Анаэробные термоацидофильные микробные сообщества

Прокофьева, Мария Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анаэробные термоацидофильные микробные сообщества
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анаэробные термоацидофильные микробные сообщества"

Российская академия наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского

На правах рукописи

ПРОКОФЬЕВА Мария Игоревна

АНАЭРОБНЫЕ ТЕРМОАЦИДОФИЛЬНЫЕ МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА

Специальность 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Е.А. Бонч-Осмоловская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.М. Горленко

доктор биологических наук М.Б. Ванштейн

Ведущая организация: кафедра микробиологии Московского

государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится " Ч " декабря 2006 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, пр. 60-летия Октября, д.7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан "Д ' ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Термоацидофильные сообщества вулканических гидротерм давно привлекают внимание исследователей из-за воздействия на микроорганизмы сразу двух экстремальных факторов — высокой температуры и низкого значения pH. Из кислых гидротерм, расположенных в различных географических зонах, разными авторами были выделены термоацидофильные бактерии и археи, однако полного представления о микробных термоацидофильных сообществах нет.

Особый интерес к термоацидофилам обуславливается возможностью их промышленного использования. Внеклеточные ферменты термоацидо-филов ценны для ряда производственных процессов, идущих при высоких температурах и низких значениях pH, например, для переработки крахмала и целлюлозы. Экстремофильность микроорганизма или фермента обуславливает и общую его стабильность. В высокотемпературных процессах (и процессах с низкой кислотностью) снижается риск микробного загрязнения; очистка ферментов, клонированных в мезофильные клетки, упрощается благодаря процедуре температурного (и pH) шока, денатурирующего остальные белки клетки-хозяина (Vieille and Zeikus, 2001; Bertoldo et al., 2004).

Анаэробные процессы, осуществляемые известными термоацидофильными прокариотами, ограничиваются автотрофной фиксацией углерода в биомассу, литотрофным и органотрофным восстановлением элементной серы и некоторых серных соединений, а также окислением Сахаров, полисахаридов и пептидов. Процессы, идущие непосредственно в термоацидофильных сообществах, не изучались. Поэтому одним из направлений данной работы было определение с помощью радиоизотопных методов скорости процессов, идущих в горячих кислых источниках.

На момент начала этой работы группа анаэробных термоацидофильных органотрофных прокариот была крайне малочисленной и состояла только из представителей факультативно анаэробного рода Thermoplasma (Johnson, 1998). В последующие годы было описано еще несколько новых родов этой группы (Itoh et al., 1998, 1999, 2002, 2003), и в результате группа расширилась. Однако облигатно анаэробные термоацидофилы были представлены лишь одной археей — литотрофным Stigiolobus azoricus (Segerer et al., 1991). Поэтому исследования в рамках данной работы были сфокусированы на поиске новых анаэробных термоацидофилов, в том числе органотрофных.

Способность к брожению не известна среди мезофильных ацидофи-лов; нейтрофильные мезофилы чаще всего прекращают брожение при pH

около 4.0, и лишь единичные нейтрофилы способны осуществлять брожение при более низких рН, например Багета уеМпсиН (Сапа1е-Раго1а, 1986). Среди термофильных ацидофилов способность к брожению известна только у ТИегтор^та врр.; представители рода СаШмрИаега также способны расти в отсутствие внешних акцепторов электронов. Из-за столь малого количества организмов, способных к брожению в кислых условиях, актуален поиск других термоацидофилов-бродилыциков.

Пели и задачи исследования

Целью работы было изучение термоацидофильных микробных сообществ из природных местообитаний.

Задачи исследования состояли в следующем:

1. Определение микробной активности в континентальных горячих кислых источниках с помощью радиоизотопных методов.

2. Получение анаэробных термоацидофильных накопительных культур из континентальных горячих кислых источников и их филогенетический анализ.

3. Получение анаэробных термоацидофильных накопительных культур из глубоководных гидротермальных источников и их филогенетический анализ.

4. Выделение и характеристика термоацидофильных и термоацидо-толерантных микроорганизмов.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые с помощью радиоизотопных методов показана высокая активность микробиологических процессов цикла углерода в горячих кислых источниках. С помощью молекулярно-биологических и микробиологических методов исследовано разнообразие термоацидофильных прокариот в наземных и морских гидротермах.

Разработан метод приготовления твердых сред, устойчивых при высоких температурах и низких значениях рН.

Выделены и полностью охарактеризованы новые ацидофильные и ацидотолерантные термофильные микроорганизмы. Описан новый род термоацидофильных архей АсИНоЬш ёеп. поу., включающий 2 вида -АЫсЫоЬш асеИст 5р. поу. и 'АскШоЬш засскагохогат' ер. поу.; новый вид археи ' \ги1сат5ае1а тоШпоузИа' ер. поу.; а также новая термофильная бактерия 'ТЬегпюапаегоЬаМегтт а^оШегапя' ер. поу.

В анаэробных термоацидофильных накопительных и чистых культурах обнаружены новые морфотипы вирусоподобных частиц.

Полученные результаты расширяют представление о филогентиче-ском и фенотипическом разнообразии анаэробных микроорганизмов, населяющих горячие кислые источники. Кроме того, новые микроорганизмы,

обитающие при экстремальных значениях температуры и pH, могут являться потенциальными источниками новых ферментов, обладающих устойчивостью к этим параметрам среды и поэтому ценных для использования в производствах, требующих повышенных температур или низких значений pH среды.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Thermophiles 1998", "IXth International Congress of Bacteriology & Applied Microbiology" 1999, "Extremophiles 2000"; "Extremophiles 2002"; "1-st FEMS Congress of European Microbilogists", 2003; "2-nd FEMS Congress of European Microbilogists", 2006, а также на международной студенческой конференции "Ломоносов-99", 1999; школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии", 2000; Всероссийской молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии — 2005".

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано и сдано в печать 15 печатных работ (6 публикаций и 9 тезисов).

Место проведения работы

Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Филогенетический анализ накопительных культур был выполнен во время стажировки в лаборатории микробиологии Европейского Института моря Университета Западной Бретани (Брест, Франция) под научным руководством д-ра Кристиана Жантона и с участием сотрудника лаборатории Оливье Нерсессяна.

Определение состава Г+Ц пар в ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию выполнили к.б.н. А.М. Лысенко и к.б.н. H.A. Черных (ИНМИ РАН). Анализ последовательностей 16-S рДНК чистых культур выполнили к.б.н. Б.Б. Кузнецов, к.б.н. Т.В. Колганова (Центр Биоинженерии РАН) и к.б.н. Т.П. Турова (ИНМИ РАН). Электронную микроскопию накопительных и чистых культур проводили совместно с H.A. Кострикиной (ИНМИ РАН). Радиоизотопные исследования проводили совместно с И.И. Русановым и Н.В. Пименовым (ИНМИ РАН). Исследование метаболизма Acidilobus асе-ticus проводили совместно с д.б.н. М.Ю. Грабович, к.б.н. Д.А. Подкопае-вой и М.А. Арабцевой (кафедра физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского Государственного университета).

Автор приносит искреннюю благодарность всем упомянутым участникам работы, а также сотрудникам и аспирантам лаборатории гипертер-

мофильных микробных сообществ за поддержку и участие в этой работе. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за постоянное внимание и большую помощь в работе и обсуждении результатов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на ш страницах машинописного текста и включает 24 рисунка и 11 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 180 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили микробные сообщества горячих источников Камчатки (Долины гейзеров, Центрального, Западного, Северного, Оранжевого полей кальдеры Узон, а также Дачного термального участка возле вулкана Мутновский), Курильских островов (о. Кунашир, кальдера Головнина), Италии (сольфатарного поля Поццуолли), из глубоководных горячих источников Восточного Тихоокеанского поднятия 13°N. Континентальные источники характеризовались температурой 50-95°С, и рН 2.0-4.8. Флюид глубоководных гидротерм имел температуру 350°С, рН 3.5; пробы содержали внутреннюю часть гидротермальной постройки, соприкасавшейся с флюидом.

Определение активности лнтотрофных процессов и утилизации органических веществ в кислых горячих источниках. Скорость лито-трофного метаногенеза, ацетогенеза, ассимиляции неорганического углерода была измерена с использованием NaHl4C03 (вносили 0,55 мг с общей активностью 50 мкКи на 15 мл пробы). Скорость ацетокластического метаногенеза и окисление ацетата до COj измеряли с использованием Na-2-14С-ацетата, меченого по метальной группе (вносили 1.72 мг с общей активностью 10 мкКи на 10 мл пробы). Потенциальную скорость деструкции Сахаров проводили с помощью равномерно меченой С14-сахарозы (вносили 0.63 мкг с общей активностью 1 мкКи на 15 мл пробы). После инкубации в месте отбора проб в течение 24-х часов, образцы фиксировали КОН и по возвращению в лабораторию измеряли радиоактивность образовавшихся продуктов на жидкостном сцинтилляционном счетчике Rack-Beta 1219 (LKB, Швеция). Методика и схема экспериментов дана в соответствующих публикациях (Бонч-Осмоловская и др., 1999; Прокофьева и др., 2006; Pi-menov, Bonch-Osmolovskaya, 2006).

Культивирование анаэробных термоацидофильных прокариот

проводили на средах двух типов: пресной (А) и морской (В). Среда А имела следующий минеральный состав (г/л): по 0.33 каждой из солей MgCh*2H20, СаС12*6Н20, KCl, КН2Р04, NH4C1. Состав среды В (г/л): NaCl - 18, KCl - 3,25 , MgCl2*2H20 - 4.26, MgS04* 7H20 - 3.45, СаС12*6Н20 -0.15, NH4CI - 0.25, К2НРО4 - 0.15. Обе среды содержали 1 мл/л витаминов (Wolin et al., 1963), 1 мл/л микроэлементов (Кевбрин, Заварзин, 1992), дрожжевой экстракт 50-100 мг/л, а также различные субстраты роста (2 г/л) и акцепторы электронов (2 г/л, элементная сера 10 г/л). Среды готовили анаэробно, с кипячением и последующим охлаждением под током газа (С02 или смесь N2/C02 80:20), с добавлением резазурина (1 мг/л) и, в качестве восстановителя, Na2S*9H20 (700 мг/л). После восстановления среды pH доводили до нужного значения с помощью 6N HCl или H2S04, после чего также под током газа разливали среду по пробиркам или флаконам с герметично завинчивающимися крышками. Автоклавирование среды производили при 1.0 или 0.5 избыточных атмосферах.

Для получения колоний гипертермофильных ацидофилов была экспериментально разработана методика приготовления твердой среды. Стандартную среду (А) с растворимыми субстратами и добавлением MgS04 (0.5 г/л) анаэробно разливали под током С02 по 5 мл в плоские стеклянные флаконы фирмы Bélico объемом 90 мл с пробками из бутиловой резины и добавляли полимеризующий агент Gelrite (Merck, USA) в концентрации 1.2%. Колонии умеренно-ацидофильных умеренно-термофильных прокариот (pH 5.0 и 60°С) получали в агаровых столбиках, для чего стандартную среду анаэробно разливали в пенициллиновые флаконы с добавлением 1.5% агара.

Наблюдение за ростом и подсчет клеток проводили с помощью светового микроскопа МБИ-3 (Россия) с фазово-контрастным устройством. Тонкое строение клеток и морфологию фаговых частиц изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963), с использованием ультрамикротома LKB 3R и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol,Tokyo, Japan).

Концентрацию белка определяли по Лоури (Lowry et al., 1951).

Измерения концентрации продуктов микробного роста. Органические кислоты и спирты, а также газы определяли на газо-жидкостном хроматографе Chrom-5 (Чехия), согласно опубликованной методике (Prokofeva et al., 2005). Сероводород фиксировали в виде сульфида цинка и определяли колориметрически (Trueper, Schlegel, 1964), в модификации.

Проверка устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. Антибиотики канамицин А, полимиксин В, неомицин, хлорамфеникол добавляли в среду для культивирования в количестве 100 мг/мл, а пенициллин и стрептомицин — в количестве 500 мг/мл. Устойчивость антибиотиков к

термоацидофильным условиям проверяли по действию на ThiobacUlus fer-rooxidans VKM B-458 после предварительной инкубации среды с антибиотиком в течение 3 суток при 80°С и pH 2.5.

Геносистематические методы. Выделение ДНК проводили по общепринятым методикам (Marmur, 1961; Charbonnier et al., 1995). Определение содержания гуанина и цитозина в ДНК проводили с помощью кривых плавления (Герхардт и др., 1984).

Амплификацию генов 16 S рибосомальной РНК производили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических прямых бактериальных 8 F, 11-27 F и архейных 4F, A8F, 341 F праймеров и универсальных обратных праймеров 1407R, 1492R, 519R. ПЦР производили на термоциклере Robocycler Gradient 96 (Strategene, La Jolla, Calif).

Клонирование продуктов амплификации ДНК проводили по методике и с использованием набора реактивов "TOPO-cloning" (Invitrogen, Groningen, the Netherlands).

Рестриктацнонный анализ клонов состоял из этапа рестрикции эн-донуклеазами BST U1 (New England Biolabs) и Нае III (Promega), согласно прилагаемым инструкциям с последующим разделением продуктов рестрикции электрофорезом в агарозном геле и окрашиванием с помощью бромистого этидия. Для последующего определения нуклеотидной последовательности отбирали клоны с разными рестрикционными профилями.

Определение нуклеодидной последовательности клонов проводили с использованием Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech Amersham ref RPN2438) на автоматическом секвенаторе LI-COR 4000 (Sciencetec).

Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК чистых культур проводили по методу Сангера (Sanger et al. 1977) на секвенаторе SQ3 Sequencer (Hoefer, USA).

Филогенетическое положение клонов и изолятов определяли при сравнении с последовательностями, представлеными в базе данных GenBank, с использованием программы BLAST |bttp://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast] и CLUSTAL. X (Thompson et al. 1994). Филогенетические деревья были построены с помощью программ TREECONW (Van de Peer and De Wächter, 1994) и PHYLIP (Felsenstein, 1993).

Методы определения активности ферментов Acidilobus aceticus. Определение ферментативных активностей проводили в клеточных экстрактах. Клеточные экстракты приготовляли разрушением клеточной суспензии ультразвуком 22 кГц с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т при мощности 500 Вт в течение 3 мин на ледяной бане. Цито-плазматическую фракцию получали после центрифугирования при 9000g и температуре 4°С в течении 30 минут. Определение спектров поглощения

цитохромов и активности ферментов определяли спектрофотометрически на «СФ-26» или «Specord UV VIS» при температуре 72°С, общепринятыми методиками, как описано ранее (Veeger et al., 1996; Асатин, 1965; Chidren, Kenneth 1984; Bergmeyer et al., 1965; Романова, 1980; Hespell, Canale-Parola 1970).

2. Результаты исследования и их обсуждение

2.1. Определение активности термоацидофильных прокариот с помощью радиоизотопных методов.

Процессы анаэробного цикла углерода были исследованы в горячих кислых источниках Оранжевого поля кальдеры Узон, Камчатка, с температурами 60, 70, 80-85 °С и pH 2.1-3.7. Было установлено отсутствие метано-генеза и наличие ацетогенеза при pH 3.5 и температурах 60-85°С, причем интенсивность ацетогенеза с температурой возрастала (Рис. 1). Наиболее активная ассимиляция С02 была отмечена при 60°С, однако при 85°С также шел интенсивный процесс.

Рис. 1. Скорости анаэробных микробиологических I у^т к н процессов в горячих

Скорость, L-al ff^i I источниках Оранжевого

мкг С/л/сутки ' i ГШ ■ ■ поля с pH 3.5.

60 70

окисление ацетата ассимиляция углерода

ацетогенез

ацетокластический метаногенез литотрофный метаногенез

г. "с

Процесс окисления органического вещества исследовали с помощью равномерно меченой С14-сахарозы. Исходное содержание сахарозы в источниках не определяли, поэтому полученные данные характеризуют потенциальную активность процесса. В кислых горячих источниках процесс деструкции сахарозы оказался очень активным — за сутки до 43.5% от внесенного С14 было обнаружено в С02; при этом активность возрастала с

температурой (Рис. 2). Присутствие воздуха в газовой фазе экспериментальных флаконов не влияло на скорость деструкции сахарозы. Основным продуктом был СО2, образование ацетата составляло лишь доли процента от образовавшегося С02.

Температура(С) Рн-Условия

Рис. 2. Образование СОг из равномерно меченой 14С-сахарозы в источниках с рН 2.1-3.7, Т59-82°С.

Были исследованы пути трансформации меченого по метальной группе ацетата — важнейшего интермедиата процесса анаэробной деструкции органического вещества. В горячих кислых источниках образования метана из ацетата обнаружено не было. Окисление ацетата до СО^ было отмечено при всех температурах (Рис. 1).

Таким образом, результаты радиоизотопных опытов указывают на то, что в термоацидофильном сообществе активно функционирует большинство ключевых метаболических групп микроорганизмов, участвующих в анаэробном цикле углерода. Для выяснения роли различных акцепторов электрона в продукционных и деструкционных процессах было исследовано их восстановление лабораторными термоацидофильными сообществами.

2.2. Активность термоацидофильных прокариот при инкубации проб в лабораторных условиях.

Литотрофные процессы

Пробы из горячих кислых источников инкубировали в присутствии водорода и различных акцепторов электронов, а также с СО, при темпера-

туре и рН, соответствующих значениям in situ (рН 3.5-4.0, температура 50-85°С). Литотрофный метаногенез и анаэробное окисление СО зарегистрированы не были. Было обнаружено образование ацетата (до 15мМ за 7 суток) в присутствии водорода при рН 3.5.

Также были зарегистрированы термоацидофильные процессы лито-трофной серо- и сульфатредукции в присутствии водорода, причем оба они имели два температурных максимума — при 60 и при 80°С (до 16 мМ H2S за 7 дней в обоих случаях). Литотрофное восстановление окисного железа при рН 4.0 шло во всем интервале температур с оптимумом при 70°С - до 12 мМ Fe(II) за 7 суток. Образующийся темный осадок содержал значительные количества закисного железа, но магнитными свойствами не обладал.

Органотрофные процессы

При инкубации проб из континентальных источников при температуре и рН близким к значениям in situ (рН 2.0-4.5, температура 50-85°С) в анаэробных условиях наблюдали рост и сбраживание дрожжевого экстракта, крахмала, Сахаров. При температурах 50-60°С отмечено образование ацетата, этанола, Н2. При 80-85°С в большинстве случаев единственным продуктом брожения на всех органических субстратах без акцептора был ацетат; и в нескольких случаях образовывались также этанол и водород. При температуре 70°С рост и образование продуктов было незначительным. В присутствии тех же органических субстратов и серы наблюдался процесс сероредукции. Термоацидофильная сульфатредукция была зарегистрирована только в нескольких пробах на лактате, дрожжевом экстракте и сахарах при температурах 60 и 80-85°С и рН 3.5-4.0.

Микробный рост, сопровождавшийся обесцвечиванием среды, наблюдали с ацетатом, глицерином или дрожжевым экстрактом в качестве субстратов и Fe(IIl) (в виде цитрата железа) в качестве акцептора электронов, при 60, 70 и 90°С и рН 3.5. Образование Fe(II) составляло до 25 мМ за 7 суток инкубирования и было максимальным при 60°С с глицерином.

Таким образом, в лабораторных условиях удалось зарегистрировать несколько новых процессов, ранее не известных для термоацидофильных прокариот: литотрофный ацетогенез, сульфатредукцию, восстановление железа; впервые брожение органических субстратов наблюдали при 80-85°С и рН 2.5-4.0. Однако стабильные накопительные культуры анаэробных термоацидофильных прокариот удалось получить только на органических субстратах при температурах 60 и 80-85°С и рН 3.5-4.0. Эти лабораторные сообщества стали основными объектами дальнейшего исследования.

2.3. Устойчивые лабораторные сообщества термоацидофильных прокариот.

Из континентальных гидротерм Камчатки и Италии было получено 7 органотрофных культур, развивающихся анаэробно при температурах 50-60°С и рН 3.5-4.5. В трех из них доминировали микроорганизмы с клетками неправильной коккоидной формы (Рис. За). При росте на дрожжевом экстракте, крахмале и сахарах они образовывали ацетат (до 3 мМ) и П2. Элементная сера стимулировала рост этих микроорганизмов, восстанавливаясь до Н28 . Анализ библиотеки клонов генов 16 Б рРНК из этих культур показал, что микроорганизмы, содержащиеся в данных накопительных культурах, являются археями рода Т1гегтор1а$та.

Рис. 3. Органотрофные анаэробные накопительные культуры, рН 3.5-4.0, из континентальных источников: 60°С (а-б), 85°С (в); из глубоководных гидротерм: 60 °С (г-д), 85 °С (е). Окраска ФВК, маркер 1 мкм.

Четыре умеренно-термофильные органотрофные культуры, содержали морфологически однородные клетки палочковидной формы (Рис. 36). В первых пересевах урожай клеток при росте на среде с рН 3.0-3.5 достигал 5 х 108 клеток/мл менее чем за 24 часа. Анализ библиотеки клонов генов 16Б рРНК показал, что эти организмы являются бактериями рода ТИегтоап-аегоЬас1ег (рис. 4).

Clone 7И-Ь25

Isolate 711-75

Tr. ethanolicus ATCC 31550T, L09162 Tr. aceioeihylicus ATCC 33265T, L09163 Thermoanaerobacter sp. AB11 Ad, U51198 Tr. sulfurophilus L-64T, YI6940 Tr. wiegelii Rt8.BlT, Isolate 518-21

Tr. siderophilus SR4T, AF120479 Clone 711-M2

Tr. thermohydrosulfuricus 39E, X58350 Tr. thermohydrosulfuricus DSM 567T, L09161 Tr. kivui DSM 2030T, L09160 brockii subsp. lactiethylicus SEBR 5268T, U14330 brockii DSM 1457T, L09165 Tr. brockii subspfinii DSM 3389T, L09166

ETr. italicus DSM 9252т, АЯ50846 - Tr. ihermocopriae JT3-3T, L09167 Tr. mathranii A3T, Yl 1279 Tr. sulfurigignens' JW/SL8267, AF234164

E. Caldanaerobacter subterraneusLA6\T, AF195797 C. subterraneus subsp. yonseiensis KB1T, AF212925 С

С. subterraneus subsp. tengcongensis MB4T, Af209708

_J Tm. polysaccharolyticum DSM 13641T, (J40229* Tm. zeae ше12т, U75993 — Tm. xylanotylicum DSM 7097T, L09172 pi~l Tm. thermosulfurigenes 4BT, X58351

Tm. saccharolyticum DSM 7060T, L09169 Tm. aotearoense JW/SL-NZ613T, X93359

Tm acidotolerans' 761-119T Tm. thermosaccharolyticum ATCC 7956т, M59119

'Tm. bryanlii' mel9T, AY140670 .

Рис. 4. Филогенетическое положение новых бактериальных штаммов и клонов.

При 80-85°С подавляющее большинство термоацидофильных органо-трофных сообществ было представлено микроорганизмами с коккоидными клетками (Рис. Зв). Единственным продуктом брожения был ацетат (2-2.5 мМ). В присутствии серы образовывался Н25. Филогенетический анализ одного из таких сообществ показал, что микроорганизмы, доминирующие в нем, относятся к археям царства СгепагсИаео1а с ближайшим родственным организмом невалидированным 'СаШососсгк поЬопЬеШз' (90.8 % сходства по 16 8 рДНК, Рис. 5).

^СепагсЬаеит хутЬюхит, и51469

0.1

-Пегто/Нит репЛет ОБМ 2475т, Х14835

001— ' Уи1сап11ае1а тоШпоучШ' 768-28т

1_Г УикатааеШ Л.ИпЬиШ 1С-0171, ЛВ063630 —

— Уи1сат1ае1а хоитапа 1С-059Т, АВ063645 ТЬегторго1еиз 1епах М35966

-РугоЬасиЫт аегорИНит ОБМ 7523т, 1.07510

-СаШтгца тадшЬщеп.'их 1С-167Т, АВ013926

- ТИегтосЫтт тоЛенИиз ГСМ 10088т, АВ005296

1 СаШрИаега ¡артети 1С-154Т, АВ087499

Г АЫШ1оЬи.ч асеНсих 1904т

г 'СаМососст поЬопЬеш*1 КС 12, 085038 'А сиШоЬих $ассагоуогат' 345-15Т Г АсШ1оЬи$ ер, 722-67 |Г С1опе 405-аЗ I АсШИоЬих ер. 405-16 I—АсМИоЬиз $р. 124

С1опе 405-а1

—Н С1опе 405-а2

| 7'Легшое/«сы5 тапПтш Б2Т, Х99554

100 1-Аегоругит регпис К1т, 083259

_Г РутЬЬш].итап ББМ 11204т, Х99555

99 | | НурепИегтий Ьи!уПсиз Э5М 545бт, Х99553 РутоЛснит оссикит ОБМ 2709т, М21087 1§пеососсиз 151апЖсих Ко18Т, Х99562

ТЕГ1

1 ил '

Би1/орИоЬососсш гШщИ 05М 11193т, Х98064

йеЫ/ыгососсш тоЬШх 2161т, Х06188 ПегтпарИаега а^гецапх ОЙМ 11486т, Х99556 ХшрЬу1о11хгтш тагтиз ОБМ 3639т, Х99560 Б1ечег1а Иу^ощепорЬИа 4АВСТ, У07963

-МешИозрИаега ¡ес1и1а 1КО 155091,026491

■ АаЛапиз т/егпиз ОБМ 3191х, 085505 Би!/итрЬаега оИиакиети 1РО 15161т, 085507

— ЛИ/о/о*!« аМосаШгшз АТСС 33909т, 014876

•Ёр

100|_|-

891

Рис. 5. Филогенетическое положение новых архейных штаммов и клонов из континентальных кислых источников.

2.4. Лабораторные анаэробные термоацндофильные сообщества ш глубоководных гидротерм.

8 проб, содержавших внутреннюю часть гидротермальной постройки из глубоководных гидротерм, были использованы для засева анаэробно приготовленной морской среды с рН 3.5-4.0. В качестве субстратов использовали молекулярный водород, ацетат или смесь органических суб-

стратов (крахмал, мальтоза, пептон), без акцептора или с элементной серой.

Рост наблюдали только в присутствии серы, как при 60°С, так и при 80°С. При 80°С в культурах наблюдали только коккоидные клетки диаметром 0.6-2 мкм (Рис. Зг,е), а на 60°С - также короткие палочки 3-5 мкм длиной (Рис. Зд). При 80°С урожай клеток на смеси органических субстратов достигал 108 клеток/мл за 3 суток, образовывался Нгв (до 40 мМ), и ацетат (до 24 мМ). При 60°С рост и образование продуктов на этих же субстратах были слабее. Филогенетический анализ трех из этих лабораторных культур, выявил присутствие архей рода ТИегтососсиз.

2.5. Выделение термоацидофильных и -ацидотолерантных прокариот.

Из органотрофных культур с устойчивым ростом, полученных из континентальных и морских гидротерм, было выделено 3 штамма анаэробных бактерий и 12 штаммов архей.

2.5.1. Анаэробные термоацидофильные бактерии.

Т/гегтоапаегоЬасГепит ас1(1о1о1егат ер. поу.

Выделен из термального источника на Оранжевом поле, кальдера Узон, Камчатка.

Клетки представляют собой подвижные спорообразующие палочки 0.4 мкм шириной и 3-12 мкм длиной, с одним жгутиком (Рис. 6).

Рис. 6. Препараты целых клеток (окраска ФВК) и ультратонкие срезы (окраска уранилацетатом) Т. а^оЫегат 761-119т. Маркер 1 мкм.

Клеточная стенка граммположительного типа. Колонии дисковид-ные, около 2 мм в диаметре, белого цвета. Облигатный анаэроб. Умеренный термофил, растущий при 37-68°С с отпимумом 55°С. Умеренный аци-

дофил, растущий при рН 3.2-7.1 с оптимумом 5.7. Растет при концентрациях NaCl от 0 до 3%.

Глюкоза, мальтоза, галактоза, фруктоза, сахароза, ксилоза, рибоза, лактоза, арабиноза, крахмал, ксилан, сорбитол, желатин, альбумин, дрожжевой экстракт поддерживают рост. Глицерол, этанол, пируват и цитрат не используются. Продуктами брожения являются ацетат, этанол, Н2 и С02. Тиосульфат стимулирует рост и восстанавливается до S0. Сульфит незначительно ингибирует рост, восстанавливаясь до сульфида, при этом сильно повышая продукцию этанола и изменяя морфологию клеток.

Содержание Г+Ц пар в ДНК составляет 34 (+\- 0.5) мол. %.

Сходство по 16 S рДНК с другими видами рода составляет 86.5-97.8%. Единственный известный вид рода, способный расти при низких рН, Ther-moanaerobacterium aotearoense с рН мин. 3.8, рН опт. 5.2 (Liu et al., 1996), является одним из ближайших родственников штамма 761-119. ДНК-ДНК гибридизация между нашим штаммом и типовым штаммом Т. aotearoense составляет 33%.

Типовой штамм 761-119т (=DSM 16487, ВКМ В-2363).

Thermoanaerobacter sp., штамм 711-75

Выделен из грязевого озера с рН 3.8, Долина гейзеров, Камчатка.

Клетки представляют собой подвижные палочки длиной 3-10 мкм и шириной 0,4 мкм со жгутиками. Колонии белые, точечные, 1-2 мм в диаметре.

Облигатный анаэроб. Умеренный термофил: оптимальная температура роста 60°С. Умеренный ацидофил: рН минимум роста около 3.0, оптимум при рН 5.0-6.3.

Гетеротроф. Использует глюкозу, галактозу, лактозу, ксилозу, рибозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, сорбитол, пируват, дрожжевой экстракт в качестве субстратов роста, но не арабинозу, глицерин, этанол, цитрат. Продуктами роста являются ацетат, этанол, Н2 и С02. В присутствии Na2S2C>3 или S° образуется H2S.

По результатам анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамм 711-75 был отнесен к роду Thermoanaerobacter, где его ближайшим родственником является Thermoanaerobacter ethanolicus (98.9 % сходства, рис. 4).

Thermoanaerobacter sp., штамм 518-21 (= DSM 15493)

Выделен из глубоководного гидротермального источника Восточного Тихоокеанского поднятия, 13° N.

Клетки представляют собой подвижные палочки 0.6 х 3-6 мкм со жгутиками. Колонии размером 1.5 -2 мм в диаметре, конической формы.

Облигатный анаэроб. Умеренный термофил: диапозон роста 40-85°С, оптимум 60°С, рН диапазон 3.0-7.5, оптимум 5.9. Способен расти при концентрации NaCl до 7 %, с оптимумом 0-2.5 %.

Гетеротроф. Сахароза, мальтоза, галактоза, лактоза, ксилоза, фруктоза, глюкоза, крахмал, дрожжевой экстракт, пептон поддерживают рост. Во всех случаях дрожевой экстракт в количестве 40 мг/л требуется в качестве фактора роста. Продуктами брожения являются ацетат,'этанол, Н2 и С02. Тиосульфат значительно стимулирует рост, восстанавливаясь при этом до H2S. При росте на пептоне восстанавливает аморфный оксид Fe (III) до магнетита - более 10 мМ Fe (II).

По результатам анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамм 518-21 был отнесен к роду Thermoanaerobacter, ближайшим родственником оказался Т. siderophilus (сходство 99.3%, рис. 3).

Все выделенные бактерии оказались умеренно-термофильными и ацидотолерантными. У выделенных нами штаммов минимальный рН роста был около 3.0, в то время как для ранее известных представителей рода Thermoanaerobacterium он около 4.0 (Schink and Zeikus 1983; Liu et al., 1996; Cann et al., 2001), а для рода Thermoanaerobacter - около 4.5 (Kim et al., 2001). Таким образом, разделяя основные метаболические характеристики соответствующих родов, новые штаммы отличаются большей аци-дотолерантностью.

Штамм 518-21 является первым представителем ^оял Thermoanaerobacter, выделенным из глубоководных гидротерм. Минимальный рН роста близкородственного типового штамма Т. siderophilus, выделенного из континентального горячего источника Камчатки (Slobobkin et al., 1999) равен 4.8, в то время как штамм 518-21 способен расти при рН 3.0. Рост типового штамма ингибируется 4% NaCl, в то время как новый изолят способен расти при концентрации NaCl до 7%. По сравнению с другими представителями рода штамм 518-21 обладает не только большей ацидотолерантно-стью, но и большей солеустойчивостью. Таким образом, новый штамм Thermoanaerobacter обладает широкими диапазонами параметров роста, что позволяет ему приспосабливаться к меняющимся условиям глубоководных гидротерм.

2.5.2. Анаэробные термоацидофильные археи.

' Vulcanisaeta moutnovskia' sp. nov.

Выделена из континентального горячего источника термального поля возле вулкана Мутновский.

Клетки представляют собой тонкие длинные палочки с заостренными концами, размером 5.0 х 0.5 мкм. (Рис. 7а).

Растет при температурах от 60 до 102°С, с оптимумом 80-85°С, рН диапазон 3.9-6.0 с оптимумом 5.0-5.5. Строгий анаэроб. Гетеротроф. Рост поддерживается различными сахарами и полисахаридами, пептоном и дрожжевым экстрактом. Тиосульфат и элементная сера стимулирует рост, восстанавливаясь до H2S.

Содержание Г+Ц пар в ДНК составляет 50.6 (+/- 0.6) мол. %. Ближайшим родствеником является Vulcanisaeta distributa (Itoh et al. 2002), сходство по 16 S рДНК составляет 96.8 % (рис. 5). ДНК-ДНК гибридизация с Vulcanisaeta distributa составляет 28 мол.%, с Vulcanisaeta souniana - 33 мол. %. Типовой штамм 768-281 (=DSM 15532).

Рис. 7.' Vulcanisaeta moutnovskia' 768-28т (а), Acidilobus aceticus 1904т (б,в), 'Acidilobus saccharovorans' 345-15т (г). Препараты целых клеток (а,б,г) -окраска ФВК, ультротонкий срез (в) — окраска уранил ацетатом. Маркер 1 мкм.

Acidilobus gen. nov.

Клетки представляют собой неправильные кокки. Клеточная стенка состоит из S-слоя, прикрепленного к цитоплазматической мембране.

Архея. Гипертермофил. Ацидофил. Облигатный анаэроб. Органотроф. Пептиды и полисахариды используются в качестве источников энергии и углерода. Элементная сера стимулирует рост и восстанавливается до H2S.

Устойчив к антибиотикам. Типовой вид: Acidilobus aceticus.

Места обитания: континентальные горячие кислые источники.

Acidilobus aceticus sp. nov.

Клетки представляют собой неподвижные неправильные кокки 1-2 мкм в диаметре. Клеточная стенка состоит из S-слоя, прикрепленного к цитоплазматической мембране (Рис. 7 б, в). Растет при температурах 6092° С (оптимум 85°С) и рН 2.0-6.0 (оптимум 3.8). Строгий анаэроб. Гетеро-троф. Дрожжевой, мясной, соевый экстракты и крахмал используются как субстраты роста. Элементная сера стимулирует рост на дрожжевом экстракте, но не является необходимой для роста. Продуктами роста являются ацетат, и, в присутствии серы, H2S.

Устойчив к пенициллину, стрептомицину, хлорамфениколу.

Содержание Г+Ц пар в ДНК составляет 53.8 мол. %.

Типовой штамм 1904т (DSM 11585). Место выделения - сольфатарное поле возле вулкана Мутновский, Камчатка. Штаммы 1919, 1920, 124, 908, 912, 923, 949, выделенные из горячих кислых источников различных областей Камчатки, вероятно, также относятся к этому виду.

'Acidilobus saccharovorans' sp. nov.

Клетки представляют собой неправильные кокки 1-2 мкм с пучком жгутиков (Рис. 7г).

Растет в диапазоне температур от 60 до 90°С с оптимумом 80 - 85°С, оптимальный рН 3.5-4.0. Строгий анаэроб. Гетеротроф. Используют пептон, дрожжевой экстракт, крахмал, моно- и дисахариды. Элементная сера стимулирует рост на дрожжевом экстракте, но не является необходимой для роста. Продуктами роста являются ацетат, в присутствии серы - H2S. Сходство последовательности 16S рРНК с Acidilobus aceticus составляет 95.1-96.0 % (Рис. 5); ДНК-ДНК гибридизация 61 %. Содержание Г+Ц пар в ДНК 54.5 мол. %.

Типовой штамм 345-15т. Выделен из континентального горячего источника термального поля возле вулкана Мутновский, Камчатка. Штаммы 405-16, 722-67, выделенные из источников о. Кунашир (Курильские о-ва) и Камчатки также относятся к этому виду.

На момент описания рода Acidilobus наиболее близким к нему по филогенетическому положению был 'Caldococcus noboribetus, (Aoshima et al., 1997), не имеющий подробного фенотипического описания. Из валидно описанных, наиболее близким был нейтрофильный аэробный род

Aeropyrum (порядок Desulfurococcales) со сходством последовательностей нуклеотидов 16S рРНК 90.8%, представленный гипертермофильными аэробными нейтрофилами.

Позднее был описан род Caldisphaera (Itoh et al., 2003), представленный единственным видом С. lagunensis, который оказался близок к роду Acidilobus со сходством нуклеотидных последовательностей типовых видов родов 91.5-92.0%. При этом оба вида Acidilobus, С. lagunensis и iCaldococcus noboribetus' кластируются в единую группу с достаточно высоким значением показателя bootstrap-анализа (94%). Эти организмы обладают общими фенотипическими свойствами: имеют коккоидную форму и являются ацидофилами (оптимум рН 3.0-4.0), строгими анаэробами, экстремальными (С. lagunensis) или гипертермофилами (Acidilobus spp., 'Caldococcus noboribetus''), органотрофами, способными использовать серу в качестве акцептора электрона. К этой же группе относятся организмы, представленные природными клонами 16S рРНК в библиотеках, полученных из горячих кислых источников (данная работа; Patricia et al., 2006).

Помимо обособленного положения этой группы на филогенетическом дереве ее представители имеют общие сигнатуры в последовательности гена 16S рРНК и лишь несколько сигнатур, общих с представителями порядка Desulfurococcales. Учитывая наличие у членов группы 'Acidilobus' общих физиологических свойств, отличающих их от Desulfurococcales, мы предлагаем новое семейство ' Acidilobaceae, и новый порядок iAcidilobales\ Таксономическая дивергенция этой группы может быть связана с освоением другой экологической ниши — кислых источников.

'Acidilobales' order nov.

Клетки являются кокками размером 0.8-2 мкм в диаметре. Строгие анаэробы. Экстремальные термофилы или гипертермофилы. Ацидофилы. Органотрофы, способные использовать углеводы и пептиды в отсутствии акцепторов электронов. Способны восстанавливать серу в сероводород. Устойчивы к антибиотикам стрептомицину, хлорамфениколу. Содержание Г+Ц пар в ДНК 31-54.6 мол. %. Распространены в континентальных горячих кислых источниках.

iAcidilobaceaé' fam. nov.

Описание как для порядка. Типовой род Acidilobus (Prokofeva et al., 2000).

2.6. Исследование метаболизма Acidilobus aceticus.

Были изучены пути катаболического обмена новой термоацидофильной археи Acidilobus aceticus. При росте A. aceticus на дрожжевом экстракте была обнаружена протеолитическая активность, активность ами-нотрансфераз, а также активность ацетил-СоА-синтетазы и глутаматдегид-

рогеназы (Табл. 1). Активности гидрогеназы, лактатдегидрогеназы, алко-гольдегидрогеназы и аланиндегидрогеназы обнаружены не были.

Табл. 1. Активности ферментов АасШоЬш асейсж (нмоль/мин/мг белка) при росте на дрожжевом экстракте в присутствии серы и без нее.

Фермент Условия роста

Дрожжевой экстракт Дрожжевой экстракт +сера

Протеолитическая активность 1,0*±0,05 1,0*±0,07

Аспартатаминотрансфераза 40,0± 0,85 —

Аланинаминотрансфераза 45,0±1,15 —

Глутаматдегидрогеназа(НАДФ) 74,0±0,58 148,0±1,76

Пируваткарбоксилаза 112,0^2,01 —

Алкогольдегидрогеназа(НАД) 0,0 0,0

Лактатдегндрогеназа (НАД) 0,0 0,0

Гидрогеназа 0,0

Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ) 150,0±1,29 626,0±2,42

Малатдегидрогеназа(ЫАД) 140,0±1,03 260,0±2,04

Аконитатгидратаза — 684,0±3,01

Фумаратгидратаза 0,0 195,0±0,69

Сукцинатдегидрогеназа 0,0 102,0±0,43

Цитратлиаза 0,0 0,0

Ацетил-СоА-синтетаза (АДФ) 10,0±0,06 11,0±0,08

у.е./(час-мг белка);— активность фермента не определяли

Установлено, что в присутствии серы при росте на дрожжевом экстракте функционирует ЦТК (Табл. 1). Активность малатдегидрогеназы и изоцитратдегидрогеназы обнаружена также и при росте в отсутствии серы, что свидетельствует о конститутивной природе этих ферментов.

Наличие цитохрома Ь560 при росте на среде с серой позволяет предположить функционирование у ЛсгсШоЬш асеИсия электрон-транспортной цепи.

При росте на крахмале его гидролиз до глюкозы осуществляется с помощью а-амилазы. По наличию активности гексокиназы, глюкозо-6-фосфатизомеразы, 6-фосфофруктокиназы, фруктозобисфосфатальдолазы, ацетил-СоА-синтетазы (Табл. 2), и отсутствию активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы — ключевого фермента пути Энтнера-Дудорова и окислительного пентозофосфатного пути, можно заключить, что глюкоза окисляется по гликолитическому пути.

Табл. 2. Активность ферментов АсгсШоЬт асе Ист при росте на . крахмале._____

Фермент Активность ферментов, нмоль/(минмг белка)

А-амилаза 19,0±0,59

Гексокиназа (АДФ) 206,0±1,54

Глюкозо-6-фосфатизомераза 350,0±2,07

. 6-фосфофруктокиназа (АДФ) 34,0±2,00

Фрукгозобисфосфатальдолаза 70,0± 1,32

Ацетил-СоА синтетаза (АДФ) 16,0±0,57

Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ) 180,0±1,50

Малатдегидрогеназа (НАД) 73,0±0,68

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа 0,0

Рис. 8. Вирусоподобные частицы из накопительных культур 345 (а-ж), 502 (и) и чистой культуры 345-15 (з); свободные, прикрепленные и находящиеся внутри клеткок. Окраска ФВК, маркер 200 нм.

В накопительной и чистой культуре 'Acidilobus saccharovorans' с помощью электронной микроскопии были обнаружены морфологически разнообразные вирусоподобные частицы, в том числе прикрепленные к клеткам или находящиеся внутри них. Всего наблюдалось 6 морфотипов вирусоподобных частиц (Рис. 8).

Можно предположить принадлежность некоторых из них (рис. 8 а, б, в), к уже охарактеризованным семействам Lipotrixviridae и Bicaudoviridae (Janekovic et al., 1984; Haring et al., 2005). Другие вирусы (рис. 8г-е) сходны с неиндефицированными вирусами из Иеллоустонского парка, однако отличаются концевыми структурами и/или размерами. Один из морфотипов (рис. 8ж) уникален и не наблюдался прежде.

В органотрофной анаэробной накопительной культуре, растущей при 85°С и рН 3.5, выделенной из глубоководных гидротермальных проб, обнаружены вирусоподобные частицы (рис. 8и), по форме и размерам схожие с одним из вирусов 'Acidilobus saccharovoransа также с вирусом, выделенным из глубоководных проб (Geslin et al., 2003).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью радиоизотопных методов и путем лабораторной инкубации проб в присутствии различных доноров и акцепторов электронов мы смогли установить, что в анаэробных термоацидофильных сообществах идут разнообразные микробные процессы, в том числе неизвестные для этих местообитаний.

Нами были зарегистрированы ассимиляция СОг, литотрофные ацето-генез, серо-, сульфат- и железоредукция. Микробные агенты известны для ассимиляции С02 и литотрофной сероредукции, идущих при рН 2-4 и 70-90°С (Segerer et al., 1986; 1991; Kurosawa et al. 1998). В нашей работе было установлено, что первичная ассимиляции углерода и литотрофная сероре-дукция имеют максимумы при 60°С, что делает актуальным поиск агентов умеренно-термофильных ацидофильных агентов этих процессов. Пока не известны термоацидофильные литотрофные ацетогены, сульфат- и желе-зоредукторы. Однако полученные нами данные не только указывают на существование этих новых физиологических групп, но и регистрируют их высокую активность: выявленный пробел дает основание для дальнейшего поиска возбудителя этого процесса.

Кроме того, нами были зарегистрированы использование Сахаров, полисахаридов и пептидов, окисление ацетата, органотрофные серо-, сульфат-, железоредукция. Разложение Сахаров и пептидов, сопряженное с се-роредукцией, может бьггь ассоциировано с деятельностью многочисленных известных термоацидофильных прокариот (Segerer et al., 1988, Itoh et al., 1998; 1999; 2002; 2003 Kurosawa et al. 1998; Zillig et al., 1981). Сбражи-

вание органических субстратов при 60°С может быть осуществлено Thermoplasma sp. Высокотемпературные ацидофильные бродилыцики не были известны. Список организмов, способных к разложению органических субстратов за счет сероредукции или брожения, может быть расширен описанными в ходе данной работы представителями нового рода Acidilobus-, а также Thermoanaerobacterium и Thermoanaerobacter, новые виды и штаммы которых способны расти при рН 3.0. Acidilobus является первым организмом, способным к росту на органических субстратах в отсутствие акцепторов электрона при Т 80-85°С и рН 3.0-4.0. Окисление ацетата, а также органотрофные железо- и сульфатредукция, идущие в широком диапазоне температур, не были ранее известны для термоацидофилов; агенты этих процессов пока не известны. Возможно, органотрофную желе-зоредукцию осуществляют выделенные в данной работе ацидотолерант-ные штаммы Thermoanaerobacter.

В чистую культуру были выделены микроорганизмы, способные к брожению или окислению органических веществ. Среди них выделен новый вид бактерий Thermoanaerobacterium acidotolerans. Кроме того, два бактериальных штамма относятся, вероятнее всего, к известным видам рода Thermoanaerobacter. Среди архей нами описан новый вид ' Vulcanisaeta moutnovskia'; а также род Acidilobus с двумя входящими в него видами, новое семейство 'Acidilobaceae'. Возможно, эта группа является таксоном уровня порядка 'Acidilobales'.

Все выделенные из континентальных гидротерм бактериальные культуры оказались умеренно-термофильными и ацидотолерантными. Они относятся к группе Clostridia, порядку Thermoanaerobacteriales. Разделяя основные метаболические характеристики соответствующих родов, новые штаммы отличаются большей ацидотолерантностью и имеют самые низкие минимальные значения рН роста для этой группы.

Выделенные и детектированные в континентальных гидротермах архей, являются гипертермофильными представителями царства кренархеот (кроме умеренно-термофильной Thermoplasma sp., относящейся к царству эвриархеот). ' Vulcanisaeta moutnovskia' отличается наиболее высоким температурным максимумом роста, известным для континентальных микроор-ганизов. Все охарактеризованные археи из континентальных гидротерм являются ацидофильными, за исключением ацидотолерантного вида ' Vulcanisaeta moutnovskia'.

Прокариоты, идентифицированные в термоацидофильных лабораторных сообществах из глубоководных гидротерм, оказались относящимися к известным нейтрофильным родам. Бактериальный штамм, выделенный из сообществ, растущих при рН 3.5 и температуре 60°С, относится к роду Thermoanaerobacter и является первым представителем этого рода из глубоководного гидротермального местообитания.

Археи, идентифицированные в термоацидофильных сообществах из глубоководных гидротерм при pH 3.5 и 60-85°С относились к роду Thermo-coccus, многочисленному и широко распространенному в морских гидротермах. Хотя представители рода Thermococcus являются нейтрофилами, наши данные не входят с противоречие с литературными, т.к. некоторые виды Thermococcus имеют нижний предел роста при pH 3.5-4.0 (Neuner et al. 1990; Huber et al. 1995; González et al. 1995; Godfroy et al. 1997). Однако быстрый рост и значительный урожай клеток могут указывать на присутствие в наших сообществах новых видов Thermococcus, для которых низкие значения pH среды являются оптимальными.

Описание термоацидофильного анаэробного микробного сообщества дополняют обнаруженные в накопительных и чистой культурах вирусоподобные частицы. Они вписываются в картину уникального разнообразия фагов из горячих кислых источников, однако некоторые морфотипы обнаружены впервые.

4. Выводы

1. В континентальных горячих источниках активно функционируют анаэробные термоацидофильные микробные сообщества, осуществляющие первичную продукцию и минерализацию органического вещества. Выявлены термоацидофильные процессы серо-, сульфат- и железоредукции.

2. В глубоководных гидротермах присутствуют термофильные ацидо-толерантные анаэробные микроорганизмы, способные как к литотрофно-му, так и к органотрофному росту.

3. Выделенный из континентальных гидротерм представитель нового вида Thermoanaerobacterium acidotolerans обладает наиболее низким для термофильных анаэробных бактерий нижним пределом pH роста, равным 3.2.

4. Выделенный из горячего кислого источника Камчатки представитель нового вида ' Vulcanisaeta moutnovskiá' характеризуется наиболее высоким верхним температурным пределом роста среди организмов, обитающих в наземных гидротермах — 102°С.

5. Выделенные из континентальных гидротерм штаммы гипертермофильных анаэробных архей, растущие на органических субстратах при рНощ. 3.5 и температуре 62-95°С, являются представителями нового рода и видов Acidilobus aceticus gen. nov. sp. nov. и 'Acidilobus saccharovorans' sp. nov.

6. Новый род Acidilobus, совместно с описанный впоследствии родом Caldisphaera, образует обособленную филогенетическую группу с общими фенотипическими свойствами, для которой мы предлагаем ранг нового семейства Acidilobaceae и, возможно, нового порядка 'Acidilobales

7. У нового вида Acidilobus aceticus показано функционирование гликолиза, и, в присутствии серы, цикла трикарбоновых кислот.

8. Морфологически разнообразные вирусоподобные частицы, в том числе с уникальной морфологией, присутствуют в культуре термоацидофильных микроорганизмов (85°С, рН 3.5).

Список публикаций по теме диссертации

1. Е.А. Бонч-Осмоловская, МЛ. Мирошниченко, А.И. Слободкин, Т.Г. Соколова, Г.А. Карпов, Н.А.Кострикина, Д.Г. Заварзина. М.И.Прокофьева. И.И. Русанов, Н.ВЛименов. Биоразнообразие анаэробных литотрофных прокариот в наземных гидротермах Камчатки. Микробиология, 1999, Том 68 (3), с. 398-406.

2. М.И. ' Прокофьева. И.И. Русанов, Н.В. Пименов, Е.А. Бонч-Осмоловская. Определение органотрофной активности в горячих источниках Камчатки с низкими значениями рН. Микробиология, 2006, Том 75 (2) с. 284-286.

3. M.I. Prokofeva. M.L. Miroshnichenko, N.A. Kostrikina, N.A. Chernyh, B.B. Kuznetsov, T.P. Tourova, E.A. Bonch-Osmolovskaya. Acidilobus aceticus gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic thermoacidophilic archaeon from continental hot vents in Kamchatka. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, Vol. 50, p. 2001-2008.

4. Olivier Nercessian, Maria Prokofeva. Alexander Lebedinski, Stephane L'Haridon, Craig Cary, Daniel Prieur, Christian Jeanthon. Design of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes for detecting cultured and uncultured archaeal lineages in high-temperature environments. Environmental Microbiology, 2004, Vol. 6(2), p. 170-182.

5. Maria I. Prokofeva. Ilya V. Kublanov, Olivier Nercessian, Tatjana P. Tourova, Tatjana V. Kolganova, Alexander V. Lebedinsky, Elizaveta A. Bonch-Osmolovskaya, Stefan Spring, Christian Jeanthon. Cultivated Anaerobic Aci-dophilic/Acidotolerant Thermophiles from Terrestrial and Deep-sea Hydrothermal Habitats. Extremophiles, 2005, Vol. 9, p. 437-448.

6. Kublanov I.V., Prokofeva M.I.. Kostrikina N.A., Kolganova T.V., Tourova T.P., Bonch-Osmolovskaya E.A. Thermoanaerobacterium acidotoler-ans sp. nov., a novel moderately thermoacidophilic bacterium from a Kamchatka hot spring. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, принято к печати.

7. Maria Prokofeva. Margorita Miroshnichenko, Boris Kuznetsov, Tatyana Tourova, Nadezhda Kostrikina, Nikolay Chernyh, Elisaveta Bonch-Osmolovskaya. Isolation of new anaerobic thermoacidophilic archaea from Kamchatka acidic hot springs. International conference "Thermophiles'98", September 1998, Brest, France. Abstract B-P19.

8. М.И. Прокофьева. М.Л. Мирошниченко, Н.А.Кострикина, Б.Б. Кузнецов, Т.П. Турова, Н.А. Черных, Е.А. Бонч-Осмоловская. Новые термоацидофильные анаэробы из континентальных горячих источников.VI Международная конференция аспирантов и студентов по фундаментальным наукам "Ломоносов-99", Москва, 1999. Тезисы доклада.

9. Maria Prokofeva. Margorita Miroshnichenko, Boris Kuznetsov, Talyana Tourova, Nadezhda Kostrikina, Nikolay Chernyh, Elisaveta Bonch-Osmolovskaya. Biodiversity of thermoacidophitic anaerobes in terrestrial acidic hot springs. "IXth International Congress of Bacteriology & Applied Microbiology", Sydney, Australia, 1999. Abstract BPO 11.21.

10. М.И. Проко<Ььева. М.Л. Мирошниченко, И.В. Кубланов, Н.А. Ко-стрикина, Н.А. Черных, Т.П. Турова, Б.Б. Кузнецов, Е.А. Бонч-Осмоловская. Анаэробные органотрофы из кислых горячих источников. Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, 2000. Тезисы доклада, с.205.

11. Prokofeva М.. Kublanov I., Chernih N.A., Jeanthon С., Kostrikina N.A., Bonch-Osmolovskaya E. A. Marine and Terrestrial Anaerobic Ther-moacidophiles. "The 3-rd International Congress on Extremophiles", Hamburg, Germany, 2000. Abstract PI6.

12. Prokofeva M.I.. Kostrikina N.A., Tourova T.P., Bonch-Osmolovskaya E.A. Isolation of a novel anaerobic hyperthermophilic representative of Ther-moproteaceae family from Kamchatka acidic hot springs. "The 4th International Congress on Extremophiles", Naples, Italy, 2002. Abstract p. 175.

13. I.V. Kublanov, M.I. Prokofeva. I.V. Subbotina, T.P. Tourova, E.A.Bonch-Osmolovskaya. Anaerobic thermophilic, moderately acidophilic bacteria from Kamchatka hot springs. 1-st FEMS Congress of European Micro-bilogists, Ljubliana, Slovenia, 2003. Abstract, P4-3.

14. Прокофьева М.И.. Бонч-Осмоловская Е.А. Морфологическое раз-нобразие вирусоподобных частиц в накопительных культурах из горячих кислых источников Камчатки. Всероссийская Молодежная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии - 2005". Тезисы доклада, с. 76-78.

15. Prokofeva M.I.. Rusanov I.I., Nercessian О, Tourova Т.Р., Bonch-Osmolovskaya E. A. Anaerobic organotrophic thermophiles from acidic continental hot springs of Kamchatka. 2-nd FEMS Congress of European Microbilo-gists, Madrid, Spain, 2006. Abstract.

Отпечатано в типографии РИСИ. Тираж 120 экз. Подписано в печать 31.10.2006 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прокофьева, Мария Игоревна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Термальные местообитания

2.2. Активность термофильных прокариот в природных местообитаниях

2.3. Термоацидофильные прокариоты 18 2.3.1. Термоацидофильные археи

2.3.1.]. Облигатно-аэробные термоацидофильные археи 19 2.3.1.2. Термоацидофильные археи, способные к анаэробному росту

2.3.2. Термоацидофильные бактерии

2.4. Метаболизм термоацидофилов

2.4.1. Энергетический метаболизм

2.4.2. Конструктивный метаболизм

2.5. Вирусы термоацидофильных прокариот

2.6. Использование термоацидофильных микроорганизмов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анаэробные термоацидофильные микробные сообщества"

Актуальность проблемы

Термоацидофильные сообщества вулканических гидротерм давно привлекают внимание исследователей из-за воздействия на микроорганизмы сразу двух экстремальных факторов - высокой температуры и низкого значения pH. Из кислых гидротерм, расположенных в различных географических зонах, разными авторами были выделены термоацидофильные бактерии и археи, однако полного представления о микробных термоацидофильных сообществах нет.

Особый интерес к термоацидофилам обуславливается возможностью их промышленного использования. Внеклеточные ферменты термоацидофилов ценны для ряда производственных процессов, идущих при высоких температурах и низких значениях pH, например, для переработки крахмала и целлюлозы. Экстремофильность микроорганизма или фермента обуславливает и общую его стабильность. В высокотемпературных процессах (и процессах, проходящих в кислых условиях) снижается риск микробного загрязнения; очистка ферментов, клонированных в мезофильные клетки, упрощается благодаря процедуре температурного (и pH) шока, денатурирующего остальные белки клетки-хозяина (Vieille, Zeikus, 2001; Bertoldo et al., 2004).

Анаэробные процессы, осуществляемые известными термоацидофильными прокариотами, ограничиваются автотрофной фиксацией углерода в биомассу, лито-трофным и органотрофным восстановлением элементной серы и некоторых серных соединений, а также окислением Сахаров, полисахаридов и пептидов. Процессы, идущие непосредственно в термоацидофильных сообществах, не изучались. Поэтому одним из направлений данной работы было определение скорости процессов, идущих в горячих кислых источниках, с помощью радиоизотопных методов.

На момент начала этой работы группа анаэробных термоацидофильных орга-нотрофных прокариот была крайне малочисленной и состояла только из представителей факультативно анаэробного рода Thermoplasma (Johnson, 1998). В последующие годы было описано еще несколько новых родов этой группы (Itoh et al., 1998, 1999, 2002, 2003), и в результате группа расширилась. Однако облигатно анаэробные термоацидофилы были представлены лишь одной археей - литотрофным Stigiolobus агопсш1 (Segerer е1 а1., 1991). Поэтому исследования в рамках данной работы были сфокусированы на поиске новых анаэробных термоацидофилов, в том числе органо-трофных.

Способность к брожению не известна среди мезофильных ацидофилов; ней-трофильные мезофилы чаще всего прекращают брожение при рН около 4.0, и лишь единичные нейтрофилы способны осуществлять брожение при более низких рН, например Багета уеШпсиИ (Сапа1е-Раго1а, 1986). Среди термофильных ацидофилов способность к брожению известна только у Ткегтор1азта 8рр.; представители рода Са1(И$рНаега также способны расти в отсутствие внешних акцепторов электронов. Из-за столь малого количества организмов, способных к брожению в кислых условиях, актуален поиск других термоацидофилов-бродилыциков.

Цели и задачи исследования

Целью работы было изучение термоацидофильных микробных сообществ из природных местообитаний.

Задачи исследования состояли в следующем:

4. Выделение и характеристика термоацидофильных и -ацидотолерантных микроорганизмов.

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработан метод приготовления твердых сред, устойчивых при высоких температурах и низких значениях рН.

Выделены и полностью охарактеризованы новые ацидофильные и ацидотоле-рантные термофильные микроорганизмы. Описан новый род термоацидофильных архей Acidilobus gen. nov., включающий 2 вида - Acidilobus aceticus sp. nov. и 'Acidilobus saccharovorans' sp. nov.; новый вид археи ' Vulcanisaeta moutnovskia' sp. nov.; а также новая термофильная бактерия 'Thermoanaerobacterium acidotolerans' sp. nov.

Полученные результаты расширяют представление о филогентическом и фено-типическом разнообразии анаэробных микроорганизмов, населяющих горячие кислые источники. Кроме того, новые микроорганизмы, обитающие при экстремальных значениях температуры и рН, могут являться потенциальными источниками новых ферментов, обладающих устойчивостью к этим параметрам среды и поэтому ценных для использования в производствах, требующих повышенных температур или низких значений рН среды.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Thermophiles 1998", "IXth International Congress of Bacteriology & Applied Microbiology", 1999, "Extremophiles 2000"; "Extremophiles 2002"; "1-st FEMS Congress of European Microbiologists", 2003; "2-nd FEMS Congress of European Microbiologists", 2006, а также на международной студенческой конференции "Ломоносов-99", 1999; школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии", 2000; Всероссийской молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии - 2005".

Место проведения работы

Определение состава Г+Ц пар в ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию выполнили к.б.н. A.M. Лысенко и к.б.н. H.A. Черных (ИНМИ РАН). Анализ последовательностей 16-S рДНК чистых культур выполнили к.б.н. Б.Б. Кузнецов, к.б.н. Т.В. Колга-нова (Центр Биоинженерии РАН) и к.б.н. Т.П. Турова (ИНМИ РАН). Электронную микроскопию накопительных и чистых культур проводили совместно с H.A. Кост-рикиной (ИНМИ РАН). Радиоизотопные исследования проводили совместно с И.И. Русановым и д.б.н. Н.В. Пименовым (ИНМИ РАН). Исследование метаболизма Acidilobus aceticus проводили совместно с д.б.н. М.Ю. Грабович, к.б.н. Д.А. Подко-паевой и М.А. Арабцевой (кафедра физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского Государственного университета).

Список публикаций по теме диссертации

По теме диссертационной работы опубликовано и сдано в печать 15 печатных работ (6 публикаций и 9 тезисов).

Публикации в журналах

1. Е.А. Бонч-Осмоловская, M.J1. Мирошниченко, А.И. Слободкин, Т.Г. Соколова, Г.А. Карпов, Н.А.Кострикина, Д.Г. Заварзина, М.И.Прокофьева, И.И. Русанов, Н.В.Пименов. Биоразнообразие анаэробных литотрофных прокариот в наземных гидротермах Камчатки. Микробиология. 1999. Том 68 (3). С. 398-406.

2. М.И. Прокофьева, И.И. Русанов, Н.В. Пименов, Е.А. Бонч-Осмоловская. Определение органотрофной активности в горячих источниках Камчатки с низкими значениями pH. Микробиология. 2006. Т. 75 (2). С. 284-286.

3. M.I. Prokofeva, M.L. Miroshnichenko, N.A. Kostrikina, N.A. Chernyh, B.B. Kuznetsov, T.P. Tourova, E.A. Bonch-Osmolovskaya. Acidilobus aceticus gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic thermoacidophilic archaeon from continental hot vents in Kamchatka. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2000. V. 50. P. 2001-2008.

4. Olivier Nercessian, Maria Prokofeva, Alexander Lebedinski, Stephane L'Haridon,

Craig Сагу, Daniel Prieur, Christian Jeanthon. Design of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes for detecting cultured and uncultured archaeal lineages in high-temperature environments. Environmental Microbiology. 2004. V. 6 (2). P. 170-182.

5. Maria I. Prokofeva, Ilya V. Kublanov, Olivier Nercessian, Tatjana P. Tourova, Tatjana V. Kolganova, Alexander V. Lebedinsky, Elizaveta A. Bonch-Osmolovskaya, Stefan Spring, Christian Jeanthon. (2005) Cultivated Anaerobic Acidophilic/Acidotolerant Thermophiles from Terrestrial and Deep-sea Hydrothermal Habitats. Extremophiles. V. 9. P. 437-448.

6. Kublanov I.V., Prokofeva М.1., Kostrikina N.A., Kolganova T.V., Tourova T.P., Bonch-Osmolovskaya E.A. Thermoanaerobacterium acidotolerans sp. nov., a novel moderately thermoacidophilic bacterium from a Kamchatka hot spring. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, принято к печати.

Тезисы докладов на конференциях

1. Maria Prokofeva, Margorita Miroshnichenko, Boris Kuznetsov, Tatyana Tourova, Nadezhda Kostrikina, Nikolay Chernyh, Elisaveta Bonch-Osmolovskaya. Isolation of new anaerobic thermoacidophilic archaea from Kamchatka acidic hot springs. International conference "Thermophiles'98", September 1998, Brest, France. Abstract B-P19.

2. М.И. Прокофьева, M.JT. Мирошниченко, Н.А.Кострикина, Б.Б. Кузнецов, Т.П. Турова, Н.А. Черных, Е.А. Бонч-Осмоловская. Новые термоацидофильные анаэробы из континентальных горячих источников.У1 Международная конференция аспирантов и студентов по фундаментальным наукам "Ломоносов-99", Москва, 1999. Тезисы доклада.

3. Maria Prokofeva, Margorita Miroshnichenko, Boris Kuznetsov, Tatyana Tourova, Nadezhda Kostrikina, Nikolay Chernyh, Elisaveta Bonch-Osmolovskaya. Biodiversity of thermoacidophilic anaerobes in terrestrial acidic hot springs. "IXth International Congress of Bacteriology & Applied Microbiology", Sydney, Australia, 1999. Abstract BPO 11.21.

4. М.И. Прокофьева, M.JI. Мирошниченко, И.В. Кубланов, Н.А. Кострикина, Н.А. Черных, Т.П. Турова, Б.Б. Кузнецов, Е.А. Бонч-Осмоловская. Анаэробные ор-ганотрофы из кислых горячих источников. Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, 2000. Тезисы доклада. С. 205.

5. Prokofeva М., Kublanov I., Chernih N.A., Jeanthon С., Kostrikina N.A., Bonch-Osmolovskaya E. A. Marine and Terrestrial Anaerobic Thermoacidophiles. "The 3-rd International Congress on Extremophiles", Hamburg, Germany, 2000. Abstract PI6.

6. Prokofeva M.I., Kostrikina N.A., Tourova T.P., Bonch-Osmolovskaya E.A. Isolation of a novel anaerobic hyperthermophilic representative of Thermoproteaceae family from Kamchatka acidic hot springs. "The 4lh International Congress on Extremophiles", Naples, Italy, 2002. Abstract. P. 175.

7. I.V. Kublanov, M.I. Prokofeva. I.V. Subbotina, T.P. Tourova, E.A.Bonch-Osmolovskaya. Anaerobic thermophilic, moderately acidophilic bacteria from Kamchatka hot springs. 1-st FEMS Congress of European Microbilogists, Ljubljana, Slovenia, 2003. Abstract P4-3.

8. Прокофьева М.И., Бонч-Осмоловская E.A. Морфологическое разнобразие вирусоподобных частиц в накопительных культурах из горячих кислых источников Камчатки. Всероссийская Молодежная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии - 2005". Тезисы доклада. С.76-78.

9. Prokofeva M.I., Rusanov I.I., Nercessian О, Tourova Т.Р., Bonch-Osmolovskaya E. A. Anaerobic organotrophic thermophiles from acidic continental hot springs of Kamchatka. 2-nd FEMS Congress of European Microbilogists, Madrid, Spain, 2006. Abstract.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

К термофилам относятся микроорганизмы, имеющий температурный оптимум развития при 55°С и выше. Они, в свою очередь, делятся на умеренных термофилов, развивающихся в температурном интервале 40-70°С с оптимумом при 55-60°С, экстремальных термофилов (диапазон 50-80 и оптимум 70-75°С) и гипертермофилов (диапазон 70-110, оптимум 85-105°С). Организмы, развивающиеся одновременно при высокой температуре и низком pH, называются термоацидофилами. В отличие от термофилии, четкая граница между ацидофильными и нейтрофильными микроорганизмами не определена. Мы будем придерживаться определения, при котором ацидофильными называют микроорганизмы с pH оптимумом роста ниже значения pH 4.0, включая это значение (Гусев и Минеева, 1985).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Прокофьева, Мария Игоревна

5. ВЫВОДЫ

2. В глубоководных гидротермах присутствуют термофильные ацидотолерант-ные анаэробные микроорганизмы, способные как к литотрофному, так и к органо-трофному росту.

3. Выделенный из континентальных гидротерм представитель нового вида Thermoanaerobaclerium acidotolerans обладает наиболее низким для термофильных анаэробных бактерий нижним пределом pH роста, равным 3.2.

4. Выделенный из горячего кислого источника Камчатки представитель нового вида lVulcanisaeta moutnovskia' характеризуется наиболее высоким верхним температурным пределом роста среди организмов, обитающих в наземных гидротермах -102°С.

5. Выделенные из континентальных гидротерм штаммы гипертермофильных анаэробных архей, растущие на органических субстратах при рН0Пт 3.5 и температуре 62-95°С, являются представителями нового рода и видов Acidilobus acelicus gen. nov. sp. nov. и 'Acidilobus saccharovorans' sp. nov.

6. Новый род Acidilobus, совместно с описанный впоследствии родом Caldisphaera, образует обособленную филогенетическую группу с общими феноти-пическими свойствами, для которой мы предлагаем ранг нового семейства Acidilobaceae и, возможно, нового порядка Acidilobales.

7. У нового вида Acidilobus acelicus показано функционирование гликолиза, и, в присутствии серы, цикла трикарбоновых кислот.

8. Морфологически разнообразные вирусоподобные частицы, в том числе с уникальной морфологией, присутствуют в культуре термоацидофильных микроорганизмов (85°С, pH 3.5).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прокофьева, Мария Игоревна, Москва

1. Асатин B.C. (1965) Новые методы биохимической фотометрии. Москва, Наука.

2. Басков Е.А., Суриков С.Н. (1989) Гидротермы Земли. Ленинград, "Недра".

3. Башкатова H.A., Северена Л.О., Головачева P.C., Митюшина Л.Л. (1991) Поверхностные слои экстремально термоацидофильных архебактерий рода Sulfurococcus. Микробиология Т. 60 (6). С. 90-94.

4. Бонч-Осмоловская Е.А. (2001) Термофильные микроорганизмы в морских гидротермальных системах. В книге: Биология гидротермальных систем. Под ред. A.B. Гебрук, К.Н. Несис, А.П. Кузнецова, A.M. Сагалевич. М., КМК Press. С. 320-328.

5. Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М., Карпов Г.А., Старынин Д.А. (1987) Анаэробная деструкция органического вещества в цианобактериальных матах источника Термофильного. Микробиология. Т.56 (6). С. 1022-1028.

6. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л., Пикута Е.В. Качалкин В.И., Миллер Ю.М. Пропп Л.Н., Тарасов (1993) Бактериальная сероредукция в мелководных гидротермах юго-западной части Тихого океана. Микробиоло-гия.Т. 62. С. 564-573.

7. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л. (1994) Влияние молекулярного водорода и элементарной серы на метаболизм экстремально-термофильных архебактерий рода Thermococcus. Микробиология. Т.63 (5). С. 777-782.

8. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л., Пикута Е.В., Сорокин Д.Ю., Намсараев Б.Б. (1993) Бактериальная сероредукция в мелководных гидротермах юго-западной части тихого океана. Микробиология. Т.62. С. 564-573.

9. Вартанян Н.С., Пивоварова Т.А., Цаплина И.А. и др. (1988) Новая термофильная бактерия, относящаяся к роду Sulfobacillus. Микробиология. Т.57. С. 268-274.

10. Гальченко В. Ф. (2001) Метанотрофные бактерии. Москва, Геос. С. 452-455.

11. Головачева P.C. (1984) Новый экстремально термофильный микроорганизм, окисляющий серу. Доклады академии наук СССР. Т.274 (6). С. 1488 1490.

12. Головачева P.C., Каравайко Г.И. (1978) Sulfobacillus новый род термофильных спорообразующих бактерий. Микробиология, Т. 47. С.815-822.

13. Головачева P.C., Вальехо-Роман К.М., Троицкий А.В. (1987) Sulfurococcus mirabilis gen. nov. sp. nov. новая термофильная окисляющая серу архебакте-рия. Микробиология. Т. 56 (1). С.100-107.

14. Головачева P.C., Жукова И.Г., Никульцева Т.П., Островский Д.Н. (1987) Некоторые свойства Sulfurococcus mirabilis новой термоацидофильной архе-бактерии. Микробиология. Т. 56 (2). С.281-287.

15. Гусев М.В., Минеева JI.A. (1985) Микробиология. Москва: МГУ. С. 107.

16. Дулов J1.E., Леин А.Ю. Дубинина Г.А., Пименов Н.В. (2005) Микробиологические процессы на гидротермальном поле Лост-Сити, Срединно-Атлантический хребет. Микробиология. Т. 74 (1). С. 111-118.

17. Заварзин Г.А. Бактерии и состав атмосферы (1984) Москва: Наука.

18. Жилина Н.В., Северина Л.О., Головачева P.C.(1989) Некоторые физиолого-биохимические свойства экстремально термоацидофильных сероокисляющих архебактерий рода Sulfurococcus. Микробиология. Т. 58 (1). С.36-41.

19. Каравайко Г.И. (1984) Микробиологические процессы выщелачивания металлов из руд: обзор проблем. Программа ООН по окружающей среде (ЮНЕП). Центр международных проектов, ГКНТ.

20. Каравайко Г.И., Гольшина О.И., Троицкий А.В., Ваэльхо-Роман К.М., Головачева З.С., Пивоварова Т.А. (1994) Sulfurococcus yellowstonii sp. nov. новый вид железо- и сероокисляющей термоацидофильной архебактерии. Микробиология. Т. 63 (4). С. 668-682.

21. Каравайко Г.И., Турова Т.П., Цаплина И.А., Богданова Т.И. (2000) Исследование филогенетического положения аэробных умеренно термофильных бактерий рода Sulfobacillus, окисляющих Fe(2+), S(0) и сульфидные минералы. Микробиология. Т.69 (6). С.857-860.

22. Кевбрин В.В., Заварзин Г.А. (1992) Влияние соединений серы на рост гало-фильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium arabaticum. Микробиология. Т. 61(5). С. 812-817.

23. Коваленко Е.В., Малахова П.Т. (1983) Спорообразующая, железоокисляющая бактерия Sulfobacillus thermosulfidooxidans. Микробиология. Т. 52. С. 962-966.

24. Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б, Турова Т.П. (2002) Конструирование системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации и секвенирования генов16S рРНК архей из микробных сообществ различного происхождения. Микробиология. Т. 71 (2). С. 283-286.

25. Кочетов Г.А. (1980) Практическое руководство по энзимологии. 2-е изд., пе-рераб. и дополненное. Москва, Высшая школа. С.250-253.

26. Меламуд B.C., Пивоварова Т.А., Турова Т.П., Колганова Т.В., Осипов Г.А., Лысенко А.М., Кондратьева Т.Ф., Каравайко Г.И. (2003) Новая умеренно термофильная бактерия Sulfobacillus sibiricus sp.nov. Микробиология. Т.72 (5). С. 681-688.

27. Намсараев З.Б., Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Бархутова Д.Д. (2006) Микробные сообщества щелочных гидротерм. Новосибирск, издательство Сибирского отделения РАН.

28. Резников А.А., Мушковская Е.П., Соколов И.Ю. (1970) Методы анализа природных вод. Издательство "Недра".

29. Романова А.К. (1980) Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. М: Наука. С. 40-41.

30. Старынин Д.А., Намсараев Б.Б., Бонч-Осмоловская Е.А., Качалкин В.И., Пропп Л.Н. (1995) Микробиологические процессы в донных осадках озера Грин острова Рауль (острова Кердамек, Тихий океан). Микробиология. Т. 64(2). С. 264-269.

31. Чудаев О.В., Чудаева В.А., Карпов Г.А., Эдмунде У.М., Шанд П. (2000). Владивосток, Дальнаука.

32. Angelov A., Futterer О., Valerius О., Braus G.H., Liebl W. (2005) Properties of the recombinant glucose/galactose dehydrogenase from the extreme thermoacidophile, Picrophilus torridus. FEBS J. Y. 272(4). P.1054-1062

33. Aoshima A., Nishibe Y., Hasegawa M., Yamagishi A., Oshima T. (1996) Cloning and sequencing of a gene encoding 16S ribosomal RNA from a novel hyperther-mophilic archaebacterium NC12. Gene. V.180. P. 183-187.

34. Arnold H.P., Ziese U., Zillig W. (2000b) SNDV, a novel virus of the extremely thermophilic and acidophilic archaeon Sulfolobus. Virology. V. 272 (2). P. 409416.

35. Baross J.A., Deming J.W. (1995) Growth at hight temperatures: isolation and taxonomy, physiology, and ecology. In: The microbiology of deep-sea hydrothermal vents, edited by Karl M. D. Boca Raton - New York - London - Tokyo - CRC Press. P. 169-218.

36. Belly R.T., Bohlool B.B., Brock T.D. (1973) The genus Thermoplasma. Ann. N. Y. Acad. Sci. V. 225. P. 94-107.

37. Bergmeyer H.U., Bernt E., Hess B. (1965) Methods of enzymatic analysis. J. Bio-chem. P. 736-743.

38. Bertoldo C., Dock C., Antranikian G. (2004) Thermoacidophilic microorganisms and their novel biocatalysts. Eng. Life Sci. V. 4(6). P. 521-531.

39. Bettstetter M., Peng X., Garrett R.A., Prangishvili D. (2003) AFV1, a novel virus infecting hyperthermophilic archaea of the genus Acidianus. Virology. V. 315(1). P. 68-76.

40. Breitbart M, Wegley L, Leeds S, Schoenfeld T, Rohwer F. (2004) Phage community dynamics in hot springs. Appl Environ Microbiol. V. 70(3). P. 1633-1640.

41. Brierley C.L, Brierley J.A. (1973) A chemoautotrophic and thermophilic microorganism isolated from an acid hot spring. Can.J. Microbiol. V.19. P. 183-188.

42. Bridge T.A.M, Johnson D.B. (1998) Reduction of soluble iron and reductive dissolution of ferric iron-containing minerals by moderately thermophilic iron-oxidizing bacteria. Appl. Environ. Microbiol. V. 64. P. 2181-2186.

43. Brock T.D. (1978) Bidomal pH distribution of hot springs of the World. In: Thermophilic microorganisms and life at high temperatures. New York, Springer. P. 3136.

44. Brock T.D. (1986) Notes on the ecology of thermophilic archaebacteria. Syst.Appl.Microbiol. V. 7. P. 213-215.

45. Brock T.D, Brock K.M, Belly R.T, Wiess R.L. (1972) Sulfolobus: a new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch. Microbiol. V. 84. P.54-68.

46. Canale-Parola E. (1986) Genus Sarcina Goodsir 1842, 434AL. In: Bergey's manual of systematic bacteriology. V. 2. Williams & Wilkins Co, Baltimore; London; Los Angeles; Sydney. P. 1100-1103.

47. Charbonnier F, Forterre P, Erauso G, Prieur D. (1995) Purification of plasmids from thermophilic and hyperthermophilic archaea. In: Robb F.T. and Place A.R. (eds) Archaea: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA. P. 87-90.

48. Chidren S.E., Kenneth M.N. (1984) Characterization and regulation of sulfur reductase activity in Thermotoga neapolitana. Appl. Environ.Microbiol., V.60 (7). P. 2622-2626.

49. Darland G., Brock T.D., Samsonoff W., Conti S.F.: A thermophilic acidophilic mycoplasm isolated from a coal refuse pile. (1970) Science.V. 170. P. 1416-1418.

50. Darland G. Brock T.D. (1971) Bacillus acidocaldarius sp. nov., an acidophilic thermophilic spore-forming bacterium. J. Gen. Microbiol., 67(1), P. 9-15.

51. De Lay J., Cattoir H., Reynaerts A. (1970) The quantative measurement of DNA hybridization from renaturation rates. Eur. Biochem. V. 12. P. 133-142.

52. De Rosa M., Gambacorta A., Bu'Lock J.D. (1975) Extremely thermophilic acidophilic bacteria convergent with Sulfolobus acidocaldarius. J. Gen. Microbiol. V. 86. P.156-164.

53. De Rosa M., Gambacorta A. (1988) The lipids of archaebacteria. Prog. Lipid Res. V.27. P. 153-175.

54. Dufresne, S., Bousquet, J., Boissinot, M., Guay, R. (1996) Sulfobacillus disulfi-dooxidans sp. nov., a new acidophilic, disulfide-oxidizing, Gram-positive, spore-forming bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 46. P. 1056-1064.

55. Edwards U., Rogall T., Blocker H., Emde M„ Bottger E.C. (1989) Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA . Nucl. Acids. Res. V. 17(19). P.7843-7853.

56. Egorova K., Antranikian G. (2005) Industrial relevance of thermophilic Archaea. Curr Opin Microbiol. V. 8(6). P.649-655.

57. Felsenstein J. (1993) PHYLIP (phylogenetic interference package) version 3.5c. http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html

58. Fuchs T., Huber H., Teiner K., Burggraf S., Stetter K.O. (1995) Metallosphaera prunae, sp. nov., a novel metal-mobilizing, thermoacidophilic archaeum, isolated from a uranium mine in Germany. System Appl Microbiol. V. 18. P. 560-566.

59. Fuchs T, Huber H., Burggraf S., and Stetter K.O. (1996) 16S rDNA-based phylog-eny of the archeal order Sulfolobales and reclassification of Desulfurolobus am-bivalens as Acidianus ambivalens comb. nov. Syst. Appl. Microbiol. V.19. P.56-60.

60. Geslin C., Le Romancer M., Gaillard M., Erauso G., Prieur D. (2003) Observation of virus-like particles in high temperature enrichment cultures from deep-sea hydrothermal vents. Res Microbiol. V. 154(4). P. 303-307.

61. Gonzalez J.M., Kato C., Horikoshi K. (1995) Thermococcus peptonophilus sp. nov., a fast- growing, extremely thermophilic archaebacterium isolated from deep-sea hydrothermal vents. Arch Microbiol. V. 164. P. 159-164.

62. Graccia G.C., McLean K.M., Gle'nat P., Bauld J., Sheehy A. (1996) A systematic survey for thermophilic fermentative bacteria and archaea in high temperature petroleum reservoirs. FEMS Microbiol. Ecol. V. 21. P. 47-58.

63. Grogan D., Palm P., Zillig W.(1990) Isolate B12, which harbours a virus-like element, represents a new species of the archaebacterial genus Sulfolobus, Sulfolobus shibatae, sp. nov. Arch Microbiol. V. 154(6). P. 94-99.

64. Hallberg K.B., Lindstrom E.B. (1994) Characterization of Thiobacillus caldus sp. nov., a moderately thermophilic acidophile. Microbiology, V.140, P.3451-3456

65. Haring M., Vestergaard G., Rachel R.,Chen L., Garrett R.A., Prangishvili D. ( 2005b) Virology: independent virus development outside a host. Nature. V. 436(7054). P. 1101-1102.

66. Huang Y., Krauss G., Cottaz S., Driguez H., Lipps G. (2005) A highly acid-stable and thermostable endo-beta-glucanase from the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. Biochem J. V. 385 (2). P. 581-588.

67. He Z.G., Zhong H., Li Y. (2004) Acidianus tengchongensis sp. nov., a new species of acidothermophilic archaeon isolated from an acidothermal spring. Curr Microbiol. V. 48 (2). P. 159-163.

68. Hespell R.B., Canale-Parola E.(1970) Carbohydrate metabolism in Spirochaeta stenostrepta. J. of Bacteriology .V. 103(1). P. 216-226.

69. Huber H., Stetter K.O. (1998) Hyperthermophiles and their possible potential in biotechnology. J.Biotechnol. V. 64. P. 39-52.

70. Huber G., Stetter K.O. (1991) Sulfolobus metallicus, sp. nov.,a novel strictly chemolitoautotrophic thermophilic archaeal species of metal mobilizers. System Appl Microbiol. V. 14. P. 372-378.

71. Huber G., Spinnler C., Gambacorta A., Stetter K.O. (1989) Metallosphaera sedula gen. nov., and sp. nov. represents a new genus of aerobic, metal-mobilizing, thermoacidophilic archaebacteria. System Appl Microbiol. V. 12. P. 38-47.

72. Inatomi K., Ohba M., Oshima T. (1983) Chemical properties of proteinaceous cell wall from an acido-thermophile, Sulfolobus acidocaldarius. Chem Lett. P. 11911194.

73. Itoh T., Suzuki K., Nakase T. (1998) Thermocladium modestius gen. nov., sp. nov., a new genus of rod-shaped, extremely thermophilic crenarchaeote. Int J Syst Bacte-riol. V. 48, P. 879-887.

74. Itoh T., Suzuki K., Sanchez P.C., Nakase T. (1999) Caldivirga maquilingensis gen. nov., sp. nov., a new genus of rod-shaped crenarchaeote isolated from a hot spring in the Philippines. Int J Syst Bacteriol.V. 49. P. 1157-1163.

75. Itoh T., Suzuki K., Sanchez P.C., Nakase T. (2003) Caldisphaera lagunensis gen. nov., sp. nov., a novel thermoacidophilic crenarchaeote isolated from a hot spring at Mt. Maquiling, Philippines. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 53. P. 1149-1154.

76. Jan R.L., Wu J., Chaw S.M, Tsai C.W., Tsen S.D. (1999) A novel species of thermoacidophilic archaeon, Sulfolobus yangmingensis sp. nov. Int. J. Syst. Bacte-riol. V. 49 (4). P.1809-1816.

77. Janekovic D., Wunderl S, Holz I., Zillig W., Gierl A., Neuman H. (1983) TTV1, TTV2, and TTV3, a family of viruses of the extremely thermophilic, anaerobic, sulfur-reducing archaebacterium Thermoproteus tenax. Mol. Gen. Genet. V. 192. P. 39-45.

78. Jannasch H.W., Mottl M.J. (1995) Geomicrobiology of deep-sea hydrothermal vents. In: The microbiology of deep-sea hydrothermal vents, edited by Karl M. D. -Boca Raton New York - London - Tokyo - CRC Press. P. 3-35.

79. Johnson D.B. (1998) Biodiversity and ecology of acidophilic microorganisms. FEMS Microbiol. Ecol. V.27. P.307-317.

80. Karavaiko G. I., Bogdanova Т. I., Tourova T. P., Kondrat'eva T. F., Tsaplina I. A., Egorova M. A., Krasil'nikova E. N., Zakharchuk L. M. (2005) Reclassification of

81. Karl M.D. (1995) Ecology of free-living, hydrothermal vent microbial communities. In: The microbiology of deep-sea hydrothermal vents, edited by Karl M. D. -Boca Raton New York - London - Tokyo - CRC Press. P.36-124.

82. Kelly D.P., and Wood A.P. (2000) Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 50. P. 489500.

83. Kim B.C., Grote R., Lee D.W., Antranikian G, Pyun Y.R. (2001) Thermoanaero-bacter yonseiensis sp. nov., a novel extremely thermophilic, xylose-utilizing bacterium that grows at up to 85 oC. Int J Syst Evol Microbiol., V. 51. P. 1539-1548.

84. Kletzin A. (1994) Sulfur oxidation and reduction in Archaea: sulfur oxigenase/-reductase and hydrogenases from the extremely thermophilic and facultatively anaerobic archaeon Desulfurolobus ambivalens. System. Appl. Microbiol. V. 16. P. 534-543.

85. Kobayashi T. (2001) Genus I. Thermococcus. In: Boone D.R, Castenholz R.W. and Garrity G.M. (eds) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1, 2 edn. New York: Springer-Verlag. P. 342-346.

86. Kocabiyik S., Ozel H. (2007, доступна online с января 2006) An extracellular-Pepstatin insensitive acid protease produced by Thermoplasma volcanium. Biore-sour. Technol. V. 98(1). P. 112-117.

87. Kurosawa N., Itoh Y.H., Iwai Т., Sugai A., Uda I., Kimura N., Horiuchi Т., Itoh T. (1998) Sulfurisphaera ohwakuensis gen. nov., sp. nov., a novel extremely thermophilic acidophile of the order Sulfolobales. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 48. P.451-456.

88. Lane D.J. (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E and Goodfellow M (eds) Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Wiley, New-York. P. 115-147.

89. L'Haridon S., Reysenbach A.-L., Gle'nat P., Prieur D., Jeanthon C. (1995) Hot subterranean biosphere in a continental oil reservoir. Nature. V. 337. P. 223-224.

90. Lubben M., Castresana J., Warne A. (1994) Terminal oxidases of Sulfolobus: genes and proteins. System. Appl. Microbiol. V. 16. P. 556-559.

91. Lowry O.H., Rosenbrough N.L., Farr A.L., Randall R.I. (1951)Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol.Chem. V. 193. P. 265 271.

92. Marmur J. (1961) A procedure for the isolation DNA from microorganisms. J. of Molecular biology. V. 3. P. 208-218.

93. Martin A., Yeats S, Janekovic D., Reiter W.D., Aicher W„ Zillig W. (1984) SAV 1, a temperate u.v.-inducible DNA virus-like particle from the archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius isolate В12. EMBO J., V. 3(9). P. 2165-2168.

94. Matzke J, Schwermann B, Bakker E.P. (1997) Acidostable and acidophilic proteins: the example of the alpha-amylase from Alicyclobacillus acidocaldarius. Comp. Biochem. Physiol. A. Physiol. V. 118(3). P.475-479.

95. Meyer-Dombard D.R, Shock E.L. and Amend J.P. (2005) Archaeal and bacterial communities in geochemically diverse hot springs of Yellowstone National Park, USA. Geobiology. V. 3(3). P. 211-227.

96. Miroshnichenko M.L, Bonch-Osmolovskaya E.A. (2006) Recent development in the thermophilic microbiology of deep-sea hydrothermal vents. Extremophiles, V.10, P. 85-96.

97. Nazina T.N, Ivanova A.E, Borzenkov I.A, Belyaev S.S, Ivanov M.V. (1995) Occurrence and geochemical activity of microorganisms in high-temperature, water-flooded oil fields of Kazakhtan and Western Siberia. Geomicrobiol. J. V.13. P. 181-192.

98. Nazina T.N, Xue Y.-F, Wang X.-Y, Belyaev S.S, Ivanov M.V. (2000) Microorganisms of the hight-temperature Liaohe oil field of China and their potential for MEOR. Resour. Environ. Biotechnol. 3: 109-120.

99. Nicolaus B, Improta R, Manca M. C, Lama L, Esposito E, Gambacorta A. (1998) Alicyclobacilli from an unexplored geothermal soil in Antarctica: Mount Rittmann. Polar Biol. V. 19. P. 133-141.

100. Norris P.R, Ingledew W.J. (1992) Acidophilic bacteria: adaptations and applications. In: Molecular biology and biotechnology of extremophiles (Hebert R. A, Sharp R. J, Eds.). Glasgow: Blackie. P. 115-142.

101. Norris P.R, Clark D.A, Owen J.P, and Waterhouse S. (1996) Characteristics of Sulfobacillus acidophilus sp. nov. and other moderately thermophilic mineral-sulphide-oxidizing bacteria. Microbiology. V. 142. P. 775-783.

102. Neuner A, Jannasch H.W, Belkin S, Stetter K.O. (1990) Thermococcus litoralis sp. nov.: a new species of extremely thermophilic marine archaebacteria. Arch Microbiol. V.153.P. 205-207.

103. Owen R.J., Hill L.R., Lapage S.P. (1969) Determination of DNA base composition from melting profiles in delute buffer. Biopolimers. V. 7. P. 503-516.

104. Pichler T., Hall G.E.M., Veizer J. (1999) The chemical composition of shallow-water hydrothermal fluids in Tutum Bay, Ambitle Island, Papua New Guinea and their effect on ambient seawater. Marine Chemistry V. 64. P. 229-252.

105. Pimenov N.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. (2006) In situ activity studies in thermal environments. In: Methods in Microbiology. V. 35. P. 29-53.

106. Pfennig N (1965) Anreicherungskulturen fur rote und griine Schwefelbakterien. Zbl. Bakt. I. Abt. Orig. Supplementheft, V.l. P.179-189.

107. Prangishvili D., Stedman K., Zillig W. (2001) Viruses of the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus. Trends Microbiol. V. 9(1). P. 39-43.

108. Prangishvili D., Forterre P., Garrett R.A. (2006) Viruses of the Archaea: a unifying view. Nat Rev Microbiol. V. 4(11). P.837-848.

109. Rachel R., Bettstetter M., Hedlund B.P., Haring M., Kessler A., Stetter K.O., Prangishvili D. (2002) Remarkable morphological diversity of viruses and viruslike particles in hot terrestrial environments. Arch. Virol. V. 147(12). P. 24192429.

110. Reynolds S. (1963) J. Cell Biol., V. 17. P. 208.

111. Reysenbach A-L., Longnecker K., Kirshtein J. (2000) Novel bacterial and archaeal lineages from an in situ growth chamber deployed at a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent. Appl. Environ. Microbiol. V. 66(9). P. 3798-3806.

112. Reysenbach A.-L., Liu Y., Banta A.B., Beveridge T.J., Kirshtein J.D., Schouten S., Tivey M.K., Von Damm K.L., Voytek M.A. (2006) A ubiquitos thermoacidophilic archaeon from deep-sea hydrothermal vents. Nature. V. 442. P. 444-447.

113. Roychoundhury A. (2004) Sulfate respiration in the extreme environments: a kinetic study. Geomicrobiology Journal. V.21. P.33-43.

114. Ruepp A., Graml W., Santos-Martinez M.L., Koretke K.K., Volker C., Mewes H.W., Frishman D., Stocker S., Lupas A.N., Baumeister W. (2000) The genome sequence of the thermoacidophilic scavenger Thermoplasma acidophilum. Nature. V. 407(6803). P. 508-513.

115. Sako Y.,Nomura N., Uchida A., Ishida Y., Morii H.,Koga Y., Hoaki T., Maruyama T. (1996) Aeropirum pernix gen. nov., sp. nov., a novel aerobic hyperthermophilic archaeon growing at temperatures up to 100 °C. Int.J.Syst.Bacteriol. V. 46. P. 1070-1077.

116. Sand W., Gehrke T., Hallman R., Schippers A. (1995) Sulfur chemistry, biofilm, and the (in)direct attack mechanism a critical evaluetion of bacterial leaching. Appl. Microbiol. Biotechnol. V.43. P. 961-966.

117. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 74(12). P. 5463-5467.

118. Schönheit P.,Schafer T. (1995) Metabolism of hyperthermophiles. World Journal of Microbiology & Biotechnology. V. 11. P. 26-57.

119. Sedwick P., Stuben D. (1996) Chemistry of shallow submarine warm springs in an arc-volcanic setting: Volcano Island, Aeolian Archipelago, Italy. Marine Chemistry. V. 53. P. 147-161.

120. Segerer A., Stetter K.O., Klink F. (1985) Two contrary modes of chemolithotrophy in the same arhaebacterium. Nature. V. 13. P. 787-789.

121. Segerer A., Langworthy T.A., Stetter K.O. (1988) Thermoplasma acidophilum and Thermoplasma volcanium sp. nov. from solfatara fields. System. Appl. Microbiol. V.10. P. 161-171.

122. Segerer A.H., Trincone A., Gahrtz M., Stetter K.O. (1991) Stigiolohus azoricus gen., sp. nov. represents a novel genus of anaerobic, extremely thermoacidophilic archaebacteria of the order Sulfolobales. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 41(4). P. 495501.

123. Serour E., Antranikian G. (2002) Novel thermoactive glucoamylases from the thermoacidophilic Archaea Thermoplasma acidophilum, Picrophilus torridus and Picrophilus oshimae. Antonie Van Leeuwenhoek, V.81(1-4), P.73-83.

124. Seyfried W. E. Jr., and M. J. Mottl. (1995) Geologic Setting and chemestry of deep-sea hydrothermal vents. In: The microbiology of deep-sea hydrothermal vents, edited by Karl M. D. Boca Raton - New York - London - Tokyo - CRC Press.

125. Shafer G.,Anemuller S., Moll S., Meyer W., Lubben M. (1990) Electron transport and energy conservation in the archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius. FEMS Microbiology revives. V. 75. P. 335-348.

126. Siering P.L., J.M. Clarke, Wilson M.S. (2006) Geochemical and biological diversity in acidic, hot springs in Lassen Volcanic National Park. Geomicrobiology Journal. V. 23. P. 129-141.

127. Simbahan J., Drijber R., Blum P. (2004) Alicyclobacillus vulcanalis sp. nov., a thermophilic, acidophilic bacterium isolated from Coso Hot Springs, California, USA. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 54. P. 1703-1707.

128. Simmons S., Norris R. (2002) Acidophiles of saline water at thermal vents of Vul-cano, Italy. Extremophiles, V.6(3). P.201-207.

129. Sleytr U.B., Messner P. (1983) Crystalline surface layers on bacteria. Annu. Rev. Microbiol. V. 37. P. 311-339.

130. Spector T. (1978) Refinement of the Coomassi blue method of protein quantitation. Anal.Biochem. V. 86. P. 142 146.

131. Suzuki Y., Miyamoto K., Ohta H. (2004) A novel thermostable esterase from the thermoacidophilic .archaeon Sulfolobus tokodaii strain 7. FEMS Microbiol Lett. V. 236(1), P. 97-102.

132. Takayanagi S., Kawazaki H., Sugimori K., Yamada T., Sugai A., Ito T., Yamasato K., Shioda M. (1996) Sulfolobus hakonensis sp. nov., a novel species of acidother-mophilic archaeon. Int.J.Syst.Bacteriol. V. 46. P. 377-382.

133. Truper H.G., Shlegel H.G. (1964) Sulfur metabolism in Thiorhodoceae. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii. Antonie van Leeuwen-hoek, J. Microbiol Serol. V.30. P. 225-228.

134. TsuruokaN., Isono Y., Shida O., Hemmi I-L, Nakayama T., Nishino T. (2002) Ali-cyclobacillus sendaiensis sp. nov., a novel acidophilic, slightly thermophilic species isolated from soil in Sendai, Japan. Extremophiles. V. 6(5). P. 419-425.

135. Van de Peer Y., De Wachter R. (1994) TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Appl. Biosci. V.10. P.569-570.

136. Veeger C., Devatanin B.V., Zeynenoka W.P. (1996) Citric acid cycle. Meth. Enzym. V.23.P.81.

137. Vieille C., Zeikus G.J. (2001) Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molekular Mechanisms for Thermostability. Microbiol, and Mol. Biol. Rev. V.3. P. 1-43.

138. Wolin E.A., Wolin M.J., Wolfe R.S. (1963) Formation of methane by bacterial extracts. J Biol Chem. V. 238. P. 2882-2888.

139. Wood A.P., Kelly D.P., Norris P.R. (1987) Autotrophic grouth of four Sulfolobus strains on tetrationate and the effect of organic nutrients. Arch.Microbiol. V. 146. P. 382-389.

140. Xiang X., Dong X., Huang L. (2003) Sulfolobus tengchongensis sp. nov., a novel thermoacidophilic archaeon isolated from a hot spring in Tengchong, China. Ex-tremophiles. V. 7(6). P. 493-498.

141. Yasuda M., Oyaizu H., Yamagishi A.,Oshima T. (1995) Morphological variation of new Thermoplasma acidophilum isolates from Japanese springs. Appl. Enviroment. Microbiol. V.6l.P. 3482-3485.

142. Zillig W., Stetter K.O, Wunderl S, Schulz W., Priess H., Scholz I. (1980) The Sulfolobus-" Caldariella" group: taxonomy on the basis of the Structure of DNA-Dependent RNA Polymerases. Arch. Microbiol. V. 125. P. 259-269.

143. Zillig W., Stetter K.O., Schafer W, Janekovic D., Wunderl S, Holz I., Palm P. (1981) Thermoproleales: a novel type of extremely thermoacidophilic anaerobic archaebacteria isolated from Iceland solfataras. Zbl. Bact. Hyd. I. Abt. Orig. V.2. P. 205-227.

144. Zillig W.,Yeats S., Holz I., Bock A., Rettenberger M., Gropp F., Simon G. (1986) Desulfurolobus ambivalens, gen. nov.,sp. nov., an autotrophic archaebacteriumfacultatively oxidizins or reducing sulfur. System. Appl. Microbiol. V.8. P. 197203.

145. Zillig W.,Kletzin A., Shleper C., Holz I., Janekovic D., Hain J., Lanzendorfer M., Kristjansson J. (1994) Screening for Sulfolobales, their plasmids and their viruses in Icelandic solfataras. System. Appl. Microbiol. V.16. P. 609-628.

146. Zillig W., Prangishvilli D., Schleper C., Elferink M., Holz I., Albers S., Janekovic D., Götz D. (1996) Viruses, plasmids and other genetic elements of thermophilic and hyperthermophilic Archaea. FEMS Microbiol Rev. V. 18(2-3). P. 225-236.

147. Zillig W., Arnold H.P., Holz I., Prangishvili D., Schweier A., Stedman K., She Q., Phan H., Garrett R., Kristjansson J.K. (1998) Genetic elements in the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus. Extremophiles. V. 2(3). P. 131-140.

Информация о работе

Прокофьева, Мария Игоревна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Анаэробные термоацидофильные микробные сообщества - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы