Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деструкция аминоароматических веществ анаэробными микробными сообществами

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Деструкция аминоароматических веществ анаэробными микробными сообществами"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова Биологический факультет_

на правах рукописи

4853597

ЛИНЬКОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ АНАЭРОБНЫМИ МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 СЕН 2011

Москва, 2011 г.

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Нетрусов Александр Иванович кандидат биологических наук, доцент Котова Ирина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ножевникова Алла Николаевна кандидат химических наук Емашова Наталия Александровна

Ведущая организация:

Защита состоится 4" 2011 годав 15 ч. 30 мин. на заседании

диссертационного совета Д.501.001.21 по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан_2011 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета, к.б.н. Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. С развитием новых химических технологий в биосферу поступает большое количество токсичных и устойчивых соединений, уровень которых возрастает с каждым годом. Аминоароматнческие соединения, используемые в производстве лекарственных препаратов и лакокрасочных материалов, содержатся в сточных водах предприятий химической и фармацевтической промышленности (Carmona et al., 2009). Аминоароматнческие вещества являются также продуктами восстановления азокраснтелей в анаэробных условиях (Емашова и др., 2005), причем некоторые имеют природное происхождение. Например, 2-аминобензойная кислота (2-АБК) - предшественник синтеза алкалоидов в растениях, а 4-АБК (4-аминобензойная кислота, витамин Hi) используется кишечной микробиотой для синтеза фолиевой кислоты.

В настоящее время нагрузка на естественные процессы самоочищения биосферы является избыточной, и параллельно с незначительной деструкцией ксенобиотиков идёт их постепенное накопление в окружающей среде. Значительная роль в деградации таких загрязнений принадлежит микроорганизмам (Остроумов, 1986; Щербакова, 2000; Diaz, 2004). Микроорганизмы являются важным звеном в круговороте веществ в биосфере, выполняя в основном роль редуцентов. Анаэробные микроорганизмы, обладающие способностью трансформировать большое количество органических и неорганических субстратов, принимают активное участие во всех биологических циклах (круговороте углерода, азота, серы и других элементов). В естественных условиях анаэробные микроорганизмы, входящие в состав микробных консорциумов, осуществляют функции деструкции сложных органических веществ, обеспечивая самоочищение экосистем.

Деструкция (амино)ароматических соединений зачастую происходит более эффективно в анаэробных условиях, т.к. в присутствии кислорода многие из них полимеризуются, что затрудняет дальнейшую минерализацию, либо образуют токсичные промежуточные продукты (Савельева, 2003). В связи с этим актуальны исследования, направленные на получение микробных сообществ, способных осуществлять процесс минерализации (амино)ароматических ксенобиотиков в отсутствие кислорода. В настоящее время результаты исследований по биодеградации загрязнений учитываются при разработке различных очистных сооружений. Для очистки почв, атмосферы, сточных вод используются биореакторы различных технологических типов: аэробный, анаэробный и гибридный, включающий анаэробную и аэробную стадии (Deriell et al., 1999). Как правило, в реакторах используются естественно сложившиеся консорциумы микроорганизмов. В таких консорциумах наблюдается комбинация катаболических возможностей, благодаря чему

происходит полное разрушение вещества, недоступное чистым культурам микроорганизмов из-за термодинамических ограничений.

В настоящее время получены как микробные ассоциации, так и чистые культуры бактерий, разлагающие эти соединения в условиях сульфат- (Schnell, Schink, 1992) и нитратредукции (Tschech, Fuchs, 1987), изучены физиологические признаки и биохимические особенности расщепления ароматического кольца (Head, 1998; Harwood et al., 1999; Schink et al., 2000; Boll, 2005; Heider, 2007; Fuchs, 2008; Хоменков и др., 2008; Carmona et al., 2009). Значительно меньше работ посвящено изучению деструкции амнноароматических соединений в условиях метаногенеза при отсутствии внешних акцепторов электронов.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было изучение способности микробных сообществ к деструкции аминоароматических кислот в анаэробных условиях. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Получение метаногенных микробных сообществ, способных расщеплять аминоароматические субстраты до СН4 и СО2;

2. Определение функциональных возможностей выделенных сообществ и влияния ряда факторов на процесс биодеградации;

3. Определение биохимического пути деструкции аминоароматических кислот и идентификация интермедиатов процесса;

4. Изучение микробного состава выделенных сообществ, разлагающих аминоароматику в анаэробных условиях;

5. Выделение чистых культур микроорганизмов, осуществляющих различные этапы деструкции аминоароматических веществ в изучаемых сообществах.

Научная новизна и практическая значимость работы. Была продемонстрирована потенциальная способность анаэробных микробных сообществ различного происхождения к разложению как исходных аминоароматических субстратов, так и других ароматических веществ и азокрасителей. Показана возможность деструкции аминоароматических соединений сообществами, выделенными из донных отложений естественных водоемов, которые ранее не подвергались массированному воздействию аминоароматических ксенобиотиков. Определены ароматические интермедиа™ начальных стадий трансформации аминоароматики сообществами, полученными из различных источников биоматериала. Показано влияние ряда факторов на скорость и эффективность процесса биодеградации.

Проведено сравнение выделенных микробных консорциумов по таким параметрам, как видовое разнообразие (число морфотипов), активность биодеструкции аминоароматических

субстратов, стабильности активности, течение самого процесса деградации. Был проанализирован состав микробных сообществ различного происхождения, определены функциональные возможности выделенных консорциумов и выявлены представители различных физиологических групп. Из двух метаногенных сообществ был выделен ряд чистых культур, участвующих в процессе деструкции ароматических аминов на стадии брожения.

Понимание сути процессов в биоремеднации природных сред и в очистке стоков позволяет предсказывать поведение микробных сообществ на разных этапах деструкции и управлять процессом очистки. Результаты исследований по микробной деградации загрязнений представляют собой научную основу для биотехнологического процесса обработки стоков, их необходимо учитывать при прогнозировании судьбы поллютаптов в окружающей среде и разработке различных очистных сооружений.

Публикации и апробация работы. По результатам работы опубликовано 12 печатных работ, из них 3 - статьи в рецензируемых журналах. Основные положения и результаты работы были представлены на Всероссийском симпозиуме "Биотехнология микробов" (Москва, 2004), Международной конференции "Проблемы бнодеструкцин техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 2005), 12-й международной Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука 21 века" (Пущино, 2008), 4-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Экологические проблемы промышленных городов" (Саратов, 2009), XI и XVI Международных конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2004 и 2009), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), VI Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010).

Структура и объём работы: Материалы диссертации изложены на 1?0 страницах машинописного текста и включают 85 рисунков и 21 таблицу. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который содержит 35 отечественных и 178 иностранных наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе были исследованы накопительные культуры, полученные из анаэробных илов двух очистных сооружений и донных отложений естественных водоемов. Базовым служил режим культивирования при рН 7, 30°С, в статических условиях в темноте в анаэробной минеральной среде, содержащей 100 мг/л дрожжевого экстракта, микроэлементы и резазурин (индикатор анаэробных условий).

Анаэробные условия создавали с помощью замены азотом газовой фазы в закрытых резиновыми пробками флаконах объёмом 120 мл, а также внесения восстановителя - 0,278 г/л Na2S9H20. В качестве (амино)ароматических субстратов использовали 2-,3- и 4-аминобензойные кислоты (2-,3-,4-АБК), 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК), бензойную кислоту (БК), 2-гидроксибензиловый спирт (2-ГБС), бензиловый спирт (БС), салициловую кислоту (СК).

Для определения деградации аминоароматики накопительными культурами содержание ароматических соединений в среде измеряли с помощью спектрофотометрического сканирования (Shímadzu UV-1202, Япония) в диапазоне волн от 200 до 600 им, а также высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) в обращенных фазах на колонках ChromSpher С18 2x10 см ("Chrompack", Нидерланды) по поглощению при 230 нм. Концентрацию органических кислот и спиртов определяли с помощью ВЭЖХ на колонке Varian Metacarb 67Н (300x6,5 мм; "Merck",ФРГ)- Содержание газов измеряли на газовом хроматографе Shimadzu GC-2014 (Япония) с двумя колонками. Разделение водорода и метана проводили на колонке Molsieve 2 м х 3 мм, температура детектора -100°С, газ-носитель - гелий. СОг измеряли на том же хроматографе, температура детектора 33°С, газ-носитель - гелий, колонка - Poraplot Q С37554, 25 м х 0,53 мм ("Chrompack", Varian Inc., США).

Содержание белка в культуральной жидкости накопительных культур определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Аммоний-ион определяли по стандартному методу Несслера (Лурье, 1984). Анализ содержания лактата проводили электрохимически с использованием биосенсоров первого поколения на основе L-лактатоксидазы. API-тесты для лактобацилл (BioMerieux, Франция) проводили согласно рекомендациям.

Для выделения чистых культур применяли натуральные и минеральные жидкие или агаризованные среды общего назначения (МПА, голодный агар, базовую минеральную среду), селективные среды для разных групп микроорганизмов (сульфатредукторы, микроорганизмы-гидролитики, использующие целлюлозу, анаэробные азотфиксаторы из рода Clostridium, олиготрофные микроорганизмы, БГКП), а также базовую анаэробную агаризованную среду, содержащую различные добавки. Культивирование осуществляли как в анаэробных, так и в аэробных условиях. Для части посевов использовали предварительный прогрев биологического материала.

Выделение ДНК из чистых культур и первичную очистку проводили модифицированным фенол-хлороформным методом (Маниатис и др., 1984; Нетрусов и др., 2005). Полученные образцы ДНК дополнительно подвергали очистке с помощью

миниколонок "Wizard DNA clean-up system" (Promega Corporation, Madison, США) no методике, приведенной в руководстве с поставляемым набором.

ПЦР-амплификацию генов 16S рРНК проводили с универсальными праймерами 8-27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') согласно протоколу Lane (1991). Очистку ПЦР-продуктов выполняли с помощью миниколонок "Wizard PCRPreps" («Promega», США) согласно рекомендациям производителя. ПЦР-продукты, полученные при амплификации с праймерами 8-27F и 1492R (для чистых культур), очищали и секвенировали. Секвенирование проводили с использованием набора реактивов "BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit" (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя.

Сравнительный анализ последовательностей генов 16S рРНК осуществляли с помощью данных и программного обеспечения Ribosomal Database Project - RDP (http://rdp.cme.msu.edu). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.nesu.edu/BioEdit/bioedit.html). Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов микроорганизмов с помощью программы CLUSTALW v 1.75. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECONW (http://bioc-www.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.html. Van de Peer, De Wächter, 1994). Автор выражает глубокую признательность и благодарность д.б.н. Туровой Т.П. за помощь в проведении филогенетического анализа.

ПЦР-продукты, полученные при амплификации с праймерами 338F (GC) (5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3') и 518F(GC) (5-GCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGGTGBCAGCMGCCGCG GTAA-3') (для сообществ), разделяли методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) в 8% полиакриламидном геле, содержащем линейный градиент (3070%) ДНК-денатурантов (мочевина и формамид). Электрофорез проводили при 60°С при напряжении 70 В 20 ч. После электрофореза гели окрашивали раствором красителя SYBR(R) Gold (разведение 1:10 ООО) в течение 40 мин. Наиболее четкие полосы, содержащие фрагменты ДНК, извлекали из геля и впоследствии проводили реамплификацию ДНК-фрагментов, используя праймеры 907R (51-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3') и 515F (5-GTGBCAGC MGCCGCGGTAA-3').

Морфологические особенности микроорганизмов в образцах исследовали методами фазово-контрастной и световой (микроскоп Биолам-2, ЛОМО, Россия) микроскопии препаратов живых и термически фиксированных окрашенных фуксином клеток,

соответственно, а также сканирующей электронной микроскопии. Микрофотографии с использованием фазового контраста получали с использованием микроскопа Leica DMR НС (Wetzlar, ФРГ), оборудованного цифровой камерой Leica DC 250. Подготовку препаратов для сканирующей электронной микроскопии проводили по стандартной методике (Нетрусов и др., 2005) и просматривали на электронном сканирующем микроскопе «Hitachi S - 405 А» (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Накопительные культуры, использующие в своём метаболизме аминоароматнчсскме вещества. Анаэробные накопительные культуры, расщепляющие амниоароматические соединения, получали из активных метаногенных илов различного происхождения путем длительной адаптации к соответствующим аминоароматическим субстратам (более 3 лет на момент начала экспериментов). В работе использовали несколько источников биопроб: мезофильный флокулярный ил очистных сооружений Курьяновской станции аэрации (ил КСА), анаэробный ил очистных сооружений пивоваренного завода "Efes Pilsener" (ил ЕР), донные отложения реки Джамна (Индия), донные отложения содового озера Цайдам (Бурятия). В качестве субстратов использовали 2-, 3-, 4-АБК и 5-АСК. После практически полного исчезновения в культуральной жидкости внесенной порции начального субстрата в культивационные сосуды вносили шприцем новые порции того же аминоароматического вещества, после чего начинался следующий цикл потребления аминоароматики.

Мезофильный флокулярный ил очистных сооружений Курьяновской станции аэрации (ил КСА) представлял собой черные мелкие частицы, состоящие из тонких палочек разной длины, мелких прямых палочек и скоплений кокков разного размера. Анаэробные культуры 04 и Р2 были получены из данного ила путем адаптации к 2-АБК (культура 04) и смеси 2-АБК+4-АБК (культура Р2) в течение длительного периода (более 9 лет). Лаг-период активности перед первым циклом потребления составлял 50 и 70 сут соответственно.

Аминобензойные кислоты являлись единственным источником углерода и энергии в сообществе. Средняя скорость потребления 2-АБК культурой 04 составляла 0,03 мМ /сут, культура Р2 разрушала 2-АБК со скоростью 0,03 мМ/сут, 4-АБК - со скоростью 0,15 мМ/сут. Микроскопическая картина обоих сообществ была представлена мелкими кокками, расположенными как в скоплениях, так и отдельно, короткими толстыми палочками, а также крупными фрагментированными палочками, появление которых было связано с концом цикла потребления ароматического субстрата и образованием биогаза. В сообществе Р2 встречались также крупные кокки и мелкие изогнутые палочки.

Активный метаногенный ил очистных сооружений пивоваренного завода "Efes Pilsner" состоял из тёмных гранул, включающих 11 типов палочек и 3 типа кокков, с преобладанием крупных прямых палочек с обрубленными концами в виде коротких цепочек и коккобацилл, лежащих попарно. Анаэробная накопительная культура ЕР была получена путём адаптации ила к 2-АБК в течение долгого промежутка времени (более 5 лет). 2-АБК являлась единственным источником углерода и энергии в сообществе. Первый цикл потребления субстрата для данной культуры длился 38 сут, из них 14 сут продолжался лаг-период. Последующие циклы потребления начинались без адаптационного периода, культура потребляла 2-АБК со средней скоростью 0,06-0,08 мМ/сут. Микроскопический анализ сообщества ЕР показал наличие кокков, как в цепочках, так и отдельно, коротких толстых палочек; фрагментированных палочек с прямыми концами средней длины и в конце цикла потребления субстрата - длинных тонких изогнутых нитей.

Донные отложения реки Джамна (Индия) представляли собой чёрные хлопья, состоящие из мелких кокков, коккобацилл и палочек разной формы и размера. Базовым служил режим культивирования при рН 7, 30°С, в статичных условиях в темноте. В ряде экспериментов варьировали значения различных параметров культивирования (рН, освещенности, температуры). При базовом режиме культивирования накошггельные культуры наиболее активно разрушали 2-АБК, причем первый цикл ее потребления длительностью 135 сут начался с довольно длительного (54 сут) лаг-периода. Следующий цикл деградации 2-АБК проходил уже без лаг-периода и завершился за 25 сут.

Донные отложения содового озера Цайдам, для которого характерно высокое содержание минеральных солей (общая минерализация 14 г/л), представляли собой зеленовато-серые крупные рыхлые хлопья, состоящие из скоплений мелких и крупных кокков и палочек разной длины и формы. Из всех использованных нами субстратов наиболее активно в базовом режиме культивирования происходила деструкция накопительной культурой 2-АБК. Ее потребление началось спустя 35 сут, средняя скорость использования субстрата в цикле составила 0,22 мМ/сут. В варианте, культивируемом при базовых условиях и расщепляющем 2-АБК, в середине цикла преобладали мелкие палочки, были немногочисленные длинные прямые тонкие палочки.

Культуры, выделенные из илов очистных сооружений, являлись наиболее активными из всех использованных в работе. Они с высокой скоростью и в течение длительного времени потребляли аминоароматический субстрат и образовывали конечные продукты (биогаз), скорость потребления субстрата от цикла к циклу не изменялась. При пересевах и масштабировании эти анаэробные сообщества не теряли своей активности.

Для культур, полученных из естественных водоемов, был характерен довольно продолжительный лаг-период, тогда как некоторые культуры, полученные из неадаптированных илов очистных сооружений, начинали потреблять субстрат практически без лаг-периода. Видовое разнообразие в культурах, выделенных из неадаптированного ила, вследствие непродолж1ггелыгого воздействия аминоароматических веществ была богаче, чем в длительно адаптированных накопительных культурах 04 и Р2, однако активность деградации и ее стабильность была выше у культур 04 и Р2.

В зависимости от обсуждаемых характеристик все использованные нами в работе культуры можно расположить в виде следующих рядов (в порядке возрастания) (табл.1).

Таблица 1.

Основные свойства анаэробных сообществ в сравнении.

Характеристика сообщества Сообщества (в порядке возрастания)

Видовое разнообразие/Число морфотипов 04, Р2 < Цайдам < Джамна <ЕР

Стабильность активности ЕР < Джамна < Цайдам < 04, Р2

Активность Цайдам, Джамна < ЕР < 04, Р2

Длительность потребления аминоароматики ЕР < Джамна, Цайдам < 04 < Р2

Итак, наиболее активными и стабильными, хотя и менее разнообразными по компонентному составу вследствие длительного селективного воздействия аминоароматических субстратов оказались сообщества 04 и Р2, выделенные из ила КСА и длительное время находящиеся в контакте с аминоароматикой.

2. Общая характеристика процесса биодеградации. Нами показано, что независимо от источника биологического материала процесс потребления аминоароматического субстрата протекает в несколько стадий. Для всех сообществ в начале первого цикла потребления субстрата был характерен определённый лаг-период (адаптационный период), в течение которого происходит пространственная организация сообщества, изменение его трофических связей и активизация ферментных систем, участвующих в разложении ароматических субстратов до конечных продуктов (Kotova et al., 2005). Время адаптации и длительность цикла минерализации исходного аминоароматического субстрата (табл. 2) в разных вариантах накопительных культур различались, но последовательность появления, состав основных интермедиатов и конечных продуктов оставались неизменными: в качестве промежуточных продуктов всегда образовывались СОа, Нг и NH/, затем бензоат, ацетат, конечными продуктами деструкции являлись СН4 и СО2 (рис.1). В качестве иигермедиатов

процесса фиксировали также следовые количества лактата, бугирата и этанола, а также следы водорода (в начале цикла потребления). Таблица 2.

Накопительные культуры, расщепляющие аминоароматические субстраты.

Вариант Исходный ИЛ Параметры культивирования, субстрат Лаг-период активности биоразло-жеиня (сут) Средняя скорость деградации (мМ/сут) в цикле потребления субстрата Стабильность активности (возраст культуры/число циклов потребления)

04 КСА С°=30°С, рН = 6,57,5, 2-АБК 10 0,03 Высокая (9 лет 9 мес/355)

Р2 КСА 1°= 30°С, рН = 6,57,5, 4-АБК 10-14 0,03 Высокая (3 года 7 мес/129)

ЕР ЕР 1°= 30°С, рН = 6,5-7,5,2-АБК 7-14 0,08 Средняя (5 лет 6 мес/39)

Ц Ц 1= 30°С, рН=7,0, 2-АБК 35 0,22 Средняя (2 года/18)

Рис.1. Типичная картина появления промежуточных и конечных продуктов при биодеградации аминоароматики на примере накопительной культуры ЕР, разрушающей 2-АБК.

В сообществах, активно разлагающих аминоароматику, наблюдали значительное «обеднение» компонентного состава и смену доминирующих видов микроорганизмов.

При деструкции аминоароматических кислот различные фазы процесса сопровождались изменениями микроскопической картины микробных сообществ. На примере микробного консорциума ЕР, расщепляющего 2-АБК, наблюдали сукцессию сообщества в течение цикла потребления (рис. 2). В начале цикла потребления в культуре присутствовали палочки, короткие и средней длины, а также небольшое количество кокков (рис.2, А, Б). Начало метаногенеза всегда было связано с появлением в сообществе длинных палочек или нитей, окруженных кокками (рис.2, В, Г). Эти длинные палочки (нити) могут располагаться как отдельно, так и быть включёнными в скопления (агрегаты) клеток. Клетки в составе агрегатов в активной накопительной культуре часто бывают ослизнены,

А) Б)

Рис. 2. Изменение микроскопической картины сообщества ЕР в течение цикла потребления 2-АБК (световая микроскопия с фазово-контрастным устройством, х!200). А - нулевая точка, Б - 2-е сут, В, Г - 6-8-е сут цикла.

Для накопительной культуры ЕР, расщепляющей 2-АБК, было исследовано влияние пирувата и глюкозы как дополнительных источников углерода и энергии на процесс деструкции аминоароматических веществ. Внесение в накопительную культуру пирувата до

конечной концентрации 20 мМ приводило к увеличению скорости деструкции 2-АБК в 2,5 раза, в присутствии глюкозы (2 г/л) скорость процесса биодеградации 2-АБК сообществом ЕР также увеличивалась в 1,5-1,7 раза (рис.3).

Рис.3. Расщепление 2-АБК сообществом ЕР/2-АБК в присутствии и отсутствие пирувата.

Для определения роли небиологических факторов (физико-химических параметров) в процессе деградации ксенобиотиков был проведён ряд экспериментов. В опыте с автоклавированным илом было показано, что начальная стадия потребления субстрата связана с адсорбцией вещества на частицах ила. При сравнении активности «живых» и подвергнутых автоклавированию при 1 ати различных анаэробных илов было показано, что уже в течение первых суток концентрация субстрата уменьшалась на 10-20% от исходной. Однако в дальнейшем «живой» ил потреблял аминоароматическое соединение полностью с образованием промежуточных и конечных продуктов, в том числе и при повторном введении субстрата.

Изменение гидродинамических условий также влияет на процесс деградации субстрата и на формирование микробных агрегатов, приводя к изменению морфологических характеристик сообщества. Образование структурированных микробных агрегатов в статичных условиях происходит намного быстрее, чем в условиях перемешивания, они крупнее, но их количество меньше. Изменение гидродинамических условий влечет за собой и изменение микроскопической картины стабильных накопительных культур, потребляющих 2-АБК.

В эксперименте по определению влияния начальных параметров культивирования (температуры, освещенности, рН и химической природы субстрата) на процесс деградации

субстрата, морфологические и физиологические характеристики сообщества были использованы илы естественных водоемов. Выбор именно этих илов для эксперимента по варьированию комплекса физико-химических параметров культивирования был обусловлен тем, что в естественных местообитаниях колебание физико-химических факторов является обычной ситуацией, тогда как в очистных сооружениях условия культивирования гораздо более стабильны и контролируемы. Для накопительных культур из донных осадков задавали разные сочетания четырех факторов: 1) температуры - комнатная переменная, 30°С, 55°С; 2) рН - 7 и 9, 3) субстрата - 2-АБК, 4-АБК, 3-АБК, 5-АСК и 4) освещенности - на свету и в темноте. В результате комбинаций всех факторов получили около 100 вариантов, различающихся по степени использования аминоароматического субстрата. Благоприятными для процесса деградации аминобензойных кислот оказались 30°С или комнатная переменная температура. При повышенной температуре (55°С) активного потребления аминоароматического субстрата не происходило. Выделены только две накопительные культуры, в которых показано медленное использование аминоароматики при 55°С. Активные накопительные культуры, потребляющие аминоароматический субстрат, имели рН не выше 8,5. Наиболее «биодеградабельным» субстратом для микробных ассоциаций оказалась 2-АБК. 3-АБК выделенные нами культуры практически не потребляли. В условиях освещенности только в отдельных случаях процесс также мог идти более активно, чем в темноте.

Для активно разлагающих аминобензойные кислоты анаэробных микробных сообществ было отмечено селективное действие аминоароматических веществ и существенное снижение морфологического разнообразия микроорганизмов по сравнению с исходным консорциумом (например, для накопительной культуры ЕР, разрушающей 2-АБК, с 14 морфотипов до 5), что свидетельствует о возможной токсичности аминоароматики для микроорганизмов, осуществляющих неметаногенные стадии процесса биоразложения.

3. Интермеднаты процесса биодеструкции аминоароматических кислот и возможности использования сообществами других ароматических субстратов. Для активных сообществ, полученных из различных источников биоматериала, нами были идентифицированы ароматические интермедиаты биодеструкции аминоароматики. Ранее при исследовании деградации аминоароматических соединений продукт первичной трансформации 5-АСК метаногенным сообществом, полученным из ила очистных сооружений свиноводческого комплекс, был определен как 2-ГБС (БауеНеуа Л а1., 2003). Продукт трансформации 5-АСК в сообществе, выделенном из ила озера Цайдам, был также идентифицирован нами как 2-ГБС, превращающийся последовательно в бензоат. Продуктом первичной биоконверсии 2-АБК является бензиловый спирт.

Реальные сточные воды зачастую содержат несколько загрязняющих компонентов и продуктов их трансформации, поэтому для определения потенциальных метаболических возможностей культуры, продемонстрировавшие • наибольшую активность в процессе деструкции аминоароматических веществ (04, Р2, ЕР), были проверены на способность к деструкции интермедиатов анаэробной биоконверсии аминобензойных кислот (бензилового спирта, бензойной кислоты, 2-гидроксибензилового спирта), а также салициловой кислоты и широко применяющегося в текстильной промышленности кислотного азокрасителя Acid Orange 6, при восстановлении которого образуются ароматические амины (табл.3).

Довольно активное, практически без лаг-периода потребление бензилового спирта с образованием СН4 и СОг в качестве конечных продуктов происходило во всех трех сообществах. Наиболее значительная деградация имела место в сообществах 04 и Р2, ранее подвергшихся более длительному воздействию аминоароматического субстрата, чем вариант ЕР. Бензойную кислоту с образованием СН4 и СО2 потребляли накопительные культуры 04 и ЕР, причем вариант ЕР отличался большей активностью. В качестве промежуточных продуктов регистрировали ацетат и следы этанола. Незначительное потребление 2-гидроксибензилового спирта (0,34 мМ) с образованием СН4 и СОг происходило только в варианте ЕР (табл.3).

Для выявленных нами промежуточных продуктов трансформации аминоароматики при помощи стандартного метода определения активности ацетокластического метаногенеза анаэробной биомассы (Donion et al., 1995) определяли токсичность стандартным методом по отношению к ацетокластическим метаногенам. Было показано, что токсичность ароматических веществ уменьшается в ряду: 2-ГБС > бензиловый спирт > бензойная кислота > салициловая кислота.

Таблица 3.

Использование ароматических субстратов сообществами 04, Р2 и ЕР, адаптированными к аминобепзойным кислотам.

Культура Субстрат Скорость потребления (мМ/сут) Нптермедиаты Конечные продукты

04 2-АБК (основной) 0,03 Бензиловый спирт, бензоат, ацетат, N11/ сн4,со2

АОб 0,25 Сульфаниловая кислота, ацетат, этанол сн,,со2

БС 0,167 Бензоат, ацетат, этанол (следы) сн4,со2

БК 0,071 Ацетат, этанол (следы) СН4,С02

2-ГБС — — —

СК — — —

Р2 4-АБК (основной) 0,03 Бензиловый спирт, бензоат, ацетат, N11/ СИ|,С02

АОб 0,22 Сульфаниловая кислота, ацетат, этанол СЦ,,С02

БС 0,040 Бензоат, ацетат, этанол (следы) сн4,со2

БК — — —

2-ГБС — — —

СК — — —

ЕР 2-АБК (основной) 0,08 Бензиловый спирт, бензоат, ацетат, N11/ СН,,С02

АОб 0,12 Сульфаниловая кислота, ацетат, этанол СН,,С02

БС 0,022 Бензоат, ацетат, этанол СН<,С02

БК 0,113 Ацетат, этанол (следы) сн4,со;

2-ГБС 0,002 Н2 (следы), бензоат, ацетат, этанол (следы) СН4,С02

СК — — —

Для культуры ЕР было изучено влияние пирувата на процесс деструкции и других ароматических субстратов (бензойной кислоты, бензилового спирта, салициловой кислоты, 2-гидроксибензилового спирта, бензальдегида, пирогаллола, резорцинола и флороглюцинола). Так, внесение 20 мМ пирувата в среду культивирования стимулировало процесс биодеградации как основного субстрата, так и других использованных ароматических веществ. Некоторые вещества (салициловую кислоту, пирогаллол, бензальдегид) накопительная культура ЕР оказалась способна разлагать только в присутствии пирувата как дополнительного источника углерода и энергии. Внесение пирувата ускоряло минерализацию как основного, так и других ароматических субстратов в 2-60 раз по сравнению с ростом на (амино)ароматическом веществе как единственном источнике углерода и энергии. Параллельно с деструкцией ароматического субсграта сообщество сбраживало пируват, образуя ацетат, пропионат, формиат, бутират и лактат в качестве промежуточных продуктов.

Анализ интермедиатов деструкции 2-АБК и 5-АСК с большой долей вероятности позволяет говорить о реализации бензоил-КоА-пути деструкции аминоароматических субстратов (Heider, Fuchs,1997) полученными микробными сообществами.

Как известно, существуют различные пути анаэробной конверсии ароматических веществ, где в качестве центрального иитермедиата могут выступать не только бензоат, но и резорцннол или флороглюцинол (Heider, Fuchs,1997). Для проверки возможности реализации альтернативных путей деградации аминоароматических веществ было изучено потребление сообществом ЕР, изначально адаптированным к 2-АБК, флороглюцинола, резорцинола и его аналога пирогаллола. Отсутствие потребления флороглюцинола и резорцинола данным сообществом указывает на то, что в заданных условиях эти пути не реализуются.

С учетом всех идентифицированных нами интермедиатов можно предложить следующую последовательность реакций разложения 2-АБК:

сн2он

+ н2о + NHj*

4[Н]

3 СНзСООН + С02 + б [Н]

4) 3 СНзСООН -► ЗС02 + ЗСН4

5) ЗН2 + 0,5С02 -► 0,5СН4 + 2Н20

Схема деструкции 5-АСК отличается от вышеприведенной схемы только на первых этапах (5-АСК трансформируется сначала в 2-ГБС, затем в бензоат, последующие стадии деградации совпадают с таковыми для процесса разложения 2-АБК).

4. Анализ компонентного состава сообщества. Анаэробные микробные сообщества, использованные в нашей работе, являются хорошо сбалансированными системами с облигатными связями между микроорганизмами-членами сообщества, что приводит к значительным трудностям при выделении чистых культур микроорганизмов прямым высевом на питательные среды. Высевы сообществ 04, Р2 и ЕР на селективные среды, проведенные с целью выявления различных функциональных групп микроорганизмов, входящих в состав сообщества, а также демонстрации потенциальных функциональных

возможностей сообществ в реальных меняющихся условиях (например, в настоящих сточных водах), показали присутствие в сообществах сульфатредукторов, целлюлозолитических и олиготрофных микроорганизмов. Для определения общей численности гетеротрофных микроорганизмов, присутствующих в анаэробных сообществах, и количественных соотношений разных морфологических типов были проведены также высевы активных анаэробных культур на богатые и минеральные плотные питательные среды в анаэробных и аэробных условиях, выявившие присутствие в значительных количествах факультативных анаэробов.

При исследовании роли бесспоровых микроорганизмов в процессе деструкции и пространственной организации сообщества проводили кипячение образцов на водяной бане в течение 10 мин. Исключение метаногенных микроорганизмов и неспорообразующих синтрофов из анаэробных сообществ приводило к изменению как промежуточных продуктов, так и структуры микробного сообщества.

Для оценки филогенетического положения микроорганизмов, зависящих друг от друга в сложной пищевой цепи (сети) и зачастую некультивируемых, использовали DGGE-метод анализа (Diaz et al., 2006) неадаптированного ила ЕР и активного сообщества ЕР, разрушающего 2-АБК. При разделении методом DGGE продуктов амплификации ДНК были получены DGGE-профили двух исследованных культур. Секвенирование реамплифицированных и очищенных ДНК-фрагментов, экстрагированных из DGGE-полос, и филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S рДНК выявили преобладание как в исходном иле, так и в накопительной культуре некультивируемых представителей филогенетической группы Bacteroidetes, а также присутствие представителей родов Bacillus, Moraxella, Lactobacillus, Methanosaeta и Methanosarcina. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в накопительной культуре было меньше, чем для исходного неадаптированного ила, что свидетельствует о селективном воздействии аминоароматических веществ на микробное сообщество, приводящее к снижению количества видов в и4м.

5. Чистые культуры. Из двух метаногенных сообществ, активно разрушающих аминоароматические субстраты, были выделены 5 чистых культур микроорганизмов, участвующих в процессе деструкции ароматических аминов.

Штамм Tsaydam-5-ASA.

Из микробного сообщества Ц-5-АСК, разлагающего 5-АСК до биогаза, была выделена чистая культура Pseudomonas aeruginosa. Клетки изолята представляли собой грамотрицательные прямые или слегка изогнутые подвижные палочки, не образующие спор.

Данный штамм хотя и не принимает непосредственного участия в процессе деструкции аминоароматических соединений, однако при определённых условиях может происходить трансформация аминоароматики данным штаммом либо другим нитратредуцирующим микроорганизмом по схеме, предложенной ранее (Савельева, 2003). Помимо этого, по литературным данным, псевдомонады в составе сообщества могут как опосредованно стимулировать процесс деструкции аминобензойных кислот (синтез внеклеточных ПАВ, увеличивающих эффективность биодеструкции 5-АСК, Воробьев и др., 2007; Семёнова и др., 2011), так и выполнять функции защиты других членов микробного сообщества от стрессорных воздействий (Николаев, 2011).

У исследуемого штамма бактерий была определена значительная часть (1435 нуклеотидов) последовательности гена 16S рРНК, что соответствует позициям с 52 по 1492 по номенклатуре Е. coli. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм относится к филуму Gammaproteobacteria и близок к микроорганизмам рода Pseudomonas. Более точное филогенетическое положение исследуемого штамма среди ближайших представителей данного рода представлено на рис. 4.

Выделенный штамм был идентифицирован и систематизирован как P. aeruginosa Tsaydam-5-ASA.

Pseudomonas aeruginosa 1-15 (HQ434555) Pseudomonas aeruginosa BSF-g (GU121439) Pseudomonas aeruginosa zxy0926 (HQ537785) Tsavdam-5-ASA

96

Pseudomonas aeruginosa nsm (HQ658761)

97 Pseudomonas aeruginosa DQ8 (GU269267) 11 - Pseudomonas aeruginosa IRMD-2010

*■ Pseudomonas aeruginosa DSM 50071T

-Pseudomonas citroneiiolis DSM 50332T (Z76659)

■ — Pseudomonas anguiliiseptica NCIMB 1949T

— Pseudomonas alcaligenes IAM 12411T (D84006) -Pseudomonas oieovorans IAM 1508T (D84018)

— Pseudomonas flavescens B62T (U01916)

" Pseudomonas pseudoalcaiigenes LMG1225T (Z76666) Pseudomonas mendocina NCI8 10541T (D84016)

Рис.4. Филогенетическое положение штамма Tsaydam-5-ASA среди видов рода Pseudomonas.

Штамм ЕР-АВА

Из накопительной культуры ЕР/2-АБК был выделен штамм Bacillus subtilis ЕР-АВА. Клетки штамма представляли собой грамположительные подвижные палочки среднего размера. В условиях нитратредукции ранее была описана возможность деструкции фталата микроорганизмами, относящимися к роду Bacillus (Ahring, Taylor, 1981), однако изменений концентраций внесенных ароматических субстратов в условиях нашего эксперимента обнаружено не было. Выделенный штамм обладает бродильным типом метаболизма, и внесение в сообщество дополнительных количеств клеток приводило к увеличению количества образующихся летучих продуктов, в том числе ацетата, служащего субстратом метаногенеза.

По данным литературы для B.subtilis показана способность продуцировать защищающие клетки от стрессорных воздействий внеклеточные факторы - адаптогены, обладающие перекрестным действием (т.е. действием на клетки микроорганизмов других видов, Николаев, 2011). Одной из функций B.subtilis в выделенных нами ассоциациях может быть защита других микроорганизмов-членов сообщества от воздействия неблагоприятных факторов и поддержание его стабильного функционирования.

У исследуемого штамма была определена значительная часть (1495 нуклеотидов) последовательности гена 16S рРНК, что соответствует позициям с 15 по 1501 по номенклатуре Е. coli. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм относится к филуму Firmicutes и близок к бактериям рода Bacillus. Более точное филогенетическое положение исследуемого штамма среди ближайших представителей данного рода отражено на рис.5.

Bacillus subtills subsp. subtilis YJ001 (DQ444283) Bacillus subtilis subsp. subtilis h-g (EF581127) EP-ABA

Bacillus subtilis subsp. subtilis C7-3 (EU257445) Bacillus subtilis subsp. subtilis C9-1 (EU257446) Bacillus subtilis subsp. subtilis HDYM-34 (EF428253) Bacillus subtilis subsp. subtilis EDR4 (EF502020) Bacillus subtilis DSM 10T (AJ276351) Bacillus vallismortis DSM 11031T (AB021198) ■ Bacillus atrophaeus JCM9070T (AB021181) Bacillus amyloliquefaciens DSM 7T (X60605) — Bacillus licheniformis DSM 13т (X68416)

Рис. 5. Филогенетическое положение штамма ЕР-ABA среди видов рода Bacillus.

Штамм ЕР-АВА2

Штамм Moraxella osloensis ЕР-АВА2 был выделен из сообщества ЕР, расщепляющего 2-АБК. Клетки представляли собой мелкие грамотрицательные неподвижные палочки. Согласно литературным данным, представители этого рода способны к деструкции бензоата (Berry et al., 1987) и «-крезола (Bossert, Young, 1986) в условиях нитратредукции, а также п-нитрофенола (Spain, Gibson, 1991) и нафталинсульфокислот (Wittich et al., 1988) в аэробных условиях. В условиях нашего эксперимента изменений концентраций внесенных

0.05

I-1

100

100

ближайших 0.05

рис.6.

ароматических субстратов не наблюдали. Представители рода Moraxella способны осуществлять смешанное брожение (Asano et al., 1988). Внесение клеток штамма в сообщество приводило к увеличению количества образующихся кислот, в том числе ацетата, служащего субстратом метаногенеза.

У исследуемого штамма была определена значительная часть (1485 нуклеотидов) последовательности гена 16S рРНК, что соответствует позициям с 11 по 1505 по номенклатуре Е. coli. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм относится к филуму Gammaproteobacteria и близок к микроорганизмам рода Moraxella. Более точное филогенетическое положение исследуемого штамма среди представителей данного рода представлено н юо f Moraxella lacunata АТСС 17967т (D64049) Moraxella equi 327/72т (AF005184) Moraxella ovis АТСС 33078т Moraxella bovoculi 237T (DQ153089) Moraxella bovis АТСС 10900т Moraxella caprae АТСС 700019т Г— Moraxella caviae CCUG 355T (AF005187) Moraxella catarrhalis АТСС 25238T (AF005185) Moraxella canis LMG 11194T (AJ269511) Moraxella pluranlmallum 248-01T 99 L- Moraxella cuniculi CCUG 2154T (AF005188)

Moraxella boevrel АТСС 700022T (DQ156147)

H

100

юС I

"Ii

Г

i— л,

Ц-'

I ЛЛ

c;

100

f Moraxella osloensls 3 (Y15855) Moraxella osloensis PIV-10-1 (AJ505859) Moraxella osloensis S44-4 (HM217989) Moraxella osloensis Ben 58 (X95304) EP-ABA2

¡Moraxella osloensis LBS6 (EU400648) > Moraxella osloensis LMG 5131T (AJ247232) ' Moraxella osloensis AKAV10 (HQ130446)

Рис. 6. Филогенетическое положение штамма ЕР-АВА2 среди видов рода Moraxella.

Штаммы L-43.1 и L-34.

Штаммы Lactobacülus paracasei ssp. paracasei L-34 и h.rhamnosus L-43.1 были выделены из метаногенных сообществ Цайдам-5-ACK и ЕР-2-АБК, соответственно и идентифицированы по результатам API-тестов. Нами была проведена проверка способности выделенных штаммов лактобацилл к деструкции аминоароматических субстратов, а также восстановлению двух пищевых азокрасителей. Ни одна из культур не разлагала ароматические амины и азокрасители в качестве единственного источника углерода и энергии, однако обе осуществляли сбраживание линейных интермедиатов процесса до лактата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биодеградацию различных веществ, загрязняющих окружающую среду, изучают уже несколько десятилетий, однако имеющиеся литературные данные по деструкции аминоароматических соединений довольно немногочисленны и отрывочны.

Возможность разрушения ароматических веществ донными осадками природных водоёмов, не загрязненных соответствующими веществами, ранее была продемонстрирована различными авторами (Ye et al., 1992; Haggblom et al., 1993; Edwards, Grbic-Galic, 1994; Becker et al., 2001). Однако биодеградация именно аминоароматических веществ сообществами, выделенными из подобных мест обитания, впервые была продемонстрирована в нашей лаборатории. Начальная стадия потребления субстрата зачастую связана с действием небиологических факторов, заключающихся в адсорбции вещества на частицах ила (Wu et al., 1993; Fu, Viraragharan, 2001), причем вещества, отличающиеся по химическому строению, по-разному адсорбируются на поверхности клеток (Fu, Viraragharan, 2001), однако для аминоароматических соединений такие сведения отсутствовали. Нами было также показано, что в случае 2- и 4-АБК химическая природа субстрата не влияла на степень его адсорбции.

В данной работе впервые было показано влияние гидродинамических условий на процесс деградации аминоароматического субстрата и морфологические характеристики микробного сообщества, определены оптимальные начальные параметры культивирования для сообществ, разрушающих аминоароматический субстрат. Для ароматических интермедиатов (2-ГБС, CK, БС) была определена токсичность, сведения об их токсичности по отношению к метаногенным консорциумам в литературе отсутствуют. Были также определены интермедиаты деструкции аминоароматики и предложена схема разложения 2-АБК и 5-АСК выделенными консорциумами.

Результаты проверки возможности реализации альтернативных путей деградации (Heider, Fuchs, 1997) использованных в работе аминоароматических веществ свидетельствовали о реализации бензоил-КоА-пути деструкции в микробных консорциумах.

Несмотря на преобладание некультивируемых микроорганизмов в изучаемых консорциумах, нами были выделены в чистые культуры и идентифицированы до вида несколько микроорганизмов. Штамм P.aeruginosa Tsaydam-5-ASA хотя и не принимает непосредственного участия в процессе деструкции аминоароматических соединений, однако при определенных условиях может принимать участие в трансформации аминоароматики (Савельева, 2003), а также опосредованно стимулировать процесс деструкции аминобензойных кислот и выполнять функции защиты от стрессорных воздействий других членов микробного сообщества (Николаев, 2011). Остальные выделенные штаммы - две лактобациллы L.rhamnosus и L. paracasei subsp. paracasei, Bacillus subtilis, Moraxella osloensis, выделенные из сообществ ЕР-2-АБК и Цайдам-5-ACK, участвуют в процессе биоразрушения аминоароматических субстратов, входя в «бродильный» блок анаэробных микробных сообществ и осуществляя сбраживание линейных интермедиатов - продуктов деструкции аминобензойных кислот. Одной из функций, выполняемых всеми выделенными штаммами - факультативными анаэробами, является также поддержание условий анаэробиоза в метаногенном сообществе, что способствует стабилизации процесса метаногенной биодеградации субстратов.

Таким образом, представленные в работе данные позволяют лучше понять механизмы биоконверсии аминоароматических веществ до безвредных минеральных соединений, существенно расширяют знания о структурно-функциональной организации микробных сообществ, как из естественных мест обитания, так и из искусственно созданных человеком очистных сооружений.

ВЫВОДЫ

1. Выделены и изучены анаэробные микробные сообщества, стабильно и с высокой активностью расщепляющие изомеры аминобензойной кислоты и 5-аминосапициловую кислоту до СН4 и СО2.

2. Показано влияние на процесс биодеструкции ряда физико-химических факторов: адсорбции, перемешивания, температуры и pH культивирования, освещенности, природы и токсичности аминоароматического субстрата, присутствия легкоусваиваемых источников углерода и энергии.

3. Идентифицированы продукты первичной трансформации: для 2-АБК и салициловой кислоты - бензиловый спирт, для 5-АСК - 2-гидроксибензиловый спирт.

4. Определены основные интермедиа™ процесса и установлено их соответствие бензоил-КоА-пути деструкции аминоароматических соединений в выделенных метаногенных сообществах.

5. Из метаногенных сообществ различного происхождения выделено и идентифицировано до вида 5 чистых культур микроорганизмов, участвующих в процессе деструкции аминоароматики.

6. Установлено селективное воздействие аминоароматических субстратов на микробное сообщество, выражающееся в снижении биоразнообразия и последовательной смене доминирующих морфотипов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах

1.Лиш>кова Ю.В., Есакова A.A., Дьяконова А.Т., Намсараев Б.Б., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Проверка способности анаэробных микробных сообществ к разрушению аминоароматических ксенобиотиков // Экология и промышленность России. 2011. №1. С.29-33.

2. Лннькова Ю.В., Куликова И.А., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деградация азокрасителей и ароматических аминов метаногенными микробными сообществами из илов очистных сооружений // Вода: химия и экология. 2011. №7. С.51-58.

3. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Гладченко М.А., Калюжный C.B., Котова И.Б., Стамс А., Нетрусов А.И. Метаногенная деструкция (амино)ароматических веществ анаэробными микробными сообществами // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т.47. Х»5. С.558-565.

Тезисы конференций

1.Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Структура анаэробных микробных сообществ, потребляющих аминоароматические субстраты // "Биотехнология микробов". Тезисы докладов Всероссийского симпозиума. Москва, МГУ, 20-23 октября 2004 г. М: МАКС Пресс, 2004. С.54.

2. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Анаэробные сообщества микроорганизмов, разрушающие аминоароматические соединения // "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды". Материалы международной конференции. Саратов, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 14-16 сентября 2005 г. Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. С.32.

3. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деструкция некоторых ароматических соединений анаэробными микробными сообществами // 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология-наука 21 века". Тезисы докладов. Пущино, 10-14 ноября 2008 г. С. 268-269.

4. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т. Деструкция ароматических веществ метаногенными микробными сообществами // Международная конференция "Ломоносов-2009". Тезисы докладов. Москва, МГУ, 13-18 апреля 2009 г.М.: МАКС Пресс, 2009. С.161.

5. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Метаногенные микробные сообщества, разрушающие ароматические соединения // "Экологические проблемы промышленных городов". Материалы 4-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Саратов, СГТУ, 7-8 апреля 2009 г. С. 38-39.

6. Куликова И.А., Дьяконова А.Т., Линькова Ю.В., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Разрушение двух пищевых азокрасителей анаэробными микробными сообществами различного происхождения // "Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов". Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, 24-27 декабря 2009 г. М.: МАКС Пресс, 2009. С.99.

7. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деструкция аминоароматических кислот анаэробными микробными сообществами // "Экосистемы. Организмы. Инновации-11". Труды научной конференции. Москва, МГУ им.М.В.Ломоносова, биологический факультет, 24 июня 2009 г. М.: МАКС Пресс, 2010. С.58.

8. Линькова Ю.В., Котова И.Б., Куликова И.А., Дьяконова А.Т., Нетрусов А.И. Особенности физиологии анаэробных микробных сообществ, использующих аминоароматические вещества // "Актуальные аспекты современной микробиологии". Материалы VI молодежной школы-конференции с международным участием. Москва, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, 25-27 октября 2010 г. М.: МАКС Пресс, 2010. С.41.

9. Линькова Ю.В., Куликова И.А., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Биодеструкция трех азокрасителей анаэробными микробными сообществами // "Автотрофные микроорганизмы (к 85-летию со дня рождения академика РАН Е.Н.Кондратьевой)". Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, 23-26 декабря 2010. М.: МАКС Пресс, 2010. С. 60.

Подписано в печать:

29.08.2011

Заказ № 5820 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat, ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Линькова, Юлия Валерьевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет Кафедра микробиологии

04.2.01 1 63 61 5 "

Линькова Юлия Валерьевна

ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ АНАЭРОБНЫМИ

МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ

03.02.03 — микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

НЕТРУСОВ А.И. кандидат биологических наук, доцент

КОТОВА И.Б.

Москва, 2011

СОДЕРЖАНИЕ

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6

2. ВВЕДЕНИЕ 7

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 3.1. Метаболизм ароматических соединений 9

3.1.1. Аэробная деградация 9

3.1.2. Анаэробная деградация 10

3.1.3. Альтернативный (гибридный) путь деградации 12

3.2 Микроорганизмы, анаэробно расщепляющие аминоароматические 13 субстраты

3.2.1. Чистые культуры 13

3.2.2. Микробные сообщества 17

3.2.2.1. Синтрофные взаимодействия 17

3.2.2.2. Сложность и устойчивость микробных сообществ 21

3.2.2.3. Консорциумы микроорганизмов, разрушающие 22 ароматические вещества, и их трофическая структура

3.3. Влияние различных факторов на структуру сообщества 25

3.3.1. Природа субстрата и состав среды 25

3.3.2. Температура 27

3.3.3. Изменение состава сообщества во времени 28

3.4 Пространственная структура анаэробных сообществ, разлагающих 31 вещества-загрязнители

3.4.1. Образование анаэробных агрегатов и их влияние на процессы 31 деградации

3.4.2. Каналы как важная структура микробных агрегатов 34 3.5. Современные методы анализа состава микробных сообществ 35 3.6 Заключение 41

4. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ 42

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 43 5.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43

5.1.1. Источники биологического материала 43

5.1.2. Использованные реактивы 43

5.1.3. Условия культивирования 43

5.1.4. Выделение чистых культур из анаэробных сообществ 46

5.1.5. Молекулярно-биологические методы 48

5.1.5.1. Выделение ДНК 48

5.1.5.2. ПЦР-амплификация 48

5.1.5.3. Разделение ПЦР-продуктов методом ДГГЭ 49

5.1.5.4. Секвенирование ДНК-фрагментов 50

5.1.6. Аналитические методы 51

5.1.6.1. Определение концентраций субстратов и продуктов их 51 деградации

5.1.6.2. Определение токсичности ароматических субстратов в 53 анаэробных условиях

5.1.6.3. Определение содержания белка 53

5.1.6.4. Определение аммоний-ионов 54

5.1.6.5. Определение содержания лактата 54

5.1.6.6. АР1-тесты 54

5.1.7. Микроскопические методы 55

5.1.7.1. Световая микроскопия 55

5.1.7.2. Электронная сканирующая микроскопия 55 5.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 56

5.2.1. Получение накопительных культур, использующих в своём 56 метаболизме аминоароматические вещества

5.2.1.1. Схемы получения накопительных культур 5 6

5.2.1.2. Накопительные культуры, выделенные из илов 60 очистных сооружений

Накопительная культура 04 60

Накопительная культура Р2 61

Накопительная культура ЕР 63

5.2.1.3. Накопительные культуры, выделенные из естественных 64 мест обитания

Накопительные культуры из донных отложений 64 реки Джамна (Индия)

Накопительные культуры, полученные из донных 66 отложений озера Цайдам (Бурятия) 5.2.2. Свойства выделенных активных и стабильных накопительных 69

культур

5.2.2.1. Культуральные признаки, морфология агрегатов и 69

микроскопическая картина активных накопительных культур в сравнении с неактивными 5.2.2.2. Определение роли небиологических факторов (физико- 71 химических параметров) в процессе деградации ксенобиотиков. Токсичность использованных аминоароматических субстратов

Адсорбция 71

Гидродинамические условия (перемешивание) 73 Температура, освещенность, рН, 76

аминоароматический субстрат

Токсичность использованных 85

аминоароматических субстратов

5.2.3. Общая характеристика процесса биодеструкции 88 аминоароматических субстратов

5.2.4. Стимуляция процесса деградации при добавлении 90 дополнительных источников углерода и энергии

5.2.5. Интермедиаты процесса биодеструкции аминоароматических 92 кислот и возможности использования сообществами других ароматических субстратов

5.2.5.1. Идентификация интермедиатов процесса- и 92 трансформация других ароматических веществ

5.2.5.2. Токсичность интермедиатов процесса биодеградации 98 аминобензойных кислот

5.2.5.3. Влияние пирувата на процесс деструкции 100 интермедиатов анаэробной биоконверсии аминобензойных кислот

5.2.5.4. Определение биохимического пути деструкции 106 аминоароматики

5.2.6. Пространственная организация и компонентный состав активных 109 сообществ

5.2.6.1. Морфотипы клеток, изменение микроскопической 109 картины на разных стадиях процесса, смена доминирующих видов

5.2.6.2. Агрегирование микробного сообщества 113

5.2.6.3. Функциональные группы микроорганизмов в 117 выделенных накопительных культурах

5.2.6.4. Бесспоровые микроорганизмы-члены сообщества и их 120 возможные функции в процессе

5.2.6.5. Гетеротрофные микроорганизмы в сообществе 125

5.2.6.6. Филогенетический анализ состава сообществ 127

5.2.7. Выделение чистых культур микроорганизмов, входящих в 129 микробные сообщества, разрушающие аминоароматику

5.2.7.1. Особенности выделения чистых культур с учётом их 129 функционирования в составе синтрофных анаэробных микробных сообществ

5.2.7.2. Систематическое положение и свойства выделенных 131 чистых культур

Штамм Tsaydam-5 - AS А 131

Штамм ЕР-ABA 133

Штамм ЕР-АВА2 135

Штамм L-34 137

Штамм L-43.1 140

5.2.7.3. Определение роли выделенных культур в едином 141 процессе деструкции аминоароматики

Определение роли выделенных лактобацилл в 141 процессе биоразложения ароматических аминов и пищевых азокрасителей

Определение роли штамма ЕР-ABA в процессе 146 биоразложения ароматических аминов

Определение роли штамма ЕР-АВА2 в процессе 148 биоразложения ароматических аминов

Определение роли штамма Tsaydam-5-ASA в 149 процессе биоразложения ароматических аминов

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ . 152

7. ВЫВОДЫ 155

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 156

1.СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБК — аминобензойная кислота

А06 - кислотный краситель Acid Orange 6 АСК - аминосалициловая кислота БК - бензойная кислота БС - бензиловый спирт

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография 2-ГБС - 2-гидроксибензиловый спирт ДГГЭ — денатурирующий градиентный гель-электрофорез CK — салициловая кислота

EGSB - Expanded Granular Sludge Bed - анаэробный реактор с расширенным слоем гранулярного ила

UASB - Upflow Anaerobic Sludge Blanket - реактор с восходящим потоком жидкости сквозь слой анаэробного ила

2.ВВЕДЕНИЕ

С развитием химической промышленности в биосферу стало поступать более тысячи различных ксенобиотиков, которые в значительной степени её загрязняют. Известно, что соединения, вносимые человеком в окружающую среду в последнее время (инсектициды, гербициды, детергенты и другие ксенобиотики), помимо того, что очень токсичны, ещё и весьма устойчивы, что представляет опасность для человека и животных (Carmona et al., 2009). В 'настоящее время нагрузка на естественные процессы самоочищения биосферы является избыточной, поэтому параллельно с незначительной деструкцией загрязнений идёт их постепенное накопление в окружающей среде. Деградация ксенобиотиков микроорганизмами является одним из важных направлений защиты биосферы.

Многие ксенобиотики по своей химической природе являются ароматическими веществами. Так, например, некоторые пестициды представляют собой феноксиалкановые кислоты (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота—-2,4-D), встречаются и хлорорганические соединения (пентахлорфенол, дихлордифенилтрихлорэтан — DDT), _ карбаматы (пестициды на основе анилина), триазины (Скрябин, Головлёва, 1974). Ежегодно в крупных масштабах мировой химической промышленностью производятся и алкилбензолсульфонаты, которые служат основой для производства широкого спектра моющих средств (Щербакова, 2000). Помимо этого, ароматические соединения используются в производстве фармацевтических препаратов, лакокрасочных материалов, красителей, взрывчатых веществ (Березин, Березин, 2001; Razo-Flores et al., 2007а). Ароматические соединения являются одними из наиболее токсичных и устойчивых загрязняющих веществ (Carmona et al., 2009). Термодинамическая стабильность бензольного кольца обусловливает устойчивость к химическому разложению соединений ароматического ряда в окружающей среде и, следовательно, их большую опасность для биосферы (Хоменков и др., 2008; McLeod, Eltis, 2008). Значительная роль в деградации этих соединений принадлежит микроорганизмам (Остроумов, 1986; Щербакова, 2000; Diaz, 2004). Благодаря огромному генетическому разнообразию, метаболической пластичности, высокой скорости размножения наряду со способностью к горизонтальному переносу генов микроорганизмы способны вовлекать в свой метаболизм вещества неприродного происхождения, развиваться и адаптироваться к быстро изменяющимся условиям внешней среды даже в экстремальных условиях, в которых не способны выжить другие живые организмы (Хоменков и др., 2008).

В настоящее время результаты исследований по биодеградации загрязнений учитываются при разработке различных очистных сооружений. Биологические методы очистки сточных вод имеют ряд преимуществ: относительно небольшие эксплуатационные расходы; надёжность очистки, обусловленная практически полным разрушением растворённых в воде органических веществ; получение безвредных для окружающей среды отходов (Гвоздяк и др., 1985). Анаэробная очистка в ряде случаев предпочтительнее аэробной с экономической точки зрения: 1) не требует принудительного подвода кислорода и дополнительных питательных веществ-источников азота и фосфора; 2) даёт значительно меньшее накопление биомассы микроорганизмов и ведёт к образованию полезного продукта — биогаза; 3) характеризуется высокой скоростью отмирания патогенной микробиоты; 4) образующийся и быстро уплотняющийся осадок может быть использован в сельском хозяйстве как органическое удобрение; 5) процесс возможно проводить в концентрированных стоках (Заварзин, 1985; Trosch, Chmiel, 1985; Ditchfield, 1986). Кроме того, аэробная минерализация ароматических соединений имеет и ряд других ограничений: 1) ароматические соединения способны реагировать с молекулярным кислородом, что может вызвать последующую полимеризацию веществ (особенно для фенолов и др.); 2) ароматические соединения понижают поверхностное натяжение водных растворов и, следовательно, могут являться причиной неконтролируемого пенообразования в аэрируемых резервуарах; 3) разложение некоторых ароматических соединений в аэробных условиях происходит менее эффективно, чем в анаэробных (например, нитро- и азопроизводных); 4) некоторые ароматические соединения летучи и токсичны, а значит, могут вызывать проблемы с загрязнением воздуха (Савельева и др., 2003).

Для очистки почв, атмосферы, сточных вод используются биореакторы различных технологических типов: аэробный, анаэробный и гибридный, включающий анаэробную и аэробную стадии (Deriell et al., 1999). Как правило, в реакторах используются естественно сложившиеся консорциумы микроорганизмов. В консорциумах микроорганизмов наблюдается комбинация катаболических возможностей, благодаря чему происходит полное разрушение вещества, недоступное чистым культурам микроорганизмов из-за термодинамических ограничений. В состав консорциумов, участвующих в анаэробной очистке сточных вод с высоким содержанием вредных органических веществ, входят гидролитические, ацидогенные и метаногенные микроорганизмы (Satoh et al., 2007):

Деградацию веществ, загрязняющих окружающую среду, изучают уже несколько десятилетий, в результате чего очень подробно исследованы биохимические и молекулярно-биологические аспекты метаболизма (Head, 1998; Harwood et al., 1999;

8

Schink et al., 2000; Boll, 2005; Heider, 2007; Fuchs, 2008; Хоменков и др., 2008; Carmona et al., 2009). Несмотря на то, что сложившиеся естественным путём сообщества микроорганизмов активно используют при очистке промышленных сточных вод, при их изучении практически не уделяют внимания структуре (т.е. пространственной организации, трофическим связям, видовому составу) этих сообществ. Литературные данные, касающиеся этого аспекта проблемы, очень разрозненные и отрывочные. На данный момент времени мало известно о структуре микробных консорциумов, разрушающих токсичные органические вещества, в частности, ароматические соединения: не выявлены таксономическое положение и функции отдельных компонентов, их связи между собой и пространственное расположение микроорганизмов-партнеров.

Приведенный ниже обзор обобщает и анализирует немногочисленные литературные данные относительно различных аспектов структуры сообществ микроорганизмов, разлагающих ароматические вещества.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Метаболизм ароматических соединений

Разложение ароматических субстратов может происходить несколькими различными путями. 3.1.1. Аэробная деградация

Деароматизация в аэробных условиях является хорошо изученным и давно описанным процессом (Dagley, 1971; Dagley, 1986; Harayama et al., 1992; Harwood, Parales, 1996), который протекает при участии ферментов—моно- и диоксигеназ, катализирующих включение кислорода в молекулу субстрата (рис.1).

Монооксигеназы

О,

+2[hj

+ Н20

Жг«0

Диоксигеназь, Q —► ^—► —► ^CD0H

j4G«0

Рис.1. Реакции с участием моно- и диоксигеназ в аэробном метаболизме ароматических веществ (модифицировано по Fuchs, 2008).

Бензольное кольцо образовавшихся центральных интермедиатов содержит либо две гидроксильные группы, расположенные рядом, либо гидроксильную группу рядом с карбоксильной, как, например, в катехоле (1,2-дигидроксибензоле), протокатехоате (3,4-дигидроксибензоате) и гентизате, или 2,5-дигидроксибензоате (Fuchs, 2008). Затем эти гидроксилированные субстраты подвергается либо орто- (между двумя гидроксильными группами), либо мета- (рядом с одной из гидроксильных групп) расщеплению, приводящему к раскрытию бензольного кольца (рис.2).

СОО"

С^Хон

Катехол

орто^/ \мета

С соо' соо"

о н

¿ СОО"

¡LA„

Протокатехоат орто / \ Мета

7 X

н

оос

СОО' СОО"

оос

V-

Y соо

СОО'

ОН

НО

о СОО"

X

€ соо

KJ

Рис.2. Пути расщепления бензольного кольца при аэробной деструкции (модифицировано по Cao et al., 2009).

Продуктами служат СОг, пируват и ацетат, которые далее метаболизируются до СО2 и Н2О (Хоменков и др., 2008).

3.1.2. Анаэробная деградация

В анаэробных условиях происходят более сложные процессы, протекающие в несколько этапов: активирование бензольного кольца, его разрыв, образование Ci- и С2-соединений. В литературе описаны три различных пути конверсии ароматических соединений в анаэробных условиях, отличающиеся основными ароматическими интермедиатами. Этими интермедиатами являются бензоат, резорцин и флороглюцин (рис. 3, 4).

т

БенхнлоЕын опфт

сося

т»

Фенол у 6и

ССОИ

ö

П*Р«°Л Аннлнк

1

\ Б ею альдегид

* " / 4-атннобеюоат соон

Фшдрохснбекюат

»

50-saA

»

CO-SCei

Щ

\

он

Бензоат 1

C0-SC4A

Беюокл-КоА

Л

Толуол

i^cacH

О

Беммлсукцнмат

Рис.3. Периферические пути анаэробной деградации ароматических соединений, ведущие к образованию центрального интермедиата - бензоил-КоА (модифицировано по Heider, Fuchs, 1997).

он

Гздлок^я кислоте

Он

■ф"

т

сода

ОН Гамма-реюраднноваяккслота.

О

I Пирогаллол Гцфиашцфояшок

\ i 1

Eeia-peivpimiDiH кксло-ra

Рис.4. Периферические пути анаэробной конверсии некоторых ароматических веществ, ведущие к образованию резорцина и флороглюцинола (модифицировано по Heider, Fuchs, 1997).

В настоящее время наиболее распространенным в мире микробов считают бензоил-КоА-путь разложения ароматических соединений, центральным интермедиатом которого является бензоил-КоА (рис.3, 5), а конечным продуктом—ацетил-КоА (Heider, Fuchs, 1997; Fuchs, 2008; Carmona et al., 2009).

Раскрытию бензольного кольца может предшествовать отщепление различных заместителей, таких как метоксил (Bache, Pfennig, 1981; Krumbolz, Bryant, 1985), гидроксил (Szewzyk et al., 1985; Young, Rivera, 1985), метил (Bossert, Young, 1986), карбоксил (Scheline, 1966; Tschech, Schink, 1986) или атом галогена (Sulfita et al., 1982).

Рис.5. Бензош-КоА-путъ анаэробной деградации ароматических веществ (модифицировано по Fuchs, 2008).

3.1.3. Альтернативный (гибридный) путь деградации

У факультативных аэробов был также описан альтернативный, т.н. гибридный путь конверсии ароматических субстратов (Fuchs, 2008), совмещающий в себе признаки обоих путей (рис. 6). Гидроксильные группы вводятся в кольцо при участии молекулярного кислорода, как в случае классического аэробного пути, в то же время происходит и восстановление бензольного кольца, и интермедиаты существуют в форме КоА-эфиров, как в случае анаэробного бензоил-КоА пути. Расщепление кольца также не требует участия кислорода.

Реакции Ферменты Гены

5

At*

-(»A JW

V *

icac Ô

М11ГИ-

tr ШН1 \ /*.

O,

г crac«*;

¿a

COSCtA tc&tm

ó-óC

(.СКОЛ

ne^Jt № V/

h

COOH

рп

(W

Сукщшил- Ко A

»r»

ntcw

Y

^xoo- Ацетил-Ko A

Рис.6.Гибридный аэробный путь метаболизма бензоата, реализуемый некоторыми денитрифицирующими бактериями (модифицировано по Fuchs, 2008).

Денитрифицирующие микроорганизмы, а также, возможно, и другие (Fuchs, 2008) сначала преобразуют фенилацетат (Luengo et al., 2001; Mohamed et al., 2002), бензоат (Zaar et al., 2001) или 2-аминобензоат (Langkau et al., 1990; Schuhlc et al., 2001) в соответствующие КоА-эфиры. Бензоил-КоА и фенилацетил-КоА затем трансформируются при участии диоксигеназ (оксидо