Анаэробные микробные сообщества, разрушающие азокрасители и их производные

Котова, Ирина Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анаэробные микробные сообщества, разрушающие азокрасители и их производные
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анаэробные микробные сообщества, разрушающие азокрасители и их производные"

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Ломоносова Биологический факультет_

На правах рукописи

КОТОВА ИРИНА БОРИСОВНА

АНАЭРОБНЫЕ МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА, РАЗРУШАЮЩИЕ АЗОКРАСИТЕЛИ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ

Специальности 03.02.03 - микробиология

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

1 6 МАЙ ¿013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2013

005057994

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета ФГБОУ ВПО Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр Иванович

Официальные оппоненты:

Градова Нина Борисовна,

доктор биологических наук, профессор кафедры биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российский химико-технологический университет имени Д.И.Менделеева

Ушакова Нина Александровна,

доктор биологических наук, зав. лабораторией инновационных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем экологии и эволюции имени А.Н.Северцова РАН

Яковлев Александр Сергеевич,

доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой земельных ресурсов и оценки почв факультета почвоведения Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН

заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан $ (о Ж-Д&^Щ 2013 г.

Ученый секретарь

пиллллтп 1|цлт гт г г~\рл ллпл'гл

Защита состоится

2013 года в 15 ч 30 мин на

Пискункова Нина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Азокрасптели и амнноароматическне соединения (ААВ) входят в состав многих товаров (красок, лаков, тканей, кожаных, пластиковых и типографских изделий, продуктов питания, лекарственных средств и парфюмерно-косметической продукции) и применяются практически во всех областях человеческой деятельности (Березин, Березин, 2001; Карпов, Белов, 2002). При производстве и использовании со сточными водами сбрасывается от 10 до 50% ААВ. Пищевые азокрасители требуют особо пристального внимания, так как они вступают в прямой контакт с человеческим организмом. Высокую токсичность и мутагенность ААВ связывают с преобразованием их в реакционноспособные интермедиа™, взаимодействующие с молекулами ДНК и гемоглобином крови и способствующие развитию раковых заболеваний у человека и животных (Weisburger, 1997; Pinheiro et al., 2004).

Сохранение азокрасителями и ароматическими аминами своих свойств под действием факторов окружающей среды обусловило их повсеместное применение, однако именно это качество стало серьезным препятствием для разрушения их в сточных водах и в естественных местообитаниях. Анаэробные микроорганизмы способны осуществлять полную минерализацию ААВ с образованием незначительного количества биомассы, а проведение процесса в метаногенных условиях технологически более удобно, так как не требует внесения дополнительных акцепторов электронов в среду и позволяет получить на выходе полезный продукт - биогаз (Slokar, Majcen Le Maréchal, 1998; Калюжный, 2004). В связи с этим первостепенное значение приобретает изучение метаногенных микробных сообществ, способных активно и стабильно осуществлять полную минерализацию ААВ.

Состояние вопроса.

К началу настоящего исследования в научной литературе имелось значительное количество работ, показывающих принципиальную возможность полной минерализации ААВ в анаэробных условиях (Bumpus, 1995), однако в большинстве случаев авторы ограничивались простой констатацией факта деструкции ААВ безотносительно к состоянию микробных культур и без подробного разбора этапов и промежуточных продуктов этого процесса. Данные литературы о специфичности микробных сообществ к ароматическим аминам весьма противоречивы, поскольку не выделены микроорганизмы, осуществляющие первые стадии деструкции и использующие сразу несколько изомеров аминоароматики. Наиболее изучены процессы разложения аминоароматичсскнх кислот (ААК) в нитрат- и сульфатрсдуцирующих условиях (Braun, Gibson, 1984; Tschech, Fuchs, 1987; Schnell, Schink, 1992). Для этих условий подробно разобраны пути расщепления ароматического кольца через бензоил-КоА-, резорциновый и флороглюциновый пути (Dutton, Evans, 1969; Heider, Fuchs, 1997; Carmona et al.. 2009). Несмотря на то, что в очистных сооружениях используются анаэробные реакторы на основе именно метаногенных сообществ, на момент начала наших исследований работы по разложению в метаногенных условиях ААК были малочисленны (Tschech, Schink. 1988; Kalyuzhnyi et al., 2000), а пути превращений ААК на первых этапах процесса не были известны.

В подавляющем большинстве работ, посвященных деструкции ААВ, авторы применяли метаногенные сообщества как «черный ящик» без учета видового состава и взаимодействий внутри него. На момент начала наших исследований данных об их микробном составе и свойствах входящих в них культур было крайне мало, сведения отрывочны и не систематизированы. Отсутствовали данные о влиянии этих ксенобиотиков на общую структуру анаэробных сообществ, превращающих их в биогаз, а также на каждую группу микроорганизмов неметаногенных стадий процесса. Не было сведений о таксономической принадлежности, метаболическом потенциале и функциях в сообществе выделенных из таких

консорциумов чистых культур. Таким образом, к началу работы микробиологическая конверсия ААВ в биогаз не была изучена комплексно, так как отсутствовала полная схема превращений с указанием интермедиатов и групп микроорганизмов, ответственных за каждую стадию процесса.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было комплексное изучение метаногенной деструкции азокрасителей и амнноароматических кислот анаэробными микробными сообществами различного происхождения и изменений структуры этих сообществ при контакте с аминоароматическими ксенобиотиками. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Выделить из плов очистных сооружений и донных отложений природных водоемов активные и стабильные анаэробные микробные сообщества, способные к полной минерализации ААВ, и определить параметры культивирования, оптимальные для эффективного обесцвечивания азокрасителей и метаногенной деградации ААК;

2) Определить основные ароматические и линейные интермедиаты процесса конверсии ААВ в биогаз, вероятный механизм обесцвечивания азокрасителей и путь деградации ААК в активных сообществах;

3) Проследить изменения структуры сообществ по ходу процесса и во времени;

4) Определить компонентный состав типичного активного метаногенного сообщества и сравнить его с исходным илом;

5) Выделить чистые и ко-культуры микроорганизмов-членов сообществ и определить их роли в общем процессе биодеградации ААВ;

6) Создать искусственные микробные ассоциации из выделенных чистых и ко-культур для подтверждения их функций в сообществе и для проверки предложенной схемы трофической цепи;

7) Проверить выявленные закономерности на кишечных микробных сообществах млекопитающих и определить подходы к их использованию в качестве тест-систем для проверю! пищевых азокрасителей.

Научная новизна работы.

Впервые проведено комплексное исследование процесса метаногенной конверсии ААВ, сопровождаемое изучением изменений структурно-функциональной организации осуществляющих его анаэробных микробных сообществ различного происхождения.

Полученные в работе данные о возможности «подстраивания» метаболизма как отдельных микроорганизмов, так и микробных сообществ в целом к использованию неприродных соединений расширили наши познания о пределах существования живой материи. Сведения о поведении микробных сообществ при контакте с ксенобиотиками, которые можно рассматривать как стрессовые факторы, представили новую информацию о возможных направлениях сукцессионных изменений структуры сообщества и его активности.

Впервые получены стабильные метаногенные сообщества, способные с высокой скоростью разлагать изомеры АБК и АСК. Выявлены основные закономерности функционирования сообществ при контакте с ААВ и факторы, влияющие на их активность.

Показана принципиальная разница характеристик и оптимальных параметров для первой стадии метаногенной деструкции азокрасителей (обесцвечивания) и последующих этапов разложения образовавшихся ароматических аминов. Впервые определены основные ароматические и линейные интремедиаты процесса метаногенной деструкции ААК и предложена последовательность реакций, осуществляемая в сообществах. Независимо от происхождения сообществ продемонстрирована схожесть у них цепи реакций деструкции ААК,

наиболее соответствующей бензоил-КоА-пути. Впервые показана возможность деструкции ЛАК сообществами, выделенными нз донных отложений естественных водоёмов, которые ранее не подвергались массированному воздействию таких ксенобиотиков. Впервые установлено, что при преобразовании ААВ и их ннтермеднатов сообщества также меняют свою структуру.

Из метаногенного сообщества выделен Citrobacter frcundii \VA1, осуществляющий не описанную ранее реакцию восстановления и одновременного дезамииирования АЛК. Впервые показано наличие и индуцибельный характер данной активности у штаммов вида Citrobacter frcundii. хранящихся в коллекции микроорганизмов каф. микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.Из активных метаногенных сообществ выделены два штамма Pseudomonas aeruginosa ASA2 п Tsaydam-5-ASA и впервые показана возможность опосредования химической реакции трансформации ЛАК биологической нитратредуцнрующей активностью псевдомонад. Выделен и идентифицирован ряд чистых культур (Bacillus suhtilis ЕР-ABA. Moraxella osloensis EP-ABA2. Lactobacillus paracasei ssp. paracasci L-34. L. rhamnosns L-43.1), участвующих в процессе деструкции ААК на стадии брожения. Впервые показано наличие дополнительной функции обесцвечивания азокрасителей у данных лактобацилл п С. freundii WA1. Установлена значимая роль факультативных и аэротолерантных анаэробов в стабилизации и фуикцнонирова......метаногенных микробных сообществ, разрушающих ААВ.

Практическая значимость работы.

В процессе экспериментов с ААВ выработан алгоритм получения и исследования активных и стабильных анаэробных микробных сообществ, который может быть применен к другому классу сложных органических ксенобиотиков. Полученные в работе фундаментальные знания могут послужить основой для моделирования н «конструирования» микробных сообществ с заданными свойствами, а также для отслеживания судьбы ААВ в природе и их влияния па экосистемы различных уровней. Выделенные нами стабильно работающие высокоактивные микробные сообщества могут стать базой для создания биореакторов.

Изучение процессов биологической и химической трансформации ААК. осуществляемых С. fretmdii WA1 и штаммами P. aeruginosa, поможет моделировать микропроцессы, происходящие в анаэробных плах при изменении физико-химических условий.

Данные о сукцессноииых изменениях структуры сообщества и его активности при контакте с ААВ должны учитываться при прогнозировании результатов загрязнения природных и искусственных систем. Исследование бнодеградабелыюй способности сообществ, полученных из донных осадков природных водоемов, почвы, экскрементов животных и человека, и мониторинг изменений их структуры под влиянием ААВ может дать исходные сведения для построения более сложных моделей, а также возможность прогнозировать последствия загрязнения таких биотопов. Простая и быстрая регистрация в кишечных сообществах пищевых азокрасителей и интермедиатов их обесцвечивания и дальнейшей деструкции позволяет рекомендовать такие тесты для первичной проверки данных добавок. Установленные сдвиги в структуре кишечных сообществ при контакте с ААВ и токсичность азокрасителей и продуктов их распада по отношению к лактобациллам, составляющим важную часть нормальной микробиоты ЖКТ млекопитающих, позволяет предвидеть риски для здоровья при попадании пищевых азокрасителей в организм с пищей, напитками и лекарствами.

Материалы диссертационной работы использованы автором для написания разделов в 9-тн учебниках (см. Список публикаций) и вошли в читаемые в МГУ имени М.В.Ломоносова курсы «Микробиология» н «Актуальные проблемы микробиологии». Они могут быть использованы в системе высшего профессионального образования в программах по микробиологии и биотехнологии естественнонаучных направлений.

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены на Симпозиуме INTAS "Microbial and cellular systems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and Environment" (Moscow, 26-30 May, 1999), научной конференции «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов» (Москва, 21 декабря 1999); научной конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 28 мая - 2 июня, 2000); 9-м Международном симпозиуме по микробной экологии "Interaction's in microbial world" (Амстердам, Нидерланды, 26-31 августа, 2001); 7-м Международном семинаре FAO/SREN «Анаэробное разложение для поддержания очистки сточных вод» (Москва, 19-22 мая, 2002); 2-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 10-14 ноября, 2003); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 20-23 октября, 2004); Международной конференции •'Проблемы биодеструкцин техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 14-16 сентября, 2005); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофныс микроорганизмы» (Москва, 21-24 декабря, 2005); 12-й Международной путинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 10-14 ноября, 2008); 4-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Экологические проблемы промышленных городов" (Саратов, 7-8 апреля, 2009); научной конференции "Экосистемы Организмы. Пнновацин-11" (Москва, 24 июня, 2009); Вссроссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 24-27 декабря, 2009); 7-й Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск, 31 мая - 4 июня, 2010); 6-й школс-конфсрснции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 25-27 октября, 2010); 6-й Международной научно-практической конференции «Найновите постижения на европей'ската наука - 2011» (Болгария, София, 17-25 июня, 2011).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 47 работ, из них 10 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 10 глав в учебниках и учебных пособиях, 6 статей в сборниках и 21 тезис докладов.

Положения, выносимые на защиту.

1) Анаэробная конверсия азокрасителей в биогаз, осуществляемая микробными сообществами, является многоэтапным процессом, включающим неспецифическую стадию обесцвечивания и специфическую стадию трансформации образовавшихся ароматических аминов. Эти стадии имеют различный механизм, регуляцию и отношение к параметрам культивирования.

2) Активные метаногенные сообщества независимо от происхождения осуществляют процесс деструкции ЛАВ сходным образом и имеют аналогичную структурно-функциональную организацию.

3) Контакт с ЛАВ приводит к сукцессии микробных сообществ, выражающейся в снижении общего числа клеток, уменьшении биоразнообразия и смене доминирования.

4) Факультативно анаэробные и аэротолсрантныс микроорганизмы играют значительную роль как в процессе метаногенной деструкции ААВ, так и в стабилизации микробного сообщества, разрушающего эти вещества.

5) Искусственные микробные сообщества с заданными свойствами могут быть созданы как из микроорганизмов, выделенных из активных консорциумов одинакового или разного происхождения, так и нз коллекционных штаммов со свойствами, аналогичными присутствующим в консорциуме.

6) Прослеживание судьбы ААВ в кишечных микробных сообществах млекопитающих может быть использовано в качестве первичного теста при проверке пищевых азокрасителей на безопасность.

Структура il объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследований и излагающей полученные результаты и нх обсуждение, заключения и выводов. Текст предваряется списком сокращении и завершается перечнем использованной литературы из 398 источников. Работа изложена на 431 странице, проиллюстрирована 137 рисунками и 43 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы.

В обзоре представлены данные о значимости ЛЛВ в человеческой практике, рассмотрены преимущества и недостатки биологических способов удаления этих ксенобиотиков из отходов н стоков. Обобщены сведения о биохимических путях конверсии азокраептелей и ароматических аминов у микроорганизмов в анаэробных условиях н описаны микробные сообщества н чистые культуры микроорганизмов, способные к деструкции ароматических веществ. Рассмотрены данные о структурно-функциональной организации анаэробных сообществ, осуществляющих полную минерализацию других органических загрязнителей, и о влиянии на их активность различных параметров культивирования.

Экспериментальная часть: материалы il методы.

Биологический материал. В работе использованы илы очистных сооружении (Курьяновской станции аэрации, пивоваренного завода «Eies Pilsener» н свиноводческих комплексов), донные отложения естественных водоемов (озер Хплганта. Цандам, Алгпнское. термальных источников на реках Гарга, Алла, Сея. Белого моря и реки Джамна) и фекалии млекопитающих (лошади, верблюда, козы, оленя, свиньи, коровы и человека), характеризовавшиеся разными физико-химическими и микробиологическими параметрами. Пробы нз содовых озёр Бурятии любезно предоставлены д. б. и. проф. Б. Б. Намсараевым (Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН). Активные штаммы \felhann\airiiia barkeri (DSMZ 800) и MethanospiriHum Inmgatei (DSMZ 864) любезно предоставлены Dr. С. Plügge il Dr. F. de Bock (кафедра микробиологии. Университет Вагенпнгена. Нидерланды).

Основные субстраты и другие реактивы. В качестве субстратов использованы азокрасители Acid Orange 6 (АОб), Acid Orange 7 (A07). Methyl Orange (МО) и Methyl Red (MR), широко применяемые в текстильном производстве, Tartrazine (Tn), Ponceau S (PS) и Sunset Yellow FCF (SY), активно используемые в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Ii Azophloxine (Az), ранее являвшийся пищевым азокрасителем. а в настоящее время запрещенный к использованию в большинстве стран. Как предполагаемые интермедиаты разложения азокрасителей и их изомеры применяли 4-аминорезорцин, 1-амино-2-нафтол, сульфаниловую кислоту, Ы,Ы-днметил-п-фенилендиамнн (ДМФ). 1,4-феннлендна.мнн (Aldrich, США), 2- и 3-аминобензонные кислоты (2- и 3-АБК), 4-аминосалициловую кислоту (4-АСК) (Sigma, США), 4-АБК (Merck. ФРГ), 5-АСК (Merck. ФРГ и Janssen Chimical. Бельгия), а также 3-гидроксибепзальдсгид, бензальдегнд (БА), бромэтансульфоновую кислоту (БЭСК, Sigma, США), бензиловый спирт (БС), 2- и 3-гидроксибеизиловые спирты (2- и 3-ГБС), 2- и З-аминобензнловые спирты (Aldrich. ФРГ), бензойную (БК) и сачицнловую (СалК) кислоты, ацетонитрнл, метанол, уксусную и серную кислоты (Merck, ФРГ), нитропрусспд натрия, фенол, резазурин (Fluka, ФРГ), дрожжевой экстракт (BDH Chemicals, Великобритания) высшей степени очистки. Другие соли и реактивы производства различных отечественных п зарубежных фирм были максимально доступной степени чистоты (не ниже ч.д.а.).

Среды и условия культивирования. Для получения сообществ как базовую использовали минеральную среду №1 (Razo-Flores, 1997а, б; Kalyuzhnyi, Sklyar, 2000), содержащую 0,01% дрожжевого экстракта, микроэлементы и резазурин как индикатор анаэробных условий. Для выделения, очистки и роста чистых и ко-культур микроорганизмов применяли также минеральную среду № 2 (г/л): КН2Р04 - 0,38; Ка2НР04 - 0,53; NH4C1 - 0,30; NaCl - 0,30; СаСЬ 2Н;0 - 0,11; MgCl26H20 - 0,10, с микроэлементами и витаминами. Для выделения чистых культур из сообществ использовали эти же среды с азокрасителями или ароматическими аминами как основными субстратами; МПА или БСА; MRS (как в жидком, так и в агаризованном варианте). В ряде случаев применяли внесение в среды ко-субстратов, экзогенных акцепторов электронов, фосфатного или карбонатного буфера, изменяли содержание дрожжевого экстракта, исключали NH4C1. Ко-культуры WFS и WAC выращивали на^ глюкозо-пептонной среде. Среды для анаэробного культивирования кипятили для избавления от кислорода и разливали под током азота во флаконы, которые закрывали резиновыми пробками и зажимали алюминиевыми колпачками. Газовую фазу во флаконах дополнительно заменяли на требуемую - N2, Ib, NvCtb (80/20), П:/С02 (80/20). Конечное давление во флаконах составляло 160 кПа (-1,6 атм). Среды стерилизовали автоклавированием (1 ати), а раствор витаминов - фильтрованием. После стерилизации в некоторые среды в качестве восстановителя добавляли раствор Na2S 9Н20 до конечной концентрации 0,278 г/л. рН среды устанавливали после стерилизации до 7,0-7,5 - для сообществ; 7,5 - для культивирования штамма WA1 и ко-культуры WSR; 6,8-7,0 - для роста М. barkeñ, М. hungatei, а также для накопления мстаногенов, бродилыциков и гомоацетогенов из сообществ. Базовое культивирование сообществ н чистых культур проводили при 30"С.

Для формирования анаэробных сообществ в жидкую анаэробную среду стерильными шприцами вносили 5-50% об/об гомогенизированной анаэробной пробы, а также ААВ-субстраты и различные добавки, необходимые по условиям опытов, из их стерильных анаэробных концентрированных растворов. Аэробное культивирование осуществляли на качалке (180-220 об/мин). Накопительные культуры различных функциональных групп микроорганизмов получали по классическим микробиологическим схемам (Практикум по микробиологии, 2005). Для выделения чистых культур разведения культуралыюй жидкости высевали глубинным или поверхностным способом в агарнзованные анаэробные среды в чашках Петри и пенициллиновых пузырьках или использовали метод предельных разведений. Посевы инкубировали в анаэробных боксах с газогенераторными пакетами Genbox (bioMerieux, Франция) или в термостате в аэробных условиях.

Методы идентификации микроорганизмов. Выделение и первичную очистку ДНК проводили модифицированным фенол-хлороформным методом (Маниатис и др., 1984; Брюханов и др., 2012). Полученные образцы ДНК дополнительно очищали на миниколонках "VVizard DNA clean-up system" (Promega Corporation, США) согласно инструкции производителя.

Для амплификации полноразмерной копии гена 16S рРНК использовали пару праймеров 8-27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') и 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') согласно протоколу. Продукты ПЦР очищали от посторонних примесей при помощи электрофореза в 0,8% агарозе и на миниколонках "Wizard PCRPreps" (Promega, США) по инструкции производителя. Секвенирование проводили в двух направлениях с применением набора "BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit" (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя. Последовательности генов 16S рРНК сравнивали с помощью данных и программного обеспечения Ribosomal Database Project - RDP (http://rdp.cme.msu.edu). Редактирование последовательностей осуществляли с помощью редактора BioEdit (http://iwbrovvn.rnbio.ncsu.ed4/BioEdit/bioedit.htmn. Последовательности были выравнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы

CLUSTALW v 1.75 (Thompson et al., 1994). Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с помощью пакета программ TREECONW (httpV/bioc-ww.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.htrnl, Van de Peer, De Wächter, 1994).

Разделение фрагментов ДНК, полученных при ПЦР-амплификации выделенных из сообществ образцов с пранмерами 338F (GC) (5-

CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3') и 518R (GC) (5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGGTGBCAGCMGCCGCGGTAA-3'), проводили методом ДГГЭ в 8% полнакрнламндном геле, содержащем линейный градиент (30-70%) ДНК-денатурантов (мочевина и формамид), при 60°С н напряжении 70 В в течение 20 ч. После электрофореза гели окрашивали раствором красителя SYBR Gold (разведение 1:10000) 40 мин. Фрагменты ДНК, извлеченные нз наиболее четких полос геля, рсамплнфицировали. используя универсальные праймеры 907R (5-CCGTCAATTCCTTTAAGTTT-3') и 515F (S-CTGCCAGCMGCCGCGGTAA^').

Для идентификации чистых культур проводили стандартные цитологические и физиолого-биохнмические тесты согласно руководству Берджн (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2001, 2005. 2009), а также API-тестирование (www.apiweb.biornericux.com).

Аналитические методы. Анализ содержания ААВ и НАДН в культуральной жидкости проводили спектрофотометрическнм сканированием в диапазоне длин волн 200-600 им на спектрофотометре Shimadzu UV-1202 (Япония). Концентрацию ароматических аминов определяли также с помошыо ВЭЖХ. используя колонки с обращенной фазой Диасорб 130-Cif,T, б мкм (ВСМ, Россия) и Luna 5u Cis (2) 100 A (Phenomenex, США) в системе уксусная кислота - метанол, ChromSpher С18 2x10 см (Chrompack. Varian Inc., США) в градиенте смеси серной кислоты и ацетонитрила. Inertsil ODS3 2x10 см (Chrompack, Varian Inc., США) в градиенте смеси уксусной кислоты и ацетонитрила. по поглощению при 230-255 им. Масс-снектрометрическни анализ продуктов трансформации ААВ проводили с использованием газового хроматографа HP5890-II (Hewlett Packard, США), снабженного TCD-детектором, и масс-спектрометра 5974А MSD (Hewlett Packard. США). Разделение компонентов пробы производили на капиллярной колонке SÍ15CB-MS 25 м х 0.32 мм (Chrompack, Varian Inc.. США). Концентрации летучих продуктов определяли с помощью хроматографов CHROM - 5 (ЧССР), Chrompack СР9000 (Varian Inc.. США) с пламенно-ионизационным детектором на колонке SÍL5 СВ 25 м х 0.32 мм (Chrompack. Varian Inc.. США) и Кристалл 2000М (Россия) на микрокапиллярной колонке Zcbron ZB- FF АР (США). Концентрацию органических кислот также определяли с помощью ВЭЖХ разделением на колонках Polyspher OAHY 3 см X 6.5 мм (Merck, ФРГ) и Varian Mctacarb 67Н (300 мм) (Merck, Германия). Концентрацию аминокислот определяли с помощью ВЭЖХ в обращенных фазах с разделением на колонке Inertsil ODS2 (Chrompack, Varian Inc., США), регистрируя поглощение при 436 нм с помощью детектора ThermoQuest (США). Определение содержания лактата проводили электрохимически с использованием бносенсоров первого поколения на основе L-лактатоксидазы в проточно-инжекцнонной ячейке (www.rusens.com). Аммоний-ион в культуральной жидкости накопительных культур определяли по стандартному методу Несслера (Лурье, 1984) и методу Фосетта и Скотта (Fawcett. Scott. 1960) с нитропруссидом натрия. Сульфид-нон детектировали по методу Трюпера и Шлегеля (Truper. Schlegel. 1964) с ДМФ. Определение концентрации нитратов в жидкой фазе проводили с помощью спектрофотометрнческого метода с хромотроповой кислотой, а нитритов - с а-нафтиламином (Лурье, 1984), используя спектрофотометр Shimadzu UV-1202 (Япония). Нитрат, нитрит, сульфат, сульфит и тиосульфат анализировали также с помощью ВЭЖХ на аналитической колонке Ionopac AS9-SC (Chrompack. Varian Inc.. США). Концентрацию органических веществ в жидкой фазе определяли по ХПК, выявленному бнхроматным методом (Лурье, 1984). Анализ газов проводили на хроматографе ЛХМ 8 МД - модель 3 с катаромстром (Россия), на колонках.

заполненных порапаком - QS, и на хроматографе Кристалл 2000М (Россия) с катарометром и набивной колонкой, неподвижная фаза - уголь, с предварительным измерением давления во флаконах с помощью манометра WIKA (Германия). Содержание водорода, метана и СО: измеряли также на газовом хроматографе Shimadzu, модель GC-20I4 (Япония), содержащем 2 колонки н снабженном TCD-детектором. Разделение водорода и метана проводили на колонке Nlolsieve 2 м х 3 мм, температура детектора 150°С, газ-носитель - аргон. Концентрацию СО; измеряли на том же хроматографе, снабженном TCD-детектором, температура детектора 130°С, газ-носитель - гелий. Разделение производили на колонке Poraplot Q С37554, 25 м х 0,53 мм (Chrompack, Varian Inc., США).

Для определения скорости роста штаммов измеряли оптическую плотность проб культуралыюй жидкости на однолучевом спектрофотометре LKB Ultraspec II (Швеция). Рост молочнокислых бактерий оценивали нефелометричсскн с использованием фотоэлектрического колориметра-нефелометра ФЭКН-57 (Россия). В ряде случаев количество клеток определяли с помощью рассевов на агаризованные среды по Коху. Содержание белка в среде анализировали методом Бредфорд (Bradford, 1976). Концентрацию биомассы оценивали по количеству БВБ (Скляр, 1987). Общую протеолитическую активность определяли методом Ансона (Anson, 1935; Hagihara et al., 1958)

Микроскопические методы. Сравнительный анализ морфологического состава анаэробных сообществ и приблизительную оценку численности клеток проводили с помощью световой и электронной сканирующей микроскопии (Практикум по микробиологии, 2005). Препараты живых клеток просматривали с использованием фазового контраста на микроскопе Leica DMR ПС (Wetzlar, ФРГ) со встроенной цифровой камерой Leica DC 250. Фиксированные в пламени горелки и окрашенные препараты просматривали в световом микроскопе «Микмед-1» (ЛОМО, Россия) и Биолам-2 (ЛОМО, Россия) с масляной иммерсией при общем увеличении 900-Ю00х. Фотографирование препаратов и колоний на агаре производили фотоаппаратом «Canon IXUS 70» в автоматическом режиме. Зафиксированные в 2,5% растворе глугарового альдегида и обезвоженные образцы, закрепленные на предметных столиках, напыляли порошком золота и просматривали на электронных сканирующих микроскопах "AMRAY 18301" (США) и '-Hitachi S-405A"№oiiim).

Экспериментальная часть: результаты и обсуждение.

Деструкция изокрасителей метаногенными микробными сообществами из luoe очистных сооружений. На первом этапе работы использовали пробы илов из очистных сооружений пивоваренного завода «Эфес Пилснер» (ЕР) и Курьяновской станции аэрации (КСА), которые перерабатывали смеси загрязнителей, состояли из большого числа видов микроорганизмов различных функциональных групп и были способны к мстаногснному разложению органических веществ. Для работы выбрали четыре технических (АОб и 7, МО и MR) и два пищевых (Тп и PS) азокрасителя. Метаногенные консорциумы микроорганизмов были получены внесением в среду № 1 10% по объему инокулята и растворов субстратов до конечной концентрации 50-300 мг/л. В анаэробных условиях культивирования микробный консорциум КСА обесцвечивал все 6 веществ практически без лаг-периода, но с разной скоростью, убывающей в ряду: MR > PS > МО > А07 > Тп = АОб. Микробное сообщество ЕР гораздо медленнее фрагментировало PS (MR > МО > А07 > АОб > PS) и не разлагало в условиях опыта Тп (рис. 1).

Обесцвечивание не содержащего сульфо-группу азокрасителя MR (1) привело к образованию ДМФ н 2-АБК, после чего в консорциуме КСА началось выделение метана (рнс. 2А) как за счет деметилирования ДМФ до 1,4-фенилендиа.мина (2), так и за счёт последующей полной минерализации 2-АБК (3). 1,4-фенилендиамин был устойчив к дальнейшему разложению и накапливался в культуралыюй жидкости.

[.'С

■ АС6

Я 0.08

Г г.

* х

КСА ЕР

Микробные сообщества

Рис. 1. Обесцвечивание микробными сообществами анаэробных условиях.

азокрасителеи КСА и ЕР в

В сообществе ЕР полное обесцвечивание МК приводило к появлению ДМФ и 2-АБК (рис. 2Б). однако далее в течение 90 сут опыта они накапливались, а выделения метана не происходило.

В процессе обесцвечивания АОб в обоих консорциумах наблюдали постепенное накопление метана (рис. ЗА), очевидно, за счет минерализации 4-аминорезорцина (5). появления которого следовало ожидать исходя из структурной формулы азокраентеля (4), но который не был обнаружен.

СОС№

СООКа

Рис. 2. Разложение МИ консорциумом КСА (А) и изменение спектра культу-ральной жидкости сообщества ЕР с МЯ

(Б).

■"•»МеТВ* —ДМ»

5 10 15 20 Время, егг

(4)

НО- —N=1*1 - < 50зИ« 4|Н|» НО— ')—ИНг * 50,N8

ОН

(5)

он

+ 4Н,0-► зсн4 + зсо2 + нн,

1 0.8 т

;| 0.7 -

| 0.6

1 од —А07 ■ Метан

5 ОА Сульф. К-73

|оз 1-эмино-2-нзфтал

»0.2

'¿од X

0 5 10 1 5 20 25

ОН

Рис. 3. Разложение АОб и А07 анаэробными консорциумами (на примере ЕР).

После полного обесцвечивания А07 (6) обоими сообществами концентрации образовавшихся 1 -амино-2-нафтола и сульфа-ниловой кислоты практически не изменялись, а накопление метана было незначительно (рис. ЗБ).

Рис. 4. Разложение МО анаэробными консорциумами (на примере ЕР).

Под действием обоих анаэробных консорциумов МО восстанавливался (7) с образованием ДМФ и сульфанило-вой кислоты, не разлагавшейся в течение 90 сут культивирования. Выделение метана регистрировали одновременно с образованием устойчивого 1,4-феннлендиамина в процессе деметилирования ДМФ (рис. 4).

Количество метана в сообществах, где он образовывался, соответствовало теоретически рассчитанному по уравнениям полной минерализации разлагаемых интермедиа-тов.

Под действием КСА фрагментация РЭ проходила постепенно с изменением цвета с малинового на оранжевый, а затем среда становилась бесцветной. В качестве интерме-диата фиксировали образование сульфаниловой кислоты, со временем накапливающейся в среде. После полного обесцвечивания наблюдали активное образование биогаза, очевидно, за счет разложения не идентифицированных нами продуктов (рис. 5А, Б). Существенное расхождение теоретически рассчитанных (8 ммоль) и экспериментально определённых (3,8 ммоль) количеств образовавшегося метана свидетельствовало о неполноте их разложения.

Сообщество ЕР разрушало РБ медленнее, но с образованием тех же интермедиатов, однако без выделения метана.

О 5 10 15 20 _Время, сут_

ІОДІ

Сульфмклояая кислота

Время, слт

Рис. 5. Предполагаемая схема распада РБ (А) и его разложение под действием анаэробного мета-ногенного консорциума КСА (Б).

Обесцвечивание Тп консорциумом КСА приводило к образованию сульфаниловой кислоты, которая накапливалась в культуральной жидкости. и метана за счет разложения неидентифици-рованных интермедиатов (рис. 6). Из-за их неполной минерализации полученное экспериментальным путем количество метана (3.5 ммоль) не соответствовало теоретически рассчитанному (5 ммоль).

Микробное сообщество ЕР не обесцвечивало Тп в течение 90 сут.

Таким образом, все исследованные азокраси-тели (кроме Тп в случае ЕР) в анаэробных условиях эффективно обесцвечивались под действием метаногенных сообществ микроорганизмов (см. рис 1). в то время как в аэробных условиях только МЯ подвергался разложению консорциумом КСА (рис. 7).

011 Т«гЦэлк

Сульфамялоям кнезот»

м»ООС

-Су«4вниг кислота

Рис. 6. Предполагаемая схема распада Тп (А) и его разложение под действием консорциума КСА (Б).

Микробное сообщество КСА в целом показало более высокую активность обесцвечивания азокрасителей и образования метана, чем консорциум ЕР. однако ни в одном сообществе не была достигнута полная конверсия азокрасителей в биогаз. Легче всего оба консорциума обесцвечивали МИ. не содержащий сульфо- и гидроксильных заместителей и имеющий одну азосвязь.

Рис. 7. Аэробная инкубация сообществ с азокрасителями (на примере МЯ. Тп и Р5).

Скорость обесцвечивания росла в интервале значений концентраций азокрасителей 0-2 мМ (для РБ - до 1 мМ) и при повышении температуры культивирования в диапазоне 20-55°С. При содержании инокулята 5-10 об.% ее значение становилось практически постоянным, а оптимальные значения рН находились в

диапазоне 6,5-8,0. При этом учитывали, что обесцвечивание является только первой стадией биодеструкции азокрасителя и ее ускорение необязательно должно повысить скорость всего процесса полной конверсии субстрата в биогаз.

Рис. 8. Изменение скорости обесцвечивания азокрасителей при внесении в среду сообщества ЕР экзогенных акцепторов электронов и этанола.

В опытах с более простыми по химическому строению МЯ, АОб и 7 и МО и консорциумом ЕР,

заведомо обладающим как сульфат-, так и нитратвосстанавливающей активностями, показано, что внесение в среду 2 мМ сульфата и особенно нитрата резко замедляло процесс обесцвечивания (рис. 8А) за счет эффективной конкуренции с азогруппами за восстановительные эквиваленты. Добавление в среду 4 мМ этанола в качестве доступного ко-субстрата (донора электронов) увеличивало скорость обесцвечивания азокрасителей (рис. 8Б), так как при его потреблении анаэробным сообществом синтезировались дополнительные

Рис. 9. Обесцвечивание азокрасителей анаэробной куль-туральной жидкостью, освобожденной от клеток (А); путем химического восстановления 0,5 мМ сульфида (Б) или 0,5 мМ НАДН (В) и сравнение средних скоростей обесцвечивания анаэробным консорциумом и его метаболитами (на примере сообщества ЕР и АОб, КЖ - культуральная жидкость).

Обесцвечивание структурно различных азокрасителей анаэробными сообществами разного происхождения практически без лаг-периода, в том числе консорциумом из аэробного активного ила КСА в анаэробных условиях, показывает неспецифичность этого процесса. Сохранение способности анаэробных сообществ к обесцвечиванию азокрасителей на фоне полного подавления метаногенеза с помощью БЭСК говорит о второстепенной роли ацетокластических метаногенов в процессе восстановления азосвязей. Отсутствие

восстановительные эквиваленты.

ОДБ

гут__и ИДДН 0,5 IV.N1

обесцвечивания азокрасителей автоклавированным сообществом подтвердило, что адсорбция не является фактором, существенным для процесса, и для его прохождения необходимы жизнеспособные клетки. Оценка токсического влияния исходных азокрасителей и образовавшихся в результате их обесцвечивания ароматических аминов по изменению ацетокластической метаногенной активности анаэробного сообщества (табл. 1) отчасти подтвердила, что анаэробное восстановление может представлять собой неспецифичную реакцию детоксикации (Donlon et al., 1995; Razo-Flores, 1997), так как только 1-амнно-2-нафтол и 1,4-феннлендиамин оказались более токсичными, чем исходный азокраситель. В то же время, между скоростями обесцвечивания азокрасителей в анаэробных условиях (см. рис. 1, MR > PS > МО > А07 >Тп = АОб) и их токсичностью (табл. 1, МО > А07 > MR > PS > АОб > Тп) не наблюдали корреляции, поэтому эта характеристика азокраснтеля не может быть напрямую использована для предсказания эффективности его обссцвсчивання анаэробным сообществом.

Восстановление активности ацетокластического метаногенеза после многократной стерильной отмывки консорциума ЕР от 2 мМ (10-тикратного уровня IC50) самого токсичного из азокрасителей МО послужило косвенным свидетельством преимущественно внеклеточной локализации первой стадии деструкции азокраснтеля. Еще одним доказательством восстановления азосвязи вне клеток явилось полное обссцвсчиваннс азокрасителей с образованием соответствующих ароматических аминов бесклеточной культуральной жидкостью. содержащей все продукты жизнедеятельности микробных сообществ (рис. 9А) без дальнейшей конверсии аминов и выделения метана.

Таблица 1.

Токсичность азокрасителей и ароматических аминов в анаэробных условиях._

Азокраситель 1С su азокраснтеля, мМ ICso образовавшихся ароматических аминов, мМ

МО 0,25 Сульфаниловая кислота Не токсична до 2,0 ДМФ 2,02 1,4-фенилендиамин 0,51

А07 0,90 Сульфаниловая кислота Не токсична до 2,0 1 -амино-2-нафтол 0,54

MR 0,99 2-АБК Не токсична до 2,0 ДМФ 2.02 1,4-феннлендиамин 0.51

PS 2.00 Сульфаниловая кислота Не токсична до 2,0 Нендентнфицированный(е) ароматическин(е) ннтермедиат(ы) н.о.

АОб 2,50 Сульфаниловая кислота Не токсична до 2,0 4-амннорезорцин >2,0

Тп >2,50 Сульфаниловая кислота Не токсична до 2,0 Неидентифицированный(е) ароматический(е) интермедиат(ы) н.о.

Примечание: токсическое воздействие ароматических аминов оценивали вплоть до концентрации 2,0 мМ, н.о. - не определяли.

Метаболиты, участвующие в обесцвечивании азокрасителей, отличались термонестабнльностью, так как подвергнутые автоклавированню микробные консорциумы не восстанавливали азосвязь. Для выявления конкретных соединений, участвующих в разрыве азосвязей, проверили возможность восстановления азокрасителей (150, 75 и 0,75 мг/л) в бесклеточной системе. В присутствии сульфида (после небольшого лаг-периода, рис. 9Б) или НАДН (рис. 9В) все исследуемые азокрасители полностью обесцветились с образованием

ароматических аминов. Однако поскольку концентрации сульфида и НАДН, измеренные в культуральной жидкости анаэробного консорциума, были очень низкими (<0,05 мМ и <20 мкМ, соответственно), то эти соединения нельзя считать основными агентами восстановления азокрасителей, хотя определённый вклад в обесцвечивание они могли вносить (рис. 9Г).

При взаимодействии рибофлавина и АОб в бесклеточной системе обесцвечивания последнего не наблюдали, в то время как добавление рибофлавина даже в низкой концентрации (15 мкМ) в анаэробный консорциум привело к увеличению скорости обесцвечивания азокраснтеля практически в 10 раз. Однократное добавление рибофлавина способствовало сохранению повышенной скорости фрагментации АОб на протяжении последующих циклов обесцвечивания азокрасителя, что говорит о многократном участии (обратимом окислении-восстановлении) рибофлавина или его производного в качестве переносчика.

На основании полученных данных нами предложен гипотетический механизм анаэробного восстановления азокрасителей (рис. 10). В соответствии с ним азосвязь красителя расщепляется под действием восстановленных всщсств-мсдиаторов, являющихся продуктами метаболизма микробного сообщества в анаэробных условиях. При этом роль микробных клеток заключается в постоянном пополнении запаса таких веществ за счет ферментативного восстановления их окисленной формы.

Деструкция ароматических аминов метаногенными микробными сообществами и> илов очистных сооружений. В случае использования ароматических аминов-интермедиатов восстановления азокрасителей как исходных субстратов в анаэробных условиях полной минерализации до биогаза подвергались 4-аминорезорцин, 1-амино-2-нафтол и 2-АБК (рис. 11). Характерной особенностью процесса их конверсии в бногаз являлось наличие лаг-периода, длительность которого для 4-аминорезорцина составила 3-4 сут, для 2-АБК - 14 сут и для 1-амино-2-нафтола - 22 сут. Интересно, что при обссцвсчивапии А07 образующийся 1-амино-2-нафтол практически не подвергался дальнейшей деструкции. Количество выделившегося метана во всех случаях в целом соответствовало теоретически рассчитанному по уравнениям полной минерализации для 4-аминорезорцина (5), 2-АБК (3) и 1-амино-2-нафтола (8). Было также отмечено увеличение концентрации обязательного продукта - аммиака (аммония).

so,11

N11,

! +4И.01-1Г -► 2.5Cll4f 3.5СО, 1-Nllj'1-H.S

I |: I i SH.O -5.5СН4 - 4.5СО, t\II: I

(g)4^^ (9) NH2

При использовании в качестве исходного субстрата сульфаниловон кислоты анаэробные сообщества после лаг-периода длительностью 25 суг осуществляли ее метаногенную биодеградацию на 60% за 40 сут (рис. 12А), тогда как при обесцвечивании азокрасителей она накапливалась в среде и дальнейшей минерализации не подвергалась. Экспериментальный баланс (1,1 мМ СН4) для конвертированного в бногаз количества сульфаниловой кислоты (0,5 мМ) согласуется с теоретически рассчитанным по уравнению 9 (1,25 мМ CHj), хотя по данным литературы сульфосодержащпе ароматические амипы вообще не способны разлагаться в бескислородных условиях (Таи, 2001).

ДМФ и 1,4-феннлендиамин не разлагались анаэробными сообществами в течение 360 сут инкубации. ДМФ, подвергавшийся деметнлированию в консорциумах, обесцвечивающих азокрасителн МО и MR, при использовании в качестве исходного субстрата оказался устойчивым и накапливался в культуральной жидкости. Вероятно, при обесцвечивании этот интермедиат образуется постепенно, в небольших количествах, не оказывающих ингибирующего действия на микроорганизмы, осуществляющие деметилирование.

Беспветные ачпвы (

"О«

Азокраситель

Окисленные продукты

Донор электронов

Рис. 10. Гипотетический механизм обесцвечивания азокрасителей: МВ0Сст.. Мокисл. - окислнтельно-вос-становительнын(е) медиа-тор(ы), восстановлен-ный(е) и окисленный(е). соответственно. РФ - рибофлавин. СР - сульфат-редуктор.

Сравнительная оценка показателей токсичности каждого амина, определенная по степени снижения активности ацетокласти-ческого метаногенеза. показала (см. табл. 1), что биоразлагаемость не вполне коррелирует с этой характеристикой.

Рис. 11. Деструкция ароматических аминов (А) и образование метана (Б) анаэробными сообществами (на примере ЕР).

Так, полной метаногенной конверсии подвергался достаточно токсичный 1 -амино-2-нафтол. в то время как нетоксичная суль-фаннловая кислота разлагалась только на 60%. Это еще одно подтверждение «неуниверсальности» такого метода определе-

0 10 20 30 45 » 60 BpfJHLCVT -2-ЛБК "•-4-ам№«М1еэ&риии

10 20 30 « 50 60 Время.«тт Б

возможного ингибирования аминами

кислот»

ло сульфаниловую кислоту в течение деструкции в аэробных условиях (Tan.

ния токсичности и свидетельство активности микроорганизмов нсмстаногенных стадий процесса.

Рис. 12. Неполная конверсия сульфаниловой кислоты в биогаз в анаэробном метано-генном сообществе (А): разложение 2-АБК и устойчивость сульфаниловой кислоты в аэробных условиях (Б).

В то же время, в аэробных условиях сообщество из активного ила КСА не разлага-25 сут (рис. 12Б), хотя в литературе есть данные о ее 2001). 4-аминорезорцин. 1-амино-2-нафтол, ДМФ и 1.417

В' 4 ■ I I Только 2-АБК полнос-

I * lit - I тью минерализовалась под

Щ0 Ж К Я действием аэробного кон-

Ж • Ъ Я соРЧиУЬ1а (Рис- 12Б). что

(HL ^Bft ^И соответствует данным

а <i/ I других авторов (Balba,

А ^ 5 Evans, 1980; Lochmeyer

al„ 1992). Об этом свидетельствовало также снижение значения ХПК культуральной жидкости в конце опыта на величину 0,39 г ХПК/л при начальной концентрации 2-АБК в среде 0,3 г ХПК/л. Использование безаммонийной среды в наших экспериментах привело к существенному сокращению (в 2-3 раза)

Соотношение морфотнпов в исходном иле ЕР, °/о

■ Крупные прямые палочку

■ Короткие овальные палочки

* Крупные овалы

■ Короткие толстыеизогнутые палочки

■ Мелкие прямые палочки

г Тонкие длинные прямые палочки

■ Мелкие короткие прямые палочки

* Изогнутые палочки с округлыми концами

* Мелкие изогнутые палочки

■ Тонкие изогнутые палочки в цепочках

* Нитевидные палочки с заостренными концами Крупные о^нсчные кокки

Одиночные кокки среднегоразмера Мелкие одиночные кокки

лаг-периодов разложения 2-АБК и 4-амино-резорцина,тогда как 1-амино-2-нафтол в этих условиях не разлагался даже через 120 сут. Нехватка азота при сохранении всех остальных параметров опыта не изменила скорость и глубину частичной конверсии сульфани-ловой кислоты и не привела к деградации устойчивых ДМФ и 1,4-фенилендиамина.

фенилендиамин в аэробных условиях через несколько часов подвергались автополимеризации с образованием темного нерастворимого осадка, поэтому их анаэробная деструкция, вероятно, является единственным путем минерализации этих соединений.

Рис. 13. Микроскопическая картина исходного ила КСА (А) и консорциума КСА с РЭ (Б), ЮООх.

разложения).

Рис. 14. Соотношение морфотипов в исходном иле ЕР и в сообществах с МО, МИ., РБ (обесцвечивание), 2-АБК (полная конверсия в биогаз), супьфа-ниловой кислотой (неполная конверсия) и ДМФ (отсутствие

2-АБК

сульф. кислота

Добиться практически полной конверсии сульфаниловой кислоты в биогаз удалось путем внесения дополнительной порции анаэробного инокулята (10% от объема исходного

биоматериала) и снижения начальной концентрации субстрата с 0,8 до 0,5 мМ при инкубации сообщества на безаммоиийной среде. Вероятно, за счет уменьшения концентрации субстрата было снято ингибирование всех стадий процесса, а отсутствие аммония стимулировало отщепление аминогрупп и дальнейшие превращения субстрата. Накопление конечных продуктов (1,35 мМ СТЦ. 0,6 мМ NH4* it 0.4 мМ hbS) соответствовало теоретически рассчитанному (1,25 мМ СНд, 0,5 мМ NH4+ и 0,5 мМ H;S), причем концентрация сульфида не превышала 0,48 мМ и не являлась ингибпругошей для анаэробных микроорганизмов (Калюжный и др.. 1991).

Присутствие сульфата в среде не привело к изменениям бнодеградабельности ДМФ и 1.4-феинлеиднамнна. тогда как внесение 3 мМ нитрата имело следствием исчезновение субстратов из культуралыюй жидкости и образование темного нерастворимого осадка вследствие автополимеризации.

При полной или частичной конверсии 2-АБК. 4-амшюрезорципа, 1-амино-2-нафтола и сульфаниловой кислоты в качестве промежуточного продукта фиксировали только следовые количества ацетата.

Морфологические особенности микробных консорциумов, разрушающих азокрасители и ароматические амины. Определение морфологического состава анаэробных микробных сообществ при добавлении азокрасителей в концентрации 0,75 мМ и приблизительную оценку численности микробных клеток проводили с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии. Несмотря на ограниченность этого метода оценки, его применение позволило нам судить о качественных н количественных изменениях состава исследуемых сообществ. В исходных илах выявлено 14 основных морфотнпов, из них 11 типов палочек и 3 типа кокков. В сообществах с азокрасителями и ароматическими аминами количество морфотнпов и общая численность клеток снижается (рнс. 13). При этом для всех случаев контакта с ААВ наблюдали уменьшение доли преобладающих в исходных илах длинных палочек с тупыми концами, расположенных главным образом в цепочках, и относительное увеличение доли кокковидных клеток, особенно резкое в сообществах с устойчивыми соединениями (рис. 14). Независимо от степени деградации аминов в их присутствии число оелнзненпых и поврежденных клеток в сообществах было повышено на 30-50% как по сравнению с исходными илами, так и по сравнению с консорциумами, разлагающими азокраептелн. Чем медленнее происходило разложение азокраситсля, тем более явным «обедняющим» изменениям подвергалось сообщество. Эти же параметры в сообществах при контакте с ароматическими аминами коррелировали с биоразлагаемостью и ацетокластической токсичностью соединений. Таким образом, внесение в анаэробные метаногенные сообщества ААВ привело к визуально наблюдаемым количественным и качественным изменениям, т.е. эти вещества оказывали селективный эффект на состав консорциумов.

Деструкция изомеров АБК и АСК микробными сообществами из илов различного происхождения. Для детального исследования этапов преобразования ААВ в биогаз и изменений в структуре консорциумов выбрали амнноароматические монокарбоновые кислоты с одной аминогруппой (ААК): 2-, 3-, 4-АБК и 4-, 5-АСК. Эти соединения являются интермеднатами обесцвечивания многих азокрасителей (MR, Mordant Yellow, Mordant Orange, Siriuslichtbraun, Siriuslichtgclb и др.) и имеют важное значение как самостоятельные загрязнители стоков и отходов нефтехимической и фармацевтической промышленности. Также расширили спектр источников метаногепных сообществ, включив в работу мезофильный флокулярнын ил очистных сооружений стоков свиноводческих комплексов (CK) и донные отложения природных водоемов с разными физико-химическими параметрами (см. Биологический материал). Активные сообщества получали путем длительной инкубации бноматериала на среде № 1 в анаэробных условиях с одним из изомеров ААК, варьируя три температуры (20. 30 и 55°С). Начальный pH среды для каждого ила соответствовал pH

исходного местообитания. В консорциумах из донных осадков термальных источников рек Алла, Сея и Белого моря за счет адсорбции (что было показано в опытах с автоклавнрованной биомассой) концентрация субстрата палата на 10-20% в течение 20-50 сут, однако разложения ААК не происходило. В сообществах из донных осадков термальных источников реки Гарга и озера Алгинское содержание ААК на 15-50% изменялось вследствие неполной деструкции, так как регистрировали следовые количества 1Ь и ЛЖК (ацетата, пропионата, бутнрата), однако ни образования биогаза, ни дальнейшего потребления субстрата не наблюдали в течение последующих 2-х лет. Потребление субстрата с выделением биогаза было отмечено только в консорциумах, представленных в табл. 2. Во всех микробных ассоциациях независимо от степени их активности даже при принудительном подщелачивании в процессе культивирования рН самопроизвольно устанавливался в интервале значений 6,5-8,0. Несмотря на разнообразие использованных нами сочетаний температуры инкубации и кислотности срсды, оптимальным для процесса биодеградацил выбранных субстратов оказался режим культивирования при температуре 30°С и околонентральном (6,5-7,5) значении рН. Не удалось получить ни одной активной и стабильной ассоциации при пониженной или повышенной температурах и высоком уровне рН.

Таблица 2.

Сообщества, показавшие потребление ААК._

Вариант Параметры культивирования, субстрат Лаг-период активности биоразложения (сут) Средняя скорость деградации (мМ/сут) в цикле потребления субстрата'

СК ,0= 30»с рН = 6>5_7>5> 2. АБК 80-100 0,60-0,80

Г=30"С. рН = 6,5-7,5.4-АБК 300 0,15

1"= 30"С, рН = 6,5-7,5, 5-АСК 150-200 0,50

1"= 55"С, рН = 6,5-7,5, 3-АБК 250 0,50 (автополимернзация субстрата во 2-ом цикле)

КСА 1°= 30°С, рН = 6,5-7,5. 2-АБК 10 0,03

I"- 30"С, рН = 6,5-7,5, 4-АБК 10-14 0,03

ЕР 1"= 301,С. рН - 6,5-7,5. 2-АБК 7-14 0,08

X 1=30"С, рН=7,0, 2-АБК 50 0,02

Ц 1=30"С, рН=7,0, 2-АБК 35 0,22

1=30"С, рН=7,0, 3-АБК 176 0,03

1-30"С, рН-7,0, 4-АБК 176 0.04

1-3()"С, рН=7,0, 5-АСК 113 0.07

Дж »=30"С, рН=7,0, 2-АБК 54 0,04

1-30"С, рН=7,0, 4-АБК 90 0,01

1=30"С, рН=7,0, 5-АСК 176 0.02

*цнкл потребления субстрата - промежуток времени от внесения субстрата до момента его полного использования.

В активных консорциумах на начальном этапе всегда наблюдали лаг-период (7-300 сут), в течение которого могли регистрироваться незначительные колебания концентрации субстрата в

среде, однако активного его разрушения не происходило. В зависимости от источника биоматериала различались время адаптации к ААК (см. табл. 2) и длительность цикла его потребления, однако природа и последовательность появления промежуточных и конечных продуктов были сходны во всех активных сообществах (рис. 15). В новом цикле потребления наблюдали увеличение содержания бензоата. аммония и метана, однако уровень ацетата оставался постоянно низким. Дальнейшее использование того же субстрата активными консорциумами обычно протекало без лаг-периодов и с увеличенной скоростью (сокращалась длительность цикла потребления), причем Нг, ЛЖК и спирты уже не регистрировались. В целом, наиболее высокие показатели активности и стабильности бподеградации показали микробные сообщества, полученные из илов очистных сооружений, вероятно потому, что эти илы были изначально адаптированы к высоким концентрациям смесей органических веществ, обладали исходным высоким биоразнообразисм микроорганизмов и существовали при температуре и значениях рН, наиболее приближенных к тем, что оказались оптимальными для процесса биодеструкции.

Рис. 15. Типичная картина появления промежуточных и конечных продуктов при биодеградации ААК на примере сообщества СК. разрушающего 2-АБК (стрелками отмечено время регистрации следовых количеств водорода, ЛЖК и спиртов - пропи-оната. ацетата, бутирата. этанола и изопропанола).

Не удалось получить ни одного активного и стабильного консорциума, разрушающего 4-АСК. Наиболее биодеградабельным субстратом для микробных ассоциаций различного происхождения оказалась 2-АБК. В дальнейших исследованиях основной упор был сделай на активные и стабильные сообщества СК (2-, 4-АБК и 5-АСК). КСА (2- и 4-АБК). ЕР (2-АБК) и Ц (2-АБК и 5-АСК).

Показано, что скорости использования субстрата и образования метана возрастают линейно при увеличении начальной концентрации ААК в среде от 0 до 1200 мг/л (от 0 до 8.759 мМ). Микробное сообщество в варианте с максимальным содержанием субстрата было представлено более крупными и рыхлыми хлопьевидными агрегатами, а с минимальным - мелкими частицами, лежащими плотным слоем, тогда как по литературным данным для других органических веществ в системах с высокой концентрацией субстратов, напротив, развиваются компактные и более мелкие агрегаты (ТИауеезп сП а1„ 1995; Ркмогеапи е! а!.. 1998; 1999). При анализе микроскопической картины отмечено примерно одинаковое соотношение морфотипов клеток во всех опытных вариантах с преобладанием скоплений мелких кокков и мелких прямых палочек. Отсутствие ряда морфотипов исходных илов объяснялось, по-видимому, их высокой чувствительностью даже к небольшим концентрациям ААК. Снижение биоразнообразия в сообществе под действием ААК может свидетельствовать об их токсичности для микроорганизмов, причем поскольку деструкция субстрата и метанообразование даже увеличивались, эти члены сообщества скорее всего выполняют вспомогательные функции.

Потребление субстрата и выделение биогаза существенно замедлены прп инкубации активных сообществ в условиях перемешивания (220 об/мин) по сравнению с культивированием в статичных условиях, что отмечено и в литературе (.Типпагкаг с1 а!.. 2006).

1«

14 -»-2-АБК

12 Бензоат

5 10 / А.шдонуп

-1 8 ¡ЛЖК+слярт / -•-Ацетат

6 Ж -♦- Метай

4 —— СО.

2 ----

0«= 85 -ь— 95 -1*—«= 105 115 125 135

СУТ

Параллельные микроскопические наблюдения показали, что в статичных условиях образование структурированных агрегатов происходит намного быстрее и они крупнее, чем при перемешивании.

Установлено, что при увеличении количества биомассы в среде активность биодеградации также повышается, причем в отличие от обесцвечивания азокрасителей в случае разложения ААК «насыщение» не обнаружено вплоть до 50%-ного содержания биологического материала в среде.

Не обнаружено прямой корреляции между концентрацией белка, степенью биоразнообразия исходного биоматериала и активностью биодеградации ААК у сообществ из него. Высокое содержание белка может отражать наличие большего количества микроорганизмов, не принимающих непосредственного участия в процессе биодеградации. В то же время, наибольшей стабильностью обладали сообщества из осадков с богатым видовым разнообразием (СК и КСА), так как по мнению группы авторов (Morales et al., 1996) более разнообразные сообщества могут иметь большую устойчивость к внешним воздействиям. Прирост биомассы, определенный по общему белку через 10 циклов потребления субстрата, составлял не более 510%.

Рис. 16. Зависимость активности биодеградации ААК от концентрации глюкозы (А. на примере ЕР с 2-АБК) и пнрувата (Б, на примере СК с 5-АСК) в среде.

Несмотря на показанную нами потенциальную возможность деградации ААК в илах естественных водоемов, в природных экосистемах эти процессы не происходят или идут очень медленно из-за неоптимальности физико-химических условий. В таких случаях эти соединения могут быстро накапливаться, создавая избыточную нагрузку на процессы самоочищения, кардинально изменять трофические связи и видовой состав данной срсды обитания.

Показано, что оптимальной температурой для всех активных консорциумов является 30°С. Снижение (до 20°С) и особенно повышение (до 55°С) температуры культивирования приводило к падению активности биодеградации, в то время как для обесцвечивания азокрасителей именно высокая температура являлась оптимальной. Установлено, что при отклонении начального значения рН среды от околонейтрального активность и стабильность деструкции ААК существенно снижались, причем высокое исходное значение рН (9,0) во всех сообществах по мере потребления субстрата падало до 7,0-7,5. При принудительном подщелачивании среды все консорциумы сразу, а консорциум Ц через 35 циклов потребления, практически теряли разрушающую способность. Микроскопи-

1 ММ Г/1ЮКС1Ы S «М 1ЛКЖОМ1 10 мМ 1ЛЛОКОДО

20 мМ »«юно 'без Г Л

£ О.Л

з_ s

г о.2

О 1 5 10 20

Концентрация пнруеата. мМ

ческая картина сообществ, культивируемых при экстремальных для процесса значениях температуры и рН, отличалась от растущих при оптимальных условиях наличием большого количества детрита и незначительным общим числом клеток.

Активные метаногенные сообщества, долгое время контактировавшие с ААК. были не способны к их нитрат- и сульфатзавнснмому разложению, тогда как исходные илы обладали активностями нитрат- и сульфатредукции.

Из проверенных легкоусваиваемых ко-субстратов (глюкозы, этанола, пирувата или смеси возможных продуктов стадии брожения - лактата. формиата. ацетата, пропионата. бутпрата) только глюкоза и ппруват оказали заметное стимулирующее воздействие на скорость деструкции ААК. которая повышалась в диапазоне концентраций ко-субстрага 0-20 мМ (рис. 16А. Б). При этом сбраживание пирувата с образованием ацетата, пропионата, формиата, бутирата и лактата консорциумами приводило к снижению рН до 6.7, глюкозы с образованием тех же продуктов - до 5.5-5.0. Усиление метаногенеза коррелировало с повышением концентрации ко-субстрата в среде, однако из-за более резкого закислення среды при сбраживании 20 мМ глюкозы активность метанообразования в этом случае несколько понижалась. Добавление ко-субстрата приводило также к увеличению общей численности клеток в консорциуме, что фиксировали нефеломстричсски и с помощью микроскопии.

Детальное исследование процесса метаиогеишш деструкции ААК. На предыдущих этапах нашей работы в качестве ароматического промежуточного продукта удалось зафиксировать только бензоат. Для «разбалансирования» межвидового переноса интермедиатов с целью их выявления и идентификации использовали разведения микробных сообществ в 2-3 раза, что существенно замедлило общую скорость процесса, однако позволило наряду с IЬ. БК и некоторыми линейными летучими соединениями (этанолом, пропанолом. изопропанолом. пропионатом и бутиратом) зарегистрировать в сообществах СК. КСА. ЕР и Ц продукты первичной трансформации: 2-гидроксибензиловый спирт (2-ГБС) для 5-АСК и бензиловый спирт (БС) - для АБК и СалК. Все идентифицированные и предполагаемые (исходя из структурных формул ААК) ароматические интермедиаты были внесены в среду с активными консорциумами в концентрации 2-3 мМ. Также проверили возможность обесцвечивания этими сообществами азокрасителя АОб. продуктами восстановления которого являются ароматические амины, отличные от использованных нами ААК. Установлено (табл. 3). что сообщества различались по субстратным предпочтениям, однако все они были способны восстанавливать азосвязь АОб. что еще раз подтверждает неспецифичность данной реакции. Продукт дальнейшего превращения БС и 2-ГБС был идентифицирован как БК. БС и 2-ГБС значительно активней потреблялись теми консорциумами, в которых они были определены как первичные продукты трансформации основного субстрата. В то же время, скорость использования 2-ГБС была крайне низкой даже в этих случаях, что, как мы определили, было связано с его высокой токсичностью ОСзп для 2-ГБС составила 0.355 мМ). Остальные соединения даже в концентрациях 12-15 мМ не снижали активность образования метана на 50%. Только процесс разрушения 2-ГБС предварялся длительным лаг-периодом (150 сут) и даже через 200 сут не наблюдали полной минерализации этого вещества. Остальные ароматические субстраты потреблялись сообществами значительно быстрее, но с разными скоростями. БК использовали все изученные сообщества.

Консорциум ЕР с 2-АБК оказался единственным, который мог потреблять и БС. п 2-ГБС. поэтому его исследовали более подробно. Внесение 20 мМ пирувата в среду стимулировало процесс биодеградации сообществом ЕР как основного субстрата (2-АБК). так и других использованных ароматических веществ в 2-60 раз, а СалК и БА сообщество ЕР было способно разлагать только в присутствии пирувата. При сбраживании пирувата как единственного субстрата образовывались 1Ь. СО2. ацетат, пропионат. формпат, бутират и лактат.

Таблица 3. Использование ароматических субстратов консорциумами, разрушающими ААК.

Сообщество Субстрат Средняя скорость потребления субстрати, мМ/сут Интермедниты Конечные продукты

СК 2-АЬК (основной) 0,59±0,011 БС, БК. ацетат СН4, СО:, МН4'

БС 0,163*0,074 БК, ацетат, этанол (следы) С114, С02

2-ГБС 0 - -

БК 0,077*0,009 Ацетат, этанол (следы) СН4, С02

СалК 0 - -

А06 0,19*0,008 Сульфаниловая кислота, ацетат, этанол Сульфаниловая кислота, СМ4. СО:. N11/

ск 5-АСК (основной) 0.47*0,014 2-ГБС, БК, 112, ацетат, этанол (следы) СН4, СО:. N11/

2-ГБС 0,003*0,0007 ІІ2 (следы), БК, ацетат, этанол (следы) СН4, СО:. 1МН4+

БС 0 - -

БК 0,010*0,003 Ацетат, этанол (следы) СН4, СО:

СалК 0,09*0,007 БС, БК, ацетат СН4, СО:, N»4'

А06 0,17*0,004 Сульфаниловая кислота, ацетат, этанол Сульфаниловая кислота. СН4, СО:,

КСА 2-АБК (основной) 0,03*0,0017 БС, БК, ацетат С1І4, С02,КН4+

БС 0,167*0,081 БК, ацетат, этанол (следы) СН4, С02

2-ГБС 0 - -

БК 0,071*0,006 Ацетат, этанол (следы) СН4, С02

СалК 0 - -

А06 0,25*0,012 Сульфаниловая кислота, ацетат, этанол Сульфаниловая кислота, СН4. СО:. NH41

4-АБК (основной) 0,03±0,001 1 БС. БК. ацетат сн4. со2, ыш'

БС 0,040±0,003 БК, ацетат, этанол (следы) сн4. со2

2-ГБС 0 - -

КСА БК 0,021 ±0.008 Ацетат, этанол (следы) СН4. ССЬ

СалК 0 - -

А06 0,22±0,029 Сульфаниловая кислота, ацетат, этанол Сульфаниловая кислота, СН4. СО?. ЫН4'

2-АБК (основной) 0,08±0,011 БС, БК, ацетат сн4. со2. ЫН/

БС 0,022±0,0037 БК, ацетат, этанол СІ14, со2

ЕР 2-ГБС 0,002±0,0003 Н2 (следы). БК, ацетат, этанол (следы) СП4, С02

БК 0,113±0,012 Ацетат, этанол (следы) СН4, С02

СалК 0 - -

А06 0,12±0,015 Сульфаниловая кислота, ацетат, этанол Сульфаниловая кислота, СН4, С02, ЫП4"

5-АСК (основной) 0,07±0,0016 2-ГБС, БК, Н:, ацетат, этанол (следы) сш, со2, N11/

2-ГБС 0,003±0,0009 Н2 (следы), БК, ацетат, этанол (следы) СН4, С02, ИН4'

Ц БС 0 - -

БК 0,014±0,002 Ацетат, этанол (следы) сн4, со2

СалК 0,05±0,004 БС, БК, ацетат С114, С02, N11/

АОб 0,10±0,017 Сульфаниловая кислота, ацетат, этанол Сульфаниловая кислота, СН4, С02, Ш/

Приведены средние значения трёх независимых экспериментов со стандартными ошибками среднего.

При исследовании процесса потребления 2-ГБС был идентифицирован еще один промежуточный продукт его трансформации - бензальдегид (БА). Разложение Б С и БК сообществом ЕР при наличии пирувата проходило без лаг-периода и с увеличенной скоростью, причем сначала сбраживался практически весь пируват (0,5-3 сут), затем следовала стадия трансформации БС в БК и деароматизация БК (2-8 сут) и наконец наблюдали полную минерализацию субстратов (13-22 сут).

Таким образом, доступное питательное вещество (пируват) стимулировало не только деструкцию самих ААК, но и ароматических интермедиатов их разложения, что свидетельствует о вероятности осуществления первичной трансформации (амино)ароматических соединений в процессе кометаболизма. Для накопления интермедиатов разложения ААК применили также ингибирование конечных стадий конверсии субстрата в метан с помощью БЭСК, которое, в отличие от обесцвечивания азокраситслей. полностью останавливало деградацию ААК. Подавление метаногенеза в тех же консорциумах, но с добавлением пирувата как ко-субстрата. не оказывало влияния на скорость исчезновения из среды ААК. однако позволило накопить и идентифицировать с помощью ВЭЖХ ароматические

продукты трансформации 5-АСК и АБК как 2-ГБС и БС, соответственно. Обнаружение тех же интермедиатов ароматической природы в условиях блокирования метаногенеза согласуется с результатами наших экспериментов и подтверждает нашу гипотезу и данные литературы по другим ароматическим веществам (Heider, Fuchs, 1997а), что на начальных этапах их деградации не происходит расщепления бензольного кольца субстрата. На основе анализа зарегистрированных нами интермедиатов и последовательности их появления в куль-турапьной жидкости активных сообществ предложена следующая цепь реакций (трофическая цепь) использования ААК (рис. 17).

Рис. 17. Гипотетическая схема метано-генной биодеградации ААК в активных сообществах.

В активных сообществах при внесении ААК бензальдегид (БА) не регистрировался как промежуточный продукт, однако он выявлялся как интерме-диат при использовании в тех же консорциумах 2-ГБС в качестве начального субстрата. Поскольку во всех сообществах с разными изомерами ААК всегда идентифицировали БК, то наиболее вероятным путем деструкции ААК представляется бснзоил-КоА-путь, наиболее распространенный по литературным данным в нитрат- и сульфатредуцирующих условиях (Heider, Fuchs, 1997а).

СООН

БК

Нами не обнаружено потребления активными сообществами флороглюнина. резорцина и его аналога пирогаллола как в качестве единственных источников углерода и энергии, так и в присутствии пирувата, т.е. вероятно в данных сообществах не реализуются альтернативные резорциновый и флороглюциновый пути деградации ААК.

При длительной (более 1 месяца) инкубации активных метаногенных сообществ без ААК (без или с доступным линейным субстратом) активность деструкции ААК падала до нуля, при этом способность к метаногенезу за счет сбраживания пирувата или глюкозы сохранялась. Восстановление прежнего уровня деструкции ААК либо требовало значительных по времени лаг-периодов (до полугода), либо не достигалось вообще в пределах времени эксперимента (до 3 лет). Для поддержания высокой скорости метаногенной конверсии ААК следовало исключить ситуацию «голодания по аминоароматическому субстрату» для активных микробных сообществ.

Структурно-функциональная организация метаногенных микробных сообществ, разрушающих ААК. Нами показано, что субстраты-ксенобиотики оказывают значительное влияние на состав и функциональные возможности микробных сообществ, т.е. способствуют закономерным изменениям их структуры. Так, различные фазы процесса биодеградации коррелировали с изменениями морфологических и культуральных признаков метаногенных сообществ. Активизация использования ААК сообществом имела следствием слипание находящихся в среде конгломератов в рыхлые гранулы, которые по мере стабилизации процесса биодеградацин уплотнялись и принимали вид мелких (не более 15 мкм в диаметре) округлых агрегатов с внутренней полостью, содержащих значительное количество кокков (рис. 18А, Б). Появлялись также округлые сильно ослизненные сплошные агрегаты, состоящие из мелких кокков и палочек (рис. 18В). Отмеченные нами агрегаты с внутренней полостью описаны в литературе как ассоциации, где эдификатором выступают представители рода Methanosarcina (Dotting et al„ 1985; Wiegant, de Man, 1986; Dubourguier et al., 1988; Wu et al., 1992; Заварзин, 2003). В конце цикла потребления ААК часть клеточных агрегатов могла приобретать неправильную формуй содержать включения и микроколонии.

Рис. 18. Микрофотографии агрегатов CK различной морфологии (А - общий вид смеси агрегатов, масштабная черта 300 мкм, Б - с внутренней полостью, м.ч. 6 мкм, В - сплошной, м.ч. 1 мкм).

Начало активного метаногенеза всегда совпадало с появлением в сообществе в значительном количестве тонких палочек разной длины, часто фрагментированных, собранных в очень длинные нити, иногда в чехлах, а также Melhanosarciиа-подобных клеток (рис. 19, 1, 2). При сравнении микроскопической картины исходных илов и активных консорциумов из них было отмечено снижение общего количества клеток и уменьшение числа их морфотипов с более чем 14 до 5-8 (рис. 19А, 1-6). Установлено также, что микроорганизмы в сообществе находятся в тесном физическом контакте (рис. 19Б), который характерен для синтрофных взаимодействий (Schink, 1997, Stams, Plügge, 2009).

Рис. 19. Морфотипы клеток (1-6), характерные для активного метаногенного разрушающего ААК сообщества, и пространственное объединение микроорганизмов (А - общий план консорциума ЕР с 2-АБК; Б - тесный контакт клеток, начальный этап формирования микробного агрегата; А, Б, 5, 6 - фазовый констраст. 1-4 -электронные микрофотографии; м.ч. А - 5 мкм. Б - 20 мкм, 1- 10 мкм, 2-12 мкм, 3-6 мкм, 4-3 мкм).

Добавление доступного ко-субстрата увеличивало общее количество клеток в активных консорциумах, а также повышало долю вибриоподобных клеток, гетероморфных бесспоровых палочек и мелких кокков. Длительное существование активного консорциума в условиях «голодания» помимо утраты разрушающей способности приводило к уплотнению микробных агрегатов, появлению большого количества спор и исчезновению гетероморфных палочек, собранных в цепи. В сообществах с заблокированным метаногенезом как в отсутствие, так и в присутствии ко-субстрата не обнаруживали крупные кокки в пакетах или многоклеточных агрегатах (рис. 19. 2), а также вибриоподобные клетки (рис. 19, 3) и длинные тонкие споровые палочки (рис. 19, 5). Клеточные агрегаты в этих условиях принимали неправильную форму и становились существенно мельче (распадались на группы клеток). Это согласуется с данными других исследователей (Dolfing et al., 1985; Wiegant. de Man, 1986; Dubourguier et al„ 1988; Wu et al., 1992; Заварзин. 2003) о значительной роли метаногенов в формировании и поддержании архитектуры микробных агрегатов.

Стабильность любого микробного сообщества в значительной мере зависит от функционального разнообразия входящих в его состав микроорганизмов. В активных сообществах выявлены следующие функциональные группы микроорганизмов: 1) гетеротрофные мезофилы (до 106 КОЕ/мл). олиготрофы (1,5-3.5 х 10" КОЕ/мл). споровые формы, целлюлозолитики (7.5-14 х 10* клеток/мл), анаэробные азотфиксаторы (2,5-4.0 х 10" клеток/мл), сульфатредукторы (1.1-4.2 х 10й клеток/мл) и молочнокислые бактерии (104-10? КОЕ/мл).

Для сравнительного ДГГЭ-анализа микробного состава активных сообществ, полученных нами из различных источников, но осуществляющих аналогичные процессы биодеградации ААК, использовали консорциумы ЕР с 2-АБК как представителя сообществ из илов очистных сооружений и Ц с 5-АСК в качестве сообщества из донных отложений природного, не загрязненного ААК водоема. Анализ визуальной идентичности, т.е. количества и местоположения полос на геле, показал, что образцы сходны друг с другом. Филогенетический анализ выявил преобладание в исследуемых сообществах значительного числа некультивируемых микроорганизмов, относящихся к группам 77\ermotogae, Вас!его1с1е1е.\ и «некультивируемые почвенные бактерии». В дальнейшем для подробного исследования видового состава выбрали сообщество ЕР с 2-АБК и исходный ил ЕР, филогенетический анализ которых подтвердил преобладание некультивируемых микроорганизмов нескольких филогенетических групп (рис. 20).

А Б В Г

5» 5: Название вида (М ближайшего сиквенса в Ген банке)

1 Некультивируемые бактерии, клон MF С-A3 5 (FJ262597). Близок к филуму Bacteroidetes

2 Неизвестный, с ближайшим сходством к Bacillus sp. М 40 (GQ495065)

3 Некультавнруемые бактерии (НМ006712). Близки к филуму Bacteroidetes

4 Moraxella sp. (AFQ05190)

5 Некуяыивнруемые бактерии (НМ006712). Близки к фильму Bacteroidetes

б Некультивируемые бактерии (НМ006712). Близки к филуму Bacteroidetes

7 Некультивируемые бактерии (НМ006712). Близки к филуму Bacteroidetes

S Proteiniphilum acetatigenes (HQ710548). Близок к роду Bacteroides

9 Неизвестный, с ближайшим сходством с Lactobacillus sp. NR1006 (EF585247)

10 Некультивируемые микроорганизмы рода Clostridium (DQ16S162)

11 Некультивируемые бактерии, клон RABS_C16 (HQ660797). Близок к роду Clostridium

12 Некультивируемые бактерии, клон MFC-A35 (FJ262597). Близки к фнлуму Bacteroidetes

13 Некультивируемые бактерии (НМ006712). Близки к филуму Bacteroidetes

14 Methanosarcina mazeii strain LM5 (HQ67S09S)

ШЬтю-чаею caneM GP-fi ГТ)т39719Ч

Рис. 20. ДГГЭ-профили исходного ила ЕР (Б. Г) и активного сообщества ЕР с 2-АБК (А, В) и филогенетическое положение микроорганизмов, входящих в состав исследованных образцов (А, Б - археи, В, Г - бактерии).

Полосы 1-10 присутствовали в обоих образцах, однако в исходном иле регистрировали также полосы 11-13, не обнаруженные в активном сообществе, что еще раз подтверждает селективный эффект ЛАК. В исходном иле наибольшей плотностью отличались полосы 10, 12 и 13. тогда как в активном сообществе самыми насыщенными были полосы 5-7. И в том, в другом образце просматривалось множество слабых полос, не поддающихся идентификации. Анализ архейного компонента показал, что под действием ААК произошла смена доминирующего микроорганизма: в исходном иле наблюдали преобладание МеАтпотгста тссеи, а в активном сообществе доминировала \1ellianosaela сопсИП.

Несмотря на выявление в составе активных сообществ большого числа некультивнруемых микроорганизмов параллельно проводили классический микробиологический анализ. Особое внимание обращали на выделение и идентификацию микроорганизмов, участвующих в первых реакциях конверсии ААК. поскольку к началу нашей работы о них было практически ничего не известно. Также были выделены три стабильных ко-культуры, в которых наблюдали преобладающие компоненты, однако элиминация минорных микроорганизмов не происходила в течение длительного времени (более 7 лет) и они пассировались как единое целое. Выделенные чистые и ко-культуры и их свойства представлены в табл. 4, 5).

Показано, что С. /гечпс/П \\'Л1 был способен восстанавливать азосвязь АОб при культивировании в среде № 1 с дрожжевым экстрактом и пнруватом, причем азокраентель в выбранной концентрации (0.3 мМ) не оказывал токсического действия на культуру (количество живых клеток не снижалось).

Цитробактср не использовал ААК как субстрат для роста, однако при добавлении в среду пирувата. глюкозы или сернна клетки с разной скоростью осуществляли анаэробную трансформацию изомеров АСК в 2-ГБС, а изомеров АБК и БА - в БС. 2-АБК. БК и СалК культурой практически пе трансформировались (табл. 6). Глюкоза и серии были менее эффективными ко-субстратамн. Другие субстраты, поддерживающие рост цптробактера, не стимулировали трансформацию 5-АСК. однако снижение концентрации дрожжевого экстракта в среде негативно отражалось на приросте биомассы, полноте сбраживания пирувата и трансформации ААК.

Как в отсутствие, так и в присутствии 5-АСК пируват сбраживался клетками С./гсчпсШ \УА1 до ацетата. СО;. Н2 и следовых количеств лактата. сукцпната и формиата. Восстановление 5-АСК начиналось, когда некоторое количество пирувата уже было сброжено культурой С. /гсит/П \\'А 1. 5-АСК в концентрации 9 мМ полностью ннгибировала рост культуры, тогда как даже 40 мМ БК угнетали его лишь на 40%. Высокие концентрации 5-АСК ингибировали также собственную трансформацию клетками С. /геипсШ \VA1- Внесение 5-АСК в анаэробную среду н ее последующая трансформация в 2-ГБС снижали количества лактата и формиата на 11 и 13%, соответственно. Ацетата при этом становилось больше на 10%. Удельная скорость роста (ц) С. /геипсШ \\'А1 составляла 0,19 и 0.22 ч"1 с и без 5-АСК, соответственно, что косвенно свидетельствует об использовании части восстановительных эквивалентов, полученных клетками в результате брожения пирувата. для трансформации ААК. Таким образом, выделенный нами С. /гсшиШ \\'А 1 отвечает за первые этапы трофической цепи разложения ААК, осуществляя их первичную трансформацию. Он восстанавливает ароматические карбоксикислоты до соответствующих спиртов с одновременным дезаминнрованпем при росте на среде с доступным источником углерода и энергии, т.е. в процессе кометаболизма. Эффективность этой реакции зависит от положения заместителя ароматического кольца (см. табл. 6). При инкубации С. /гешнШ ЛУЛ1 с ко-субстратами, но без ААК, способность к трансформации утрачивается. Проверка штаммов вида С'ИгоЪас1ег /геитШ, хранящихся в коллекции микроорганизмов каф. микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломопосова. на наличие трансформирующей активности показала, что все они после 9 мес. инкубации с ААК были способны к их трансформации (на 12-57%) в присутствии ко-субстрата (пирувата или глюкозы).

Таблица 4.

Выделенные чистые культуры и их основные свойства._

Haieauue, M « reiißaiiKC Источник и способ выделения Основные свойства

Citrobacter freundii WA1, AY259630 СК с 5-АСК, посев на агаризованную среду № 2 с 5-АСК и пируватом, инкубация в анаэробных условиях Грамотрицательные, подвижные, бссспоровые, прямые или слегка изогнутые палочки, иногда в длинных цепочках в общем слизистом чехле. Факультативный анаэроб, сбраживает сахара до кислоты и газа, растет также на пирувате, ссрине, формиате, фумарате, манате, дрожжевом экстракте, но не на а-кетоглутарате, спиртах, других ЛЖК и Н2/СО2. Восстанавливает нитрат только до нитрита. Диссоциирует на Я-, Б- и 8і-вариантьт. В активных сообществах присутствует в виде К-днссоцианта

Pseudomonas aeruginosa ASA2, KCl 37274 СК с 2-АБК, посев на агаризованную среду № 1 с 2-АБК, инкубация в анаэробных условиях Грамотрицательные мелкие прямые бссспоровые подвижные палочки. Факультативный анаэроб, не способен сбраживать глюкозу или расти автотрофно. Растет на дрожжевом экстракте, фумарате, алашшс, гистидине, аспартате, но не на серине или цистеине Восстанавливает нитрат только до нитрита. Диссоциирует на 8-, Я- и М-варианты. В активных сообществах присутствует в виде М-диссоцианта

Pseudomonas aeruginosa Tsaydam-5- ASA, KCl 37277 Ц с 5-АСК, посев на агаризованную среду № 1 с 5-АСК и пируватом, инкубация в анаэробных условиях Грамотрицательные мелкие прямые или слегка изогнутые подвижные палочки, не образующие спор. Факультативный анаэроб, способен расти анаэробно на среде с дрожжевым экстрактом, глюкозой, пептоном, пируватом, аэробно на МПА или БСА. Восстанавливает нитрат только до нитрита. Диссоциирует на Б-, II- и М-варианты. В активных сообществах присутствует в виде М-диссоцианта

Bacillus subtilis EP- ABA, JQ762447 ЕР с 2-АБК, глубинный посев в агаризованную среду № 1 с пируватом после кипячения пробы 10-15 мин, инкубация в анаэробных условиях Грамположительныс подвижные палочки, способные образовывать эндоспоры. Факультативный анаэроб, растет аэробно и анаэробно в среде с пируватом, нептоиом, дрожжевым экстрактом, глюкозой, но не с О-ксилозой и глицеролом. Сбраживает нируват, глюкозу и смесь аминокислот до лактата, этанола, ацетата и 2,3-бутандиола

Moraxella osloensis EP-ABA2, JQ762446 ЕР с 2-АБК, поссв на МПА после кипячения пробы 15-20 мин, инкубация в анаэробных условиях Грамотрицательные неподвижные бссспоровые палочки. Факультативный анаэроб, растет аэробно и анаэробно в среде с пируватом, пептоном, глюкозой, аэробно и микроаэрофилыю на МІ1А

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei L- 34, KC137275 Ц с 5-ЛСК, постановка накопительной культуры бактерий молочнокислой группы на жидкой MRS и рассев на анаэробный и аэробный MRS-arap Грамположительные короткие палочки с зернистым содержимым, неподвижны, спор не образуют, иногда располагаются в коротких цепочках и гроздьях. Аэротолерантный анаэроб, растет на ряде И-сахаров, в том числе глюкозе, сахарозе и лактозе, и спиртов, в том числе глицероле. Не восстанавливает нитрат, не разжижает желатину

Lactobacillus rhamitosus L-43.1, КС 137276 HP с 2-АБК, постановка накопительной культуры бактерий молочнокислой группы па жидкой MRS и рассев на анаэробный и аэробный MRS-arap Грамположительные ровные неподвижные бсссноровыс палочки среднего размера, в коротких цепочках. Аэротолсрантный анаэроб, растет на ряде О-сахаров, в том числе глюкозе, сахарозе и лактозе, и спиртов, по не на глицероле. Не восстанавливает нитрат, не разжижает желатину

Таблица 5.

Выделенные ко-культуры и их основные свойства._

Обозначение Источник и способ выделения Микроскопическая картина Основные свойства

WFS СК с 5-АСК и пнруватом, посев на анаэробную глюкозо-пептонную среду и последующий прогрев при 80"С 20-25 мин Значительно преобладают крупные палочки со спорообразованием бациллярного типа, как минорный компонент присутствуют очень мелкие кокки или короткие палочки Рост в строго анаэробных условиях с высокой скоростью. Сбраживает глюкозу с образованием кислот и газа. Не требует факторов роста в средс. Не растет автотрофно

WAC СК с 5-АСК и пнруватом, постановка накопительной культуры в анаэробной среде № 2 с дрожжевым экстрактом и Н2/СО2 (80/20)в качестве газовой фазы, предельные разведения Преобладают длинные тонкие палочки, образующих круглые споры плсктридиального тина, как минорный компонент присутствуют очень мелкие коккн или короткие палочки Рост в строго анаэробных условиях. Способна расти автотрофно при наличии факторов роста. При росте на 1Ь/ССЬ (80/20) образует ацетат и бугнрат, а на метаноле - ацетат и пропионат

СК с 5-АСК н пируватом, постановка накопительной культуры в срсдс № 2 с лактатом, сульфатом и дрожжевым экстрактом, предельные разведения Изогнутые внбриоподобные клетки и тонкие палочки среднего размера в приблизительно равном соотношении, возможно, присутствуют мелкие кокки Восстанавливает сульфат при росте на лактате, пирувате и смеси ЛЖК (ацетата, пропноната, бутирата, формната). Сбраживает пируват в отсутствии сульфата в среде. Требует присутствия факторов роста

Таблица 6.

Трансформация ароматических кислот (1 мМ) и беизальдегида (0,5 мМ) С./геншШ \\'А 1 при росте на среде с пируватом.

Ароматическое вещество Трансформировано через 3 сут инкубации, мМ Ароматическое вещество Трансформировано через 3 сут инкубации, мМ

2-АБК <0,010 4-АСК 0,066 ±0,014

3- АБК 1.167 ±0.214 5-АСК 1.096 ±0,196

4- АБК 0.049 ±0.012 БК <0,010

БА 0,322 ± 0,025 СалК <0,010

Данные являются средними значениями трех независимых экспериментов со стандартными ошибками среднего.

В аэробных условиях P. aeruginosa ASA2 и Tsaydam-5-ASA могли окислять из всех ААК только 2-АБК. причем скорость окисления зависела от степени аэрации.

При росте в анаэробной жидкой среде без экзогенных акцепторов электронов они не показали способности к преобразованию ААК, а также к использованию БК. СалК. БС и 2-ГБС. В свою очередь, ААК в концентрациях до 10 мМ по результатам посева па БСА не оказывали ннгибирующего действия на жизнеспособность и последующий рост культур. Концентрация ААК снижалась только при развитии псевдомонад в присутствии дрожжевого экстракта или некоторых аминокислот (аланина. гистидина или аспартата) и нитрата в среде культивирования, однако пи один изомер ААК в условиях нитратредукцни не потреблялся культурами как ростовой субстрат. По данным ВЭЖХ исчезновение всех изучаемых изомеров АБК и АСК сопровождалось появлением двух ароматических продуктов, один из которых был идентифицирован как соответствующая начальному субстрату гидрокси- (ГБК) или дигидрокенбензойная (ДГБК) кислота. Второй ароматический продукт трансформации (АПТ) идентифицировать не удалось. Соотношение ГБК (пли ДГБК) и АПТ в стационарной фазе роста P. aeruginosa ASA2 составляло для разных изомеров ААК от 20:80 до 35:65. Добавление в среду № 1 без клеток различных анионов продемонстрировало, что трансформация ААК осуществляется не ферментными системами пссвдомонад. а в результате химической реакции ААК и нитрита. Эта небиологическая трансформация при росте культур на доступном углеродном субстрате может быть опосредована живыми клетками псевдомонад, образующих нитрит в результате восстановления нитрата. Мы предполагаем, что взаимодействие нитрита и ААК приводит к образованию иона арилдназоиия с последующим появлением арильного катиона и выделением N; (Engbersen, de Groot, 1988; Шабаров, 1994). Арильный катион, вероятно, реагирует с гидроксильным (и возможно, с бикарбонатным) анионом. Зарегистрированная разница концентраций потребленного нитрата и образованного нитрита эквнмолярна количеству преобразованной ААК. Таким образом, жизнедеятельность клеток Р. aeruginosa ASA2 и Tsaydam-5-ASA может обеспечивать химическую трансформацию при изменении химического состава реальных сточных вод.

У Р. aeruginosa ASA2 и Tsaydam-5-ASA нами не обнаружены описанные в литературе способности М-диссоциантов псевдомонад расти анаэробно за счет сбраживания глюкозы, а также проявлять протеолитическую активность (Милько. Ильиных, 2004; Милько и др., 2008; Милько и др.. 2010).

Выделенные нами штаммы В. subtilis ЕР-ABA и М. osioensis ЕР-АВА2 не показати способности использовать ААК, БК, СалК, БС, 2-ГБС (1 мМ) и БА (0,5 мМ) при инкубации в среде № I без или с доступным ко-субстратом, хотя для представителей рода Bacillus ранее была отмечена возможность деградации фталата (Aftring, Taylor. 1981), а для членов рода Moraxella - БК. БА, БС, флороглюцнна (Веггу et al.. 1987) и »-крезола (Bossert. Young, 1986), сопряженная с нитратредукцией. Внесение биомассы (20 об.% от исходного бпоматернала) B.sublilis ЕР-ABA или М. osioensis ЕР-АВА2 в активный консорциум ЕР с 2-АБК стимулировало мстанообразование на 12 и 18%, соответственно, и снижаю значение pH до 6,5, хотя скорость потребления 2-АБК практически не изменялась. Одновременное добавление клеток штаммов и глюкозы, напротив, уменьшало выход метана на 7-20%. вероятно, из-за значительного закислення среды (до 5,5). Таким образом, выделенные культуры способны осуществлять сбраживание линейных субстратов и их следует поместить в «бродильный» блок трофической цепи бнодеструкции ААВ.

В анаэробных условиях в виде чистых культур выделенные нами L. paracasei subsp. paracasci L-34 и L. rhamnosus L-43.1 не разлагали ААВ при инкубации на «бедной» для них минеральной среде № 1 как в отсутствие, так и в присутствии доступного ко-субстрата (пирувата). Показано, что в вариантах с пируватом происходило его сбраживание с образованием L-лактата и закисление.м среды. Лактобацнллы осуществляли молочнокислое брожение смеси ЛЖК и спиртов, использованных как сборный субстрат, соответствующий возможным ннтермедпатам.

Рост L.jjaracasei subsp. paracasei I.-34 про внесение ЛАВ

Рис. 21. Обесцвечивание PS (фото, 1 -культуральная жидкость в начале опыта, 2 - через 3 суг) и SY (спектры) L. ра-racasei subsp. para-casei L-34 в анаэробных условиях роста.

Чтобы смоделировать условия «достаточности питания», которые лактобациллам, по-видимому, создают партнеры при инкубации сообществ в минеральной среде, нами для культивирования лактобацилл в виде чистых культур была выбрана богатая среда MRS. Поскольку лактобациллы относятся к аэротолерантным микроорганизмам, то параллельно те же варианты инкубировали в аэробных условиях. Испытания проводили с пищевыми азокрасителями PS, Tn, SY и Az и интермедиатами их разложения. Оба штамма лактобацилл в отсутствие кислорода полностью обесцвечивали азокрасители PS, Тп и SY через 2-4 суг (рис. 21) с образованием сульфаниловой кислоты, накапливающейся в культуральной жидкости. В то же время, Az обесцвечивался только культурой L. rhamnosus L-43.1 (на 7-е сут). При росте обеих культур в аэробных условиях PS, SY и Az не обесцвечивались, в то время как Тп подвергался частичной фрагментации. Однако нами, в отличие от Perez-Diaz. McFeeters (2009) для некоторых штаммов L. casei и L. paracasein не зафиксировано появление некоего «продукта анаболизма» пурпурного цвета с максимумами поглощения на 361 и 553 нм.

Рис. 22. Влияние различных ААВ на рост L. paracuses subsp. paracasei L-34 (А) и L. rhamnosus L-43.1 (Б) в аэробных и анаэробных условиях.

5-АСК, 2-АБК, суль-фаниловая кислота, БС, БК и СалК лактоба-циллами не потреблялись как в анаэробных, так и в аэробных условиях. Обе культуры активно росли и на 2-3-и сут достигали

Рост Lactobacillus rhamnosus L-43 при внесении ААВ

стационарной фазы, при этом значение рН падало с 6,5 до 4-4,5 за счет осуществляемого лактобациллами молочнокислого брожения. В анаэробных условиях присутствие в среде 2-АБК, 5-АСК, БС и БК практически не влияло, Тп и Аг - несколько замедляло, а РБ и БУ, наоборот, стимулировало рост Ь. рагасаяе/ 58р. рагасаяе/ Ь-34 (рис. 22А). Наиболее заметную задержку роста наблюдали при добавлении сульфаниловой и салициловой (СалК) кислот. В аэробных условиях ингибирующее действие ААВ на рост культуры было более выраженное, причем ни одно вещество не стимулировало рост. Наиболее токсичным субстратом как в анаэробных, так и в аэробных условиях оказалась сульфаниловая кислота, а самым нетоксичным - 2-АБК. Незначительное ингибирование роста Ь. гЬатпошч Ь-43.1 наблюдали при внесении РБ, ЗУ, 5-АСК и 2-АБК (рис. 22Б). Аг. напротив, несколько стимулировал развитие культуры. Наиболее существенное негативное влияние (25-40%) выявлено для Тп, СалК, БС и БК, тогда как сульфаниловая кислота не действовала на рост этой культуры. В аэробных условиях ингибирующее действие ААВ возрастало в 2,1-5,0 раз, причем «безразличная» культуре в анаэробных условиях сульфаниловая кислота в присутствии кислорода в 4,5 раза сннжала скорость роста штамма, а для красителя Аг наблюдали смену небольшого стимулирующего действия на ингибирующее. Неожиданным оказалось положительное влияние на культуру в присутствии кислорода азокраситсля БУ, который в анаэробных условиях замедлял ее рост. Наиболее токсичным субстратом для гЪатповиз Ь-43 как в анаэробных, так и в аэробных условиях оказался Тп, а самыми нетоксичными - БУ и Аъ.

При внесении дополнительного количества клеток /Латио^ги 1,-43.1 (20 об.% от исходного биоматсриала) в активное сообщество ЕР с 2-АБК показана стимуляция процессов брожения при неизменной скорости деструкции 2-АБК. Наблюдали усиление метанообразования на 15% и закисление среды до рН=6,5, так как внесенные клетки лактобацилл при броженин продуцировали дополнительное количество органических кислот, в том числе ацетата, служащего субстратом метаногенеза. Если в сообщество вместе с биомассой лактобацилл вносили еще и глюкозу, то снижение рН до 5,5 приводило, наоборот, к ингибированию метаногенеза в 1,1-1,3 раза. Таким образом, лактобациллы входят в «бродильный» блок трофической цепи сообществ, разрушающих ААВ. В составе сообщества, где партнеры, вероятно, могут обеспечивать им «достаточность питания», лактобациллы способны развиваться на минеральной среде, сбраживать линейные интермедиа™ и выполнять дополнительную функцию разрыва азосвязеи при метаногенной деструкции азокрасителей.

Ко-культуры \\ТЭ, \\'АС и \\'5Я при росте в среде № 1 с ААК как в присутствии ко-субстрата, так и без него не показали способности трансформировать или разлагать изомеры АБК и АСК.

Искусственные анаэробные микробные сообщества. Для доказательства способности выделенных чистых и ко-культур взаимодействовать и функционировать в составе микробного сообщества создали ряд искусственных ассоциаций с разным набором компонентов.

Для формирования сообществ, где 5-АСК являлась единственным источником углерода и энергии, использовали 6 компонентов в различных сочетаниях (табл. 7). Бинарные культуры метаногена и одной из ко-культур \\Т5, WAC или WSR, а также различные сочетания ко-культур между собой не обладали деградирующей активностью. Ассоциации С. /гегшсШ \¥А1 и ко-культуры \УЕ5 или XV АС не могли трансформировать 5-АСК, однако добавление метаногена стимулировало ее разложение. Внесение в искусственные сообщества ко-культуры существенно не влияло на активность потребления субстрата. Ни одно из искусственных сообществ не могло полностью минерализовать 5-АСК в условиях эксперимента, возможно, из-за несоблюдения нужных пропорций компонентов и/или отсутствия не выделенных нами или некультнвируемых партнеров. Тем не менее, осуществление частичной (на 20-25%) биодеструкцин 5-АСК продемонстрировало способность С./гсипсШ \УА1 в составе сообщества трансформировать 5-АСК до 2-ГБС без дополнительных источников углерода.

Таблица 7.

Искусственные сообщества, показавшие потребление 5-АСК._

Члены сообщества (основная функция) Деградация 5-АСК Детектируемые (промежуточные) и конечные продукты

C.framdii WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WAC (гомоацетогенез) Ко-культура WFS (брожение) M. harkeri (метаногенез) + (<25% за 10 сут) (Н:, 2-ГБС. ацетат), С02, СН4

C.freundii WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WAC (гомоацетогенез) Ко-культура WSF (брожение) А/. himgalei (метаногенез) + (<25% за 10 сут) (Н;, 2-ГБС), СО,, СН4, ацетат

C.framdü WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WAC (гомоацетогенез) M. harkeri (метаногенез) + (<20% за 10 сут) (Н;, ацетат), 2-ГБС, С02, СН4

C.freundii WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WFS (брожение) Л/, himgalei или Л/, harkeri (метаногенез) + (<20% за 10 сут) (Н2), 2-ГБС, СО:, СН4

C. freundii WA1 (первнчная трансформация) Ко-культура WAC (гомоацетогенез) Ко-культура WFS (брожение) + (~ 10% за 10 сут) 2-ГБС, СОг, Нг, ацетат, проиионат

C.freundii WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WFS (брожение) или Ко-культура WAC (гомоацетогенез) - -

C. freundii WA1 (первичная трансформация) M himgalei (метаногенез) или M. harkeri (метаногенез) - -

Очевидно, в сообществе восстановительные эквиваленты для этой реакции могут быть получены из общего пула, обусловленного межвидовым транспортом водорода или формиата (Stams, 1994; Schink, 1997).

Еще одна искусственная микробная ассоциация была создана для демонстрации возможности деструкции азокрасителей. Сообщество составили из выделенных нами чистых культур С. freundii WA1, L. rlmnmosus L-43.1 и ко-культуры WSR. При его развитии в анаэробной среде № 1, содержащей MR (1 мМ), 2-АБК или 5-АСК (0,5 мМ), на 6 сут наблюдали обесцвечивание азокрасителя (рис. 23). Исчезновение MR сопровождалось появлением ДМФ и 2-АБК (пики на 242 и 310 нм). В дальнейшем, при уменьшении пика, соответствующего 2-АБК, регистрировали появление валериановой и капроновой кислот, пропноната. бутирата и ацетата. Из-за отсутствия метаногенов количество Hz в течение всего опыта увеличивалось. Таким образом, MR подвергся частичной деструкции под действием созданной нами микробной ассоциации в соответствии со схемой: азокраситель —» ароматические амины —» линейные интермедиаты —► ЛЖК, спирты, СО;, Н2. 2-АБК и 5-АСК в качестве начальных субстратов были устойчивы в течение опыта либо из-за элиминации метаногенной стадии, либо из-за длительного лаг-периода. Использованные компоненты были выделены нами из сообществ различного происхождения, однако осуществляли совместный процесс бнодсградашш, т.е. показана принципиальная возможность «конструирования» микробных консорциумов из культур с заданными свойствами.

Несмотря на то, что по нашим данным полученные из активных сообществ псевдомонады не играют непосредственной роли в процессе метаногенной деградации ААВ, онн постоянно выделяются из различных плов, включая илы очистных сооружений. Для доказательства возможности полной минерализации хотя бы одного продукта химической трансформации ААК создали искусственную ассоциацию из P. aeruginosa ASA2 и специально выделенного из ила очистных сооружений, обрабатывающих бытовые стоки, «вспомогательного» микроорганизма WH, разлагающего 2,5-дигидроксибеизойную кислоту (2,5-ДГБК) до СО: при восстанавлении нитрата до N;. При одновременном внесении в среду с 5-АСК и 10-20 мМ нитрата культур P. aeruginosa ASA2 и WH происходила как химическая трансформация 5-АСК, так и разложение образованной 2,5-ДГБ до С02 (рис. 24).

Таким образом, создание искусственных микробных ассоциации позволило подтвердить роли выделенных нами микроорганизмов. На основе анализа собственных и имеющихся в литературе данных идентифицированные микроорганизмы были расположены в последовательности, составляющей трофическую цепь (рис. 25). Нам не удалось выделить микроорганизм, способный использовать 2-ГБС и/или БС, однако регистрируемый в сообществе следующий интермедиат, БА, мог использоваться тем же цнтробактером. Не исключено, что С. freundii WA1 при трансформации ААК часть БА восстанавливает до 2-ГБС или БС, а часть окисляет в БК. В этих реакциях могут участвовать также присутствующие в сообществе некультивируемые члены рода Clostridium, представители которого обладают широкими метаболическими возможностями. Деароматизацию БК также могут осуществлять клостридии и/или ко-культура WSR, содержащая сульфатредуцирующий микроорганизм, для которых известна способность раскрывать бензольное кольцо (Bock et at., 2000; Muller, Schink, 2000; Plugge et al., 2002). He выделенный нами, но идентифицированный в сообществе при помощи ДГТЭ-аналнза представитель вида Proteiniphilum acetatigenes на основании сведений о свойствах типового и других описанных штаммов (Chen, Dong, 2005) может участвовать, например, в превращении пирувата в ацетат и С02. В синтрофиой стадии может принимать участие выделенная нами ко-культура WSR как сульфатредуктор в отсутствие сульфата. Возможно также, что она осуществляется также какой-либо группой некультивируемых микроорганизмов, присутствующих в сообществе.

Рис. 23. Обесцвечивание азокрасителя MR искусственным микробным сообществом: 1 -без добавления субстрата (контроль); 2-е MR. начало эксперимента; 3-е MR, на 6 сут инкубации - и изменение спектральных характеристик культурапьной жидкости искусственной микробной ассоциации с MR.

Рис. 24. Предполагаемая схема, сочетающая биологические и химическую реакции при разложении ААК (на примере 5-АСК), под действием искусственной ассоциации P. aeruginosa ASA2 и изолята WH.

aeruginosa ASA2

NO.i

N0,

NOi +; 5-дек

№

NOr

'О ,

Штамм WH

2,5-ДГБК

Моделирование ситуаций загрязнения ЛАВ. Первым шагом к исследованию «судьбы» ксенобиотика в реальных системах может быть создание лабораторных моделей, имитирующих основные параметры места загрязнения.

Поскольку даже сточные воды специализированных химических производств содержат, как правило, набор загрязнителей, то определили возможность использования выделенными нами сообществами (на примере СК и КСА) ААК из бинарных смесей. Показано, что смешивание двух ААК в целом снижало скорость их деструкции. Из смеси 5-АСК+2-АБК оба субстрата потреблялись сообществами одновременно и с практически одинаковой скоростью, тогда как из смесей 2-АБК+4-АБК и 5-АСК+4-АСК в первую очередь использовался более деградабильный изомер (рис. 26А, Б).

В качестве первичной грубой модели, имитирующей вброс пищевых азокраентелей в ЖКТ, использовали микробные сообщества экскрементов человека и некоторых млекопитающих и Тп, РБ, широко применяемые в пищевой, фармацевтической, косметической

промышленности, запрещенный к применению в пищевой промышленности в большинстве стран Аг и, для сравнения, технический азокраситель MR, а также ароматические интермедиа™ их разложения. Микробные сообщества из фекалий различных млекопитающих были способны с разной скоростью обесцвечивать использованные азокраеителн (рис. 27), что еще раз свидетельствует о неспецифичности реакции разрыва азосвязей. Самым устойчивым оказался Тп, а самыми биодеградабильными - 8У и Аг. Образовавшаяся в вариантах с Тп, и Аг сульфаниловая кислота была устойчива к дальнейшему расщеплению, а 2-АБК и ДМФ в образцах с MR исчезали из культуральной жидкости, как и в случае с сообществами из илов очистных сооружений. В качестве линейных интермедиатов во всех пробах регистрировали ацетат и пропионат, а в ряде сообществ - также бутират, валериановую и капроновую кислоты.

Азокраеитель

Proteiniphilum acetatigenes

WSR

Линейные продукты деаромашзации

C.fremdii WA1

L. paracasei subsp. paracasei L-34

L rhamnosus t-43.1

M osloensis EP-ABA2

B.subrilis EP-ABA

WFS

WAC

Н:. СО;. Ci-соединения г —^ТІ Ацетат

•

Methanosaeta concilii

Methanosarcma

malen

Рис. 25. Трофические связи в анаэробном сообществе, осуществляющем конверсию азо-красителей в биогаз.

Для сообщества ФКР с Ти было показано, что на 7 сут содержание кислот в опыте более чем в 2 раза превышает таковое в контроле, что подтверждает деструкцию ароматических ин-термедиатов.

В сообществах ФВ. ФКЗ, ФЧ2, ФКР и ФО отмечали образование метана за счет разложения азокрасителя. в других образцах присутствие азокрасителя. наоборот. подавляло метаногенез. Наиболее активный и устойчивый метаногенез наблюдали в сообществе ФО. которое конвертировало в биогаз три из пяти использованных азокраси-телей (Тп, Р5 и МЯ). Путем сопоставления времен выхода различных групп веществ нами установлено, что закономерности разложения ААВ в кишечных сообществах повторяют закономерности, выявленные для сообществ из илов очистных сооружений и донных отложений природных водоемов.

Рис. 26. Потребление ААК из бинарных смесей метаногенными сообществами СК (А - 4-АБК+2-АБК: Б - 4-АСК+5-АСК).

В то же время, длительность удержания каловых масс у испытанных млекопитающих не позволяет говорить о прохождении полной минера-

лизации азокрасителей в реальных условиях, поэтому велика вероятность длительного присутствия в ЖКТ самих азокрасителей и продуктов их распада.

Лошадь Верблюд Козз Олень Ребенок Ребенок Свинья Корова

3,5 г 5,5 л

1Тп ВР5 : ЭУ 1Д2 1М

Поскольку ААВ снижают общую численность клеток, обедняют компонентный состав микробных сообществ и меняют доминирование в них, а также ингибируют рост лактобацилл, которые являются неотъемлемой частью нормальной мик-робиоты ЖКТ млекопитающих, то можно утверждать, что испытанные вещества являются скорее «вредными» и представляют определенную опасность для здоровья людей.

Рис. 27. Сравнение времен полного обесцвечивания азокрасителей микробными сообщест-

вами из ЖКТ разных млекопитающих.

Таким образом, показана принципиальная возможность использования микробных сообществ ЖКТ для первичного экспресс-тестирования пищевых азокрасителей.

Заключение.

Главной целью работы было детальное изучение процесса полной метаногенной деструкции ААВ и соотнесение с ним изменений в структурно-функциональной организации активного сообщества. Такие исследования к моменту написания нашего труда в литературе представлены не были.

Выбор биологического материала диктовался наличием или теоретической возможностью осуществления метаногенного разложения органических веществ. Налги проведен скрининг 11 видов анаэробных осадков различного происхождения и активные микробные сообщества получены как из источников, где подобные загрязнения могли иметь место, так и из естественных водоемов, не загрязнённых соответствующими веществами. Поскольку априори результат был непредсказуем, то на начальной стадии работы задействовали максимально возможный спектр сред и условий культивирования. Нам удалось получить анаэробные микробные сообщества, которые стабильно (более 5-10 лет) с высокой скоростью разрушают азокрасители и ААК до биогаза, что делает их перспективными для биотехнологического использования.

Другим результатом работы является детальное изучение процесса полной минерализации ААК до биогаза, определение основных ароматических и линейных интермедиатов и последовательности реакций в метаногенных сообществах, а также оптимальных физико-химических параметров культивирования. Для этого были применены как накопление и регистрация интермедиатов при различных воздействиях на сообщества, так и использование

идентифицированных и предполагемых промежуточных продуктов в качестве начальных субстратов. Подтверждением «двухстадийности» процесса конверсии азокрасителей в биогаз стали выявленные различия в механизмах, регулировании и отношении к факторам инкубации этапов обесцвечивания и преобразования аминов-интермедиатов (в частности, ААК). Несмотря на разнообразие использованных сочетаний температуры и кислотности среды, оптимальными для процесса биодеградации в целом оказалась инкубация при 30°С и рН=6,5-7,5, что не соответствует физико-химическим параметрам природных местообитаний, из которых происходят илы донных отложений. Это существенно ограничивает протекание анаэробной биодеградации таких соединений при показанной нами ее потенциальной возможности и наличии микроорганизмов необходимых функциональных групп. Поскольку в природных водоемах невозможно привести физико-химические факторы к требуемым значениям, то при сбросе стоков, загрязненных ААВ, необходимо применять дополнительные методы очистки в искусственных системах с использованием специально разработанных препаратов на основе анаэробных микробных сообществ.

Другим важным результатом работы является демонстрация воздействия ААВ на структурно-функциональную организацию сообществ, осуществляющих их деструкцию. Наши исследования подтвердили, что традиционный быстрый и удобный метод оценки токсичности по снижению ацетокластической активности свидетельствует об угнетении именно метаногенов и не позволяет выявить ингибирующее влияние исследуемых соединении на другие группы членов анаэробного сообщества. Проверка влияния ААВ, осуществленная нами на выделенных чистых культурах, показала, что одно и то же соединение может не ннгнбировать ацетокластический метаногенез и одновременно значительно подавлять развитие других членов трофической цепи. Доказательством «небезразличности» ААВ для сообщества также является наблюдаемое снижение общего количества клеток и изменение соотношения морфотнпов, более выраженное в случае ароматических аминов как начальных субстратов.

Большинство микроорганизмов в сообществе оказалось некультнвируемымн, а те, которые удалось выделить в виде чистых культур, являлись представителями рутинных систематических групп, факультативными или аэротолерантными анаэробами с довольно пластичным метаболизмом. Изучение физиолого-биохимических возможностей выделенных микроорганизмов и привлечение литературных данных, а также создание из них искусственных ассоциаций позволили нам определить их функции в сообществе и соотнести их с этапами процесса деструкции ААВ. Показана возможность «сборки» искусственных сообществ как из микроорганизмов с аналогичными функциями, но из других источников, так и из выделенных в чистые культуры членов разных консорциумов, выполняющих одинаковый процесс биоразложения ААВ.

Анализ собственных и литературных сведений показывает необходимость проведения тщательного мониторинга судьбы ААВ не только в окружающей среде, но и в организме человека и животных. Осуществленное в данной работе лабораторное моделирование свидетельствует о разрушении азокраситслсй кишечными микробными сообществами млекопитающих по предложенной нами схеме. Не только запрещенные к использованию, но и разрешенные пищевые азокрасители подвергаются неполному разложению за времена нахождения в организме, а значит могут вызывать негативные изменения в структуре и функционировании нормальной микробиоты человека и животных. Поскольку отказ от их использования в современной жизни не представляется реальным, то следует прежде всего ограничить контакт с пищевыми азокрасителями чувствительных групп населения (особенно детей) и проводить очистку сточных вод от этих соединений вследствие риска для здоровья.

Таким образом, наши исследования показали, что не только микробные сообщества могут преобразовывать азокрасители и ААК вплоть до полного превращения в биогаз, но и ААВ, в свою очередь, воздействуют на микробные сообщества, изменяют их структуру и функционирование.

Выводы:

1. Из нлов очистных сооружении и донных осадков природных водоемов выделены и изучены анаэробные микробные сообщества, стабильно (5-10 лет) и с высокой активностью обесцвечивающие азокраснтели и конвертирующие аминоароматические кислоты (0,07-0,8 мМ'сут) в биогаз, что делает их псрпективнымн для бпотсхнологнчсского использования.

2. Установлено, что анаэробная конверсия азокрасителей в биогаз, осуществляемая микробными сообществами, включает неспецифическую стадию обесцвечивания и специфический этап трансформации образовавшихся ароматических аминов, различающиеся механизмами, регуляцией и отношением к параметрам культивирования.

3. Определены продукты фрагментации испытанных Дю красителей и впервые идентифицированы основные ароматические и линейные интермедиаты анаэробной деструкции ААК. Предложена обшая схема процесса разложения ААК путем первичной трансформации до соответствующих ароматических спиртов, окисляющихся до бензойной кислоты, с ее последующей деароматизацней и образованием смеси ЛЖК, спиртов, СО; и Н;, превращающихся через синтрофную стадию в биогаз. Установлено, что метаногенные сообщества разрушают ААК по бешоил-КоА-путп.

4. Показано, что ААВ оказывают селективное воздействие на метаногенные микробные сообщества, снижая общее количество клеток н биоразнообразие в них и вызывая смену доминирующих видов. В свою очередь, активные консорциумы в определенных пределах способны к самокоррекции своей структуры в ответ на воздействие различных факторов.

5. Определен компонентный состав активных метаногенных сообществ и показано преобладание в них некультнвируемых микроорганизмов, близких к Bacteroidetes и Clostridium. Выделено и идентифицировано до вида 7 чистых культур, установлены их возможные функции и предложена схема трофических связей при конверсии ААК в биогаз.

6. Показана принципиальная возможность «конструирования» сообществ с заданными свойствами как из микроорганизмов, выделенных из консорциумов различного происхождения, так и из коллекционных культур с аналогичными свойствами.

7. Путем лабораторного моделирования продемонстрирована необходимость проведения тщательного мониторинга судьбы ААВ в окружающей среде п в организме человека и животных из-за их неполного разложения в ЖКТ, способного привести к негативным изменениям структуры и функционирования нормальной микробиоты млекопитающих. Показана принципиальная возможность использования кишечных микробных сообществ для первичного тестирования пищевых азокрасителей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Савельева О.В., Котова И.Б., Скляр В.П., Калюжный C.B., Нструсов А.И. Выделение штамма Pseudomonas ASA2 из метаногенного сообщества, расщепляющего амннобензоат и аминосалнцилат.// Микробиология,- 2002.- Т.71, № 2,- С.1-2.

2. Савельева О.В., Емашова H.A., Котова И.Б., Нетрусов А.И., Калюжный C.B. Анаэробная биоконверсия аминоароматических соединении.// Успехи современной биологии,- 2003,- Т. 123, № 4,- С.336-349.

3. Savelieva О., Kotova I., Roelofsen W., Stams A.J.M., Netrusov A. Conversion of aminoaromatic acids by a methanogenic enrichment and by a novel Citrobacter frenndii strain.// Arch. Microbiol. - 2004. -T. 181. - P. 163-170.

4. Yemashova N.A., Telegina A.F., Kotova I.B., Netrusov A., Kalyuzhnyi S.Decolorization and partial degradation of selected azo dyes by methanogenic sludee.// Appl. Biochem. and Biotechnol. -2004. - V.l 19, № 1. - P. 31-40.

5. И.Б.Котов;«, О.В.Савельева. А.Т.Дьяконова. В.М.Скляр. С.В.Калюжный, А.Стамс. А.И.Нетруеов. Анаэробные микробные сообщества, разлагающие амнноароматические кислоты.,7 Прикл. биохим. и мнкробнол. - 2005. - Т.41, № 4,- С.422-428.

6. Н.А.Емашова. И.Б.Котова. А.И.Нетруеов, С.В.Калюжный. Особенности разложения азокрасителей анаэробными микробными сообществами. // Прикл. биохим. и микробиол. - 2009. - Т.45, № 2. - С. 195-201.

7. Линькова Ю.В., Есакова A.A., Дьяконова А.Т., Намсараев Б.Б., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Проверка способности анаэробных микробных сообществ к разрушению аминоароматических ксенобиотиков. // Экология и промышленность России. - 2011 - ЛИ. - С. 29-33.

8. Линькова Ю.В., Куликова H.A.. Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деградация азокрасителей и ароматических аминов мстаногснными микробными сообществами из илов очистных сооружений // Вода: химия н экология. - 2011. - № 7 - С. 51-58.

9. Линькова Ю.В.. Дьяконова А.Т.. Гладченко М.А.. Калюжный C.B.. Котова И.Б., Стамс А., Нетрусов А.И. Метаногенная деструкция (амнно)ароматнческих веществ анаэробными микробными сообществами // Прикл. биохим. и мнкробнол. - 2011. - Т.47. № 5. - С.558-565.

10. Линькова Ю.В.. Котова И.Б., Нструсов А.И. Способность микробных сообществ из донных отложений оз. Цайдам к метаногенной деструкции аминоароматических ксенобиотиков// Вода: химия и экология. - 2013. -№1. - С. 64-70.

Главы в учебных пособиях:

1. Котова И.Б. Бноразрушения.// Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов/ Под ред.А.И.Нетрусова. - М.: Издательский центр «Академия». - 2004. - С. 165-175. (272 е.).

2. Семенова Е.В.. Котова И.Б.. Нетрусов А.И. Получение накопительных и чистых культур анаэробных микроорганизмов.// Практикум по микробиологии. Учеб. для студентов вузов./Под ред.А.И.Нетрусова. - N1.: Издательский центр «Академия»,- 2005.- С.214-222 (608 е.).

3. Котова И.Б. Анаэробная биодеградацня азокрасителей и их производных.//' Практикум по микробиологии. Учеб. для студентов вузов./Под ред.А.И.Нетрусова. - М.: Издательский центр «Академия»,- 2005.- С. 376-387 (608 е.).

4. А.И.Нетруеов, И.Б.Котова. Взаимоотношения микроорганизмов друг с другом. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения. Микробиологическая очистка сточных вод и переработка отходов.// А.И.Нетруеов, И.Б.Котова. Микробиология Учеб. для студ. вузов,- М.: Издательский центр «Академия». - 2006. - С. 266-268, 290-292, 313-314 (352 е.)

5. А.И.Нетруеов. И.Б.Котова. Взаимоотношения микроорганизмов друг с другом. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения. Синтетические химические соединения и их детоксикация микроорганизмами.// А.И.Нетруеов. И.Б.Котова. Общая микробиология. Учеб. для студ. вузов,- М.: Издательский центр «Академия». - 2007. - С. 180-181.206-209(288 с).

6. А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Взаимоотношения микроорганизмов друг с другом. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения. Микробиологическая очистка сточных вод и переработка отходов.//А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробиология Учеб. для студ. вузов. 2-е издание. - М.: Издательский центр «Академия». - 2007. - С. 266-268. 290-292, 313-314(352 с).

7. А.И.Нетрусов. И.Б.Котова. Взаимоотношения микроорганизмов друг с другом. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения. Микробиологическая очистка сточных вод и переработка отходов.// А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробиология Учеб. для студ. вузов. 3-е издание, нсправл. - М.: Издательский центр «Академия». - 2009. - С. 266-268, 290-292. 313-314(352 с).

S. А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробное еообщество.Сннтрофия. Микробные местообитания. Пространственное расположение микроорганизмов. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения.// А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробиология: учеб. для студ. учреждении высш. проф. образования. Бакалавриат, педагогическое образование.- М.: Издательский центр «Академия». - 2012. - С. 237-239, 277-2S 1,292-294 (384 с).

9. А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Взаимоотношения микроорганизмов друг с другом. Рост микроорганизмов в прикрепленном состоянии. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения. Микробиологическая очистка сточных вод н переработка отходов.// А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробиология. Университетский к>рс: учебник для студ. учреждений высш. проф. образования. Бакалавриат. - 4-е изд., перераб. и дон. - М.: Изд. центр «Академия», 2012. - С. 281-283, 299-300, 306-308, 342-348 (384 с).

10. Котова И.Б. Биоразрушения.// Экология микроорганизмов: Учеб. для бакалавров. 2-е издание/ Под ред.А.И.Нетрусова. - N1.: Издательство «Юрант», 2013. - (в печати).

Статьи в других журналах и сборниках:

1. Savelieva О., Kotova I., Sklyar V., Kalyuzhnyi S., Netrusov A. Anaerobic microbial communities degrading of various aminoaromatics.// "Anaerobic digestion for sustainability in waste (water) treatment and re-use". Proc. 7,h FAO/SREN - Workshop, 19-22 May 2002, Moscow, Russia -M„ 2002,-V.I.- P. 84-90.

2. Esakova A., Diakonova A., Kotova I., Netrusov A. Analysis of the ability of anaerobic sediments to transform aminoaromatic xenobiotics.// '"Anaerobic digestion for sustainability in waste (water) treatment and re-use". Proc. 7lh FAO/SREN - Workshop, 19-22 May 2002, Moscow, Russia.-M„ 2002,- V.2.- P. 415-416.

3. Ycmashova N.A., Tclcgina A.F., Kotova I.B., Kalyuzhnyi S.V. Degradation of azo dyes by mcthanogcnic sludge // In Biocatalytic Technology and Nanotechnology. Ed.: G.E. Zaikov, Nova Science Publisher. - 2004. - P. 41 -50.

4. Ю.В.Линькова, А.Т.Дьяконова, И.Б.Котова, А.И.Нетрусов. Метаногенные микробные сообщества, разрушающие ароматические соединения.// «Экологические проблемы промышленных городов». Сборник научных трудов. Ч. 1. - Саратов: СГУ, 2009. - С. 38-39.

5. И.Б.Котова, Ю.В.Линькова, И.А.Куликова, А.Т.Дьяконова, А.И.Нетрусов Особенности микробных сообществ, способных разрушать амипоароматические ксенобиотики в анаэробных условиях.// «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Материалы VII Международной конференции (Минск, 31 мая - 4 июня 2010 г.) - Минск: «Белоруская павука», 2010. - С. 360-362.

6. Линькова Ю.В., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Особенности микробных сообществ, способных разрушать амипоароматические ксенобиотики в анаэробных условиях.// Матернали за VII международна научна практична конференция «Найновите постижения на европейската наука - 2011», 17-25-ти юни 2011, Ветеринарна наука. Биологии. - София, «Бят ГРАД-БГ» ООД 2011. - T. 32.-С. 66-68.

Тезисы научных конференций:

1. Kalyuzhnyi S.V., Sklyar V.I., Mosolova Т.Р., Kucherenko I.A., Degtyarova N.N., Russkova Y.I., Kotova I.B., Netrusov A.I. Methanogenic biodégradation of selected aminobenzoates and aminosalicylates.// "Microbial and cellular systems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and Environment" INTAS Symp., Moscow, 26-30 May 1999,- M„ 1999.-C. 52-53.

2. Савельева O.B., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Анаэробное сообщество, разлагающее 2-амннобензойную кислоту.//Тр. Науч. Конф. «Проблемы экологии и физиологии

микроорганизмов (к 110-летию со дня рождения проф. Е.Е.Успенского)». Москва, 21 декабря 1999 г.- M., 2000.- С. 93.

3. Тян Л.Т., Брюханов А.Д., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Разложение 5-амшюсалициловой кислоты в анаэробных условиях консорциумом микроорганизмов.// Тр. Науч. Конф. «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов (к 110-летию со дня рождения проф. Е.Е.Успенского)». Москва, 21 декабря 1999 г.- М„ 2000.-С. 103.

4. Мятлева-Савельева О.В., Котова И.Б., Нетрусов A.II. Микробное разложение изомеров аминобензонной кислоты в анаэробных условиях.//Тр. Науч. конф. мол. ученых «Горизонты физико-химической биологии». Пущино, 28 мая - 2 июня 2000 г.- Пущино, 2000,- С. 54.

5. Savelieva О., Kotova I., Diakonova A., Sklyar V., Stams A.. Netrusov A. Biodegradation of selected aminoaromatic compounds under anaerobic conditions./VProc. 9lh Int. Symp. On Microbial Ecology "Interactions in microbial world". Amsterdam, The Netherlands, 26-31 August 2001.-Amstcrdam. 2001,- P. 372.

6. Емашова H.A.. Телегина А.Ф.. Котова И.Б.. Калюжный C.B. Разложение азокраептелей метаногенным консорциумом мпкроорганнзмов.//"Биотехнология: состояние и перспективы развития". Материалы II Международ. Конгресса. 10-14 ноября 2003, Москва, Россия. - М., 2003. -4.2.-С. 216-217.

7. Емашова H.A., Телегнна А.Ф., Котова И.Б.. Нетрусов А.И., Калюжный C.B. Конверсия N-замещенных ароматических веществ метаногенным консорциумом мнкроорганизмов.//"Биотехнология микробов". Материалы Всеросс. Сими., посвященного 120-летию со дня рожд. акад. В.Н.Шапошникова, 20-23 октября 2004 г, Москва, Россия.- М.:"Макс Пресс". 2004,- С. 28.

8. Есакова A.A.. Дьяконова А.Т.. Котова И.Б., Нетрусов A.II. Использование аминоароматнческих соединений метаногенными микробными ассоциациями из донных отложений водоемов с разными физико-химическими свойствами. //"Биотехнология микробов". Материалы Всеросс. Симп., посвященного 120-летию со дня рожд. акад. В.Н.Шапошникова. 2023 октября 2004 г, Москва. Россия.- М.:"Макс Пресс". 2004,- С. 30.

9. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Структура анаэробных микробных сообществ, потребляющих аминоароматические субстраты.//"Биотехнология микробов". Материалы Всеросс. Симп., посвященного 120-летию со дня рожд. акад. В.Н.Шапошникова, 20-23 октября 2004 г. Москва. Россия,- М.:"Макс Пресс", 2004,- С. 54.

10. Линькова Ю.В., Есакова A.A., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нструсов

A.И.Влияние начальных условий культивирования на потребление 2-амннобензойной кислоты метаногенными ассоциациями из донных отложений естественных водоемов. //"Биотехнология микробов". Материалы Всеросс. Симп.. посвященного 120-летию со дня рожд. акад.

B.Н.Шапошникова. 20-23 октября 2004 г. Москва. Россия,-М.:"Макс Пресс", 2004.- С. 55.

11. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б.. Нетрусов А.И. Анаэробные сообщества микроорганизмов, разрушающие аминоароматические соединения.// «Проблемы бнодсструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». Материалы Международной конференции, 14-16 сентября 2005 г. Саратов, Россия.- Саратов: Изд-во «Научная книга», 2005,-

C. 32-33.

12. Телегнна А.Ф., Емашова H.A., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Воздействие физико-химических факторов на формирование активного анаэробного сообщества, разрушающего азокрасители.// «Проблемы бнодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». Материалы Международной конференции. 14-16 сентября 2005 г, Саратов, Россия.- Саратов: Изд-во «Научная книга», 2005,- С. 116-117.

13. Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Скрининг штаммов Citrobacter freimdii на способность к первичной трансформации аминоароматических кислот.// «Автотрофные микроорганизмы». Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием, 21-24 декабря 2005 г, Москва. Россия,- М.: МАКС Пресс, 2005.- С. 89.

14. Емашова H.A., Телегина А.Ф., Котова И.Б., Калюжный C.B., Нетрусов А.П. Разрушение азокраеителей и их ароматических производных метаногенными микробными сообществами.// «Автотрофные микроорганизмы». Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием, 21-24 декабря 2005 г, Москва, Россия,- М.: МАКС Пресс 2005 - С 90.

15. Piksasova O.V., Cherdintseva Т.А., Kotova I.B., Ulumdjiev A.N., Netrusov A.I. Collection of Potential Strains of Probiotic Lactic Acid Bacteria from Natural Sources. EUPROBIO 2008 (Краков - Польша, 15-17 октября 2008 г.) Материалы, тезисы докладов. - Krakow: Polskie Towarzystwo Probiotyczne i Prebiotyczne, 2008 - С. 72.

16. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.Н. Деструкция некоторых ароматических соединений анаэробными микробными сообществами.//12-я Международная путинская школа-конференция мол. ученых «Биология - наука XXI века». Сборник тезисов, Пущино, 10-14 ноября 2008 г., Пущино, 2008. -С. 268.

17. Куликова H.A., Дьяконова А.Т., Линькова Ю.В., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Разрушение двух пищевых азокраеителей анаэробными микробными сообществами различного происхождения.// «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Материалы Всеросс. симпозиума с международ, участием, МГУ им. Ломоносова, биол. ф-т, 24-27 дек. 2009 г. - М.: МАКС Пресс, 2009. - С. 99.

18. Чердынцева Т.А., Котова И.Б., Пиксасова О.В., Нетрусов А.И. Поиск новых штаммов бактерий молочнокислой группы как потенциальных пробиотиков.// «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Материалы Всеросс. симпозиума с международ, участием, МГУ им. Ломоносова, биол. ф-т, 24-27 дек. 2009 г - M ■ МАКС Пресс, 2009. -С. 198.

19. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деструкция амипоароматнческих кислот анаэробными микробными сообществами. Труды научи, конференции "Экосистемы. Организмы. Инповацни-П": Москва, 24 шоня 2009 г - M • Макс-Пресс, 2010.- С. 59.

20. Чердынцева Т.А., Котова И.Б., Пиксасова О.В., Пименова М.А., Мельников В.Г., Хлебников B.C., Абрамов В.М., Нетрусов А.П.. Новые штаммы лактобацнлл, выделенные из природных источников, как потенциальные пробиотики. // «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Материалы VII Международной конференции. Минск, 31 мая-4 нюня 2010 г.. - Минск: «Белоруская навука», 2010. - С. 76-77.

21. Линькова Ю.В., Котова И.Б., Куликова И.А., Дьяконова А.Т., Нетрусов А.И.. Особенности физиологии анаэробных микробных сообществ, использующих ампноароматичеекпе вещества.// «Актуальные аспекты современной микробиологии». Тезисы VI молодежной школы-конференции с международным участием. Москва, 25-27 октября 2010

г. - М.: Макс пресс. 2010,- С. 41-43.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному консультанту

д.б.н., проф. Нетрусову А.И. и д.х.н., проф. Калюжному C.B., по инициативе которых было начато это исследование, за постоянное внимание, помощь и заинтересованное обсуждение результатов. Автор искренне признателен своим соратникам, принимавшим участие в работе па разных ее этапах: сотрудникам, дипломникам и аспирантам каф. микробиологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова - к.б.н. Линьковой Ю.В., к.б.н. Савельевой О.В., Дьяконовой А.Т., Есаковой A.A., Куликовой И.А., Пуреховской К.А. и сотрудникам каф. химической энзимологии химического факультета МГУ и.м.Ломопосова - к.х.н. Скляру В.И., к.х.н. Емашовой H.A. и к.х.и. Гладченко М.А.

Хотелось бы выразить огромную благодарность д.б.н., проф. Егорову Н.С., в группе которого я начинала свою научную деятельность, и с бесконечной признательностью вспомнить моего первого наставника к.б.н.|Н.СЛандау]

Автор искренне благодарен д.б.н. Т.Г.Юднной за консультации и помощь в осуществлении электронно-микроскопических исследований, ко.п. Е.С.Милько - за консультации и методическую помощь в вопросах диссоциации микроорганизмов, к.б.н. Е.В.Семеновой - за критическое обсуждение проблем биодеградацин ксенобиотиков, к.б.н. Т.А.Чердынцевой - за участие в работе с лактобацилламн и постоянную экспериментальную помощь.

Автор признателен д.б.н. Т.П.Туровой (Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН) и сотрудникам группы молекулярно-биологической идентификации Центра «Биоинженерия» РАН за помощь в проведении и интерпретации результатов филогенетического анализа. Хочется поблагодарить проф. А.Стамса и сотрудников его лаборатории (Университет Вагешшгена. Нидерланды) за предоставление аппаратурной базы, методическую помощь, обсуждение результатов и советы по дальнейшим направлениям исследований.

Автор выражает признательность всем сотрудникам и преподавателям кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова, оказывавшим разнообразную помощь в процессе выполнения работы.

Большое спасибо членам моей семьи и моим друзьям за постоянную моральную поддержку и веру в успех.

Список сокращении

ЛЛВ - аминоароматнческое(не) вещество) а):

ААК - аминоароматическая(ие) кислота(ы): АБК, АСК - аминобензонная и аминосали-цпловая кислоты, соответственно; АПТ - ароматический продукт трансформации:

АОб, А07, Az, МО, \1R, PS, SY, Tn - Acid Orange 6. Acid Orange 7. Azophloxine. Methyl Orange, Methyl Red. Ponceau S, Sunset Yellow FCF, Tartrazine, соответственно; БА, БК, БС, ГБС - бензальдегнд, бензоат, бензиловый и гидрокснбензнловый спирты, соответственно;

БВБ - беззолыюе вещество биомассы; БЭСК - бромэтансульфоновая кислота: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГБК, ДГБК, СалК - гидрокснбензойная, дигидроксибензойная и салициловая (2-гид-роксибензойная) кислоты, соответственно: ДГГЭ - денатурирующий градиентный гель-электрофорез:

ДМФ - М.1^-димстнл-«-фснилсндиамин;

ЕР, КСА, СК - мезофнльный гранулярный ил из ЕОБВ-реактора очистных сооружений пивоваренного завода «ЕГев Рйвепег» (Москва) и мезофильные флокулярные илы очистных сооружении Курьяновской станции аэрации (Москва) и свиноводческих комплексов (Россия), соответственно: ЖКТ - желудочно-кишечный тракт: 1С<<? - концентрация субстрата, при которой ацетокластическая метаногенная активность микробного сообщества снижается на 50%; ЛЖК - летучие жирные кислоты: м.ч. - масштабная черта: ПЦР - полимеразная цепная реакция; ФВ, ФКЗ, ФКР, ФЛ, ФО, ФС - фекални верблюда, козы, коровы, лошади, оленя, свиньи, соответственно, из национального парка «Хвалынскнй» Саратовской области; ФЧ1 и ФЧ2 - фекалии ребенка 3,5 (1) и 5,5 (2)лет, соответсвенно;

X, Ц, Дж - донные отложения озер Хилган-та, Цайдам (Россия, Бурятия) и реки Джамна (Индия), соответственно; ХПК - химическое потребление кислорода.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

"-К..49

ДЛЯ ЗАМЕТОК

Заказ № 102, Сдано в печать 28.02.13 Формат 297x210 1/2 Гарнитура Times New Roman

Бумага мелованная 80 г/м2 Усл. печ. л. 12, Тираж 70 экз. Отпечатано в типографии «КлассМ» 109386, г. Москва, ул. Новороссийская, д. 21

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Котова, Ирина Борисовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет

имени М.В.Ломоносова БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

05201350861

Котова Ирина Борисовна

АНАЭРОБНЫЕ МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА, РАЗРУШАЮЩИЕ АЗОКРАСИТЕЛИ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ

Специальности 03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр Иванович

Москва, 2013

СОДЕРЖАНИЕ:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................11

1. Введение.............................................................................................................11

2. Значение аминоароматических соединений для человеческой практики................................................................................................................12

3. Особенности азокрасителей и ароматических аминов как загрязнителей.......................................................................................................13

4. Преимущества биологических методов очистки от ароматических азосоединений.......................................................................................................18

5. Возможности применения анаэробной микробной технологии для биоразложения азокрасителей и ароматических аминов...........................19

6. Уровни и способы изучения микробной биодеградации.........................21

7. Пути конверсии азокрасителей у микроорганизмов................................23

8. Биохимические пути конверсии аминоароматических соединений у микроорганизмов в отсутствие кислорода.....................................................28

9. Микроорганизмы, участвующие в анаэробном разложении азокрасителей и аминоароматических соединений......................................37

10. Преимущества осуществления процесса анаэробной биодеградации микробными сообществами...............................................................................44

11. Метаногенная деградации азокрасителей и ароматических аминов микробными сообществами и влияние различных факторов на этот процесс...................................................................................................................48

11.1. Метаногенные микробные сообщества, использующие в метаболизме азокрасители и аминоароматику..................................48

11.2. Специфичность микробных сообществ по отношению к азокрасителям и ароматическим аминам............................................52

11.3. Токсичность азокрасителей и ароматических аминов.............56

11.4. Влияние различных факторов на деструкцию азокрасителей и ароматических аминов метаногенными микробными сообществами.............................................................................................58

11.4.1. Свойства и концентрация основного субстрата.................58

11.4.2. Дополнительные источники углерода и энергии...............61

11.4.3. Дополнительные акцепторы электронов............................63

11.4.4. Добавление медиаторов........................................................64

11.4.5. Температура культивирования............................................65

11.4.6. Начальное значение рН среды.............................................67

11.4.7. Начальное содержание инокулята в среде..........................68

11.4.8. Другие факторы.....................................................................69

12. Структурно-функциональная организация метаногенных микробных сообществ, осуществляющих конверсию азокрасителей и аминоароматических соединений................................................................71

12.1. Микробное сообщество как единое целое.....................................71

12.2. Синтрофия.........................................................................................74

12.3. Пространственная организация метаногенных микробных сообществ, разрушающих вещества-загрязнители............................81

12.4. Компонентный состав, взаимодействия и взаимосвязи в метаногенных сообществах, осуществляющих биодеградацию ароматических загрязнителей................................................................94

12.4.1. Методы анализа компонентного состава микробных сообществ...........................................................................................94

12.4.2. Биоразнообразие в метаногенных микробных сообществах, разрушающих органические загрязнители.............96

12.4.3. Микроорганизмы, способные к разрыву азосвязи и первичной трансформации соединений, содержащих бензольное кольцо...............................................................................................102

12.4.4. Микроорганизмы,_потребляющие_продукты

трансформации................................................................................105

12.4.5. Метаногенные археи как конечное звено процесса

анаэробной_биодеградации_(амино)ароматических

соединений.......................................................................................106

12.4.6. Микроорганизмы-члены сообщества, не принимающие непосредственного участия в процессе метаногенной конверсии органических загрязнителей...........................................................108

12.5. Влияние физико-химических факторов на структуру анаэробного сообщества, разрушающего органические загрязнители.............................................................................................109

12.5.1. Природа основного субстрата и состав среды культивирования..............................................................................109

12.5.2. Температура культивирования..........................................111

12.6. Изменение структуры метаногенных микробных сообществ, разрушающих органические загрязнения, во времени........................112

13. Заключение. Перспективы исследования микробных сообществ, конвертирующих азокрасители и ароматические амины в биогаз .... 114

13.1. Перспективы использования микробных сообществ для очистки стоков от аминоароматических ксенобиотиков.............115

13.2. Перспективы создания искусственных микробных сообществ, способных в анаэробных условиях разрушать аминоароматику.... 117

13.3. Моделирование ситуации загрязнения........................................118

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................121

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........122

1. Материалы и методы................................................................................122

1.1. Биологический материал.................................................................122

1.2. Основные субстраты и другие реактивы.....................................126

1.2.1. Азокрасители.........................................................................126

1.2.2. Ароматические амины..........................................................126

1.2.3. Другие реактивы....................................................................131

1.3. Среды и условия культивирования.................................................131

1.3.1. Среды для выделения накопительных культур и поддержания микробных сообществ.............................................131

1.3.2. Среды для выделения и поддержания чистых и ко-культур микроорганизмов.............................................................................133

1.3.3. Приготовление и стерилизация сред...................................136

1.4. Схемы выделения накопительных и чистых культур. Условия

проведения основных экспериментов...................................................138

1.4.1. Получение микробных сообществ.......................................138

1.4.2. Выделение чистых культур из анаэробных сообществ.....140

1.4.3. Условия проведения основных экспериментов.................142

Определение биоразлагаемости азокрасителей и

(амино)ароматических субстратов...................................142

Определение токсичности ААВ...........................................143

Ингибирование метаногенеза..............................................144

Определение возможного влияния на азокрасители продуктов метаболизма анаэробного метаногенного

сообщества............................................................................144

Определение возможности химического восстановления азокрасителей........................................................................144

1.5. Методы идентификации микроорганизмов..............................145

1.5.1. Молекулярно-биологические методы.................................145

Выделение ДНК......................................................................145

ПЦР-амплификация...............................................................146

Разделение ПЦР-продуктов методом ДГГЭ.....................147

Секвенирование ДНК-фрагментов......................................147

1.5.2. Физиолого-биохимические тесты........................................149

1.6. Аналитические методы................................................................... 149

1.6.1. Определение_содержания_азокрасителей_и

(амино)ароматических соединений...............................................150

1.6.2. Определение_продуктов_трансформации

аминоароматических кислот..........................................................152

Масс-спектрометрия...........................................................152

ВЭЖХ......................................................................................153

1.6.3. Определение концентраций органических кислот, спиртов и аминокислот.....................................................................................153

1.6.4. Определение концентраций неорганических ионов..........156

Определение концентрации иона аммония.........................156

Определение концентрации иона сульфида........................156

Определение концентрации нитратов и нитритов.........157

1.6.5. Определение показателя общего химического потребления кислорода (ХПК).............................................................................158

1.6.6. Определение содержания газов...........................................159

1.6.7. Определение параметров роста культур.............................160

Построение кривых роста...................................................160

Определение белка.................................................................160

Определение количества беззольного вещества биомассы (БВБ).......................................................................................161

1.6.8. Определение протеолитической активности в культуральной жидкости...........................................................................................162

1.7. Микроскопические методы.............................................................162

1.7.1. Световая микроскопия..........................................................162

1.7.2. Сканирующая электронная микроскопия...........................163

1.8. Обработка результатов экспериментов......................................163

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................................................164

I. Деструкция азокрасителей метаногенными

микробными сообществами из илов очистных

сооружений............................................................................164

1. Выделение из илов очистных сооружений микробных консорциумов, разрушающих азокрасители, и изучение их свойств.............................................................................................................164

1.1. Разложение азокрасителей в аэробных условиях.......................166

1.2. Разложение азокрасителей в анаэробных условиях...................168

1.3. Токсичность азокрасителей...........................................................179

1.4. Значение метаногенной стадии процесса для осуществления деколоризации азокрасителей...............................................................183

1.5. Влияние различных факторов на активность обесцвечивания азокрасителей анаэробными микробными сообществами..............183

1.5.1. Начальная концентрация азокрасителя в среде.................184

1.5.2. Концентрация анаэробного инокулята................................184

1.5.3. Температура культивирования анаэробных сообществ.... 186

1.5.4. Значение рН среды................................................................186

1.6. Влияние донорно-акцепторных условий среды на восстановление азосвязей.......................................................................188

1.6.1. Экзогенные акцепторы электронов.....................................188

1.6.2. Дополнительный донор электронов (ко-субстрат)............190

1.7. Механизм деколоризации азокрасителей в анаэробных условиях......................................................................................................192

1.7.1. Значение адсорбции..............................................................192

1.7.2. Детоксикация.........................................................................193

1.7.3. Внеклеточная локализация процесса обесцвечивания......195

1.7.4. Продукты клеточного метаболизма, участвующие в процесс разрыва азосвязи..............................................................................196

1.7.5. Механизм обесцвечивания азокрасителей в анаэробных условиях............................................................................................201

2. Морфологические особенности микробных консорциумов, разрушающих азокрасители........................................................................203

II. Деструкция ароматических аминов метаногенными микробными сообществами из илов очистных сооружений.............................................................................210

3. Выделение из илов очистных сооружений микробных консорциумов, разрушающих ароматические амины-интермедиаты распада азокрасителей, и изучение их свойств.......................................211

3.1. Разложение ароматических аминов в аэробных условиях........211

3.2. Разложение ароматических аминов в анаэробных условиях......................................................................................................212

3.2.1. Биодеградабельность ароматических аминов....................212

3.2.2. Способы повышения активности и глубины биодеструкции ароматических аминов в анаэробных условиях...........................216

4. Морфологические особенности микробных консорциумов, инкубируемых с ароматическими аминами............................................220

III. Деструкция изомеров АБК и АСК микробными сообществами из илов различного происхождения........229

5. Выделение из илов различного происхождения микробных сообществ, разрушающих ААК, и изучение их свойств........................229

5.1. Выделение сообществ из анаэробных осадков и отбор активных и стабильных консорциумов..................................................................229

5.2. Микробные консорциумы, использующие ААК: их общие свойства и различия................................................................................234

5.3. Влияние ряда факторов на активность деструкции ААК в активных микробных сообществах.....................................................239

5.3.1. Токсичность ААК..................................................................239

5.3.2. Гидродинамические условия инкубации............................240

5.3.3. Исходная концентрация ААК в среде.................................242

5.3.4. Концентрация инокулята......................................................244

5.3.5. Пред существование биологического материала................246

5.3.6. Температура и pH культивирования...................................248

5.4. Способность активных сообществ к кросс-акклиматизации............................................................................250

5.5. Возможности повышения эффективности метаногенной конверсии ААК..........................................................................................251

5.5.1. Изменение температуры культивирования активных консорциумов...................................................................................252

5.5.2. Внесение экзогенных акцепторов электронов...................253

5.5.3. Внесение легкоусваиваемых ко-субстратов.......................254

6. Детальное исследование процесса метаногенной деструкции

ААК...................................................................................................................257

6.1. Идентификация интермедиатов процесса метаногенной деструкции ААК.......................................................................................258

6.1.1. Разведение микробных сообществ......................................258

6.1.2. Проверка способности сообществ минерализовать идентифицированные ароматические интермедиаты и другие структурно похожие вещества.......................................................259

6.1.3. Токсичность продуктов трансформации ААК...................264

6.1.4. Стимуляция пируватом потребления интермедиатов конверсии ААК................................................................................265

6.1.5. Ингибирование метаногенной стадии процесса биодеградации ААК........................................................................270

6.2. Определение путей деградации ААК в активных метаногенных консорциумах............................................................................................270

6.2.1. Последовательность реакций деградации ААК.................270

6.2.2. Путь деградации ААК в активных сообществах...............272

6.2.3. Индуцибельность биодеградации ААК в метаногенных микробных сообществах.................................................................272

7. Структурно-функциональная организация метаногенных микробных сообществ, разрушающих ААК............................................273

7.1. Морфологические особенности сообществ, использующих ААК, и изменение их структуры в процессе метаногенной деструкции субстрата и при различных воздействиях..........................................273

7.1.1. Изменение культуральных и морфологических характеристик сообщества при активизации процесса метаногенной конверсии ААК.......................................................273

7.1.2. Селективный эффект ААК и морфотипы, характерные для активного метаногенного сообщества..........................................279

7.1.3. Изменения морфологических характеристик активного сообщества при различных воздействиях.....................................285

7.2. Функциональные группы в составе сообществ, способных к метаногенной деградации ААК.............................................................288

7.2.1. Гетеротрофные мезофильные микроорганизмы в активных сообществах.....................................................................................289

7.2.2. Олиготрофные микроорганизмы.........................................291

7.2.3. Спорообразующие и бесспоровые микроорганизмы в активных сообществах....................................................................291

7.2.4. Микроорганизмы, гидролизующие целлюлозу..................294

7.2.5. Азотфиксирующие анаэробные микроорганизмы.............295

7.2.6. Сульфатредуцирующие микроорганизмы..........................295

7.2.7. Бактерии группы кишечной палочки (БГКЩ....................296

7.2.8. Бактерии молочнокислой группы........................................296

7.3. Филогенетический анализ компонентного состава активных метаногенных сообществ, разлагающих ЛАК....................................297

7.4. Микробиологический анализ компонентного состава активных и стабильных метаногенных сообществ, разрушающих ААК........301

7.4.1. Выделение и идентификация чистых культур и изучение их физиолого-биохимических свойств...............................................302

7.4.1.1. Изолят WA1..............................................................302

7.4.1.2. Изолят ASA2.............................................................307

7.4.1.3. Изолят Tsaydam-5-ASA............................................310

7.4.1.4. Изолят ЕР-АВА........................................................312

7.4.1.5. Изолят ЕР-АВА2......................................................314

7.4.1.6. Изолят L-34..............................................................316

7.4.1.7. Изолят L-43.1...........................................................319

7.4.2. В�

Информация о работе

Котова, Ирина Борисовна
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Анаэробные микробные сообщества, разрушающие азокрасители и их производные - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Анаэробные микробные сообщества, разрушающие азокрасители и их производные ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анаэробные микробные сообщества, разрушающие азокрасители и их производные"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Котова, Ирина Борисовна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анаэробные микробные сообщества, разрушающие азокрасители и их производные
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология