Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Углеродный метаболизм бактерий рода Sulfobacillus

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Углеродный метаболизм бактерий рода Sulfobacillus"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. MB. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЕГОРОВА Мария Анатольевна

УГЛЕРОДНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ БАКТЕРИЙ РОДА SUL.FOBAC1LL.US

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. MB. Ломоносова и в лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов института микробиологии им. С.К Виноградского Российской Академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

доцент Л.М. Захарчук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Т.Г. Корженевская

кандидат биологических наук, н.с. Т.Г. Соколова

Ведущая организация: Российский химико-технологический

университет им. Д.И. Менделеева, кафедра биотехнологии

Защита диссертации состоится 10 июня 2004 г. в 15 ч. 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу. 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, корп. 12, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан «_» мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.Ф. Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сульфобациллы представляют собой уникальную группу умеренно-термофильньж спорообразующих ацидофильньж бактерий, использующих в

которые наряду с углекислотой также используются как источник углерода. Эти организмы широко распространены в зонах спонтанного разогрева руд и играют важную роль в биогидрометаллургии, в частности, при переработке сложных руд и концентратов. Однако, особенности углеродного и серного метаболизма сульфобацилл практически не изучены.

Исторически сложилась концепция, считающая облигатной связь хемолитотрофии и автотрофии. Однако было обнаружено, что метаболическая гибкость является основой успешного роста и выживания у довольно большого числа. организмов. Так, для всех известных представителей рода ЗыуЬЬасШш общей характеристикой является способность к стабильному росту только в миксотрофных условиях, когда в среду одновременно внесены неорганический окисляемый субстрат - закисное железо или восстановленные соединения серы - и органическое вещество. Следовательно, способ питания этих организмов может быть описан как миксотрофия - способность одновременно использовать разные источники энергии, окисляя неорганические и органические субстраты, и/или синтезировать один и тот же компонент клеток одновременно из разных соединений углерода - из СО2 и органического вещества. Это свойство описано для многих микроорганизмов, например, водородных бактерий и некоторых грамотрицателъных организмов, окисляющих тиосульфат. Однако, все указанные культуры способны к стабильному росту как в автотрофных, так и в гетеротрофных условиях, что не показано для сульфобацилл. Таким образом, для выяснения возможных причин отсутствия стабильного роста данных организмов в авто- и гетеротрофных условиях представляло интерес изучение у представителей рода 8ы1/оЬасИШ как ферментных систем, отвечающих за рост в автотрофных условиях, так и путей использования органического вещества.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение ферментов углеродного и серного метаболизма бактерий рода SыlfoЬacillыs в различных условиях культивирования.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Изучить особенности роста SJhermosыlfidooxidanssviЬsp.asporogenes штамм 41, S.siЬiricыs

штамм N1 и "S.thermosыlfidooxidans киЬБр. thermotolerans" штамм К1 в различных условиях культивирования.

2. Провести определение в бесклеточных экстрактах культур штаммов 41, N1 и К1 активностей различных ферментов, участвующих в метаболизме углерода: карбоксилаз, ферментов цикла трикарбоновых кислот и ферментов метаболизма углеводов.

качестве источников энергии сульфидные минералы и органические вещества,

3. Выявить закономерности изменения активностей ферментов в зависимости от состава среды культивирования у трех изученных штаммов.

4. Выяснить особенности метаболизма соединений серы в клетках штамма 41.

5. На основе молекулярно-биологических данных и изучения особенностей роста и активности ферментов углеродного метаболизма уточнить систематическое положение nS.theгmosulfidooxidans, subsp.thermotolerans"штамм К1.

Научная новизна работы. В ходе исследований впервые было проведено комплексное изучение характеристик роста и активностей карбоксилирующих ферментов, ферментов метаболизма углеводов и ЦТК у 8Лкггто8и1[1ёоох1ёат si&sp.asporogenes штамм 41, БзШНеш штамм N 1т и "S.thermosulfidooxidans БиЪБр. ШегтоЫетт " (ныне ЛНсус1оЬасШш Мегат) штамм К1. Доказан строго миксотрофный тип питания у всех изученных организмов, нуждающихся как в неорганических донорах электронов, так и в органических веществах. Впервые подробно изучены закономерности изменения активности карбоксилаз в зависимости от внесенного в среду источника углерода и энергии, а также от интенсивности аэрации среды. Показано, что в клетках штамма К1 активность РБФК/О в несколько раз ниже, чем у других изученных организмов, что подтверждает более гетеротрофный тип питания данной бактерии. Впервые у аспорогенного штамма 41 были определены активности ферментов, участвующих в метаболизме соединений серы, и доказано сходство процесса с таковым у облигатно хемолитоавтотрофных серуокислителей. В ходе исследований удалось показать, что в клетках сульфобацилл штаммов 41 и N1 ЦТК не замкнут, как и у строго автотрофных организмов, в то время как у термотолерантного штамма К1 функционирует полный' ЦТК. На основании фенотипических и генотипических признаков "S.theгmosulfidooxidans БиЪБр. theгmotoleгans" штамм К1 переклассифицирован и отнесен к роду ЛlicyclobaciUus как вид ЛШМетт Бр. поу. Проведенные исследования позволяют считать данный организм промежуточным звеном между сульфобациллами с миксотрофным типом питания и типичными гетеротрофами рода ЛlicyclobaciUus.

Практическая значимость. Сульфобациллы входят в состав сообщества хемолитотрофных ацидофилов, которое участвует в процессах окисления сульфидных минералов и в цикле окисления-восстановления железа в естественных и искусственных технологических местообитаниях. Мезофильные и умеренно-термофильные сульфобациллы используется в промышленных процессах биовыщелачивания металлов из руд и золото-мышьяковых концентратов. Знание особенностей углеродного и серного метаболизма сульфобацилл позволяет оценить их вклад в биогидрометаллургические процессы в области температур ЗО-55°С и создать высокоэффективные сообщества сульфобацилл и автотрофных организмов для оптимизации окисления сульфидных минералов сообществом ацидофилов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научной конференции «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов» (Москва, 1999), школе-

конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2000), Международном конгрессе по биотехнологии «BI0TECHN0L0GY-2000» (Берлин, 2000), общероссийской конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в восточно-сибирском регионе" (Иркутск, 2002.), 1-ом Международном конгрессе федерации европейских микробиологических обществ «1st FEMS Congress of european microbiologists» (Любляна, 2003), 2-ой Международной конференции «Биотехнология — охране окружающей среды» (Москва, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ и 2 работы находятся в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения результатов, списка литературы (185 наименований). Работа изложена на 164 листах машинописного текста, включает 18 таблиц и 38 рисунков.

Список сокращений. РБФК/О - рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа; ЦГК -цикл трикарбоновых кислот, ФЕП - фосфоенолпируват.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе использовались 3 вида ацидофильных бактерий -S.thermosulfidooxidans svbsp.asporogenes штамм 41 (=ИНМИ Армении В-6981), выделенный из рудничных вод отвала. полиметаллического сульфидного месторождения Арманис (Вартанян и др. 1988), Ssibiricus штамм N1T (ВКМ В-2280), выделенный из концентрата, полученного из руды Нежданинского месторождения Республики Саха, Якутия (Меламуд и др., 2003) и "S.thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans" штамм К1, выделенный из окисляющихся свинцово-цинковых руд Узбекистана (Коваленко, Малахова, 1983).

Штаммы сульфобацилл 41 и N1T выращивали при температуре 50°С и 55°С соответственно на минеральной среде Брайли (Brierley et al., 1977). Термотолерантный штамм К1 культивировали при температуре 37-40°С на модифицированной среде Маннинга (Manning, 1975).

25% раствор FeS04*7H20 стерилизовали при 0,5 атм, добавляя на каждые 100 мл 5 мл 10N HiSO«, и вносили в среду до конечной концентрации 5г/л FeJ+ для культивирования 41 штамма, 2,5г/л Feí+ для штамма N1T и 1-1,5 г/л Fe2t для штамма К1. Кристаллическую серу промывали дистиллированной водой, высушивали, помещали в колбу на 250-500 мл и заливали 96% этанолом, оставляя при 65°С до полного испарения последнего. К среде серу добавляли в количестве 0,5%. Дрожжевой экстракт и глюкозу стерилизовали отдельно в виде 5-10% растворов при 0,5 атм и вносили в среды до конечной концентрации 0,02-0,05% и 1-3 мМ соответственно.

Культуры бактерий выращивали в авто-, миксо- и гетеротрофных условиях. Для автотрофного выращивания к основной среде добавляли неорганический источник энергии и 10-15 об.% посевного материала. При культивировании бактерий в миксотрофных условиях в минеральную среду вносили Ре2+ или элементную серу, дрожжевой экстракт и/или глюкозу до концентрации 0,02-0,05% и 10 об.% посевного материала Для создания гетеротрофных условий к минеральному фону добавляли указанные органические вещества и 5 об.% посевного материала.

Начальные значения рН в средах, содержащих Ре2+, устанавливали для штамма 41 в интервале 1,6-1,8, для штамма N1 - 1,8-2,0, При использовании в качестве энергетического источника 8° исходное значение рН среды при выращивании этих организмов было равно 2,1-23. В гетеротрофных условиях этот показатель был равен 2,0-2,2. При выращивании термотолерантного штамма начальные значения рН устанавливали в диапазоне 2,5-2,7, независимо от состава среды.

Культуры выращивали в бутыли емкостью 5 л с 4 л среды, интенсивная аэрация которой достигалась продуванием 1 объема воздуха/1 объем среды в 1 мин. При изучении влияния обогащения среды ОСЬ углекислоту подавали в смеси с воздухом из расчета 5-10 об.%. В ряде опытов использовали культуру, выросшую микроаэробно. Для ограничения доступа кислорода бутыль емкостью 5 л с 4 л среды с и глюкозой не аэрировали.

За ростом бактерий следили, определяя количество клеток методом прямого счета в камере Горяева, и по скорости окисления Ре2+доРе3+. О о д е р ж ажЙ «оЛр е д е л я л и комплексонометрическим титрованием (Резников и др., 1970). Содержание глюкозы в среде определяли антроновым или фенольным методом (АИшеП, 1957; Хансон, Филлипс, 1984).

Клетки собирали центрифугированием при 10000 g в течение 40 мин, промывали средой, не содержащей энергетического источника, ресуспендировали в 0,1 М трис-НО1 буфере, рН 7,4. Разрушение клеток проводили на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН при 22 кГц, в течение 5-7 мин с перерывами по 1 мин при охлаждении. Полученный гомогенат центрифугировали 20-30 мин, при 40000 g. Супернатант использовали для определения активности ферментов.

Активности карбоксилирующих ферментов определяли радиоизотопным методом (Романова, 1980; ¡уапоуйку е! а1., 1999). Активность ферментов ЦГК, глиоксилатного шунта, путей углеводного метаболизма определяли спектрофотометрическим методом за исключением изоцитратлиазы и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы, активности которых определяли колориметрически (Захарчук и др., 1994; Каравайко и др., 2000). Активность ферментов серного метаболизма определяли, как описано ранее (Красильникова и др., 1998). Активность ферментов выражали в нмоль/мин»мг белка. Белок измеряли по методу Лоури (Ьо^еМ., 1951).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Рост сульфобацилл в разных условиях.

Для всех изученных в нашей работе штаммов сульфобацилл оптимальными условиями культивирования были миксотрофные, при содержании в среде 0,02% дрожжевого экстракта и закисного железа или 82780. При этом достигалась максимальная концентрация клеток и минимальное время генерации, равное 3-4 часам. В данных условиях выращивания культуры выдерживали неограниченное число пересевов, тогда как в авто и гетеротрофных условиях рост продолжался ограниченное число пассажей (табл. 1, рис. 1). Однако наблюдали различия в способности к использованию органических и неорганических субстратов между штаммами 41 и N1 и термотолерантным штаммом К1 (рис. 2,3). Последний организм полнее использовал органическое вещество, но хуже двух других изученных штаммов рос в хемолитоавтотрофных условиях. Кроме того, три изученных штамма отличались по способности к росту в гетеротрофных условиях. Наименее благоприятны гетеротрофные условия для штамма 41. Культура штамма N1 развивалась

Таблица 1.

Характеристики роста $. thermosulfidooxidans штамм 41, 88{Ьтст штамм N1, и "S.thermosulfidooxidans киЪБр. thermotolerans"штамм К1.

Параметры роста в разных условиях культивирования Шт. 41 IUT.N1 Шт. К1

Время генерации в условиях культивирования (часы). автотрофных 12 8 18

миксотрофных 4 3 3,5

гетеротрофных 11 4 5

При росте в миксотрофных условиях окисленное Ре^ (% от исходной концентрации) 100 100 20

потребленная глюкоза (% от исходной концентрации) 40 40 80

При росте в гетеротрофных условиях потребленная глюкоза (% от исходной концентрации) 10 40 60

Количество пересевов - в автотрофных условиях 1-2 1-2 1-2

в гетеротрофных условиях до 4-х 4-6 6-8

о.

Время, часы

а б в

Рис. 1. Рост сульфобацилл в разных условиях культивирования: а - £ йегтозг^/МоахиАзги штамм 41; б - ЯвгЫ^сш штамм N1, в • "5.Легтоьи1А(1оох1<1ап$ зиЬвръ. ¡кегтоЫегаги" штамм К1. Условия роста: 1 - автотрофные (среда с Ре2+); 2 - гетеротрофные (среда с 0,02% дрожжевого экстракта и 0,02% глюкозы), 3 - миксотрофкые (среда с Ре:+ и с 0,02% дрожжевого экстракта и 0,02% глюкозы).

Рис. 2. Окисление железа в миксотрофных условиях на среде с Ре2+, 0,02% дрожжевого экстракта и 0,02% глюкозы у Блкегтозиу^оох'икш штамм 41, Ыпсш штамм N1, и "5.1Иегто5и1А<ЬохШат 5\А)%р. ¡Иегтою/егат" штамм К1.

Время, часы

Рис. 3. Ассимиляция глюкозы в гетеротрофных условиях на среде с 0,02% дрожжевого экстракта и 0,02% глюкозы у 8.1ИегтохиуЫоохи1ага штамм 41, Яз/Ьтсш штамм N1, и "ЗлИегтовиЩсЬохиНат БиЬэр. (ИегтоЫегаги" штамм К1

за счет использования органического вещества быстрее и выдерживала большее число пересевов, подобно S.acidophilus, который растет в гетротрофных условиях с меньшим временем генерации и образует большую биомассу, чем S.thermosulfidooxidans (Nonis et al., 1996). Штамм К1 обладал наиболее гетеротрофным метаболизмом из трех изученных бактерий, но все же данный организм не способен к стабильному органотрофному росту. Активность карбоксилаз.

В экстрактах клеток всех исследованных культур была обнаружена РБФК/О -ключевой фермент цикла Кальвина. Из всех изученных в данной работе организмов SJhermosulfidoaxidans штамм 41 проявлял самую высокую активность этой карбоксилазы (табл. 2). Её максимальная активность - 44,6 нмоль СОг/мин'мг белка была обнаружена в клетках, выращенных в автотрофных условиях при окислении двухвалентного железа и содержании СО2 в газовой фазе, равном атмосферному. Выращивание штамма 41 в автотрофных условиях в присутствии Fei+ при содержании СО2 в газовой фазе 5-10% (7V) приводило к уменьшению активности фермента в 10 раз до значения 4,4 нмоль СОг/мин'мг белка. В экстрактах клеток Ssibiricus штамм N1 активность РБФК/О при автотрофном росте культуры достигала . значения 12,8 нмоль/мин»мг белка. Уровень активности данной карбоксилазы у "SLthermosulfidooxidans subsp. thermotolerans"штамм К1, был в несколько раз ниже, чем у всех других изученных нами сульфобацилл, и как и в случае штамма 41 значения активности РБФК/О снижались в клетках, выращенных при обогащении газовой фазы СОг. Значения активности РБФК/О у всех изученных ними бактерий снижались при внесении органических веществ в среду культивирования. В экстрактах клеток штамма 41, выращенных в миксотрофных условиях в присутствии и 0,02% дрожжевого экстракта, активность РБФК/О составляла 18 нмоль СОг/мин»мг белка (табл. 2), достигая 40% от максимальных значении, отмеченных у бактерий, выросших без органических субстратов. Однако, при внесении в среду в качестве источника органического углерода 0,02-0,05% глюкозы, в клетках аспорогенной культуры сохранялся высокий уровень активности данной карбоксилазы, равный 31,0 нмоль СОг/мин'мг белка. При росте культур Ssibiricus, штамм N1 и "S.thermosufidoaxidans • subsp. thermototerans", штамм К1 в миксотрофных условиях активность РБФК/О была примерно в 2 раза ниже, чем в автотрофно выросших клетках и достигала уровня 7,0 и 2,1 нмоль/мин*мг белка соответственно. В клетках сульфобацилл S.thermosulfidooxidans, штамм 41 и Ssibincus, штамм N1, выращенных в гетеротрофных условиях, также выявлена низкая активность данной карбоксилазы. Однако в экстрактах клеток термотолерантного штамма К1, выросших в таких условиях, активность РБФК/О не обнаруживалась совсем.

Таблица 2

Активность карбоксилаз у S.thermosulfidooxidans штамм 41, S.sibincus штамм N1, и "S.thermosulfidooxidans subsp. thermotoleram"штамм Kl в разных условиях роста (нмоль/мин на мг белка).

Фермент Автотрофные условия (Fe2+) Миксотрофные условия (Fe2+, 0,02% дрожжевого экстракта) Гетеротрофные (0,02% дрожжевого экстракта)

Шт.41 IIIt.N1 Шт. К1 Шт.41 Шт. N1 Шт. К1 Шт.41 Шт. N1 Шт. К1

Рибулозобисфосфаткарбоксилаза/ оксигеназа (КФ 4.1.1.39) 44,6 12,8 4,3 18,0 7,0 2,1 1,5 4,8 н.о.

Фосфоенолпируваткарбоксилаза (КФ 4.1.1.31) 8,7 1,8 3,5 20,7 0,6 1,5 од 2Д н.о.

Фосфоенолпируват-карбокситрансфосфорилаза (КФ 4.1.1.38) и.о. 0,4 3,1 но. 0,7 0,9 н.о. н.о. н.о.

Фосфоенолпируваткарбоксикиназа (КФ 4.1.1.49) и.о. 4,1 0,6 и.о. н.о. н.о. н.о. и.о. и.о.

Пируваткарбоксилаза (КФ 6.4.1.1) 0,5 0,5 1.4 0,3 9,8 0,5 0,2 1.1 н.о.

Примечание: <ш.о.» - в данной и следующих таблицах означает, что в условиях опыта активность не обнаруживалась

Из полученных данных следует, что, по-видимому, синтез РБФК/О у изученных штаммов умеренно-термофильных ацидофильных бактерий, как и у факультативных автотрофов, зависит от состава среды культивирования, что нехарактерно для облигатных автотрофов. Кроме того, уровень активности данного фермента у сульфобацилл штаммов 41 и N1 соответствует значениям, полученным для таких организмов как Paracoccus versutvs (Smith et al., 1980); Acidiphilium acidophilum APronk et al., 1990), Thlomonas intermedius (London, Rittenberg, 1966), Beggiatoa sp. MS-81-6 (Hagen, Nelson, 1996), которые стабильно растут в автотрофных условиях. Следовательно, отсутствие. данной. способности у SJhermosulfidoaxidans штамм 41 и Ssibiricus штамм N1 невозможно объяснить низкой активностью фермента автотрофной фиксации ССЬ-

В экстрактах клеток всех трех изученных штаммов выявлены активности некоторых карбоксилаз гетеротрофной фиксации ССЬ (табл. 2). У S.thermosulfidooxidans 41 наиболее активна ФЕП-карбоксилаза, максимальный уровень которой проявлялся в клетках, растущих в миксотрофных условиях, и понижался в авто- и гетеротрофных. У штамма N1 сходным образом изменялась активность другого фермента - пируваткарбоксилазы, низкий уровень которой у 41 штамма сохранялся во всех условиях роста. У бактерий культуры К1 активности ферментов гетеротрофной фиксации СО; довольно низкие, максимальны в автотрофных условиях, а в гетеротрофных, в отличие от двух других штаммов не выявлялись. У штаммов N1 и К1 в автотрофных условиях обнаруживались активности ФЕП-карбокситранфосфорилазы, которая сохранялась и в миксотрофных условиях, а также ФЕП-карбоксикиназы. Активность двух данных ферментов у бактерий штамма 41 выявлена только при резком изменении условий культивирования - при использовании в качестве источника • органического вещества глюкозы, но не дрожжевого экстракта, ограничении доступа кислорода или увеличении содержания СО2 в газовой фазе для культур, окисляющих железо в миксотрофных условиях, при замене источника энергии на S0, а также при длительном культивировании в гетеротрофных условиях. Ферменты углеводного метаболизма.

В клетках всех трех штаммов обнаруживались активности ключевых ферментов гликолитического и окислительного пентозомонофосфатного пути. У S.thermosulfidooxidans, штамм 41 и SLthermosulfidoaxtdans subsp. thermotolerans" штамм К1, функционирует также путь Энтнера-Дудорова, как и у типового штамма 1269 (Захарчук и др., 1994), У SMbiricus штамм N1, не обнаружено активностей ключевых ферментов данного пути, как и у S.acidophillus ALV (Wood, Kelly, 1984). Функционирование того или иного пути метаболизма углеводов у изученных бактерий зависит от условий их роста (табл. 3).

В миксотрофных условиях у S.thermosulfidooxidans штамм 41, использование глюкозы происходит по гликолитическому и окислительному пентозофосфатному пути. Функционирование пути Энтнера-Дудорова ограничено из-за низкой активности ключевого

Таблица 3.

Активность ферментов углеводного метаболизма у S. thermosulfidooxidans штамм 41, Ssibtricus штамм N1, и "S.thermosidfidooxidans subsp. thermotolerans" штамм К1 в разных условиях роста (нмоль/мин на мг белка).

Ферменты Автотрофные условия (Ре2*) Миксотрофные условия (Ре2+, 0,02% дрожжевого экстракта, 0,02% глюкозы) Гетеротрофные условия (0,02% дрожжевого экстракта, 0,02% глюкозы)

Шт. 41 mT.Ni Шт. К1 Шт. 41 mT.Nl Шт.К1 Шт. 41 mT.Nl Шт. К1

Гексокиназа (КФ 2.7.1.1) 13,8 20,7 5,0 28,5 42,4 43,5 5,6 26,7 7,2

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49) 13,8 184,7 38,2 та 215,0 143,3 26,8 312,7 87,6

6-Фосфоглюконатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.43) 3,1 6,3 и.о. 4,2 12.1 10,0 и.о. 26,9 и.о.

6-Фосфоглюконатдегидратаза (КФ 4.2.1.12) + 2-кето-З-дезокси-б-фосфоглюконатальдолаза (КФ 4.1.2.14) и но. и.о. 0,9 и.о. 76,1 22,8 но. 23,9

Фруктозобисфосфатальдолаза (КФ 4.1.2.13) 424,0 585,2 30,9 640,0 424,5 705,0 63,2 542,3 20,8

Фосфофрукгокиназа (КФ 2.7.1.11) 1,0 16,2 1.7 4,5 46,5 125,2 5,9 61,5 8,9

Дегидрогеназа З-фосфоглицеринового альдегида (КФ 1.2.1.12) 15,4 238,8 35,8 94,6 316,3 183,3 26,6 423,1 7,3

Пируваткиназа (КФ 2.7.1.40) и.о. 25,6 8,8 10,9 81,8 10,2 5,6 75,1 и.о.

фермента - 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы и данный фермент не обнаруживается при обогащении газовой фазы ССЬ или ограничении доступа кислорода в среду.

При выращивании клеток S.thermosulfidooxidans штамм 41 и Ssibiricus штамм N1, в автотрофных условиях отмечалось снижение уровня активностей почти всех ферментов метаболизма глюкозы по сравнению с культурой, выращенной на среде с Fe2+ и дрожжевым -экстрактом. Однако при этом сохранялась высокая активность фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы, что позволяет предположить участие данного фермента в синтезе органического вещества. В отличие от этих культур в клетках термотолерантного штамма К1 такой закономерности не наблюдалось.

Ферменты пути Энтнера-Дудорова у S.thermosulfidooxidanst штамм 41, и SLthermosulfidooxidans subsp. thermotolerans" штамм К1, максимально активны в гетеротрофных условиях, так же как у типового штамма 1269 (Захарчук и др., 1994) и P.versutus A2 (Smith et al., 1980), и не обнаруживаются или проявляют наименьшие активности при росте клеток на минеральной среде, что свидетельствует о преимущественной роли этого пути в гетеротрофно растущих клетках. У Ssibiricus штамм N1, максимальной активности в гетеротрофных условиях достигает ключевой фермент окислительного пентозофосфатного пути 6-фосфоглюконатдегидрогеназа. Активность данного фермента у других изучаемых штаммов при переносе в гетеротрофные условия не обнаруживается, однако, его низкий уровень выявляется в клетках у S.thermosulfidooxidans штамм 41, растущих в гетеротрофных условиях 4-ый пассаж.

Хотя штамм К1 более полно использует органический субстрат (табл. 1) и выдерживает большее число пересевов в гетеротрофных условиях, активность ферментов пути Энтнера-Дудорова и гликолитического пути. достигали максимального уровня в миксотрофных условиях, а активность ключевого фермента окислительного пентозофосфатного пути, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, обнаруживалась только в клетках, культивировавшихся на среде с Fe + и 0,02% дрожжевого экстракта (табл. 3). Кроме того, у штамма К1 в автотрофных. условиях активности. ферментов пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса также низкие, в том числе и значения активности фруктозобисфосфатальдолазы. Ферменты ЦТК и глиоксилатного шунта.

Полученные нами, а также литературные данные свидетельствуют о том, что у S.thermosulfidooxidans 41 и SLsibiricus N1 как и у S.thermosulfidooxidans 1269 (Захарчук и др., 1994), и облигатных автотрофов, цикл трикарбоновых кислот разомкнут из-за отсутствия 2-оксоглутаратдегидрогеназы (табл. 4). Независимо от условий культивирования у данных сульфобацилл функционируют его отдельные реакции. Кроме того, уровни активностей

Л ' ~

Таблица 4.

Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного шунта у S.thermosulfidooxidans штамм 41, SLsibincus штамм N1, и "S.thermosulfidooxidans адЬБр. thermotolerans" штамм К1 в разных условиях роста (нмоль/мин на мг белка).

Фермент Автотрофные условия Миксотрофные условия (Ре2+, 0,02% дрожжевого экстракта, 0,02% глюкозы) Гетеротрофные условия (0,02% дрожжевого экстракта, 0,02% глюкозы)

Шт. 41 I1IT.N1 Шт.К1 Шт. 41 Шт. N1 Шт.К1 Шт. 41 Шт. N1 Шт. К1

Цитратсинтаза(КФ 4.1.3.7) 13,6 14,4 24,2 19,8 13,6 41,7 8,7 3,8 5,1

Аконитатгидратаза (КФ 4.2.1.3) 146,8 но. 352,4 18,8 26,6 405,2 17,6 но. 153,2

Изоцитратдегидрогеназа (КФ 1.1.1.42) 24,4 42,8 114,6 17,6 197,3 215,7 2,2 77,4 122,0

2-Оксоглутаратдегидрогеназа (КФ 1.2.4.2) н.о. н.о. 29,2 н.о. н.о. 29,5 Н 0. н.о. 8,5

Сукцинатдегидрогеназа (КФ 1.3.99.1) 46,7 91,4 91,9 56,1 38,9 84,4 64,0 55,3 90,6

Фумаратгидратаза (КФ 4.2.1.2) 30,0 76,5 320,3 58,2 66,8 132,3 105,1 22,8 160,3

Малатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.37) 28,9 300,3 250,7 50,0 490,1 166,8 71,0 653,8 151,4

Изоцитратлиаза (КФ 4.1.3.1) н.о. н.о. но. и.о. н.о. но. н.о. н о. н.о.

Малатсинтаза (КФ 4.1.3.2) 6,4 23,1 24,2 5,2 10,5 15,9 9,6 13,5 10,9

ферментов невысокие в сравнении с активностями аналогичных ферментов у облигатных гетеротрофов, что позволяет предположить использование реакций цикла в биосинтетических процессах. В отличие от перечисленных штаммов у S.thermosulfidoaxidans subsp. thermotokrans" штамм К1, 2-оксоглутаратдегидрогеназа выявлена во всех условиях роста культуры, следовательно, полное окисление органических соединений происходит у этого организма в ЦТК. Это, вероятно, является одной из причин гораздо более эффективного использования данной бактерией органического вещества по сравнению с типичными сульфобациллами. Кроме того, в гетеротрофных условиях у-штамма К1, по сравнению с другими изученными штаммами, отмечен максимальный уровень активности большинства ферментов ЦТК.

В клетках всех исследованных культур отсутствовала активность одного из ключевых ферментов глиоксилатного шунта - изоцитратлиазы. Следовательно, глиоксилатный шунт, независимо от состава ростовой среды, не может функционировать, хотя активность второго фермента этого пути, малатсинтазы, проявлялась у всех изучаемых штаммов независимо от условий культивирования.

Таким образом, экстракты клеток изученных культур содержат ключевые ферменты путей метаболизма глюкозы Кроме того, значения активностей ряда ферментов определены на уровне, сходном как с факультативно автотрофными бактериями, способными к длительному росту в гетеротрофных условиях (London, Rittenberg, 1966, Fnedrich et aL, 1981, Smith et al, 1980), так и с некоторыми гетеротрофными организмами (Paavilaainen, 199S). Однако, даже "S.thermosufidoaxidans subsp. thermotolerans" штамм К1, для которого существует возможность полного окисления органических веществ не способен стабильно расти в отсутствие минерального источника энергии Можно предположить, что ограниченное использование органического вещества S.thermosulfidooxidans 41 и Ssibincus N1 связано с отсутствием.транспортных систем, как показано для облигатных автотрофов, или такой процесс требует затрат энергии и зависит от окисления Fe2, как показано для S.acidophillus ALV (Wood, Kelly, 1984).

Рост на средах с S°, активность карбоксилаз и ферментов, участвующих в метаболизме неорганических соединений серы у S.thermosidfldocaddans subsp. asporogenes 41.

Элементная сера как энергетический субстрат при последовательных пересевах обеспечивает менее полноценный рост S.thermosulfidooxidans 41 в автотрофных и в миксотрофных условиях, чем закисное железо, что было отмечено ранее для S.acidophillus ALV и S.thermosulfidooxidans 1269 (Головачева, Каравайко, 1978; Karavaiko et al, 1989, Norris et a], 1996; Красильникова и др, 1998). Уже во втором пассаже на среде с элементной серой и 0,02% дрожжевого экстракта рост начинался только после 15-18 часов лаг-фазы и максимальная концентрация клеток снижалась в два раза по сравнению с первым пассажем. В

культурах, окисляющих серу в автотрофных условиях, концентрация клеток не поднималась выше значений 106 кл/мл.

Таблица 5.

Активность карбоксилаз в экстрактах клеток S.thermosufidoaxidans subsp asporogenes

штамм 41 в разных условиях роста на средах с 8° (нмоль/мин«мг белка).

Ферменты Автотрофные условия Миксотрофные условия

1-ый пересев со среды с Ге2* н 0,02% дрожжевого экстракта 1-ый пересев со среды с Б0 и 0,02'/. дрожжевого экстракта 0,02% дрожжевого экстракта, 2-ой пересев со среды с 8° и 0,02% дрожжевого экстракта 0,02% глюкозы, 1-ый пересев со среды с Б0 и 0,02% дрожжевого экстракта

Рибулозо-бисфосфат-карбоксилаза/ оксигеназа 44,0 5,0 34,0 5,4

Фосфоенол- пируват- карбоксилаза 2,3 1,6 и.о. 5,6

Фосфоенол-пируват-карбокси-трансфосфорилаза 7а 0,5 2,0 4,2

Фосфоенол- пируват- карбоксикиназа 4,6 0,8 2,0 И.О.

Пируват-карбоксилаза и 23 2,3 0,1

В экстрактах клеток S.thermosulJidooxidans 41, растущих первый пассаж на среде с серой в автотрофных условиях сохранялся максимальный уровень активности РБФК/О, однако уже во втором пассаже активность данной карбоксилазы уменьшалась на порядок. При росте штамма 41 в миксотрофных условиях на среде с 8° и дрожжевым экстрактом, в отличие от клеток, окислявших Бе2+, сохранялся высокий уровень активности РБФК/О, сравнимый с максимальным - 34,0 нмоль СО/мин»мг белка. Однако, при росте бактерии в миксотрофных условиях на среде с элементной серой и 0,02% глюкозы при использовании в качестве посевного материала культуры, выросшей на среде с элементной серой и 0,02% дрожжевого экстракта, активность РБФК/О падала до значения 5,0 нмоль СОг/мин'мг белка.

При культивировании штамма 41 на средах с 80 изменялось соотношение активностей ферментов гетеротрофной фиксации СОг. Так, по сравнению с клетками, окислявшими Бе2+, активность ФЕП-карбоксилазы заметно ниже, а в миксотрофных условиях на среде с 80 и 0,02% дрожжевого экстракта данный фермент не проявляется. Однако, в экстрактах клеток, окислявших серу в авто- и миксотрофных условиях обнаруживаются активности ФЕП-карбокситранфосфорилазы и ФЕП-карбоксикиназы

Клетки S.thermosulfidooxidans БиЬзр. asporogenes штамм 41 содержат ряд ферментов, участвующих в окислении неорганических соединений серы (табл. 6).

Таблица 6.

Активность ферментов, участвующих в метаболизме неорганических соединений серы у S.thermosulfidooxidans subsp. asporogenes штамм 41 (нмоль/мин»мг белка)

Ферменты Условия роста культуры

Миксотрофные с Рег+ и БгОз2" Миксотрофные с Б"

Тиосульфатокисляющий фермент (КФ 1.8.2.2) 85,6 50,3

Сульфитоксидаза(КФ 1.8.2.1) 166,0 154,0

АФС-редутза (КФ 1.8.99.2) 15,9 11,1

Роданаза (КФ 2.8.1.1) П.2 4,0

Серадиоксигеназа (КФ 1.13.11.18) 10,5 12,2

Активность серадиоксигеназы была выявлена в клетках штамма 41 при их росте в миксотрофных условиях на среде с дрожжевым экстрактом и элементной серой или закисным железом и тиосульфатом. Бесклеточные экстракты данной сульфобациллы содержали сульфитоксидазу, высокая активность которой не зависела от внесения в среду культивирования элементной серы или тиосульфата. Активность АФС-редуктазы также показана в клетках SJhermosulfidooxidans subsp. asporogenes штамм 41. У культуры, выросшей в присутствии элементной серы активность данного фермента увеличивалась в 1,5 раза по сравнению с активностью в клетках, окисляющих Бе2+. В бесклеточных экстрактах SJhermosulfidooxidans, штамм 41, не удалось обнаружить сульфит: Ре3+оксидоредукгазу и сера.Ре3+оксидоредуктазу независимо от состава среды и условий аэрации культуры. Наличие данных ферментов было показано для AcidithioЪacillus thooxidans и At.ferrooxidans ^идо е1 а1., 1987), а также для S.siЪincus (Красильникова и др, 2004).

У S.thermosulfidooxidans, штамм 41, метаболизм тиосульфата может осуществляться с помощью тиосульфатокисляющего фермента и роданазы. Наличие тиосульфата в среде вызывает увеличение активности этих ферментов. У бактерий, окисляющих серу, активность роданазы более чем в 2 раза ниже, чем в клетках, растущих на среде с закисным железом и тиосульфатом. Значение активности тиосульфатокисляющего фермента сохраняется в клетках, окисляющих серу почти на таком же уровне, что и у культуры, растущей на среде с Бе2+ и тиосульфатом. Тиосульфатредуктазу (КФ 2.8.1.3) в бесклеточных экстрактах выявить не удалось. Экстракты клеток штамма 41 разлагали тетратионат с образованием тиосульфата, серы и, возможно, сульфата.

Наличие в клетках тиосульфатокисляющего фермента и способность к гидролизу тетратионата клетками S.thermosulfidooxidans штамм 41, указывает на то, что окисление

серных соединений происходит сходным образом с автотрофными тиобациллами, у которых тетратионат образуется в качестве промежуточного продукта и потребляется как субстрат (Kelly et al., 1997). Наличие АФС-редуктазы делает возможным получение АТФ на субстратном уровне в реакции, катализируемой АТФ-сульфурилазой или АДФ-сульфурилазой (Kappler, DaM, 2001).

На основании полученных данных можно представить схему серного метаболизма у S.thermosulfidooxidans штамм 41 (рис. 3).

АФС

Рис. 3. Схема метаболизма соединений серы у S.thermosulfidoaxidans штамм 41.

/ — тиосульфатокисляющий фермент, 4 - серадиоксигеназа

2 — роданаза; 5 - сульфитоксидаза

3 — тетратионатгидролаза; б - АФС-редуктаза

Изменение таксономического статуса "SLthermosutfldoaxidans subsp. ШегтоШегат штамм Ю.

Описанный в 1983 г. как «Sulfobacillus thermosulfidooxidans йи1вр. thermotolerans", штамм К1 (Коваленко, Малахова 1983) был отнесен к роду SulfobaciИus, для которого на тот момент не было определено филогенетическое положение в соответствии с последовательностью 168 рРНК. При характеристике термотолерантного подвида «S.thermosufidoaxidans БиЬБр. thermotolerans" штамм К1, его сравнивали с единственным известным представителем рода S.thermosulfidooxidans 1269. Как и бактерии типового штамма, новый организм являлся грамположительной спорообразующей бактерией, способной к окислению сульфидных минералов, 8° и Бе2+. По мере накопления данных по биохимии, цитологии, физиологии и хемотаксономии стало очевидным, что статус подвида термотолерантного организма не соответствует действительности.

Штамм К1 отличается от других изученных бактерий рода SulfobaciИus более стабильным ростом в гетеротрофных условиях (табл. 1), более полным использованием органического вещества, вероятно, за счет функционирования замкнутого ЦГК (табл. 4). С другой стороны, он в меньшей степени окисляет минеральные субстраты, чем штаммы 41 и N1. Организм существенно отличается от вида S.thermosufidooxidans следующими

характеристиками: большими размерами клеток, овальными спорами, имеющими покровы сложного строения (Богданова и др., 1990), особенностями строения цитоплазматической мембраны (Сузина и др., личн. сообщ.), температурным оптимумом роста, более широким спектром используемых органических субстратов (Коваленко, Малахова, 1983), наличием замкнутого ЦГК, присутствием в мембране со-алициклических жирных кислот во всех условиях роста (Цаплина и др., 1994), отсутствием внутривидовой гомологии ДНК. Сравнительный анализ числа и размера рестриктных фрагментов хромосомной ДНК штаммов К1 и 1269Т, проведенный методом пульс-электрофореза (Кондратьева и др., 1998), а также низкий уровень сходства 168 рРНК этих бактерий, равный 87,7% (Каравайко и др., 2000) свидетельствуют об отсутствии внутривидового сходства этих культур.

С другой стороны, высокий уровень сходства последовательностей нуклеотидов гена 168 рРНК изучаемого штамма К1 и неидентифицированных штаммов, предварительно отнесенных к роду Лlicyclobacillus, равный 97,4-99,6%, говорит о том, что это бактерии одного вида (рис. 4).

0j05

- Ahcyclobacittus sp. CLG, AY371274

- Bacterium GSM, AY007662 AhcvclobaaUus sp. AGC-2. AF450135

- Ahcyclobacittus so. 5C. AY371273 Ahcyclobacittus tolerant k1t. dsm162971. af137502

--Ahcyclobacittus cycloheptamcus DSM 4006T, AB042059

Sul lb bacillus di sulfidooxidans DSM12064T, — Ah cyclobaattus pomontm DSM 14955T, AB089840 r— AUcyclobacillus hesptridum DSM 12489T. AJ133633 — Ahcyclobacittus addotamstns DSM 3924T. AB059676 ' Ahcyclobacittus acidipfolusDSM. 14558T, AB076660 MI— "Ahcyclobacittus vulcams" CsHg2. AY425985

If" Ahcyclobacittus acidocaldarius subsp. acidocaldarius DSM 446T, AJ496806 1— Ahcyclobacittus stndawnsis ATCC BAA-«09T. AB034128 * Ahcyclobacittus acidocaldarius subsp. rittmamii DSM 11297T, AB089859

-Ahcvclobacittus herbanus DSM 13609T. AB042055

SuObbacillus thermosulfidooxidans DSM 9293T. AB089844 -Sulfobacittus acidophilus DSM 10332T. AB089842

Рис. 4. Филогенетическое дерево, основанное на анализе последовательностей генов 168 рРНК, представителей родов Sulfobacillus и Лlicyclobacillus. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов.

На основании всех изложенных данных штамм К1 переклассифицирован и отнесен к роду Лlicyclobacillus как новый вид рода -ЛШЛоктт Бр.поу.

ВЫВОДЫ:

1. Ацидофильные умеренно термофильные бактерии S.thermosulfidooxidam штамм 41, Ssibiricus штамм N1, и "SJhermosulfidooxidans БиЬзр. thermotolerans" штамм К1 способны к стабильному росту только в миксотрофных условиях на среде с минеральными субстратами и 0,02% дрожжевого экстракта

2. Изученные бактерии отличаются по способности использовать органическое вещество; штамм К1 способен полнее использовать органическое вещество и расти большее число пересевов в гетеротрофных условиях по сравнению со штаммами сульфобацилл 41 и N1.

3. Наличие РБФК/О свидетельствует об участии цикла Кальвина в ассимиляции СО2 у изученных штаммов. Наиболее высокий уровень этого фермента отмечен у S.thermosulfidooxidans штамм 41.

4. Метаболизм глюкозы у штаммов 41 и К1 осуществляется при участии гликолитического, окислительного пентозофосфатного путей и пути Энтнера-Дудорова, у бактерий штамма N1 по гликолитическому и пентозофосфатному пути.

5. У сульфобацилл штаммов 41 и N1 ЦГК не замкнут из-за отсутствия 2-оксоглутаратдегидрогеназы и функционируют лишь отдельные реакции цикла. У штамма К1 функционирует полный цикл трикарбоновых кислот.

6. На основании наличия и активности ряда ферментов, участвующих в окислении неорганических соединений серы можно предположить, что окисление серных соединений у сульфобацилл штамма 41 происходит сходно с этим процессом у автотрофных тиобацилл.

7. Проведенные нами исследования позволили изменить таксономический статус штамма К1 и описать данный, организм как AUcyclobacillus ^кшт Бр.поу. - алициклобациллу с миксотрофным типом питания характерным для сульфобацилл - промежуточное звено между родом Sulfobacillus и родом A Ucyclobacillus семейства Alicyclobacillaceae.

8. На основании анализа ростовых характеристик и активностей ферментов углеродного обмена была показана значительная лабильность метаболизма, позволяющая изученным бактериям кратковременно переключаться с оптимального миксотрофного на литоавтотрофный или органогетеротрофный тип питания в соответствующих условиях культивирования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Егорова М.А., Захарчук Л.М Активность карбоксилаз у Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes штамм 41 // В сб. трудов научи, конф. «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов» Москва. 1999. М: Диалог-МГУ. 2000. С. 58.

2. Цаплина И.А., Богданова Т.И., Егорова М.А., Красильникова Е.Н. Влияние условий роста на активность ферментов цикла трикарбоновых кислот у сульфобацилл // В сб. трудов научн. конф.: "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов". Москва. 1999. М.: Диалог-МГУ. 2000. С. 105.

3. Цаплина И.А., Красильникова E.IL, Захарчук JLM., Егорова МА., БогдановаТ.И., Каравайко Г.И. Метаболизм углерода у Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes штамм 41 // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 334-340.

4. Егорова М_А Ферменты углеродного метаболизма у Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes штамм 41 // В сб. трудов научн. конф. «Горизонты физико-химической биологии». Пущино.: ОНТИ НЦБИ. 2000. С. 196-197.

5. Красильникова Е.Н., Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Егорова МА. Углеродный метаболизм сульфобацилл в разных условиях роста. // В сб. "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" Воронеж.: ВГУ. 2000. С.71-77.

6. Цаплина И.А., Красильникова Е.Н., Захарчук Л..М., Богданова Т.Н. Егорова М.А. Метаболизм углерода у трех штаммов бактерий рода Sulfobacillus II В сб. трудов научн. конф: «Автотрофные микроорганизмы». Москва. 2000. М.: Диалог- МГУ. 2000. С. 81-82.

7. Красильникова Е.Н., Цаплина ИА., Захарчук Л.М., Богданова Т.Н. Егорова МА. Метаболизм серы у природного аспорогенного штамма сульфобацилл // В сб. трудов научн. конф: «Автотрофные микроорганизмы». Москва. 2000. М: Диалог-МГУ. 2000. С. 110.

8. Krasilnikova E.N., Tsaplina I.A., Bogdanova T.I., Zakharchuk L.M. Egorova M.A, Carbon metabolism of bacteria of Sulfobacillus genus. // In: Proceedings book ofThe World Congress on Biotechnology "BI0TECHN0L0GY-2000". Berlin September 3-8. Berlin. 2000-. P. 34.

9. Захарчук Л.М, Цаплина НА., Красильникова Е.Н., БогдановаТИ., Егорова МА. Изменение физиолого-биохимических свойств бактерии рода Sulfobacillus под воздействием внешних факторов // В сб. "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" Воронеж.: ВГУ. 2001. С.50-55.

10. Каравайко Г.И., Захарчук Л.М., Богданова Т.И., Егорова М.А., Цаплина ИА, Красильникова Е.Н. Ферменты метаболизма углерода у термотолерантной сульфобациллы, штамм К1 // Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С. 755-761.

11. Красильникова Е.Н., Егорова М.А., Меламуд B.C. Конструктивный метаболизм нового вида бактерий Sulfobacillus "sibiricus"ИВ сб. трудов научн. конф.: "Оценка современного состояния микробиологических исследований в восточно-сибирском регионе". Иркутск. ИГУ. 2002. С.61-63.

12. Захарчук Л.М, Егорова М.А., Цаплша И.А., Богданова Т.И., Красильникова Е.Н., Меламуд B.C., Каравайко Г.И. Активность ферментов углеродного обмена у Sulfobacillus sibiricus в различных условиях культивирования // Микробиология. 2003. Т. 72. № 5. С. 621-626.

13. Egorova M.A., Krasilnikova E.N., Tsaplina I.A, Zakharchuk L.M. Phisiologjcal and biochemical features of growth of Sulfobacillus thermosulfidooxidans 41 under microaerobic conditions // In: Abstract book of 1st FEMS Congress of european microbiologists. Slovenia. Ljubljana. 2003. P. 326.

14. Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Красильникова Е.Н., Егорова М.А., Богданова Т.И. Биотехнологический потенциал хемолитотрофной бактерии Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes, штамм 41 // В сб. трудов научн. конф.: «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004).

15. Егорова М.А., Цаплина И.А., Захарчук Л.М., Богданова Т.И., Красильникова Е.Н. Влияние условий культивирования на рост, активность ферментов метаболизма серы и карбоксилаз у Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes, штамм 41 // Прикл. Биохим. Микробиол. в печати.

Р-90 88

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 159 тираж 100 экз. Подписано в печать 07.05.2004 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Егорова, Мария Анатольевна

Список сокращении.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Особенности местообитания и видовой состав группы умеренно-термофильных ацидофилов.

ГЛАВА 2. Характеристика бактерий рода Sulfobacillus.

2.1 Видовое разнообразие представителей рода Sulfobacillus.

2.2 Филогенетическое положение рода Sulfobacillus.

2.3 Морфологическая характеристика сульфобацилл.

2.4. Образование эндоспор.

2.5 Физиологические свойства.

2.6 Метаболизм.

2.6.1. Приспособление к низким значениям рН среды.

2.6.2. Окисление/восстановление железа.

2.6.3.Метаболизм углерода.

2.6.3.1. Пути автотрофной фиксации СОг.

2.6.3.2 Миксотрофия и ее распространение.

2.6.3.3. Метаболизм глюкозы.

2.6.3.4. Цикл трикарбоновых кислот и анаплеротические реакции.

2.6.4. Окисление серы.

ГЛАВА 3. Нахождение в природе и практическое применение сульфобацилл.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования.

4.1. Объекты исследования и условия их культивирования.

4.2. Методы анализов.

4.2.1. Определение железа.

4.2.2. Определение глюкозы.

4.2.3. Летучие жирные кислоты и этанол.

4.3. Ассимиляция клетками штамма К1 меченной углекислоты.

4.4. Определение активности ферментов.

4.4.1. Определение карбоксилирующих ферментов.

4.4.2. Определение активности ферментов цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта.

4.4.3. Определение активности ферментов углеводного метаболизма.

4.4.4. Ферменты серного метаболизма.

4.4.5. Определение белка.

4.4.6. Математическая обработка результатов.

ГЛАВА 5. Результаты.

5.1. Рост сульфобацилл в разных условиях.

5.1.1.5. thermosulfidooxidans, штамм 41.

5.1.2. S.s/6/r/cus N1T.

5.1.3. "S.thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans "штамм К1.

5.2. Морфология сульфобацилл.

5.3. Фиксация 14С-бикарбоната суспензиями клеток "S.thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans " штамм К1.

5.4. Активность ферментов углеродного метаболизма.

5.4.1. S.thermosulfidooxidans штамм 41.

5.4.2. S.sibiricus штамм N1T.

5.4.3. "S.thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans "штамм К1.

5.5. Активность ферментов, участвующих в метаболизме серы у S.thermosulfidooxidans subsp. asporogenes 41.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Углеродный метаболизм бактерий рода Sulfobacillus"

Сульфобациллы представляют собой уникальную малоизученную группу умеренно-термофильных спорообразующих ацидофильных бактерий, широко распространеных в зонах спонтанного разогрева руд. Они используют в качестве источников энергии Fe2+, S2VS°, сульфидные минералы и органические вещества, которые наряду с углекислотой также ассимилируются как источник углерода. При исследовании этой группы бактерий основное внимание уделялось роли сульфобацилл в переработке сложных руд и концентратов, систематическому положению и распространению в различных биотопах. В то же время отмечалось, что штаммы грамположительных умеренно-термофильных бактерий, выделенных в лаборатории хемолитотрофных организмов ИнМи РАН, различаются по морфологическим свойствам, способности окислять неорганические субстраты и некоторым другим характеристикам. Однако особенности углеродного и серного метаболизма сульфобацилл, позволяющие оценить их вклад в процессы окисления Fe2+, S2VS°, сульфидных минералов в естественных и техногенных местообитаниях, практически не изучены.

Микроорганизмы, получающие энергию при окислении восстановленных соединений серы, выделены и описаны еще в конце XIX века. Отправной точкой для их изучения явились исследования С.Н.Виноградским бактерий из рода Beggiatoa, окисляющих сероводород с накоплением в клетках серы. Первый микроорганизм, окисляющий закисное железо, был выделен и описан позднее, в 1947 г (Colmer, Hinkle). Первоначально хемолитотрофия обязательно связывалась с автотрофией, и термин Виноградского "аноргоксидация" подразумевал не только жесткую связь получения энергии при окислении неорганических веществ и синтеза материала клетки исключительно из диоксида углерода, но и токсичность органических соединений. Однако было обнаружено, что метаболическая гибкость является основой успешного роста и выживания у довольно большого числа организмов.

В физиологической группе экстремально ацидофильных умеренно термофильных железо-/сероокислителей представители рода Sulfobacillus на момент описания (Головачева, Каравайко, 1978) были единственными грамположительными спорообразующими представителями. Другой характерной чертой этих бактерий явилось то, что в отличие от микробов с однозначно определяемым типом питания, они способны расти как автотрофы, за счет фиксации углекислоты, так и как гетеротрофы, используя органические вещества как источники углерода и энергии. Однако в обоих случаях рост бактерий продолжается ограниченное число пересевов. Стабильное развитие культур сульфобацилл возможно только в миксотрофных условиях, когда в качестве источника энергии используется элементная сера, восстановленные соединения серы, закисное железо, сульфидные минералы, а источником углерода служат некоторые органические соединения и углекислота. В связи с этим, для выяснения возможных причин отсутствия стабильного роста данных организмов в авто- и гетеротрофных условиях представляло интерес изучение у представителей рода Sulfobacillus как ферментных систем, отвечающих за рост в автотрофных условиях, так и путей использования органического вещества.

Целью настоящей работы было изучение в различных условиях культивирования особенностей роста и ферментов углеродного и серного метаболизма бактерий рода Sulfobacillus, отличающихся по ряду признаков от ранее изученных представителей сульфобацилл.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Изучить особенности роста S.thermosulfidooxidans subsp.asporogenes штамм 41, S.sibiricus штамм N1 и "S.thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans" штамм К1 в различных условиях культивирования.

2. Провести определение в бесклеточных экстрактах культур штаммов 41, N1 и К1 активностей различных ферментов, участвующих в метаболизме углерода: карбоксилаз, ферментов цикла трикарбоновых кислот и ферментов метаболизма углеводов.

3. Выявить закономерности изменения активностей ферментов в зависимости от состава среды культивирования у трех изученных штаммов.

4. Выяснить особенности метаболизма соединений серы в клетках штамма 41.

5. На основе молекулярно-биологических данных и изучения особенностей роста и активности ферментов углеродного метаболизма уточнить систематическое положение "S.thermosulfidooxidans, subsp. thermotolerans" штамм Kl.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Егорова, Мария Анатольевна

ВЫВОДЫ:

1. Ацидофильные умеренно термофильные бактерии SJhermosulfidooxidans штамм 41, S.sibiricus штамм N1, и "SJhermosulfidooxidans subsp. thermotolerans" штамм К1 способны к стабильному росту только в миксотрофных условиях на среде с минеральными субстратами и 0,02% дрожжевого экстракта

2. Изученные бактерии отличаются по способности использовать органические субстраты; штамм К1 способен полнее использовать органическое вещество и расти большее число пересевов в гетеротрофных условиях по сравнению со штаммами сульфобацилл 41 и N1.

3. Наличие РБФК/О свидетельствует об участии цикла Кальвина в ассимиляции СОг У изученных штаммов. Наиболее высокий уровень этого фермента отмечен у SJhermosulfidooxidans штамм 41.

4. Метаболизм глюкозы у штаммов 41 и К1 осуществляется при участии гликолитического, окислительного пентозофосфатного путей и пути Энтнера-Дудорова, у бактерий штамма N1 по гликолитическому и пентозофосфатному пути.

5. У сульфобацилл штаммов 41 и N1 ЦТК не замкнут из-за отсутствия 2-оксоглутаратдегидрогеназы и функционируют лишь отдельные реакции цикла. У штамма К1 функционирует полный цикл трикарбоновых кислот.

6. На основании анализа ростовых характеристик и активностей ферментов углеродного обмена была показана значительная лабильность метаболизма, позволяющая изученным бактериям кратковременно переключаться с оптимального миксотрофного на литоавтотрофный или органогетеротрофный тип питания в соответствующих условиях культивирования.

7. На основании наличия и активности ряда ферментов, участвующих в окислении неорганических соединений серы можно предположить, что окисление серных соединений у сульфобацилл штамма 41 происходит сходно с этим процессом у автотрофных тиобацилл.

8. Проведенные исследования позволили изменить таксономический статус штамма К1 и описать данный организм как Alicyclobacillus tolerans sp.nov. -алициклобациллу с миксотрофным типом питания характерным для сульфобацилл - промежуточное звено между родом Sulfobacillus и родом Alicyclobacillus семейства Alicyclobacillaceae.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Егорова, Мария Анатольевна, Москва

1. Балашова В.В., Дубинина Г.А. Микроорганизмы, окисляющие железо и марганец. // В: «Хемосинтез» / под ред. Иванова М.В., М.: Наука. 1989. С. 101-122.

2. Богданова Т.И., Цаплина И.А., Саякин Д.Д., Каравайко Г.И., Коваленко Э.В. Морфология и цитология бактерий Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans. И Микробиология. 1990. Т.59. № 5. С.844-855.

3. Богданова Т.И., Мулюкин А.Л., Цаплина И.А., Эль-Регистан Г.И., Каравайко Г.И. Влияние состава среды и условий культивирования на спорообразование хемолитотрофных бактерий. //Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 187-193.

4. Вартанян Н.С., Пивоварова Т.А., Цаплина И.А., Лысенко A.M.Каравайко Г.И. Новая термоацидофильная бактерия, относящаяся к роду Sulfobacillus. II Микробиология. 1988. Т. 57. № 2. С. 268-274.

5. Вартанян Н.С. Изучение новой факультативно термофильной бактерии рода Sulfobacillus. II Автореферат Дис. канд. биол. наук. Абовян. 1989. 21 С.

6. Вартанян Н.С., Каравайко Г.И., Пивоварова Т.А. Влияние органических веществ на рост и окисление неорганических субстратов Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes.il Микробиология. 1990. Т. 59. № 3. С. 411-417.

7. Головачева Р.С., Каравайко Г.И. Sulfobacillus новый род термофильных спорообразующих бактерий. // Микробиология. 1978. Т. 47. № 5. С. 815-821.

8. Головачева Р.С. Прикрепление клеток Sulfobacillus thermosulfidooxidans к поверхности сульфидных минералов. // Микробиология. 1979 а. Т. 48. № 5. С. 528533.

9. Головачева Р.С. Ультраструктурная организация клеток и спор Sulfobacillus thermosulfidooxidans. //Микробиология. 1979 б. Т. 48. № 5. С. 681-688.

10. Головачева Р.С. Морфогенетические свойства Sulfobacillus thermosulfidooxidans. И Микробиология. 1979 в. Т. 48. № 5. с. 863-867.155

11. Головачева Р.С. Аэробные термофильные хемолитотрофные бактерии, участвующие в круговороте серы. // Успехи микробиологии. 1984. Т. 19. С. 166-202.

12. Готгшалк Г. Метаболизм бактерий. М.: Мир. 1982. 310 С.

13. Дубинина Г.А. Бесцветные серобактерии. // В: «Хемосинтез» / под ред. Иванова М.В., М.: Наука. 1989. С. 76-100.

14. Заварзин Г.А. Литотрофные микроорганизмы М.: Наука. 1972. 324 С.

15. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука. 2003. 348 С.

16. Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Красильникова Е.Н., Богданова Т.И., Каравайко Г.И. Метаболизм углерода у Sulfobacillus thermosulfidooxidans II Микробиология. 1994. Т. 63. Вып.4. С. 573-580.

17. Ивановский Р.Н. Биоэнергетика и транспорт субстратов у бактерий. М.: МАКС Пресс. 2001. 48 С.

18. Каравайко Г.И. Микроорганизмы и их роль в биотехнологии металлов. // В: «Биогеотехнология металлов. Практическое руководство» под ред. Каравайко Г.И., Росси Дж., Агате А. Грудев С., Авакян З.А. М.: Центр международных проектов ГКНТ. 1989. С. 11-28.

19. Каравайко Г.И., Турова Т.П., Цаплина И.А., Богданова Т.И. исследование филогенетического положения аэробных умеренно термофильных бактерий рода Sulfobacillus, окисляющих Fe2+, S° и сульфидные минералы. // Микробиология. 2000. Т. 69. № 6. С. 857-860.

20. Каравайко Г.И., Красильникова Е.Н., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Захарчук Л.М. Рост и углеводный метаболизм сульфобацилл. // Микробиология. 2001. Т. 70. № 3. С. 293-299.

21. Каравайко Г.И., Пивоварова Т.А., Кондратьева Т.Ф. Хемолитотрофные бактерии и их роль в биогидрометаллургии. // В: Сборник тезисов. 1-ый международный конгресс «Биотехнология-состояние и перспективы развития». Москва. 2002. С. 458.

22. Каравайко Г.И. Биотехнология металлов. В: «Экология микроорганизмов» под ред. Нетрусова А.И. М.: Академия. 2004. С. 199-220.

23. Коваленко Э.В., Малахова П.Т. Спорообразующая железоокисляющая бактерия Sulfobacillus thermosulfidooxidans. И Микробиология. 1983. Т. 52. № 6. С. 962-966.

24. Кондратьева Е.Н. Хемолитотрофы и метилотрофы. М.: Издательство МГУ. 1983. 176С.

25. Кондратьева Е.Н. Автотрофные прокариоты. М.: Издательство МГУ. 1996. 312 С.

26. Красильникова Е.Н., Богданова Т.И., Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Каравайко Г.И. О метаболизме восстановленных соединений серы у Sulfobacillus thermosulfidooxidans, штамм 1269//Микробиология. 1998. Т.67. №2. С. 156-164.

27. Красильникова Е.Н., Цаплина И.А., Захарчук Л.М., Богданова Т.П. Влияние экзогенных факторов на активность ферментов метаболизма углерода у термоацидофильных бактерий рода Sulfobacillus. И Прикл. биохим. микробиол. 2001. Т. 37. №4. С. 418-423.

28. Красильникова Е.Н., Богданова Т.И., Захарчук Л.М., Цаплина И.А. Ферменты метаболизма серы у термоацидофильной бактерии Sulfobacillus sibiricus. II Прикл. биохим. микробиол. 2004. Т. 40. № 1. С. 62-64.157

29. Лысенко A.M., Цаллина И.А., Головачева Р.С., Пивоварова Т.А., Вартанян Н.С., Каравайко Г.И. Таксономическое положение рода Sulfobacillus, основанное на изучении ДНК. // Доклады АН СССР. 1987. Т. 294. № 4. С. 970-972.

30. Меламуд B.C., Пивоварова Т.А. Особенности роста типового штамма бактерий вида Sulfobacillus thermosulfidooxidans на среде 9К. // Прюсл. биохим. микробиол. 1998. Т. 34, №3. С. 309-315.

31. Меламуд B.C., Пивоварова Т.А., Турова Т.П., Колганова Т.В.,Осипов Г.А., Лысенко A.M., Кондратьева Т.Ф., Каравайко Г.И Новая умеренно-термофильная бактерия Sulfobacillus sibiricus sp.nov. //Микробиология. 2003. Т.72. № 4. С. 1-8.

32. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции и процесс диссоциации. М:Изд-во МГУ. 1991. 144 С.

33. Петушкова Ю.П., Ивановский Р.Н. Ферменты, участвующие в метаболизме тиосульфата у Thiocapsa roseopersicina при росте в разных условиях. // Микробиология. 1976. Т.45. № 6. С. 960-965.

34. Резников А.А., Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. Методы анализа природных вод, 1970. М.: Недра. С. 140 143.

35. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. -М., Наука. 1980.160 С.

36. Романова А.К. Ассимиляция углекислоты при хемолитоавтотрофии. // В: «Хемосинтез» / под ред. Иванова М.В. М.: Наука. 1989. С. 148-169.

37. Северина JI.O., Сенюшкин А.А., Каравайко Г.И. Структура и химический состав S-слоев представителей рода Sulfobacillus. II Микробиология. 1995. Т.64 № 3. С. 336344.

38. Северина Л.О., Сенюшкин А.А., Сузина Н.Е., Каравайко Г.И. Ультраструктурная организация поверхностного слоя клеточной стенки Sulfobacillus thermosulfidooxidans. //Микробиология. 1998. Т.67. № 6. С.762-766.

39. Сенюшкин А.А., Северина Л.О., Митюшина Л.Л. Образование полисахаридной капсулы Sulfobacillus thermosulfidooxidans в олиготрофных и миксотрофных условиях. //Микробиология. 1997. Т.66. №4. С.455-461.

40. Сенюшкин А.А. Поверхностные слои сульфобацилл. Дисс. канд. биол.наук, Москва, Институт микробиологии РАН. 1999. 140 С.

41. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука. 1989. 564 С.

42. Уголькова Н. В., Ивановский Р. Н. О механизме автотрофной фиксации углекислоты у Chloroflexus aurantiacus II Микробиология. 2000. Т. 69. № 2. С. 175-179.

43. Хансон Р., Филлипс Дж. Химический состав бактериальной клетки // В «Методы общей бактериологии» под ред. Герхарда Ф.М. М.: Изд-во Мир. 1984. Т.2. С. 295-297.

44. Цаплина И.А., Богданова Т.И., Саякин Д.Д., Каравайко Г.И. Влияние органических веществ на рост Sulfobacillus thermosulfidooxidans 1269 и окисление пирита. // Микробиология. 1991. Т. 60. № 6. С. 34-40.

45. Цаплина И.А., Осипов Г.А., Богданова Т.И., Недорезова Т.П., Каравайко Г.И. Жирно-кислотный состав липидов термоацидофильных бактерий рода Sulfobacillus. II Микробиология. 1994. Т.63. № 5. С. 821-830.

46. Alexander В., Leach S., Ingledew W.S. The relationship between chemiosmotic parameters and sensivity to anions and organic acids in the acidophile Thiobacillus ferrooxidans. И J. Gen. Microbiol. 1987. V. 133. P.l 171-1179.

47. Anfinsen C.B. Aconitase from pig heart muscle. // In: Methods in enzymology. / Ed. Colowick S.P., Kaplan N.O. New York: Acad.Press. 1955. V. 1. P. 695-698.

48. Atkinson Т., Cairns S., Cowan D.A., Danson M.J., Hough D.W., Johnson D.B., Norris P.R., Raven N., Robinson C., Robson R., Sharp R.J. A microbial survey of Montserrat island hydrothermal biotopes. // Extremophiles. 2000. V. 4. P. 305-313.

49. Bacelar-Nicolau P., Johnson D.B. Leaching of pyrite by acidophilic heterotrophic iron-oxidizing bacteria in pure and mixed cultures. // Appl. Environm. Microbiol. 1999. V. 65. №2. P. 585-590.

50. Baker B. J., Banfield J.F. Microbial communities in acid mine drainage. // FEMS Microbiol. Ecol. 2003. V. 44. P. 139-152.

51. Bakker E.P. The role of alkali-cation transport in energy coupling of neutrophilic and acidophilic bacteria: an assessment of methods and concepts. // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 75. №2-3. P. 319-334.

52. Barr D.W., Ingledew W.J., Norris P.R. Respiratory chain components of iron-oxidizing, acidophilic bacteria. //FEMS Microbiol. Lett 1990. V. 70. № 1. P. 85-90.

53. Bassham J. A., Calvin M. The path of carbon in photosynthesis.- Englewood Cliffs, NJ: Prentice Hall. 1957. 104 P.

54. Bergey's Manual of systematic Bacteriology. Ed. by Boone D.R., Castenholz R.W. 2nd edition. Springer. 2001. V.l

55. Bergmeyer H.U., Gawehn K., Grasse M Enzymes as biochemical reagents. // In: "Methods of enzymatic analysis". Acad, press. New York. San Francisco. London. 1974. V. 1. P. 425522.

56. Beudeker R.F., Gottschal J. C., Kuenen J.G. Reactivity versus flexibility in thiobacilli. // Antonie van Leeuvenhoek. 1982. V. 48. № 1. P. 39-51.

57. Blake R.C., Shute E.A., Greenwood M.M., Speacer G.H., Ingledew W.J. Enzymes of aerobic respiration on iron. // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. P. 9-18.

58. Bond P.L., Smriga S.P., Banfield J.F. Phylogeny of microorganisms populating a thick, subaerial, predominantly lithotrophic biofilm at an extreme acid mine drainage site. // Appl. Environm. Microbiol. 2000. V. 66. № 9. P. 3842-3849.

59. Bond P.L., Druschel G.K., Banfield J.F. Comparison of acid mine drainage microbial • communities in physically and geochemically distinct ecosystems. // Appl. Environm.

60. Microbiol. 2000. V. 66. № 11. P. 4962-4971.

61. Bonjour F., Aragno M. Bacillus tusciae, a new species of thermoacidophilic, facultatively chemolithoautotrophic, hydrogen oxidizing sporeformer from a geothermal area. // Arch. Microbiol. 1984. V. 139. P. 397-401.

62. Bowes G., Ogren W. L., Hagerman R. H. Phosphoglycolate production catalyzed by ribulose diphosphate carboxylase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. V. 45. № 3. P. 716-722.

63. Bridge T.A.M, Johnson D.B. Reduction of soluble iron and reductive dissolution of ferric iron-containing minerals by moderately thermophilic iron-oxidizing bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. № 6. P. 2181-2186.

64. Brierley J. A. Thermophilic iron-oxidizing bacteria found in copper leaching dumps. // Appl. Environ. Microbiol. 1978. V. 36. P. 523-525.

65. Brierley J.A., Norris P.R., Kelly D.P., LeRoux N.W. Characteristics of a moderately thermophilic and acidophilic iron-oxidizing Thiobacillus. И Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1978. V. 5. P. 291-299.

66. Brock T.D., Gustafson J. Ferric iron reduction by sulfur- and iron-oxidizing bacteria. // Appl. Environm. Microbiol. 1976. V. 32. №4. P. 567-571.

67. Brune D. C. Sulfur compounds as photosynthetic electron donors // Anoxygenic photosynthetic bacteria / Ed. by R. E. Blankenship, M. T. Madigan, С. E. Bauer. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1995. P. 847-870.

68. Bucher Т., Peleiderer G. Pyruvate kinase from muscle. // In: Methods in enzymology. / Ed. Colowick S.P., Kaplan N.O. New York: Acad.Press. 1955. V. 1. P. 435-440.

69. Cavicchioli R., Thomas T. Extremophiles. // In Encyclopedia of Microbiology. 2000. V. 2. P. 317-337.

70. Ciferri O. Carbohydrate metabolism of Prototheca zopfti. 1. Enzymes of the glycolytic and • hexose monophosphate pathways. // Enzymologia. 1962. V. 24. № 5. P. 283-285.

71. Claassen P.A.M., Kortstee G.J.J., Oosterveld-van Vliet W.M., van Neerven A.R.W. Colonial heterogeneity of Thiobacillus versutus. //J. Bacteriol. 1986. V. 168, № 2. P. 791794.

72. Clark D.A., Norris P.R. Acidimicrobium ferrooxidans gen. nov.,sp. nov.: mixed culture ferrous iron oxidation with Sulfobacillus species. // Microbiology. 1996. V. 142. P. 785790.

73. Clark D.A., Norris P.R. Acidophilic bacteria and their activity in mineral sulfide oxidation // In: Microbial Mineral Recovery / Eds. Ehrlich H.L. and Brierley C.L. McGraw-Hill, New York, NY. 1996. P. 3-27.

74. Clarke W.A, Konhauser K.O., Thomas J.C., Bottrell S.H. Ferric hydroxide and ferric hydroxysulfate precipitation by bacteria in an acid mine drainage lagoon. // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20, P. 351-361.

75. Colmer A.R., Hinkle M.E. The role of microorganisms in acid mine drainage: a preliminary report. // Science. 1947. V.106. P. 253-256.

76. Corbett C.M., Ingledew W.J. Is Fe3+/2+ cycling on intermediate in sulphur oxidation by Fe2+-grown Thiobacillus ferrooxidansl //FEMS Microbiol. Lett. 1987. V. 41. № 1. P. 1-6.

77. Daron H.H. Grunsalus J.C. Citratase and isocitratase. // In: Methods in enzymology. / Ed. Colowick S.P., Kaplan N.O. New York: Acad.Press. 1962. V. 5. P. 622-633.

78. Dijkhuizen L., Harder W. Regulation of autotrophic and heterotrophic metabolism in Pseudomonas oxalaticus 0X1. Growth on mixtures of acetate and formate in continuous culture. // Arch. Microbiol. 1979. V. 123. № 1. P. 47-53.

79. Dispirito A.A., Dugan P.R., Tuovinen O.H. Inhibitory effects of particulate materials in growing cultures of Thiobacillus ferrooxidans. II Biotechnol. Bioeng. 1981. V. 23. P. 27612769.

80. Dopson M., LindstrOm E.B. Potential role of Thiobacillus caldus in arsenopyrite bioleaching // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. № 1. P. 36-40.

81. Duda V.I., Suzina N.E., Severina L.O., Dmitriev V.V. Karavaiko G.I. Formation of flat lamellar intramembrane lipid structures in microorganisms. // J.Membr. Biol. 2001. V. 180. №3. P. 33-48.

82. Dufresne S., Bousquet J., Boissinot M., Guay R. Sulfobacillus disulfidooxidans sp. no v., a new acidophilic, disulfide-oxidizing, gram-positive, spore-forming bacterium. //Intern. J. System. Bacteriol. 1996. V. 46. №. 4. P. 1056-1054.

83. Dunn M.F. Tricarboxylic acid cycle and anaplerotic enzymes in rhizobia. // FEMS Microbiol. Rev. 1998. V. 22. P. 105-123.

84. Edwards K.J., Ни В., Hamers R.J., Banfield J.F. A new look at microbial leaching patterns on sulfide minerals. // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 34. № 1. P. 197-206.

85. Englard S., Siegel L. Mitochondrial L-malate degydrogenase of beef heart. // In: Methods in enzymology. / Ed. Lowenstein. New York etc.: Acad.Press. 1969. V. 13. P. 99-106.

86. Evans M. C. W., Buchanan В. В., Arnon D. I. A new ferredoxin-dependent carbon reduction cycle in a photosynthetic bacterium // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1966. V. 55. № 4. P. 928-934.

87. Ezaki S., Maeda N., Kishimoto Т., Atomi H., Imanaka T. Presence of structurally novel type ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygenase in the hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus kodakaraensis KOD1. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 8. P. 5078-5082.

88. Friedrich C.G., Friedrich В., Bowien B. Formation of enzymes of autotrophic metabolism during heterotrophic growth of Alcaligenes eutrophus. // J. Gen. Microbiol. 1981. V. 122. P. 69-78.

89. Friedrich C.G. Derepression of hydrogenase during limitation of electron donors and derepression of ribulosebisphosphate carboxylase during carbon limitation of Alcaligenes eutrophus. II J. Bacteriol. 1982. V. 149. № 1. P. 203-210.164

90. Friedrich C.G., Rother D., Bardischewsky F., Quentmeier A., Fischer J. Oxidation of reduced inorganic sulfur compounds by bacteria: emergence of a common mechanism? // Appl. Environm. Microbiol. 2001. V. 67. № 7. P. 2873-2882.

91. Gehrke Т., Telegdi J., Thierry D., Sand W. Importance of extracellular polymeric substances from Thiobacillus ferrooxidans for bioleaching. // Appl. Environm. Microbiol. 1998. V. 64. № 7. P. 2743-2747.

92. Gonzales-Toril E., Llobet-Brossa E., Casamayor E.O., Amann R., Amils R. Microbial ecology of an extreme acidic environment, the Tinto river. // Appl. Environm. Microbiol. 2003. V. 69. № 8. P. 4853-4865.

93. Gottschal J.C., Pol A., Kuenen J.G. Metabolic flexibility of Thiobacillus A2 during substrate transition in the chemostat. // Arch. Microbiol. 1981. V. 129. № 1. P. 23-28.

94. Hagen K.D., Nelson D.C. Organic carbon utilization by obligately and facultatively autotrophic Beggiatoa strains in homogeneous and gradient cultures. I I Appl. Environm. Microbiol. 1996. V. 62. № 3. P. 947-953.

95. Hallbeck L., Pedersen K. Autotrophic and mixotrophic growth of Gallionella ferruginea. 113. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 2657-2661.

96. Hallberg K.B., Lindstrfim E.B. Characterization of Thiobacillus caldus sp.nov., a moderately thermophilic acidophile. //Microbiology. 1994. V. 140. P. 3451-3456.

97. Hallberg K.B., Yahya A., Bridge T.A.M., Johnson D.B. Sulfobacillus montserratensis sp. nov., and Sulfobacillus ambivalens, sp. nov., represent the first two mesophilic species of the genus Sulfobacillus to be described. // 2000. Direct submission.

98. Holden P.J. Characterisation of carbon fixation in the iron-oxidizing moderate thermophile NMW6. // In: Biohydrometallurgikal Technologies. / Ed. Torma A.E., Wey J.E., Lakshmanan V.L. The Minerals, Metals and Material Society. 1993. P. 705-714.

99. Hugler M., Huber H., Stetter K.O., Fuchs G. Autotrophic CO2 fixation pathways in • archaea (Crenarchaeota). // Arch. Microbiol. 2003. V. 179. P. 160-173.

100. Inui M., Dumay V., Zahn K., Yamagata H., Yukawa H. Structural and functional analysis of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene from the purple nonsulfur bacterium Khodopseudomonaspalustris No. 7 // J. Bacteriol. 1997. V. 179. № 15. P. 4942-4945.

101. Inui M, Nakata K., Roh J. H., Zahn K., Yukawa H. Molecular and functional characterization of the Khodopseudomonas palustris No. 7 phosphoenolpyruvate carboxykinase gene //J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 9. P. 2689-2696.

102. Ivanovsky R. N., Krasilnikova E. N., Fal Y. I. A pathway of the autotrophic CO2 fixation in Chloroflexus aurantiacus II Arch. Microbiol. 1993. V. 159. № 3. P. 257-264.

103. Johnson D.B., McGinness S. Ferric iron reduction by acidophilic heterotrophic bacteria. // Appl. Environm. Microbiol. 1991. V. 57. № 1. P. 207-211.

104. Johnson D.B. Selective solid media for isolating and enumerating acidophilic bacteria. // J. Microbiol. Meth. 1995. V. 23. P. 205-218.

105. Johnson D.B., Roberto F.F. Heterotrophic acidophiles and their roles in the bioleaching of sulfide minerals. // In: Biomining: Theory, Microbes and Industrial Processes. / Ed Rawling D.E. Springer, Berlin. 1997. P. 259-279.

106. Johnson D.B. Biodiversity and ecology of acidophilic microorganisms. //FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 307-317.

107. Johnson D.B., Hallberg K.B. The microbiology of acidic mine waters. // Research in Microbiology. 2003. V. 154. P. 466-473.

108. Johnson D.B., Okibe N., Roberto F.F. Novel thermo-acidophilic bacteria isolated from geothermal sites in Yellowstone national park: physiological and philogenetic characteristics. //Arch. Microbiol. 2003. V. 180. P. 60-68.

109. Jones G.E., Starkey R.L. Surface-active substances, produced by Thiobacillus thiooxidans. //J. Bacteriol. 1961. V. 82. № 5. P. 788-789.

110. Kappler U., Dahl K. En2ymology and molecular biology of prokaryotic sulfite oxidation. //FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 203. № 1. P. 1-9.

111. Karavajko G.I., Bulygina E.S., Tsaplina I.A., Bogdanova T.I., Chumakov K.M. Sulfobacillus thermosulfidooxidans: a new lineage of bacterial evolution? // FEBS Letters. 1990. V. 261. №1. P. 8-10.

112. Karavaiko G.I., Smolskaja L.S., Golyshina O.K., Jagovkina M.A., Egorova E.Y. Bacterial pyrite oxidation: influence of morphological, physical and chemical properties. // Fuel Processing Technology. 1994. V. 40. P. 151-165.

113. Karavaiko G.I. Microbial aspects of biohydrometallurgy. // Journal of Mining and Metallurgy. 1997. V. 33. P. 51-68.

114. Kelly D.P., Shergill J.K., Lu W.-P., Wood A.P. Oxidative metabolism of inorganic sulfur compounds by bacteria. // Antonie van Leeuwenhoek. 1997. V. 71. P. 95-107.

115. Kelly D.P. Thermodynamic aspects of energy conservation by chemolithotrophic sulfur bacteria in relation to the sulfur oxidation pathways. // Arch. Microbiol. 1999. V. 171. № 3. P. 219-229.

116. Kelly D.P. The Chemolithotrophic Procaryotes. //In The Procaryotes. / Eds. Balow A., et al.- New-York; Berlin; Heidelberg; London; Paris; Tokyo; Hong Kong; Barcelona; Budapest: Springer-Verlag. 1992. V. 1. P. 331 -343.

117. Kelly D.P., McDonald I.R., Wood A.P. Proposal for the reclassification of Thiobacillus novellus as Starkeya novella gen. nov., comb, nov., in the a-subclass of the Proteobacteria. // Int. J. System. Bacteriol. 2000. V.50. P. 1797-1802.

118. Kelly D.P., Wood A.P. Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov. // Int. J. System. Bacteriol. 2000. V.50. P. 511-516.

119. Key J.O., Suzuki, I. Isolation and characterization of membrane-associated thiosulphate-oxidizing system of Thiobacillus novellus. И J. Gen. Microbiol. 1977. V. 99. P. 397-412.

120. Kingma J.G., Silver M. Autotrophic growth of Thiobacillus acidophilus in the presence of a surface-active agent, tween 80. // Appl. Environm. Microbiol. 1979. V. 38. № 5. P. 795799.

121. Knouw B.T., McCurdy U.D. Tricarboxylic asid cycle enzymes and morphogenesis in Blastocladiella emersonii. II J. Bacteriol. 1969. V. 99. № 1. P. 197-206.

122. Komnitsas K, Paspaliaris I., Zilberchmidt M., Groudev S. Environmental impacts at coal waste disposal sites efficiency of desulfurization technologies. // Global Nest: the Int. J. 2001. V. 3. №2. P. 109-116.

123. Kondratieva E. N., Ivanovsky R. N., Krasilnikova E. N. Carbon metabolism in Chloroflexus aurantiacusll FEMS Microbiol. Lett. 1992. V. 100. P. 269-272.

124. Konishi Y., Asai S., Yoshida N. Growth kinetics of Thiobacillus thiooxidans on the surface of elemental sulfur. // Aappl. Environm. Microbiol. 1995. V. 61. № 10. P. 36173622.

125. Lane D.J., Harrison A.P., Stahl D., Pase В., Giovannoni S.J., Pase N.R. Evolutionary relationships among sulfur- and iron-oxidizing eubacteria. // J. Bacterid. 1992. V. 174. № 1. P. 269-278.

126. Ling K.N., Paetkau V., Marcus F., Lardy H.A. Phosphofructokinase. // In: "Methods in enzymology". Acad, press. New York. London. 1966. V. 9. P. 425-429.

127. London J., Rittenberg S.C. Effects of organic matter on the growth of Thiobacillus intermedius. //J. Bacteriol. 1966. V. 91. № 3. P. 1062-1069.

128. Lowry, O.H., Rosenbrough, H.J., Farr, A.L. & Randell, R. J. (). Protein measurement with theFolin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

129. Lovley D.R. Dissimilatory metal reduction. // Annual Rev. Microbiol. 1993. V. 47. P. 263-290.

130. Lyric R.M., Suzuki I. Enzymes involved in the metabolism of thiosulfate by Thiobacillus thioparus. I. Survey of enzymes and properties of sulfite: cytochrome с oxidoreductase. // Can. J. Biochem. 1970 a. V. 122. № 1. P. 334-343.

131. Lyric R.M, Suzuki I. Enzymes involved in the metabolism of thiosulfate by Thiobacillus thioparus. П. Properties of the adenosine-5-phosphosulfate reductase. // Can. J. Biochem. 1970 b. V. 122. № 1. P. 344-354.

132. Maeda N., Kanai Т., Atomi H., Imanaka T. The unique pentagonal structure of an archaeal rubisco is essential for its high thermostability. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 35. P. 31656-31662.

133. Manning H.L. New medium for isolating iron-oxidizing and heterotrophic acidophilic bacteria from asid mine drainage. //Appl. Microbiol. 1975. V. 30. P. 1010-1015.

134. Marsh R.M., Norris P.R. The isolation of some thermophilic, autotrophic iron- and sulfur-oxidizing bacteria//FEMS Microbiol. Lett. 1983. V. 17. P. 311-315.

135. Massey V. Fumarase. // In: Methods in enzymology. / Ed. Colowick S.P., Kaplan N.O. New York: AcadPress. 1955. V. 1. P.729-735.

136. Matin A., Rittenberg S.C. Utilization glucose in heterotrophic media by Thiobacillus intermedius. II J. Bacteriol. 1970 a. V. 104. № 1. p. 234-238.

137. Matin A., Rittenberg S.C. Regulation of glucose metabolism in Thiobacillus intermedius. II J. Bacteriol. 1970 b. V. 104. № 1. P. 239-246.m

138. Matin A. Keeping a neutral cytoplasm: the bioenergetics of obligate acidophiles. I I FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 75. № 2-3. P. 307-318.

139. McFadden B. A., Shively J. M. Bacterial assimilation of carbon dioxide by the Calvin cycle // Variations in autotrophic life / Ed. by J. M. Shively, L. L. Barton. London: Acad. Press, 1991. P. 25-49.

140. Meulenberg R., Scheer E.J., Pronk J.T., Hazeu W., Bos P., Kuenen J.G. Metabolism of tetrathionate in Thiobacillus acidophilus. //FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 112. P. 167172.

141. Miernyk J.A., Trelease R.N., Choinsky G.S. Malate synthase activity in cotton and other ungerminated oilseeds. // Plant physiology. 1979. V. 63. № 6. P. 1068-1071.

142. Miculic K., Benada O., Andernova M. Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase of thermophilic hydrogen-oxidizing microorganism Bacillus schlegelii. II Biochem. Biophys.

143. Res. Comm. 1992. V. 182. № 1. P. 425-431.171

144. Moreira D., Amilis R. Philogeny of Thiobacillus cuprinus and other mixotrophic thiobacilli: proposal for Thiomonas gen. nov. // Int. J. System. Bacterid. 1997. V.47. P. 522-528.

145. Nelson D.C., Hagen K.D. Physiology and Biochemestry of Symbiotic and Free-Living Chemoautotrophic Sulfur Bacteria. //Amer. Zool. 1995. V. 35. P. 91-101.

146. Norris P.R., Murrell J.C., Hinson D. The potential for diazotrophy in iron- and sulfur-oxidizing acidophilic bacteria. //Arch. Microbiol. 1995. V. 164. № 2. P. 294-300.

147. Norris P.R., Clark D.A., Owen J.P., Waterhouse S. Chracteristics of Sulfobacillus acidophilus sp.nov. and other moderately thermophilic mineral-sulphide-oxidizing bacteria. //Microbiology. 1996. V. 142. P. 775-783.

148. Okibe N., Johnson B. Bioleaching of pyrite by defined mixed cultures of moderately thermophilic acidophiles. // Biohydrometallurgy: Fundamentals, Technology and Sustainable Development, Part A. / Ed. Ciminelli V.S.T., Garcia O. 2001. P. 443-451.

149. Okibe N., Gericke M., Hallberg K.B., Johnson D.B. Enumeration and characterization of acidophilic microorganisms isolated from a pilot plant stirred tank bioleaching operation. // Appl. Environm. Microbiol. 2003. V. 69. №4. P. 1936-1943.

150. Paavilainen S. Carbohydrate catabolism in alkaliphilic bacilli. // Academic dissertation. Turku. Finland. 1995.

151. Padden A.N., Kelly D.P., Wood A.P. Chemolithoautotrophy and mixotrophy in the thiophene-2-carboxylic acid-utilizing Xanthobacter tagetidis. II Arch. Microbiol. 1998. V. 169. №3. P. 249-256.

152. Park S.S., DeCicco B.T. Hydrogenase and ribulose diphosphate carboxylase during autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth of scotochromogenic mycobacteria. // J. Bacteriol. 1976. V. 127. №2. P. 731-738.

153. Perez R.S, Matin A. Carbon dioxide assimilation by Tiobacillus novellus under nutrient-limited mixotrophic conditions. // J. Bacteriol. 1982. V. 150. № 1. P. 46-51.172

154. Pronk J.T., Meesters P.J.W., van Dijken J.P., Bos P., Kuenen J.G. Heterotrophic growth of Thiobacillus acidophilus in batch and chemostat cultures. // Arch. Microbiol. 1990 a. V. 153. №4. P. 392-398.

155. Pronk J.T., Meulenberg R., Van den Berg D.J.C., Batenburg-van der Verge W., Bos P., Kuenen J.G. Mixotrophic and heterotrophic growth of Thiobacillus acidophilus on glucose and thiosulfate. // Appl. Environm. Microbiol. 1990 b. V. 56. P. 3395-3401.

156. Pronk J.T., Meulenberg R., Hazeu W., Bos P., Kuenen J.G. Oxidation of redused inorganic sulfur compaunds by acidophilic thiobacilli. // FEMS Microbiol. Rev. 1990 с. V. 75. P. 239-306.

157. Pronk J.T., Meijer W.M., Hazeu W., van Dijken J.P., Bos P. Growth of Thiobacillus ferrooxidans on formic acid. // Appl. Environm. Microbiol. 1991 a. V. 57. № 7. P. 20572062.

158. Pronk J.Т., Liem K., Bos P., Kuenen J.G. Energy transduction by anaerobic ferric iron • respiration in Thiobacillus ferrooxidans. H Appl. Environm. Microbiol. 1991 b. V. 57. № 7.1. P. 2063-2068.

159. Pronk J.T., Johnson D.B. Oxidation and reduction of iron by acidophilic baceria. // Geomicrobiol. 1992. V. 10. P. 153-171.

160. Quayle J. R, Fuller R. C., Benson A. A., Calvin M. Enzymatic carboxylation of ribulose diphosphate//J. Am. Chem. Soc. 1954. V. 76. P. 3610-3611.

161. Rainey F.A., Fritze D., Stackebrandt. The philogenetic diversity of thermophilic members of the genus Bacillus as revealed by rDNA analysis. // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V. 115. №2. P. 205-212.

162. Rohwerder Т., Sand W. The sulfane sulfur of persulfides is the actual substrate of the sulfur-oxidizing enzymes from Acidithiobacillus and Acidiphilium spp. // Microbiology. 2003. V. 149. P. 1699-1710.

163. Sand W., Gerke Т., Hallmann R., Schippers A. Sulfur chemistry biofilm, and the (indirect attack mechanism a critical evaluation of bacterial leaching. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V 43. № 6. P. 961-966.

164. Schaeffer W. I., Umbreit W.W. Phosphotidylinositol as a wetting agent in sulfur oxidation by Thiobacillus thiooxidans. // J. Bacteriol. 1963. V. 85. № 2. P. 492-493.

165. Schippers A., Jozsa P.G., Sand W. Sulfur chemistry in bacterial leaching of pyrite. // Appl. Environm. Microbiol. 1996. V. 62. №9. P. 3424-3431.

166. Schippers A., Sand W. Bacterial leaching of metal sulfides proceeds by two indirect mechanisms via thiosulfate or via polysulfides and sulfur. // Appl. Environm. Microbiol. 1999. V. 65. №1. P. 319-321.

167. Schobert P., Bowien B. Unusial Сз and C\ metabolism in the chemoautotroph Alcaligenes eutrophus. //J. Bacteriol. 1984. V. 159. № 1. P. 167-172.

168. Shively J.M., van Keulen G., Meijer W.G. Something from almost nothing: Carbon • dioxide fixation in chemoautotrophs. // Annual Rev. Microbiol. 1998. V. 52. P. 191-230.

169. Sibley J. A., Lehninger A.L. Determination of aldolase in animal tissues. // J. Biol. Chem. 1949. V.177. №2. P. 859-872.

170. Smith A.L., Kelly D.P., Wood A.P. Metabolism of Thiobacillus A2 grown under autotrophic, mixotrophic and heterotrophic conditions in chemostat culture. // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 121. P. 127-138.

171. SOrbo B. A colorimetric Method for the determination of thiosulfate. // Biochim. Biophys. Acta. 1957. V.23. P. 412-416.

172. Srere P.A. Citrate synthase. // In: Methods in en2ymology. / Ed. Lowenstein. New York etc.: AcaAPress. 1969. V. 13. P. 3-11.

173. Straub K.L., Benz M., Schink B. Iron metabolism in anoxic environments at near neutral pH.//FEMSMicrobiol. Ecol. 2001. V. 34. P. 181-186.

174. Strauss G., Fuchs G. Enzymes of a novel autotrophic CO2 fixation pathway in the phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus, the 3-hydroxypropionate cycle // Eur. J. Biochem. 1993. V. 215. № 3. P. 633-643.

175. Sugio Т., Mizunashi W., Inagaki К., Tano T. Purification and some properties of sulfurferric iron oxidoreductase from Thiobacillus ferrooxidans. II J. Bacteriol. 1987. V. 169. № 11. P. 4916-4922.

176. Sugio Т., Hirose Т., Li-Zhen Ye., Tano T. Purification and some properties of sulfite:ferric iron oxidoreductase from Thiobacillus ferrooxidans II J.Bacteriol. 1992. V. 174. №10. P. 4189-4192.

177. Suzuki I., Silver M. The initial product and properties of the sulfur-oxidizing enzyme of Thiobacilli.//Biochem. Biophys. Acta. 1966. V. 122. № 1. P. 22-33.

178. Suzuki I., Chan C.W., Takeuchi T.L. Oxidation of inorganic sulfur compounds by thiobacilli. // In Enviromental Geochemistry of sulfide oxidation. /Edited by Alpers C.N. and Blowes D.W. American Chemical Society Washington. 1994. P. 60-67.

179. Suzuki I. Microbial leaching of metals from sulfide minerals. // Biotechnology Advances. 2001. V. 19. P. 119-132.

180. Tabita F.R. Molekular and cellular regulation of autotrophic carbon dioxide fixation in microorganisms. //Microbiol. Rev. 1988. V. 52. №2. P. 155-189.

181. Tigerstrom M., Campbell J.J.R. The accumulation of a-ketoglutarate by suspensions of Pseudomonas aeruginosa. II Can. J. Microbiol. 1966. V. 12. № 5. P. 1005-1013.

182. Tourova T.P., Poltoraus A.B., Lebedeva I.A., Tsaplina I.A., Bogdanova T.I., Karavajko G.I. 16S Ribosomal RNA (rDNA) Sequence Analysis and Phylogenetic Position of Sulfobacillus thermosulfidooxidans. //System. Appl. Microbiol. 1994. V. 17. P. 509-512.

183. Truper, H.G., Schlegel, H.G., Sulfur metabolism in Thiorhodaceae: 1. Quantitative measurements on growingcCells of Chromatium okenii. II Antonie van Leeuwenhoek. 1964. V. 30. P. 225-238.

184. Veeger С., Der Vartanian D.V., Zeylemaker W.P. Succinate dehydrogenase. // In: Methods in enzymology. / Ed. Lowenstein. New York etc.: Acad.Press. 1969. V. 13. P. 8190.

185. Visca P., Bianchi E., Polidoro M, Buonfiglio V., Valenti P., Orsi N. A new solid medium for isolating and enumerating Thiobacillus ferrooxidans. H J. Gen. Appl. Microbiol. 1989. V. 35. P. 71-81.

186. Visser J. M., de Jong G.A. H., Robertson L. A., Kuenen J. G. Purification and characterization of a periplasmic thiosulfate dehydrogenase from the obligately autotrophic Thiobacillus sp. W5. // Arch. Microbiol. 1997. V. 166. № 6. P. 372-378

187. Waterbuiy J.B. The Cyanobacteria. Isolation, purification and identification. // In The Procaryotes. /Eds. Balow A., et al.- New-York; Berlin; Heidelberg; London; Paris; Tokyo; Hong Kong; Barcelona; Budapest: Springer-Verlag. 1992. V. 2. P. 2058-2078.

188. Watson G.M.F., Tabita F.R. Microbial ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a molecule for philogenetic and enzymological investigation. // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 146. №1. P. 13-22.

189. Watson G.M.F., Yu J.P., Tabita F.R. Unusual ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase of anoxic Archaea. II J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 5. P. 1569-1575.

190. Wood W.A. Assay of enzymes representative of metabolic pathway. // Methods microbiol. 1971. V. 6. P. 411-424.

191. Wood A.P., Kelly D.P. Triple Catabolic Pathways for glucose in a fast-growing strain of Thiobacillus A2. //Arch. Microbiol. 1978. V. 117. №4. P. 309-310.

192. Wood A.P., Kelly D.P. Autotrophic and mixotrophic growth of three thermoacidophilic iron-oxidizing bacteria. //FEMS Microbiol. Lett. 1983. V. 20. P. 107-112.176

193. Wood A.P., Kelly D.P. Growth and Sugar Metabolism of a Thermoacidophilic Iron-oxidizing Mixotrophic Bacterium. //J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130. P. 1337-1349.

194. Wood H. G., Ragsdale S. W., Pezacka E. The acetyl-CoA pathway of autotrophic growth //FEMSMicrobiol. Reviews. 1986. V. 39. P. 345-362.

195. Wood A.P., Kelly D.P., Norris P.R. Autotrophic growth of four Sulfolobus strains on tetrathionate and the effect of organic nutrients. // Arch. Microbiol. 1987. V. 146. № 4. P. 382-389.

196. Yahya A., Hallberg K.B., Roberto T.T., Johnson D.B. Sulfobacillus yellowstonensis, sp. nov., a facultatively anaerobic moderately thermophilic acidophile, isolated from a geothermal pool in Yellowstone National Park. // 2000. Direct submission.

197. Приношу самую сердечную благодарность моему руководителю к.б.н. Захарчуку JI.M. за внимательное и чуткое руководство, постоянную помощь и содействие в работе, а также за моральную поддержку.

198. Я искренне признательна заведующему кафедрой микробиологии биологического факультета МГУ проф. Нетрусову А.И. за проявленный интерес к работе, содействие и критические замечания.

199. Особую благодарность приношу чл.-корр. РАН, зав. лабораторией хемолитотрофных микроорганизмов ИнМи им. С.Н Виноградского Г.И. Каравайко за постоянное внимание к работе, ценные замечания и помощь в обсуждении результатов.

200. Искренне признательна сотрудникам и аспирантам кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова и лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов ИнМи РАН им. С.Н Виноградского за дружеское участие и полезные советы.

201. Я искренне благодарна моей маме О.Н. Ширяевой за моральную поддержку и терпение.