных представителей рода Sulfobacillus в области оптимальных температур (Wood, Kelly, 1990; Захарчук и др., 1994), тогда как при температурах, близких к предельным для роста, характерных для мест обитания умеренно термофильных сульфобацилл, в природных и техногенных эконишах, сведений нет. Данные об энергетическом обмене фрагментарны. В литературных источниках не представлено информации о процессах энергообеспечения клеток сульфобацилл в форме АТФ; остается неясной роль органических субстратов при миксотрофном типе питания этих бактерий. Электронтранспортная система (ЭТС) сульфобацилл практически не изучена: предполагается функционирование отдельных переносчиков электронов у бактерий, позднее отнесенных к видам рода Sulfobacillus (Barr et al., 1990; Blake et al., 1993).

Исследование особенностей метаболизма штаммов сульфобацилл имеет большое значение как для решения теоретических задач, так и практического применения. Изучение путей метаболизма сульфобацилл при изменении условий культивирования - при переключении с оптимального миксотрофного на лито- и органотрофный типы питания, изменении содержания кислорода, температуры, в условиях нестабильного снабжения органическими веществами, является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение конструктивного обмена новой термотолерантной бактерии S. thermotolerans KrlT, выделенной при 30 С, и особенностей энергетического метаболизма представителей рода Sulfobacillus при различных типах питания и температурах роста.

Задачи исследования включали:

1. Подробную характеристику фенотипических свойств термотолерантной культуры 5. 1кегто1о1егапк Кг1т - роста и центральных путей углеродного метаболизма, при различных типах питания и предельных температурах.

2. Изучение энергетического обмена 5. ЛегтоШегат Кг1 и умеренного термофила 5. 5г'Ьг'пс«5 Ы1т: установление взаимосвязи внутриклеточного уровня АТФ с типом питания, определение субстратов - доноров электронов и акцепторов электронов, исследование ЭТС при окислении Ре(П).

3. Исследование возможности использования термофильных сульфобацилл для биоокисления упорных золотомышьяковых концентратов сульфидных руд Олимпиадинского месторождения при 50°С. Выделение преобладающих культур из термофильной ассоциации.

Научная новизна. В результате исследования активности ферментов катаболизма углеводов обнаружено, что у термотолерантной бактерии •У. Легто1о1егат Кг1т, в отличие от умеренно термофильных сульфобацилл, функционируют три главные пути метаболизма Сахаров - путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, окислительный пентозофосфатный и путь Энтнера-Дудорова при различных типах питания (миксо-, органогетеро- и литоавтотрофном). В условиях предельных температур роста (12 и 55°С) сохранение жизнеспособности и окислительной активности клеток сульфобацилл обеспечено ферментными системами путей Эмбдена-Мейергофа-Парнаса и Энтнера-Дудорова, что объясняет присутствие бактерий и их функционирование в местах обитания при низких и высоких температурах. Впервые исследована динамика пула АТФ и потребление субстратов в процессе миксо-, органо- и литотрофного роста сульфобацилл, установлена взаимосвязь этих процессов. Обнаружены различия в динамике пула АТФ, окисления субстратов и роста культур сульфобацилл при различных типах питания. Предложено использовать величину пула АТФ в качестве показателя эффективности роста и энергетического метаболизма сульфобацилл.

Выявлено сопряжение синтеза АТФ с функционированием электронтранспортной системы (ЭТС) при окислении неорганического и/или органических субстратов. Таким образом, органические вещества являются как источником углерода, так и донором электронов для ЭТС в условиях миксотрофии. Установлено использование бактериями X зШпсия Шт и £ ЛегтоШегат Кг1 альтернативного кислороду акцептора электронов - Ре(Ш), в условиях гипоксии и пониженного содержания кислорода в газовой фазе.

Обнаружено, что ЭТС 5. яШпсш N1 разветвлена и обеспечивает эффективное окисление железа при различном содержании 02. Система переноса электронов 51. «б/псг« N1 при окислении Ре(П) в начале роста включает кислотоустойчивый

растворимый цитохром с и цитохромоксидазу см^-типа, в конце роста - цитохром с, мембрансвязанный высокопотенциальный цитохром ¿573 и цитохромоксидазу Ьо}-типа. Впервые выявлен состав гемов цитохромов у штаммов S. sibiricus N1 (гемы А, В, С и О) и S. thermotolerans Krl (А и В, не исключено наличие гема С).

Практическая значимость. Лабильность конструктивного и энергетического метаболизма умеренно термофильных сульфобацилл впервые позволила реализовать биовыщелачивание упорных золотомышьяковых концентратов при 50°С в режиме двустадийного полунепрерывного процесса в лабораторных реакторах. Выделены новые штаммы сульфобацилл и отнесены к виду Sulfobacillus sibiricus.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на П-ой (международной) и IV-ой (с международным участием) молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, ИНМИ РАН им. С.Н. Виноградского, 2006, 2008 гг.), 4-м московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.), 17-м Международном симпозиуме по биогидрометаллургии (Германия, 2007 г.), международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, ИНМИ РАН им. С.Н. Виноградского, 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации, включая тезисы, опубликовано 10 работ; 1 статья сдана в печать.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 190 страницах машинописного текста, включают 20 таблиц и 37 рисунков Диссертация состоит из введения, четырех глав («Обзор литературы», «Объекты и методы исследований», «Результаты» и «Обсуждение»), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает отечественных и иностранных работ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными объектами исследования были 2 вида сульфобацилл -термотолерантныи штамм Ъ. thermotolerans Кг Г (ВКМ B-2339T=DSM 17362т), выделенный из пульпы концентрата пирротиновой золото-пиритно-мышьяковой руды Восточной Сибири (Bogdanova et al., 2006), и умеренно термофильный штамм S. sibiricus N1T (ВКМ B-2380T=DSM 17363т), выделенный из опытно-промышленной установки из пульпы концентрата пиритно-арсенопиритной золотосодержащей руды Нежданинского месторождения Якутии (Меламуд и др., 2003). Для изучения взаимосвязи внутриклеточного пула АТФ с типом питания, кроме упомянутых штаммов, были также взяты другие ацидофильные бактерии: умеренно

термофильная S. thermosulfidooxidans 1269T (BKM B-1269T=DSM 9293т) (Головачева и др., 1978), миксотрофная бактерия Alicyclobacillus (Alb.) tolerans К1Т (BKM В-2304T=DSM 16297т) (Коваленко, Малахова, 1983, Karavaiko et al., 2005), автотроф Acidithiobacillus (At.) ferrooxidans TFBk (Агеева и др., 2001) и облигатные гетеротрофы Alb. acidocaldarius (АТСС 27009т = DSM 446т) и Alb. cycloheptanicus (DSM 4006т = АТТС 49029т).

Среды и условия культивирования. Культивирование штаммов сульфобацилл и ацидитиобациллы проводили на среде 9К (Silverman, Lundgren, 1959) с Fe(II) (2.5 и 9.0 г/л соответственно), pH 1.7-1.8, и/или глюкозой (1.1 мМ) и дрожжевым экстрактом (0.02%) (в случае сульфобацилл). Сахара (0.02%), аминокислоты (0.02% по углероду) и глицерин (1-3 мМ) добавляли к среде 9К для создания гетеротрофных условий. Миксотрофную алициклобациллу выращивали на модифицированной среде Маннинга (Manning, 1975), pH 2.5, при 37°С с 1.0-1.5 г/л Fe(II) и 3-5 мМ Na2S203 и/или с добавлением глюкозы (1.1 мМ) и дрожжевого экстракта (0.02%). Гетеротрофные алициклобациллы культивировали на среде ВАМ при 45-55°С, pH 4.0 (Darland, Brock, 1971) с глюкозой (0.5%) и дрожжевым экстрактом (0.2% - в случае Alb. acidocaldarius; 0.5% - для Alb. cycloheptanicus). Штаммы N1, 1269, TFBk выращивали соответственно при температурах 55, 50 и 28°С, штамм Krl - при 40°С и предельных температурах роста - 12 и 55°С. Периодическое культивирование штаммов проводили в колбах Эрленмейера (на 250 мл со 100 мл среды) при 180 об/мин, в конических колбах на 2.5 л при интенсивной аэрации (Цаплина и др., 2006, 2008), в 5-л бутылях с 4 л среды при парциальном давлении воздуха, а также в пробирках Хангейта объемом 18 мл (объем среды - 15 мл) с 17%о кислорода в газовой фазе. Объем посевного материала составлял 10 об%. В условиях гипоксии (0.07% Ог) 40-мл флаконы содержали 18 мл среды (с 20 об% посевного материала). Полунепрерывное культивирование проводили в 2* ферментерах объемом 3 л с 1 л среды, со скоростью подачи воздуха 4 л/мин, перемешиванием при 470 об/мин и D=0.0042 ч\ Для выделения преобладающих серо-, железо- и концентрат-окисляющих культур использовали среду 9К с 0.02% дрожжевого экстракта и 0.5% S0, 2.5 г/л Fe(II) или 5% концентрата соответственно. Для создания условий гипоксии среду кипятили, остужали, разливали в 40-мл флаконы в токе азота, барботировали СОг и асептически вносили посевной материал и Fe(III).

Посевной материал штаммов получали в оптимальных для них условиях (Цаплина и др., 2006). Чистоту культур проверяли посевом на агаризованные среды - МПА, ВАМ или агарозную среду (Johnson, 1995) и микроскопированием.

Методы исследования. Рост культур оценивали прямым счетом количества клеток под микроскопом с фазово-контрастным устройством и методом Лоури для определения содержания белка (Lowry et al., 1951). Концентрацию ионов Fe(III) и Fe(II) и содержание глюкозы определяли комплексонометрическим и антроновым методами соответственно (Резников и др., 1970; Ashwell, 1957). Подготовку

биомассы для измерения активности ферментов углеродного обмена проводили, как описано (Захарчук и др., 1994). Активности карбоксилирующих ферментов бесклеточных экстрактов и фиксацию 14С02 клеточными суспензиями определяли радиоизотопным методом (Романова, 1980; Ивановский, 1980), остальных ферментов углеродного обмена - спектрофотометрически/колориметрически (Захарчук и др., 1994). Подготовку биомассы для измерения пула АТФ проводили согласно (Цаплина и др., 2007), определение АТФ - биолюминесцентным методом (Угарова и др., 1993). Для ингибиторного анализа АТФ-азы использовали 200 мкМ дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД). Измерение скорости дыхания клеток проводили на полярографе с платиновым электродом Кларка. Для исследования ЭТС подготовку биомассы, фракционирование клеток, получение пиридиновых производных гемохромов и анализ спектров проводили, как описано (Strom et al., 2001; Цаплина и др., 2008). ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) в обращенной фазе проводили по методу (Soné, Fujiwara, 1991), ДС-Na (додецилсульфат Ыа)-электрофорез - по методике (Laemmli, 1970). Концентрации ингибиторов железооксидазной активности составляли 1-20 мМ (KCN) и 1-30 мМ (NaN3). Содержание кислорода в газовой фазе регистрировали на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Для идентификации штаммов выделяли и очищали хромосомную ДНК по методике (Marmur, 1961), использовали методы рестриктного анализа ДНК с помощью высоковольтного пульс-электрофореза (Кондратьева, Каравайко, 1992), ДНК/ДНК-гибридизации (De Ley et al., 1970) и определения содержания нуклеотидных пар Г+Ц в ДНК (Owen et al., 1969). Данные обрабатывали статистическими методами (Зайцев, 1973; Лакин, 1990), достоверность показателей оценивали с помощью /-критерия Стьюдента, принимая достаточным уровень значимости Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фенотипические характеристики S. thermotolerans Krl. Недавно выделенная бактерия S. thermotolerans Krl была кратко охарактеризована (2006 г.), в данной работе изучены фенотипические свойства более подробно. У термотолерантного штамма Krl минимальное время генерации при лимитирующих рост температурах - 12-14 и 55°С - увеличивалось, соответственно, до 7.6 и 38 ч, т. е. в 2 и 10 раз по сравнению с оптимальной температурой. В отличие от умеренно термофильного штамма S. sihiricus N1, термотолерантная бактерия S. thermotolerans обладала более широким набором органических веществ (малат, глюкоза, фруктоза, сахароза, восстановленный глутатион, дрожжевой экстракт, глицерин).

Фиксация ЫС02 клетками S. thermotolerans Krl и активность карбоксилирующих ферментов. В варианте с внесением закисного железа в среду инкубации уровень ассимиляции ИС02 штаммом Krl был максимальным - 558.9 нмоль С02/мг белка (рис. 1). Штамм имеет широкий спектр карбоксилирующих

ферментов, проявляющих активность при всех типах метаболизма. Активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О) у 5. 1кегто1о1егат Кг1 максимальна при литоавтотрофном типе питания - 7.2 нмоль/(мин-мг белка), хотя сохраняется и при органогетеро- и миксотрофном типах питания (1.1 и 4.9 нмоль/(мин-мг белка)). Активность анаплеротических карбоксилаз -пируваткарбоксилазы, ФЕП (фосфоенолпируват)-карбоксилазы и ФЕП-карбокситрансфосфорилазы - мало зависит от типа питания. Таким образом, карбоксилазы 1кегто1о1ега!к Кг1 подтверждают пластичность метаболизма, позволяя переключаться с миксотрофного на другие типы питания, и обеспечивают дополнительное использование углерода из минерального источника.

Рис. 1. Фиксация 14С02 клеточной суспензией 5. ¡НегтоЫегапз Кг1 при добавлении в инкубационную среду: 1 - Ре(П); 2 - Ре(П), глюкозы и дрожжевого экстракта; 3 - глюкозы и дрожжевого экстракта. 4 - контроль. Количество клеточного белка в инкубационной среде -1 мг.

Катаболизм углеводов ЖегтоЫегат Кг1. Отличия конструктивного обмена термотолерантной сульфобациллы от умеренно термофильных штаммов связаны с наличием при всех типах обмена активности ферментов трех главных путей центрального катаболизма углеводов (табл. 1). Судя по величинам ключевых ферментов, приоритетная роль при миксотрофном и литотрофном росте штамма принадлежит фруктозобисфосфатному пути. При смене миксотрофного типа питания на литоавтотрофный активность ферментов пути Энтнера-Дудорова

(ключевые ферменты - 6-фосфоглюконатдегидратаза и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза) и окислительного пснтозофосфатного пути (один из ключевых ферментов - 6-фосфоглюконатдегидрогеназа) снижается. При пересеве в гетеротрофные условия, кроме гликолитического, приоритетным становится также и путь Энтнера-Дудорова. При температурах роста, близких к предельным, время генерации увеличивается в 2 раза при 55°С и в 10 раз при 12-14°С, снижается активность ферментов, особенно при высокой температуре (в 2-30 раз), утрачивается пентозофосфатный путь окисления глюкозы. Тем не менее, клетки сохраняют свои окислительные свойства и жизнеспособность.

Ферменты ЦТК и глиоксилатного шунта S. thermotolerans Krl. Активность 2-оксоглутаратдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах термотолерантного штамма Krl, как и у всех изученных сульфобацилл, не обнаружена, ЦТК не замкнут и выполняет биосинтетическую функцию. При смене источника энергии ферменты ЦТК сохраняют активность, за исключением фумаратгидратазы, активность которой не выявлена при органотрофном росте штамма. Глиоксилатный шунт не функционирует из-за отсутствия активности ферментов этого цикла. При температурах 55 и 12—14°С обнаружена активность всех ферментов, за исключением 2-оксоглутаратдегидрогеназы и аконитатгидратазы.

Таким образом, можно отметить способность S. thermotolerans Krl выживать при изменениях типа питания и температуры. Это обеспечивается функционированием различных путей катаболизма гексоз, цикла Кальвина, реакциями анаплеротического карбоксилирования ФЕП и пирувата. Эти механизмы позволяют в результате регуляторных перестроек S. thermotolerans Krl переходить с оптимального миксотрофного на литоавто- или органогетеротрофный типы питания и сохранять жизнеспособность в изменяющихся условиях техногенных экониш и промышленных реакторов.

Пул АТФ в динамике роста штаммов сульфобацилл и окисления субстратов. Одной из важных характеристик микроорганизма является его энергетический показатель. Сравнение данных по накоплению и расходованию АТФ в процессе органотрофного роста миксотрофных бактерий на среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом (рис. 2, табл. 2) показало, что штамм Alb. tolerans Kl, несмотря на более интенсивный синтез АТФ, рос менее эффективно (по выходу белка), чем S. thermotolerans Krl. У штамма К1, имеющего полный ЦТК и более высокую активность ферментов путей катаболизма углеводов и большую степень утилизации глюкозы (Каравайко и др., 2001; 2002), пул АТФ составил 3.1, у штаммов Krl, N1 и 1269 - 2.2, 0.7 и 0.5 нмоль/мг белка соответственно (табл. 2). Пониженные активности ферментов углеводного обмена, незамкнутость ЦТК у сульфобацилл - штаммов N1, 1269 и Krl - обуславливают более низкий уровень их органотрофного роста, по сравнению с ацидофильными гетеротрофными бактериями Alb. cycloheptanicus, шт. 4006, и Alb. acidocaldarius, шт. 27009, что

Таблица 1. Активность ферментов углеводного метаболизма (нмоль/(мин • мг белка)) штамма 5. 1кегто1о1егат Кг1, выращенного при различном типе питания

Фермент Тип питания

Миксотрофный Литоавтотрофный Органогетеротрофный

12—14°С 40°С 55°С

Гексокиназа (КФ 2.7.1.1 ) 22.3 24.0 3.1 7.1 10.2

Глюкозо-6-фосфат-цегидрогеназа (КФ 1.1.1.49) 27.8 70.1 4.5 28.1 31.0

6-Фосфоглюконат-цегидрогеназа (КФ 1.1.1.43) н.о. 9.6 и.о. 0.6 0.5

6-Фосфоглюконатдегидратаза (КФ 4.2.1.12) + 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат-альдолаза (КФ 4.1.2.14) 6.7 9.3 1.8 1.2 24.0

б-Фосфофруктокиназа (КФ 2.7.1.11) 16.0 28.1 10.9 26.2 10.6

Фруктозо-1,6-бисфосфат-альдолаза (КФ 4.1.2.13) 147.0 132.8 37.5 100.2 157.5

Дегидрогеназа 3-фосфо-глицеринового альдегида (КФ 1.2.1.12) 30.6 72.4 10.2 52.3 32.5

Примечание. Литоавтотрофный тип питания - Fe(II), миксотрофный - Fe(II), глюкоза (1.1 мМ), дрожжевой экстракт (0.02%), органогетеротрофный - глюкоза (1.1 мМ) и дрожжевой экстракт (0.02%).

иллюстрирует в 7-25 раз более низкий пул АТФ в клетках сульфобацилл, чем в клетках штаммов 4006 и 27009 (табл. 2). Причем, в начале роста и конце экспоненциальной фазы в клетках штаммов 4006 и 27009 уровень АТФ был в несколько раз выше, чем в клетках сульфобацилл, при их росте на среде с органическими субстратами. Часть популяции клеток сульфобацилл изменяла морфологию при смене оптимальных условий роста на гетеротрофные и была представлена раздутыми клетками.

В течение литотрофного роста окисление Fe(II) штаммами Кг1, 1269 и N1 (рис. 3) и Alb. tolerans Kl с низкой скоростью наблюдали сразу после перенесения бактерий из оптимальных миксотрофных условий. Автотрофные условия для этих микроорганизмов являются стрессовыми, о чем свидетельствует падение пула АТФ, предшествующее росту. Максимальный уровень пула АТФ, в сравнении с миксотрофными условиями, отличался у культур сульфобацилл и штамма К1 в 1.55.0 и более раз (табл. 2). В клетках облигатного хемолитоавтотрофа At. ferrooxidans TFBk содержание АТФ достигало 17.0 нмоль/мг белка, что на 1-2 порядка

Рис. 2. Органотрофный рост

N1 на среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом. 1 -белок, мкг/мл (рост), 2 - утилизация глюкозы, %, 3 - концентрация АТФ, нмоль/мг белка.

Таблица 2. Параметры роста и содержание АТФ в клетках исследованных культур

Тип питания Максимальная скорость роста, ч"1 Окисленное Fe(II), мМ Утилизация глюкозы, мМ Максимальное количество белка, мг/л Максимальный уровень АТФ, нмоль/мг белка

S. thermotolerans Krl

Миксотрофный 0.26 40 0.69 32.1 3.8

Органогетеротрофный 0.17 - 0.47 21.0 2.2

Литоавтотрофный 0.12 40 - 6.2 0.3

S. sibiricus N1

Миксотрофный 0.50 40 0.50 20.0 2.4

Органогетеротрофный 0.27 - 0.44 13.5 0.7

Литоавтотрофный 0.13 40 - 3.6 0.2

S. thermosulfidooxidans 1269

Миксотрофный 0.29 40 0.39 22.5 4.4

Органогетеротрофный 0.10 - 0.22 12.6 0.5

Литоавтотрофный 0.07 40 - 6.3 0.1

Alb. tolerans Kl

Миксотрофный 0.17 20 1.10 38.7 0.6

Органогетеротрофный 0.13 - 0.96 14.0 3.1

Литоавтотрофный 0.09 10 - 7.5 <0.1

Ai. ferrooxidans TFBk

Литовтотрофный | 0.20 | 144 | - | 16.2 17.0

Alb. cycloheptanicus 4006

Органогетеротрофный| 0.20 | - | 55.00 | 220.0 12.3

Alb. acidocaldarius 27009

Органогетеротрофный) 0.20 | - | 66.00 | 92.0 | 12.8

10 20 30

Время, ч

Рис. 3. Литотрофный рост 111егто$и1/и1оох1с1ат 1269 на среде с Ре(П). 1 - белок, мкг/мл (рост), 2 - окисление железа Ре(П), г/л, 3 - концентрация АТФ, нмоль/мг белка.

превышало величину пула АТФ у сульфобацилл. Значительно более высокий уровень АТФ отмечен и у других автотрофов (Eigener, 1975; Apel et al., 1980). При литотрофном типе питания сульфобациллы, штаммы Krl, N1 и 1269, в отличие от штамма К1, окисляли все внесенное в среду закисное железо. Смена условий выращивания с миксотрофных на автотрофные отрицательно сказалась на накоплении клеточной массы культур и морфологии клеток (часть популяции была представлена клетками меньших размеров). АТФ, полученный в результате окисления железа, тратится в ряде энергоемких процессов - цикл Кальвина, трансмембранный транспорт, механические перемещения, и, вероятно, обратный перенос электронов. Результаты экспериментов позволяют заключить, что энергия, полученная в автотрофных условиях в результате окисления неорганических соединений, является недостаточной для обеспечения роста бактерий, сравнимого с миксотрофным.

В оптимальных миксотрофных условиях (рис. 4) бактерии S. thermotolerans Krl, S. Sibiriern N1, S. thermosulfidooxidans 1269 и Alb. tolerans росли с наиболее высокими скоростями и накапливали наибольшую биомассу (табл. 2). В потреблении глюкозы и закисного железа наблюдали конкуренцию. У SI Sibiriern N1 Fe(II) частично ингибировало использование глюкозы на начальных этапах развития культуры; у S. thermotolerans Krl, S. thermosulfidooxidans 1269 и Alb. tolerans Kl, наоборот, глюкоза ингибировала потребление железа. Сравнение максимального пула АТФ в клетках культур, выращенных при миксотрофном типе питания, показало, что у S. thermosulfidooxidans 1269, S. thermotolerans Krl и S. sibiricus N1, пул АТФ в 4-7 раз выше, чем у Alb. tolerans Kl (табл. 2). Это свидетельствует о большей степени хемолитотрофии штаммов сульфобацилл, тогда как способность

штамма К1 к утилизации практически всей глюкозы, вносимой в среду, свидетельствует о его большей гетеротрофии. Таким образом, у штаммов 1269, Кг1 и К1 сопряженность процессов получения и использования энергии в оптимальных ростовых условиях выявляется довольно наглядно: прослеживается корреляционная зависимость между началом интенсивного роста культур и падением уровня АТФ в клетках этих бактерий. Сравнение данных по содержанию пула АТФ в клетках сульфобацилл, растущих при различных типах питания, позволяет сделать вывод, что миксотрофные условия являются оптимальными, поддерживающими неограниченное число пересевов этих бактерий.

60

| 40Т: м 2

о

| 20-

0

Время, ч

Пул АТФ, скорости дыхания и иигибирование синтеза АТФ в суспензиях клеток сульфобацилл. Поскольку АТФ, как было показано, образуется сульфобациллами при катаболизме глюкозы на уровне субстрата, одной из задач исследований было определение интенсивности синтеза АТФ при функционировании ЭТС при окислении неорганического и органических субстратов, а также проведение ингибиторного анализа и измерение скорости дыхания этих штаммов. Результаты изучения энергетического обмена на отмытых суспензиях клеток показали, что штаммы Кг1 и N1 синтезируют АТФ при внесении в среду инкубации Ре(Н) и/или органических соединений (табл. 3). Наблюдали подавление синтеза АТФ на 50-90% (табл. 3) в зависимости от субстрата окисления, дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД) - специфическим ингибитором синтеза АТФ. Измерение скорости поглощения 02 суспензиями клеток показало, что клетки обеих культур имеют достаточно высокие скорости дыхания, когда донором электронов являются как Ре(П), так и органические соединения. Быстрое восстановление скорости дыхания, показанное для штамма N1, выращенного при парциальном давлении воздуха, в отсутствие интенсивной аэрации, свидетельствует

Рис. 4. Миксотрофный рост 5.ЛегтаЫегат Кг1 на среде с Ре(П), глюкозой и дрожжевым экстрактом.

1 - белок, мкг/мл (рост),

2 - окисление Ре(Н), г/л,

3 - потребление глюкозы, %,

4 - изменение пула АТФ в динамике роста, нмоль/мг белка.

о пластичности энергетического обмена, обеспечивающего сохранение жизнеспособности культуры (табл. 3).

Таблица 3. Синтез АТФ суспензиями клеток и его ингибирование 200 мкМ ДЦКД. Скорость дыхания суспензий клеток при окислении неорганического и/или органических субстратов

Субстраты Fe(II) глю* др. э.* Глю + др. э. Fe(II) + глю Fe(II) + др.э. Fe(II) + глю + др.э.

thermotolerans Ki 1

АТФ, нмоль/мг белка 15.2 10.3 7.2 19.2 25 20.4 28.0

Ингибирование синтеза АТФ ДЦКД, % 78.5 93.0 74.4 91.8 79.6 87.2 90.1

Скорость дыхания, нмоль С>2/(мин-мг белка) (клетки выращены с интенсивной аэрацией) 571.6 310.0 270.0 580.0 685.1 657.4 733.4

S. sibiricus N1

АТФ, нмоль/мг белка 12.3 11.5 7.7 17.0 22.0 21.0 26.0

Ингибирование синтеза АТФ ДЦКД, % 50.3 81.9 82.3 69.7 53.0 70.6 63.2

Скорость дыхания, нмоль Ог/(мин- мг белка) Клетки выращены с интенсивной аэрацией 520.0 220.0 295.5 400.5 620.7 643.1 690.2

Клетки выращены в отсутствие интенсивной аэрации 457.0 353.6 254.0

Примечание. Количество клеточного белка в инкубационной среде - 1.1-1.5 мг. * Дрожжевой экстракт или глюкоза.

ЭТС у сульфобацилл. Данные об ЭТС сульфобацилл в литературе почти не представлены. Так, упоминается растворимый кислотоустойчивый желтый хромофор в клетках S. thermosulfidooxidans ВС1, способный окислять Fe(II) (Blake et al., 1993). Предполагается наличие цитохромоксидазы ааз и присутствие цитохромов ¿-типа у штаммов S. thermosulfidooxidans ТН1 и S. acidophilus ALV (Barr et al., 1990). Наиболее изучена ЭТС у At. ferrooxidans (Bruscella et al., 2007).

На первом этапе исследований ЭТС показано, что скорость окисления сульфата железа мембранной фракцией клеток S. sibiricus N1 максимальна при рН 3.0. Спектральная характеристика мембран, выделенных из клеток S. sibiricus N1 разного возраста, приведена на рис. 5. В начале экспоненциальной фазы роста (рис.

5а) на разностных спектрах поглощения виден широкий максимум при 604 нм с плечом при 595 нм в а-полосе и максимум при 446 нм с плечом при 453 нм в у-полосе, соответствующие цитохрому ааутипа. Разностный спектр поглощения мембран из клеток поздней экспоненциальной фазы роста (рис. 56), помимо спектральных характеристик оксидазы ааз-типа, выявил а-, и у -максимумы при 564, 536 и 436 нм соответственно, относящиеся к цитохромам Ь/о типа. На СО-разностном спектре поглощения видны цитохромы, способные связывать СО, а, следовательно, и кислород. Восстановленный+СО минус восстановленный разностный спектр мембран из клеток поздней экспоненциальной фазы роста выявил СО-связывающие цитохромы а- и о- типа. Присутствие цитохрома а показано максимумом поглощения при 545 нм и минимумом поглощения при 446 нм. Минимумы при 590 и 433 нм свидетельствуют о присутствии цитохром о-СО комплекса.

433 446

Рис. 5. Разностные спектры поглощения мембран из клеток $1Ыпси$ N1 начала (а) и конца (б, в) экспоненциальной фазы роста. Дитионит-восстановленные минус персульфат-окисленные разностные спектры мембран (а, б). СО-разностный (восстановление дитионитом натрия + СО минус восстановление дитионитом натрия) спектр поглощения солюбилизированных мембран (в). Концентрации белка (мг/мл): а-5.4, б-4.8, в-5.0.

475 550 625

Длина волны, нм

700

Разностные спектры поглощения пиридиновых гемохромов (рис. 6) кислого ацетонового экстракта мембран из клеток конца экспоненциальной фазы роста выявили а- максимум при 590 нм тема А, а- и р-максимумы при 559 и 527 нм гемов В и О (рис. 6а). Учитывая коэффициенты экстинкции для этих гемов, согласно полученному спектру, соотношение гемов А и В было 3.4 к 1. Разностный спектр белковых частиц после экстракции 5% НС1-ацетоном не выявил мембрансвязанного цитохрома с (рис. 66). При более мягком режиме экстракции гемов из мембран

смесью 2% HCl и ацетона на спектре видны а-максимум при 573 нм и ß-максимум при 537 нм, которые относятся к цитохрому 657J (рис. 6в), обнаруженному ранее у архей (Barr et al., 1990). ВЭЖХ нековалентно связанных гемов показало наличие гемов А, В и О в мембранах шт. N1 (рис. 7). Методом электрофореза с ДС-Na выявлен растворимый полипептид с массой 13 кДа, обладающий пероксидазной активностью и, следовательно, являющийся цитохромом с (рис. 8). Так как в клетках S. sibiricus N1 практически отсутствует периплазматическое пространство, цитохром с, видимо, прикреплен к внешней стороне плазматической мембраны, и, скорее всего, переходит в растворимую фракцию после длительного разрушения ультразвуком.

Рис. 6. Разностные спектры поглощения мембран S. sibiricus N1 конца экспоненциальной фазы роста. Дитионит-восстановленные минус феррицианид-окисленные разностные спектры экстракта 5% HCl-ацетона в 20% пиридине (а), дитионит-восстановленные минус персульфат-окисленные разностные спектры экстракта 5% HCl-ацетоном в 50 мМ /?-аланин-Н2804 буфере pH 3.0 (б), дитионит-восстановленные минус феррицианид-окисленные разностные спектры экстракта 2% HCl-ацетоном в 20% пиридине (в). Концентрации белка (мг/мл): а-2.0, б - 1.3, в-2.2.

573 I

500 550 600 650 700 Длина волны, нм

Согласно полученным данным по ингибированию NaN3 и KCN, одна из оксидаз более чувствительна к азиду и цианиду (рис. 9). Монофазная кинетика ингибирования дыхания мембран клеток ранней экспоненциальной фазы роста свидетельствует о преимущественном участии оксидазы ад3-типа, клеток поздней экспоненциальной фазы - выявляет преимущественное функционирование цитохрома 603-типа. Обе оксидазы чувствительны к цианиду и азиду со значениями К; 4.1 дМ и 2.5 juM для цитохрома аа3 и 9.4 цМ и 7.0 /дМ для цитохрома Ьо}.

Обобщив полученные результаты, можно предложить, что электронный транспорт от Fe(II) к акцептору 02 идет через растворимый цитохром с и оксидазу ааз-типа в клетках ранней экспоненциальной фазы роста и через цитохром с, высокопотенциальный цитохром 6573 и оксидазу 6с>з-типа в клетках поздней экспоненциальной фазы роста. Исходя из полученных результатов, предполагается,

что цитохромоксидаза boy типа обладает большим сродством к кислороду и дерепрессируется при снижении кислорода в среде культивирования с увеличением плотности популяции S. sibiricus N1. Таким образом, окисление Fe(II) направлено на поддержание роста и обеспечение высоких скоростей окисления данного субстрата а, следовательно, и запасание энергии при различных концентрациях кислорода в среде.

В качестве первого шага в установлении состава цитохромов термотолерантной сульфобациллы S. thermotolerans Krl была выбрана идентификация гемов. Анализ спектров пиридиновых производных гемохромов показал, что клетки штамма Krl содержат гемы А, В и, вероятно, С (рис. 10). Согласно ВЭЖХ в клетках штамма Krl присутствуют гемы А и В (рис. 11). Гем А служит указанием на наличие саа3 или аа3 цитохромоксидазы, гем В - цитохромов è-типа.

Рис. 7. Профили элюции нековалентно связанных гемов, экстрагированных из мембран 5. лЫпсги N1 (а) и контрольных культур Е. соИ (б) и В. хиЬЧШ (в), полученные методом ВЭЖХ в обращенной фазе. Линия тренда (б) характеризует градиент элюции ацетонитрила (30-100%) в Н20, содержащей 0.05% трифторуксусной кислоты. Время удерживания (мин) гемов-стандартов: гем О - 13.1, гем В - 15.1, гем А - 21.6, гем О - 26.4.

(а)

___ж.

(В)

J

о

100 80 *

60 | 40 1

20 I

А

5 10 15 20 25 30 35 Время удерживания, мин

Рис. 8. Электрофорез с ДС-№ в ПААГ (12.6%) растворимой фракции клеток 5. зШпсш N1 конца экспоненциальной фазы роста. 1 - цитохром с сердца лошади, 2 - растворимая фракция. Содержание белка в 1 и 2 - 5 мкг. Гель окрашивали на пероксидазную активность гема с помощью 3,3',5,5' - тетраметилбензидина и Н202.

-10 О 10 20

[КС1М]. цМ

-10 0 10 20 30

Рис. 9. Кинетики ингибирования цианидом калия (а) и азидом натрия (б) железооксидазной активности мембран 5. ьШпсиз N1 начала (□) и конца (А) экспоненциальной фазы роста. У/У, - 100/активность, %. [КШ] -концентрация цианида калия, мкМ, [№N3] -концентрация азида натрия, мкМ.

550 585

450

500 550 600 Длина волны, нм

650

Рис. 10. Дитионит-восстановленный минус феррицианид-окисленный дифференциальный спектр поглощения пиридиновых гемохромов, экстрагированных 5% НС1-ацетоном в 20% пиридине из мембран £ ЛегтоШегаю Кг1 конца экспоненциальной фазы роста. Концентрация белка - 2.3 мг/мл.

А А = 0.05

8 12 16 Время удерживания, мин

20

100 60 I

н х

40 о

н и Я 20 <

24

Рис. 11. Профиль элюции нековалентно связанных гемов, экстрагированных из мембран 5. ¡кегтоиЛегапи Кг1, полученный методом ВЭЖХ в обращенной фазе. Линия тренда характеризует градиент элюции ацетонитрила (30-100%) в Н20, содержащей 0.5%) трифторуксусной кислоты. Время удерживания (мин) гемов-стандартов В. $иЫШ$ БТи: гем В - 13.3, гем А- 17.5.

Использование Fe(III) в качестве альтернативного акцептора электронов.

Ранее было показано восстановление Fe(III) у двух видов умеренно термофильных сульфобацилл (Bridge, Johnson, 1998); в нашем исследовании установлено, что S. thermotolerans Krl и S. sibiricus N1 способны использовать альтернативный кислороду акцептор электронов - Fe(III) - при изменении условий аэрации. Так, в условиях гипоксии (0.07% 02 в газовой фазе) окисление дрожжевого экстракта и глицерина сопряжено с восстановлением Fe(III) до Fe(II) (табл. 4). При снижении содержания кислорода в газовой фазе в среде культивирования до 17% акцепоторами электронов являлись и 02, и Fe(III) (табл. 4). При этом конечная концентрация 02 в газовой фазе была равной 10.3%; из 7.50 мМ Fe(III) образовывалось 5.75 мМ Fe(II). В условиях гипоксии Fe(III) полностью восстанавливалось клетками S. thermotolerans Krl и S. sibiricus N1. При этом максимальная биомасса бактерий в условиях гипоксии через 8 суток культивирования несколько уступала величине биомассы культур на среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом в условиях интенсивной аэрации.

Использование термофильных сульфобацилл для биоокисления упорного пирротинового золотосодержащего пиритно-арсенопиритного концентрата при 50°С. Поскольку изученные сульфобациллы, согласно полученным результатам, обладают большими метаболическими возможностями, представляло интерес проследить реализацию гибкости обмена этого вида в оптимальных температурных условиях (50 С) при биовыщелачивании золотосодержащего флотоконцентрата Олимпиадинской руды в режиме двустадийного полунепрерывного культивирования при D=0.0042 ч", плотности пульпы Т:Ж = 1:7.5. Для биоокисления использовали ассоциацию штаммов, выделенную из Олимпиадинской руды. Элементный состав флотоконцентрата, %: Sb^,,, - 12.8, Sbs -10.7, Fe^- 14.98, Fes- 10.8, So6ul- 15.96, Ss- 14.3, S°- 1.59, Aso6la-4.85, Ass-2.02, Ca - 5.2, Copr - 3.2. Au - 124 г/т. Крупность концентрата 80% -0.044 мм. Параметры бактериального окисления приведены в табл. 5. В конце процесса установлена высокая степень окисления Fes, Ass и Sbs- В биокеке (остаток концентрата после окисления сульфидных минералов) содержание элементов было низким (табл. 6), что привело к увеличению степени извлечения золота и сократило расход цианида натрия. Таким образом, использование термофильных сульфобацилл при 50°С целесообразно. Высокие температуры позволят сократить затраты воды и электроэнергии на охлаждение реакторов, а также снизить расход серной кислоты на поддержание pH.

Выделение преобладающих культур из термофильной ассоциации. После окончания процесса БО была выделена накопительная культура, а затем преобладающие штаммы на субстратах окисления - Fe(II), S° и флотоконцентрате. По своим молекулярно-генетическим признакам (составу оснований ДНК, уровню ДНК/ДНК гибридизации, данных рестрикционного анализа хромосомной ДНК) и

Таблица 4. Использование Fe (III) штаммами S. sibiricus N1 и S. thermotolerans KrI в качестве альтернативного акцептора электронов при снижении содержании 02 в газовой фазе и условиях гипоксии

Субстраты и условия культивирования Число клеток, 1- 107 кл/мл Fe (III), мМ Fe(II), мМ

S. sibiricus N1

Дрожжевой экстракт (0.02%) 17% Ог в газой фазе 15.2 1.25 5.75

Гипоксия, близкая к аноксии (0.07% Ог) 9.1 0 10.00

S. thermotolerans Krl

Дрожжевой экстракт (0.02%) Гипоксия, близкая к аноксии (0.07% Ог) 8.7 0 10.00

Глицерин (10 мМ) Гипоксия, близкая к аноксии (0.07% Ог) 8.3 0 10.00

Примечание. Засев - 1.0 • 107 кл/мл. Концентрация Fe(II) - за вычетом контроля.

Таблица 5. Параметры бактериального окисления сульфидных минералов золотосодержащего концентрата Олимпиадинской руды ассоциацией штаммов сульфобацилл в ходе двустадийного полунепрерывного процесса при 0=0.0042 ч"1 в отливно-доливном режиме в реакторах при 50°С

II ¡Ü Технологические параметры процесса Единицы измерения Значения параметров в ходе процесса БО

I реактор II реактор

1 Промежуток времени между отливом-доливом пульпы ч 24 24

2 Общее количество клеток микробной ассоциации кл/мл 5.70-10'-2.09-108 6.30»10'-8.40*10'

3 Концентрация железа, суммарная г/л 11.96 12.16

4 Активная кислотность жидкой фазы пульпы едрН 1.40-1.70 1.25-1.52

5 Окислительно-восстановительный потенциал мВ 704-798 798-836

6 Концентрация мышьяка, суммарная г/л 2.46 2.24

7 Продолжительность процесса сут 10 10

свойствам окисления субстратов все они принадлежали виду 5. Один из

штаммов - 5. эЛтст НТРе2 обладал одинаковой способностью к окислению как Ре (II), так и серы. Другой штамм НТК активно окислял концентрат, по данным

рестрикционного анализа хромосомной ДНК он был близок к штамму НТ1. Последний штамм обладал наиболее низким оптимумом рН роста. Штамм НТБ отличается от других выделенных штаммов широкой областью рН-оптимума роста и окисления Б0 (2.05-2.40), толерантностью к органическим соединениям и высокой степенью специализации в отношении субстрата окисления.

Таблица 6. Содержание элементов в биокеке флотоконцентрата Олимпиадинской руды и степень извлечения золота ассоциацией штаммов 5. йШпсиз в результате двустадийного полунепрерывного процесса при 0=0.0042 ч"' и температуре 50°С

№ реактора Содержание элементов в биокеке, % Степень извлечения золота, %

^общ. 8й ЭЪз Авз Ре5

1 11.90 4.26 1.57 0.7 0.130 3.23 90.34

2 9.66 1.18 0.83 0.2 0.012 0.63 91.17

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе исследованы как пути метаболизма сульфобацилл, так и параметры роста, потребление субстратов, морфология клеток при различных типах питания. Изучение особенностей роста и конструктивного метаболизма бактерии 5. МегтоЫегаю Кг1, недавно выделенной из золотосодержащего концентрата Олимпиадинского месторождения, позволяет заключить, что данный вид характеризуется адаптивным типом метаболизма. Об этом свидетельствуют наличие активности ключевых ферментов всех трех главных путей диссимиляции Сахаров, карбоксилаз автотрофной и гетеротрофной фиксации при миксо-, органогетеро- и литоавтотрофном типах питания и изменение активности ферментов при смене энергетического источника. Сохранение жизнеспособности и окислительных свойств термотолерантных сульфобацилл при температурах роста, близких к предельным (12 и 55°С), свидетельствует о приспособлении этих бактерий как к повышенным, так и пониженным температурам в местах обитания и объясняет их присутствие и функционирование в природных и техногенных эконишах.

Различие в величине пула АТФ в клетках сульфобацилл в динамике их миксо-, органо- и литотрофного роста подтверждает, что оптимальный тип питания этих бактерий - миксотрофный, при этом пул АТФ максимален, тогда как в гетеротрофных и автотрофных условиях пул АТФ снижен. Установленную взаимосвязь между внутриклеточной концентрацией АТФ, использованием субстратов и ростовыми параметрами культур следует учитывать при оптимизации условий деятельности сообщества микроорганизмов при выщелачивании/окислении

сульфидных минералов руд и концентратов. Полученные данные о синтезе АТФ, его ингибировании ДЦКД и высокой скорости дыхания клеток Л', х/бг'г/сги и Я. /¡1егтоЫегат свидетельствуют о том, что при окислительном фосфорилировании источником энергии могут служить не только неорганические, но и органические вещества. В условиях сниженной концентрации кислорода и гипоксии показано окисление органических соединений штаммами Кг1 и N1, сопряженное с восстановлением Ре(Ш) до Ре(П). Полученные результаты об электронтранспортной системе (ЭТС) 5. «¿/>гси5 N1 позволили предложить вероятную схему окисления закисного железа у данного микроорганизма. Штамм обладает разветвленной ЭТС, в состав которой в начале экспоненциальной фазы роста входят растворимый цитохром с, цитохромоксидаза аа3-типа и в конце экспоненциальной фазы -цитохром с, высокопотенциальный цитохром Ь573 и цитохромоксидаза ЬоТтипа. Установлено, что простетическими группами цитохромов являются гемы А, В, С и О в случае умеренно термофильного штамма N1 и гемы А, В и, вероятно, С - у термотолерантного штамма Кг1.

Полученные данные свидетельствуют о том, что экстремальные условия обитания привели к выработке приспособительных механизмов и отдельных реакций, обеспечивающих выживание сульфобацилл. Одним из них является чрезвычайная пластичность их конструктивного и энергетического обмена, а именно, способность переключаться с одного типа метаболизма на другой. Возможность использования термофильных сульфобацилл при температуре 50°С для биовыщелачивания золотосодержащих концентратов сульфидных руд позволит интенсифицировать данный процесс и значительно снизить затраты. Из микробных ассоциаций, окисляющих сульфидный концентрат в лабораторных реакторах, выделены новые штаммы сульфобацилл и отнесенны к виду & зЛтст на основании совокупности характеристик.

Таким образом, полученные в ходе выполнения работы сведения значительно расширили данные о центральном углеродном и энергетическом обмене сульфобацилл и ацидофильных микроорганизмов, в целом.

выводы

1. Новая бактерия 5. 1кеппою1егат Кг1т ассимилирует углерод из С02 и органических субстратов, набор которых шире, чем у умеренного термофила .чАтст Ы1Т.

2. У Б. ¡Иегто1о1ега>п Кг1т впервые обнаружена активность ферментов трех главных путей катаболизма углеводов (фруктозобисфосфатного, окислительного пентозофосфатного и Энтнера-Дудорова), а также карбоксилаз автотрофной и гетеротрофной фиксации |4С02 при хемолитоавтотрофном, хемоорганогетеротрофном и миксотрофном типах питания. Установлено, что ЦТК не замкнут, глиоксилатный шунт отсутствует. При температурах роста, близких к предельным (12 и 55°С) пентозофосфатный путь окисления глюкозы и активность аконитатгидратазы утрачиваются.

3. Миксотрофный тип питания у термотолерантной и умеренно термофильных сульфобацилл обеспечивает максимальный уровень пула АТФ в клетках и выживание бактерий при многократных пересевах. Низкий уровень пула АТФ при литоавто- и органогетеротрофном типах питания коррелирует с прекращением роста бактерий после нескольких пассажей.

4. Доказано, что в аэробных условиях Ре(П) и/или органические соединения являются донорами электронов для электронтранспортной системы (ЭТС). В условиях гипоксии (0.07% 02 в газовой фазе) окисление органических веществ сопряжено с восстановлением Ре(Ш) в качестве альтернативного кислороду акцептора электронов.

5. ЭТС 5. з&тсиБ N1 при окислении Ре(П) в клетках начала экспоненциальной фазы роста включает кислотоустойчивый растворимый цитохром с и цитохромоксидазу адз-типа, в клетках конца экспоненциальной фазы - цитохром с, мембрансвязанный высокопотенциальный цитохром ¿573 и цитохромоксидазу 603-типа; выявлены гемы А, В, С и О. Клетки 1(гегто1о1егапз Кг1 содержат гемы А, В, не исключено наличие цитохрома С.

6. Лабильность путей энергетического и углеродного метаболизма сульфобацилл обеспечивает их доминирование в природных ассоциациях ацидофильных термофильных микроорганизмов, что может быть использовано в биогидрометаплургических технологиях извлечения золота из сульфидных минералов концентратов пиритно-арсенопиритных руд при температурах 40-50°С в условиях непостоянства состава энергетического субстрата и содержания органических веществ в пульпе.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации Экспериментальные статьи:

1. Цаппина И.А., Журавлева А.Е., Исмаилов А.Д., Захарчук U.M., Красильникова E.H., Богданова Т.Н., Каравайко Г.И. Взаимосвязь внутриклеточного содержания АТФ с типом питания ацидофильных бактерий рода Sulfobacillus thermotolerans и Alicyclobacillus tolerans. Микробиология. 2007. Т. 76. № 6. С. 742-751.

2. Zhuravleva А.Е.. Tsaplina I.A., Ismailov A.D., Zakharchuk L.M., and Karavaiko G.I. Metabolism peculiarities of bacteria of the genus Sulfobacillus. Advanced Materials Research. 2007. V. 20-21. P. 469-472.

3. Журавлева A.E.. Исмаилов А.Д., Захарчук Л.М., Красильникова E.H., Цаплина И.А. Особенности процессов энергообеспечения у умеренно термофильных бактерий рода Sulfobacillus. Микробиология. 2008. Т. 77. № 5. С. 708-712.

4. Цаплина И.А., Красильникова E.H., Журавлева А.Е.. Егорова М.А., Захарчук Л.М., Сузина Н.Е., Дуда В.И, Богданова Т.Н., Стадничук И.Н., Кондратьева Т.Ф. Сравнительные аспекты фенотипических свойств Sulfobacillus thermotolerans. Микробиология. 2008. Т. 77. № 6. С. 742-751.

5. Dinarieva T.Y., Zhuravleva А.Е.. Pavlenko O.A., Tsaplina I.A., Netrusov A.I. Ferrous iron oxidation in a moderate thermoacidophile Sulfobacillus sibiricus N1T. FEBS Lett, (в печати).

Тезисы конференций:

1. Журавлева А.Е.. Каравайко Г.И. "Особенности метаболизма бактерий семейства Alicyclobacillaceae". II молодежная международная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва. Россия. 1-3 ноября 2006. С. 57-58.

2. Журавлева А.Е.. Цаплина И.А., Исмаилов А.Д., Богданова Т.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М., Красильникова E.H., Каравайко Г.И. "Особенности метаболизма бактерий семейства Alicyclobacillaceae". Четвертый московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва. Россия. 12-16 марта 2007 г. С. 350.

3. Цаплина И.А., Богданова Т.И., Савари Е.Е., Сергеева Т.В., Кондратьева Т.Ф., Журавлева А.Е.. Седельникова Г.В., Каравайко Г.И. "Исследование сообщества умеренно термофильных сульфобацилл в процессе окисления пиритно-арсенопиритного концентрата". Четвертый московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва. Россия. 12-16 марта 2007 г. С. 325.

4. Zhuravleva А.Е.. Tsaplina I.A., Ismailov A.D., Zakharchuk L.M., and Karavaiko G.I. Metabolism peculiarities of bacteria of the genus Sulfobacillus. International Biohydrometallurgy Symposium "Biohydrometallurgy: From the Single Cell to the Environment". 2007. V. 20-21. P. 46ÍM72.

5. Цаплина И.А., Журавлева A.E.. Богданова Т.И., Кондратьева Т.Ф. "Биотехнологический потенциал хемолитотрофных умеренно термофильных бактерий Sulfobacillus sibiricus". Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера». Москва. Россия. 19-20 ноября 2007. С. 140-141.

6. Журавлева А.Е.. Цаплина И.А. "К вопросу об энергетическом метаболизме сульфобацилл". IV молодежная школа-конференция с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва. Россия. 20-22 октября 2008. С. 16-18.

Заказ №219/11/08 Подписано в печать 20.11.2008 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Журавлева, Анна Евгеньевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1. Сообщества ацидофильных хемолитотрофпых микроорганизмов, окисляющих Fe(II),

S /S " и сульфидные минералы.

2. Характеристика рода Sulfobacillus.

2.1. История открытия. Таксономическое положение.

2.2. Морфология, физиология и структурная организация клеток сульфобацилл.

2.3. Метаболизм сульфобацилл и некоторых других ацидофильных микроорганизмов.

2.3.1. Метаболизм углерода.

2.3.1.1. Фиксация ,4СС>2; карбоксилазы автотрофной и гетеротрофной фиксации.

2.3.1.2. Углеводный метаболизм.

2.3.1.3. Ферменты цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта.

2.3.2. Влияние экзогенных факторов на активность ферментов углеродного метаболизма у бактерий рода Sulfobacillus.

2.3.3. Метаболизм железа.

2.3.3.1. Окисление и восстановление железа.

2.3.3.2. ЭТС микроорганизмов при окислении Fe(II).

2.3.4. Метаболизм серы.

2.3.5. Пул АТФ в клетках бактерий.

3. Использование микробных ассоциаций термоацидофилов для выщелачивания/окисления сульфидных минералов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

Глава 3. Результаты.

3.1. Метаболизм S. thermotolerans Krl.

3.1.1. Рост и окисление субстратов бактерией S. thermotolerans Krl при различных типах питания.

3.1.2. Ферменты углеводного обмена, ЦТК, фиксация 14СОг и карбоксилирующие ферменты S. thermotolerans Krl при различных типах питания.

3.2. Внутриклеточный пул АТФ, тип питания и динамика роста сульфобацилл и других ацидофильных бактерий е различным типом метаболизма.

3.2.1. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания в динамике роста S. thermotolerans Krl.

3.2.2. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания, в динамике роста S. sibiricus N1.

3.2.3. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания в динамике роста S. thermosuljidooxidans 1269.

3.2.4. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания в динамике роста миксотрофа Alicyclobacillus tolerans К1.

3.2.5. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с потреблением субстратов в динамике роста гетеротрофов Alb. acidocaldarius 27009 и Alb. cycloheptanicus 4006.

3.2.6. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с потреблением субстрата в динамике роста автотрофа At. ferrooxidans TFBk.

3.3. Синтез АТФ суспензиями клеток S. sibiricus N1 и S thermotolerans Krl при окислении различных субстратов. Ингибиторный анализ.

3.4. Скорости дыхания клеточных суспензий и мембран клеток сульфобацилл.

3.4.1. Скорость дыхания суспензий клеток S. sibiricus N1 и 51. thermotolerans Krl.

3.4.2. Скорость дыхания мембран клеток S. sibiricus N1.

3.5. Цитохромный и гемовый состав клеток S. sibiricus N1 и S. thermotolerans Krl.

3.6. Рост S. sibiricus N1 и S. thermotolerans Krl при снижении содержания кислорода в газовой фазе и условиях гипоксии.

3.7. Цитологические особенности S. thermotolerans Krl и S. sibiricus ~N\.

3.8. Использование термофильных сульфобацилл для биоокисления упорного пирротинового золотосодержащего пиритно-арсенопиритного фл ото концентрата при 50°С.

Глава 4. Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пути метаболизма сульфобацилл при различных типах питания"

Постановка проблемы и её актуальность. Сульфобациллы — уникальная группа хемолитотрофных аэробных грамположительных спорообразующих экстремально ацидофильных бактерий семейства "Alicyclobacillaceae", окисляющих и сульфидные минералы. Большинство представителей рода Sulfobacillus - умеренные термофилы; оптимальный тип питания — миксотрофный, когда одновременно используются различные метаболические пути окисления неорганических (указанных) и органических соединений (дрожжевой экстракт, глюкоза и др.) (Современная микробиология, 2005); рост бактерий при хемоорганогетеротрофном и хемолитоавтотрофном типах питания, как правило, ограничен несколькими пассажами (Каравайко, 2006; Захарчук, 2006). Местами обитания сульфобацилл являются отвалы сульфидных руд и угля, кислые гидротермы, шахтные воды, месторождения сульфидных минералов, где температура варьирует в пределах 10-60°С.

Сульфобациллы являются постоянными членами сообществ микроорганизмов в области температур до 55°С, играющих важную роль в биогидрометаллургических процессах и принимающих участие в циклах окисления-восстановления железа и окисления серы в природе. К настоящему времени подробно исследованы экофизиология и выщелачивающая активность этих бактерий (Каравайко и др., 2006). Значительные успехи также достигнуты в изучении центрального конструктивного метаболизма умеренно термофильных представителей рода Sulfobacillus в области оптимальных температур (Wood, Kelly, 1984; Захарчук и др., 1994; 2003; Цаплина и др., 2000), тогда как в области предельных для их роста температур, характерных для природных и техногенных экосистем, сведений нет. Данные об энергетическом обмене немногочисленны. В литературных источниках не представлено информации о процессах энергообеспечения клеток сульфобацилл в форме АТФ или других макроэргических соединений (МЭС) (кроме Захарчук, 2006; в этих исследованиях участвовала автор, Журавлева, в 2005-2006 гг.); остается неясной роль органических субстратов при миксотрофном типе питания этих бактерий. Электронтранспортная система сульфобацилл практически не изучена: предполагается наличие отдельных переносчиков электронов — цитохромоксидазы ааз-типа и цитохромов 6-типа — у бактерий, позднее отнесенных к видам рода Sulfobacillus - S. thermosulfidooxidans и S. acidophilus (Barr et al., 1990; Blake, Shute, 1994).

Исследование особенностей метаболизма штаммов сульфобацилл имеет большое значение как для решения теоретических задач, так и практического применения.

Поскольку конструктивный метаболизм и, в особенности, энергетический, непосредственно обуславливают способность железо- и сероокисляющих микроорганизмов к окислению сульфидных минералов, оптимизация данного процесса зависит от знания путей их углеродного метаболизма и понимания механизмов получения и консервации энергии. Изучение путей метаболизма сульфобацилл при изменении условий культивирования — при переключении с оптимального миксотрофного на литоавто- или органогетеротрофный типы питания, изменении содержания кислорода, температуры, в условиях нестабильного снабжения органическими веществами, является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение конструктивного обмена новой термотолерантной бактерии S. thermotolerans KrlT, выделенной при 30°С, и особенностей энергетического метаболизма представителей рода Sulfobacillus при различных типах питания и температурах роста.

Задачи исследования включали:

1. Подробную характеристику фенотипических свойств термотолерантной культуры S. thermotolerans KrlT - роста и центральных путей углеродного метаболизма - при различных типах питания и предельных температурах.

2. Изучение энергетического обмена S. thermotolerans Krl и умеренного термофила S. sibiricus N1 : установление взаимосвязи внутриклеточного АТФ с типом питания, определение субстратов-доноров электронов и акцепторов электронов, исследование электронтранспортной системы (ЭТС) при окислении Fe(II).

3. Исследование возможности использования термофильных сульфобацилл для биоокисления упорных золотомышьяковых концентратов сульфидных руд Олимпиадинского месторождения при 50°С. Выделение преобладающих культур из термофильной ассоциации.

Научная новизна и практическая значимость. В результате исследования активности ферментов катаболизма углерода обнаружено, что у термотолерантной бактерии S. thermotolerans Krl , в отличие от умеренно термофильных сульфобацилл, функционируют три главных пути метаболизма Сахаров - путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, окислительный пентозофосфатный и путь Энтнера-Дудорова при различных типах питания (миксо-, органогетеро- и литоавтотрофном). При всех условиях питания активны карбоксилазы автотрофной и гетеротрофной фиксации СО2. В области предельных температур роста (12 и 55°С) сохранение жизнеспособности и окислительной активности клеток сульфобацилл обеспечено ферментными системами путей Эмбдена-Мейергофа-Парнаса и Энтнера-Дудорова, что объясняет присутствие бактерий и их функционирование в местах обитания при низких и высоких температурах. Впервые исследована динамика пула АТФ и потребление субстратов в процессе миксо-, органо- и литотрофного роста сульфобацилл, установлена взаимосвязь этих процессов. Обнаружены различия в динамике пула АТФ, окисления субстратов и роста культур сульфобацилл при различных типах питания. Предложено использовать величину пула АТФ в качестве показателя эффективности роста и энергетического метаболизма сульфобацилл.

Выявлено сопряжение синтеза АТФ с функционированием электронтранспортной системы (ЭТС) при окислении неорганического и/или органических субстратов. Таким образом, органические вещества являются как источником углерода, так и донором электронов для ЭТС в условиях миксотрофии. Установлено использование бактериями S. sibiricus N11 и S. thermotolerans Krl альтернативного кислороду акцептора электронов -Fe(III) - в условиях гипоксии и пониженного содержания кислорода в газовой фазе.

Обнаружено, что ЭТС S. sibiricus N1 разветвлена и обеспечивает эффективное окисление железа при различном содержании О2. Система переноса электронов S. sibiricus N1 при окислении Fe(II) в начале роста включает кислотоустойчивый растворимый цитохром с и цитохромоксидазу ааз-типа, в конце роста - цитохром с, мембрансвязанный высокопотенциальный цитохром Л573 и цитохромоксидазу 603-типа. Впервые выявлен состав гемов цитохромов у штаммов S. sibiricus N1 (гемы А, В, С и О) и S. thermotolerans Krl (А и В, не исключено наличие гема С).

Лабильность конструктивного и энергетического метаболизма умеренно термофильных сульфобацилл впервые позволила реализовать биовыщелачивание упорных золотомышьяковых концентратов при 50°С в режиме двустадийного полунепрерывного процесса в лабораторных реакторах. Выделены новые, преобладавшие в реакторах, штаммы сульфобацилл, которые отнесены к виду Sulfobacillus sibiricus.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Н-ой (международной) и IV-ой (с международным участием) молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН, 2006, 2008 гг.), 4-м московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.), 17-м Международном симпозиуме по биогидрометаллургии (Германия, 2007 г.), международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН, 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации, включая тезисы, опубликовано 10 работ; 1 статья сдана в печать.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Журавлева, Анна Евгеньевна

ВЫВОДЫ

1. Новая бактерия S. thermotolerans KrlT ассимилирует углерод из СО2 и органических субстратов, набор которых шире, чем у умеренного термофила S. sibiricus N1T.

2. У S. thermotolerans Krl впервые обнаружена активность ферментов трех главных путей катаболизма углеводов (фруктозобисфосфатного, окислительного пентозофосфатного и Энтнера-Дудорова), а также карбоксилаз автотрофной и гетеротрофной фиксации 14С02 при хемолитоавтотрофном, хемоорганогетеротрофном и миксотрофном типах питания. Установлено, что ЦТК не замкнут, глиоксилатный шунт отсутствует. При температурах роста, близких к предельным (12 и 55°С) пентозофосфатный путь окисления глюкозы и активность аконитатгидратазы утрачиваются.

3. Миксотрофный тип питания у термотолерантной и умеренно термофильных сульфобацилл обеспечивает максимальный уровень пула АТФ в клетках и выживание бактерий при многократных пересевах. Низкий уровень пула АТФ при литоавто- и органогетеротрофном типах питания является одной из причин прекращения их роста после нескольких пассажей.

4. Доказано, что в аэробных условиях Fe(II) и/или органические соединения являются донорами электронов для электронтранспортной системы (ЭТС). В условиях гипоксии (0.07% О2 в газовой фазе) окисление органических веществ сопряжено с восстановлением Fe(III) в качестве альтернативного кислороду акцептора электронов.

5. ЭТС S. sibiricus N1 при окислении Fe(II) в клетках начала экспоненциальной фазы роста включает кислотоустойчивый растворимый цитохром с и цитохромоксидазу ааз-типа, в клетках конца экспоненциальной фазы цитохром с, мембрансвязанный высокопотенциальный цитохром 6573 и цитохромоксидазу йоз-типа; выявлены гемы А, В, С и О. Клетки S. thermotolerans Krl содержат гемы А, В, не исключено наличие цитохрома С.

6. Лабильность путей энергетического и углеродного метаболизма сульфобацилл обеспечивает их доминирование в природных ассоциациях ацидофильных термофильных микроорганизмов, что может быть использовано в биогидрометаллургических технологиях извлечения золота из концентратов сульфидных минералов пиритно-арсенопиритных руд при температурах 40-50°С в условиях непостоянства состава энергетического субстрата и содержания органических веществ в пульпе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе исследованы как пути метаболизма сульфобацилл, так и параметры роста, потребление субстратов, морфология клеток при различных типах питания. Изучение особенностей роста и конструктивного метаболизма бактерии S. thermotolerans Krl, недавно выделенной из золотосодержащего концентрата Олимпиадинского месторождения, позволяет заключить, что данный вид характеризуется адаптивным типом метаболизма. Об этом свидетельствуют наличие активности ключевых ферментов всех трех главных путей диссимиляции Сахаров, карбоксилаз автотрофной и гетеротрофной фиксации при миксо-, органогетеро- и литоавтотрофном типах питания и изменение активности ферментов при смене энергетического источника. Сохранение жизнеспособности и окислительных свойств термотолерантных сульфобацилл при температурах роста, близких к предельным (12 и 55°С), свидетельствует о приспособленности этих бактерий как к повышенным, так и пониженным температурам в местах обитания и объясняет их присутствие и функционирование в природных и техногенных экосистемах.

Различие в величине пула АТФ в клетках сульфобацилл в динамике их миксо-, органо- и литотрофного роста подтверждает, что оптимальный тип питания этих бактерий — миксотрофный, при этом пул АТФ максимален, тогда как в случае органогетеротрофного и литоавтотрофного типов питания пул АТФ снижен. Установленная взаимосвязь между внутриклеточной концентрацией АТФ, использованием субстратов и ростовыми параметрами культур следует учитывать при оптимизации условий деятельности сообщества микроорганизмов при выщелачивании сульфидных минеральных руд и концентратов. Полученные данные о синтезе АТФ, его ингибировании ДЦКД и высокой скорости дыхания штаммов S. sibiricus и S. thermotolerans в присутствии органических субстратов свидетельствуют о том, что при окислительном фосфорилировании источником энергии могут служить не только неорганические, но и органические вещества. В условиях сниженной концентрации кислорода и гипоксии показано окисление органических соединений штаммами Krl и N1, сопряженное с восстановлением Fe(III) до Fe(ll). Полученные результаты об электронтранспортной системе (ЭТС) S. sibiricus N1 позволили предложить вероятную схему окисления закисного железа у данного микроорганизма. Штамм обладает разветвленной ЭТС, в состав которой в начале экспоненциальной фазы роста входят растворимый цитохром с, цитохромоксидаза ааз-типа и в конце экспоненциальной фазы -цитохром с, высокопотенциальный цитохром 6573 и цитохромоксидаза 603-типа.

Установлено, что простетическими группами цитохромов являются гемы А, В, С и О в случае умеренно термофильного штамма N1 и гемы А, В и, вероятно, С — у термотолерантного штамма Krl.

Полученные данные свидетельствуют о том, что экстремальные условия обитания привели к выработке приспособительных механизмов и отдельных реакций, обеспечивающих выживание сульфобацилл. Одним из них является чрезвычайная пластичность их конструктивного и энергетического обмена, а именно, способность переключаться с одного типа метаболизма на другой. Возможность использования термофильных сульфобацилл при температуре 50°С для биовыщелачивания золотосодержащих концентратов сульфидных руд позволит интенсифицировать данный процесс и значительно снизить затраты. Выделены новые штаммы сульфобацилл, входящие в состав ассоциаций и на основании совокупности характеристик отнесены к виду S. sibiricus.

Таким образом, полученные в ходе выполнения работы сведения значительно расширили данные о центральном углеродном и энергетическом обмене сульфобацилл и, в целом, ацидофильных микроорганизмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Журавлева, Анна Евгеньевна, Москва

1. Агеева С.Н. Фенотипический и генотипический полиморфизм штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans / Автореф. дис. . канд. биол. наук. М.: ИНМИ РАН. 2003. 25 с.

2. Балашова В.В., Дубинина Г.А. Микроорганизмы, окисляющие железо и марганец // В: «Хемосинтез» / Под ред. Иванова М.В. М.: Наука, 1989. С. 101-122.

3. Богданова Т.И., Цаплина И.А., Саякин Д.Д., Каравайко Г.И., Коваленко Э.В. Морфология и цитология бактерий Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans // Микробиология. 1990. Т. 59. № 5. С. 844-855.

4. Бонч-Осмоловская Е.А. Сероредуцирующие бактерии и их участие в процессе анаэробной деструкции органического вещества // В: «Хемосинтез» / Под ред. Иванова М.В. М.: Наука, 1989. С. 183-198.

5. Вартанян Н.С. Изучение новой факультативно термофильной бактерии рода Sulfobacillus II Автореферат Дис. . канд. биол. наук. Абовян, 1989. 21 с.

6. Вартанян Н.С., Каравайко Г.И., Пивоварова Т.А. Влияние органических веществ на рост и окисление неорганических субстратов Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes II Микробиология. 1990a. Т. 59. № 3. С. 411—417.

7. Вартанян Н.С., Каравайко Г.И., Пивоварова Т.А., Дорофеев А.Г. Устойчивость Sulfobacillus termosulfidooxidans subsp. asporogenes к ионам Cu2+, Zn2+, Mn 2+ // Микробиология. 19906. Т. 59. № 4. С. 587-593.

8. Вартанян Н.С., Пивоварова Т.А., Цаплина И.А., Лысенко A.M., Каравайко Г.И. Новая термоацидофильная бактерия, относящаяся к роду Sulfobacillus II Микробиология. 1988. Т. 57. № 2. С. 268-274.

9. Веденина И.Я., Сорокин Д.Ю. Синтез АТФ при окислении тиосульфата до тетратионата гетеротрофными бактериями // Микробиология. 1992. Т. 61. № 5. С. 764-769.

10. Головачева Р.С. Биология аэробных термоацидофильных хемолитотрофных бактерий // В: «Хемосинтез» / Под ред. Иванова М.В. М.: Наука, 1989. С. 123-138.

11. П.Головачева Р.С., Каравайко Г.И. Sulfobacillus новый род термофильных спорообразукяцих бактерий // Микробиология. 1978. Т. 47. № 5. С. 815-821.

12. Гусев М. В., Минеева JI. А. Микробиология. М.: Изд-во МГУ, 1992. 448 с.

13. Дубинина Г.А. Бесцветные серобактерии // В: «Хемосинтез» / Под ред. Иванова М.В. М.: Наука, 1989. С. 76-100.

14. Дубинина Г.А. Механизмы адаптации бесцветных серобактерий к среде обитания // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Юбилейный сборник к 70-летию Института. Вып. XII. М.: Наука, 2004. С. 126-148.

15. Егорова М.А. Углеродный метаболизм бактерий рода Sulfobacillus II Автореф. дис. . канд. биол. наук. М.: МГУ. 2004. 21 с.

16. Заварзин Г.А. Литотрофные микроорганизмы. М.: Наука, 1972. 324 с.

17. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука, 2004. 348 с.

18. Зайцев Г. Н. Методика биометрических расчётов. М.: Наука, 1973. 256 с.

19. Захарчук JI.M. Миксотрофия у фототрофных и хемотрофных бактерий // Автореф. дис. . докт. биол. наук. М.: МГУ. 2006. 22 с.

20. Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Красильникова Е.Н., Богданова Т.И., Каравайко Г.И. Метаболизм углерода у Sulfobacillus thermosulfidooxidans 11 Микробиология. 1994. Т. 63. Вып. 4. С. 573-580.

21. Иванов В.Н. Энергетика роста микроорганизмов // Киев: Наукова думка, 1981. 138 с.

22. Иванов М.В. Роль микробиологических процессов в генезисе месторождений самородной серы. М.: Наука, 1964. " 1

23. Ивановский Р.Н. Биоэнергетика и транспорт субстратов у бактерий. М.: МАКС Пресс, 2004. 48 с.

24. Каравайко Г.И. Микроорганизмы и их роль в биотехнологии металлов // В: «Биогеотехнология металлов. Практическое руководство» / Под ред. Каравайко Г.И., Росси Дж., Агате А. Грудев С., Авакян З.А. М.: Центр международных проектов ГКНТ, 1989. С. 11-28.

25. Каравайко Г.И. Биогеотехнология металлов // В кн.: «Экология микроорганизмов» / Под ред. Нетрусова А.И. М.: Академия, 2004. С. 199-220.

26. Каравайко Г.И., Дубинина Г.А., Кондратьева Т.Ф. Литотрофные микроорганизмы окислительных циклов серы и железа // Микробиология. 2006. Т. 75. № 5. С. 593— 629.

27. Каравайко Г.И., Захарчук Л.М., Богданова Т.И., Егорова М.А., Цаплина И.А., Красильникова Е.Н. Ферменты метаболизма углерода у термотолерантной сульфобациллы, штамм К1 // Микробиология. 2002а. Т. 71. № 6. С. 755-761.

28. Каравайко Г.И., Красильникова Е.Н., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Захарчук Л.М. Рост и углеводный метаболизм сульфобацилл // Микробиология. 2001. Т. 70. № 3. С.293-299.

29. Каравайко Г.И., Кузнецов С.И., Голомзик А.И. Роль микроорганизмов в выщелачивании металлов из руд. М.: Наука, 1972. 248 с.

30. Каравайко Г.И., Пивоварова Т.А., Кондратьева Т.Ф. Хемолитотрофные бактерии и их роль в биогидрометаллургии // Сб. тез. 1 междунар. конгресс «Биотехнология -состояние и перспективы развития». Москва, 20026. С. 458.

31. Каравайко Г.И., Турова Т.П., Цаплина И.А., Богданова Т.И. Исследование филогенетического положения аэробных умеренно термофильных бактерий рода2+ Q

32. Sulfobacillus, окисляющих Fe , S и сульфидные минералы // Микробиология. 20006. Т. 69. № 6. С. 857-860.

33. Кахру А.О. Исследование регуляции уровня адениннуклеотидов и энергетического метаболизма у микроорганизмов / Автореф. дис. . канд. биол. наук. Тарту. 1986. 15 с.

34. Коваленко Э.В., Малахова П.Т. Спорообразующая железоокисляющая бактерия Sulfobacillus thermosulfidooxidans II Микробиология. 1983. Т. 52. № 6. С. 962-966.

35. Ковров Б.Г., Денисов Г.В., Секачева Л.Г., Белый А.В. Скорость окисления железа культурой Thiobacillus ferrooxidans в зависимости от аэрации // В кн.: Рост микроорганизмов на Срсоединениях. Тез. докл. сим. Пущино, 1977. С. 113-115.

36. Кондратьева Е.Н. Автотрофные прокариоты. М.: МГУ, 1996. 312 с.

37. Красильникова Е.Н., Богданова Т.Н., Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Каравайко Г.И. О метаболизме восстановленных соединений серы у Sulfobacillus thermosulfidooxidans, штамм 1269 // Микробиология. 1998. Т. 67. № 2. С. 156-164.

38. Красильникова Е.Н., Захарчук Л.М., Богданова Т.И., Егорова М.И. Углеродный метаболизм сульфобацилл в разных условиях роста // В сб.: "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов". Воронеж: ВГУ, 2000. С. 71—77.

39. Красильникова Е.Н., Захарчук Л.М., Богданова Т.И., Цаплина И.А. Ферменты метаболизма серы у термоацидофильной бактерии Sulfobacillus sibiricus // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. № 1. С. 62-65.

40. Красильникова Е.Н., Цаплина И.А., Захарчук Л.М., Богданова Т.И. Влияние экзогенных факторов на активность ферментов метаболизма углерода у термоацидофильных бактерий рода Sulfobacillus II Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 4. С. 418^123.

41. Кузнецов С.И., Иванов М.В., Ляликова Н.Н. Введение в геологическую микробиологию. М.: АН СССР, 1962.

42. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

43. Ломакина Г.Ю., Угарова Н.Н. Биолюминесцентное определение общей бактериальной загрязненности воздуха // В сб. докл. 3 междунар. конгресса "Биотехнология состояние и перспективы развития" ч. 2. Москва. 14-18 марта 2005. С. 197-198.

44. Лысенко A.M., Цаплина И.А., Головачева Р.С., Пивоварова Т.А., Вартанян Н.С., Каравайко Г.И. Таксономическое положение рода Sulfobacillus, основанное на изучении ДНК // Доклады АН СССР. 1987. Т. 294. № 4. С. 970-972.

45. Меламуд B.C., Пивоварова Т.А. Особенности роста типового штамма бактерий вида Sulfobacillus thermosulfidooxidans на среде 9К // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. № 3. С. 309-315.

46. Меламуд B.C., Пивоварова Т.А., Турова Т.П., Колганова Т.В.,Осипов Г.А., Лысенко A.M., Кондратьева Т.Ф., Каравайко Г.И Новая умеренно-термофильная . бактерия Sulfobacillus sibiricus sp. nov. // Микробиология. 2003. Т. 72. № 4. С. 1-8.

47. Монцевичюте-Эрингене Е.В. Упрощённые математико-статистические методы в медицинской исследовательской работе // Пат. физиология и эксперимент, терапия. 1964. №4. С. 71.

48. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Хоулта Дж., Крига Н., Снита П., Стейли Дж., Уильямса С. Перев. с англ. под ред. Заварзина Г.А. Девятое изд. М.: Мир, 1997. Т. 2. С. 457.

49. Петушкова Ю.П., Ивановский Р.Н. Ферменты, участвующие в метаболизме тиосульфата у Thiocapsa roseopersicina при росте в разных условиях // Микробиология. 1976. Т. 45. № 6. С. 960-965.

50. Пивоварова Т.А., Каравайко Г.И. Новые данные о субмикроскопической организации Thiobacillus thiooxidans И Микробиология. 1974. Т. 43. С. 282.

51. Питрюк А.В. Особенности энергетического метаболизма экстремально галоалкалофильных анаэробных прокариот / Автореф. дис. . канд. биол. наук. М. ИНМИ РАН. 2002. 25 с.

52. Подкопаева Д.А. Филогенетическая гетерогенность серных спирилл и физиология микроаэрофильных представителей // Автореф. дис. . канд. биол. наук. М. ИНМИ РАН. 2005. 24 с.

53. Практикум по микробиологии / Под общ. ред. Нетрусова А.И. М.: Академия, 2005. С.296-297.

54. Резников А.А., Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. Методы анализа природных вод. М.: Недра, 1970. С. 140-143.

55. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. М.: Наука, 1980. 160 с.

56. Романова А.К. Ассимиляция углекислоты при хемолитоавтотрофии // В кн.: «Хемосинтез» / Под ред. Иванова М.В., М.: Наука, 1989. С. 148-169.

57. Самуилов В.Д., Олескин А.В. АТФ и его функции // В. кн.: «Технологическая биоэнергетика». М.: МГУ, 1994. С. 6-11.

58. Сапегин А. Г. Программа STATIST для Windows MS-DOS / Кафедра прикладной и экспериментальной математики МГОПУ, 2001.

59. Северина Л.О., Сенюшкин А.А., Сузина Н.Е., Каравайко Г.И. Ультраструктурная организация поверхностного слоя клеточной стенки Sulfobacillus thermosulfidooxidans II Микробиология. 1998. Т. 67. № 6. С. 162-1 вв.

60. Сенюшкин А.А., Северина JI.O., Митюшина JI.JI. Образование полисахаридной капсулы Sulfobacillus thermosulfidooxidans в олиготрофных и миксотрофных условиях // Микробиология. 1997. Т. 66. № 4. С. 455-461.

61. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989. 564 с.

62. Соколова Г.А., Каравайко Г.И. Физиология и геохимическая деятельность тионовых бактерий. М.: Наука, 1964.

63. Современная микробиология: Прокариоты в 2-х томах // Под ред. Ленгелера Й. Древса Г., Шлегеля Г.М.: Мир, 2005. Т. 1. С. 298-313.

64. Сорокин Д.Ю. Совмещенные микробно-химические процессы трансформации неорганических веществ: роль в природных системах и возможности использования в биотехнологии // Микробиология. 1997. Т. 66. № 3. С. 293-301.

65. Сузина Н.Е., Северина Л.О., Сенюшкин А.А., Каравайко Г.И., Дуда В.И. Ультраструктурная организация мембранной системы у Sulfobacillus thermosulfidooxidans II Микробиология. 1999. Т. 68. № 4. С. 491-500.

66. Тупикина О.В. Фенотипические и генотипические характеристики ацидофильных хемолитотрофов, окисляющих разные типы пиритов // Автореф. дис. . канд. биол. наук. М. ИНМИ РАН. 2008. 26 с.

67. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Кутузова Г.Д., Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ // Биохимия. 1993. Т. 58. № 9. С. 1351-1372.

68. Уголькова Н.В., Ивановский Р.Н. О механизме автотрофной фиксации углекислоты у Chloroflexus aurantiacus II Микробиология. 2000. Т. 69. № 2. С. 175-179.

69. Фихте Б.А., Заичкин Э.И., Ратнер Е.Н. Новые методы физического препарирования биологических объектов для электронно-микроскопических исследований. М.: Наука, 1973.

70. Фомченко Н.В., Муравьев М.И., Меламуд B.C. Двухстадийный процесс бактериально-химического выщелачивания медного концентрата // В сб. докл. 4 междунар. конгресса "Биотехнология состояние и перспективы развития" ч. 2. Москва. 12-16 марта 2007. С. 322.

71. Фрунджян В.Г., Бровко Л.Ю., Бабунова B.C., Карташова В.М., Угарова Н.Н. Биолюминесцентный метод определения общей бактериальной обсеменненности сырого молока // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 3. С. 358—365.

72. Цаплина И.А., Богданова Т.И., Кондратьева Т.Ф., Меламуд B.C., Лысенко А.М., Каравайко Г.И. Генотипический и фенотипический полиморфизм штаммов умеренно термофильной бактерии Sulfobacillus sibiricus II Микробиология. 2008. Т. 77. №2. С. 178-187.

73. Цаплина И.А., Богданова Т.И., Саякин Д.Д., Каравайко Г.И. Влияние органических веществ на рост Sulfobacillus thermosulfidooxidans 1269 и окисление пирита // Микробиология. 1991. Т. 60. № 6. С. 34-40.

74. Цаплина И.А., Красильникова Е.Н., Захарчук Л.М., Егорова М.А., Богданова Т.И., Каравайко Г.И. Метаболизм углерода у Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes штамм 41 // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 334-340.

75. Цаплина И.А., Осипов Г.А., Богданова Т.И., Недорезова Т.П., Каравайко Г.И. Жирнокислотный состав липидов термоацидофильных бактерий рода Sulfobacilli4S II Микробиология. 1994. Т. 63. № 5. С. 821-830.

76. Шелемех О.В., Гейдебрехт О.В., Плакунов В.К., Беляев С.С. «Кислородная регуляция» состава дыхательной цепи дрожжей Debaryomyces hansenii при множественном стрессе // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 562-569.

77. Anfinsen C.B. Aconitase from pig heart muscle // In: Methods in enzymology / Ed. Colowick S.P., Kaplan N.O. N. Y.: Acad.Press, 1955. V. 1. P. 695-698.

78. Apel W.A., Dugan P.R., Tuttle J.H. Adenosine 5'- triphosphate formation in Thiobacillus ferrooxidans vesicles by H+ ion gradients comparable to those of environmental condition // J. Bacteriol. 1980. V. 142. № 1. P. 295-301.

79. Appia-Ayme C., Guiliani N., Ratouchniak J., Bonnefoy V. Characterization of an operon encoding two c-type cytochromes an ааз-type cytohrome oxidase, and rusticyanin in T. ferrooxidans ATCC 33020 // Appl. Environ. Microbiol. 1999. P. 4781^787.

80. Ashwell G. Colorimetric analysis of sugars. Anthrone reaction // Methods Enzymol. 1957. V. 3.P. 84—85.

81. Atkinson Т., Cairns S., Cowan D.A., Danson M.J., Hough D.W., Johnson D.B., Norris P.R., Raven N., Robinson C., Robson R., Sharp R.J. A microbial survey of Montserrat island hydrothermal biotopes // Extremophiles. 2000. V. 4. P. 305-313.

82. Bacelar-Nicolau P., Johnson D.B. Leaching of pyrite by acidophilic heterotrophic iron-oxidizing bacteria in pure and mixed cultures // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. № 2. P. 585-590.

83. Baker B.J., Banfield J.F. Microbial communities in acid mine drainage // FEMS Microbiol. Ecol. 2003. V. 44. P. 139-152.

84. Barr D.W., Ingledew W. J., Norris P.R. Respiratory chain components of iron-oxidizing, acidophilic bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1990. V. 70. № 1. P. 85-90.

85. Bassham J. A., Calvin M. The path of carbon in photosynthesis. Englewood Cliffs. N.J.: Prentice Hall, 1957. 104 p.

86. Bathe S., Norris P.R. Ferrous iron- and sulfur-induced genes in Sulfolobus metallicus И Appl. Environ. Microbiol. 2007. P. 2491-2497.

87. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. / Ed. Garrity G.M. New York: Springer Verlag, 2005. V. 2. 2816 p.

88. Bergmeyer H.U., Gawehn K., Grasse M. Enzymes as biochemical reagents // In: "Methods of enzymatic analysis". New York; San Francisco; London: Acad. Press, 1974. V. l.P. 425-522.

89. Bernier L., Warren L.A. Geochemical diversity in S processes mediated by culture-adapted and environmental-enrichments of Acidithiobacillus spp. // Geochim. Cosmochim. Acta. 2007. V. 71. P. 5684-5697.

90. Berry E.A., Trumpower B.L. Simultaneous determination of hemes a, b, and с from pyridine hemochrome spectra // Anal. Biochem. 1987. V. 161. № 1. P. 1—15.

91. Blake R.C., Shute E.A. Respiratory Enzymes of Thiobacillus ferrooxidans. Kinetic properties of an acid-stable iron:rusticyanin oxidoreductase // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 9220-9228.

92. Blake R.C., Shute E.A., Greenwood M.M., Spencer G.H., Ingledew W.J. Enzymes of aerobic respiration on iron // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. P. 9-18.

93. Bond P.L., Banfield J.F. Design and performance of rRNA targeted oligonucleotide probes for in situ detection and phylogenetic identification of microorganisms inhabiting acid mine drainage environments // Microbiol. Ecol. 2001. V. 41. P. 149-161.

94. Bond P.L., Druschel G.K., Banfield J.F. Comparison of acid mine drainage microbial communities in physically and geochemically distinct ecosystems // Appl. Environ. Microbiol. 2000a. V. 66. № 11. P. 4962-4971.

95. Bond P.L., Smriga S.P., Banfield J.F. Phylogeny of microorganisms populating a thick, subaerial, predominantly lithotrophic biofilm at an extreme acid mine drainage site // Appl. Environ. Microbiol. 20006. V. 66. № 9. P. 3842-3849.

96. Bonjour F., Aragno M. Bacillus tusciae, a new species of thermoacidophilic, facultatively chemolithoautotrophic, hydrogen oxidizing sporeformer from a geothermal area// Arch. Microbiol. 1984. V. 139. P. 397-401.

97. Bridge T.A.M., Johnson D.B. Reduction of soluble iron and reductive dissolution of ferric iron-containing minerals by moderately thermophilic iron-oxidizing bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 2181-2590.

98. Brierley C.L., Brierley J.A. A chemolithotrophic and thermophilic microorganism isolated from acid hot spring // Can. J. Microbiol. 1973. V. 19. № 2. P. 183-188.

99. Brierley C.L., Brierley J. A., Norris P.R., Kelly D.P. Metal-tolerant microorganisms of hot, acid environment // Microbial Growth and Survival in Extremes of Environment / Eds. Gould G.V., Corry J.E.L. London: Academ. Press, 1980. P. 39-51.

100. Brierley J.A., Lockwood S.J. The occurrence of thermophilic iron-oxidizing bacteria in copper leaching system // FEMS Microbiol. Lett. 1977. V. 2. P. 163-165.

101. Brierley J.A., Norris P.R., Kelly D.P., Le Roux N.W. Characteristics of a moderately thermophilic and acidophilic iron-oxidizing Thiobacillus II Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1978. V. 5. P. 291-299.

102. Brock T.D., Brock K.M., Belly R.T., Weiss R.L. Sulfolobus: a new genus of sulfur-oxidizing bacteria, living at low pH and high temperature // Arch. Mikrobiol. 1972. V. 84. №1. P. 54-68.

103. Brock T.D., Gustafson J. Ferric iron reduction by sulfur- and iron-oxidizing bacteria// Appl. Environ. Microbiol. 1976. V. 32. № 4. P. 567-571.

104. Bryan C.G., Johnson D.B. Dissimilatory ferrous iron oxidation at low pH: a novel trait identified in the bacterial subclass Rubrobacteridae II FEMS Microbiol. Lett. 2008 (in press).

105. Bucher Т., Peleiderer G. Pyruvate kinase from muscle // In: Methods in enzymology / Eds. Colowick S.P., Kaplan N.O. N. Y.: Acad. Press, 1955. V. 1. P. 435440.

106. Buckstein M.H., He J., and Rubin H. Characterization of nucleotide pools as a function of physiological state in Escherichia coli II J. Bacteriol. 2008. V. 190. № 2. P. 718-726.

107. Callaway E. Cell Biology. Bacteria's new bones // Nature. 2008. V. 451. № 7175. P. 124-126.

108. Carlos C., Reis F.C., Vicentini R., Hadureira D.J., Ottoboni L.M. The rus operon genes are differentially regulated when Acidithiobacillus ferrooxidans LR is kept in contact with metal sulfides // Curr. Microbiol. 2008. V. 57. № 4. P. 375-380.

109. Cavazza C., Giudichi-Orticoni M-T., Nitschke W., Appia C., Bonnefoy V., Bruschi M. Characterisation of a soluble cytochrome c4 isolated from Thiobacillus ferrooxidans II Em. J. Biochem. 1996. V. 242. P. 308-314.

110. Cavicchioli R., Thomas T. Extremophiles // In: Encyclopedia of Microbiology. 2000. V. 2. P. 317-337.

111. Chen Z.-W., Liu Y.-Y., Wu J.-F., She Q., Jiang C.-Y., Liu S.-J. Novel bacterial sulfur oxygenase reductases from bioreactors treating gold-bearing concentrates // Appl. . Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 74. P. 688-698.

112. Chu C.P., Lee D.J., Chang Bea-Ven, Liao C.S. Using ATP bioluminescence technique for monitoring microbial activity in sludge // Biotechnol. Bioeng. 2001. V. 75. № 4. P. 469^174.

113. Clark D.A., Norris P.R. Acidimicrobium ferrooxidans gen. nov., sp. nov.: mixed-culture ferrous iron oxidation with Sulfobacillus species // Microbiology. 1996. V. 141. P. 785-790.

114. Cleaver A.A., Burton N.P., Norris P.R. A novel Acidimicrobium species in continuous cultures of moderately thermophilic mineral-sulfide-oxidizing acidophilcs // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. № 13. P. 4294^1299.

115. Corbett C.M., Ingledew WJ. Is Fe3+/2+ cycling on intermediate in sulphur oxidation by Fe2+-grown Thiobacillus ferrooxidans? // FEMS Microbiol. Lett. 1987. V. 41. № i.p. i6.

116. Cox J.C., Boxer D.H. The purification and some properties of rusticyanin, a blue copper protein involved in iron(II) oxidation from Thiobacillus ferrooxidans II Biochem. J. 1978. V. 174. № 2. P. 497-502.

117. Darland G., Brock T.D. Bacillus acidocaldarius sp. nov., an acidophilic thermophilic spore-forming bacterium // J. Gen. Microbiol. 1971. V. 67. P. 9-15.

118. Daron H.H. Grunsalus J.C. Citratase and isocitratase // In: Methods in enzymology / Eds. Colowick S.P., Kaplan N.O. N. Y.: Acad. Press, 1962. V. 5. P. 622633.

119. Dauner M., Storm Т., Sauer U. Bacillus subtilis metabolism and energetics in carbon-limited and excess-carbon chemostat culture // J. Bacteriol. 2001. V. 183. № 24. P. 7308-7317.

120. Dement'eva E.I., Fedorchuk E.A., Brovko L.Yu., Savitskii A.P., Ugarova N.N. Fluorescent properties of firefly luciferases and their complexes with luciferin // Biosci. Reports. 2000. V. 20. № 1. P. 21-30.

121. De Ley J., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates // Eur. J. Beochem. 1970. V. 12. P. 133—142.

122. De Vrij W., Azzi A., Konings W.N. Structural and functional properties of cytochrome с oxidase from Bacillus subtilis W23 // Eur. J. Biochem. 1983. V. 131. P. 97-103.

123. Diaby N. Dold В., Pfelfer R., Holliger C., Johnson D.B., Hallberg K.V. Microbial communities in a porphyry copper tailings impoundment and their impact on the geochemical dynamics of the mine waste // Environ. Microbiol. 2007. V. 9. № 2. P. 298307.

124. Dopson M., Baker-Austin С., Bond P.L. Analysis of differential protein expression during growth states of Ferroplasma strains and insights into electron transport for iron oxidation // Microbopl. 2005. V. 151. P. 4127^137.

125. Dopson M., Lindstrom E.B. Potential role of Thiobacillus caldus in arsenopyrite bioleaching // Appl. Environ. Microbiol. 1999. P. 65. № 1. P. 36^10.

126. Dopson M., Lindstrom E.B. Analysis of community composition during moderately thermophilic bioleaching of pyrite, arsenical pyrite, and chalcopyrite // Microbiol. Ecol. 2004. V. 48. P. 19-28.

127. Dufresne S., Bousquet J., Boissinot M., Guay R. Sulfobacillus disulfidooxidans sp. nov., a new acidophilic, disulfide-oxidizing, gram-positive, spore-forming bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. № 4. P. 1056-1064.

128. Edwards K.J., Ни В., Hamers R.J., Banfield J.F. A new look at microbial leaching patterns on sulfide minerals // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 34. № 1. P. 197-206.

129. Ehrlich H.L. In.: Geomicrobiology, 4th edition. N. Y.: Taylor and Francis, 2002.

130. Eigener U. Adenine nucleotide pool variation in intact Nirobacter winogradskyi cells//Arch. Microbiol. 1975. V. 102. P. 233.

131. Englard S., Siegel L. Mitochondrial L-malate degydrogenase of beef heart. // In: Methods in enzymology / Ed. Lowenstein J.M. N. Y. etc.: Acad. Press, 1969. V. 13. P. 99-106.

132. Evans M.C.W., Buchanan B.B., Arnon D.I. A new ferredoxin-dependent carbon reduction cycle in a photosynthetic bacterium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1966. V. 55. № 4. P. 928-934.

133. McFadden B.A., Shively J.M. Bacterial assimilation of carbon dioxide by the Calvin cycle // Variations in autotrophic life / Eds. Shively J.M., Barton L.L. London: Acad. Press, 1991. P. 25-49.

134. Feniouk В A, Cherepanov DA, Junge W, Mulkidjanian AY. Coupling of proton flow to ATP synthesis in Rhodobacter capsulatus: FoFi-ATP synthase is absent from about half of chromatophores // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1506. № 3. P. 189203.

135. Friedrich C.G., Rother D., Bardischewsky F., Quentmeier A., Fischer J. Oxidation of reduced inorganic sulfur compounds by bacteria: emergence of a common mechanism? // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 7. P. 2873-2882.

136. Fuchs Т., Huber H., Teiner Т., Burggraf S., Stetter K.O. Metallosphaera prunae sp. nov., a novel metal-mobilizing, thermoacidophilic archaeum, isolated from a uranium mine in Germany // Syst. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 560-566.

137. Fukumori Y., Yano Т., Sato A., Yamanaka T. Fe(II)-oxidizing enzyme purified from Thiobacillus ferrooxidans II FEMS Microbiol. Lett. 1988. V. 50. P. 169-172.

138. Gadkari D., Stolp H. Energy metabolism of Bdellovibrio bacterivorus. Energy production, ATP pool, energy charge // Arch. Microbiol. 1975. V. 102. P. 179.

139. Garcia-Horsman J.A., Barquera В., Rumbley J., Ma J., and Gennis R.B. The superfamily of heme-copper respiratory oxidases // J. Bacteriol. 1994. P. 5587-5600.

140. Ghauri M.A., Johnson D.B. Physiological diversity amongst some moderately thermophilic iron-oxidizing bacteria// FEMS Microbiol. Ecol. 1991. V. 85. P. 327-334.

141. Gillis M., De Ley J., Cleen M. The determination of molecular weight of bacterial DNA from renaturation rates // Eur. J. Biochem. 1970. V. 12. P. 143-153.

142. Giudici-Orticoni M.-T., Leroy G., Nitschke W., Bruschi M. Characterization of a < new dihemic C4-type cytochrome isolated from Thiobacillus ferrooxidans II Biochem. 2000. V. 39. P. 7205-7211.

143. Gleissner M., Kaiser U., Antonopoulos E., Schafer G. The archaeal Sox ABCD complex is a proton pump in Sulfolobus acidocaldarius И J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 13. P. 8417-8426.

144. Gonzales-Toril E., Llobet-Brossa E., Casamayor E.O., Amann R., Amils R. Microbial ecology of an extreme acidic environment, the Tinto River // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 8. P. 4853^1865.

145. Greer III L.F., Szalay A.A. Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms: a review // Luminescence. 2002. V. 17. P. 43— 74.

146. Guffanti A.A., Davidson L.F., Mann T.M., Krulwich T.A. Nigeriein induced death of an acidophilic bacterium // J. Gen. Microbiol. 1979. V. 114. P. 201-206.

147. Hagen K.D., Nelson D.C. Organic carbon utilization by obligately and facultatively autotrophic Beggiatoa strains in homogeneous and gradient cultures // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. № 3. P. 947-953.

148. Hallberg K.B., Coupland K., Kimura S., Johnson D.B. Macroscopic streamer growths in acidic, metal-rich mine waters in north Wales consist of novel and remarkably simple bacterial communities // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 2022-2030.

149. Hallberg K.B., Johnson B.D. Biodiversity of acidophilic prokaryotes // Adv. Appl. Microbiol. 2001. V. 49. P. 37-84.

150. Hallberg K.B., Lindstrom E.B. Characterization of Thiobacillus caldus sp. nov., a moderately thermophilic acidophile // Microbiology. 1994. V. 140. P. 3451-3456.

151. He Z., Xiao Sh., Xie X., Hu Y. Microbial diversity in acid mineral bioleaching systems of Dongxiang copper mine and Yinshan lead-zinc mine // Extremophiles. 2008. V. 12. № 2. P. 225-234.

152. Henning W., Vo L., Albanese J., Bruce C.H. High-yield purification of cytochrome ааз and cytochrome сааз oxidases from Bacillus subtilis plasma membranes // Biochem. J. 1995. V. 309. P. 279-283.

153. Hiraishi A., Inagaki K., Tanimoto Y., Iwasaki M., Kishimoto N., Tanaka H. Phylogenetic characterization of a new thermoacidophilic bacterium isolated from hot springs in Japan // J. Gen. Appl. Microbiol. 1997. V. 43. P. 295-304.

154. Holden P.J. Characterisation of carbon fixation in the iron-oxidizing moderate thermophile NMW6 // In: Biohydrometallurgical Technologies / Eds. Torma A.E., Wey J.E., Lakshmanan V.L. The Minerals, Metals and Material Society, 1993. P. 705-714.

155. Hiigler M., Huber H., Stetter K.O., Fuchs G. Autotrophic CO2 fixation pathways in archaea (1Crenarchaeota) // Arch. Microbiol. 2003. V. 179. P. 160-173.

156. Ivanovsky R. N., Krasilnikova E. N., Fal Y. I. A pathway of the autotrophic CO2 fixation in Chloroflexus aurantiacus II Arch. Microbiol. 1993. V. 159. № 3. P. 257-264.

157. Johnson D.B. Selective solid media for isolating and enumerating acidophilic bacteria // J. Microbiol. Meth. 1995. V. 23. P. 205-218.

158. Johnson D.B. Biodiversity and ecology of acidophilic microorganisms // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 307-317.

159. Johnson D.B., McGinness S. Ferric iron reduction by acidophilic heterotrophic bacteria// Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. № 1. P. 207-211.

160. Johnson D.B., Hallberg K.B. The microbiology of acidic mine waters // Res. Microbiology. 2003a. V. 154. P. 466-473.

161. Johnson D.B., Hallberg K.B. Techniques for detecting and identifying acidophilic mineral-oxidizing microorganisms // Biomining / Eds. Rawlings D.E., Johnson D.B. Berlin: Springer, 2007. P. 237-261.

162. Johnson D.B., Joulian C., d'Hugues P., Hallberg K.B. Sulfobacillus benefaciens sp. nov., an acidophilic facultative anaerobic Firmicute isolated from mineral bioleaching operations // Extremophiles. 2008. V. 12. P. 789-798.

163. Johnson D.B., Okibe N., Roberto F.F. Novel thermo-acidophilic bacteria isolated from geothermal sites in Yellowstone national park: physiological and philogenetic characteristics//Arch. Microbiol. 20036. V. 180. P. 60-68.

164. Johnson D.B., Okibe N., Hallberg K.B. Differentiation and identification of iron-oxidizing acidophilic bacteria using cultivation techniques and amplified ribosomal DNA restriction enzyme analysis // J. Microbiol Methods. 2005. V. 60. № 3. P. 299-313.

165. Kai M., Yano Т., Tamegai H., Fukumori Y., Yamanaka T. Thiobacillus ferrooxidans cytochrome oxidase: purification, and molecular and enzymatic features // J. Biochem. (Tokyo). 1992. V. 112. № 6. P. 816-821.

166. Kappler U., Dahl K. Enzymology and molecular biology of prokaryotic sulfite oxidation // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 203. № 1. P. 1-9.

167. Kappler U., Sly L., McEwan A. Respiratory gene clusters of Metallosphaera sedula differential expression and transcriptional organization // Microbiology. 2005. V. 151. P. 35-43.

168. Karavaiko G.I. Microbial aspects of biohydrometallurgy // J. Mining Metallurgy. 1997. V. 33. P. 37-40.

169. Karavajko G.I., Bulygina E.S., Tsaplina I.A., Bogdanova T.I., Chumakov K.M. Sulfobacillus thermosulfidooxidans: a new lineage of bacterial evolution? // FEBS Lett. 1990. V. 261. №1. P. 8-10.

170. Karavaiko G.I., Golovacheva R.S., Pivovarova T.A., Tsaplina I.A., Vartanyan N.S. Thermophilic bacteria of the genus Sulfobacillus // In: Biohydrometallurgy, Proceed. Int. Symp. / Eds. Norris P.R. and Kelly D.P. 1988. P. 29^11.

171. Karavaiko G.I., Smolskaja L.S., Golyshina O.K., Jagodkina M.A., Egorova E.Y. Bacterial pyrite oxidation: influence of morphological, physical and chemical properties // Fuel Processing Technology. 1994. V. 40. P. 151-165.

172. Kasai K., Nishizawa Т., Takashi K., Hosaka Т., Aoki H., Ochi K. Physiological analysis of the stringent response elicited in an extreme thermophilic bacterium, Thermus thermophilus // J. Bacteriol. 2006. V. 188. № 20. P. 7111-7122.

173. Kelly D.P. The Chemolithotrophic Procaryotes // In The Procaryotcs / Eds. Balow A. et al. New-York; Berlin; Heidelberg; London; Paris; Tokyo; Hong Kong; Barcelona; Budapest: Springer Yerlag, 1992. V. 1. P. 331-343.

174. Kelly D.P. Thermodynamic aspects of energy conservation by chemolithotrophic sulfur bacteria in relation to the sulfur oxidation pathways // Arch. Microbiol. 1999. V. 171. №3. P. 219-229.

175. Kelly D.P., McDonald I.R., Wood A.P. Proposal for the reclassification of Thiobacillus novellus as Starkeya novella gen. nov., comb, nov., in the a-subclass of the Proteobacteria// Int. J. Syst. Bacteriol. 2000. V. 50. P. 1797-1802.

176. Kelly D.P., Shergill J.K., Lu W.-P., Wood A.P. Oxidative metabolism of inorganic sulfur compounds by bacteria // Antonie van Leeuwenhoek. 1997. V. 71. P. 95-107.

177. Kelly D.P., Wood A.P. Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halolhiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 2000. V. 50. P. 511-516.

178. Kita K., Konishi K., Anraku Y. Terminal oxidases of Escherichia coli aerobic respiratory chain // 1984. V. 259. № 5. p. 3375-3381.

179. Knouw B.T., McCurdy U.D. Tricarboxylic asid cycle enzymes and morphogenesis in Blastocladiella emersonii II J. Bacteriol. 1969. V. 99. № 1. P. 197-206.

180. Kock D., Schippers A. Quantitative microbial community analysis of three different sulfidic mine drainage // Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. № 16. P. 5211— 5219.

181. Komnitsas K., Paspaliaris I., Zilberchmidt M., Groudev S. Environmental impacts at coal waste disposal sites efficiency of desulfurization technologies // Global Nest: Int. J. 2001. V. 3. № 2. P. 109-116.

182. Komorowski L, Verheyen W, Schafer G. The archaeal respiratory supercomplex SoxM from Sulfolobus acidocaldarius combines features of quinole and cytochrome с oxidases // Biol. Chem. 2002. V. 383. № 11. P. 1791-1799.

183. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

184. Lazdunski A., Belaich J.P. Uncoupling in bacterial growth: ATP pool variation in Zymomonas mobilis cells in relation to different uncoupling condition of growth // J. Gen. Microbiol. 1972. V. 70. № 2. P. 187-198.

185. Lehner S., Savage K. The effect of As, Co, and Ni impurities on pyrite oxidation kinetics: batch and flow-through reactor experiments with synthetic pyrite // Geochem. Cosmochim. Acta. 2008. V. 72. P. 1788-1800.

186. Ling K.N., Paetkau V., Marcus F., Lardy H.A. Phosphofructokinase // In: "Methods in enzymology". N. Y.; London: Acad. Press, 1966. V. 9. P. 425^129.

187. Liu C.-Q., Plumb J., and Hendry P. Rapid specific detection and quantification of bacteria and archaea involved in mineral sulfide bioleaching using real-time PCR // Biotechnol. Bioeng. 2006. V. 94. № 2. P. 330-336.

188. London J., Rittenberg S.C. Effects of organic matter on the growth of Thiobacillus intermedius // J. Bacteriol. 1966. V. 91. № 3. P. 1062-1069.

189. Lovley D.R. Dissimilatory metal reduction // Ann. Rev. Microbiol. 1993. V. 47. P. 263-290.

190. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. № 1. P. 265-275.

191. Lubben M., Morand K. Novel prenylated hemes as cofactors of cytochrome oxidases // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 21473-21479.

192. Macalady J.L., Jones D.S., Lyon E.N. Extremely acidic pendulous cave wall biofilms from the Frasassi cave system, Italy // Environ. Microbiol. 2007. V. 9. № 6. P. 1402-1414.

193. Manning H.L. New medium for isolating iron-oxidizing and heterotrophic acidophilic bacteria from asid mine drainage // Appl. Microbiol. 1975. V. 30. P. 10101015.

194. Marmur J.A. A procedure for the isolation DNA from microorganism // J. Mol. Biol. 1961. V.3.P. 208-218.

195. Marsh R.M., Norris P.R. The isolation of some thermophilic, autotrophic iron-and sulfur-oxidizing bacteria//FEMS Microbiol. Lett. 1983. V. 17. P. 311-315.

196. Massey V. Fumarase // In: Methods in enzymology / Eds. Colowick S.P., Kaplan N.O. New York: Acad. Press, 1955. V. 1. P. 729-735.

197. Matin A. Keeping a neutral cytoplasm: the bioenergetics of obligate acidophiles // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 75. № 2-3. P. 307-318.

198. Miernyk J.A., Trelease R.N., Choinsky G.S. Malate synthase activity in cotton and other ungerminated oilseeds // Plant physiology. 1979. V. 63. № 6. P. 1068-1071.

199. Mikkelsen D., Kappler U., McEwan A.G., Sly L.I. Archaeal diversity in two thermophilic chalcopyrite bioleaching reactors // Environ. Microbiol. 2006. V. 8. P. 2050-2056.

200. Morales T.A., Dopson M., Athar R., Herbert R.B.Jr. Analysis of bacterial diversity in acidic pond water and compost after treatment of artificial acid mine drainage for metal removal // Biotechnol. Bioeng. 2005. V. 90. № 5. P. 543-551.

201. Nicolaus В., Improta R., Manca C.M., Lama L., Esposito E., Gambacorta A. Alicyclobacilli from an unexplored geothermal soil in Antarctica: Mount Rittmann // Polar Biol. 1998. V. 19. P. 133-141.

202. Nouailler M., Bruscella P., Lojou E., Lebrun R., Bonnefoy V., Guerlesquin F. Structural analysis of the HiPIP from the acidophilic bacteria: Acidithiobacillus ferrooxidans // Extremophiles. 2006. V. 10. P. 191-198.

203. Norris P.R. Acidophilic bacteria and their activity in mineral sulfide oxidation // In: Microbial Mineral Recovery / Eds. Ehrlich H.L., Brierleyi C.L. N. Y.: McGraw-Hill, 1990. P. 3-27.

204. Norris P.R., Burton N.P., Foulis N.A. Acidophiles in bioreactor mineral processing // Extremophiles. 2000. V. 4. № 2. P. 71-76.

205. Norris P.R., Clark D.A., Owen J.P., Waterhouse S. Characteristics of Sulfobacillus acidophilus, sp. nov., and other moderately thermophilic mineral-sulfide-oxidizing bacteria// Microbiology. 1996. V. 142. P. 775-783.

206. Okibe N., Gericke M., Hallberg K.B., Johnson D.B. Enumeration and characterization of acidophilic microorganisms isolated from a pilot plant stirred tank bioleaching operation // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 4. P. 1936-1943.

207. Okibe N., Johnson B. Bioleaching of pyrite by defined mixed cultures of moderately thermophilic acidophilcs // Biohydrometallurgy: Fundamentals, Technology and Sustainable Development, Part A / Eds. Ciminelli V.S.T., Garcia O. 2001. P. 443451.

208. Owen R.J., Hill L.R., Lapagc S.P. Determination of DNA base compositions from melting profiles in delute buffers // Biopolymers. 1969. V. 7. P. 503-516.

209. Ozkaya В., Sahinkaya E., Nurmi P., Kaksonen A.H., Puhakka J.A. Kinetics of iron oxidation by Leptospirillum ferriphilum dominated culture at pH below one // Biotechnol. Bioeng. 2007. V. 97. № 5. P. 1121-1127.

210. Palmfeldt J., Paese M., Hahn-Hagerdal В., Ed. W.J. van Niel. The Pool of ADP and ATP regulates anaerobic product formation in resting cells of Lactococcus lactis II Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. № 9. P. 5477-5484.

211. Pronk J.T., Johnson D.B. Oxidation and reduction of iron by acidophilic baceria // Geomicrobiol. 1992. V. 10. P. 153-171.

212. Pronk J.T., Liem K., Bos P., Kuenen J.G. Energy transduction by anaerobic ferric iron respiration in Thiobacillus ferrooxidans II Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. № 7. P. 2063-2068.

213. Pronk J.T., Meesters P.J. W. van Dijken J.P., Bos P., Kuenen J.G. Heterotrophic growth of Thiobacillus acidophilus in batch and chemostat cultures // Arch. Microbiol. 1990a. V. 153. № 4. P. 392-398.

214. Pronk J.T., Meijer W.M., Hazeu W., van Dijken J.P., Bos P. Growth of Thiobacillus ferrooxidans on formic acid // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. № 7. P.2057-2062.

215. Pronk J.T., Meulenberg R., Hazeu W., Bos P., Kuenen J.G. Oxidation of reduced inorganic sulfur compounds by acidophilic thiobacilli // FEMS Microbiol. Rev. 1990b. V. 75. P. 239-306.

216. Quayle J. R., Fuller R. C., Benson A. A., Calvin M. Enzymatic carboxylation of ribulose diphosphate // J. Am. Chem. Soc. 1954. V. 76. P. 3610-3611.

217. Rainey F.A., Fritze D., Stackebrandt. The philogenetic diversity of thermophilic members of the genus Bacillus as revealed by rDNA analysis // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V. 115. № 2. P. 205-212.

218. Rawlings D.E., Johnson D.B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia // Microbiology. 2007. V. 153. P. 315-324.

219. Reed L.J., Mukheryae B.B. a-Ketoglutarate dehydrogenase complex from Escherichia coli / Ed. Lowenstein J.M. N.Y.: Academic Press, 1969. V. 13. P. 81-90.

220. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol. 1963. V. 17. P. 208-213.

221. Riekkola-Vanhanen M. Talvivaara black schist bioheap-leaching demonstration plant // Adv. Mater. Res. 2007. V. 20-21. P. 30-33.

222. Rieske J.S. The quantitative determination of mitochondrial hemoproteins // Methods in enzymology. 1967. V. 10. P. 488^193.

223. Robertson L.A., Kuenen J.G. The Genus Thiobacillus // Prokaryotes. 2006. V. 5. P. 812-827.

224. Rohwerder Т., Sand W. The sulfane sulfur of persulfides is the actual substrate of the sulfur-oxidizing enzymes from Acidithiobacillus and Acidiphilium spp. // Microbiology. 2003. V. 149. P. 1699-1710.

225. Rohwerder Т., Sand W. Oxidation of inorganic sulfur compounds in acidophilic prokaryotes // Eng. Life Sci. 2007. V. 7. № 4. P. 301-309.

226. Sand W., Gerke Т., Hallmann R., Schippers A. Sulfur chemistry biofilm, and the (in)direct attack mechanism — a critical evaluation of bacterial leaching // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 43. № 6. P. 961-966.

227. Schippers A., Jozsa P.G., Sand W. Sulfur chemistry in bacterial leaching of pyrite // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. № 9. P. 3424-3431.

228. Schippers A., Sand W. Bacterial leaching of metal sulfides proceeds by two indirect mechanisms via thiosulfate or via polysulfides and sulfur // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. № 1. P. 319-321.

229. Segerer A., Stetter K.O., Klink F. Two contrary modes of chemolithotrophy in the same archaebacterium // Nature. 1985. V. 313. № 6005. P. 787-789.

230. Shively J.M., van Keulen G., Meijer W.G. Something from almost nothing: Carbon dioxide fixation in chemoautotrophs // Ann. Rev. Microbiol. 1998. V. 52. P. 191— 230.

231. Sibley J.A., Lehninger A.L. Determination of aldolase in animal tissues // J. Biol. Chem. 1949. V. 177. № 2. P. 859-872.

232. Silverman M.P., Lundgren D.G. Studies on the chemoautotrophic iron bacterium Ferrobacillus ferrooxidans. I. An improved medium and a harvesting procedure for securing high cell yields // J. Bacteriol. 1959. V. 77. № 5. P. 642-647.

233. Simmons S.L., Dibartolo G., Denef V.J., Goltsman D.S., Thelen M.P., Banfield J.F. Population genomic analysis of strain variation in Leptospirillum group II bacteria involved in acid mine drainage formation // PLoS Biol. 2008. V. 22. № 6 (7). P. 177.

234. Slobodkin A., Reysenbach A-L., Mayer F., Wiegel J. Isolation and characterization of the homoacetogenic thermophilic bacterium Moorella glycerini sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 969-974.

235. Smith A.L., Kelly D.P., Wood A.P. Metabolism of Thiobacillus A2 grown under autotrophic, mixotrophic and heterotrophic conditions in chemostat culture // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 121. P. 127-138.

236. Sone N., Fujiwara Y. Effects of aeration during growth of Bacillus stearothermophilus on proton pumping activity and change of terminal oxidases // J. Biochem. 1991. V. 239. P. 1024-1031.

237. Sone N., Koyanagi S. and Sakamoto J. Energy-yielding properties of SoxB-type cytochrome 603 terminal oxidase: analyses involving Bacillus stearothermophilus K1041 and its mutant strains // J. Biochem. 2000. V. 127. P. 551-557.

238. Srere P.A. Citrate synthase // In: Methods in enzymology / Ed. Lowenstein J.M. N. Y. etc.: Acad. Press, 1969. V. 13. P. 3-11.

239. Steigmiller S., Turina P., Graber P. The thermodynamic H+/ATP ratios of the H+-ATP-synthases from chroloplasts and Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. № 10. P. 3745-3750.

240. Straub K.L., Benz M., Schink B. Iron metabolism in anoxic environments at near neutral pH // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 34. P. 181-186.

241. Strauss G., Fuchs G. Enzymes of a novel autotrophic CO2 fixation pathway in the phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus, the 3-hydroxypropionate cycle // Eur. J. Biochem. 1993. V. 215. № 3. P. 633-643.

242. Strom E.V., Dinarieva T.Y., Netrusov A.I. Methylobacillus flagellatus KT contains a novel cbo-type cytochrome oxidase // FEBS Lett. 2001. V. 505. P. 109-112.

243. Sugio Т., Hirose Т., Ye Li-Zhen, Tano T. Purification and some properties of sulfite: ferric ion oxidoreductase purified from Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 4189.

244. Sugio Т., Iwahori K., Takeuchi F., Neigishi A., Maeda Т., Kamimura K. Cytochrome с oxidase purified from a mercuri-resistant strain of Acidithiobacillus ferrooxidans volatilizes mercury // J. Biosci. Bioeng. 2001. V. 92. № 1. P. 44-49.

245. Sugio Т., Mizunashi W., Inagaki K., Tano T. Purification and some properties of sulfur:ferric iron oxidoreductase from Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1987. V. 169. № 11. P. 4916-4922.

246. Suzuki I. Microbial leaching of metals from sulfide minerals // Biotechnology Advances. 2001. V. 19. P. 119-132.

247. Suzuki I., Chan C.W., Takeuchi T.L. Oxidation of inorganic sulfur compounds by thiobacilli // In Enviromental Geochemistry of sulfide oxidation / Eds. Alpers C.N., Blowes D.W. Washington: American Chemical Society, 1994. P. 60-67.

248. Tabita F.R. Molecular and cellular regulation of autotrophic carbon dioxide fixation in microorganisms // Microbiol. Rev. 1988. V. 52. № 2. P. 155-189.

249. Takai M., Kamimura K., Sugio T. Involvement of cytochrome a in iron oxidation of a moderately thermophilic iron oxidizing bacterium, strain TI-1 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. V. 63. № 9. P. 1541-1547.

250. Takai M., Kamimura К., Sugio Т. A new oxidase from a moderately thermophilic iron oxidizing bacterium strain TI-1 // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 1653-1658.

251. Tan G.-L., Shu W.-S., Hallberg K.B., Li F., Lan C.-Y., Zhou W.-H., Huang L.-N. Culturable and molecular phylogenetic diversity of microorganisms in an open-dumped, extremely acidic Pb/Zn mine tailings // Extremophiles. 2008. V. 12. № 5. P. 657-664.

252. Tourova T.P., Poltoraus A.B., Lebedeva I.A., Tsaplina I.A., Bogdanova T.I., Karavajko G.I. 16S Ribosomal RNA (rDNA) sequence analysis and phylogenetic position of Sulfobacillus thermosulfidooxidans II Syst. Appl. Microbiol. 1994. V. 17. P. 509-512.

253. Valera C.A., Baez M.E., Agosin E. Osmotic stress response: quantification of cell maintenance and metabolic fluxes in a lysine-overproducing strain of Corynebacterium glutamaticum II Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. № 7. P. 4222^229.

254. Veeger C., Der Vartanian D.V., Zeylemaker W.P. Succinate dehydrogenase // In: Methods in enzymology / Ed. Lowenstein J.M. New York etc.: Acad. Press, 1969. V. 13. P. 81-90.

255. Visser J. M., de Jong G.A. H., Robertson L. A., Kuenen J. G. Purification and characterization of a periplasmic thiosulfate dehydrogenase from the obligately autotrophic Thiobacillus sp. W5 // Arch. Microbiol. 1997. V. 166. № 6. P. 372-378

256. Watson G.M.F., Tabita F.R. Microbial ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a molecule for philogenetic and enzymological investigation // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 146. № 1. P. 13-22.

257. Wood W.A. Assay of enzymes representative of metabolic pathway // Methods microbiol. 1971. V. 6. P. 411-424.

258. Wood A.P., Jukka P.A., Kelly D.P. A challenge for 21st century molecular biology and biochemistry: what are the causes of obligate autotrophy and methanotrophy // FEMS Microbiol. Rev. 2004. V. 28. P. 335-352.

259. Wood A.P., Kelly D.P. Triple Catabolic Pathways for glucose in a fast-growing strain of Thiobacillus A2 // Arch. Microbiol. 1978. V. 117. № 1. P. 309-310.

260. Wood A.P., Kelly D.P. Autotrophic and mixotrophic growth of three thermoacidophilic iron-oxidizing bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1983. V. 20. P. 107— 112.

261. Wood A.P., Kelly D.P. Growth and sugar metabolism of a thermoacidophilic iron-oxidizing mixotrophic bacterium // J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130. P. 1337-1349.

262. Yahya A., Hallberg K.B., Johnson D.B. Iron and carbon metabolism by a mineral-oxidizing Alicyclobacillus-like bacterium //Arch. Microbiol. 2008. V. 189. P. 305-312.

263. Yamanaka Т., Yano Т., Kai M., Tamegai II., Sato A., Fukumori Y. The electron transfer system in an acidophilic iron-oxidizing bacterium // In New era of bioenergetics / Ed. Mukohata Y. Tokyo: Acad. Press, 1991. P. 223-246.

264. Yarzabal A., Brasseur G., Bonnefoy V. Cytochromes с of Acidithiobacillus ferrooxidans //FEMS Microbiol. Lett. 2002. № 209. P. 189-195.

265. Zeng J., Geng M., Liu Y., Zhao W., Xia L., Qiu G. Expression, purification and molecular modeling of the Iro protein from Acidithiobacillus ferrooxidans Fe-1 // Protein Expression and Purification. 2007. V. 52. P. 146-152.

266. Zillig W., Yeats S., Holz I., Gropp F., Rettenberger M., Lutz S. Plasmid-related anaerobic autotrophy of the novel archaebacterium Sulfolobus ambivalens II Nature. 1985. V. 313. № 6005. P. 789-791.

267. Zychlinsky E., Matin A. Effect of starvation on cytoplasmic pH proton motive force, and viability of an acidophilic bacterium, Thiobacillus acidophilus II J. Bacteriol. 1983. V. 153. № l.P. 371-374.1. Благодарности