Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Термоацидофильные микробные сообщества природных и техногенных экосистем

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Термоацидофильные микробные сообщества природных и техногенных экосистем"

На правах рукописи

БУЛАЕВ АЛЕКСАНДР ГЕНРИХОВИЧ

ТЕРМОАЦИДОФИЛЬНЫЕ МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА ПРИРОДНЫХ И ТЕХНОГЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ

Специальность 03.02.03. — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2013

005051555

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИРАН)

Научный руководитель: Тамара Федоровна Кондратьева

доктор биологических наук, ИНМИРАН, зав. лабораторией хемолитотрофных микроорганизмов

Официальные оппоненты: Тамара Николаевна Назина

доктор биологических наук, ИНМИРАН, в.н.с. лаборатории нефтяной микробиологии

Леонид Михайлович Захарчук

доктор биологических наук, Биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова, профессор кафедры микробиологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина Российской академии наук

Защита диссертации состоится «/X» м&рТ(а 2013 г. в/' ~ часов на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан « » февраля 2013 г.

Ученый секретарь кандидат биологических наук

Диссертационного совета Т.В. Хижняк

сЛ-. С&7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ацидофильные хемолитотрофные микроорганизмы (АХМ), участвующие в окислении сульфидных минералов, составляют филогенетически гетерогенную группу, включающую представителей нескольких филумов бактерий и архей, объединяемых по физиологическим признакам: ацидофилии; использованию для энергетического метаболизма неорганических соединений (двухвалентного железа, серы и ее восстановленных соединений, а также большого разнообразия сульфидных минералов); устойчивости к ионам тяжелых металлов, которые накапливаются в местах обитания АХМ в результате растворения сульфидных минералов [Каравайко и др., 2006; Schippers, 2007].

АХМ играют ключевую роль в закислении рудничных вод и загрязнении их тяжелыми металлами, но благодаря использованию в биогидрометаллургических технологиях получения цветных и благородных металлов из сульфидных руд имеют большое практическое значение.

Окисление сульфидных минералов в природных и техногенных экосистемах осуществляется сообществами, в состав которых, помимо АХМ, зачастую входят и гетеротрофы, играющие косвенную роль в окислительных процессах, а иногда и окисляющие неорганические субстраты [Schippers, 2007; Johnson et al., 2009].

До недавнего времени основное внимание исследователей уделялось изучению мезофильных сообществ АХМ. Отмечен ряд закономерностей в формировании их видового состава и влияние на этот процесс различных факторов среды [Goebel & Stackebrandt, 1994; Pizarro et al., 1996; Gonzalez-Toril et al., 2003].

Поскольку процессы окисления сульфидных минералов являются экзотермическими, особый интерес представляет применение в биогидрометаллургических технологиях умеренно термофильных и термотолерантных АХМ [Меламуд, 2000; Plumb et al., 2007].

В последние годы сообщества термоацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов из разных мест обитания начали активно изучаться [Tyson et al., 2004; Hawkes et al., 2006 a, b; d'Hugues et al., 2008; Okibe et al., 2003]. Имеющиеся результаты пока не позволяют понять закономерности их формирования, влияние факторов среды на видовой и штаммовый состав и на эффективность окисления сульфидных минералов. Поэтому исследование термоацидофильных микробных сообществ представляет научный и практический интерес.

Цель и задачи исследования. Цель исследования — изучить состав термоацидофильных микробных сообществ, сформировавшихся в природных и техногенных экосистемах, и выявить факторы среды, влияющие на состав сообществ и скорость окисления сульфидных минералов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить состав сообществ АХМ, осуществляющих биоокисление концентрата руды Олимпиадинского месторождения в промышленном процессе при 40°С; в

1

лабораторном процессе при 50°С; на второй стадии в двухстадийном лабораторном процессе после выщелачивания концентрата на первой стадии при 80°С культуральной жидкостью, содержащей ионы трехвалентного железа.

2. Провести сравнительное исследование состава сообществ АХМ, осуществляющих биоокисление концентрата руды месторождения Кючус, и сформированного при переключении процесса на окисление концентрата руды Олимпиадинского месторождения.

3. Выделить накопительные культуры умеренно термофильных АХМ из природных экосистем (концентрат и окисленная руда месторождения Шануч и сульфидная руда Попутнинского месторождения) и изучить их состав.

4. Изучить полиморфизм фено- и генотипических свойств штаммов микроорганизмов одного вида, доминирующих в разных сообществах АХМ.

5. Провести сравнительное изучение скорости окисления минералов пирита, пирротина и арсенопирита сообществами АХМ из природных и техногенных экосистем.

Научная новизна. В результате сравнительных исследований выделенных из природных и техногенных экосистем сообществ умеренно термофильных и термотолерантных ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, окисляющих сульфидные минералы, показано, что важнейшими факторами среды, формирующими их видовой и штаммовый состав, являются температура процесса окисления энергетического субстрата и его минералогические свойства.

Установлено, что изменение состава минерального субстрата (концентрата руды Олимпиадинского месторождения) при высокотемпературном окислении культуральной жидкостью, содержащей ионы трехвалентного железа, в двухстадийном процессе сопровождается замещением в сообществе доминирующих штаммов микроорганизмов.

Штаммы одного вида БЬ. thermosulfid.ooxida.ns, выделенные из разных сообществ АХМ, отличаются физиологическими свойствами: оптимальными значениями рН и температуры для роста и окисления энергетических субстратов, способностью окислять различные энергетические субстраты и расти в авто-, миксо- или гетеротрофных условиях.

Скорость окисления сообществами АХМ сульфидных минералов в качестве единственных источников энергии зависит как от сходства их физико-химических свойств со свойствами минералов, присутствующих в субстратах, на которых сформировалось данное сообщество, так и от скорости его адаптации к новому субстрату.

Практическая значимость. Результаты исследований были использованы при составлении рекомендаций по интенсификации биотехнологических процессов извлечения золота из концентратов упорных сульфидных руд. Показана экономическая целесообразность окисления концентратов сульфидных руд

сообществами умеренно термофильных АХМ за счет уменьшения расхода серной кислоты на поддержание необходимого рН, затрат электроэнергии и воды на охлаждение реакторов, снижения содержания серы в твердых остатках биовыщелачивания и расхода реагентов в процессе их сорбционного цианирования.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 5-ом и 6-ом Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011); VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2010); VI Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010); 4-ом Научном симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010); Международном совещании «Новые технологии обогащения и комплексной переработки труднообогатимого природного и техногенного минерального сырья» (Верхняя Пыщма, 2011).

Личный вклад автора. Автором проведены микробиологические и биотехнологические исследования и осуществлен анализ полученных результатов. Автору принадлежит основная роль в написании экспериментальных статей.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ: 6 статей, 1 обзор и 8 тезисов.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста, включают 27 таблиц и 25 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы объекты и методы исследований, результатов исследований (в 4 главах), заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 362 работы, в том числе 45 на русском и 317 на иностранном языке.

Место выполнения работы. Исследования проводили в лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (зав. лаб. д.б.н. Т.Ф. Кондратьева), а также в ФГУП ЦНИГРИ. Молекулярно-биологические исследования проводили совместно с сотрудниками ЦКП ФГБУН Центр "Биоинженерия" РАН.

Благодарности. Автор выражает признательность научному руководителю д.б.н. Т.Ф. Кондратьевой, сотрудникам лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов ИНМИ РАН, ЦНИГРИ и ЦКП Центра «Биоинженерия» РАН за помощь в выполнении работы и анализе данных, сотрудникам МИСиС и ЗАО «Полюс» за предоставление проб.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Объектами исследования были сообщества АХМ, сформировавшиеся при 40-50°С в биотехнологических процессах окисления сульфидных минералов в концентратах руд разных месторождений, а также выделенные из проб руд или их концентратов.

В качестве минеральных субстратов использовали:

1. концентрат руды Олимпиадинского месторождения, содержащий пирротин (FeS), пирит (FeS2), арсенопирит (FeAsS) и антимонит (Sb2S3);

2. концентрат руды месторождения Кючус, содержащий пирит (FeS2), арсенопирит (FeAsS) и антимонит (SbÄ);

3. концентрат руды месторождения Шануч, содержащий пирротин (FeS), пентландит ((Fe, Ni)9S8), бравоит ((Fe,Ni,Co)S2);

4. окисленную руду месторождения Шануч, содержащую оксидные минералы железа, пентландит ((Fe, Ni)9S8) и халькопирит (CuFeS2);

5. руду Попутнинского месторождения, содержащую пирит (FeS2), кварц, слюду.

Культуральные и физико-химические методы. Чистые культуры микроорганизмов выделяли путем посевов жидкой фазы пульпы методом предельных десятикратных разведений на элективные среды, содержащие двухвалентное железо или серу в качестве источника энергии [Silverman & Lungren, 1959; Меламуд и Пивоварова, 1998; Coram & Rawlings, 2002]. Посевы инкубировали при 30, 35, 40 и 50°С на ротационной качалке (170 об/мин) в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 100 мл среды и 10% (об/об) инокулята или в лабораторных реакторах объемом 2.5 л с 1.0 л среды при скорости перемешивания 470 об/мин и подаче воздуха со скоростью 4 л/мин. Численность микроорганизмов определяли методом прямого счета клеток в световом микроскопе Amplival "Carl Zeiss" (ГДР) с фазово-контрастной приставкой. Для этого наносили на предметное стекло фиксированный объем питательной среды (3 мкл), накрывали покровным стеклом размером 24x24 мм, запаивали препарат парафином и считали число клеток в 25 полях зрения. Окисление закисного железа и элементной серы изучали в автотрофных и миксотрофных условиях. Для миксотрофных микроорганизмов определяли возможность использования органических веществ: глюкозы, фруктозы, сахарозы, глицина, метионина, цитрата, ацетата, сукцината, глутатиона, дрожжевого экстракта (ДЭ) в концентрации 0.05% (вес/об) в качестве единственных источников энергии и доноров электронов. Миксотрофный рост оценивали на среде 9KS, содержащей двухвалентное железо и дополненной теми же органическими субстратами в концентрации 0.02%. Во всех вариантах опытов делали несколько последовательных пересевов. Концентрацию двух- и трехвалентного железа определяли методом тригонометрического титрования [Резников и др., 1970], общего и пятивалентного мышьяка - йодометрическим

титрованием [Суровская и др., 1957]. Об окислении серы судили по снижению рН среды. Состав сульфидных руд, концентратов и продуктов биоокисления определяли фазовым анализом [Филиппова, 1975]. Содержание сульфидных элементов в продуктах переработки золотосодержащих концентратов определяли флуоресцентным рентгенорадиометрическим методом после отмывки твердой фазы в 5%-ном растворе НС1 в течение 24 ч при 30°С. Содержание золота в твердой фазе определяли пробирным анализом, степень извлечения золота - сорбционным цианированием [Зеленов, 1978].

Молекулярно-биологические исследования. Для определения состава сообществ АХМ использовали метод создания и анализа библиотек клонов генов 16S рРНК в сочетании с выделением чистых культур. Выделенные штаммы идентифицировали на основе определения последовательности гена 16S рРНК.

Выделение ДНК из биомассы бактерий проводили согласно методу [Булыгина и др., 2001]. Для проведения ПЦР фрагментов генов 16S рРНК представителей доменов Bacteria и Archaea использовали универсальные праймеры [Lane et al., 1991; Колганова и др., 2002]. Для получения библиотек клонов продукты амплификации клонировали с использованием набора реактивов pGEM-T System («Promega», США). Секвенирование проводили с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 («Applied Biosystems, Inc.», USA) на секвенаторе ABI PRIZM 3730 («Applied Biosystems, Inc.», USA). Первичный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК проводили с помощью сервера BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Выравнивали последовательности с помощью программы CLUSTALW [Thompson et al., 1994]. Построение филогенетических деревьев производили с помощью программы TREECONW [Van de Peer et al., 1994]. Полученные последовательности генов 16S рРНК были депонированы в GenBank.

Анализ структуры хромосомной ДНК. Структуру хромосомной ДНК анализировали методом пульс-электрофореза фрагментов хромосомной ДНК, расщепленной эндонуклеазой рестрикции Noil [Кондратьева и др., 1998].

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Состав микробных сообществ, сформировавшихся в процессах окисления концентрата руды Олимпиадинского месторождения

2.1.1 Состав сообщества в пульпе реакторов Олимпиадинской фабрики

Выделение чистых культур микроорганизмов и физиологические свойства выделенных штаммов. Из пробы пульпы промышленного реактора, где осуществлялся процесс биоокисления концентрата руды Олимпиадинского месторождения при 40°С, было выделено шесть чистых культур микроорганизмов. Свойства выделенных штаммов приведены в таблице 1.

На основании филогенетического анализа генов 16S рРНК штаммы были идентифицированы и обозначены как Acidithiobacillus ferrooxidans OL10-01,

5

Leptospirillum ferriphilum OL10-02, Sulfobacillus thermosulfidooxidans OL10-03, Ferroplasma acidiphilum OL10-04, Alicyclobacillus tolerans OL10-05, Acidiphilium cryptum OL 10-06.

Таблица 1. Свойства микроорганизмов, выделенных в чистые культуры из пробы пульпы реактора Олимпиадинской фабрики

Микроорганизм (номер последовательности генов 16S рРНК в Genbank) Предельное десятикратное разведение, из которого выделили штамм Сходство последовательности гена 16S рРНК с последовательностью типового штамма, % Оптимальная температура (верхний предел), °С Используемые субстраты

Acidithiobacillus ferrooxidans OLIO-Ol (JF891384) 4 98.5 35-37 (40) Fe24, S°

Leptospirillum ferriphilum OL10-02 (JF891387) 8 99.6 35-37 (45) Fe2+

Sulfobacillus thermosulfidooxidans OL10-03 (JF891382) 7 99.8 45-50 (55) Fe2+, S° в миксотрофных условиях, ДЭ

Ferroplasma acidiphilum OL10-04 (JF891386) 8 99.8 35 (45) Fe2+B миксотрофных условиях

Alicyclobacillus tolerans OL10-05 (JF891385) 7 98.4 H.O.* SUB миксотрофных условиях, ДЭ

Acidiphilium cryptum OL10-06 (JF891383) 7 99.9 Н.О.* ДЭ

* параметр не определяли

Таким образом, из выделенных в чистые культуры штаммов основная роль в окислении неорганических энергетических субстратов могла принадлежать представителям родов Sulfobacillus, Leptospirillum и Ferroplasma. Гетеротрофные микроорганизмы могли положительно влиять на окисление минеральных субстратов АХМ путем потребления растворенных органических веществ, ингибирующих рост автотрофов [Okibe & Johnson, 2004].

Определение состава сообщества микроорганизмов методом анализа библиотек клонов генов 16S рРНК. На основе ДНК, выделенной из биомассы микроорганизмов, присутствующих в пульпе реактора, был получен и проанализирован 51 клон генов 16S рРНК бактерий. Последовательности были сгруппированы в два филотипа, относящиеся к родам: Acidiferrobacter (12 клонов) и

б

Leptospirillum (39 клонов). Последовательности рода Acidiferrobacter имели 99.5% сходства с геном 16S рРНК Acidiferrobacter thiooxydans DSM 2392т (рис. 1) -ацидофильной термотолерантной автотрофной бактерии, окисляющей железо, серу и пирит.

-ÍT

Clone Consensus И2 sequences) ■Acidiferrobacter thiooxydans DSM 2392 (AJ459800)

571-él

п—'

•Acidithiobacillus sa. OLIO-tll (JF8913841

•Acidithiobacillus fernxxidans ATCC 232701 (NC_011761)

'Acidithiobacillus ferrivorans NO-371 AF376020 •AcidithiobaciUus thiooxidans ATCC 193771 (AY552087)

100 ^AcidithiobaciUus aibertensis DSM 143661 (NR_028982)

-Acidithiobacillus cupríthermicus (AJ243934)

С а

100 I-Acidithiobacillus caldus DSM 8584 (Z29975)

—Thermithiobacillus tepidarius DSM 3134T (AJ459801)

Рис. 1. Дендрограмма нуклеотидньгх последовательностей генов 16S рРНК представителей y-Proteobacteria из пробы пульпы из реактора Олимпиадинской фабрики, показывающая положение штамма Acidithiobacillus sp. OLIO-Ol и консенсусного филотипа из библиотеки клонов микробного сообщества. В качестве outgroup использована последовательность 16S рДНК Thermithiobacillus tepidarius DSM 3134т (AJ 459801). Здесь и на рис. 2, 4, 5 цифры указывают достоверность bootstrap-анализа. Последовательности, полученные в настоящей работе, выделены подчеркиванием. Слева вверху дан масштаб эволюционных расстояний. Алгоритм - neighbor-joining.

Все последовательности рода Leptospirillum формировали единый кластер с последовательностью L. ferriphilum BY (EF025341) (99.9% сходства), филогенетически отличный от последовательностей типовых штаммов L. ferriphilum ATCC 49881 и L. ferrooxidans DSM 2705т (рис. 2).

Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК бактерий рода Sulfobacillus выявлены не были. Этот факт может объясняться как низкой численностью бактерий рода Sulfobacillus, так и разной эффективностью выделения ДНК из разных бактерий. В контрольном эксперименте, в ходе которого смешали биомассу исследуемого сообщества с биомассой сульфобацилл в соотношении 9:1, выделили суммарную ДНК и получили амплификат 16S рДНК, наличие сульфобацилл в количестве 10% от общей биомассы успешно детектировалось. Таким образом, можно утверждать, что в исследуемом сообществе относительная численность сульфобацилл была невелика.

Последовательности консенсусного филотипа архейного компонента сообщества имели 100%-ное сходство с геном 16S рРНК выделенного штамма Fp. acidiphilum OL 10-04 и, следовательно, принадлежали к виду Fp. acidiphilum.

С помощью культуральных методов исследования в сообществе было обнаружено большее разнообразие микроорганизмов {At. ferrooxidans, L. ferriphilum, Sb. thermosulfidooxidans, Fp. acidiphilum, Al. tolerans и Ac. cryptum), чем при анализе

библиотек клонов генов 16Б рРНК (А/Ь. 1Ыоохус1ап5, ¿. /егпрИИит и Гр. ас'кИрЫЫт). При этом молекулярно-биологический метод выявил один из доминирующих видов микроорганизмов, не выделенный в чистую культуру (А/Ъ. МоохусЛапз).

Типовой штамм этого вида окисляет железо, серу и сульфидные минералы при 40°С, поэтому в пульпе промышленных реакторов данный микроорганизм, вероятно, может играть важную роль в окислении соединений серы.

Таким образом, сочетание микробиологических и молекулярно-биологических методов исследования сообществ АХМ способствует более полному выявлению физиологических и филогенетических групп микроорганизмов.

nf-eotospirillum ferriohilum ATCC 498811 (AF3568 mJLeptospirillum ferriphilum РЗа (NR_028818) 2. ^-Leptospirillum sp. RT (EU37Z650) '-Leptospirillum sp. isolate LA (AJ237902) "Leptospirillum sp. BGR 44 (GU167989) a iLeptospirillum sp. DSM 2391 (AJ237903) 93 ^-Leptospirillum ferriphilum Warwick (AF356831) -Leptospirillum ferrooxidans TzT-B1-K3 (AJ295685) "Leptospirillum ferriphilum BY (EF025341) -Leptospirillum so. QL10-02 (JF891387)

Clone consensus (39 sequences)

eptospirillum ferrooxidans DSM 2705' (X86776) ■Leptospirillum sp. NOenl (AF376016) ■Nitrosoira moscoviensls NSP M-1' (NR 029287)

"Г

Рис. 2. Дендрограмма нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК представителей рода Leptospirillum, показывающая положение штамма Leptospirillum sp. OLI0-02 и консенсусного филотипа из библиотеки клонов микробного сообщества. В качестве outgroup использована последовательность гена 16S рРНК Nitrospira moscoviensis NSP М-1т.

2.1.2 Влияние на состав сообщества обработки концентрата при 80°С культуральной жидкостью, содержащей ионы трехвалентного железа

Исследовано влияние на состав сообщества АХМ изменения минералогического состава концентрата руды после обработки при температуре 80°С культуральной жидкостью, содержащей ионы трехвалентного железа. Ранее было показано, что введение в технологическую схему процесса стадии предварительной высокотемпературной обработки сульфидных концентратов позволяет интенсифицировать процесс биоокисления. Известно, что в процессе окисления ионами Fe3+ изменяется минералогический состав концентрата: выщелачивается пирротин и накапливается элементная сера [Фомченко и др., 2011]. Обработанный таким образом концентрат руды Олимпиадинского месторождения окисляли при 40°С в отъемно-доливном режиме. Плотность пульпы составляла 15%, время окисления —

10 сут. В качестве инокулята использовали сообщество из пульпы промышленных реакторов Олимпиадинской фабрики, сформировавшееся при 40°С при окислении необработанного концентрата..

Сообщество микроорганизмов, сформировавшееся в процессе окисления химически обработанного концентрата, исследовали культуральными методами. В посевах из наибольших разведений доминировали спорообразующие палочковидные клетки размером 0.5-0.6 х 1.4-2.0 мкм. Они были выделены в чистую культуру, обозначенную как штамм НТ-4. По результатам филогенетического анализа штамм был отнесен к виду Sb. thermosulfidooxidans (сходство последовательности гена 16S рРНК с типовым штаммом Sb. thermosulfidooxidans ВКМ-12697 - 99%). Последовательность нуклеотидов гена 16S рРНК штамма НТ-4 была депонирована в GenBank под номером GU180244.1 (рис. 5, стр. 14). Профиль рестрикции хромосомной ДНК штамма НТ-4 отличался от профиля известных штаммов сульфобацилл [Кондратьева и др., 1998] (рис. 3).

2.1.3 Влияние температуры на состав сообщества умеренно термофильных АХМ в пульпе в процессе чанового биовыщелачивания

Для изучения влияния температуры процесса на состав сообщества АХМ был проведен процесс окисления концентрата Олимпиадинской руды при 50°С. В качестве инокулята было использовано сообщество из пульпы промышленных реакторов, сформировавшееся при 40°С. Плотность пульпы составляла 15%, процесс проводили в отъемно-доливном режиме в двух реакторах в течение 10 сут. Величины pH (1.3—1.6) в реакторах через 24 ч после отъема-долива пульпы и высокие значения Eh (до 810 мВ) свидетельствовали о высоких скоростях окисления сульфидных минералов.

Продукты бактериального окисления концентрата направляли на сорбционное цианирование для извлечения золота. Степень извлечения золота в результате проведения процесса при 50°С составила 91%. При проведении процесса в аналогичных условиях, но при 40°С - 82.4% [Фомченко и др., 2011].

Повышение температуры процесса биоокисления флотоконцентрата Олимпиадинской руды с 40°С до 50°С позволило повысить глубину окисления сульфидных минералов и скорость окисления субстратов, содержащих серу, что увеличило степень извлечения золота.

Состав микробного сообщества. При рассеве пульпы из реактора лабораторной установки на элективные среды при 50°С было получено два изолята. Штамм НТ-1 был выделен на среде 9KS с двухвалентным железом, а штамм НТ-3 был выделен на той же среде, но с элементной серой вместо двухвалентного железа. По результатам филогенетического анализа штаммы были отнесены к виду Sb. thermosulfidooxidans. Сходство последовательностей генов 16S рРНК этих штаммов с последовательностью штамма Sb. thermosulfidooxidans НТ-4 составила 100% (рис. 5, стр. 14). Штаммы отличались друг от друга и от исследованных ранее штаммов сульфобацилл по профилю фрагментов хромосомной ДНК [Кондратьева и др., 1998] (рис. 3).

А Б В

Рис. 3. Пульс-электрофореграмма фрагментов хромосомной ДНК штаммов гкегтоьгйАйооххскть НТ-1(А); НТ-3 (Б); НТ-4 (В), расщепленной эндонуклеазой рестрикции КоЛ. Справа указаны размеры фрагментов в т.п.н.

Таким образом, в процессе биоокисления концентрата сульфидной руды при смене температуры произошло вытеснение выявленных ранее штаммов двумя новыми штаммами рода Би1/оЬасП1и$, и сформировалось новое по составу сообщество.

2.1.4 Сравнительный анализ физиологических свойств штаммов БЬ. 111егт(тфйоохи1ат, доминирующих в процессах биоокисления концентрата руды Олимпиадинского месторождения при различных условиях

Был проведен сравнительный анализ физиологических свойств штаммов БЬ. 1кегто$1фс1оох1с1ап5 НТ-1, НТ-3, НТ-4 и НТ-5, выделенных из пульп реакторов при разных режимах процесса окисления концентрата руды Олимпиадинского месторождения. Штаммы различались предельными и оптимальными значениями рН и температуры (табл. 2), способностью окислять элементную серу и расти в авто-, гетеро- и миксотрофных условиях.

Только штамм НТ-3, выделенный на среде с элементной серой, окислял ее в миксотрофных условиях неограниченное число пересевов. Штамм НТ-5 рос в автотрофных условиях на среде с двухвалентным железом. Остальные штаммы росли только в присутствии 0.02% ДЭ. ДЭ в концентрации 0.05% не обеспечивал рост штаммов в качестве единственного источника энергии. В миксотрофных условиях, в присутствии двухвалентного железа, он мог быть заменен 0.02% глюкозы, фруктозы, сахарозы, метионина и глутатиона. Скорость окисления железа и урожайность всех культур на среде с этими субстратами была ниже, чем на среде с ДЭ. В присутствии ДЭ для полного окисления железа в среде 9КБ требовалось 9-12 ч, тогда как при использовании указанных выше органических веществ — 48-72 ч. Глицин, цитрат,

ацетат, сукцинат поддерживали рост культур на протяжении 2-5 последовательных пересевов.

Таблица 2. Физиологические свойства штаммов БЬ. 1кегто$и1Ас1оох1с1а№

Штамм ГС, оптимум (верхний предел) рН, оптимум (пределы) Число пересевов на Б0 Число пересевов на Ре2+ Число пересевов на дэ

НТ-1 50(65) 1.4-1.5 (0.52.8) 2 4 4

НТ-3 45(55) 1.7(1,2-2.8) >10 0 8

НТ-4 55(60) 1.6(1.2-2.8) 3 1 3

НТ-5 50(55) 1.8(1.2-2.4) 4 >10 8

Таким образом, показано, что штаммы одного вида БЪ. 1Иегто$1фс1оох1с1ам, доминирующие в сообществах микроорганизмов, как сформированных в процессах окисления концентрата руды Олимпиадинского месторождения в разных режимах, так и выделенные из пульпы одного и того же реактора, отличаются физиологическими свойствами: способностью окислять различные энергетические субстраты, скоростью роста в авто-, миксо- или гетеротрофных условиях, оптимальными значениями рН и температуры для роста и окисления энергетических субстратов.

2.2 Состав сообщества, сформировавшегося в процессе окисления концентрата руды Кючусского месторождения и его изменение при переключении на окисление другого минерального субстрата

2.2.1 Сообщество микроорганизмов, участвующее в процессе окисления концентрата руды Кючусского месторождения в условиях переменного температурного режима

Исследовали состав сообщества микроорганизмов, сформировавшегося в процессе окисления концентрата руды месторождения Кючус, содержащей пирит, арсенопирит и антимонит. Процесс проводили в лабораторной установке из 4-х последовательно соединенных реакторов в условиях переменного температурного режима (35°С в первых двух реакторах и 40°С - в третьем и четвертом) при рН 1.6—1.7 в течение 120 часов. Концентрация ионов Ре3+ в пульпе третьего реактора (96 ч) достигала 10.5 г/л, а в четвертом (120 ч) — 12.2 г/л. Ионы Ре2+ присутствовали только в первом реакторе (0.3 г/л), что свидетельствовало о высокой окислительной активности сообщества микроорганизмов. Об окислении арсенопирита судили по содержанию общего мышьяка, а также трех- и пятивалентного Аб в жидкой фазе пульпы. В первом реакторе концентрация общего мышьяка составила 1.95 г/л, в третьем— 2.99 г/л. Уже во втором реакторе (72 ч) практически весь мышьяк был окислен до пятивалентного.

Численность микроорганизмов в жидкой фазе пульпы на протяжении всего процесса была высокой, 10® кл/мл.

Основным критерием, характеризующим эффективность процесса микробного окисления концентрата, является степень окисления сульфидных минералов. При продолжительности процесса 120 час в 4-м реакторе степень окисления арсенопирита достигала 99.7%, пирита - 89.5%, антимонита - 63.6%, степень извлечения золота -94.6%. Эти результаты свидетельствовали о высокой скорости окислительных процессов.

Состав сообщества. Из сообщества АХМ было выделено три чистых культуры. Нуклеотидная последовательность штамма Kuch 1 (JX966410) имела 99.8% сходства с последовательностью типового штамма Sb. thermotolerans Кг1т, что свидетельствовало о принадлежности штамма Kuch 1 к этому виду; штамм Kuch 2 (JX966411) принадлежал к виду L. ferriphilum (сходство с последовательностью типового штамма вида L. ferriphilum АТСС 49881х - 98.2%); Kuch 3 (JX966412) принадлежал к виду Fp. acidiphilum (сходство с последовательностью типового штамма вида Fp. acidiphilum Y1T —99.9%).

Состав сообщества микроорганизмов был также исследован методом создания и анализа библиотек клонов генов 16S рРНК представителей доменов Bacteria и Archaea. Последовательности бактериальных клонов (65 независимых клонов) разделились на 2 группы. 33 клона принадлежали к виду L. ferriphilum (рис. 4). Остальные последовательности 32 клонов принадлежали к различным видам рода Sulfobacillus: Sb. thermosulfidooxidans (18 клонов), Sb. benefaciens (2 клона) и Sb. thermotolerans (12 клонов) (рис. 5). Все клонированные последовательности архей (37 независимых клонов) принадлежали к виду Fp. acidiphilum.

Таким образом, применение молекулярно-биологических методов позволило выявить в составе сообщества большее разнообразие микроорганизмов, чем использование культуральных методов. Интересным является обнаружение сразу трех видов рода Sulfobacillus, которые сложно выявить из сообщества с помощью культуральных методов, так как виды этого рода обладают близкими физиологическими свойствами и плохо поддаются культивированию на плотных средах.

2.2.2 Влияние минералогического состава концентрата руды на состав сообщества АХМ, участвующего в процессе его биоокисления

Сообщество микроорганизмов, сформировавшееся в процессе окисления концентрата руды месторождения Кючус, было использовано в качестве инокулята в процессе биоокисления концентрата пирротин содержащей пиритно-арсенопиритной руды Олимпиадинского месторождения. Процесс проводили в течение 30 сут при 40°С, рН пульпы поддерживали на уровне 1.60-1.75. Для определения филогенетического разнообразия сформировавшегося сообщества микроорганизмов были созданы библиотеки клонов генов 16S рРНК представителей доменов Bacteria и Archaea — 62 и 40 клонов соответственно.

Leptcspirillum lerriphilum ATCC 49881 (AF356829)

Leptospirillum feniphilum P3a (NR_028818)

. Leptospirillum sp. RT (EU372650)

_ Leptospirillum sp. isolate LA (AJ237902)

98 Leptospirillum sp. DSM 2391 (AJ237903)

L Leptospirillum sp. BGR 44 (GU167989)

Kuchus gone Consensus Group (33 clones)

OIKuch Clone Consensus Group (48 clones)

_ Leptospirillum ferrooxidans DSM 2705 (X86776)

_ Nitrospira moscoviensis NSP M-1T (NR_029287)

Рис. 4. Дендрограмма нуклеотидных последовательностей генов 16Б рРНК бактерий рода ЬерЮзр1гИ1ит, показывающая филогенетическое положение полученных консенсусных филотипов из библиотек клонов. Здесь и на рисунке 5 последовательности, относящиеся к сообществу, проводившему процесс окисления концентрата руды месторождения Кючус, обозначены индексом КисЬ; относящиеся к сообществу, проводившему процесс окисления концентрата руды Олимпиадинского — 01КисЬ. В качестве «О1^гоир» использована последовательность 16Б рРНК типового штамма N Иг охр ¡га moscoviensis М-1т.

Клонированные последовательности бактерий принадлежали к трем филотипам: Ь. /егпрИНит (48 клонов) (рис. 4), БЬ. 1Ьегтози!/н1оох1с1апх (13 клонов), БЬ. 1кегто1о1егат (1 клон) (рис. 5). Все архейные последовательности принадлежали виду /•р. ас'кИрЫЫт (99.9% сходства с геном 16Б рРНК типового штамма).

Таким образом, в процессе окисления субстрата с другими минералогическими характеристиками произошло изменение видового состава сообщества микроорганизмов (отсутствие вида БЬ. Ьепе/аЫепя) и изменение соотношений между разными видами.

2.3.Состав накопительных культур, выделенных из природных субстратов с различным минеральным составом

Для получения накопительных культур аборигенных умеренно термофильных микроорганизмов из руды месторождения Шануч использовали пробу окисленной медно-никелевой руды, отобранной из отвала, находящегося под открытым небом в течение 10 лет, и флотационный концентрат сульфидной руды. Минеральные субстраты помещали в колбы со средой 9 К8, дополненной элементной серой (10 г/л), и инкубировали при 45°С. При молекулярно-биологическом исследовании полученных накопительных культур было показано, что в каждой из них присутствует только по одной последовательности, принадлежащей к виду БЬ. 1Иегтози1/1^ох1Ыапз (БЬЮ-! (1Ы180088) и 8И10-2 (Ж180089)). По результатам секвенирования гена 16Э

рРНК была показана филогенетическая идентичность выделенных штаммов между собой (рис. 5).

В тех же условиях была получена накопительная культура из пробы пиритной руды Попутнинского месторождения. В накопительной культуре так же, как и в предыдущем случае, показано наличие только последовательности, относящейся к 56. 1кегто$иЩоохк1ат (РориНО (Ж 180090)) (рис. 5).

виМасШа МегтозиШасМапэ \ЖМ В-1269Т (АВ089844) -ЯЬ. Мегто5иШ<юхШп* НТ-4 (GU180244.11

-Sb thermosulfidooxIdansPooutW (JN1800901

Sb thermosulfidooxidans Sh10-1 (JN1800881= Sh10-2 (JN180089)

OlKuch Clone Consensus Groupl (13 clones)

Sb. thermosulfidooxidans G2 (AY140233)

_Sb. thermosulfidooxidans BC1 (U75648)

Kuch Clone 01

Sb. thermosulfidooxidans DK_J16_45 (EU419197) Sö. thermosulfidooxidans N19-5001 (EU499919) Kuch Clone Consensus Groupl (17 dones)

I— Sil. thermosulfidooxidans AT-1 (X91080) Sulfobacillus sibiricus N1T (AY079150) - Kuch Clone 05 i— Kuch clone 04 OlKuch clone 01

Kuch Clone Consensus Group2 (10 clonesl Sulfobacillus thermotolerans Kr1T (DQ124681) — Kuch clone 02 Sb. benefaciens TVK8 (EU099988) Sulfobacillus benefaciens BRGM2T (EF679212) Kuch clone 03

Г—

Mf

87 T.S

Sb. benefaciens MT606 (EU495236)

. Sulfobacillus acidophilus DSM 10332T (AB089842) 100 I-Sb. acidophilus Sa (FJ154517)

Рис. 5. Суммирующая дендрограмма последовательностей генов 16S рРНК бактерий рода Sulfobacillus, показывающая филогенетическое положение полученных консенсусных филотипов из библиотек клонов и штаммов, выделенные из накопительных культур. Последовательности, выделенные из накопительных культур из руд месторождения Шануч, - Sb. thermosulfidooxidans ShlO-1 и Sb. thermosulfidooxidans ShlO-2; последовательность, выделенныя из накопительной культуры из руды Попутнинского месторождения, - Sb. thermosulfidooxidans PoputlO. В качестве «outgroup» использована последовательность гена 16S рРНК типового штамма Alicyclobacillus disulfidooxidans DSM 12064.

2.4 Окисление сульфидных минералов сообществами умеренно термофильных и термотолерантных АХМ

Из представленных в разделах 2.1-2.3 результатов видно, что минералогические особенности субстрата окисления влияют на видовой и штаммовый состав сообществ термоацидофильных микроорганизмов.

Была проведена серия опытов по выяснению зависимости скорости окисления минералов пирита, пирротина и арсенопирита сообществами АХМ от их присутствия в субстрате, при окислении которого сообщества были сформированы. Состав минеральных субстратов и обозначения разных сообществ микроорганизмов приведены в таблице 3.

Таблица 3. Состав сообществ АХМ, их обозначение и состав минеральных субстратов, использованных для биоокисления

Минеральный субстрат, на котором сформировалось сообщество Состав минерального субстрата Состав сообщества микроорганизмов Обозначение вариантов опыта

Концентрат руды Олимпиадинского месторождения Пирротин, пирит, арсенопирит, антимонит Sb.thermosulfidooxidans НТ-1, Sb.thermosulfidooxidans НТ-3 1 (в среду добавлено 0.02% ДЭ) 2

Acf. thiooxidans Aí. ferrooxidans OLIO-Ol, L. ferriphilum OL10-02, Sb.thermosulfidooxidans OL10-03, Fp. acidiphilum OL10-04, Alb. tolerans OL10-05, Ac. cryptum OL10-06 3

Концентрат руды месторождения Шануч Пирротин, пентландит, бравоит Sb.thermosulfidooxidans ShlO-1 4

Концентрат руды месторождения Кючус Пирит, арсенопирит, антимонит L. ferriphilum Kuch 2, Sb. thermosulfidooxidans, Sb. thermotolerans Kuch 1, Sb. benefaciens, Fp. acidiphilum Kuch 3 5

Окисленная руда месторождения Шануч Оксидные минералы железа, пентландит, халькопирит Sb.thermosulfidooxidans Shi0-2 6

Руда Попутнинского месторождения Пирит, кварц, слюда Sb.thermosulfidooxidans PoputlO 7

При окислении чистых минералов семью сообществами микроорганизмов были проанализированы следующие параметры процесса: рН, ЕЬ, концентрация ионов двух- и трехвалентного железа, численность клеток.

На рисунке 6 представлены концентрации Ре3+ и численности клеток в процессе окисления пирита. Наибольшие концентрация Ре3+ и число клеток были в среде в опыте с сообществом микроорганизмов из Кючусского концентрата (5), содержащего пирит. В опыте с сообществом микроорганизмов из руды Попутнинского месторождения (7), также содержащей пирит, и концентрация Ре3+, и численность клеток в культуральной жидкости были меньше по сравнению с другими вариантами опыта. Согласно ранее полученным результатам [Тупикина и др., 2009 а,б] по зависимости скорости окисления пиритов разными штаммами АХМ от их физико-химических свойств можно предположить, что пирит в составе Кючусского концентрата был близок к использованному в опыте пириту, в отличие от пирита в составе Попутнинской руды. Высокая скорость окисления пирита сообществами микроорганизмов, выделенными из субстратов, его не содержащих (4, 6), свидетельствуют об их высокой скорости адаптации к новому субстрату.

При окислении пирротина (рис. 7) наибольшую скорость накопления в жидкой фазе Ре3+ наблюдали в вариантах 1, 4 и 6 с сообществами, выделенными при окислении пирротинсодержащих субстратов. Сообщество 1 сразу начало окислять пирротин, тогда как сообществам 4 и 6 потребовался период адаптации, о чем свидетельствовала лаг-фаза. Сообщество 5 после 6-сут лаг-фазы также начало окислять пирротин. Эти результаты подтвердили высказанное предположение о роли в окислении чистых минералов сообществами АХМ как их сходства с аналогичными минералами, присутствующими в субстрате, при окислении которых сообщества были выделены, так и от скорости адаптации к новому субстрату.

Арсенопирит - один из наиболее легко окисляемых микроорганизмами сульфидных минералов. Поэтому даже микроорганизмы, выделенные из субстратов, его не содержащих, после непродолжительной лаг-фазы начали его окислять. В отличие от пирротина и пирита, в экспериментах с арсенопиритом не наблюдали значительных отличий в динамике параметров процесса его окисления разными сообществами.

Таким образом, скорость окисления сульфидных минералов микробными сообществами зависит от сходства их свойств с минералами, присутствующими в субстрате, при окислении которого формировались эти сообщества. Скорость окисления сульфидных минералов может также зависеть от скорости адаптации микроорганизмов к новым энергетическим субстратам.

А

2,5

1,5

0,5

^^

/ ¡х^4 /гт

/ / Г// > ^4.1

Ж-У/ V л у ?—7

10

Время, сут

15

20

Рис. 6. Изменение концентрации Ре3+ (А) и численности клеток микроорганизмов (Б) в процессе окисления пирита. Обозначения вариантов опыта 1-7 приведены в таблице 3.

Рис. 7. Изменение концентрации Ре3+ (А) и численности клеток микроорганизмов (Б) в процессе окисления пирротина. Обозначения вариантов опыта 1-7 приведены в таблице 3.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение видового и штаммового разнообразия сообществ умеренно термофильных и термотолерантных АХМ, играющих ключевую роль в окислении сульфидных минералов в биогеотехнологических процессах, представляет не только теоретический интерес, но и одну из задач в решении проблемы повышения скорости и эффективности извлечения цветных и благородных металлов из сульфидных руд и концентратов. Данные о влиянии факторов среды на состав сообществ АХМ в техногенных экотопах, а также о динамике формирования сообществ позволяют выработать эффективную стратегию проведения лабораторных исследований процессов биокисления сульфидного сырья и внедрения полученных результатов в промышленность.

В настоящем исследовании был применен комплексный подход для изучения состава сообществ умеренно термофильных и термотолерантных АХМ. Эффективный молекулярно-биологический метод создания и анализа библиотек клонов генов 16S рРНК позволил выявить доминирующие в сообществах виды, даже если их выделение в чистые культуры было затруднительно. Однако данный метод не учитывал такой важный для процессов биовыщелачивания фактор как штаммовый полиморфизм видов АХМ. Поэтому для полной характеристики роли конкретного штамма в сообществе важно не только определение его видовой принадлежности, но и исследование физиологии. Сочетание культуральных и молекулярно-биологических методов позволило наиболее полно определить состав исследуемых сообществ.

В результате проведенных исследований был выявлен ряд закономерностей формирования сообществ умеренно термофильных и термотолерантных АХМ. На примере концентрата руды Олимпиадинского месторождения показано, что при изменениях технологических условий процесса биоокисления концентрата сульфидной руды происходят адаптивные изменения в составе микробного сообщества. При повышении температуры с 40° до 50°С наблюдалась смена доминирующих микроорганизмов Aft). thiooxidans, L. ferriphilum и Fp. acidiphilum на штаммы Sb. thermosidfidooxidans HT-1 иНТ-3.

Существенным фактором, влияющим на состав микробного сообщества, является изменение состава минерального субстрата. При введении в технологическую схему процесса биоокисления сульфидного концентрата этапа предварительной обработки концентрата (при 80°С) культуральной жидкостью, содержащей ионы Fe3+, которая приводит к изменению минералогического состава субстрата, наблюдали смену состава микробного сообщества. В сформировавшемся сообществе доминировал штамм Sb. thermosulfidooxidans НТ-4.

Сравнительный анализ физиологических свойств штаммов Sb. thermosulfidooxidans, доминирующих в процессах окисления концентрата руды Олимпиадинского месторождения в различных условиях, показал их отличия по ряду свойств: оптимальным и предельным значениям температуры и рН для роста, способности окислять разные энергетические субстраты в авто-, миксо- или

гетеротрофных условиях. Таким образом, физиологические различия позволяют штаммам одного вида доминировать в сообществах при изменении состава энергетических субстратов и характеристик процесса их биоокисления.

С использованием метода анализа библиотек клонов генов 16S рРНК выявлены изменения в сообществе термоацидофильных микроорганизмов при смене окисляемых субстратов, как на уровне изменения видового состава сообщества, так и соотношения между представителями различных видов. Так как на одном месторождении встречаются зоны, содержащие руды различного минералогического и химического составов, следует учитывать, что при окислении концентратов, полученных из руды текущей добычи, будут происходить адаптивные изменения в составе микробного сообщества.

Сообщества термоацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов отличаются скоростью окисления сульфидных минералов (пирита, пирротина, арсенопирита) в качестве единственных источников энергии. Эта скорость зависит как от сходства их физико-химических свойств со свойствами минералов, входящих в состав окисляемого субстрата, на котором сформировалось данное сообщество, так и от скорости адаптации к новому субстрату.

Таким образом, комплексные фундаментальные исследования сообществ умеренно термофильных и термотолерантных АХМ дают информацию, полезную при проведении прикладных исследований в области биоокисления сульфидных минералов.

4. ВЫВОДЫ

1. С использованием культуральных и молекулярно-биологических методов определен состав сообществ умеренно термофильных и термотолерантных ацидофильных хемолитотрофов, сформировавшихся в техногенных местах обитания, и установлено, что только сочетание методов позволяет наиболее полно определить состав исследуемых сообществ. Культуральные методы исследований выявили в сообществе из пульпы реакторов Олимпиадинской фабрики большее разнообразие микроорганизмов (Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferriphilum, Sulfobacillus îhermosulfidooxidans, Ferroplasma acidiphilum, Alicyclobacillus tolerans и Acidiphilium cryptum), чем анализ библиотек клонов генов 16S рРНК (Acidiferrobacter thiooxydans, Leptospirillum ferriphilum и Ferroplasma acidiphilum). При этом молекулярно-биологический метод позволил выявить один из доминирующих видов микроорганизмов, не выделенный в чистую культуру {Acidiferrobacter thiooxydans).

2. На видовой состав сообществ умеренно термофильных и термотолерантных ацидофильных хемолитотрофов влияют как изменение температуры процесса биоокисления (повышение температуры с 40 до 50°С привело к смене доминировавших видов Acidiferrobacter thiooxydans, Leptospirillum ferriphilum и Ferroplasma acidiphilum на штаммы Sulfobacillus îhermosulfidooxidans HT-1, HT-3), так и высокотемпературная обработка культуральной жидкостью, содержащей ионы

трехвалентного железа (введение в процесс стадии предварительной высокотемпературной химической обработки привело к смене доминировавших видов Ас1(И/еггоЬас1ег Моохуйат, ЬерШрггШит /егпрИИит и Ре.ггор\а$та ас'кИрИИит на Би1/оЬасШиз 1Иегто.,ш1/11{оох1с1ап$ НТ-4).

3. При изменении минералогического и химического состава окисляемого минерального субстрата происходят адаптационные изменения в составе микробного сообщества: при переключении процесса с окисления пирит-арсенопиритного концентрата месторождения Кючус на окисление пирротин содержащего пирит-арсенопиритного концентрата Олимпиадинского месторождения произошло вытеснение минорных видов сообщества и изменения в соотношении между доминирующими видами. Так, доля клонов, относившихся к роду ЬерШр1гИ1ит, в сообществе, окислявшем концентрат руды Кючусского месторождения, составляла примерно 50% от общего числа бактериальных клонов, тогда как в процессе биоокисления концентрата руды Олимпиадинского месторождения - 77%. В то же время доля клонов, относившихся к роду бактерий 8и1/оЬасШи$, при изменении состава минерального субстрата снизилась с 50% до 23%. При этом после смены субстрата исчезли клоны, относящиеся к виду Би1/оЬасШиз Ьепе/аает, а доля клонов, относившихся к виду Би1/оЪасШиз (ИегтоЫегапз, составлявшая значительную часть от общего числа клонов рода БиЦоЬасШиз (12 из 32 клонов), стала минорной (1 клон из 14).

4. Показано, что штаммы умеренно термофильной спорообразующей бактерии вида БиуЪЬасШиз и1егто$и1Ас1оох'1с1ап5 присутствовали во всех исследованных сообществах и накопительных культурах, выделенных из техногенных и природных мест обитания. Штаммы 8и1/оЬасШш 1Иегто$и1/1с1оох'1с1ап$ НТ-1, НТ-3, НТ-4, НТ-5, выделенные из микробных сообществ, сформировавшихся в процессах окисления концентрата Олимпиадинской руды в разных условиях, отличаются физиологическими свойствами: способностью окислять разные энергетические субстраты в авто- миксо- или гетеротрофных условиях, оптимальными значениями рН и температуры для роста и окисления энергетических субстратов.

5. Сообщества термоацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов отличаются скоростью окисления сульфидных минералов (пирита, пирротина, арсенопирита) в качестве единственных источников энергии. Эта скорость зависит как от сходства их физико-химических свойств со свойствами минералов, входящих в состав окисляемого субстрата, на котором сформировалось данное сообщество, так и от скорости адаптации к новому субстрату.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи

1. Муравьев М.И., Пивоварова Т.А., Турова Т.П., Булаев А.Г.. Фомченко Н.В., Кондратьева Т.Ф. Идентификация бактерии, доминирующей в двухстадийном процессе биоокисления золотомышьякового концентрата // Микробиология. 2010. Т. 79. №3. С. 360-367.

2. Заулочный П.П., Булаев А.Г., Савари Е.Е., Пивоварова Т.А., Кондратьева Т.Ф., Седельникова Г.В. Двухстадийный процесс бактериально-химического окисления упорного пиритно-арсенопиритного золотосодержащего концентрата // Биотехнология. 2011. № 3. С. 40^9.

3. Булаев А.Г., Пивоварова Т.А., Меламуд B.C., Цаплина И.А., Журавлева А.Е., Кондратьева Т.Ф. Полиморфизм штаммов Sulfobacillus thermosulfidooxidans, доминирующих в процессах высокотемпературного окисления золотомышьякового концентрата // Микробиология. 2011. Т. 80. № 3. С. 320-328.

4. Булаев А.Г.. Пивоварова Т.А., Меламуд B.C., Бумажкин Б.К., Патутина Е.О., Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б., Кондратьева Т.Ф. Видовой состав ассоциации ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, участвующих в процессе окисления концентрата золотомышьяковой руды // Микробиология. 2011. Т. 80. № 6. С. 854-861.

5. Кондратьева Т.Ф., Пивоварова Т.А., Цаплина И.А., Фомченко Н.В., Журавлева

A.Е., Муравьев М.И., Меламуд B.C., Булаев А.Г. Разнообразие сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов в природных и техногенных экосистемах. Обзор // Микробиология. 2012. Т. 81. № 1. С. 3-28.

6. Булаев А.Г.. Пивоварова Т.А., Меламуд B.C., Бумажкин Б.К., Патутина Е.О., Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б., Кондратьева Т.Ф. Изменение видового состава термотолерантного сообщества ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов при переключении на окисление нового энергетического субстрата // Микробиология. 2012. Т. 81. №4. С. 428-433.

7. Булаев А.Г., Пивоварова Т.А., Кузнецов Б.Б., Колганова Т.В., Кондратьева Т.Ф. Скорость окисления сульфидных минералов сообществами ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов из разных мест обитания // Микробиология. 2012. Т. 81. № 4. С. 434-442.

Тезисы конференций

1. Пивоварова Т.А., Цаплина И.А., Журавлева А.Е., Меламуд B.C., Булаев А.Г., Кондратьева Т.Ф. Видовое и штаммовое разнообразие бактерий рода Sulfobacillus и их участие в процессах бактериально-химического окисления пиритно-арсенопиритных концентратов // Сборник тезисов 5-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Ч. 2. Москва. 2009. С. 326-327.

2. Кондратьева Т.Ф., Пивоварова Т.А., Цаплина И.А., Фомченко Н.В., Меламуд

B.C., Журавлева А.Е., Муравьев М.И., Булаев А.Г.. Белый A.B. Изучение ассоциации

аборигенных штаммов умеренно термофильных сульфобацилл и перспективы в биогидрометаллургии // Материалы Республиканской научной конференции «Проблемы современной микробиологии и биотехнологии». Ташкент. 2009. С. 27-28.

3. Кондратьева Т.Ф., Пивоварова Т.А., Цаплина И.А., Меламуд B.C., Журавлева А.Е., Булаев А .Г. Штаммовый полиморфизм как проявление микроэволюционных процессов в ассоциациях ацидофильных микроорганизмов // Материалы VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск. 2010. С. 46^18.

4. Булаев А.Г.. Пивоварова Т.А., Кондратьева Т.Ф. Изменение видового и штаммового состава ассоциации микроорганизмов в процессе биоокисления концентратов сульфидной руды // Материалы VI Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва. 2010. С. 94-96.

5. Булаев А.Г.. Пивоварова Т.А., Кондратьева Т.Ф. Изучение состава ассоциации ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, осуществляющей процесс окисления упорного концентрата золотомышьяковой руды // Материалы 4-го Научного симпозиума «Автотрофные микроорганизмы». Москва. 2010. С. 27.

6. Кондратьева Т.Ф., Пивоварова Т.А., Цаплина И.А., Фомченко Н.В., Журавлева А.Е., Муравьев М.И., Булаев А .Г., Меламуд B.C. Регуляция генетического разнообразия сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов в биотехнологиях минерального сырья // Сборник тезисов 6-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Ч. 2. Москва. 2011. С. 297-298.

7. Булаев А.Г.. Пивоварова Т.А., Кузнецов Б.Б., Кондратьева Т.Ф. Состав сообществ умеренно термофильных ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов техногенных экониш // Сборник тезисов 6-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Ч. 2. Москва. 2011. С. 323-324.

8. Кондратьева Т.Ф., Пивоварова Т.А., Цаплина И.А., Журавлева А.Е., Булаев А.Г. Гетерогенность сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов в биогидрометаллургических технологиях окисления концентратов упорных золотосодержащих сульфидных руд // Материалы международного совещания «Новые технологии обогащения и комплексной переработки труднообогатимого природного и техногенного минерального сырья». Верхняя Пышма. 2011. С. 341-345.

Подписано в печать 06.02.2013 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1637. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96