Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поверхностные слои сульфобацилл

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сенюшкин, Андрей Анатольевич, Москва

* С1 а

О' 4 " ^ ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

Сенюшкин Андрей Анатольевич УДК 579.232/233:579.86

ПОВЕРХНОСТНЫЕ СЛОИ

СУЛЬФОБАЦИЛЛ

Специальность 03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: член-корреспондент РАН, профессор КАРАВАЙКО Г.И. и

кандидат химических наук СЕВЕРИНА Л.О.

МОСКВА 19 9 9

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ ......................... 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................9

ГЛАВА 1. БАКТЕРИИ РОДА SULFOBACILLUS.

1. История открытия. Таксономия рода Sulfobacillus .... 9

2. Морфология и ультраструктурная организация

клеток сульфобацилл...................12

3. Культуральные свойства. Физиология. Метаболизм.....14

4. Положение рода Sulfobacillus в

системе микроорганизмов. Генетика сульфобацилл. Характеристика генома....... . . ..... . -.......1?

5. Экология, геохимическая деятельность

и практическое значение.................19

ГЛАВА 2. ПОВЕРХНОСТНЫЕ СЛОИ БАКТЕРИЙ.

1. Клеточная стенка грамположительных

бактерий. Общие сведения............*.... 22

2. Цитоплазматическая мембрана...............25

3. Муреиновый слой.....................27

4. Бактериальные поверхностные S-слои...........30

4.1. Локализация, структура, типы симметрии . . . . . .31

4.2. Функции.....................33

4.3. Химический состав................37

4.4. Методы выделения ................. 38

5. Капсульный слой.

5.1. Строение. Химический состав.

Свойства.................... . 40

5.2. Влияние внешних условий на биосинтез

веществ капсульного,слоя ............. 43

5.3. Биологические функции

экзополисахаридов . ...............47

5.4. Роль в адгезии..................49

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................51

- с -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Объекты исследований...............53

1.2. Методы культивирования микроорганизмов......53

1.3. Методы определения белка

1.3.1. Определение белка по Гартри...........56

1.3.2. Определение белка клеток в пульпе. ..............5?

1.4. Определение скорости роста культуры.......59

1.5. Определение концентрации железа.........59

1.6. Выявление локализации в клетках

соединений серы.................60

1.7. Идентификация капсульного материала

1.7.1. Цитохимические методы ..........................61

1.7.2. Определение капсульных полисахаридов

фенол-серным методом (метод Дюбуа) ..............62

1.8. Определение содержания углеводов

в культуральной жидкости ..........................63

1.9. Электронно-микроскопические методы исследования

1.9.1. Сканирующая микроскопия.............64

1.9.2. Просвечивающая электронная микроскопия ..........65

1.9.2.1. Негативное контрастирование........ ... 65

1.9.2.2. Ультратонкие срезы ............................65

1.9.2.3. Метод замораживания-скалывания...........66

1.10. Выделение З-слоёв . ...............66

1.11. Определение химического состава г-слоёв.....67

1.11.1. Определение аминокислотного

состава 3-слоев ...............67

1.11.2. Определение углеводного

состава Б-слоев ................................68

Глава 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Рост и развитие сульфобацилл на различных средах в связи с образованием поверхностного капсульного материала.......69

2.2. Динамика потребления клетками

ЬЬегтоБи 1П с1оох1 ёапБ углеводов среды ................ .74

2.3. Выявление капсулы на поверхности клеток 5. ЬЬегто5и1Т1и00х1йапБ

цитохимическими и химическими методами......75

2.4. Выявление капсульного слоя на поверхности клеток 5. 1Ьег1ЮБи1Пс!оох1с1ап5

с помощью электронной микроскопии.........77

2.5. Изучение влияния условий культивирования (различных сред) на образование

сульфобациллой полисахаридной капсулы. ...... 79

2.5.1. Образование капсульных полисахаридов

клетками ЬЪегтози 1Пбоох!сЗапБ.....80

2.6. Накопление трёхвалентного железа при росте 5. ЬЬег1Ю5и1Т1йоох16апБ

на средах с пиритом................82

2.7. Взаимодействие клеточной поверхности

5. ЬЬегтоБи1Т1боох16алз с серой..........83

СТРУКТУРЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ

3.1. Электронно-микроскопическое исследование

5-слоя......................86

3.2. Получение и очистка препарата Б-слоя

клеток сульфобацилл................88

3.3. Изучение химического состава

выделенных препаратов Б-слоя.................89

3.3.1. Аминокислотный состав белков Б-слоя.......90

3.3.2. Углеводный состав гликопротеинов З-слоя.....92

3.4. Выявление .структурированности

и симметрии 3-слоя ................ 93

3.5. Изучение способности З-слоя к самосборке.....95

ИЗУЧЕНИЕ МЕМБРАННОГО АППАРАТА 5. ЬЬегто5и1Пбоох1ёапБ 4.1. Особенности мембранного аппарата

ЬЬегтоБи1Пс1оох1с}ап5.............97

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ................. 103

ВЫВОДЫ.........................119

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................121

ВВЕДЕНИЕ

Постановка проблемы и её актуальность.

Микроорганизмы, обитающие в экстремальных условиях (высокие температуры для роста и развития, высокие концентрации тяжёлых металлов, низкие или высокие значения рН и т.д.) всё больше привлекают внимание исследователей. К таким микроорганизмам относятся представители нового рода Sulfobacillus, которые способны существовать в условиях повышенных температур и низких значений рН, а также окислять элементную серу, закисное железо и сульфидные минералы [Karavaiko et al., 19883, активно участвуя в круговороте химических элементов в природе. Данные микроорганизмы играют огромную роль в окислении рудных месторождений в широком температурном диапазоне, в загрязнении окружающей среды тяжёлыми металлами и в биотехнологии металлов [Пивоварова, Головачёва, 1985 ; Каравайко, 19893 .

Клетки сульфобацилл обладают рядом особенностей:

1) будучи грамположительными бактериями они, как и TMobaclllus ferrooxidans (грамотрицательные), используют в качестве источника энергии Fe2+, S° и сульфидные минералы [Karavaiko et al., 19883;

2) как и тиобациллы, являются ацидофильными, однако в отличие от них, окисляют неорганические субстраты при температуре 20-60°С как в автотрофных, так и в миксотрофных условиях Щаплина с соавт., 19913;

3) способны расти в гетеротрофных условиях.

- О -

Современная наука только ищет подходы к решению проблемы существования живых организмов в предельно экстремальных условиях (одновременно при высоких температурах и низких значениях pH) CNorris and Ingledew, 1992 ; Schleper et al., 1995 ; Norris and Johnson, 1998]. Мы полагаем, что комплексный подход, включающий изучение биохимических, физиологических и структурных особенностей данных микроорганизмов может оказаться наиболее результативным. Изучение поверхностных структур термоадидофилов вообще и сульфобацилл в частности является необходимым этапом на пути познания природы этих уникальных микроорганизмов. Эти структуры являются посредником при взаимодействии клетки с окружающей средой, защищают её от действия вредных факторов среды, принимают участие в обмене веществ.

Для понимания уникальной природы этих микроорганизмов и механизма осуществляемой ими трансформации минералов необходимо в первую очередь провести детальное изучение клеточных поверхностных структур, их химического состава, а также особенностей взаимодействия клеточной поверхности с нерастворимым неорганическим субстратом. Исследования в этом направлении позволяют получить новые существенные данные об ультраструктурной организации и физиологии клеток исследуемых уникальных термоадидофилов и могут явиться основополагающими для решения ряда проблем микробиологического окисления сульфидных минералов, Fe2+ и S°.

Цель и задачи исследования. При изучении сульфобацилл первостепенное значение имеет исследование структуры, тонкой организации, а также химического состава клеточной поверхности. Целью настоящей работы являлось изучение особенностей структурной орга-

п

- и -

низации у сульфобацилл поверхностного слоя (S-слоя), в том числе исследование его ультраструктуры и химического состава, а также влияние внешних условий на формирование капсулы.

Научная новизна. Исследованы поверхностные структуры клеток двух представителей рода Sulfobacillus (S. thermosuifidooxidans BKM В-1269 и S. thermosuif Idooxidans subsp. asporogenes шт. 41). У обоих штаммов обнаружен S-слой, примыкающий к пептидогликану. Впервые осуществлено препаративное выделение S-слоев у типового и аспорогенного штаммов. Показано, что S-слои изученных сульфобацилл являются гликопротеинами. Определён химический состав белковой и углеводной части S-слоя.

Впервые подробно изучена ультраструктурная организация S-слоя S. thermosuif idooxidans BKM В-1269: выявлены тип симметрии и структурированность составляющих его белков. Показана способность S-слоя данной сульфобациллы к самоорганизации в упорядоченные структуры с сохранением типа симметрии.

Подробно исследованы условия образования в процессе роста данной сульфобациллы полисахаридной капсулы, которая вместе с обнаруженным S-слоем образует гликокаликс сложного типа.

С помощью методов криофрактографии и ультратонких срезов изучены особенности ультраструктуры мембранного аппарата S. thermosuif idooxidans. Впервые обнаружено наличие в цитоплазматической мембране слоев инвертированных мембран.

Практическая значимость работы. Исследования позволяют выявить структурные особенности клеточной стенки сульфобацилл в сравнении с другими хемолитотрофными бактериями с близкими функ-

циями как, например, тиобациллами и археями. Данные исследования являются важными для понимания ряда проблем использования сульфобацилл в биогидрометаллургии.

Благодаря своей способности к окислению сульфидных минералов, 3°, Fe2+ в рудных месторождениях, сульфобациллы, как и тиобацил-лы, играют важную роль в создании агрессивной среды в районах активного вулканизма и районах рудной минерализации, а также в шахтах, в коррозии шахтного оборудования, в кучном и чановом выщелачивании металлов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на ежегодных конкурсах научно-исследовательских работ Института микробиологии РАН (в 1993, 1995, 1996 и 1998 гг) и неоднократно премировались .

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 1 статья находится в- печати.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 10 таблиц и 27 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Список цитируемой литературы включает 200 наименований, из них 67 на русском и 133 на иностранных языках.

Г)

- О -

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Северина Л.0.# Сенюшкин A.A., Каравайко Г.И. Ультраструктура и химический состав S-слоя Sulfobacillus thermosuifidooxi-dans. - Доклады Академии Наук, 1993, том 328, N 5, с. 633-636.

2. Северина Л.О., Сенюшкин A.A., Каравайко Г.И. Структура и химический состав 3-слоев представителей рода Sulfobacillus. -Микробиология, 1995, том 64, N 3, с. 336-340.

3. Сенюшкин A.A., Северина Л.О., Митюшина Л.Л. Образование полисахаридной капсулы Sulfobacillus thermosulfidooxidans в оли-готрофных и миксотрофных условиях. - Микробиология, 199?, том 66, N4, с. 455-461.

4. Северина Л.О., Сенюшкин A.A., СузинаР.Е., Каравайко Г.И. Ультраструктурная организация поверхностного слоя клеточной стенки Sulfobacillus thermosulfidooxidans. - Микробиология, 1998, том 67, N 6, с. 762-766.

5. Сузина Н.Е., Северина Л.О., Сенюшкин A.A., Каравайко Г.И., Дуда В.И. Ультраструктурная организация мембранного аппарата Sulfobacillus thermosulfidooxidans. - Микробиология, 1999, том 68, в печати.

r-,

- a -

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА 1. БАКТЕРИИ РОДА SULFOBACILLUS.

1. История открытия. Таксономия рода Sulfobacillus.

В 1878 году из проб руды, отобранных из зон спонтанного разогрева в карьере и на отвале Николаевского медно-цинково-колчеданного месторождения Восточного Казахстана была изолирована аэробная умеренно термофильная бактерия, способная использовать в качестве источников энергии железо, элементную серу и сульфидные минералы. По ацидофилии она была сходна с Thiobacillus ferrooxl-dans, но отличалась от неё термофилией, строением клеточной стенки, способностью образовывать споры, а также более низким содержанием ГЦ в ДНК [Головачёва, Каравайко, 19783. На основании проведённых исследований данный организм был выделен в новый род -Sulfobacillus (Suifо - от лат. sulfur - сера. Sulfobacillus -серная бацилла).

Род Sulfobacillus включает аэробные грамположительные факультативно- автотрофные эубактерии, способные использовать двухвалентное железо, элементную серу и её восстановленные соединения в качестве доноров электронов [Головачёва и Каравайко, 1878; Головачёва, 19841. Аналогично коринеподобным бактериям они проявляют слабую тенденцию к ветвлению клеток, делятся также путём разломов вдоль образующихся септ. Эти два признака составляют основное фе-нот-ипическое отличие Sulfobacillus от представителей рода Bacillus [Головачёва, 1984].

Типовой вид - S. thermosuifidooxidans (типовой штамм ВКМ В-1269 - DSM 9293). Кроме того, были описаны ещё два подвида: термотолерантный и аспорогенный.

В 1983 году из окисляющихся свинцово-цинковых руд Узбекистана выделена термотолерантная, железоокисляющая спорообразующая бактерия, отнесённая пока что к подвиду типового вида и получившая название S. thermosulfidooxidans subsp. nov. thermotolerans (типовой штамм К-1). Сходство с типовой культурой выражалось в аци-дофильности, спороносности, идентичном отношении к энергетическим субстратам. Различия выражались в терминальном расположении спор (у типового вида - субтерминальное, центральное), термотолерантности (типовой вид - умеренный термофил) и некоторых других особенностях [Коваленко, Малахова, 19833.

Б 1988 году из рудничных вод отвала полиметаллического сульфидного месторождения Арманис в Армении была выделена грамположи-тельная умеренно термофильная ацидофильная неспорообразующая бактерия, названная 5. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes (типовой штамм ИНМИ-4'1). Сходство её с 5. thermosulfidooxidans и S. thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans выражалось в ацидо-фильности, идентичности используемых источников энергии, строении клеточной стенки (положительная окраска по Граму), близких значениях содержания ГЦ в ДНК. Генетическое сходство с типовым штаммом подтвердилось высоким процентом (81%) ДНК-ДНК гибридизации. Существенным отличительным признаком явилось отсутствие спорообразования, а также меньший размер генома [Вартанян и др., 19883.

В 1993 году канадскими исследователями описан ещё один представитель рода Sulfobacillus - мезофильный вид S. disulfidooxidans [Dufresne et al., 1993, 19963, выделенный из сточных вод и получивший видовое название из-за своего хорошего роста на органических соединениях, содержащих дисульфидные связи (типа глутатиона).

Норрис [Norris et al., 19963 занимался изучением изолятов из

различных геотермальных источников (штаммы ТН1, BCi., ALV, NAL, ICP и др.). Изучаемые бактерии представляли собой грамположитель-ные умеренно термофильные ацидофилы, окисляющие железо и сульфидные минералы. На основании ряда признаков (белковые профили, содержание Г+Ц, морфология, характеристики автотрофного роста на железе и сере, результаты ДНК:ДНК гибридизации и др.) все исследуемые штаммы были разделены на две группы:

1) относящиеся к виду Sulfobacillus thermosulfidooxldans с содержанием Г+Ц 48-50 мол. %,

2) представители нового вида Sulfobacillus acidophilus с содержанием Г+Ц 55-57 мол. %.

Бактерии, относящееся к новому виду S. acidophilus, могли расти автотрофно и миксотрофно на железе, на элементной сере в присутствии дрожжевого экстракта, а также гетеротрофно на дрожжевом экстракте. Возможность автотрофного роста на сере была характерна только для представителей этого вида [Norris et ai., 1996].

Таким образом, род Sulfobacillus в настоящее время включает в себя три вида (S. thermosulfidooxldans ВКМ В-1269, S. disulfidoo-xidaris и S. acidophilus) и два подвида (5. thermosulfidooxldans subsp. asporogenes и S. thermosulfidooxldans subsp. thermotole-rans), хотя таксономическое положение S. disulfidooxidaris и двух подвидов ещё нельзя считать окончательно выясненным.

К настоящему времени выделены и другие умеренно-термоацидофильные эубактерии, способные расти, окисляя железо или сульфидные минералы CLe Roux et al., 1977; Brierley, 1978; Brierley et al., 1978; 1980; Marsh and Norris, 1983; Wood and Kelly, 19843. Возможно, что некоторые из них, как в случае с S. acidophilus, после детального изучения могут быть отнесены к роду Sulfobacil~

Л i-1

1 U£>.

2. Морфология и клеточная организация сульфобацилл.

Морфология всех представителей рода Sulfobacillus сходна: они представляют собой палочки с округлёнными или заострёнными концами [Головачёва, 19841. Клеточное деление бинарное с помощью септ, равномерное или неравномерное, и может происходить путём разломов вдоль септ [Karavaiko et al., 19881. Неравномерное деление приводит к образованию кокковидных форм или нитей. Основные морфологические характеристики сульфобацилл представлены в таблице 1.

Строение спор сульфобацилл и процесс спорогенеза сходны с таковыми рода Bacillus. Споры обладают высокой термо- и кислотоус-тойчивостью и выдерживают нагревание в течение 30 минут при 110°С при низких значениях pH среды. При хранении при 2°С в 1 % серной -кислоте споры S.disulfidooxidans сохраняли жизнеспособность в течение не менее 15 -недель CDufresne et al., 19931.

Все сульфобациллы не имеют жгутиков и являются неподвижными.

У клеток типового вида, выращенных на среде с пиритом, при фазово-контрастной микроскопии обнаруживается слизистый слой толщиной 200-300 нм, функция которого, как предполагается, заключается в закреплении клеток на субстрате [Головачёва, 1979а!.

Принадлежность Sulfobacillus thermosulfidooxidans к грамполо-жительным бактериям подтверждена электронной микроскопией ультратонких срезов клеток: наружной мембраны, характерной для