Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Миксотрофия у фототрофных и хемотрофных бактерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Миксотрофия у фототрофных и хемотрофных бактерий"
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА
Биологический факультет
На правах рукописи УДК 579.22.577.121
ЗАХАРЧУК Леонид Михайлович
МИКСОТРОФИЯ У ФОТОТРОФНЫХ И ХЕМОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ
Специальность 03.00.07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических иаук
Москва - 2006
Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им, М.В.Ломоносова и в лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н.Виноградского Российской Академии наук.
Научаые консультанты:
доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр Иванович
(специальность 03.00.23 - биотехнология)
чл.корр. РАН, профессор | Каравайко Григорий Иванович]
(специальность 03.00.07 - микробиология)
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук доктор биологических паук, профессор доктор биологических наук, профессор
Ножевникова Алла Николаевна Цыганков Юрий Дмитриевич Садчиков Анатолий Павлович
Ведущая организация:
Кафедра биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И.Менделсева.
Защита диссертации состоится .^/¿декабря 2006 г. в 1530 часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, корп. 12, биологический факультет, аудитория М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан " 9 " ноября 2006 г.
Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: г. Москва, 119992, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, д.1, корп. 12, биологический факультет, кафедра микробиологии, Ученому секретарю совета Д.501.001.21 Н.Ф.Пискунковой, Факс: (495) 939-27-63; e-mail: zakharchuk (aimail.ru
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
Н.Ф.Пискункова
1LVV&6
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы.
В природе рост микроорганизма происходит тогда, когда окружающая среда соответствует его физиологическим особенностям. Это обеспечивает данному виду скорость роста, достаточную для успешной конкуренции с другими организмами. Однако равновесие, которое устанавливается между организмами и средой, постоянно нарушается вследствие климатических, сезонных, суточных и других изменений, влияющих на ее физико-химические характеристики: освещенность, температуру, значение pH, наличие и концентрацию биогенных субстратов. Для сохранения возможности существования при изменении условий, мшфоорганизм должен либо изменить среду, либо сам адаптироваться к ее изменениям. Адаптация организма к изменяющимся условиям — сложный процесс, протекающий как на генотипическом, так и на фенотипическом уровнях. Результат такого приспособления на фенотипическом уровне чаще всего выражается в изменении тех или иных процессов метаболизма или типов питания микроорганизма.
Число видов прокариот, относящихся к группам, характеризующимся разным способом питания, не одинаково. Подавляющее число хемотрофных прокариот относится к группе с хемоорганогстеротрофным типом питания. Такая же неравномерность в распределении по типам питания присуща и фотосинтезирующим прокариотам. Большинство цианобактерий, пурпурных и зеленых серобактерий относится к группе с фотолитоавтотрофным типом обмена. Другие типы питания у бактерий представляют собой как бы "пробы" эволюции и сохранились у сравнительно небольшого числа видов, часто обитающих в весьма специфических условиях.
Многие бактерии бтличает постоянство потребностей в типе питания и соответственно процессов метаболизма. Так некоторые бактерии родов Thiobacillus и Acidithiobacillus являются облигатными или строгими хемолитоавтотрофами, источником энергии для которых служат процессы окисления восстановленных соединений серы или железа, а источником углерода для построения клеточного вещества - углерод С02. Причины облигатной автотрофии ученые пытаются объяснить уже много лег, но пока не найден однозначный ответ на этот вопрос (Zhang et al, 1998; Wood et al., 2004).
С другой стороны, давно известно, что в отношении условий обитания прокариоты более разнообразны, чем эукариоты. Это обусловлено значительной лабильностью их метаболизма, которая позволяет микроорганизмам использовать в целом гораздо больше химических веществ, прежде всего соединений углерода и серы, чем макроорганизмам. При этом для многих микроорганизмов, отличающихся широкими метаболическими возможностями, эта лабильность выражается не только в их способности использовать большое число разных соединений, но в некоторых случаях даже переключаться с одного типа питания на другой. Так ряд цианобактерий и фотосинтезирующих бактерий являются факультативными фототрофами, поскольку могут расти не только в присутствии света, но и в темноте в хемотрофных условиях. А некоторые бактерии способны в одних условиях к хемолигоавтотрофии, а в других - к хемоорганогетеротрофии. Их принято называть факультативными хемолитоавтотрофами. Факультативные хемолитоавтотрофы при появлении в среде доступных органических субстратов обычно переключаются на их использование, прекращая автотрофную фиксацию С02 (Schlegel, 1992; Кондратьева, 1996; Tian et al., 2003).
Однако в литературе все чаще встречаются также термины "миксотрофы",
"миксотрофия", "миксотрофный рост", питание "смешанно: называют микроорганизмы, способные к разным типам
на миксотроФами ВДЩШшЙдовйй так
иБлиота '
"•Петербург
факультативные автотрофы. Но в последнее время под миксотрофией понимают такой тип питания, при котором организмом одновременно используются различные метаболические пути, например, источником энергии (или электронов у фототрофов) служат сульфид и органическое соединение и/или источником углерода - СОг и то же органическое вещество (Кондратьева, 1996; Hagen, Nelson, 1996; Fuchs, 1999; Kelly, Wood, 2000; Wood et al., 2004).
Некоторые бактерии не только способны переключаться с одного типа метаболизма на другой, например, растут в автотрофных и гетеротрофных условиях, подобно факультативным автотрофам, но могут и, более того, предпочитают расти именно в миксотрофных условиях. К таким бактериям относятся некоторые фототрофные бактерии и хемотрофные бактерии рода Sulfobacillus, являющиеся объектами наших исследований (Головачева, Каравайко, 1978; Karavaiko et al., 1988, 2005; Кондратьева, 1989; Norris et al., 1996). Эти на первый взгляд непохожие группы бактерий, относящиеся к двум основным типам энергетического питания, объединяет способность существовать в постоянно меняющихся, часто экстремальных физико-химических условиях среды, и переключаться с одного типа метаболизма на другой вследствие их чрезвычайной метаболической гибкости.
Изучение миксотрофии у фототрофных и хемотрофных бактерий является весьма актуальным, поскольку может позволить установить:
- роль миксотрофного типа питания для выживания микроорганизмов в постоянно изменяющихся условиях окружающей среды;
- общие закономерности и различия процессов углеродного метаболизма у фототрофных и хемотрофных бактерий, растущих в разных условиях;
- особенности углеродного, серного и энергетического метаболизма, позволяющие таким микроорганизмам оптимально развиваться именно в миксотрофных условиях;
- причины плохого роста некоторых миксотрофных бактерий в автотрофных и гетеротрофных условиях;
- возможные регуляторы процессов переключения бактерий с одного типа питания на другой.
Кроме того, актуальность изучения особенностей метаболизма фототрофных и хемотрофных бактерий в разных условиях роста определяется необходимостью понимания роли каждой из групп этих микроорганизмов в круговороте углерода, серы, железа в природных и промышленных экосистемах, уточнения их места в общей системе организмов, познания закономерностей и путей эволюции прокариот. Очень важен и прикладной аспект тагах исследований, поскольку их результаты могут быть использованы для решения задач регуляции биохимической активности фототрофных и хемотрофных бактерий в целях более эффективного их применения в биотехнологии.
Цели и задачи исследования.
Различия микроорганизмов по типам питания связаны главным образом с начальными стадиями метаболизма углерода, серы, азота. Круговорот углерода и серы в природных, а в последние годы и в промышленных системах, являются одними из важнейших геохимических циклов. В этих природных циклах значительную роль играют фототрофные и хемотрофные бактерии.
Способность прокариот к хемолитотрофии, автотрофии или миксотрофии связана с биосинтезом сравнительно небольшого числа особых ферментов. Поэтому представляло интерес изучение как ферментных систем, отвечающих за рост в автотрофных условиях, так и путей использования органического вещества у исследуемых представителей хемотрофных и фототрбфных бактерий в разных условиях роста.
Основной целью работы было сравнительное изучение начальных этапов метаболизма углерода и серы у прокариот, обладающих способностью использовать разные источники энергетического питания - фототрофных и хемолитотрофных бактерий в разных условиях культивирования для определения общих биохимических механизмов лабильности их метаболизма и оптимального развития в ыикеотрофных условиях.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить особенности роста фототрофных и ацидофильных хемолитотрофных бактерий, обладающих свойством миксотрофии, в различных условиях культивирования.
2. Определить способность этих бактерий к ассимиляции углекислоты в различных условиях.
3. Провести определение в бесклеточных экстрактах миксотрофных бактерий активностей ферментов, участвующих в метаболизме углерода - ферментов метаболизма углеводов, цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта, карбоксилаз.
4. Выявить закономерности изменения активностей ферментов углеродного метаболизма в зависимости от условий культивирования бактерий.
5. Выяснить особенности метаболизма соединений серы у штаммов хемолитотрофных бактерий в сравнении с фототрофными бактериями.
6. Определить содержание АТФ в клетках и интенсивность дыхания культур хемолитотрофных бактерий, выросших в различных условиях.
7. На основании полученных данных и схем метаболизма углерода и серы найти общие ■ свойства и особенности физиологии фототрофных и хемолитотрофных бактерий,
позволяющие им оптимально развиваться в миксотрофных условиях с возможностью переключения на автотрофный и гетеротрофный типы питания.
8. Оценить потенциал изученных видов фототрофных и ацидофильных хемолитотрофных бактерий, обладающих свойством миксотрофии, для биотехнологии.
Научная новизна и значимость работы. ■ Впервые проведено комплексное сравнительное изучение характеристик роста и активностей карбоксилаз, ферментов метаболизма углеводов, цикла трикарбоновых кислот, глиоксилатного шунта у ряда фототрофных и ацидофильных хемолитотрофных бактерий, предпочитающих миксотрофные условия роста.
Показано, что при росте в миксотрофных условиях метаболизм углерода изученных фототрофных и хсмотрофных бактерий рода Бгй/оЬасШиа обеспечивается действием путей катаболизма гексоз, цикла Кальвина, реакциями карбоксилирования ФБП, пирувата, органических кислот, функционированием неполного ЦТК, а у некоторых и глиоксилатного шунта. Благодаря этим механизмам исследованные бактерии обладают чрезвычайной метаболической гибкостью. Хемотрофиые бактерии способны переключаться с миксотрофного на автотрофный или гетеротрофный типы питания, а некоторые из изученных фототрофных бактерий могут существовать кроме фотоавтотрофных и фотомиксотрофных также в хемоорганогетеротрофных условиях в темноте и на свету в присутствии Ог. Это позволяет миксотрофным бактериям сохранять жизнеспособность в постоянно меняющихся, часто экстремальных условиях среды.
Впервые установлено, что нестабильность автотрофного роста хемотрофных бактерий рода 5и1/оЬасШиз прежде всего связана с недостаточным обеспечением клеток энергией, получаемой в процессе окисления неорганических доноров электронов, из-за неэффективного функционирования их дыхательной элеиронтранспортной системы.
Впервые показано, что- в клетках Би^оЬасИЫ ШегтозифйоогЛёапх 1269т, 5. 1}1егтоБиЩйоох1йапз зиЬэр. азрого^епез шг. 41 и БЫ/оЬасШт яШпсия шт. N1 цикл
грикарбоновых кислот (ЦТК) не замкнут, как и у строго автотрофных организмов, в то время как у Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans шт. Kl (теперь Alicyclobacillus tolerans К1т) функционирует полный ЦТК.
Впервые установлено, что метаболизм углеводов у бактерий Sulfobacillus thermosulfidooxidans I269T, S. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes hit. 41 и Alicyclobacillus tolerans К1т осуществляется при участии гликолитического, окислительного пентозофосфатного путей и пути Энтнера-Дудорова, однако особую роль в миксотрофном и гетеротрофном метаболизмах сульфобацилл, особенно при обогащении среды С02 и в экстремальных условиях, играет пентозофосфатный путь расщепления гсксоз, Пентозофосфатный путь частично компенсирует незамкнутость ЦТК и отсутствие глиоксилатного шунта, обеспечивая восстановителями процессы метаболизма, цикл Кальвина, электронтранспортную систему (ЭТС).
Установлено, что потребление органических соединений при миксотрофном типе питания у сульфобацилл облигатно зависит от окисления неорганических источников энергии, Показано, что невозможность стабильного гетеротрофного роста изученных хемотрофных бактерий объясняется незамкнутостыо ЦТК, отсутствием глиоксилатного шунта, низким уровнем активности ферментов ЦТК и энергозависимым от процесса окисления неорганических соединений процессом транспорта в клетку органических веществ.
Впервые у S. thermosulfidooxidans 1269т, S. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes 41 определены активности ферментов, участвующих в метаболизме соединений серы, и доказано сходство процесса с таковым у облигатно хемолитоавтотрофных сероокислителей. Изученные хемотофные бактерии, в отличие от фототрофных, в процессе окисления восстановленных соединений серы запасают энергию не только при помощи ЭТС, но и в процессе субстратного фосфорилирования.
На основании установленных физиолого-биохимических отличий, а также ранее выявленных морфологических и филогенетических свойств S.thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans Kl, изменен таксономический статус этой бактерии и она описана как Alicyclobacillus tolerans, sp.nov. Проведенные исследования позволяют считать данный организм промежуточным звеном между сульфобациллами с миксотрофным типом питания и типичными гетеротрофами рода Alicyclobacillus.
Полученные результаты позволяют глубже понять вопрос о возможных условиях роста и деятельности фототрофных и хемотрофных бактерий в природе, их фенотипическис и филогенетические связи, а также могут быть использованы для регуляции биохимической активности этих бактерий при их практическом применении в процессах биовыщелачивания минералов и очистки окружающей среды.
Практическая значимость работы.
Бактерии рода Sulfobacillus входят в состав сообщества хемолитотрофных ацидофилов, которое участвует в процессах окисления сульфидных минералов и в цикле окисления-восстановления железа в естественных и искусственных технологических местообитаниях. В экстремальных условиях - при высоких концентрациях в среде тяжелых металлов, значениях рН до 0,9-1,0, повышенном содержании СОг и недостатке 01 в среде, температурах до 60°С деятельность этих бактерий в бактериальных сообществах выступает на первый план. Так при концентрации в среде Zn2+ до 0,5 M и значениях рН 0,9-1,0 S. thermosulfidooxidans 1269Т, S. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes 41 сохраняют не только жизнеспособность, но продолжают окислять минеральные субстраты. S.thermosulfidooxidans svbsp.asporogenes штамм 41 способен расти при концентрации Zn2+ до 0,8 М, значении рН=1,2, содержании СОг в среде 5 об.%,
температуре 50°С. При этом бактерия обладает более высокой окислительной активностью в отношении серы, Fe2+, сульфидных мипералов, чем другие ацидофильные бактерии. В периодических условиях ппамм 41 способен окислять за 10 часов до 10 г/литр Fe2+. У сульфобацилл в экстремальных условиях сохраняется активность ключевых ферментов углеродного метаболизма и высокие активности серадиоксигеназы, тиосульфатдегидрогеназы, сульфит:цитохром-с-оксидореду?лазы. Знание особенностей углеродного и серного метаболизма сульфобацилл в разных условиях роста уже используется при моделировании высокоэффективных сообществ миксотрофных сульфобацилл и автотрофных организмов, применяемых для окисления сульфидных минералов в экстремальных условиях - при высоких температурах и концентрациях ионов Zn2+, As3+, Sb3+, Fe3+.
Определена область оптимальных концентраций Na2S для роста пурпурной бактерии Ectothiorhodospira shaposhnikovii в миксотрофных условиях на свету в присутствии ацетата. Изучен процесс окисления Na2S этой бактерией в миксотрофных условиях в присутствии различных органических соединений. Показано, что иммобилизованные в каррагинане, алюмоборосиликатном волокне, агаре клетки Е. shaposhnikovii окисляют сероводород в 2-5 раз быстрее свободных клеток. Полученные результаты могут быть применены при разработке методов использования Е. shaposhnikovii для очистки сточных вод, содержащих органические соединения и сероводород.
Личный вклад соискателя.
Соискателю принадлежит решающая роль в выборе направлений исследований, в формулировании проблемы, постановке целей и задач, разработке экспериментальных подходов и обобщении результатов. Соискатель принимал личное участие во всех этапах исследований. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель принимал участие в выполнении экспериментальной работы, в обобщении и интерпретации полученных результатов, в подготовке научных публикаций, выступал с научными докладами. ,
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на: Научной конференции "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов" (Москва, 1999), Международной научной конференции "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 2000), Международном конгрессе по биотехнологии "BIOTECHNOLOGY-2000" (Берлин, 2000), Общероссийской конференции "Оценка современного состояния микробиологических исследований в восточно-сибирском регионе" (Иркутск, 2002), 1st FEMS Congress of european microbiologists" (Любляна, 2003), 2-ой Международной конференции "Биотехнология -охране окружающей среды" (Москва, 2004), 3-м Международном Конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), Всероссийском симпозиуме с международным участием "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 2005).
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 3 У-гстраницах^ содержит 62 таблицы и 78 рисунков. Список цитируемой литературы включает 4* 6Ь работ.
Публикации.
Материалы диссертации содержатся в 43 печатных работах.
Место проведения работы.
Работу проводили в 2-х учреждениях: на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова и о лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н.Випоградского РАН.
Основные защищаемые положения.
1. Ряд фототрофных бактерий и хемотрофных бактерий предпочитают миксотрофныс условия роста, причем хемотрофные бактерии рода Sulfobacillus способны к стабильному росту только в миксотрофпых условиях. И фототрофные и хемотрофные бактерии, растущие в миксотрофных условиях, обладая гибким метаболизмом, способны переключаться на автотрофный и/или гетеротрофный типы питания.
2. Способность роста в миксотрофных условиях позволяет бактериям в максимальной степени извлекать углерод и энергию из окружающей среды, что очень важно в их ограниченных по источникам питания природных местообитаниях. Переключение на авто- и гетеротрофный типы питания сохраняет жизнеспособность миксотрофных бактерий в постоянно меняющихся условиях внешней среды.
3. По типу метаболизма изученные виды миксотрофных фототрофных и хемотрофных бактерий близки к факультативным автотрофам, но обладают более широкими, чем факультативные автотрофы, метаболическими возможностями.
4. При росте в миксотрофных условиях начальные стадии углеродного метаболизма фототрофных и хемотрофных бактерий включают аналогичный набор биохимических реакций и механизмов, обеспечивающих оптимальный роет и возможность перехода на автотрофный или гетеротрофный типы питания. Потребление органики при миксотрофном типе питания у изученных фототрофов и хемотрофов зависит от окисления неорганических источников энергии, причем у хемотрофов эта зависимость облигатна.
5. Отсутствие автотрофного роста изученных нами видов хемотрофных и фототрофных (при наличии Ог на свету и в темноте) бактерий объясняется прежде всего тем, что процесс окисления неорганических доноров электронов не обеспечивает клетки достаточной энергией.
6. Метаболизм серы у изученных нами фототрофных и хемотрофных миксотрофов имеет много общих реакций, но существуют и некоторые различия. Хемотофные бактерии, в отличие от фототрофных, в процессе окисления восстановленных соединений серы запасают энергию не только при помощи электронтранспортной системы, но и в процессе субстратного фосфорилирования.
7. Метаболическая гибкость и устойчивость к факторам окружающей среды фототрофных и хемотрофных бактерий, обладающих миксотрофным типом питания, позволяет использовать их в биотехнологии.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Объекты и методы исследований.
В качестве объектов исследования использовались фототрофные бактерии -пурпурные серные Ectothiorhodospira shaposhnikovii 1К, Ectothiorhodospira mobilis 8115, Chromatium minutissimum 1, зеленые нитчатые Oscillochloris trichoides шт. DG-6, хемотрофные бактерии - Sulfobacillus thermosulfidooxidans шт. 1269T (DSMZ 92931), Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes шт. 41 (ИНМИ Армении B-6981), Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans шт. Kl (теперь Alicyclobacillus tolérons K1T, BKM B-2304), Sulfobacillus thermotolerans шт. Krl (BKM B-2339), Sulfobacillus sibiricus шт. N1 (BKM B-2380) и шт. OSSO, Acidithiobacillus ferrooxidans шт.
TFBk. Культуры получены из коллекций каф. микробиологии МГУ и лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов ИНМИ РАН.
Для культивирования хемотрофных бактерий применяли среды Брайли (Brierley et al., 1977), модифицированные среды Маннинга (Manning, 1975) и 9К (Меламуд, Пивоварова, 199S). Культуры хемотрофов выращивали в авто-, миксо- и гетеротрофных условиях. При культивировании бактерий в миксотрофных условиях в минеральную среду вносили Fei+ или элементную серу, дрожжевой экстракт и/или глюкозу до концентрации 0,02-0,05% и 10 об.% посевного материала. Для создания гетеротрофных условий к минеральному фону добавляли указанные органические вещества.
Для культивирования фототрофных бактерий использовали среды Ларсена (Larscn 1952) и Пфеннига (Triiper, 1968). Культуры фототрофов выращивали в авто-, миксо- и гетеротрофных условиях. При выращивании бактерий в присутствии органических кислот их вносили в среду в концентрации 0,1%. Количество тиосульфата или сульфида в среде составляло при этом 0,05-0,1%, бикарбоната натрия - 0,2%. В анаэробных условиях в темноте фототрофные бактерии выращивали в колбах с притертыми пробками в атмосфере аргона. Определение количества сульфида и сульфата в среде проводили колориметрическим и нефеломстрическим методами (Trüper, Schlegel, 1964). Иммобилизацию клеток E.shaposhnikovii в каррагинане, агаре и алюмоборосиликатном волокне осуществляли, как описано (Кощеенко, 1981; von Feiten et al., 1985).
За ростом бактерий наблюдали, определяя оптическую плотность суспензий, количество клеток методом прямого счета в камере Горяева и по скорости окисления Fe2+ до Fe3+. Содержание в среде Fe2+ и Fe3+ определяли комплексометрическим титрованием (Резников и др., 1970), концентрацию глюкозы в среде - антроновым или фенольным методами (Ashwell, 1957; Хансон, Филлипс, 1984). Клетки собирали центрифугированием при 10000 g в течение 40 мин, промывали средой, не содержащей энергетического источника, ресуспензировали в 0,1 М трис-HCl буфере с pH 7,4-7,8.
Определение ассимиляции клетками 14С-содержащих соединений и продуктов кратковременной ассимиляции клетками фототрофных бактерий 14С-содержащих соединений проводили, как описано ранее (Захарчук, Ивановский, 1980).
Разрушение клеток проводили на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН при 22 кГц, в течение 3-7 мин с перерывами по 1 мин при охлаждении. Полученный гомогенат центрифугировали 20-30 мин, при 40000 g. Супернатант использовали для определения активности ферментов. Активности карбоксилаз определяли радиоизотопным методом по скорости фиксации экстрактами клеток |4С02 в соответствующих системах (Романова, 1980; Ivanovsky et al„ 1999). Радиоактивность препаратов определяли, используя жидкостные сцинтилляционные счетчики импульсов "LKB RacBeta 1127" и "Intertechnique" с применением сцинтилляторов ЖС-106, ЖС-8, ЖС-7а. Определение образования 14С02 в процессе использования клетками меченых 14С ацетата и пропионата проводили с применением специальных стеклянных сосудов с боковыми отростками (Захарчук, Ивановский, 1980). Анаэробные условия в сосудах создавали троекратной откачкой воздуха и заменой его на аргон.
Активность ферментов ЦТК, глиоксилатного шунта и путей углеводного метаболизма определяли спектрофотометрическим методом за исключением изоцитратлиазы и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы, активности которых определяли колориметрически (Захарчук и др., 1994; Каравайко и др., 2000). Активность ферментов серного метаболизма определяли, как описано (Красильникова и др., 1998). Активность ферментов выражали в нмоль/мин»мг белка. Белок измеряли по методу Лоури (Lowiy et al., 1951) или Брэдфорд (Bradford, 1976). Скорость дыхания клеток определяли с
s
использованием хлорсеребряного электрода Кларка. Скорость дыхания выражали в нмоль поглощенного кислорода на мг белка за 1 мин - нмоль Ог /мг бслка*мин.
Количество АТФ в клетках определяли люциферин-люцифсразным методом (Griffiths, 1996) в модификации (Фрунджян и др., 1999, 2000) с помощью биолюминесцентного АТФ-реагеита "Микролюм", приготовленного на основе растворимой люциферазы светляков (Frundjian et al., 2000). Определение цитохромов b- и й-типа в мембранах клеток сульфобацилл проводили с помощью спектрального анализа с применением дифференциального однолучевого спектрофотометра "Specord-50, Analytic Jena AG" (Германия) (Стром и др., 2004). Цитохром с в растворимой фракции мембран определяли с помощью ДСП-электрофореза в ПААГ с последующей окраской на тем 3,3',5,5 '-тетраметилбензидином (Laemmli, 1970; de Vrij et al.,1983).
Все опыты ставили не менее трех-пяти раз по две повторности в каждой серии. Исключением являются только эксперименты по определению образования радиоактивных продуктов кратковременной ассимиляции меченых субстратов, которые ставили по два раза. Результаты в их конечном виде получали путем вычисления среднего арифметического (X) из результатов всех повторностей (Х„) при условии, что они различались не более чем на 10% ( /Х„ - X/ < 0,05 X). В случае большего разброса данных, количество опытов увеличивали. При этом расчет среднего арифметического проводили, исключая "сомнительные результаты" ("X"), не входящие в доверительный интервал /Хп -X/ = t'a, где X - среднее арифметическое без учета "сомнительных результатов", t -нормированное отклонение при Ро,« для малых выборок (n<30), а а - среднее квадратичное отклонение (±л/ (¿(Xn-X)2/(n-l)) без учета "X".
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Глава 1. Изучение фототрофных бактерий.
Большинство фототрофных бактерий способны расти в фотоавтотрофных анаэробных условиях на среде с бикарбонатом и восстановленными соединениями серы, являющимися донорами электронов. Однако оптимальный рост многих культур наблюдали на свету, когда в среду кроме бикарбоната и восстановленных соединений серы вносили органические соединения. К таким культурам относятся пурпурные бактерии Ectothiorhodospira shaposhnikovii, шг. 1К, Е. mobilis, urr.8115, Chromatium minutissimum, шт.1, а также зеленая нитчатая бактерия Oscillochloris trichoides, шт. DG6.
Особенный интерес вызывала способность Е. shaposhnikovii и Е. mobilis расти не только на свету, но и в темноте в присутствии органических соединений.
Первым этапом работы являлось исследование путей метаболизма углерода и установление типа метаболизма у фотосинтезирующих бактерий в зависимости от состава среды, условий освещения и интенсивности аэрации.
1.1. Метаболизм углерода у E.shaposhnikovii и E.mobilis в разных условиях роста.
1.1.1. Автотрофныс условия в присутствии света.
Проведенные исследования показали, что E.shaposhnikovii и E.mobilis способны расти автогрофно на минеральной среде в присутствии тиосульфата и (или) сульфида только в анаэробных условиях при освещении, однако рост в таких условиях был слабым. Максимальный урожай клеток этих бактерий, в 3-5 раз превосходящий урожай в фотоавтотрофных условиях, наблюдался на свету в анаэробных миксотрофных условиях при наличии в среде кроме бикарбоната и неорганического донора электронов также ацетата, пропионата, малата и т.д. Кроме того, оба вида могут расти как на свету, так и в темноте в присутствии кислорода, причем лучше в микроаэробных условиях.
Результаты опытов показали, что подобно другим пурпурным бактериям, Е^карояИткоуП и Е.тоЬИк в фотоавтотрофных условиях ассимилируют С02 в основном через восстаповительный рибулозобисфосфатный цикл (РБФ-цикл). Об этом свидетельствует наличие у них РБФ-карбоксилазы (РБФК) (табл. 1), высокая скорость автотрофной фиксации "¿-бикарбоната клетками (табл.2), почти полное ингибировапие фиксации углекислоты йодацетатом, подавляющим функционирование РБФ-цикла на уровне фосфоглицератдегидрогеназы (табл.3), а также быстрое и преимущественное включение метки из 14С-бикарбоната в ФГК и ФЭ Сахаров. У КзИарозИткоуИ в автотрофных условиях значительная часть ФГК метаболизируется далее через реакции ЦТК, который не замкнут из-за отсутствия 2-оксоглутаратдещдрогеназы. Не функционирует также один из ферментов глиоксилатного шунта — малатсинтаза, хотя активность изоцитратлиазы сохраняется (табл.4). Однако, видимо, в таком виде у Е^ИаровИткош и Е.тоЫИз ЦТК и глиоксилатный шунт выполняют в основном биосинтетические функции и не служат источником восстановителя (рис.1). О связи
Таблица 1. Активность РБФ-карбоксилазы (нмоль/мин'мг белка) в клетках Е. $ЬарсиЬтко\>и и Е .тоЫНз, выросших на минеральной среде с бикарбонатом и тиосульфатом и с добавлением ацетата или пропионата, в разных условиях освещения и аэрации.
Условия роста культур Среда Е.яИарояЬткоуи ЕтвЫНя .
Анаэробные Минеральная с тиос. 29,9 25,5
Анаэробные + ацетат 12,9 11,2
Анаэробные + пропионат 14,6 . -
Свет . -Микроаэробные +ацетат 4,3 2,7
Микроаэробные + пропионат 3,6 -
Аэробные 1- ацетат 1,2 -
Аэробные + пропионат 1,4 -
Анаэробные +ацетат 4,9 -
Микроаэробные +ацетат 1,3 1,2
Темнота Микроаэробные + пропионат 2,7 -
Аэробные + ацетат 0,8 0,6
Аэробные + пропионат 0,9 -
Примечание: знак"-" во всех таблицах означает, что такой вариант опыта не ставили.
Таблица 2. Фиксация 14С-бикарбоната (нмоль/мин>мг белка) клетками ЕлЬорозЬткочН, ' выросшими в разных условиях на среде с бикарбонатом, тиосульфатом и ацетатом.
Условия роста Субстрат в Условия опыта
культур опытной среде свет, анаэр. свет, аэроб. теми, анаэр. теми, аэроб.
Свет, анаэр. Нет 3,8 3,6 1,5 1,7
без ацетата Тиосульфат 32,0 29,8 1,5 1,8
(автотрофные) Ацетат 14,2 13,5 1,6 1,8
Свет, Нет 4,0 3,9 1,5 1,7
анаэробные Тиосульфат 25,3 24,3 1,5 1,8
Ацетат 18,6 18,5 1,6 1,9
Темнота, Нет 3,4 3,2 1,5 1,6
микро- Тиосульфат 20,5 19,8 1,5 1,6
аэробпые Ацетат 15,5 15,3 1,5 1,7
Темнота, Нет 3,4 3,2 1,3 1,4
аэробные Тиосульфат 8,5 8,4 1,3 1,4
Ацетат 11,7 11,5 1,3 1,6
цикла Кальвина с реакциями ЦТК и глиоксилатного шунта свидетельствует значительное снижение скорости автотрофной фотоассимиляции клетками 14СС>2 при добавлении фторацетата - ингибитора ЦТК на уровне акопитатгидратазы (Захарчук и др., 1980, а). Сопряжение цикла Кальвина и ЦТК осуществляется в автотрофных условиях через реакции карбоксилирования ФЕП и декарбоксилирования пирувата (табл.5), образующихся из ФГК (рис.1).
Таблица 3. Действие йодацетата (5 • 10'6М) на фиксацию мС-бикарбоната (в % от контроля) в анаэробных условиях при освещении клетками Е.хИаро.чкткоуи, выросшими автотрофно на среде с бикарбонатом, тиосульфатом и миксотрофно на среде с ацетатом.
Опытная среда содержит Условия роста клеток
свет, анаэробные автотрофные свет, с ацетатом анаэробные темнота, с ацетатом микроаэробные
Сульфид (контроль) 100 100 100
Сульфид+йодацстат 2 4 7
Сульфид+йодацетат+ацетат 45 53 59
Таблица 4. Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного шунта (нмоль/мин*мг белка) у Е.хИа-рюШШИ при росте на минеральной среде с бикарбонатом и тиосульфатом, а также с добавлением ацетата или пропионата на свету в анаэробных и в темноте в микроаэробных условиях.
Фермент Клетки выросли на среде
минеральной свет с ацетатом с пропионатом
свет Темнота свет темнота
Цитратсинтаза 38 67 17 15 10
Лкопитатгидратаза 88 72 46 45 61
Изоцитратдегидрогеназа 44 89 26 48 67
2-Оксопгутаратдегидрогеназа н,о. н.о. и.о. н.о. н.о.
Сукциния-КоА-еинтетаза 36 39 41 112 98
Сукцинатдегидрогеназа 8 11 7 14 27
Фумаратгидратаза 122 197 64 214 222
Малатдегидрогсназа 970 1776 1624 528 448
Изоцитратлиаза 28 49 126 32 49
Малатсшггаза н.о. 12 19 57 78
Примечание: знак "н.о." во всех таблицах означает, что активность фермента не обнаружена.
Таблица 5. Активность карбоксилирующих ферментов (нмоль/мин мг'белка) в клетках ЕлИарояИт^И, выросших на минеральной среде с бикарбонатом и тиосульфатом и в миксотрофных с добавлением ацетата или пропионата, в разных условиях.
Среда с Среда с ацетатом Среда с
Фермент тиосуль- пропионатом
фатом, свет, свет, темнота, темно- свет, темнота,
анаэр, анаэр. микроаэр та, аэр. анаэр. микроаэр.
ФЕП-карбоксилаза 0,7 2,5 2,3 2,1 1,4 0,8
ФЕП-карбокситрансфосфорилаза 0,5 1,4 0,2 0,2 0,9 0,4
Пируваткарбоксилаза н.о. 2,8 1.9 1,8 0,7 0,5
Пируватортофосфат-дикиназа 0,5 1,2 1,1 - - -
Пируватсинтаза 8,7 16,5 17,8 - 7,4 6,9
2-Оксоглутаратсинтаза 9,4 15,4 11,7 - 7,9 6,4
Пропионил-КоА-карбоксилаза - - - - 22,3 11,3
Рнс. 1. Схема начальных этапов метаболизма углерода у Е. зЪарсиНткоми при росте в анаэробных автотрофных условиях при освещении.
1.1,2. Мкксотрофяые условия в присутствии света.
Способность клеток ЕлкарояНткоуи и Е.тоЫШ ассимилировать С02 через РБФ-цикл сохраняется при их выращивании на свету в анаэробных миксотрофных условиях на среде с бикарбонатом, тиосульфатом и добавлением ацетата или пропионата. Это следует из того, что хотя активность РБФ-карбоксилазы при росте на среде с ацетатом и пропиопатом снижается, но остается на достаточно высоком уровне (табл. 1), наблюдается высокая скорость фиксации 14С-бикарбоната клетками, как в присутствии тиосульфата, так и ацетата (табл,2), отмечается почти полное ингибирование фиксации углекислоты йодацетатом (табл.3), а также быстрое включение метки из 14С-бикарбоната в ФГК и ФЭ Сахаров клетками ЕлкаровЬткош, выросшими в миксотрофных условиях на среде с ацетатом (рис. 2). В присутствии тиосульфата роль цикла Кальвина в фиксации ИС02 клетками Е.ь-ИарозИткоУп в миксотрофных условиях уменьшается (рис.2 Б).
В присутствии света в миксотрофных условиях ЕлИарозИткочИ и Е.тоЫНз хорошо растут за счет использования ряда органических соединений, в частности ацетата и пропионата. Согласно нашим данным, использование ацетата ЕлНарояИткоуН и Е.тоЫШ при освещении частично происходит через реакции ЦТК и глиоксилатного шунта (табл.4). Однако в большей степени, особенно в присутствии неорганического донора электронов, оно также связано с действием пируватсинтазы и дальнейшим образованием С4 -С5-кислот с участием углекислоты (табл.5). При наличии в среде С02 и тиосульфата скорость фотоассимиляции 2-14С-ацетата увеличивается в 2 раза (табл.б). Значительное восстановление фотоассимиляции клетками ЕлкарозИткоуИ 2-иС-ацетата в присутствии фторацетата и неорганического донора электронов только при наличии бикарбоната (табл.б) объясняется тем, что в таких условиях происходит процесс карбоксилирования
ч о О
- ФГК+ФЭ сахароз Сукцинат
- Фумарат
- ГЛалаг -Аспаргат -Алании
100 120 140 160 180 200
Время экспозиции, сек
i— ФГК+ФЭ сахарна >— Сукцинат >— Фуь'арат
Р,1алат "-Аспаргат I— Алании
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Время экспозиции, сек
Рис. 2. Распределение 14С в главных продуктах кратковременной ассимиляции 14С-бикарбоната клетками Е^ИарояИткоуп, выросшими анаэробно на свету в миксотрофных условиях на среде с ацетатом, тиосульфатом, бикарбонатом.
А - в присутствии ацетата; Б - ацетата и тиосульфата.
Таблица б. Действие фторацетата (5- 10'3М) и малоната (2 МО^М) на ассимиляцию 2-1'|С-ацетата (нмоль/мин'мг белка) клетками ЕлкарохИт^И в разных условиях опыта.
Опытная среда содержит Свет, анаэробные Темнота, аэробные
нмоль/мшгмг белка % ммодь/мшгмг белка %
2-иС-ацетат 96,3 60 24,3 97
+бикарбонат 160,7 100 25,1 100
+бикарбонат+тиосульфат 176,8 110 26,1 104
+фторацетат 0 0 0 0
ч-гиосульфат+фторацетат 24,2 15 0 0
+бикарбонат+ фторацетат 4,6 3 0 0
+6икарбонат+тиосульфат
+фторацетат 110,0 69 1,0 4
+бикарбонат+малонат 112,2 70 14,5 58
Примечание: клетки выросли в анаэробных условиях на свету на среде с ацетатом.
ацетил-КоА. Об этом свидетельствует и резкое снижение количества ИС02, выделяемого при использовании клетками 2-мС-ацетата, в присутствии тиосульфата и фторацетата на свету (табл.7). Скорость выделения 14С02 из 2-14С-ацетата показала, что около трети ацетата на свету ассимилируется через реакции ЦТК, а остальная часть - при участии реакций восстановительного карбоксилирования ацетил-КоА (табл.7). Первыми мечеными соединениями в продуктах ассимиляции 2-14С-ацетата были малат, сукцинат, аспартат, что подтверждает функционирование ЦТК в миксотрофных условиях на свету (рис. 3).
Использование ЕлИарсиИт^И пропионата при росте на свету связано с карбоксилированием пропионил-КоЛ при участии биотипзависимой пропионил-КоА-карбоксилазы (табл.5). Образующийся сукцинат включается в реакции ЦТК и глиоксилатного шунта (табл.4). Синтезируемый в ЦТК восстановитель обеспечивает фиксацшо СО2 через РБФ-цикл. Об этом говорит стимулирование фотоассимиляции 14СОг пропионатом, а фиксации 2-иС-пропионата - углекислотой (Захарчук и др., 1980 б; табл.8),
Таблица 7. Образование 14СОт (тюль/мин* мг белка) при использовании 2-14С-ацегата (нмоль/мин мг белка) в разных условиях опыта клетками Е.5}1ара$1тНю\<П, выросшими в темноте в микроаэробных условиях на ацетате.
Условия Опыта Опытная среда содер;киг (кроме бикарбоната) Фиксация 2-"С-ацетата Выделение "СОз ■4со3 2-ме-зцетат. %
2-нС-аиэтат 231,0 73,5 29,3
Свет, +тиосульфат 270,0 65,0 24,1
анаэробные + фторацетат 12,6 3,8 30,2
+ тиосульфат+фторацетат 194,0 9,5 4,9
Темнота, аэробные 2-иС-ацетат + тиосульфат + фторацетат + тиосульфат+фторацстат 60,0 62,0 0 1,6 22,2 24,2 0 0 37,0 39,0 0 0
Рис. 3. Распределение 14С в главных продуктах кратковременной ассимиляции
2- 14С-ацстота'1а клетками Е^ЬарозИткоуН, выросшими анаэробно на свету на среде с ацетатом, тиосульфатом, бикарбонатом. А - без тиосульфата; Б - с тиосульфатом.
Таблица 8. Ассимиляция 2-'4С-пропионата клетками Е.йИаро$ИткоуЦ на свету и в темноте в зависимости от наличия бикарбоната (2 10"2М), фторацетата (5 10'3М) и малоната (3 10"2М).
Опытная среда содержит Свет анаэробные Темнота, аэробнь ю
нмоль/мин-мг белка % нмоль/мин'мг белка %
2-'"С-пропионат 98,1 54 29,8 61
+ бикарбонат 181,4 100 48,7 100
+ бикарбонат+тиосульфат 127,3 70 47,4 97
+ бикарбона-м фторацетат 23,5 13 8,0 16
+ бикарбонат+малонат 30,8 17 13,5 27
Примечание: клетки выросли в темноте в микроаэробных условиях на среде с пропионатом.
состав и кинетика меченых продуктов фиксации 2-|4С-пропионата, а также подавляющее действие на фиксацию 2-1 С-пропионата клетками и экстрактами клеток авидина, малоната и фторацетата - ингибиторов соответственно пропионил-карбоксилазы, сукцинатдегидрогеназы и аконитатгидратазы (табл.8; рис. 4; Захарчук и др., 1980, б).
При росте на свету пируват может использоваться ЕлИарояНткоуи путем декарбоксилирования до ацетил-КоА, а также непосредственного карбоксилирования до оксалоацетата и/или) после превращения в фосфоенолпируват. Об этом свидетельствует наличие соответствующих карбоксилаз (табл.5), стимулирование углекислотой ассимиляции пирувата и неполное подавление этого процесса арсенитом, ингибирующим систему ферментов окисления а-кетокислот (табл.9, рис.4).
Таким образом, из полученных данных следует, что в оптимальных для роста ЕлИарояИткоуИ и Е.тоЫШ фотомиксотрофных анаэробных условиях эти бактерии одновременно используют два источника углерода - углекислоту и органические соединения, а источниками электронов выступают те же органические соединения и восстановленные соединения серы (рис.4). В миксотрофных условиях использование Е.вкарозкткочп и Е.тоЫШ, органических соединений связано с одновременным их окислением в ЦТК и ассимиляцией в реакциях карбоксилирования органических кислот.
Таблица 9. Действие арсенита (2»10"3М) на ассимиляцию 2-14С-пирувата (нмоль/мин«мг белка) клетками ЕлкарснИткоуН в разных условиях опыта.
Опытная среда содержит Свет, анаэробные Темнота, аэробные
нмоль/мин мг белка % нмоль/мии мг белка %
г^С-пируват 73,1 62 17,3 92
+ бикарбонат 118,7 100 18,9 100
+ бикарбонат+тиосульфат 124,6 105 19,3 102
+ бикарбонат+арсенит 11,7 10 1,2 6
+ бикарбонат+тиосульфат 34,7. 29 и 9
+арсенит
Примечание: клетки выросли в анаэробных условиях на свету на среде с пнруватом.
Количество СОг, усваиваемого Е.вкаровЫхкот и Е. тоЫИз в этих условиях, составляет до 20-25% от ассимилируемого клетками в виде органических субстратов. Причем только около половины этого С02 фиксируется в цикле Кальвина, а остальное количество ассимилируется в реакциях карбоксилирования органических кислот. При росте ЕлкарозЬт^и и Е. тоЫШ в фотомиксотрофных условиях при наличии в среде кроме углекислоты и органического соединения еще и неорганического донора электронов, скорость ассимиляции органических соединений возрастает и изменяются пути их метаболизма. Так часть ацетата включается через реакцию карбоксилирования ацетил-КоА и далее через реакции обращенного ЦТК. В отсутствие в среде неорганических доноров электронов ацетат, а также пируват и пропионат, метаболизируются в основном через реакции ЦТК и глиоксилатный шунт, где происходит их частичное окисление с получением восстановителя, используемого для биосинтетических реакций и ассимиляции С02 в цикле Кальвина (рис.4).
1.1.3. Гетеротрофные условия в темноте.
При переносе на свет клеток Е.якарозИткоуп, выросших в микроаэробных и даже аэробных условиях в темноте в присутствии бикарбоната, тиосульфата и ацетата, они немедленно начинают ассимилировать С02 при наличии в качестве доноров электронов
/ Цикл V—С02 V Кальвина I
^__цодэцетэт
Фосфоглг.цорат
Алании-*
Фосфоэнолпируват Ацетат
-С02 |{
Ацетил-КоА
Пропионат
Пропионил-КоА
ааидин-
Мотилмалонип-КоА<—► Сукцинил-КоА
С02 2-Оксоглутарат
Глутамат
СОг
Рис. 4. Схема начальных этапов метаболизма углерода у Е.хИарояИткоуИ при росте в миксотрофных анаэробных условиях при освещении.
тиосульфата или сульфида (табл.2). Кроме того, наблюдается почти полное ингибирование фиксации углекислоты йодацетатом (табл.3). В то же время, в отсутствие света автотрофной фиксации 14С-бикарбоната не происходит даже в том случае, если клетки выросли при освещении в автотрофных условиях (табл.2) и содержат РБФ-карбоксилазу в максимальном количестве (табл.1). Это доказывает, что ЕлНарохШкоуИ при росте в темноте сохраняет способность к ассимиляции С02 через РБФ-цикл, однако последний не может функционировать в темноте и обеспечивать в этих условиях автотрофный рост. Причиной может быть то, что действие РБФ-цшсла в присутствии 02 ограничено заметной репрессией в таких условиях синтеза РБФ-карбоксилазы (табл.1). В связи с этим скорость фиксации С02 у ЕлкарозИткоуп и Е.тоЫШ, выросших при сильной аэрации как в темноте, так и на свету, значительно ниже, чем после роста в анаэробных и микроаэробных условиях (табл.2). Длительная и интенсивная аэрация анаэробных фотоавтотрофных клеток ЕМарозИткоуИ, обладающих максимальной активностью РБФ-карбоксилазы, уже в условиях опыта, также приводит к снижению скорости фотоассимиляции С02 по сравнению с анаэробными условиями (табл.10). Следовательно, наряду с репрессией синтеза РБФ-карбоксилазы, кислород может ингибировать механизмы автотрофной ассимиляции С02. Не исключена и конкуренция кислорода с С02 за восстановитель, необходимый для ассимиляции углекислоты через РБФ-цикл (КЬаппа е1 а!., 1981; Романова, 1989), что также ограничивает функционирование последнего.
Однако, при слабой аэрации это, видимо, не основные причины полного прекращения ассимиляции клетками СОг и отсутствия роста в темноте в автотрофных условиях, поскольку на свету, даже при наличии Ог, значительная фиксация углекислоты через РБФ-цикл имеет место (табл.3). Основной причиной невозможности функционирования в темноте цикла Кальвина и обеспечения в этих условиях автотрофного роста, является то, что окисление E.shaposhnikovii тиосульфата и/или сульфида, возможное в отсутствие света (Кондратьева и др., 1976 а, б), не обеспечивает в достаточной мере энергетические потребности клеток, в отличие от Т. roseopersicina и некоторых других пурпурных серобактерий (Triiper, Fischer, 1984; Кондратьева, 1989,1996).
Очевидно также, что культуры E.shaposhnikovii и E.mobilis не растут в фотоавтрофных условиях в присутствии 02 потому, что кислород подавляет синтез пигментов и всего фотоеинтезирующего аппарата, а получать достаточную для роста энергию в результате окисления неорганических соединений серы эти бактерии не способны ни в темноте, как уже отмечалось, ни на свету. У E.shaposhnikovii синтез АТФ при использовании соединений серы возможен лишь в результате окислительного фосфорилирования (Родова, 1980; Ивановский, 1986). Однако АТФ синтезируется в укороченной ЭТЦ, поскольку при окислении тиосульфата и сульфида акцепторами электронов служат цитохромы, а не НАД+, что и ограничивает использование восстановленных соединений серы E.shaposhnikovi и E.mobilis в качестве источника энергии для роста в автотрофных аэробных условиях как в темноте, так и на свету.
При росте в темноте в присутствии таких органических соединений, как ацетат, пируват, сукцинат, фумарат и малат, фиксация клетками E.shaposhnikovii и Е. mobilis С02 очень мала (табл.2). Лишь при наличии пропионата клетки обоих микроорганизмов фиксируют С02 не только при освещении, но и в темноте (табл.8; Захарчук и др., 1980 б).
Состав и кинетика меченых продуктов, образующихся при кратковременной ассимиляции клетками E.shaposhnikovii 2-иС-пропионата в присутствии бикарбоната (рис.5) и 14С-бикарбоната в присутствии пропионата (рис.б) свидетельствуют о том, что начальный этап метаболизма пропионата в темноте и при освещении одинаков и связан с карбоксилированием пропионил-КоА. Оно ведет к образованию метилмалонил-КоА, а затем - сукцината. Такой путь метаболизма пропионата подтверждается наличием в клетках E.shaposhnikovii, выросшими в темноте, биотип-зависимой пропионил-КоА-карбоксилазы (табл.5), а также заметной стимуляцией поглощения пропионата в
Таблица 10. Фиксация 14С-бикарбоната (нмоль/мин'мг белка) клетками Е. зЬароякткоуН, выросшими миксотрофно на свету на среде с ацетатом, тиосульфатом и бикарбонатом, в зависимости от условий аэрации клеток.
Условия роста Субстрат в Условия опыта
культур опытной среде
свет, анаэробные свет, аэробные (предварительная
аэрация клеток в течение 2-х часов)
Свет, Нет 3,6 4,2
анаэробные Тиосульфат 25,2 13,2
Ацетат 18,5 13,0
Свет, Нет 3,0 3,7
аэробные Тиосульфат 14,7 6,5
Ацетат 14,0 9,8
присутствии ССЬ и подавлением этого процесса малонатом, ингиб!фующим действие сукцинатдегидрогеназы (табл.8).
Образующийся в результате карбоксилирования пропионил-КоА сукцинат используется Е-зИарояИткоуи через реакции ЦТК и глиоксилатного шунта. Это следует из состава меченых продуктов кратковременной ассимиляции 2-нС-пропионата (рис.5), ингибирующего действия фторацетата на потребление клетками пропионата (табл.8) и наличия соответствующих ферментов ЦТК (табл.4). При росте ЕлИарозИт^И на среде с пропионатом на свету в анаэробных условиях этот субстрат частично окисляется; образующийся при этом восстановитель (НАДН) обеспечивает фиксацию СОг через цикл Кальвина (рис.4). В темноте путь ассимиляции углекислоты в РБФ-цикле не реализуется (табл.2, рис.6), хотя окисление иС-пропионата, как показали результаты опытов по измерению скорости образования из него 14СОг, происходит более интенсивно (Захарчук и др., 1980,6), что важно для получения клетками энергии.
60-. 50403020 10
20 40 60 60 100 120 140 160 180 200
Время экспозиции, сек
8
Б
СП<6ФЭ сзхароо
Сукцинат
Фунзрат
Мапат
Аспортат
0 20 40 60 80 100 120 140 160 100 200 Время экспозиции, сек
Рис.5. Распределение ИС в главных продуктах кратковременной ассимиляции 2-иС-
пропионата клетками ЕлИарозИткоуп, выросшими в аэробных условиях в темноте на среде с пропионатом, тиосульфатом и бикарбонатом.
А - в присутствии бикарбоната; Б - бикарбоната и тиосульфата.
Поскольку использование ЕлкарояИткоуН пирувата в темноте не связано с фиксацией углекислоты и почти полностью ингибируется арсенитом (табл.9), его метаболизм у данной бактерии в отсутствие света начинается с превращения в ацетил-КоА при участии пируватдегидрогеназы (Красильникова, Кондратьева, 1974).
В отличие от фотомиксотрофных условий, в темноте в присутствии кислорода ассимиляция ЕлИарозИткоуи и Е.тоЬШя ацетата не зависит от наличия СОг и неорганических доноров электронов (табл.6). Но при отсутствие света фторацетат оказывает более сильное ингибирующее действие на использование клетками ЕлИарозИпИсоуИ ацетата, а также его окисление до СОг (табл.7), чем при освещении. Анализ продуктов, образующихся при кратковременной ассимиляции клетками ЕлкарозИткоуЦ 2-14С-ацетата в аэробных условиях в темноте (рис.7), подтверждает, что определяющим путем использования этого субстрата в таких условиях являются реакции ЦТК и глиоксилатного шунта, ферменты которых у ЕлИарозЬткоуН обладают достаточно высокой активностью (табл.4). Наличие глиоксилатного шунта, видимо, компенсирует незамкнутость в темноте у Е.зкарозкткоуЦ и Е.тоЫШ ЦТК из-за отсутствия 2-оксоглутаратдегидрогеназы и позволяет бактериям использовать ацетат не только как
источник углерода, но и как донор электронов. О функционировании глиоксилатного цикла у ЕлкарозЬикочН при ассимиляции ,4С-ацегата в темноте свидетельствует образование клетками в таких условиях меченого гликолата, высокий процент включения радиоуглерода в малат в первые секунды экспозиции с 2-14С-ацетатом (рис.7), а также слабое ингибирование процесса использования ацетата малонатом (табл.б). О важной роли глиоксилатного шунта при росте Е^ИарозИткоун и Е.тоЫШ на среде с ацетатом в отсутствие света свидетельствует, кроме того, увеличение в таких условиях активности малатсинтазы и, особенно, изоцшрат-лиазы (табл.4).
р 45-]
3 40-
ю
о 36-
о 30-
m 25-
„О го-
0) S 15-
X
у 10-
а.
Ф 5-
о о4
•в— ФГк>1Э сахзрои
■о—Сукцииат ■A— «tyuapar т- Ноли ■♦— Аспарпхт
20 40 60 80 100 120 140 160 1в0 200 Время экспозиции, сек
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Время экспозиции, сок
Рис. 6. Распределение 14С в главных продуктах кратковременной ассимиляции 14С-бикарбоната клетками ЕлИароаНткоуи, выросшими в аэробных условиях в темноте па среде с пропионатом, тиосульфатом и бикарбонатом. А - в присутствии пропионата; Б - пропионата и тиосульфата.
3
(О
о
а
о
9
о
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Время экспозиции, сек
0 20 40 60 во 100 120 140 160 180 200 Время экспозиции, сек
Рис. 7. Распределение 14С в главных продуктах кратковременной ассимиляции 2-иС-ацстата клетками ЕлИарозЬткоуИ, выросшими в аэробных условиях а темноте на среде с ацетатом, тиосульфатом и бикарбонатом.
А - в отсутствие тиосульфата; Б - в присутствии тиосульфата.
Таким образом, в темноте Е.зЬаро$1иикохп и Е.тоЫШ растут как хемоорганогетеротрофы. Использование таких органических соединений, как ацетат, пируват, пропионат и, видимо, ряда других субстратов в темноте в аэробных условиях связано с функционированием неполного ЦТК и глиоксилатного шунта (рис.8). В результате этого клетки обеспечиваются метаболитами для различных биосшггетических процессов и получают энергию в результате аэробного дыхания (Ивановский, Педан, 1980; Кондратьева, 1989). Хотя бактерии, выросшие в темноте в гетеротрофных условиях, сохраняют способность к образованию карбоксилирующих ферментов, в том числе РБФ-карбоксилазы, углекислота не играет такой значительной роли в метаболизме органических соединений, как при освещении. Лишь в случае пропионата карбоксилирование остается необходимым для начального этапа ассимиляции данного субстрата, поскольку другими возможностями его использования исследусмыс бактерии, судя по полученным данным, не обладают.
Полученные данные позволяют также заключить, что ЕвИароБИткот и Е.тоЫИз очень близки по физиологии и метаболизму углерода.
Фосфоэфиры Сахаров t
Фосфоглицерат-> Сорин •*■ Глицин t
►Фосфоонолпируват —► Фенилаланин
п т
Пируват -
Алании
$—»■002 Ацвтил-КоА ч—
Ацетат
С02
Аспартат ч-
Пропионат
| Малат
Пропиомил-КоА \
|^-С02 Фумарат
Мотилмалонил-КоА Сукцинат
I Ч
■ Сукцинил-КоА
2-Оксоглутарат Глутамат
Рис. 8. Схема начальных этапов метаболизма углерода у Е. shaposhnikovii
при росте в аэробных хемооргаиогегеротрофных условиях в темноте.
1.2. Миксотрофный углеродный метаболизм Chromatium minutissimum.
Пурпурная серобактерия Chromatium minutissimum, штамм 1, способна расти в анаэробных условиях при освещении автотрофно на минеральной среде в присутствии тиосульфата и (или) сульфида. Однако значительно лучше культура растет в фотомиксотрофных условиях в присутствии бикарбоната, сульфида или тиосульфата и органических соединений - ацетата, малата, пирувата. Chr. minutissimum может также использовать некоторые сахара, например глюкозу, но на этих углеводах культуры растут очень плохо (Красильникова, 1975; Захарчук, Красильникова, 2000).
В табл. 11 представлены уровни активностей некоторых карбоксилаз при росте Chr. minutissimum автотрофно на минеральной среде с бикарбонатом (0,2%), тиосульфатом и сульфидом (по 0,1%) и миксотрофно с добавлением к минеральной среде ацетата или пропионата (по 0,1%). Активность ключевого фермента цикла Кальвина РБФ-карбоксилазы оказалась самой высокой при росте бактерий в автотрофных условиях на минеральной среде. При культивировании на среде с ацетатом или малатом активность фермента примерно в 2 раза ниже, чем у культур, выросших в автотрофных условиях. Внесение в реакционную смесь ингибитора РБФ-карбоксилазы - цианида в концентрации 10"3 М приводило к подавлению в среднем на порядок уровня активности фермента в экстрактах клеток Chr. minutissimum, независимо от условий их выращивания (табл.11). Уровень ФЕП-карбокоилазы оказался очень низким, независимо от условий роста культур. Активность ФЕП-карбоксикиназы также незначительна как при росте на минеральной среде, так и в присутствии малата или ацетата. Однако в экстрактах клеток, выросших как автотрофно, так и миксотрофно, показана достаточно высокая активность еще одного из ферментов анаплеротической фиксации С02 - пируваткарбоксилазы (табл.11).
Таблица 11. Активность карбоксилаз (нмоль/мин'мг белка) в клетках Chr. minutissimum, выросших автотрофно на минеральной среде с бикарбонатом, тиосульфатом и сульфидом и миксотрофно с добавлением к минеральной среде ацетата или пропионата.
Фермент Клетки выросли на среде
с ацетатом с малатом с сульфидом и тиосульфатом (по 0,1%)
РБФ-карбоксилаза 14,0 12,3 30,2
РБФ-карбоксилаза + 1 мМ цианида 1,5 - 2,2
ФЕП-карбоксилаза 0,2 0,1 0,1
ФЕП-карбоксикшша 0,1 0,1 0,1
Пируваткарбоксилаза 2,2 3,1 2,8
"Malic-фермент" 42,6 25,0 19,0
Для функционирования полного ЦТК у Chr.minutissimum не хватает активности 2-оксоглутаратдегидрогеназы и малатдегидрогеназы. Этот недостаток при росте в миксотрофных условиях компенсируется наличием ключевых ферментов глиоксилатного шунта - изоцитратлиазы и малатсинтазы (табл.12). Кроме того, отсутствие активности малатдегидрогеназы при росте как в миксотрофных, так и автотрофных условиях компенсируется наличием "таНс-фермента" и анаплеротических реакций карбоксилирования пирувата и ФЕП (табл.11). Схема начальных этапов метаболизма углерода у Chr. minutissimum в фотомиксотрофных условиях представлена на рис.9. Углерод бактерии получают в результате действия цикла Кальвина и окисления органических веществ через глиоксилатный шунт. Доноры электронов Chr. minutissimum получает как в результате окисления органических веществ, так и восстановленных соединений серы. В автотрофных условиях (рис. 10) у бактерии действует цикл Кальвина и анаплеротические реакции карбоксилирования ФЕП и пирувата, а ЦТК не замкнут из-за отсутствия активности 2-оксоглутаратдегидрогеназы и малатдегидрогеназы. Глиоксилатный шунт также не функционирует из-за отсутствия активности изоцитратлиазы (табл.12). Но наличие "таНс-фермента" дает возможность получать малат из пирувата и ЦТК может функционировать в виде двух разнонаправленных систем реакций, обеспечивающих биосинтетические потребности бактерий.
Таблица 12. Активность ферментов ЦТТС и глиоксилатного шунта (нмоль/мин'мг белка) в клетках Chr. minutissimum, выросших в автотрофпых и миксотрофпых условиях.
Фермент Клетки выросли на среде
с ацетатом с малатом с сульфидом и тиосульфатом (по 0,1%)
Цитратсинтаза 21,8 17,3 12,6
Аконитатгидратаза 54,5 26,4 62,0
Изоцитратдегидрогеназа 28,6 46,9 16,0
2-Оксоглутаратдегидрогеназа н.о. и.о. н.о.
Фумаратгидратаза 75,7 42,1 59,0
Малатдегидрогеназа н.о. н.о. н.о.
"Malic-фермент" 42,6 25,0 19,0
Изоцитратлиаза 10,2 1,6 н.о.
Малатсинтаза 25,5 23,5 27,0
С02-
Аспартат-
Цикл V002 Кальвина
Фосфоглкцорат Сэрин —> Глицин +
. Фосфоенолпируват -к Фонилаланин
I
■ Пируват —► Алании
• СОг-*-/ WC02
/Ацотил-КоА < Ацетат
Оксалоацотат
Малат
Фумарат
\
Сукцинат
Цитр1ат^
Изоцитрат i
Оксалосукцинат 2-Оксоглутарат —»- Глутамат
Рис. 9. Схема начальных этапов метаболизма углерода у Chr. minutissimum при росте в анаэробных миксотрофных условиях при освещении.
Рис. 10. Схема начальных этапов метаболизма углерода у Chr. minutissimum при росте в анаэробных автотрофных условиях при освещении.
1.3. Миксотрофный углеродный метаболизм зеленой нитчатой бактерии ОвсШосМогЬ /п'сЛо/У/ея Ввб.
Зеленая нитчатая фототрофная бактерия О./п'с/гог'с/е^ штамм Бвб является облигатпым анаэробом. Она способна к росту в фотоавтотрофных условиях в присутствии сульфида или молекулярного водорода в качестве доноров элеюронов, но прирост биомассы в этих условиях незначителен. Оптимальный рост культуры наблюдали в фотомиксотрофных условиях в присутствии бикарбоната, сульфида и органических соединений. Ацетат, пируват и дрожжевой экстракт в 3-5, а глюкоза в 3 раза стимулируют миксотрофный рост О. и-Шюгйеъ Бйб по сравнению с автотрофным.
Фотоавтотрофная ассимиляция клетками иС-бикарбоната с использованием НгЭ в качестве донора электронов почти полностью подавляется цианидом. Наличие в экстрактах клеток активности ключевых ферментов цикла Кальвина РБФ-карбоксилазы и фосфорибулокиназы (табл. 13) подтверждает функционировние у О. МсЬоМея БСб данного механизма фиксации углекислоты. Главный продукт фотоавтотрофной ассимиляция экстрактами клеток 1 С-бикарбоната в присутствии рибуло-1,5-бисфосфата был идентифицирован с помощью двумерной хроматографии на бумаге как 3-ФГК. Подобно фиксации 14С02 целыми клетками, активность РБФ-карбоксилазы в экстрактах клеток О. Мс1ю1<1с$ ингибируется в присутствии в реакционной смеси цианида. Эти данные также говорят о действии у ОЛпс1го1с1е5 Бвб цикла Кальвина.
Ацетат, пируват и дролежевой экстракт в максимальной степени стимулируют фотомиксотрофный рост ОлпсЬ.01<1е$ БОб. У ОЛпсИо1<1е8 Овб показано наличие нескольких ферментов, карбоксилирующих ФЕП и пируват (табл.13). При росте бактерий в
Таблица 13.Активносгь карбоксилаз у О. ЩсЪоИез Ойб (нмоль/мин°мг белка) при росте культур в автотрофных условиях с бикарбонатом и Нгв и в мшссотрофпых с бикарбонатом, НгБ и ацетатом.
Фермент Условия роста культур:
автотрофные Миксотрофные
РБФ-карбоксплаза 20,7 8,8
Фосфорибулокиназа 3,0 1,1
ФЕП-карбоксилаза 1,3 6,5
ФЕП-карбоксикиназа (ГДФ) 6,2 8,9
ФЕП-карбокситрансфосфорилаза 3,6 4,2
Пируваткарбоксилаза 2,2 2,9
Пируватсинтаза 2,8 —
2-оксоглутаратсинтаза 2,6 —
"Malic-фермент" 3,9 4,3
миксотрофных условиях в присутствии сульфида и ацетата активность этих ферментов выше, чем в автотрофных. Это может быть связано как с ассимиляцией ФЕП, образуемого в цикле Кальвина, так и с ассимиляцией пирувата, синтезируемого из ацетата в пируватсштгазной реакции (Берг и др., 2005). ФЕП-карбоксилаза и ФЕП-карбокситрансфосфорилаза карбоксилируют ФЕП, а ФЕП-карбоксикиназа in vivo, как правило, осуществляет декарбоксилирование оксалоацетата (табл.13; Lea et al., 2001).
Оксалоацетат, образующийся в результате реакций карбоксилирования (табл.13) метаболизируется через реакции ЦГК. Все ферменты этого цикла, за исключением 2-оксоглутаратдегидрогеназы, были обнаружены в экстрактах клеток O.trichoides DG6, выросших в миксотрофных условиях (табл.14). Не было показано также активности ключевого фермента глиоксилатного шунта - изоцитратлиазы. Отсутствие полного ЦТК и глиоксилатного шунта объясняет неспособность бактерии расти в фотогетеротрофных условиях с одними органическими субстратами в качестве доноров электронов. Ацетат стимулирует фиксацшо |4С-бикарбоната клетками O.trichoides, что свидетельствует об участии ацетата в этом процессе через его карбоксилирование с участием пируватсинтазы, ФЕП-карбоксилазы (табл. 13) и 2-оксоглутаратсинтазы (Берг и др., 2005) в следующей
Таблица 14. Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного шунта (нмоль/мин-мг белка) в
клетках О. trichoides DG6, выросших в миксотрофных условиях на среде с ацетатом.
Фермент нмоль/мин'мг белка
Ацетил-КоА-синтетаза 78,2
Цитратсинтаза 11,6
Аконитатгидратаза 63,8
Изоцитратдегидрогеназа 34,4
2-Оксоглутаратдегидрогеназа н.о.
Сукцинатдегидрогеназа 11,2
Фумаратгидратаза 200,9
Малатдегидрогеназа 173,3
Изоцитратлиаза н.о.
Малатсинтаза 15,2
последовательности реакций, показанной также (рис.4) у Е.зкаро$кткочи\ ацетил-КоА (+С02) -» пируват -> ФЕП(+С02) —> оксалоацетат —» малат —» фумарат сукцинат -» сукцинил-КоА (+СО2) —> 2-оксоглутарат
Кроме того, ассимиляция ацетата у О.ИсИо1с1ез может происходить с участием основного продукта цикла Кальвина - ФЕП, карбоксилирование которого приводит к образованию оксалоацетата (табл.13). Конденсация оксалоацетата и ацетил-КоА приводит к синтезу цитрата, изоцитрата и 2-оксоглутарата (рис. 11). Участие цикла Кальвина в процессе ассимиляции ацетата подтверждается подавлением цианидом фиксации ацетата (Берг и др., 2005).
Следовательно, в миксотрофных условиях ОЛпскоШея Бвб включает углерод одновременно из двух источников - С02 и органических веществ, а источником энергии и донором электронов являются свет и Нгв. Реакции карбоксилирования ФЕП, пирувата и ацетил-КоА участвуют в ассимиляции ацетата и восполняют пул промежуточных продуктов цикла Кребса, используемых в биосинтетических реакциях (рис. 11).
В автотрофных условиях ОЛпс!ю1с1ез Бвб фиксирует С02 в цикле Кальвина, роль которого в этих условиях возрастает, а неполный ЦТК обеспечивает только биосинтетические потребности (табл, 14, рис. 12). С помощью пируваткиназы и пируват-фосфатдикиназы возможны превращения ФЕП в пируват и обратно, а анаплеротические реакции карбоксилирования ФЕП и пирувата восполняют пул промежуточных продуктов ЦТК (табл. 13; Берг и др., 2005).
Глава 2. Исследование хсмотрофных бактерий.
2.1. Рост бактерий.
Бактерии рода БЫ/оЬасШия способны расти в автотрофных и гетеротрофных условиях. Для создания автотрофных условий к минеральным средам Брайли или Маннинга добавляли закисное железо или элементную серу, или смесь железа и тиосульфата. Миксотрофные условия обеспечивались внесением в минеральную среду глюкозы и/или дрожжевого экстракта в сочетании с закисным железом и/или тиосульфатом или серой. Для создания гетеротрофных условий в среды вносили дрожжевой экстракт и/или глюкозу.
Стабильный рост культур наблюдался только в миксотрофных условиях, когда достигалась максимальная концентрация клеток, минимальное время генерации, равное 24 часам, и максимальная удельная скорость роста - 0,25-0,35 ч"1. В авто- и гетеротрофных условиях рост бактерий продолжался в течение только нескольких пассажей.
Изучение миксотрофного роста сульфобацилл на среде с глюкозой и Ре2+ показало, что в этих условиях урожай клеток и скорость роста (рис.13), а также скорости окисления железа и потребления глюкозы (рис.14), были максимальными. Удельная скорость роста сульфобацилл и А1Ь. Ыегат К1 в миксотрофных условиях в 2 и более раз превосходила скорость автотрофного роста At.felrooxidans ТРВк и достигала значений 0,29, 0,25, 0,24 и 0,28 ч'1 у штаммов 1269, 41, N1 и К1 соответственно. Прирост биомассы связан с использованием глюкозы в качестве источника углерода и энергии. При этом одновременно с ассимиляцией глюкозы происходило окисление Ре2+ со скоростью 2,6,2,8, 2,2, и 0,6 мМ/час культурами 1269, 41, N1 и К1 соответственно (рис. 14). Однако наблюдались различия в способности к использованию органических и неорганических субстратов между сульфобациллами штаммов 1269,41 и А1Ь. Ыегат К1 (рис. 13, 14). Эти бактерии отличались по способности к росту в гетеротрофных условиях. Рост в гетеротрофных условиях был слабым у всех штаммов. Но наименее благоприятны эти
I Цикл V— С02
Фосфоглицорат -*. Серии Глицин ■ Фосфоонолпируват —> Фенилаланин -Пируват —> Алании ¡V »-СОг ?Ацвтил-КоА
Цитрат
\
Изоцитрат
Оксалосукцинат
Аспартат щ -Оксалоацотат
/
Малат Фумарат
е V
Сукцинат \
Сукцинил-КоА ,__
2-Оксоглутарат
I
Глутамат
СОг-
' Рис. 11. Схема начальных этапов метаболизма углерода у 0.1г1ско1с1е$ Бй-б в анаэробных миксотрофных условиях при освещении.
I Цикл у-С02
V Кальвина )
Аспартат
Сорин —Глицин Фенилаланин
-Оксапоацстат
ГЛалат
Фумарат
Сукцинат \
Сукцинип-КоА
Фосфоглицорат Фосфоонолпируват Пируват —ь- Алании
»-СОг 'Ацотил-КоА
Цитрат
\
Изоцитрат
I
Оксалосукцинат
-Л СОг
2-Оксоглутарат Глутамат
Рис. 12. Схема начальных этапов метаболизма углерода у ОлпсЪо{<1е$ Бй-б в анаэробных автотрофных условиях при освещении.
О 10 20 30 40 60
10 2) 30 40
ЦХМ^ЧХЫ
10 20 30 40 60
Рис. 13. Рост бактерий 8л1кгтонЛАс1оох1с1(№, штаммы 1269,41,и/11Ъ. /окгат, штамм К1, в миксо-, гетеро- и автотрофных условиях.
условия для штаммов 1269 и 41. Культура штамма N1 развивалась за счет использования органического вещества быстрее и выдерживала большее число пересевов, подобно Б.аШорЫШй АЬV, который растет в гетеротрофных условиях с меньшим временем генерации и образует большую биомассу, чем ВЛкегтотЩс1оох1(1а.пв (Ыотз Ы а1., 1996). А1Ь. Ыегапя К1 обладал наиболее "гетеротрофным" метаболизмом из всех изученных бактерий, но все же и этот организм оказался не способным к стабильному гетеротрофному росту в отсутствие неорганического источника энергии, как и культура 8.сИзи(/1с1оох1с1ат (теперь А1Ь.сИзи1Ас1оох1с1ат), способная к гетеротрофному росту на глюкозе (Бибопе е1 а1., 1996). В миксотрофных условиях потребление глюкозы из среды штаммом 41 составляло 25%, штаммом 1269 - 35%, штаммом N1 - 45%, штаммом К1 -80% от исходного ее количества в среде (рис.14). В миксотрофных условиях рост штамма
Штамм 1269
100
0 10 20 30 40 Врзмя кугслчоирокшкя, часы
О 10 20 30 40 Время культивирования, часы
Рис. 14. Потребление Ре2+ и глюкозы ЗЛИегто*и1/}с1оохМаш\ штаммы 1269,41, в авто-, миксо-и гетеротрофных условиях роста:
1 - окисленное Ре3+ в автотрофных условиях; 2 - окисленное Ре3* в миксотрофных условиях; 3 - потребление глюкозы в миксотрофных условиях; 4 - потребление глюкозы в гетеротрофных условиях.
41, видимо в большей степени, по сравнению со штаммом 1269 и другими, связан с фиксацией С02. Глюкоза потреблялась штаммом 41 хуже, чем другими штаммами, и в концентрации 0,3 M и более резко тормозила автотрофную ассимиляцию С02 (Вартанян и др., 1990).
При пересеве бактерий из миксотрофных условий в автотрофные (рис.13), уже в первом пассаже значения удельной скорости роста, также как и в гетеротрофных условиях, были низки и составляли 0,03 ч , 0,05 ч"1, 0,07 ч"1 и 0,09 ч"1 у штаммов К1, N1, 1269 и 41 соответственно. Скорость окисления железа была наибольшей у штамма 41 и достигала 1 мМ ч"1; у штамма 1269 - 0,8 мМ ч'1, у штамма N1 - 0,7 мМ ч"1 и у штамма К1 - 0,27 мМ ч"1. При этом бактерии Alb.tolerans Kl оказались не способны к полному окислению закисного железа и в среде оставалось до 80 % от внесенного его количества.
2.2. Фиксация углекислоты клетками.
Лучше всего ассимиляция углекислоты изучена у типового вида S.thermosulfidooxidans 1269т. Независимо от условий роста культур, клетки S.thermosulfidooxidans 1269т интенсивнее фиксировали |4С02 в автотрофных условиях в присутствии закисного железа и тиосульфата и слабее при наличии одного железа или тиосульфата (табл.15). Добавление в опытную среду дрожжевого экстракта (0,02%) в большей или меньшей степени вызывало уменьшение фиксации клетками меченой углекислоты. Включение клетками 14С02 в миксотрофных условиях (в присутствии 0,02% дрожжевого экстракта) в зависимости от условий роста культур (табл.15) составляло около 20% ее фиксации в автотрофных условиях (Fe24' + тиосульфат). В то же время скорость окисления клетками S.thermosulfidooxidans 1269 закисного железа оставалась на одном уровне и почти не зависела от наличия в среде дрожжевого экстракта, а также условий роста культур (Захарчук и др., 1994). Лишь клетки, выросшие в миксотрофных условиях в присутствии дрожжевого экстракта и тиосульфата, окисляли Fe2+ быстрее, чем при наличии в опытной среде одного железа или железа и тиосульфата.
Фиксация С02 клетками штамма 1269, выросшими в миксотрофных условиях, стимулировалась при добавлении в опытную среду с железом глюкозы в концентрации 0,15 и 0,3 мМ и подавлялась при концентрации 1 и 2 мМ (табл.15). Включение клетками |4С02 в присутствии Fe2+ и 0,3 мМ глюкозы составляло около 40% от уровня фиксации в автотрофных условиях (в присутствии железа и тиосульфата). Аналогичные данные о влиянии органических веществ на уровень фиксации 14С02 были получены для S.thermosulfidooxidans 41 (Вартанян и др. 1990) и S.acidophilus ALV (Wood, Kelly, 1983).
Эти и некоторые другие наши данные (Красильникова и др. 1998), позволяют предполагать, что штамм 1269т использует органические вещества прежде всего в процессах биосинтеза, и лучшим источником энергии даже в присутствии органических соединений является двухвалентное железо, тиосульфат или некоторые сульфидные минералы, однако способность к катаболизму органических соединений с получением энергии имеется. Этот вывод согласуется с данными о том, что выход биомассы S.thermosulfidooxidans 1269т и других сульфобацилл в несколько раз выше при их росте в миксотрофных, чем в автотрофных или гетеротрофных условиях (рис. 12).
Таким образом, в миксотрофных условиях клетки сульфобацилл включают углерод из обоих субстратов - из С02 и органических веществ, а источником энергии являются закисное железо, соединения серы и органические вещества.
Таблица 15. Фиксация ИС02 (го.юль/ч°мг белка) клетками S.thermosulfidooxidans 1269т в зависимости от условий выращивания культур.
Опытная среда содержит Условия роста культур
автотрофные микотрофные гетеротрофные
1,00 мМ тиосульфата 0,33 0,22 0,05
0,12 М РеБО.» 0,6S 0,30 0,08
0,12 М Рс304 +1,00 мМ тиосульфата 2,65 1,39 0,58
0,12 М Ре804 + 1,00 мМ тиосульфата + 0,02% др. экстракта 0,49 0,27 0,04
0,12 М Ре304 + 0,02% др. экстракта 0,51 0,19 0,06
0,12 М Ре304 + 0,002% др. экстракта — 0,22 —
0,12 М РеЭ04 +0,15 мМ глюкозы — 0,38 —
0,12 М Ре804 + 0,30 мМ глюкозы — 0,58 —
0,12 М РеБ04 + 1,00 мМ глюкозы — 0,22 —
0,12 М Ре804 + 2,00 мМ глюкозы — 0,14 —
2.3. Активность карбоксилаз.
В экстрактах клеток всех исследованных культур была обнаружена РБФ-карбоксилаза - ключевой фермент цикла Кальвина. Из всех изученных в данной работе организмов S.thermosulfidooxidans, штамм 41, проявлял самую высокую активность этой карбоксилазы (табл. 16). Её максимальная активность -44,6 нмоль С02/мин»мг белка была обнаружена в экстрактах клеток, выращенных в автотрофных условиях в среде с закисным железом и содержанием С02 в газовой фазе, равном атмосферному (0,04 % v/v), причем в присутствии 1 мМ цианида уровень активности РБФК снижался на порядок. В экстрактах клеток S.thermosulfidooxidans, штамм 1269, и S.sibiricus, штамм N1, активность РБФК при автотрофном росте культур достигала значения 10,9 и 12,8 нмоль/мин*мг белка соответственно. Уровень активности данной карбоксилазы у Alb. tolerans Kl был в несколько раз ниже, чем у всех других изученных нами сульфобацилл. Значения активности РБФК у всех исследованных нами бактерий снижались в миксотрофных условиях при внесении в среду культивирования органических веществ. В экстрактах клеток штамма 41, выращенных в присутствии Fe2+ и 0,02% дрожжевого экстракта, активность РБФК составляла 18 нмоль С02/мин»мг белка (табл. 16), достигая 40% от максимальных значений, отмеченных у бактерий, выросших в автотрофных условиях. Однако, при внесении в среду в миксотрофных условиях не дрожжевого экстракта, а 0,05% глюкозы, в клетках культуры штамма 41 сохранялся более высокий уровень активности данной карбоксилазы, равный 31,0 нмоль С02/мин«мг белка.
При росте культур S.thermosulfidooxidans 1269, S.sibiricus N1 и Alb. tolerans Kl в миксотрофных условиях активность РБФК была примерно в 2 раза ниже, чем в автотрофно выросших клетках, и достигала уровня 5,6, 7,0 и 2,1 нмоль/мин«мг белка соответственно. Это объясняет результаты опытов по фиксации 14С02 клетками штамма 1269. Клетки этой культуры, выросшие в автотрофных условиях, начинали фиксировать 14С02 в среде с Fe + и тиосульфатом сразу после начала опыта. Клетки, выросшие в миксотрофных условиях, фиксировали меченую углекислоту лишь после некоторой задержки даже в автотрофных условиях опыта (Захарчук и др., 1994).
В клетках сульфобацилл штаммов 1269, 41 и N1, выросших в гетеротрофных условиях, также выявлена активность РБФ-карбоксилазы (табл.16). Однако в экстрактах клеток Alb. tolerans Kl, выросших в таких условиях, активность РБФК не обнаруживалась
Таблица 16. Активность карбокснлаз (нмоль/мин»мг белка) в клетках сульфобацилл и Alb. tolerans Kl в разных условиях роста, в том числе при обогащении среды 5 об. % С02.
Фермепт Антотрофпые ( Fe") Миксотрофиыс (Fe"+0,02 % дрож. экстр. или + 0,02% глюкозы) Гетеротрофные (0,02 % дрож. экстр, или + 0,02% глюкозы)
1269 41 /COj 5% N1 К1 /СОг 5% 1269 41 N1 К1 /со2 5% 1269 41 N1 К1
РБФ-карбоксилаза 10,4 44,6/ 4,4 12,8 4,3/ 1,3 5,6 18,0 7,0 2,1/ 0,6 1,1 1,5 4,8 и.о.
ФЕП-карбокен-лаза и.о. 8,7/ 0,6 1,8 3,5/ 0,4 11.0. 20,7 0,6 1,5/ 0,6 и.о. 0,2 2,2 и.о.
ФЕП-карбоксн-трансфосфорилаза 1,0 и.о./ и.о. 0,4 3,1/ 0,9 0,8 1I.O. 0,7 0,9/ 0,5 0,7 11.0. 11.0. 1I.O.
ФЕП-карбок-сикиназа и.о. и.о./ и.о. 4,1 0,6/ 0,1 и.о. и.о. И.О. 11.0/ и.о.. 11.0. И.О. и.о. 1I.O.
Пируваткарбокси-лаза и.о. 0,5/ 0,3 0,5 1,4/ 0,8 1I.O. 0,3 9,8 0,5/ 0,1 11,0. 0,2 1,1 И.О.
Пнруввтсинтаза - - - - 0,2 - - - - - -
2-Океоглутарат-сиитаза - - - - 1,7 - - - - - - -
Примечание: /С02 5% означает, что клетки выросли при обогащении среды культивирования С02.
совсем. При культивировании штамма 41 автотрофных условиях на среде с элементной серой и в миксотрофных при замене дрожжевого экстракта на глюкозу, активность РБФ-карбоксилазы резко снижалась до 5 нмоль/мин • мг белка (табл. 16).
В экстрактах клеток всех трех изученных штаммов сульфобацилл - 1269, 41 N1 и штамма К1 выявлены активности некоторых карбоксилаз гетеротрофной фиксации С02 (табл. 16). У S. thermosulßdooxidans 41 наиболее активна ФЕП-карбоксилаза, максимальный уровень которой проявлялся в клетках, растущих в миксотрофных условиях, и понижался в авто- и гетеротрофных. У Alb. tolerans Kl активности ферментов анаплеротической фиксации С02 довольно низкие, максимальны в автотрофных условиях, а в гетеротрофных, в отличие от других штаммов, не выявлялись (табл.16). В экстрактах клеток S.thermosulfldooxidans 1269, выросших в миксотрофных условиях, обнаружены еще две карбоксилазы гетеротрофной фиксаци С02 - пируватсинтаза и 2-оксоглутаратсинтаза.
Было проверено предположение о том, что стабильный автотрофный рост сульфобацилл требует концентраций С02 выше атмосферных из-за недостаточно эффективного механизма поглощения углекислоты (Wood, Kelly, 1984; Clark, Norris, 1996 a,b). Выращивание штамма 41 в автотрофных условиях в присутствии Fc2+ при содержании С02 в газовой фазе 5-10% (v/v) приводило к уменьшению на порядок активности РБФК и ФЕП-карбоксилазы (табл. 16). Дополнительное снабжение газовой фазы СОг ПРИ культивировании штамма К1 также вызывало резкое снижение активности всех обнаруженных карбоксилаз, как в ашочрофных, так и миксотрофных условиях (табл. 16). Сходное понижение специфической активности РБФК при снятии лимитации по С02, наблюдавшееся также у Thiobacillus А2 и T. neapolitanus, вероятно, обусловлено, как и в нашем случае, репрессирующим действием на РБФК фосфоглицсрата, синтезируемого в цикле Кальвина, а также ФЕП (Smith et al., 1980; Tabita, 1988; Романова 1989). Для Alcaligenes eutrophus существует предположение (Im, Friedrich, 1983), согласно которому синтез РБФК индуцируется процессами, генерирующими восстановитель на фоне лимитации углекислотой, а репрессия связана с процессами, приводящим к накоплению
ФЕП. Известно также, что фосфоглицерат и продует окислительного пенгозофосфатного пути разложения углеводов - 6-фосфоглтоконат ингибируют РБФК и некоторые другие карбоксил азы (Tabita, McFadden, 1972; Романова, 19S9; Tabita, 19SS; Shively et al., 1998).
Из полученных данных следует, что синтез РБФК и карбоксилаз анаплеротической фиксации С02 у изученных штаммов умеренно-термофильных ацидофильных бактерий, как и у факультативных автотрофов, зависит от состава среды культивирования. Однако, уровень активности РБФК у сульфобацилл штаммов 1269, 41 и N1, по крайней мере в автотрофных условиях, соответствует значениям, полученным для таких организмов, как Thiobacillus А2 (Smith et al., 1980), Acidiphilium acidophilum (Pronk et al., 1990), Thiomonas intermedius (London, Rittenberg, 1966), Beggiatoa sp. MS-81-6 (Hägen, Nelson, 1996), которые стабильно растут в автотрофных условиях. Следовательно, отсутствие стабильного автотрофиого роста у S.thermosulfidooxidans, штаммы 1269 и 41, а также S.sibiricus, штамм N1, невозможно объяснить низкой активностью РБФК.
2.4. Ферменты углеводного метаболизма.
В клетках S.thermosulfidooxidans, штаммы 1269, 41, и Alb. tolerans, штамм Kl, обнаружены активности ключевых ферментов всех трех путей расщепления Сахаров -гликолитического, окислительного пентозомонофосфатного и пути Энтнера-Дудорова (табл. 17). Лишь у S.sibiricus N1 не обнаружено активностей ключевых ферментов пути Энтнера-Дудорова, как и у S.acidophillus ALV (Wood, Kelly, 1984).
Однако функционирование того или иного пути метаболизма углеводов у изученных бактерий зависит от условий их роста (табл. 17), Одновременное участие всех трех путей в катаболизме глюкозы у этих культур показано только в миксотрофных условиях, как и у Thiobacillus А2 (Smith et al., 1980).
При выращивании клеток всех изученных бактерий в автотрофных условиях отмечалось снижение уровня активностей почти всех ферментов метаболизма глюкозы по сравнению с культурами, выращенными миксотрофно на среде с Fe2+ и органическими соединениями. При автотрофном росте у штамма 1269 синтезируются ферменты лишь пути Энтнера-Дудорова, у A Ib. tolerans Kl - только гликолитического пути, у штамма 41 -путей Энтнера-Дудорова и пенгозофосфатного (табл.17)..
В миксотрофных условиях у S.thermosulfidooxidans, штамм 41, использование глюкозы осуществлялось по гликолитическому и окислительному пентозофосфатному путям (табл.17). Функционирование пути Энтнера-Дудорова видимо ограничено из-за низкой активности ключевого фермента - 2-кето-З-дсзокси-б-фосфоглюконатальдолазы и данный фермент не обнаруживался и при обогащении газовой фазы С02 или ограничении доступа кислорода в среду (табл.18).
Ферменты пути Энтнера-Дудорова максимально активны у штаммов 1269,41 и К1 в миксотрофных и/или гетеротрофных условиях, так же как у Thiobacillus А2 (Smith et al., 1980), и не обнаруживались или проявляли наименьшие активности при росте клеток на минеральной среде, что свидетельствует о преимущественной роли этого пути в клетках, растущих в присутствии органики. Но у S.sibiricus N1 максимальной активности в гетеротрофных условиях достигал ключевой фермент окислительного пенгозофосфатного пути - 6-фосфоглюконатдегидрогеназа. Активность данного фермента у других изучаемых штаммов в гетеротрофных условиях роста не обнаруживалась. Однако рост штамма 41 в гетеротрофных условиях в течение 3-х пересевов (табл.17) также приводил к переключению метаболизма сахара с пути Энтнера-Дудорова на пентозофосфатный путь, при этом функционирование гликолитического пути сохранялось.
Таблица 17. Активность ферментов углеводного метаболизма (нмоль/мин'мг белка) у сульфобацилл штаммов 1269,41, N1 и Alb. tolerans Kl в разных условиях роста.
Фермент Автотрофные ( Fe") Мнксотрофные (FeJ*+0,02 % дрож. экстр, н 0,02% глюкозы) Гетеротрофные (0,02 % дрож. экстр, и 0,02% глюкозы)
1269 41 N1 KI 1269 41 N1 KI 1269 41 N1 К1
Гсксокнназа 9,9 13,8 20,7 5,0 68.0 28,5 42,4 43,5 19,4 5,6 26,7 7,2
Гпижозо-6- фосфатдсгидро- генязп 12,0 13,8 184,7 38,2 188,0 101,2 215,0 143,3 19,1 26,8 312,7 87,6
б-Ф-глюкоиат-дегидрогеназа и.о. 1,5 6,3 и.о. 5,2 4,2 12,1 10,0 и.о. 14,8 26,9 и.о.
б-Фосфоглюко-иатдегидратаза + 2-кето-З-дсзоксм-б-фосфоглгоко-натальдолаза 1,7 1,5 11.0, И.О. 128,0 0,9 и.о. 76,1 11,2 и.о. и.о. 23,9
Фруктозоб-1,6- бисфосфаталъдо- лаза 72,0 424,0 585,2 30,9 464,0 640,0 424,5 705,0 130,0 63,2 542,3 20,8
б-Фосфофрукто-кииаза и.о. 1,0 16,2 1,7 8.7 4,5 46,5 125,2 10,0 5,9 61,5 8,9
Дсгндрогснпзп 3-фосфоглнцсрнно -вого альдегида 20,0 15,4 238,8 135, 135,0 94,6 316,3 183,3 17,3 26,6 423,1 7,3
Ппруваткииаза 8,1 и.о. 25,6 11,2 11,2 10,9 81,8 10,2 20,0 5,6 75,1 и.о.
Примечание: Штамм 41 выращивали в в гетеротрофных условиях в течение 3-х пересевов.
Хотя Alb. tolerans Kl более полно использует органический субстрат и выдерживает большее число пересевов в гетеротрофных условиях, активность ферментов всех трех путей расщепления Сахаров у этой бактерии также обнаружены только в миксотрофных условиях (табл. 17). При автотрофном росте синтезировались лишь ферменты пуги Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, а в гетеротрофных действовал путь Энтнера-Дудорова.
Таким образом, экстракты клеток изученных культур содержали ключевые ферменты всех трех известных путей метаболизма глюкозы. Функционирование всех или того или иного пути метаболизма углеводов у изученных бактерий зависело от условий их роста. Наибольшими возможностями культуры обладали в миксотрофных условиях. Кроме того, значения активностей ряда ферментов определены на уровне, сходном как с факультативно автотрофными бактериями, способными к длительному росту в гетеротрофных условиях (London, Rittenberg, 1966; Smith et al., 1980; Friedrich et al., 1981), так и с некоторыми гетеротрофными организмами (Paavilaainen, 1995).
Нами показано, что выращивание сульфобацилл в миксотрофных условиях при обогащении среды С02 (5 об. % ) вызывает у штаммов 1269 и 41 прекращение работы путей Энтнера-Дудорова и Эмбдена-Мейергофа-Парнаса и действию только пентозофосфатного пути (табл.18). Отсутствие активности у них пируваткиназы при обогащении среды углекислотой приводит, видимо к накоплению в клетках ФЕП, чья репрессорная роль, как уже говорилось, может приводить к подавлению синтеза РБФК.
Изучена также (табл.18) способность сульфобацилл переносить стрессовые нагрузки в виде высоких концентраций Zn2+ (0,8 M) и более высокие, чем оптимальные, концентрации Н* (рН=1,2). В миксотрофных условиях при высоких концентрациях Zn2' скорость роста и выход биомассы уменьшались, хотя клетки продолжали активно
окислять Ре2+, однако через 5-6 пересевов культуры обычно погибали. При рН=1,2 жизнеспособность бактерий сохранялась. Концентрация 7x1* в среде, равная 0,8 М, вызывала снижение активности почти всех ферментов углеводного метаболизма и глюкоза использовалась штаммами 41 и 1269 только по пути Энтнера-Дудорова. При росте в условиях экстремально низких значений рН среды - 1,2 у штаммов 1269 и 41 в миксотрофных условиях глюкоза расщеплялась только по путям Энтнера-Дудорова и Эмбдена-Мейергофа-Парнаса. Следовательно, ухудшение роста сульфобацилл в экстремальных миксотрофных условиях можно объяснить блокированием работы пентозофосфатного пути расщепления Сахаров. Приоритетное значение приобретает в
Таблица 18. Активность ферментов углеводного метаболизма (нмоль/мин'мг белка) у S.thermosulfldooxidans 1269 и 41 в миксотрофных экстремальных условиях роста.
Фермент Условия роста культур
рН 2,0 рН 1,2 С02,5 об. % Zn*\ 0,8М
1269 41 1269 41 1269 41 1269 41
Гексокиназа 68.0 28,6 18,7 4,3 20,4 135,0 16,0 2,2
Глкжозо-б-фосфатдегидрогеназа 188,0 101,2 54,7 21,0 80,7 259,0 100,5 13,3
6-Фосфоглюконатдегидрогеназа 5,2 4,2 и.о. н.о. 1,7 9,2 н.о. 1,7
6-Фосфоглюконатдегидратаза + 2-Кето-3-дезокси-6- фосфоглюконатапьдолаза 128,0 1,9 48,9 20,3 н.о. н.о.' 72,8 6,7
Фрукгозо-1,б-бисфосфатальдолаза 464,0 640,0 18,3 6,1 527,0 585,0 131,0 11,2
б-Фосфофруктокиназа 8.7 4,5 29,3 13,5 4,4 9,5 Н.о. н.о.
Дегидрогеназа 3-фосфо-глицеринового альдегида 135,0 94,6 84,4 24,3 101,7 458,0 138,5 н.о.
Пируваткиназа 11,2 10,9 32,9 2,3 н.о. н.о. 20,2 н.о.
таких условиях путь Энтнера-Дудорова, который, однако, не обеспечивал выживаемость бактерий при концентрации Zn2+ в среде 0,8 М (табл.18).
Следовательно, пентозофосфатный путь играет особую роль в миксотрофном и гетеротрофном метаболизмах изученных хемотрофных бактерий, особенно при обогащении среды СО2, значениях рН=1,2 и концентрациях Zn2+ в среде 0,8 М. Этот путь, полностью окисляя глюкозу без участия ЦТК, компенсирует в процессе ассимиляции Сахаров незамкнутость ЦТК и отсутствие глиоксилатного шунта, обеспечивая восстановителем процессы метаболизма, цикл Кальвина и электронтранспортную систему. Известно, что в окислительном пентозофосфатном цикле происходит полное окисление глюкозы до С02 у цианобактерий, Thiobacillus novellus, T.thioparus, Brucella abortus, Gluconobacter suboxydans, Sulfobacillus acidophilus ALV которые, подобно исследованным нами бактериям рода Sulfobacillus, не обладают полным ЦТК из-за отсутствия у них 2-оксоглутаратдегидрогеназы (Гусев, Никитина, 1979; Wood, Kelly, 1983,1984; Fuchs, 1999).
2.5. Ферменты ЦТК и глиоксилатного шуита.
Результаты исследований показали, что независимо от условий культивирования, у S.thermosulfldooxidans 1269, S.thermosulfldooxidans 41, S.sibiricus N1, как и у облигатных автотрофов, цикл трикарбоновых кислот разомкнут из-за отсутствия 2-оксоглутаратдегидрогеназы (табл. 19). Кроме того, уровни активностей ферментов невысокие в сравнении с активностями аналогичных ферментов у облигатных
гетеротрофов, что позволяет предположить использование реакций цикла преимущественно в биосинтетических процессах, аналогично облигатным автотрофам. При росте в гетеротрофных условиях уровни активностей ферментов, участвующих в начальных этапах цикла, имеют минимальные величины или отсутствуют совсем.
В отличие от перечисленных штаммов, у А1ЬЛо1егат, штамм К1, 2-оксоглутаратдегидрогсназа выявлена во всех условиях роста культуры, следовательно, полное окисление органических соединений происходит у этого организма в результате действия полного ЦТК. Это, вероятно, одна из причин гораздо более эффективного использования данной бактерией органического вещества по сравнению с типичными сульфобациллами. Кроме того, в гетеротрофных условиях у штамма К1, по сравнению с другими изученными штаммами, отмечен максимальный уровень активности большинства ферментов ЦТК (табл.19).
В клетках всех исследованных культур отсутствовала активность одного из ключевых ферментов глиоксилатного шунта - изоцитратлиазы. Следовательно, глиоксилатный шунт, независимо от состава ростовой среды, также не может функционировать, хотя активность второго фермента этого пути - малатсинтазы, проявлялась у всех изучаемых штаммов, независимо от условий культивирования.
Обогащение среды углекислотой в автотрофных условиях роста приводило у штаммов 1269 и 41 к увеличению активности некоторых ферментов ЦТК, что свидетельствует об участии продуктов карбоксилирования, например оксалоацетата, в реакциях этого цикла. Следовательно, основной функцией реакций карбоксилирования ФЕП и пирувата у сульфобацилл, как и у изученных нами фототрофных бактерий, видимо является сопряжение цикла Кальвина и реакций ЦТК (табл.19).
Таким образом, ЦТК у сульфобацилл разомкнут из-за отсутствия 2-оксоглутаратдегидрогеназы и уровни активностей ферментов невысокие по сравнению с
Таблица 19. Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного шунта (нмоль/мин'мг белка) у сульфобацилл штаммов 1269,41, N1 и А1Ь. Мегапз К1 в разных условиях роста.
Фермент Автотрофиые (Ре1*) Миксотрофныс (Ре1*+0,02 % дро-ж. экстр, и 0,02% глюкозы) Гетеротрофные (0,02 % дрож. экстр, и 0,02% глюкозы)
1269 /СО! 5% 41 /СО1 5% N1 К1 /СО1 5% 1269 41 N1 К1 /со2 5% 1269 41 N1 К1
Цитратсин-таза 3,8/ 13,2 13,6/ 17,7 14,4 24,2/ 20,4 32,0 19,8 13,6 41,7/ 18,4 11.0. 8,7 3,8 5,1
Аконитат-гндратаза 7,8 51,6 146,8/ 323,0 11.0. 352,4/ 180,7 43,0 18,8 26,6 405,2/ 214.3 и.о. 17,6 и.о. 153,2
Изоцнтратде -гадрогеиаза 16,0 /28,7 24,4 /14,6 42,8 114,6 /48,5 16,8 55,0 197,3 215,7/ 194,6 1,3 2,2 77,4 122,0
2-Оксоглу-таратдеги-дрогсназа и.о. и.о. и.о. 29,2/ 23/3 н.о. н.о. н.о. 29,5/ 35.7 и.о. н.о. н.о. 8,5
Сукшшатде-пшрогеназа 7,0 /40,0 46,7 /17,2 91,7 91,9/ 141,2 59,2 56,1 38,9 84,4/ 82,0 64,0 55,3 90,6 90,6
Фумпратгид -ратаза 62,0/ 115,0 30,0/ 17,8 76,5 320,3 378,5 166,0 58,2 66,8 132,3/ 277,1 130,0 105,1 22,8 160,3
Малатде-гпдпогеназа 132,0 /38,3 28,9/ 22,5 300,3 250,7 295,6 126,0 50,0 490,1 166,8/ 590.3 38,0 71,0 653,8 151,4
Изоцитрат-лиаза и.о. /и.о. и.о. /н.о и.о. /н.о н.о, /н.о и.о. /н.о и.о. /н.о 11,0, /11.0 11.0. /н.о 11.0. /н.о 11.0. /н.о 11.0/ н.о. и.о. /и, о
Малагсни-таза 11.0. /183 6,4 /5,4 23,1 24,2/ 22,1 6,0 16,4 10,5 15,9/ 20,4 11.0. 9,6 13,5 10,9
активностями аналогичных ферментов у облигатных гетеротрофов, что позволяет предположить использование реакций цикла только в биосинтетических процессах, как это происходит у облигатных автотрофов. Однако даже A lb. tolerans, штамм Kl, для которого существует возможность полного окисления органических веществ в ЦТК, не способен стабильно расти в отсутствие минерального источника энергии.
2.6. Ферменты метаболизма неорганических соединении серы.
Результаты исследований показали, что клетки S.thermosulfidooxidans, штаммы 1269 и 41, содержат ряд ферментов, участвующих в окислении элементной серы и ее неорганических соединений (табл. 20).
На основании наличия и активности ферментов серного метаболизма, анализа промежуточных продуктов метаболизма восстановленных соединений серы у штаммов 1269 и 41 можно полагать, что окисление серных соединений происходит сходным образом с такими автотрофными бактериями, как At.ferrooxidans, Halothiobacillus neapolitanus, T.thioparus, Acidiphilium acidophilus, у которых тетратионат образуется в качестве промежуточного продукта и потребляется как субстрат (Pronk et al., 1990; Kuenen et al., 1993; Suzuki et al., 1994; Kelly et al., 1997). Центральное место в их метаболизме, как и у фототрофных бактерий, принадлежит сульфиту. Окисление сульфита под действием сульфит:цитохром*с-оксидоредуктазы происходит с получением энергии в электрон-транспортной цепи, а наличие АФС-редукгазы делает возможным получение АТФ на субстратном уровне в реакции, катализируемой АТФ-сульфурилазой или АДФ-сульфурилазой (Kappler, Dahl, 2001). Трехкратное увеличение активности АФС-редукгазы у штамма 1269 добавкой в ростовую среду тиосульфата объясняет резкое стимулирование у этого организма скорости фиксации клетками углекислоты (табл. 15) и интенсивности дыхания (табл.21). Нами показано, что суспензии клеток штамма 1269, выросшие в автотрофных условиях с добавлением железа, тетратионата (S-iOß2"), серы (S0) и тиосульфата (S2O32"), могут окислять указанные субстраты с сопоставимыми скоростями. Так в случае окисления тетратионата (50 мкМ), серы (70 мкМ), тиосульфата (100 мкМ) и Fe2+ (10 мМ), скорости дыхания были соответственно равны 270, 150, 290 и 450 нмоль Oj/мг белка/мин. В случае совместного внесения в инкубационную смесь закисного железа (10 мМ) и тиосульфата (100 мкМ) скорость дыхания достигала уровня 640 нмоль 02/мг белка/мин. Стимуляция интенсивности дыхания клеток штамма 1269 при внесении в инкубационную среду вместе с железом и тиосульфата, наряду с увеличением фиксации иС-углекислоты (табл.15), позволяет предположить возможность получения клетками энергии при окислении дополнительного минерального серосодержащего субстрата(ов), образую1цегося(ихся) из тиосульфата - S°, S,t06 и S032'.
Тетратионат, образующийся в результате окисления тиосульфата, в дальнейшем разлагается под действием тетратионатгидролазы, содержащейся в бесклеточных экстрактах как штамма 1269, так и штамма 41, с образованием тиосульфата, серы и, вероятно, сульфата (рис.15) или, возможно, окисляется через политионаты, образующиеся из сульфан-моносульфоновых кислот, до серы и, в конечном счете до сульфата (Pronk et al., 1990). Гидролиз тетратионата смещен в сторону образования серы. Количество сульфата не определяли, так как реакционная смесь содержала 2М сульфата аммония и на фоне такой высокой концентрации образующийся сульфат трудно измерить. На основании полученных данных можно представить схему серного метаболизма у S.thermosulfidooxidans 1269 и 41 (рис. 15).
Таблица 20. Активность ферментов серного метаболизма (нмоль/мин«мг белка) в клетках сульфобацилл штаммов 1269,41 и N1, выросших в мнксотрофпых условиях в присутствии элементной серы или восстановленных соединений серы.
Фермент 1269 41 N1
вЛ'2 6» в" СиРсв^ гпэ РЬЭ РеЛяв
Серадиоксигеназа 2,8 10,5 12,2 0,3 10,9 3,3 1,1 1,5 0,8
Сульфит:цитохром-с-оксидоредуктаза 297,0 166,0 154,0 69,2 10,1 160,1 9,7 66,2 7,6
АФС-редуктаза 56,0 15,9 11,1 20,1 2,2 86,5 18,2 11,7 -
Роданаза 10,0 11,2 4,0 12,3 4,2 13,3 2,9 15,2 3,3
Тиосульфатокисляющий фермент 367,0 85,6 50,3 н.о н.о н.о н.о п.о н.о.
Сера:Ре(Ш)-оксидоредуктаза н.о. н.о. н.о. 11,1 - 9,6 - - -
Сульфит:Ре(Ш)-оксидоредуктаза н.о. н.о п.о 4,1 - 1,3 - -
Рис.15. Схема метаболизма соединений серы у 5. Легто$иЩс1оох1с1ат штаммы 1269 и 41:
1 - тиосульфатокисляющий фермент; 4 - серадиоксигепаза;
2 - роданаза; 5 - сульфит:цитохром-с-оксидоредуктаза;
3 - тетратионатгидролаза; 6 - АФС-редуктаза.
Пути использования неорганических соединений серы у 5. ¡ШНсих N1 в основном подобны таковым у тиобацилл и исследованных в этом отношении сульфобацилл 8. Легто5и^оох1е1ап.ч, штамм 1269, и Легтози^оох'Шапз эиБвр. asporogenesl штамм 41. Однако выявляются и некоторые различия. Так у штаммов 1269 и 41 была определена высокая активность тиосульфатокисляющего фермента, особенно при росте на среде с тиосульфатом, в то время как у штамма N1 тиосульфатредуктаза не обнарулшвалась в клетках, независимо от условий аэрации растущих культур и содержания в среде элементной серы или серосодержащих соединений (табл.20). Отсутствие тиосульфатокисляющего фермента может быть причиной неспособности к росту Б^Лтсю N1 при внесении в среду тиосульфата, в отличие от сульфобацилл штаммов 1269 и 41. С другой стороны, у двух последних организмов не обнаруживалась активность ссра:Ре(И1)-оксидоредукгазы и сульфит:Ре(Ш)-оксидоредуктазы, а Я. яйтсив N1 содержал эти два фермента в клетках, выросших как при сильной аэрации, так и при
ограниченном доступе воздуха. У S. sibirîcus N1 окисление S0 может осуществляться при участии сера:Ре(1П)-оксидоредуктазы, а сульфита - сульфет:Ре(Ш)-оксидоредуктазы. При низкой аэрации оксидное железо, образуемое при окислении Ре2+в процессе роста штамма N1, может служить акцептором электронов, восстанавливаясь до закисного железа при одновременном окислении элементной серы или сульфита. При росте S. sibiricus N1 в микроаэробных условиях наблюдалось выделение сероводорода, что вероятно, связано с восстановлением элементной серы при участии сульфидоксидазы, что показано у At. ferrooxidans (Sugio et al.,1987). При этом сульфид может служить субстратом для сера(сульфит):Ре(Ш)-оксидоредуктазы. В процессе бактериально-химического выщелачивания концентратов сульфидных руд при высокой плотности пульпы и высокой температуре (около 50°С) создаются условия, при которых клетки находятся в условиях недостатка кислорода. Наличие в клетках S. sibiricus N1 ферментов, участвующих в окислении восстановленных соединений серы с Fe3* в качестве акцептора электронов, дает возможность сохранить жизнеспособность и активный рост этих бактерий в таких условиях. На основании полученных данных можно представить схему серного метаболизма у S. sibiricus N1 :
S7".......-> S0-> S032"-» so4
1,4 2,3,5
1- серадиоксигеназа; 2- сульфит:цитохром-с-оксидоредуктаза; 3- АФС-редуктаза; 4-сера:Ре(Ш)-оксидоредуктаза; 5- сульфит:Ре(1П)-оксидоредуктаза.
Элементная сера окисляется до сульфита с участием серооксигеназы и/или cepa:Fe(III)-оксидоредуктазы. Сульфит далее окисляется до сульфата в реакциях, катализируемых сульфитоксидазой и АФС-редуктазой, а также сульфит:Ре(Ш)-оксидоредуктазой. Окисление серы и сульфита под действием сераоксигеназы, сульфитоксидазы и сульфит:Ре(Ш)-оксидоредуктазы происходит с получением энергии в электронтранспорт-ной цепи, тогда как участие АФС-редуктазы связано с субстратным фосфорилированием. Роль роданазы у исследуемых сульфобацилл не совсем ясна. Известно, что роданаза может присутствовать у различных бактерий, независимо от 'того, являются ли они сероокислителями (Kelly et al., 1997).
Таким образом, результатом окисления штаммами сульфобацилл 1269, 41 и N1: элементной серы и восстановленных соединений серы является синтез АТФ, как сопряженный с функционированием ЭТС, так и получаемый на уровне субстратного фосфорилирования в результате действия АФС-редуктазы. Фотосинтезирующая бактерия E.shaposhnikovii, по сравнению с изученными штаммами сульфобацилл, проявляет значительно меньшие возможности окисления восстановленных соединений серы. Так получение у E.shaposhnikovii АТФ в ЭТЦ возможно только за счет действия тиосульфатокисляющего фермента и сульфит:цитохром-с-оксидоредуктазы, а активность АФС-редуктазы, обеспечивающей получение АТФ на уровне субстрата, у этой бактерии не обнаружена совсем (Ивановский, 1986).
2.7. Содержание в клетках АТФ и интенсивность дыхания бактерий.
Для выяснения возможных причин ограниченного роста сульфобацилл и Alb. tolerans Kl в автотрофных и гетеротрофных условиях роста исследовано содержание АТФ в клетках и интенсивности их дыхания в разных условиях культивирования на фоне некоторых параметров роста (табл.21).
Полученные данные подтвердили, что миксотрофные условия оптимальны для роста этих микроорганизмов (табл.21). У штаммов 1269 и N1 максимальное содержание в
клетках белка, АТФ и достаточно высокая интенсивность дыхания наблюдались в миксотрофных условиях (рис. 16 А), причем добавление глюкозы на фоне других компонентов значительно стимулировало скорость дыхания клеток. По сравнению с миксотрофными, в гетеротрофных условиях урожай клеток штаммов 1269т и N1 уменьшался, пул АТФ резко падал до минимальных значений. Одна глюкоза очень слабо, особенно у штамма 1269т, стимулировала дыхание клеток в гетеротрофных условиях. Однако максимальные значения скоростей дыхания и минимальные пулы АТФ в клетках штаммов 1269Т и N1 обнаружены в автотрофных условиях в присутствии Ре2+ и железа с тиосульфатом (табл.21).
Бактерии гкегтоШегапя Кг1 максимальные урожай клеток и пул АТФ также показали в миксотрофных условиях на среде с глюкозой, дрожжевым экстрактом и
300 я 250-
S 200Г*
150'
Еслсж
--^Г"......."
т—т
-*-» Глнксоа
| » в-« АТФ
10
S 8 u. "о LU
6 g
5
vo Л u
M
■I
S 10 15 20 25 30 35 40 45 60 Время культивирования, чае
22 -Ь20
S 18 16Л" 14 а п. 12
I Ю
1 В а В
§ 4 ш
Ш 2
о
У_
/Y______I
V^-'ч. атф
о 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Вре?ля культивдрощкия, чзсы
Рис. 16. Урожай клеток, окисление Fe2+, ассимиляция глюкозы и внутриклеточный пул АТФ у S.thermosulfldooxidans 1269 при росте в миксотрофных (А) и автотрофных (Б) условиях.
железом. В гетеротрофных условиях на глюкозе и, особенно в автотрофных условиях роста, количество белка и АТФ в клетках значительно уменьшались (табл.21).
У Alb. tolerans Kl максимальный урожай клеток и максимальное содержание АТФ в клетках также наблюдали в миксотрофных условиях, а в гетеротрофных и автотрофных как урожай клеток, так и пул АТФ значительно уменьшались (табл.21).
При культивировании в автотрофных условиях у всех бактерий - штаммов 1269 (рис.16 Б), N1, Krl и К1 при полном окислении закисного железа и максимально высотах скоростях дыхания отмечен небольшой, по сравнению с миксотрофными и гетеротрофными условиями, урожай клеток и очень низкий для прокариот максимальный пул АТФ - от 0,03 у N1 до 0,30 у Krl нмоль/мг белка. У облигатного автотрофа At.ferrooxidans TFBk при автотрофном росте на среде с Fe2+ максимальный пул АТФ (табл.21) составляет 17,00 нмоль/мг белка, что соответствует многочисленным литературным данным о содержании АТФ в клетках бактерий в интервале от 1-2 до 20-25 нмоль/мг белка (Stouthamer, 1973; Иванов, 1981; Кахру, 1986; Фрунджян и др. 1999).
Изучение изменения пула АТФ, клеточного урожая, окисления железа и глюкозы во времени показало, что, как правило, максимальный пул АТФ в клетках всех изучаемых культур бактерий в миксо- и автотрофных условиях наблюдался в экспоненциальной фазе роста в результате активного окисления энергетического субстрата — железа и/или
Таблица 21. Максимальные параметры роста S.thenr.osulßdooxidans 1269т, 5. sibiricusNl, Alb. talerans К1т S. thermotolerans Krl и Atferrooxidans TFBk в разных условиях культивирования.
Условия культпвпроваппя Белок, мкг/мл АТФ, нм/мг белка % окис-лепного Fe» % использованной глюкозы Дыхание, пм/мин*мг белка
S.thennosulfidooxidans 1269
Мнксотрофпые с Fe2', др.экстр., SjOj 20,0 8,00 100,0 — 316,3
Миксотрофные с Fe", др.экстр., S2O3, глюк. 22,5 7,40 100,0 35,0 460,3
Гетеротрофные с глюк., дрлкстр., 12,6 0,45 20,0 12,5
Автотрофные с S2O3 6,5 0,03 — 290,3
Автотрофные с FoJ+ 8,8 0,07 90,0 — 450,0
Автотрофные с Fe", S2Oj 10,2 0,08 90,0 — 640,0
S. sibirlcus N1
Миксотрофные с Fe", др.экстр. 20,0 1,60 — — 286,7
Миксотрофные с Fe3*', др.экстр, глюк. 21,0 4,40 95,0 45,0 676,2
Гетеротрофные с др. экстр. 11,7 0,50 — 43,8
Гетеротрофные с глюк. 13,5 0,70 40,0 46,9
Автотрофные с Fe2* 3,0 0,03 80,0 572,7
Автотрофные с SjOj — — — 120,7
Автотрофные с Fe", S2O3 3,6 0,22 80,0 603,7
Alb. tolerans Kl
Миксотрофные с Feï+, S203, глюк., др.экстр. 38,7 0,63 20,0 80,0 257,0
Гетеротрофные с др.экстр. 10,0 0,10 — 44,6
Гетеротрофные с глюк., др.экстр. 14,0 0,16 60,0 58,6
Автотрофные с Fc,+, SjOj 7,5 0,05 20,0 115,0
S. thermotolerans Krl
Мнксотрофпые с глюк., др.экстр., Feï+ 32,1 3,84 100,0 45,0 —
Гетеротрофные с глюк., др.экстр. 21,0 2,20 35,0 —
Автотрофные с Fc", S2O3 6,3 0,30 90,0 —
Atferrooxidans TFBk
Автотрофные с Fe2+, 1 6,2 17,00 100,0 -
глюкозы. Затем, в процессе перехода в стационарную фазу роста пул АТФ резко уменьшался (рис. 16 А, Б).
При автотрофном росте на среде с Fe2+ у облигатного автотрофа At.ferrooxidans TFBk максимальный пул АТФ - 17 нмоль/мг белка также отмечен в конце экспоненциальной фазы роста (20 часов культивирования), когда основная часть железа была окислена (табл.21). Затем, к началу стационарной фазы, содержание АТФ в клетках снижалось до 13,0 нмоль/мг белка и к 35 часу составляло около 4,0 нмоль/мг белка
Таким образом, результаты определения уровня АТФ в клетках показали, что при росте в автотрофных и гетеротрофных условиях сульфобациллы и, видимо, также Alb. tolerans Kl, испытывают нехватку энергии в форме АТФ.
В гетеротрофных условиях низкие интенсивность дыхания клеток сульфобацилл и скорости синтеза АТФ, сопряженного с дыхательным электронным транспортом, можно объяснить тем, что окисление Сахаров осуществляется из-за разорванности ЦТК и отсутствия глиоксилатного шунта только на субстратном уровне. Отсутствие стабильного гетеротрофного роста у Alb. tolerans Kl, имеющего полный ЦТК, показывает, что это может быть связано с отсутствием соответствующих транспортных систем для Сахаров,
что показано для облигатных автотрофов (Wood et al., 2004). Однако, более вероятной причиной нестабильности гетеротрофного роста является то, что в гетеротрофных условиях скорость синтеза АТФ в дыхательной ЭТС низка, а активизация процессов транспорта органических соединений в клетки требует затрат энергии, как это показано у ряда бактерий и цианобактерий, в частности у Sulfobacillus acidophillus ALV (Wood, Kelly, 1984). И тс небольшие количества АТФ, которые запасаются клетками на субстратном уровне и в дыхательной системе, вынуждены расходоваться прежде всего на процессы поддержания жизнедеятельности, а на процессы транспорта энергии недостаточно. В результате гетеротрофный рост культур прекращается. Об энергозависимости транспорта глюкозы в клетки сульфобацилл свидетельствуют, прежде всего данные о стабильности лишь миксотрофного роста этих бактерий, а также значительная стимуляция дыхания клеток глюкозой только на фоне присутствия в среде неорганических источников энергии, т.е. в миксотрофных условиях (табл.21). Мы предполагали также, что у сульфобацилл возможно ингибирование гетеротрофного роста неполностью окисленнными продуктами углеродного обмена, но это предположение не подтведилось экспериментально — в кулыуральной жидкости штаммов 41 и 1269, выросших па глюкозе, обнаружено только незначительное количество пирувата (0,2-2,0 мкмоль/л) и следы ацетата.
2.8. Цитохромы сульфобацилл.
Компоненты электронтранспортной цепи у сульфобацилл не изучали совсем. Нами исследован цигохромный состав клеток типового штамма S.thermosulfidooxidans 1269 и двух штаммов S.sibiricus - N1 и OSSO. Спектральным анализом установлено, что мембраны S. thermosulfldooxidans 1269, S.sibiricus OSSO и S.sibiricus N1 выращенных в миксотрофных условиях содержат цитохромы Ь- и а-типа.
На разностном спектре (восстановление дитионитом натрия минус окисление персульфатом аммония) поглощения мембран S.themosulfidooxidans 1269 максимумы при 561 и 432 нм соответствуют а- и у-полосам цитохрома Ь, а максимумы при 605 и 442 нм указывают на присутствие цитохрома с гемом типа А (рис.17 А). Разностный спектр поглощения мембран S.sibiricus OSSO имеет максимумы при 563 и 533 нм, соответствующие а- и ß-полосам цитохрома Ь. Максимумы поглощения при 603 и 444 нм принадлежат оксидазе а-типа (рис.17 Б). В мембранной фракции S.sibiricus N1 обнаружены цитохромы Ъ (максимумы при 559 и 429 нм, плечо при 563 нм) и цитохром а-типа (максимум при 603 нм, плечо при 442 нм) (рис.18).
С помощью ДСН-электрофореза в ПААГ с последующей окраской на гем 3,3',5,5 '-тетраметилбензидином в растворимой фракции S.sibiricus N1 обнаружен цитохром с. Поскольку только гем с связан с белком ковалентно, при электрофорезе в денатурирующих условиях (ДСН-электрофорез) он является единственным недиссоциирующим гемом, который мигрирует вместе с полипептидами. Растворимая фракция S. sibiricus N1 окрашивалась на гем в денатурирующих условиях, что указывает на присутствие в ней цитохрома с (рис.19).
Определено содержание (нмоль/мг белка мембран) цитохромов в мембранах клеток S. thermosulfldooxidans ВКМ В-1269, S. sibiricus OSSO и S. sibiricus N1 при росте в миксотрофных условиях (табл.22). Показано, что содержание цитохрома 6 в 2 раза превышает количество цитохрома а в мембранах клеток S. thermosulfldooxidans 1269 и S. sibiricus N1. В мембранах S. sibiricus OSSO цитохромы b и а содержатся примерно в равном соотношении, Из изученных штаммов максимальное количество цитохрома b (1,44 нмоль/мг белка мембран) обнаружено в мембранах S. thermosulfldooxidans ВКМ В-1269, а цитохрома а — в мембранах sibiricus OSSO (1,58 нмоль/мг-белка мембран).
Б б»
Длина волны, им
Рнс.17. Разностный спектр поглощения (восстановление дитионитом натрия минус окисление персульфатом аммония) мембран & Шето5и1/^оох1(1ат 1269 (А) и £ ¡¡ЬМсия ОЭЗО (Б),
Рис.18.. Разностный спектр поглощения Рис.19. ДСН-электрофорез:
мембран 5. $1Ыпси$ N1. 1 - цитохром с сердца лошади;
2 - растворимая фракция 5. Я1Ыпсш N1
Таблица 22. Содержание цитохромов в мембранах клеток&1Негто5и1Ас1оох1с1шк ВКМ В-1269, 5. я/ЬМсив ОБвО и £ ¿7Ыпсю N1 (нмоль/мг белка мембран) при роете в миксотрофных условиях.
Вид, штамм Цитохром b Цитохром aa3
S. thermosulfidooxidans 1269 1,44 0,67
S. sibiricus OSSO 1,18 1,58
S. sibiricus N1 0,83 0,43
У сульфобацилл при окислении ими восстановленных соединений серы и Ре2+, начальными акцепторами электронов, в соответствии с окислительно-восстановительным потенциалом этих субстратов, MOiyr служить только цитохромы b или с. Следовательно, электронтрансноргная система у этих бактерий, как и у большинства хемолитотрофов, является укороченной и электроны могут проходить на пути к кислороду только через две или даже одну протонтранслоцирующие петли, От цитохромов перенос электронов идет далее в двух противоположных направлениях - по термодинамическому потенциалу для запасания энергии в форме транемембранного протонного электрохимического потенциала и АТФ и против термодинамического потенциала для образования НАД(Ф)Н2, используемого при фиксации С02.
Механизм окисления сульфобациллами Fe2+ видимо имеет- сходство с механизмом, показанным для At.ferrooxidans. У S.sibiricus N1, как и At.ferrooxidans, P. denitiïficcms, S.acidophilus ALV и других бактерий (Fersht, 1985; Barr et al., 1990; Blake et al., 1993; Wakai et al., 2004; Rawlings, 2005) транспорт электронов к кислороду при росте в миксотрофных условиях в присутствии Fe2+ может осуществляться также с помощью оксидазы аа3-типа (цитохром с оксидаза аа}). В отличие от облигатного автотрофа At.ferrooxidans, стабильно растущего на среде с Fe2+, отсутствие устойчивогр. автотрофного роста сульфобацилл можно объяснить особенностями структуры их дыхательных цепей, изучение которых начато нами.
На основании полученных данных можно предложить (на примере S.thermosulfidooxidans 41) схемы начальных этапов метаболизма углерода у'сульфобацилл при росте в разных условиях. В автотрофных условиях (рис.20) углеродный метаболизм S.thermosulfidooxidans 41 включает цикл Кальвина, реакции карбоксилирования продуктов цикла Кальвина - ФЕП и пирувата, а также неполный ЦТК, который обеспечивает только биосинтетические потребности. Основной причиной нестабильного роста сульфобацилл и Alb. tolerans Kl в автотрофных условиях, как уже говорилось, является нехватка энергии и восстановителя, получаемых в результате окисления двухвалентного железа и/или восстановленных соединений серы и необходимых для работы цикла Кальвина и биосинтетических процессов.
В миксотрофных условиях (рис.21) углекислота фиксируется бактериями в цикле Кальвина и в реакциях анаплеротической фиксации СО 2 на ФЕП и пирувате. Последние необходимы для восполнения пула промежуточных продуктов цикла Кребса, используемых в биосинтетических реакциях. ЦТК разомкнут, работает в виде "подковы" двух противоположных направлениях, и расщепление Сахаров обеспечивает только биосинтетические потребности, снабжение углеродом, но не получение энергии. Транспорт глюкозы в клетки в миксотрофных условиях обеспечивается окислением неорганического источника энергии. В результате ассимиляции этой глюкозы по пентозофосфатному пути, об особой роли которого уже говорилось (табл. 17,18), бактерии получают энергию при использовании двух источников - неорганического и органического. Это позволяет им обеспечить себя энергией и восстановителем для фиксации С02 в цикле Кальвина, биосинтетических процессов и функционирования ЭТЦ.
Фумарат
\
Сукцинат
I
Порфирины
С02 2-Оксоп1уп>рат
I
Глутамат
Рис. 20. Схема начальных этапов метаболизма углерода у Ж Легтош1А^ох1(1ап5 БиЬэр, сирого^еле«, штамм 41, при росте в автотрофных условиях..
ГЛЮКОЗА
этс
Глюкозо-6-ф Пен:озофосф.(( ьви)
• Фосфоглицерат —*■ Серии
Гликолиз
. Фосфоенолпируват—V Фонилаланин
-Пируват —»- Алании СОг
/Ацотип-КоА -<-Ацетат
Глицин
Аспартат
СОг 2-Оксоглутарат
Глутамат
Рис. 21. Схема начальных этапов метаболизма углерода у & (/¡егтохи/^оохШап! БиЪвр. asporogenes, штамм 41, при росте в миксотрофных условиях.
В гетеротрофных условиях (рис.22) при отсутствии полного ЦТК и глиоксилатного шунта (табл.19) окисление ггаокозы у сульфобацилл осуществляется по путям окислительному пентозофосфатному и Эмбдсна-Мсйсргофа (табл. 17,18). Однако процессы транспорта органических веществ в клетки требуют затрат энергии. А энергия и восстановитель, которые синтезируются в результате окисления глюкозы, видимо обеспечивают лишь процессы поддержания жизнедеятельности клетки, а процессы транспорта субстрата в клетку, биосинтеза и некоторые другие не обеспечиваются и рост сульфобацилл в гетеротрофных условиях нестабильный.
ГЛЮКОЗА
Порфирины Глутамат
Рис. 22. Схема начальных этапов метаболизма углерода у S. thermosulfldooxidans subsp. asporogenes, штамм 41, при росте в гетеротрофных условиях.
2.9. Изменение таксономического статуса "S,thermosulfldooxidans subsp. thermotolerans", штамм Kl.
"Sulfobacillus thermosulfldooxidans subsp. thermotolerans" штамм Kl был описан в 1983 г. и отнесен к роду Sulfobacillus (Коваленко, Малахова 1983). При характеристике штамма К1 его сравнивали с единственным известным представителем рода -S.thermosulfidooxidans 1269т. Как и бактерии типового штамма, новый организм являлся грамположительной спорообразующей бактерией, способной к окислению сульфидных минералов, S0 и Fe2+. Однако по мере накопления данных по морфологии, биохимии, цитологии, физиологии, биохимии, хемотаксономии и геносистематике стало очевидным, что статус подвида термотолерантного организма не соответствует действительности.
Организм существенно отличается от вида S. thermosulfldooxidans 1269т следующими характеристиками: ббльшими размерами клеток, овальными спорами, имеющими покровы сложного строения (Богданова и др., 1990), особенностями строения цитоплазмагической мембраны, температурным оптимумом роста, более широким спектром используемых органических субстратов (Коваленко, Малахова, 1983),
присутствием в мембране ш-алициклическпх жирных кислот во всех условиях роста (Цаплина и др., 1994).
Штамм К1 отличается от других изученных бактерий рода БиуЬЬасШш в гетеротрофных условиях более стабильным ростом, урожаем клеток и скоростью роста (рис.13), более высокой активностью ферментов метаболизма углеводов (табл. 17) и более полным использованием органического вещества, вероятно, за счет функционирования замкнутого ЦТК, в то время как у всех других известных представителей сульфобацилл ЦТК разомкнут из-за отсутствия активности 2-оксоглутаратдегидрогеназы (табл. 19). С другой стороны, штамм К1 в меньшей степени окисляет минеральные субстраты и значительно слабее растет в автотрофных условиях, чем штаммы 1269, 41 и N1. Только у штамма К1 в гетеротрофных условиях не функционирует цикл Кальвина (табл. 16).
По мере накопления других знаний о разнообразии организмов семейства АНсусЬЬасШасеае стало очевидным, что в роде АИсус1оЬасШ1® существует группа бактерий, занимающая не только по своим фенотипическим свойствам, но и по филогенетическим характеристикам как бы промежуточное положение между типичными сульфобациллами и алициклобациллами. Такие свойства, как наличие полного ЦТК, высокая активность ферментов расщепления Сахаров, отсутствие ключевого фермента цикла Кальвина - РБФ-карбоксилазы при гетеротрофном росте сближают штамм К1 с настоящими гетеротрофами, в том числе и с бактериями рода АИсус1оЬасШиз.
Кроме того, штамм К1 характеризуется отсутствием внутривидовой гомологии ДНК. Сравнительный анализ числа и размера рестриктных фрагментов хромосомной ДНК штаммов К1 и 1269т, проведенный методом пульс-электрофореза (Кондратьева и др., 1998), а также низкий уровень сходства 168 рРНК этих бактерий, равный 87,7% (Каравайко и др., 2000), свидетельствуют об отсутствии внутривидового сходства этих культур. В то же время высокий уровень сходства последовательностей нуклеотидов гена 16Б рРНК изучаемого штамма К1 и неидентифицированных штаммов, предварительно отнесённых к роду АИсус1оЬасШш, равный 97,4-99,6%, говорит о том, что это бактерии одного вида. На основании всех изложенных данных штамм К1 переклассифицирован и отнесен к роду АИсус1оЬасШш как новый вид рода - АИсуЫоЬасШт Ыегат вр.поу. К1т (КатауаНсо й а1., 2005).
Глава 3. Бнотехнологнчсскин потенциал фототрофных и хсмотрофных бактерий, обладающих свойством миксотрофии.
Выщелачивание металлов из руд и концентратов происходит в результате деятельности хемолитотрофных микроорганизмов, способных окислять серу, Бе2+, сульфидные и другие минералы. Сообщества, состоящие из представителей родов ЛЫсШЫоЬасШия, БЫ/оЬасШш, РсггорЫъта, Ьер1озрт\Ыт уже используются для промышленного выщелачивания золото-арсенопиритных концентратов (Каравайко и др. 2000; Каравайко, 2005). Ведутся испытания ассоциаций микроорганизмов, состоящих из сульфобацилл, А^еггоохШат, АиЫоохгсЬхгя и Ь./еггоох1с!ат для извлечения золота из золото-мышьяковых концентратов и металлов из медно-цинково-пиритного концетрата (Седельникова и др.2005; Фомченко и др., 2005).
В процессе исследования физиологических и биохимических свойств сульфобацилл нами был изучен и биотехнологический потенциал этих бактерий. В таблице 23 представлены сравнительные результаты скоростей роста и времени генерации у нескольких видов и штаммов сульфобацилл, а также А^еггооххйат и Реггор1аша аЫсИрИИит. Минимальное время генерации у 1}кгтови1^оох1йапв $иЬБр. азрого§епе$ 41, 5. ¡¡Ыпаа N1 и других сульфобацилл в 3 и более раз меньше того, что наблюдается у штаммов А$еггоох1с1а№ и Р. аЫсИрИИит (табл.23). Скорость роста сульфобацилл на среде
Таблица 23. Скорости роста и время генерации разных видов и штаммов бактерий рода 8и1/оЬасШю и других хемотрофных бактерий, участвующих в процессах биовыщелачивания.
Организм, штамм Минимальное время генерации, ч Максимальная скорость роста, ч"1 Оптимальная температура роста (пределы)
S.themosulfldooxidans 1269' 2,5 - Ре(1Г) 0,30 - Ре(11) 50°С (20-58°С)
S.thermosulfidooxidans 41 1,9 -Ре(И) 0,37-Ре(П) 50°С (20-60°С)
S. sibiricus N1 1,3 — Ре(11> 0,50 -Ре(11) 55°С (20-60°С)
S.thermotolerans Krl 2,0 - Ре(11) 1,8-8° 0,35-Ре(Н) 0,40-8° 40°С (12-60°С)
S. acidophilus NAL' 3,5-Ре(П) 0,20 - (Ре(И) 50°С (20-55°С)
At.ferrooxidans TFL2 TFO TFN-d 4,7 - Ре(П) 11,7-8° 20,4-РеЭг 0,15-Ре(11) 0,06-8° 0,034 -РеЭг 30°С (10-40°С) 30°С (15-40°С) 30°С (10-40°С)
Ferroplasma acidiphilum Y-2 23,0-РеШ 0,02-Ре(П) 35°С (15-45°С)
Примечание: время генерации и скорость роста определялась при росте в миксотрофных условиях в присутствии 0,02 % глюкозы и 0,02 % дрожжевого экстракта.
с Ре(П) соответственно также в 2-3 раза выше, чем у лучших штаммов At.ferrooxidcms. Скорость роста на минеральной среде с серой у Б.ЛегтоШегат Кг1 в 6-7 раз превосходит скорость Atferrooxidans ТТО. При этом сульфобациллы обладают очень широким температурным диапазоном роста и показали высокую скорость роста при температурах до 60°С с оптимумом у большинства из них при 50°С (табл.23).
■ Показательны в плане биотехнологического потенциала сульфобацилл наши данные скоростей окисления Ре2+, Б0 и пирита сульфобациллами в сравнении с At.ferrooxidans. Так у S.thermosulfldooxidans эиЬзр. а$рого%епе$ 41 скорость окисления Ре2+ при температуре 50°С составляла 17,5 мМ/час, в то время как у лучшего штамма А1./еггоохМат ТТЫ-с! только 3,6 мМ/час. Скорость окисления пирита, определяемая по накоплению в среде ионов Ие3* и БОД у 5. зШЫсш Б1 и S.thermosulfidooxidans зиЬэр. asporogcn.es 41 от 2 до 4 раз выше, чем у At.ferrooxidans. Не уступают сульфобациллы At.ferrooxidans также в скорости окисления серы (Цаплина и др. 2005).
Одним из перспективных для применения является £ thermosulfldooxidans эиЬзр, дярого^епм 41 (Захарчук и др. 2004, 2005). Штамм 41 способен расти при концентрации Ъг?* до 0,8 М, значении рН=1,2, содержании С02 в среде 5 об.%, температуре 50°С. При этом бактерия обладает более высокой окислительной активностью в отношении серы, Ре2-1, сульфидных минералов, чем другие ацидофильные бактерии. В периодических условиях штамм 41 способен окислять в течение 10 часов до 10 г/литр Ре2+ в условиях лимитации по органическим соединениям. В экстремальных условиях у штамма 41 сохраняется активность ключевых ферментов углеводного метаболизма (табл. 17,18). Все это, в сочетании со способностью штамма 41 к миксотрофии и использованию разных чипов энергетического метаболизма, может способствовать адаптации к изменчивым условиям технологического процесса. Однако известно, что созданные в лабораторных условиях ассоциации хемотрофных организмов очень трудно адаптируются к условиям биовыщелачивания, например плотности пульпы, перепадам температуры, элементам минерального питания и т.д., поэтому для технологической оценки функционирования штамма 41 и других сульфобацилл в составе ассоциаций требуется еще длительная работа.
Пурпурные серные бактерии являются хорошими окислителями сероводорода и других восстановленных соединений серы. Нами изучены возможности ЕлЬарозкткоуи окислять сероводород в разных условиях с целью разработки методов очистки сточных вод от этого токсичного соединения и органических загрязнений. Область оптимальных
концентраций Na2S для роста Kshaposhni&ovü в анаэробных автотрофных и миксотрофных условиях на свету составляла 4,0-5,5 мМ при миксотрофном росте и 5,5-7,5 мМ при автотрофном. Более высокие концентрации сульфида являются токсичными и ингибируют рост бактерии. Максимальные скорости окисления S"' миксотрофными и автотрофными клетками оказались близкими и составляли 4,4 и 4,7 ммоль S274ac мг белка соответственно. Изучено влияние на окисление сульфида клетками E.shaposhnikovii разных органических веществ, в том числе ксенобиотиков - нафталина, тиомочевины, формиата, ацетата, лактата и других, которые наряду с H2S могут находиться в сточных водах. Присутствие в среде органических кислот и некоторых других органических веществ приводило к замедлению скорости окисления клетками сульфида на 10-80 %, более выраженному у миксотрофно выросших клеток. Максимальная скорость окисления сульфида была достигнута при использовании клеток, выросших в фотоавтотрофных условиях в присутствии Na2S. Однако клетки из культур, выросших в присутствии ацетата или других органических соединений, более эффективно утилизировали органические субстраты и могут оказаться перспективными для одновременной очистки стоков от сероводорода и органических соединений. Важно то, что высокая скорость окисления клетками сульфида сохранялась в присутствии органических соединений разной химической природы, часто обнаруживаемых в сточных водах различных производств.
Оптимизация процессов очистки промышленных сточных вод в настоящее время считается возможной лишь при работе с иммобилизованными клетками, так как они стабильнее, дольше сохраняют свою активность, их состояние легче контролировать, а реакции, катализируемые такими клетками, могут идти без перерыва длительное время. Нами показано, что окисление Ii2S клетками E.shaposhnikovii иммобилизованными в каррагинане, алюмоборосиликатном волокне и агаре носило светозависимый характер, как и окисление сероводорода свободными клетками и скорость его была в 3-5 раз выше скорости окисления свободными клетками. Максимальная скорость окисления H2S была получена в опытах с клетками E.shaposhnikovii, иммобилизованными в каррагинане. Высокая скорость окисления сульфида сохранялась даже после трехдневного хранения клеток в каррагинане. Работа по подбору методов иммобилизации клеток может позволить найти более эффективные пути повышения скорости окисления H2S клетками E.shaposhnikovii и разработать схему непрерывного процесса очистки сточных вод от сероводорода и органических загрязнений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
IIa основании полученных данных можно заключить, что миксотрофия оптимальна для роста многих фототрофных и хемотрофных бактерий. В фотомиксотрофных анаэробных условиях E.shaposhnikovii, E.mobilis и Chr. minutissimum одновременно используют два источника углерода - углекислоту и органические соединения и два источника электронов - те же органические соединения и восстановленные соединения серы (рис.4,9). В фотомиксотрофных условиях зеленая нитчатая бактерия O.trichoides DG6 включает углерод также одновременно из С02 и органических веществ, а источником энергии и донором электронов являются свет и H2S. (рис.11). Хемотрофные ацидофильные бактерии штаммов 1269, 41, N1 и К1 в миксотрофных условиях тоже используют одновременно по два источника углерода и энергии (таблЛб,17,18,19; рис 21), причем они способны к стабильному росту только в миксотрофных условиях. При этом все эти организмы способны, благодаря своей чрезвычайной метаболической гибкости, переключаться, иногда только на короткое время (например хемотрофы), на автотрофный или гетеротрофный (кроме O.trichoides DG6) типы питания, что позволяет им сохранять
жизнеспособность в постоянно меняющихся, часто экстремальных условиях внешней среды (рис. 1,8,10,12,20,22).
Следовательно, метаболизм изученных видов бактерий близок к таковому у факультативных аптотрофов, однако миксотрофы обладают более широкими метаболическими возможностями, так как не только способны к автотрофному и/или гетеротрофному росту, но в оптимальных для них миксотрофных условиях в присутствии органических соединений, наряду с их ассимиляцией, продолжают фиксировать С02 в цикле Кальвина и/или в качестве источников энергии (или электронов у фототрофов) одновременно могут использовать неорганическое и органическое соединения.
Миксотрофия позволяет в максимальной степени извлекать углерод и энергию из природных источников, и в то же время, при постоянных изменениях условий углеродного питания, освещения, аэрации и некоторых других факторов, что часто происходит в природе, конкурировать с факультативными автотрофами в их экологических нишах - в автотрофных и/или гетеротрофных условиях.
Полученные данные подтверждают гипотезу, объясняющую феномен миксотрофии у микроорганизмов прежде всего скоростью оборота органических соединений по сравнению с неорганическими в данном местообитании (Schlegel, 1992). Эта гипотеза основана на предположении, что в большинстве сред скорость роста микробной популяции лимитируют уровни источников углерода и энергии и, в конечном счете, регуляция метаболизма углерода как у фототрофов, так и хемотрофов, направлена на то, чтобы максимально обеспечить организм в тех или иных условиях энергией и углеродом. Такой задаче и отвечают схемы углеродного метаболизма исследованных нами бактерий при росте в миксотрофных условиях. У всех организмов они включают определенный набор механизмов и реакций - пути катаболизма гексоз, цикл Кальвина, реакции анаплеротического карбоксилирования ФЕП, пирувата, органических кислот, незамкнутый ЦТК (кроме штамма Kl), а у некоторых и глиоксилатный шунт (пурпурные фототрофные бактерии). Эти механизмы позволяют в результате регуляторных перестроек переходить с миксотрофного на автотрофный или гетеротрофный типы питания и обратно. В миксотрофных условиях у сульфобацилл в результате окисления неорганических источников энергии, согласно нашим данным, происходит активизация процессов транспорта в клетки экзогенных органических соединений, однако разомкнутый ЦТК в отсутствие глиоксилатного шунта обеспечивает в основном биосинтетические потребности клеток, но не получение ими энергии. Отсутствие замкнутого ЦТК и глиоксилатного шунта частично компенсируется функционированием у изученных сульфобацилл лентозофосфатного пути расщепления сахаров, поставляющего восстановитель прямо в цикл Кальвина и дыхательную цепь, однако основную энергетическую нагрузку несут все же неорганические доноры электронов.
О том, что активизация процессов транспорта экзогенных органических соединений у хемотрофных бактерий в миксотрофных условиях требует затрат энергии и облигатно зависит от окисления Fe2+ и неорганических соединений серы, свидетельствует стабильность только миксотрофного роста изученных нами сульфобацилл и Alb. tolerans Kl, а также максимальные в этих условиях урожаи клеток, скорости роста, окисления железа, ассимиляции глюкозы, дыхания (в том числе в присутствии в среде глюкозы), внутриклеточные пулы АТФ (рис. 13,14, 16, табл.21). Следовательно, для потребления органических субстратов штаммам хемотрофных бактерий 1269, 41, N1 и К1 облигатно необходим специфический неорганический источник энергии, поэтому стабильно расти они могут только в миксотрофных условиях. E.shaposhnikovii и E.mobilis обладают способностью стабильно расти в автотрофных и гетеротрофных условиях, но и у них показано, что в оптимальных для их роста фотомиксотрофных условиях скорость
ассимиляции пекоторых органических соединений, например ацетата, возрастает в присутствии тиосульфата или сульфида, а также изменяются пути метаболизма органических субстратов (табл. 6,7, рис.2,3,4).
Бактерии, способные к миксотрофному типу метаболизма, получают преимущество при примерном равенстве скоростей поступления в среду неорганического и органического субстратов с их одновременной лимитацией (Kuenen, 1999), что часто наблюдается в природе в местах обитания исследованных нами бактерий. Если скорость поступления в среду неорганического субстрата значительно превышает скорость поступления органических соединений, то бактерии переходят на автотрофшо. Преобладание в среде органических соединений стимулирует органогетеротрофный тип питания. Показано, что у изученных нами фототрофных бактерий, наряду с составом среды, доминирующее значение для выбора типа питания играют свет и кислород.
Тип метаболизма у миксотрофных бактерий в тех или иных условиях среды устанавливается в результате регуляция потока углерода через цикл Кальвина, ЦТК и глиоксилатный шунт, зависит от энергетического статуса клеток и осуществляется на уровне синтеза и активности карбоксилаз и других ферментов наличием органических и неорганических веществ и некоторых их метаболитов, света, кислорода, СОг, соотношением АТФ/АДФ+АМФ, НАД(Ф)/НАД(Ф)Н, ионами металлов, температурой, значением рН и, возможно, некоторыми другими факторами.
Автотрофшо можно рассматривать как адаптацию к росту в средах, бедных органическими субстратами. Общей причиной, ограничивающей рост исследованных нами фототрофных и хемотрофных бактерий в автотрофных условиях, является их неспособность обеспечить себя энергией. Нами показано, что в автотрофных условиях у сульфобацилл при полном окислении железа в среде и высоких скоростях дыхания клеток обнаружен очень низкий для прокариот внутриклеточный пул АТФ и уровень фиксации С02 клетками (рис.16; табл.15, 21). Можно предположить, что пул АТФ, запасаемый сульфобациллами в автотрофных условиях в процессе окисления железа и восстановленных соединений серы и вынужденный прежде всего использоваться для энергоемких процессов поддержания жизнедеятельности, фиксации углекислоты в цикле Кальвина, обратного переноса электронов в дыхательной цепи, является недостаточным для обеспечения в течение длительного культивирования бактерий и других биохимических механизмов, идущих с затратой энергии - биосинтеза веществ, активации ферментов и т.п. Видимо, причиной неэффективной системы получения энергии в процессе автотрофного роста у сульфобацилл являются особенности их железо- и сероокисляющей систем и дыхательной злектроцтранспортной системы.
Экономия энергии объясняет также общую в автотрофных условиях для большинства изученных нами фототрофов и хемотрофов рода Sulfobacillus схему метаболизма углерода с незамкнутым на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы ЦТК и отсутствием глиоксилатного шунта (рис.1,10,12). Эта схема полностью совпадает со схемой углеродного обмена, типичной для облигатных автотрофов и делающей невозможным энергетически невыгодное окисление продуктов цикла Кальвина в полном ЦТК (Wood et al., 2004). Она позволяет миксотрофам конкурировать с облигатными автотрофами в их экологической нише и избегать летальных или бесполезных для бактерий в этих условиях реакций метаболизма.
Иной, чем у исследованных нами сульфобацилл и фототрофов, является основная причина отсутствия автотрофного роста у Alb. tolerans K1 - бактерии, имеющей в этих условиях полный ЦТК. Окисление органических продуктов, полученных в результате фиксации С02 в цикле Кальвина, с помощью полного ЦТК в автотрофных условиях роста
обычно вызывает гибель клеток в результате их энергетического истощения или так называемого "метаболического суицида" (Schlegel, 1992; Wood et al., 2004).
Отсутствие стабильного гетеротрофного роста сульфобацилл вызвано разорванностью ЦТК и отсутствием глиоксилатного шунта в сочетании с низкими уровнями активности ферментов ЦТК, энергозависимым процессом транспорта в клетку органических соединений и низкой скоростью синтеза АТФ, сопряженного с дыхательным электронным транспортом (табл. 19, 21, рис.16). У Alicyclobacillus tolerans шт. К1т, имеющего полный ЦТК (табл.19), нестабильность гетеротрофного роста также объясняется необходимостью затраты энергии окисления неорганических соединений на активизацию процессов транспорта органических субстратов в клетки (табл. 21).
Выводы
1. Миксотрофия является оптимальным типом метаболизма для роста исследованных видов фототрофных и хемотрофных бактерий. Нами показано, что миксотрофия - это тип питания, близкий к факультативной автотрофии, при котором организмы обладают более широкими, чем факультативные автотрофы, метаболическими возможностями. Они не только способны к автотрофному и/или гетеротрофному росту, но в присутствии в среде органических источников углерода, наряду с их ассимиляцией, одновременно фиксируют С02 в цикле Кальвина и/или в качестве источников энергии (электронов у фототрофов) одновременно используют неорганическое и органическое соединения.
2. Схемы метаболизма углерода изученных фототрофных и хемотрофных бактерий при миксотрофии включают известные пути расщепления Сахаров, цикл Кальвина, реакции карбоксилирования ФЕП, пирувата и органических кислот, незамкнутый ЦТК (кроме Alb. tolerans Kl ), а у некоторых и глиоксилатный шунт (пурпурные фототрофные бактерии). Эти механизмы позволяют в максимальной степени использовать углерод и энергию в природных средах, а в результате регуляторных перестроек быстро переходить на автотрофный или гетеротрофный типы питания.
3. Окислительный пснтозофосфатный путь шрает особую роль в метаболизме миксотрофных хемотрофных бактерий, особенно при обогащении среды С02 и в экстремальных условиях, так как частично компенсирует в процессе ассимиляции Сахаров незамкнутость ЦТК и отсутствие глиоксилатного шунта, обеспечивая восстановителем и энергией цикл Кальвина, электронтранспортную систему, процессы биосинтеза.
4. Отсутствие стабильного автотрофного роста хемотрофных и фототрофных (при наличии 02 на свету и в темноте) бактерий, обладающих свойством миксотрофии, объясняется прежде всего тем, что процессы окисления неорганических доноров электронов не обеспечивают клетки достаточной энергией из-за особенностей их железо-и/или сероокисляющсй систем и неэффективного функционирования дыхательных электронтранспортных цепей. Экономия энергии в автотрофных условиях объясняет также сходную у фототрофов и хемотрофов схему метаболизма углерода с разорванным ЦТК на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы и отсутствием глиоксилатного шунта.
5. Отсутствие стабильного гетеротрофного роста исследованных сульфобацилл объясняется незамкнутосгыо ЦТК и отсутствием глиоксилатного шунта в сочетании с низкой активностью ферментов ЦТК и энергозависимым процессом транспорта в клетки органических соединений. Предпочтение миксотрофного роста изученными видами
хемотрофных и фототрофных бактерий обусловлено тем, что использование ими органических субстратов облигатпо зависит от наличия в среде пеорганических доноров электронов.
6. Окисление элементной серы и ее восстановленных соединений у сульфобацилл S.thermosulfidooxidans 1269,41 и S.sibiricus N1 происходит в результате действия реакций, показанных ранее у автотрофных тиобацилл и ацидитиобацилл и обеспечивающих синтез АТФ, как сопряженный с функционированием элеюронтранспортной системы, так и на уровне субстратного фосфорилирования в результате действия АФС-редуктазы.
7. IIa основании установленных физиолого-биохимических и генотипичсских признаков "S.thermosulßdooxidans subsp. thermotolerans" штамм Kl переклассифицирован и отнесен к роду Alicyclobacillus как вид Alb.tolerans sp. nov. К1т. Результаты изучения этой бактерии позволяют считать дашплй организм промежуточным звеном между сульфобациллами с миксотрофным типом питания и типичными гетеротрофами рода Alicyclobacillus.
8. Свойство миксотрофии у исследованных фототрофных и хемотрофных бактерий может быть использовано для разработки биотехнологических методов очистки окружающей среды (фототрофные бактерии) и биовыщелачивания сульфидных руд (хемотрофные бактерии).
Список работ, опубликованных по теше диссертации.
1. Захарчук Л.М., Ивановский Р.Н. Темновой метаболизм углерода у фототрофной бактерии Ectothiorhodospira shaposhnikovii. //В сб. "Тезисы докл. VII конференции молодых ученых "Проблемы микробиологии и вирусологии". Рига. Из-во "Зинатне". 1977. С. 97-98.
2. Захарчук Л.М., Кондратьева E.H., Фирсов H.H. Метаболизм углерода у Ectothiorhodospira shaposhnikovii на свету и в темноте. //В сб. "Тезисы докл. II Международного симпозиума "Рост микроорганизмов на С|-соединениях"". Пущино. ОНТИ Научного центра биологических исследований АН СССР. 1977. С.138-139.
3. Захарчук JIM. Метаболизм пропионата у Ectothiorhodospira shaposhnikovii на свету и в темноте. //В сб. Тезисы докл. VI съезда ВМО. т.З "Метаболизм микроорганизмов и его регуляция". Рига. Из-во "Зинатне". 1980. С. 39.
4. Захарчук Л.М., Ивановский Р.Н. Использование ацетата и бикарбоната Ectothiorhodospira shaposhnikovii в зависимости от условий роста. II Микробиология. 1980. Т.49. № 1. С.14-19.
5. Красильникова E.H., Захарчук Л.М., Линник Л.М, Рост в темноте Ectothiorhodospira mobilis // Микробиология. 1980. Т.49. № 2. С.244-248.
6. Захарчук Л.М., Ивановский Р.Н., Кондратьева E.H. Метаболизм ацетата у Ectothiorhodospira shaposhnikovii при росте в темноте. // Микробиология. 1980 а. Т.49. № 3. С.383-388.
7. Захарчук Л.М., Кондратьева E.H., Ивановский Р.Н. Метаболизм пропионата у Ectothiorhodospira shaposhnikovii при росте в темноте. // Микробиология. 1980 б. Т.49. № 5. С.669-676.
8. Захарчук Л.М. Образование и активность рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы у пурпурной бактерии Ectothiorhodospira shaposhnikovii. //В сб. "Тезисы докл. IV Республиканской конференции молодых ученых "Проблемы микробиологии и вирусологии". Киев. Из-во "Наукова думка". 1981. С. 114.
9. Исмаилов А.Д., Нетрусов А.И., Захарчук Л.М., Аль-Нури М.А. Периодическое и непрерывное культивирование микроорганизмов / В кн. Избранные задачи большого практикума по микробиологии. М.: Из-во МГУ. 1991. С.29-44.
10. Захарчук Л.М., Аль-Нури М.А., Мыльникова С.И. Образование микроорганизмами внеклеточных ферментов и антибиотиков / В кн. Избранные задачи большого практикума по микробиологии. М.: Из-во МГУ. 1991. С.70-81.
11. Захарчук J1.M., Цаплина И. А., Краснльникова E.H., Богданова Т.И., Каравайко Г.И. Метаболизм углерода у Sulfobacillus therinosulßdooxidansJ/Мшробтлотт. 1994.Т.63.№ 4. С.573-580.
12. Захарчук Л.М., Колотилова H.H., Магдашок О.В. Окисление Ectothiorhodospira shaposhnikovii штамм 1К сульфида в зависимости от его концентрации. //В сб. Тезисы докл. Конференции "Автотрофные микроорганизмы". Москва, МГУ. Из-во Диалог-МГУ. 1996. С.36.
13. Красильникова E.H., Богданова 'Г.И., Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Каравайко Г.И. О метаболизме восстановленных соединений серы у Sulfobacillus thermosulßdooxidans, штамм 1269. // Микробиология. 1998. Т.67. № 2. С. 156-164.
14. Ivanovsky R.N., Fal Y.I., Berg I.A., Ugolkova N.V., Krasilnikova E.N., Zakharchuk L.M., Keppen O.I., Zyakun A.M. Evidence for the precence of the reductive pentose phosphate cycle in a filamentous anoxygenic photosynthetic bacterium Oscillochloris trichoides strain DG-6. // Microbiology. 1999. V.145. № 7. P.1743-1748.
15. Захарчук Л.М., Красильникопа E.H. Активность ферментов углеродного метаболизма у Chromatium minutissimum после длительного хранения.// Микробиология. 2000. Т.69. № 3. С.328-333.
16. Красильникова E.II., Богданова Т.И Цаплина И. А, Захарчук Л.М. Метаболизм глюкозы у сульфобацилл. // В сб. Докл. конференции "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов". Москва. 1999. М.Из-во МГУ. 2000. С.68.
17. Егорова М.А., Захарчук Л.М. Активность карбоксилазу Sulfobacillus thermosulßdooxidans subsp. asporogenes штамм 41. II В сб. Докл. конференции "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов". Москва. 1999. М.: Из-во МГУ. 2000, С.58.
18. Цаплина И.А., Красильникова E.H., Захарчук Л.М., Егорова М.А., Богданова Т.И., Каравайко Г.И. Метаболизм углерода у Sulfobacillus thermosulßdooxidans subsp. asporogenes штамм 41. II Микробиология. 2000. T.69. Ks 3. С.334-340.
19. Красильникова E.H., Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Егорова М.А. Углеродный метаболизм сульфобацилл в разных условиях роста. // Сб. научных работ "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов". Вып. 2. Воронеж. ВГУ. 2000, С.71-77.
20. Захарчук Л.М., Красильникова E.H., Цаплина И,А., Егорова М.А., Богданова Т.И. Метаболизм углерода у трех штаммов бактерий рода Sulfobacillus. // В сб. Тезисы докл. Междунар. Конференции "Автотрофные микроорганизмы". М.: Из-во МАКС Пресс. 2000. С. 81-82.
21. Красильникова E.H., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Захарчук Л.М. Метаболизм серы у природного аспорогенного штамма сульфобацилл. // В сб. Тезисы докл. Междунар. .конференции "Автотрофные микроорганизмы". М.: Из-во МАКС Пресс. 2000. С. 110.
22. Zalcharchuk L.M., Krasilnikova E.N., Tsaplina I.A., Bogdanova T.I., Egorova М.А. Carbon metabolism of bacteria of Sulfobacillus genus. // Proceedings book of The World Congress on Biotechnology "BIOTECHNOLOGY-2000". Berlin, September 3-8. Berlin. 2000. P. 34.
23. Zakharchuk L.M., Tsaplina I.A., Krasilnikova E.N., Bogdanova T.I.. Inhibition of the growth of chemolithotrophic thermophilic sulfobacilli by extremely high Zn2+ and IT' concentrations.// Proceedings book of The World Congress on Biotechnology "BIOTECHNOLOGY-2000". Berlin, September 3-8. Berlin. 2000. P, 36.
24. Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Красильникова E.H., Богданова Т.И., Егорова М.А. Изменения физиолого-биохимических свойств бактерий рода Sulfobacillus под воздействием внешних факторов // Сб. научных работ "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов". Вып. 3. Воронеж. ВГУ. 2001. С.50-55.
25. Каравайко Г.И., Красильникова E.H., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Захарчук Л.М. Рост и углеводный метаболизм сульфобацилл. // Микробиология. 2001. Т.70. №3. С.293-299.
26. Красильникова E.H., Цаплина И.А., Захарчук Л.М., Богданова Т.И. Влияние экзогенных факторов на активность ферментов метаболизма углерода у термоацидофильных бактерий рода Sulfobacillus.II Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. №4. С. 418-423.
27. Красильникова E.H., Захарчук Л.М., Егорова М.А., Меламуд B.C.. Конструктивный метаболизм нового вида бактерий "Sulfobacillus sibiricus" // Сборник: Общероссийская конференция "Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточносибирском регионе". Иркутск. ИГУ. 2002. С.61-63.
28. Каравайко ГЛ., Захарчук Л.М., Богданова Т.И., Егорова М.А. Цашшна И.А., Красильникова E.H. Ферменты метаболизма углерода у термотолерантной сульфобациллы, штамм К1 // Микробиология. 2002. Т.71. JÉS. C.7S5-761.
29. Egorova М.А., Krasilnikova E.N., Tsaplina I.A., Zakharchuk L.M. Physiological and biochemical features of growth of Sulfobacillus thermosulfidooxidans 41 under inieroaerobic conditions. II Proc. The World Congress on Biotechnology nBIOTECHNOLOGY-2003". Lubljana. 2003. P. 326.
30. Захарчук JI.M., Егорова M.A., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Красилыгакова E.H., Меламуд B.C., Каравайко Г.И. Активность ферментов углеродного обмена у "Sulfobacillus sibiricus" в различных условиях культивирования.// Микробиология. 2003. Т.72.№5.С.621-626.
31.EropoBa М.А., Цаплина И.А., Захарчук JI.M., Богданова Т.Н., Красилыткова E.H.
Влияние условий культивирования на рост, активность ферментов метаболизма серы и карбоксилаз у Sulfobacillus thermosulßdooxidan subsp. asporogenes, штамм 41. // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т.40. № 4. С. 448-454.
32. Захарчук Л.М, Татаринова Н.Ю. Систематика и идентификация микроорганизмов / В кн.: Практикум по микробиологии. Глава. 9. М. "Академия". 2004. С. 132-143.
33 Улезко О.Н., Захарчук JI.M., Цаплина И.А., Исмаилов А.Д., Красилыгакова E.H. Содержание АТФ в клетках бактерий рода Sulfobacillus в различных условиях роста. II Сборник: Материалы Международной конференции "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии". Минск. МГУ. 2004. С.117-118.
34. Захарчук JI.M., Исмаилов А.Д. Периодическое и непрерывное культивирование микроорганизмов / В кн.: Практикум по микробиологии. Глава. 21. М. "Академия". 2004. С.284-299.
35. Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Красильникова E.H., Егорова М.А., Богданова Т.Н. Биотехнологический потенциал хемолитотрофной бактерии Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes, штамм 41. II Сборник научных работ "Биотехнология - охране окружающей среды" Москва: Из-во "Спорт и Культура". 2004.- С.49-54.
36. Красильникова E.H., Захарчук Л.М., Богданова Т.И., Цаплина И.А. Ферменты метаболизма серы у термоацидофильной бактерии Sulfobacillus sibiricus. //Микробиология. 2004. Т.40. №1. С.62-65.
37. Karavaiko G.I., Bogdanova T.I., Tourova Т.Р., Kondratieva T.F., Tsaplina I.A., Egorova M.A., Krasilnikova E.N., Zakharchuk L.M. Reclassification oV'Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans" strain K1 as Alicyclobacillus tolerans sp. nov. and Sulfobacillus disulfidooxidans Dufresne et al. 1996 as Alicyclobacillus disulfidooxidans comb, nov., and emended description of the genus Alicyclobacillus //Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V.55. P.941-947.
38. Цаплина И.А., Богданова Т.И., Красилыгакова E.H., Егорова M.A., Захарчук Л.М., Каравайко Г.И. Физиолого-биохимичсскис характеристики хемолитотрофных бактерий рода Sulfobacillus // В сб. докл. 3-го Междунар. Конгресса "Биотехнология - состояние и перспективы развития" 4.2. Москва. 14-18 марта 2005. С.251-252.
39. Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Егорова М.А., Красильникова E.H. Окисление сульфидных минералов термоацидофильными бактериями // В сб. докл. Московского общества испытателей природы. Т.Зб, Москва. Изд-во "Графикон-принт". 2005. С.49-51.
40 Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Красильникова E.H. Богданова Т.И., Егорова М.А., Бактерии семейства Alicyclobacillaceae, окисляющие сульфидные минералы // В сб. Тезисы докл. Ill-го съезда микробиологов Узбекистана. Ташкент. 2005. С. 43.
41. Динариева Т.Ю., Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Каравайко Г.И. Цитохромы бактерий рода Sulfobacillus // В сб. Материалы всероссийского симпозиума "Автотрофные микроорганизмы". Из-во МАКС Пресс. 2005 С. 33-34.
42. Захарчук Л.М., Цашшна И.А., Красильникова E.H., Егорова MA, Богданова Т.И., Каравайко Г.И. Метаболизм бактерий рода Sulfobacillus // В сб. Материалы всероссийского симпозиума "Автотрофные микроорганизмы". Из-во МАКС Пресс. 2005 С. 37.
43. Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Исмаилов АД, Красильникова E.H., Егорова MA., Богданова Т.И. Автотрофный потенциал бактерий рода Sulfobacillus // В сб. Материалы всероссийского симпозиума "Автотрофные микроорганизмы". Из-во МАКС Пресс. 2005 С. 38.
Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. wwvv.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 08.11.2006 г.
с?о0$4 eyvfcá
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Захарчук, Леонид Михайлович
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Основные пути ассимиляции СОг у микроорганизмов
1.1. Реакции гетеротрофной фиксации СОг
1.2. Системы автотрофной фиксации СОг
Глава 2. Пути ассимиляции серы и ее восстановленных соединений у сераокисляющих прокариот.
Глава 3. Характеристика пурпурных и зеленых нитчатых фототрофных бактерий
3.1. Пурпурные бактерии
3.2. Зеленые нитчатые бактерии
Глава 4. Характеристика ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, окисляющих соединения серы и железа
4.1. Разнообразие ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов
4.2. Морфология и физиологические свойства
4.2.1. Бактерии
4.2.2. Археи
4.3. Метаболизм
4.3.1. Приспособление к низким значениям рН среды
4.3.2. Окисление/восстановление железа
4.3.3. Фиксация углекислоты
4.3.4. Метаболизм органических субстратов
4.3.5. Цикл трикарбоновых кислот и анаплеротические реакции
4.3.6. Метаболизм соединений серы
4.4. Роль в природе и практическое значение ацидофильных микроорганизмов
Глава 5. Типы питания микроорганизмов и роль миксотрофии
5.1. Типы питания
5.2. Облигатная автотрофия
5.3. Миксотрофия
5.4. Метаболизм миксотрофов и его регуляция
5.5. Роль миксотрофии в природе
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 6. Объекты и методы исследований
6.1. Объекты исследований
6.2. Культивирование бактерий
6.3. Постановка опытов с целыми клетками
6.4. Иммобилизация клеток
6.5. Получение экстрактов клеток
6.6. Методы анализов
6.6.1. Определение морфологии клеток и биомассы
6.6.2. Определение белка
6.6.3. Определение значений рН
6.6.4. Определение ассимиляции клетками 14С-содержащих соединений
6.6.5 Определение радиоактивности препаратов
6.6.6. Определение продуктов кратковременной ассимиляции клетками 14С02-содержащих соединений
6.6.7. Определение образования клетками 14С
6.6.8. Определение железа
6.6.9. Определение глюкозы
6.6.10. Определение летучих кислот и этанола
6.6.11. Определение активности ферментов углеводного метаболизма
6.6.12. Определение активности ферментов цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта
6.6.13. Определение активности карбоксилаз
6.6.14. Определение активности ферментов серного метаболизма
6.6.15. Определение АТФ в клетках
6.6.16. Определение скорости дыхания
6.6.17. Определение цитохромов
6.6.18. Определение сульфида
6.6.19. Определение сульфата
6.6.20. Определение тиосульфата
6.6.21. Молекулярно-биологические методы
6.7. Математическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 7. Исследование фототрофных бактерий
7.1. Углеродный метаболизм Ectothiorhodospira shaposhnikovii и E.mobilis в разных условиях роста
7.1.1. Автотрофные условия в присутствии света.
7.1.2. Миксотрофные условия в присутствии света
7.1.3. Гетеротрофные условия в темноте
7.2. Миксотрофный углеродный метаболизм Chromatium minutissimum
7.3. Миксотрофный углеродный метаболизм зеленой нитчатой бактерии
Oscillochloris trichoides штамм DG
Заключительные замечания к главе
Глава 8. Исследование хемотрофных бактерий
8.1. Рост бактерий
8.1.1. Рост Sulfobacillus thermosulfidooxidans штамм
8.1.2. Рост S. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes штамм
8.1.3. Рост S.sibiricus штамм N
8.1.4. Рост Alicyclobacillus tolerans, штамм К
8.2. Фиксация углекислоты клетками
8.3. Активность карбоксилаз
8.4. Ферменты углеводного метаболизма
8.5. Ферменты ЦТК и глиоксилатного шунта
8.6. Метаболизм неорганических соединений серы
8.7. Содержание АТФ в клетках и интенсивность дыхания бактерий
8.8. Цитохромы сульфобацилл
8.9. Изменение таксономического статуса "S. thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans", штамм К
Заключительные замечания к главе
Глава 9. Биотехнологический потенциал фототрофных и хемотрофных бактерий, обладающих свойством миксотрофии
9.1. Хемотрофные бактерии
9.2. Фототрофные бактерии 310 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 315 ВЫВОДЫ 319 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращений:
АДФ - аденозиндифосфат;
АМФ - аденозинмонофосфат;
АТФ - аденозинтрифосфат;
АФС - аденозинфосфосульфат;
Ацетил-КоА -ацетилкофермент А;
CoASH- кофермент А;
ДМСО - диметилсульфоксид;
ДНФГ - 2,4-динитрофенилгидразин;
DTNB - 5,5'-дитиобис-(2-нитробензоат);
ВНСС - восстановленные неорганические серные соединения;
КДФГ - 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат;
НАД - никотинамидадениндинуклеотид;
РБФ -рибулозо-1,5-бисфосфат;
РБФК - рибулозобисфосфаткарбоксилаза;
РБФК/О - рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа;
ТХУ - трихлоруксусная кислота;
ФЕП - фосфоенолпируват;
ФЕПК - фосфоенолпируваткарбоксилаза;
ФЕПКК - фосфоенолпируваткарбоксикиназа;
ФГА - фосфоглицериновый альдегид
Фд - ферредоксин;
Фн - неорганический фосфат;
Фп - флавопротеид;
ФФн - пирофосфат;
Фд - ферредоксин;
Фд-Нг- восстановленный ферредоксин; Цит. - цитохром;
ЦПМ - цитоплазматическая мембрана;
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот;
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ЭТС - электронтранспортная система;
ЭТЦ - электронтранспортная цепь
Qe - энергетический заряд;
HOQNO - 2-гептил-4-гидроксихинолин-Ы-оксид;
NEM - N-ethylmaleimide;
ДСН - додецилсульфат натрия;
ПААГ - полиакриламидный гель
Введение Диссертация по биологии, на тему "Миксотрофия у фототрофных и хемотрофных бактерий"
В природе рост микроорганизма происходит тогда, когда окружающая среда соответствует его физиологическим особенностям. Это обеспечивает данному виду скорость роста, достаточную для успешной конкуренции с другими организмами. Однако равновесие, которое устанавливается между организмами и средой, постоянно нарушается вследствие климатических, сезонных, суточных и других изменений, влияющих на ее физико-химические характеристики: освещенность, температуру, значение рН, наличие и концентрацию биогенных субстратов. Для того, чтобы сохранить возможность существования при изменении условий, микроорганизм должен либо изменить среду, либо сам адаптироваться к ее изменениям. Адаптация организма к изменяющимся условиям это сложный процесс, протекающий как на генотипическом, так и на фенотипическом уровнях. Результат такого приспособления на фенотипическом уровне чаще всего выражается в изменении тех или иных процессов метаболизма или типов питания.
Число видов прокариот, относящихся к группам, характеризующимся разным способом питания, не одинаково. Подавляющее число хемотрофных прокариот относится к группе с хемооргапогетеротрофным типом питания. Такая же неравномерность в распределении по типам питания присуща и фотосинтезирующим прокариотам. Большинство цианобактерий, пурпурных и зеленых серобактерий относится к группе с фотолитоавтотрофпым типом обмена. Другие типы питания у бактерий представляют собой как бы "пробы" эволюции и сохранились у сравнительно небольшого числа видов, часто обитающих в весьма специфических условиях.
Многие бактерии отличает постоянство потребностей в типе питания и соответственно процессов метаболизма. Так некоторые бактерии родов Thiobacillus и Acidithiobacillus являются облигатными или строгими хемолитоавтотрофами, источником энергии для которых служат процессы окисления восстановленных соединений серы или железа, а источником углерода для построения клеточного вещества - углерод СОг. Причины облигатпой автотрофии ученые пытаются объяснить уже много лет, но пока не найден однозначный ответ на этот вопрос (Zhang et al., 1998; Wood et al., 2004).
С другой стороны, давно известно, что в отношении условий обитания прокариоты более разнообразны, чем эукариоты. Это обусловлено значительной лабильностью их метаболизма, которая позволяет микроорганизмам использовать в целом гораздо больше химических веществ, прежде всего соединений углерода и серы, чем макроорганизмам. При этом для многих микроорганизмов, отличающихся широкими метаболическими возможностями, эта лабильность выражается не только в их способности использовать большое число разных соединений, но в некоторых случаях даже переключаться с одного типа питания на другой. Так ряд цианобактерий и фотосинтезирующих бактерий являются факультативными фототрофами, поскольку могут расти не только в присутствии света, но и в темноте в хемотрофных условиях. А некоторые бактерии способны в одних условиях к хемолитоавтотрофии, а в других к хемоорганогетеротрофии. Их принято называть факультативными хемолитоавтотрофами. Факультативные хемолитоавтотрофы при появлении в среде доступных органических субстратов обычно переключаются на их использование, прекращая автотрофную фиксацию СО2 (Кондратьева, 1996; Tian et al., 2003).
Однако в литературе все чаще встречаются также термины "миксотрофы", "миксотрофия", "миксотрофный рост", питание "смешанного типа". Иногда миксотрофами называют микроорганизмы, способные к разным типам питания или называют так факультативные автотрофы. Но в последнее время под миксотрофией понимают такой тип питания, при котором организмом одновременно используются различные метаболические пути, например, источником энергии (или электронов у фототрофов) служат сульфид и органическое соединение и/или источником углерода - СО2 и то же органическое вещество (Кондратьева, 1996; Hagen, Nelson, 1996; Fuchs, 1999; Kelly, Wood, 2000; Wood et al., 2004).
Некоторые бактерии не только способны переключаться с одного типа метаболизма на другой, например, растут в автотрофных и гетеротрофных условиях, подобно факультативным автотрофам, но могут и, более того, предпочитают расти именно в миксотрофных условиях. К таким бактериям относятся некоторые фототрофные бактерии и хемотрофные бактерии рода Sulfobacillus, являющиеся объектами наших исследований (Головачева, Каравайко, 1978; Karavaiko et al., 1988, 2005; Кондратьева, 1989; Norris et al., 1996). Эти на первый взгляд непохожие группы бактерий, относящиеся к двум основным типам энергетического питания, объединяет способность существовать в постоянно меняющихся, часто экстремальных физико-химических условиях среды, и переключаться с одного типа метаболизма на другой вследствие их чрезвычайной метаболической гибкости.
Изучение миксотрофии у фототрофных и хемотрофных бактерий является весьма актуальным, поскольку может позволить установить:
- роль миксотрофного типа питания для выживания микроорганизмов в постоянно изменяющихся условиях окружающей среды;
- общие закономерности и различия процессов углеродного метаболизма у фототрофных и хемотрофных бактерий, растущих в разных условиях;
- особенности углеродного, серного и энергетического метаболизма, позволяющие таким микроорганизмам оптимально развиваться именно в миксотрофных условиях;
- причины плохого роста некоторых миксотрофных бактерий в автотрофных и гетеротрофных условиях;
- возможные регуляторы процессов переключения бактерий с одного типа питания на другой.
Кроме того, актуальность изучения особенностей метаболизма фототрофных и хемотрофных бактерий в разных условиях роста определяется необходимостью понимания роли каждой из групп этих микроорганизмов в круговороте углерода, серы, железа в природных и промышленных экосистемах, уточнения их места в общей системе организмов, познания закономерностей и путей эволюции прокариот. Очень важен и прикладной аспект таких исследований, поскольку их результаты могут быть использованы для решения задач регуляции биохимической активности фототрофных и хемотрофных бактерий в целях более эффективного их применения в биотехнологии.
Цели и задачи исследования.
Различия микроорганизмов по типам питания связаны главным образом с начальными стадиями метаболизма углерода, серы, азота. Круговорот углерода и серы в природных, а в последние годы и в промышленных системах, являются одними из важнейших геохимических циклов. В этих природных циклах значительную роль играют фототрофные и хемотрофные бактерии.
Способность прокариот к хемолитотрофии, автотрофии или миксотрофии связана с биосинтезом сравнительно небольшого числа особых ферментов. Поэтому представляло интерес изучение как ферментных систем, отвечающих за рост в автотрофных условиях, так и путей использования органического вещества у исследуемых представителей хемотрофных и фототрофных бактерий в разных условиях роста.
Основной целью нашей работы было сравнительное изучение начальных этапов метаболизма углерода и серы у прокариот, обладающих способностью использовать разные источники энергетического питания - фототрофных и хемолитотрофных бактерий в разных условиях культивирования для определения общих биохимических механизмов лабильности их метаболизма и оптимального развития в миксотрофных условиях.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить особенности роста фототрофных и ацидофильных хемолитотрофных бактерий, обладающих свойством миксотрофии, в различных условиях культивирования.
2. Определить способность этих бактерий к ассимиляции углекислоты в различных условиях.
3. Провести определение в бесклеточных экстрактах миксотрофных бактерий активностей ферментов, участвующих в метаболизме углерода - ферментов метаболизма углеводов, цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта, карбоксилаз.
4. Выявить закономерности изменения активностей ферментов углеродного метаболизма в зависимости от условий культивирования бактерий.
5. Выяснить особенности метаболизма соединений серы у штаммов хемолитотрофных бактерий в сравнении с фототрофными бактериями.
6. Определить содержание АТФ в клетках и интенсивность дыхания культур хемолитотрофных бактерий, выросших в различных условиях.
7. На основании полученных данных и схем метаболизма углерода и серы найти общие свойства и особенности физиологии фототрофных и хемолитотрофных бактерий, позволяющие им оптимально развиваться в миксотрофных условиях с возможностью переключения на автотрофный и гетеротрофный типы питания.
8. Оценить потенциал изученных видов фототрофных и ацидофильных хемолитотрофных бактерий, обладающих свойством миксотрофии, для биотехнологии.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Захарчук, Леонид Михайлович
Выводы
1. Миксотрофия является оптимальным типом метаболизма для роста исследованных видов фототрофных и хемотрофных бактерий. Нами показано, что миксотрофия - это тип питания, близкий к факультативной автотрофии, при котором организмы обладают более широкими, чем факультативные автотрофы, метаболическими возможностями. Они не только способны к автотрофному и/или гетеротрофному росту, но в присутствии в среде органических источников углерода, наряду с их ассимиляцией, одновременно фиксируют СОг в цикле Кальвина и/или в качестве источников энергии (электронов у фототрофов) одновременно используют неорганическое и органическое соединения.
2. Схемы метаболизма углерода изученных фототрофных и хемотрофных бактерий при миксотрофии включают известные пути расщепления Сахаров, цикл Кальвина, реакции карбоксилирования ФЕП, пирувата и органических кислот, незамкнутый ЦТК (кроме Alb. т tolerans Kl ), а у некоторых и глиоксилатный шунт (пурпурные фототрофные бактерии). Эти механизмы позволяют в максимальной степени использовать углерод и энергию в природных средах, а в результате регуляторных перестроек быстро переходить на автотрофный или гетеротрофный типы питания.
3. Окислительный пентозофосфатный путь играет особую роль в метаболизме миксотрофных хемотрофных бактерий, особенно при обогащении среды С02 и в экстремальных условиях, так как частично компенсирует в процессе ассимиляции Сахаров незамкнутость ЦТК и отсутствие глиоксилатного шунта, обеспечивая восстановителем и/или энергией цикл Кальвина, электронтранспортную систему, процессы биосинтеза.
4. Отсутствие стабильного автотрофного роста хемотрофных и фототрофных (при наличии Ог на свету и в темноте) бактерий, обладающих свойством миксотрофии, объясняется прежде всего тем, что процессы окисления неорганических доноров электронов не обеспечивают клетки достаточной энергией из-за особенностей их железо- и/или сероокисляющей систем и неэффективного функционирования дыхательных электронтранспортных цепей. Экономия энергии в автотрофных условиях объясняет также сходную у фототрофов и хемотрофов схему метаболизма углерода с разорванным ЦТК на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы и отсутствием глиоксилатного шунта.
5. Отсутствие стабильного гетеротрофного роста исследованных сульфобацилл объясняется незамкнутостью ЦТК и отсутствием глиоксилатного шунта в сочетании с низкой активностью ферментов ЦТК и энергозависимым процессом транспорта в клетки органических соединений. Предпочтение миксотрофного роста изученными видами хемотрофных и фототрофных бактерий обусловлено тем, что использование ими органических субстратов облигатно зависит от наличия в среде неорганических доноров электронов.
6. Окисление элементной серы и ее восстановленных соединений у сульфобацилл S.thermosulfidooxidans 1269, 41 и S.sibiricus N1 происходит в результате действия реакций, показанных ранее у автотрофных тиобацилл и ацидитиобацилл и обеспечивающих синтез АТФ, как сопряженный с функционированием электронтранспортной системы, так и на уровне субстратного фосфорилирования в результате действия АФС-редуктазы.
7. На основании установленных физиолого-биохимических и генотипических признаков "S.thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans" штамм К1 переклассифицирован и отнесен к роду Alicyclobacillus как вид Alb.tolerans sp. nov. К1 . Результаты изучения этой бактерии позволяют считать данный организм промежуточным звеном между сульфобациллами с миксотрофным типом питания и типичными гетеротрофами рода Alicyclobacillus.
8. Свойство миксотрофии у исследованных фототрофных и хемотрофных бактерий может быть использовано для разработки биотехнологических методов очистки окружающей среды (фототрофные бактерии) и биовыщелачивания сульфидных руд (хемотрофные бактерии).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
На основании полученных данных можно заключить, что миксотрофия оптимальна для роста многих фототрофных и хемотрофных бактерий. В фотомиксотрофных анаэробных условиях E.shaposhnikovii, E.mobilis и Chr. minutissimum одновременно используют два источника углерода - углекислоту и органические соединения и два источника электронов -те же органические соединения и восстановленные соединения серы (рис.11, 21). В фотомиксотрофных условиях зеленая нитчатая бактерия O.trichoides DG6 включает углерод также одновременно из СОг и органических веществ, а источником энергии и донором электронов являются свет и H2S. (рис.24). Хемотрофпые ацидофильные бактерии штаммов 1269, 41, N1 и К1 в миксотрофных условиях тоже используют одновременно по два источника углерода и энергии (рис. 69, 72), причем они способны к стабильному росту только в миксотрофных условиях. При этом все эти организмы способны, благодаря своей чрезвычайной метаболической гибкости, переключаться, иногда только на короткое время (например хемотрофы), на автотрофный или гетеротрофный (кроме O.trichoides DG6) типы питания, что позволяет им сохранять жизнеспособность в постоянно меняющихся, часто экстремальных условиях внешней среды (рис.5,19,22, 25, 69, 70, 73, 74).
Следовательно, метаболизм изученных видов бактерий близок к таковому у факультативных автотрофов, однако миксотрофы обладают более широкими метаболическими возможностями, так как не только способны к автотрофному и/или гетеротрофному росту, но в оптимальных для них миксотрофных условиях в присутствии органических соединений, наряду с их ассимиляцией, продолжают фиксировать СОг в цикле Кальвина и/или в качестве источников энергии (или электронов у фототрофов) одновременно могут использовать неорганическое и органическое соединения.
Миксотрофия позволяет в максимальной степени извлекать углерод и энергию из природных источников, и в то же время, при постоянных изменениях условий углеродного питания, освещения, аэрации и некоторых других факторов, что часто происходит в природе, конкурировать с факультативными автотрофами в их экологических нишах - в автотрофных и/или гетеротрофных условиях.
Полученные данные подтверждают гипотезу, объясняющую феномен миксотрофии у микроорганизмов прежде всего скоростью оборота органических соединений по сравнению с неорганическими в данном местообитании (Schlegel, 1992). Эта гипотеза основана па предположении, что в большинстве сред скорость роста микробной популяции лимитируют уровни источников углерода и энергии и, в конечном счете, регуляция метаболизма углерода как у фототрофов, так и хемотрофов, направлена на то, чтобы максимально обеспечить организм в тех или иных условиях энергией и углеродом. Такой задаче и отвечают схемы углеродного метаболизма исследованных нами бактерий при росте в миксотрофных условиях. У всех организмов они включают определенный набор механизмов и реакций - пути катаболизма гексоз, цикл Кальвина, реакции анаплеротического карбоксилирования ФЕП, пирувата, органических кислот, незамкнутый ЦТК (кроме штамма К1), а у некоторых и глиоксилатный шунт (пурпурные фототрофпые бактерии). Эти механизмы позволяют в результате регуляторных перестроек переходить с миксотрофного па автотрофный или гетеротрофный типы питания и обратно. В миксотрофных условиях у сульфобацилл в результате окисления неорганических источников энергии, согласно нашим данным, происходит активизация процессов транспорта в клетки экзогенных органических соединений, однако разомкнутый ЦТК в отсутствие глиоксилатного шунта обеспечивает в основном биосинтетические потребности клеток, по не получение ими энергии. Отсутствие замкнутого ЦТК и глиоксилатного шунта частично компенсируется функционированием у изученных сульфобацилл пентозофосфатного пути расщепления Сахаров, поставляющего восстановитель прямо в цикл Кальвина и дыхательную цепь, однако основную энергетическую нагрузку несут все же неорганические доноры электронов.
О том, что активизация процессов транспорта экзогенных органических соединений у хемотрофных бактерий в миксотрофных условиях требует затрат энергии и облигатпо зависит от окисления Fe и неорганических соединений серы, свидетельствует стабильность только миксотрофного роста изученных нами сульфобацилл и Alb. tolerans Kl, а также максимальные в этих условиях урожаи клеток, скорости роста, окисления железа, ассимиляции глюкозы, дыхания (в том числе в присутствии в среде глюкозы), внутриклеточные пулы АТФ (рис. 52, 54, 56, табл.56). Следовательно, для потребления органических субстратов штаммам хемотрофных бактерий 1269, 41, N1 и К1 облигатно необходим специфический неорганический источник энергии, поэтому стабильно расти они могут только в миксотрофных условиях. E.shaposhnikovii и E.mobilis обладают способностью стабильно расти в автотрофных и гетеротрофных условиях, но и у них показано, что в оптимальных для их роста фотомиксотрофных условиях скорость ассимиляции некоторых органических соединений, например ацетата, возрастает в присутствии тиосульфата или сульфида, а также изменяются пути метаболизма органических субстратов (табл. 14,15, рис.6, 7, 8, 9, 11).
Бактерии, способные к миксотрофному типу метаболизма, получают преимущество при примерном равенстве скоростей поступления в среду неорганического и органического субстратов с их одновременной лимитацией (Kuenen, 1999), что часто наблюдается в природе в местах обитания исследованных нами бактерий. Если скорость поступления в среду неорганического субстрата значительно превышает скорость поступления органических соединений, то бактерии переходят на автотрофию. Преобладание в среде органических соединений стимулирует органогетеротрофный тип питания. Показано, что у изученных нами фототрофных бактерий, наряду с составом среды, доминирующее значение для выбора типа питания играют свет и кислород.
Тип метаболизма у миксотрофных бактерий в тех или иных условиях среды устанавливается в результате регуляция потока углерода через цикл Кальвина, ЦТК и глиоксилатный шунт, зависит от энергетического статуса клеток и осуществляется на уровне синтеза и активности карбоксилаз и других ферментов наличием органических и неорганических веществ и некоторых их метаболитов, света, кислорода, СОг, соотношением АТФ/АДФ+АМФ, НАД(Ф)/НАД(Ф)Н, ионами металлов, температурой, значением рН и, возможно, некоторыми другими факторами.
Автотрофию можно рассматривать как адаптацию к росту в средах, бедных органическими субстратами. Общей причиной, ограничивающей рост исследованных нами фототрофных и хемотрофных бактерий в автотрофных условиях, является их неспособность обеспечить себя энергией. Нами показано, что в автотрофных условиях у сульфобацилл при полном окислении железа в среде и высоких скоростях дыхания клеток обнаружен очень низкий для прокариот внутриклеточный пул АТФ и уровень фиксации СОг клетками (рис.53,55,57; табл.32,56). Результатом окисления штаммами сульфобацилл 1269, 41 и N1: элементной серы и восстановленных соединений серы является синтез АТФ, как сопряженный с действием серадиоксигеназы, сульфит:цитохром-с-оксидоредуктазы, тиосульфатокисляющего фермента, сульфит:Ре(Ш)-оксидоредуктазы и функционированием ЭТС, так и получаемый на уровне субстратного фосфорилирования в результате действия АФС-редуктазы (табл.52,53,54,55;рис.51). Однако эта энергия не обеспечивает устойчивый автотрофный рост сульфобацилл и плохо под держивает их миксотрофный рост.
Можно предположить, что пул АТФ, запасаемый сульфобациллами в автотрофных условиях в процессе окисления железа и восстановленных соединений серы и вынужденный прежде всего использоваться для энергоемких процессов поддержания жизнедеятельности, фиксации углекислоты в цикле Кальвина, обратного переноса электронов в дыхательной цепи, является недостаточным для обеспечения в течение длительного культивирования бактерий и других биохимических механизмов, идущих с затратой энергии - биосинтеза веществ, активации ферментов и т.п. Видимо, причиной неэффективной системы получения энергии в процессе автотрофного роста у сульфобацилл являются особенности их железо- и сераокисляющей систем и дыхательной электронтранспортной системы.
Экономия энергии объясняет также общую в автотрофных условиях для всех изученных нами фототрофов (при наличии 02 на свету и в темноте) и хемотрофов рода Sulfobacillus схему метаболизма углерода с незамкнутым на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы ЦТК и отсутствием глиоксилатного шунта (рис.5, 22, 25, 68). Эта схема полностью совпадает со схемой углеродного обмена, типичной для облигатных автотрофов и делающей невозможным энергетически невыгодное окисление продуктов цикла Кальвина в полном ЦТК (Wood et al., 2004). Она позволяет миксотрофам конкурировать с облигатпыми автотрофами в их экологической нише и избегать летальных или бесполезных для бактерий в этих условиях реакций метаболизма.
Иной, чем у исследованных нами сульфобацилл и фототрофов, является основная причина отсутствия автотрофного роста у Alb. tolerans К1 - бактерии, имеющей в этих условиях полный ЦТК (рис.73). Окисление органических продуктов, полученных в результате фиксации С02 в цикле Кальвина, с помощью полного ЦТК в автотрофных условиях роста обычно вызывает гибель клеток в результате их энергетического истощения или так называемого "метаболического суицида" (Schlegel, 1992; Wood et al., 2004).
Отсутствие стабильного гетеротрофного роста сульфобацилл вызвано разорванностью ЦТК на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы (а часто и других ферментов ЦТК), отсутствием глиоксилатного шунта в сочетании с низкими уровнями активности остальных ферментов ЦТК (табл. 45,46,47), энергозависимым процессом транспорта в клетку органических соединений, низкой скоростью синтеза АТФ, сопряженного с дыхательным электронным транспортом (табл. 56). У Alleyclobacillus tolerans шт. К1 , имеющего полный ЦТК (табл.48), нестабильность гетеротрофного роста также объясняется необходимостью затраты энергии окисления неорганических соединений на активизацию процессов транспорта органических субстратов в клетки и низкой скоростью синтеза АТФ в дыхательной системе (табл. 56).
Знание физиологии и особенностей углеродного и серного метаболизма миксотрофных сульфобацилл и фототрофных бактерий в разных условиях роста может использоваться и уже применяется в биотехнологических способах очистки окружающей среды (фототрофные бактерии) и биовыщелачивания сульфидных руд (хемотрофные бактерии).
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Захарчук, Леонид Михайлович, Москва
1. Балашова В.В., Дубинина Г.А. Микроорганизмы, окисляющие железо и марганец. // В: "Хемосинтез" / под ред. Иванова М.В., М.: Наука. 1989. С. 101-122.
2. Берг И.А., Кеппен О.И., Красилышкова Е.Н., Уголькова Н.В., Ивановский Р.Н.Углеродный метаболизм аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae //Микробиология. 2005. Т.74.№3. С.305-312.
3. З.Берг И.А., Красилышкова Е.Н., Ивановский Р.Н. Исследование темпового метаболизма ацетата у клеток Rhodospirillum rubrum, выросших в фотогетеротрофпых условиях // Микробиология. 2000. Т.69. №1. С.13-18.
4. Богданова Т.И., Цаплина И.А., Саякин Д.Д., Каравайко Г.И., Коваленко Э.В. Морфология и цитология бактерий Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans. II Микробиология. 1990. T.59. № 5. C.844-855.
5. Богданова Т.И., Мулюкин А.Л., Цаплииа И.А., Эль-Регистан Г.И., Каравайко Г.И. Влияние состава среды и условий культивирования па спорообразование хемолитотрофных бактерий. //Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 187-193.
6. Богоров Л.В. О свойствах Thiocapsa roseopersicina штамм BBS, выделенного из эстуария Белого моря // Микробиология. 1974. Т.43. №2. С.326-332.
7. Брода Э. Эволюция биоэнергетических процессов. М.: Мир. 1978. 303 С.
8. Вартанян Н.С., Пивоварова Т.А., Цаплина И.А., Лысенко A.M.,Каравайко Г.И. Новая термоацидофильная бактерия, относящаяся к роду Sulfobacillus. И Микробиология. 1988. Т. 57. № 2. С. 268-274.
9. Вартанян Н.С. Изучение новой факультативно термофильной бактерии рода Sulfobacillus. / Автореферат дис. канд. биол. наук. Абовян. 1989. 21 С.
10. Вартанян Н.С., Каравайко Г.И., Пивоварова Т.А. Влияние органических веществ па рост и окисление неорганических субстратов Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes. II Микробиология. 1990. Т. 59. № 3. С. 411-417.
11. Гительзон И.И., Родичева Э.К., Медведева С.Е. и др. Светящиеся бактерии. / Новосибирск. Наука. 1984.278 С.
12. Головачева Р.С., Каравайко Г.И. Sulfobacillus новый род термофильных спорообразующих бактерий. // Микробиология. 1978. Т. 47. № 5. С. 815-821.
13. Головачева Р.С. Прикрепление клеток Sulfobacillus thermosulfidooxidans к поверхности сульфидных минералов. // Микробиология. 1979 а. Т. 48. № 5. С. 528-533.
14. Головачева Р.С. Ультраструктурная организация клеток и спор Sulfobacillus thermosulfidooxidans. И Микробиология. 1979 б. Т. 48. № 5. С. 681-688.
15. Головачева Р.С. Морфогенетические свойства Sulfobacillus thermosulfidooxidans. II Микробиология. 1979 в. Т. 48. № 5. С. 863-867.
16. Головачева Р.С. Аэробные термофильные хемолитотрофиые бактерии, участвующие в круговороте серы. //Успехи микробиологии. 1984. Т. 19. С. 166-202.
17. Горленко В.М. Окисление тиосульфата Amoebobacter roseus в темноте в микроаэробных условиях //Микробиология. 1974. Т.44.№6.С.756-758.
18. Горленко В.М. Характеристика нитчатой фототрофной бактерии из пресноводных озер // Микробиология. 1976. Т. 44. №5. С.680-684.
19. Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнецов С.И. Экология водных микроорганизмов. /М.: Наука. 1977. 324 С.
20. Горленко В.М., Компанцева Е.И., Пучкова Н.Н. Влияние температуры на распространение фототрофных бактерий в термальных источниках //Микробиология. 1985. Т. 54. №;5.С.848-853.
21. Горленко В.М., Михеев П.В. Русанов И.И., Пименов Н.В., Иванов М.В. Эко-физические свойства фотосинтезирующих бактерий из зоны хемоклина Черного моря // Микробиология. 2005. Т.74. №2. С.239-247.
22. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. М.: Мир. 1982. 310 С.
23. Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Дульцева Н.М., Чурикова В.В. Особенности углеродного метаболизма при хемолито- и хемоорганотрофном росте нитчатых серобактерий Thiothrix arctophila и Leucothrix thiophila П Микробиология. 1996. Т.65. № 2. С.149-153.
24. Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Лебедева В.Ю., Чурикова В.В. Миксотрофный и литогетеротрофный рост пресноводного штамма скользящих нитчатых серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 // Микробиология. 1998. Т.67. №4. С.464-470.
25. Грузина Т.Г., Балакина М.Н., Карамушка В.И., Степура Л.Г., Альберг З.Р. АТФ-фаза плазматических мембран бактерий в оценке токсичности тяжелых металлов.//Микробиология. 1977. Т.66.№1. С.14-16.
26. Гутина В.Н. Очерки по истории физиологии микроорганизмов М.: Наука. 1988.
27. Гусев М.В., Никитина К.А. Цианобактерии, физиология и метаболизм. /М.: Наука. 1979. 227 С.
28. Дубинина Г.А. Бесцветные серобактерии. // В кн: "Хемосинтез" / под ред. Иванова М.В. М.: Наука. 1989. С. 76-100.
29. Дульцева Н.М., Дубинина Г.А., Лысенко А.Н. Выделение галофильных нитчатых серобактерий и описание нового вида Leucothrix thiophila sp.nov. //Микробиология. 1996. Т.65. № 1. С.89-98.
30. Жуков В.Г. Сравнительное исследование метаболизма углерода у пурпурных бактерий на свету и в темноте /Автореф. дисс. канд.биол.наук. М.: МГУ. 1979.24 С.
31. Заварзин Г.А. Литотрофные микроорганизмы М.: Наука, 1972. 324 С.
32. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука, 2003. 348 С.
33. Зякун A.M., Захарченко В.Н., Ивановский Р.Н., Кеппен О.И., Кудрявцева А.И., Машкина Л.П., Пешенко В.П. Фракционирование изотопов углерода бактериями Ectothiorhodospira shaposhnikovii при фотомиксотрофном росте // Микробиология. 1998. Т.67. №1 .С.5-11.
34. Иванов В.Н. Энергетика роста микроорганизмов // Киев. "Наукова думка", 1981,138 С.
35. Ивановский Р.Н. Метаболизм фототрофныхъ бактерий в разных условиях роста. Автореф. дисс. докт. биол. наук. Москва. 1986.49 С.
36. Ивановский Р.Н., Красильникова Е.Н., Берг И.А. Механизм ассимиляции ацетата у пурпурной несерной бактерии Rhodospirillum rubrum, не имеющей изоцитратлиазы //Микробиология. 1997. Т.66. №6.С.621-626.
37. Ивановский Р.Н., Петушкова Ю.П. Субстратное фосфорилирование при окислении сульфата Thiocapsa roseopersicina в зависимости от условий роста //Микробиология. 1976. Т.45.№6.С. 110-104.
38. Ивановский Р.Н. Биоэнергетика и транспорт субстратов у бактерий. М.: МАКС Пресс. 2001.48 С.
39. Каравайко Г.И. Микроорганизмы и их роль в биотехнологии металлов. // В кн: Биогеотехнология металлов. Практическое руководство" под ред. Каравайко Г.И., Росси Дж., Агате А. Грудев С., Авакян З.А. М.: Центр международных проектов ГКНТ. 1989. С. 11-28.
40. Каравайко Г.И., Турова Т.П., Цаплина И.А., Богданова Т.И. Исследование филогенетического положения аэробных умеренно термофильных бактерий рода Sulfobacillus, окисляющих Fe2+, S° и сульфидные минералы. // Микробиология. 2000. Т. 69. № 6. С. 857-860.
41. Каравайко Г.И., Красильникова Е.Н., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Захарчук JI.M.
42. Рост и углеводный метаболизм сульфобацилл. // Микробиология. 2001. Т. 70. № 3. С. 293-299
43. Каравайко Г.И., Пивоварова Т.А., Кондратьева Т.Ф. Хемолитотрофпые бактерии и их роль в биогидрометаллургии. // В: Сборник тезисов. 1-ый международный конгресс "Биотехнология состояние и перспективы развития". Москва. 2002. С. 458.
44. Каравайко Г.И. Биотехнология металлов. / В кн: "Экология микроорганизмов" под ред. Нетрусова А.И. М.: Академия. 2004. С. 199-220.
45. Кахру А.О. Исследование регуляции уровня адеииниуклеотидов и энергетического метаболизма у микроорганизмов / Автореф. дисс. канд. биол. наук. Тарту. 1986. 15 С.
46. Кеппен О.И., Лебедева Н.В., Трошина О.И., Родионов Ю.В. Нитрогеназная активность нитчатой фототрофной зеленой бактерии //Микробиология. 1989. Т.58. №3. С.520-521.
47. Коваленко Э.В., Малахова П.Т. Спорообразующая железоокисляющая бактерия Sulfobacillus thermosulfidooxidans. П Микробиология. 1983. Т. 52. № 6. С. 962-966.
48. Ковров Б.Г., Денисов Г.В., Секачева Л.Г., Белый А.В. Скорость окисления железа культурой Thiobacillus .ferrooxidans в зависимости от аэрации /В кн. Рост микроорганизмов на Ci-соединениях. Пущино. 1977. С.113-115.
49. Компанцева Е.В., Сорокин Д.Ю., Горленко В.М., Намсараев Б.Б. Фототрофное сообщество соленого щелочного озера Хилганта (Юго-восточное Забайкалье) // Микробиология. 2005. Т. 74. №3. С. 410-419.
50. Кондратьева Е.Н., Красильникова Е.Н., Педан Л.В. Условия роста в темноте в присутствии кислорода Ectothiorhodospira shaposhnikovii II Микробиология. 1976. Т.45. №1. С.172-173.
51. Кондратьева Е.Н. Хемолитотрофы и метилотрофы. М.: Издательство МГУ. 1983.176. С.
52. Кондратьева Е.Н. Систематическое положение и физиолого-биохимическое разнообразие фототрофных микроорганизмов /Фототрофпые микроорганизмы. Пущино. 1988.1. С.3-10.
53. Кондратьева Е.Н., Красильникова Е.Н. Рост Ectothiorhodospira shaposhnikovii на средах с разными соединениями серы//Микробиология. 1979. Т.48. №2. С.194-201.
54. Кондратьева Е.Н., Гоготов И.Н. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов //М: Наука. 1981. 344 С.
55. Кондратьева Е.Н., Максимова И.В., Самуилов В.Д. Фототрофпые микроорганизмы. М.:МГУ. 1989. 375 С.
56. Кондратьева Е.Н. Способность фототрофных бактерий к хемоавтотрофии // Хемосинтез. М.: Наука. 1989. С. 139-147.
57. Кондратьева Е.Н. Автотрофные прокариоты. М.: Издательство МГУ. 1996.312 С.
58. Кондратьева Т.Ф., Агеева С.Н., Мунтян Л.Н., Пивоварова Т.А., Каравайко Г.И. Штаммовый полиморфизм плазмидных профилей у Acidithiobacillus ferrooxidans II Микробиология. 2002. Т.71. №3. С. 1-8.
59. Кондратьева Т.Ф., Пивоварова Т.А., Каравайко Г.И. Особенности структуры хромосомной ДНК у Acidianus brierleyi и Ferroplasma acidiphilum в разных условиях культивирования //Микробиология. 1999. Т.68. №4. С.508-513.
60. Костяев В.Я. Реакция циапобактерий на некоторые тяжелые металлы. //Микробиология. 1980. Т.49.№5. С.821-824.
61. Кощеепко К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов и их применение // В кн.: Промышленная микробиология. М. 1989. С.216-236.
62. Красильникова Е.Н., Педан Л.В., Фирсов Н.Н., Кондратьева Е.Н. Ферменты цикла трикарбоновых кислот у разных видов фототрофных бактерий. //Микробиология. 1973. Т.42. №6. С.995-1000.
63. Красильникова Е.Н. Ферменты углеводного метаболизма у фототрофных бактерий // Микробиология. 1975. Т. 44. №1. С.5-10.
64. Красильникова Е.Н. Ферменты метаболизма углерода у пурпурных серобактерий при росте в темноте // Микробиология. 1977. Т. 46. №2. С.217-221.
65. Красильникова Е.Н., Богданова Т.И., Захарчук Л.М., Цаплина И.А., Каравайко Г.И. О метаболизме восстановленных соединений серы у Sulfobacillus thermosulfidooxidans, штамм 1269 // Микробиология. 1998. Т.67. № 2. С. 156-164.
66. Красильникова Е.Н., Цаплина И.А., Захарчук Л.М., Богданова Т.П. Влияние экзогенных факторов на активность ферментов метаболизма углерода у термоацидофильных бактерий рода Sulfobacillus. II Прикл. биох. микробиол. 2001. Т. 37. № 4. С. 418-423.
67. Красильникова Е.Н., Богданова Т.И., Захарчук Л.М., Цаплина И.А. Ферменты метаболизма серы у термоацидофильной бактерии Sulfobacillus sibiricus. II Прикл. биох. микробиол. 2004. Т. 40. № 1.С. 62-64.
68. Красильникова Е.Н., Кеппен О.И., Горленко В.М., Кондратьева Е.Н. Рост Chloroflexus aurantiacus на средах с разными органическими соединениями и пути их метаболизма // Микробиология. 1986. Т.55.№3. С.425-430.
69. Красильникова Е.Н., Кондратьева Е.Н О начальных путях метаболизма пирувата у фототрофных бактерий //Микробиология. 1974.Т.43. №5. С.776-773.
70. Красильникова Е.Н., Кондратьева Е.Н. Рост Chloroflexus aurantiacus в темноте и метаболизм органических субстратов // Микробиология. 1987. Т.56.№3. С.357-361.
71. Красильникова Е.Н., Кондратьева Е.Н. Использование Chloroflexus aurantiacus разных соединений серы // Микробиология. 1988. Т.57.№3. С.507-509.
72. Лысенко A.M., Цаплина И.А., Головачева Р.С., Пивоварова Т.А., Вартанян Н.С., Каравайко Г.И. Таксономическое положение рода Sulfobacillus, основанное па изучении ДНК. // Доклады АН СССР. 1987. Т. 294. № 4. С. 970-972.
73. Меламуд B.C., Пивоварова Т.А. Особенности роста типового штамма бактерий вида Sulfobacillus thermosulfidooxidans на среде 9К. // Прикл. биохим. микробиол. 1998. Т. 34, № 3. С. 309-315.
74. Меламуд B.C., Пивоварова Т.А., Турова Т.П., Колганова Т.В.,Осипов Г.А., Лысенко A.M., Кондратьева Т.Ф., Каравайко Г.И Новая умеренно-термофильная бактерия Sulfobacillus sibiricus sp.nov. // Микробиология. 2003. Т.72. № 4. С. 1-8.
75. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции и процесс диссоциации. М.:Изд-во МГУ. 1991.144 С.
76. Мунтян М.С., Грабович М.Ю. Патрицкая В.Ю., Дубинина Г.А. Регуляция метаболических и электрон-транспортных путей у пресноводного штамма Beggiatoa leptomiformis Д-402 // Микробиология. 2005. Т.74. № 4. С.452-459.
77. Намсараев З.Б., Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Бурюхаев С.П., Юрков В.В. Структура и биогеохимическая активность фототрофных сообществ щелочного термального Болыпереченского источника //Микробиологияю. 2003. Т.72. №2. С.228-238.
78. Негрин С., Нефелова М.В., Гаврилова Е.М., Моралес С., Егоров Н.С. Внутриклеточное содержание АТФ и биосинтез нонактина //Антибиотики и мед. биотехнология. Т.32. №8. С.579-582.
79. Нетрусов А.И., Юдина Т.Г. Окисление неорганических соединений серы и железа тиобациллами. /В кн. Избранные задачи большого практикума по микробиологии. М.; Изд-во МГУ. 1991. С.101-104.
80. Определитель бактерий Берджи. Под ред.Дж. Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уильямса. Перев.с англ. под ред. Г.А. Заварзина. Девятое издание. В двух томах. М.: Мир. 1997. Том второй. С. 457.
81. Патрицкая В.Ю., Грабович М.Ю., Мунтян М.С., Дубинина Г.А. Литоавтотрофный рост пресноводных бесцветных серобактерий Beggiatoa leptomiformis Д-402 // Микробиология. 2001. Т.71. № 4. С.445-451.
82. Педан Л.В., Ивановский Р.Н. Дыхание Ectothiorhodospira shaposhnikovii при росте на свету и в темноте / Микробиология. 1980. Т.49. С.472-475.
83. Петушкова Ю.П., Ивановский Р.Н. Ферменты, участвующие в метаболизме тиосульфата у Thiocapsa roseopersicina при росте в разных условиях. // Микробиология. 1976 а. Т.45. № 6. С. 960-965.
84. Петушкова Ю.П., Ивановский Р.Н. Окисление сульфида Thiocapsa roseopersicina II Микробиология. 1976 б. Т.45. № 4. С. 592-597.
85. Пииевич А.В. Микробиология железа и марганца / Из-во С.-Петербургского ун-та. 2005. 367 С.
86. Питрюк А.В. Особенности энергетического метаболизма экстремально галоалкалофильных анаэробных прокариот. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. М.: ИНМИ РАН, 2002,25 С.
87. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А. Окислительный стресс у микроаэрофильных бактерий Spirillum winogradskii и системы аптиоксидантной защиты клеток // Микробиология. 2003. Т.72. № 5. С.600-608.
88. Подкопаева Д.А Филогенетическая гетерогенность серных спирилл и физиология микроаэрофильных представителей // Автореферат дис. канд. биол. наук. Москва. 2005. 24 С.
89. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А. Функциональная роль неорганических восстановленных соединений серы в метаболизме микроаэрофильных бактерий Spirillum winogradskii II Микробиология. 2005. Т.74. № 1. С. 17-25.
90. Работнова И.Л. Действие тяжелых металлов на рост микроорганизмов. В сб. Лимитирование и ингибирование микробиологических процессов /Пущино. 1980. С.3-21.
91. Резников А.А., Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. Методы анализа природных вод, 1970. М.: Недра. С. 140-143.
92. Родова Н.А. Дыхательная система фототрофных пупурных бактерий // Успехи микробиологии. 1980. Т.15.С.З-22.
93. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. М., Наука. 1980.160 С.
94. Романова А.К. Ассимиляция углекислоты при хемолитоавтотрофии. // В: "Хемосинтез" / под ред. Иванова М.В. М.: Наука. 1989. С. 148-169.
95. Самуилов В.Д., Олескин А.Д. Технологическая биоэнергетика / Из-во МГУ. 1994.189 С.
96. Северина J1.0., Сешошкин А.А., Каравайко Г.И. Ультраструктура и химический состав S-слоя Sulfobacillus thermosulfidooxidans II Доклады Академии Наук. 1993. Т.328. № 5. С.633-636.
97. Северина Л.О., Сенюшкин А.А., Каравайко Г.И. Структура и химический состав S-слоев представителей рода Sulfobacillus И Микробиология. 1995. Т.64 № 3. С.336-344.
98. Северина Л.О., Сенюшкин А.А., Сузина Н.Е., Каравайко Г.И. Ультраструктурная организация поверхностного слоя клеточной стенки Sulfobacillus thermosulfidooxidans. II Микробиология. 1998. Т.67. № 6. С.762-766.
99. Сенюшкин А.А., Северина Л.О., Митюшипа Л.Л. Образование полисахаридной капсулы Sulfobacillus thermosulfidooxidans в олиготрофных и миксотрофных условиях. // Микробиология. 1997. Т.66. № 4. С.455-461.
100. Сенюшкин А.А. Поверхностные слои сульфобацилл. /Автореф. дисс. канд. биол.наук. Москва. 1999. 22 С.
101. Серебрякова Л.Т., Зорин Н.А., Гоготов И.Н., Кеппеп О.И. Активность гидрогеназы у термофильной зеленой бактерии Chloroflexus aurantiacus II Микробиология. 1989. Т.58.№4.С.539-543.
102. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. / М.: Наука. 1989. 564 С.
103. Стром Е.В., Динариева Т.Ю., Нетрусов А.И. Цитохром cbo облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatus КТ является цитохром-с-оксидазой // Микробиология. 2004. Т.73. №2. С. 157-162.
104. Сузина Н.Е., Северина JI.O., Сенюшкин А. А., Каравайко Г.И., Дуда В.И. Ультраструктурная организация мембранного аппарата Sulfobacillus thermosulfidooxidans II Микробиология. 1999. Т.68. № 5. С.491-500
105. Уголькова Н.В. Механизм фиксации С02 у зеленых нитчатых бактерий / Автореф. дисс. канд. биол.паук. 2000.23 С.
106. Уголькова Н. В., Ивановский Р. Н. О механизме автотрофной фиксации углекислоты у Chloroflexus aurantiacus II Микробиология. 2000. Т. 69. № 2. С. 175-179.
107. Фрунджян В.Г. Биолюминесцентная АТФ-метрия в клинической и санитарной микробиологии /Автореф. дис.канд.биол наук. Москва. 1999. 24 С.
108. Фрунджян В.Г., Бровко Л.Ю., Бабунова B.C. Карташова В.М., Угарова Н.Н. Биолюминесцентный метод определения общей бактериальной обсемененности сырого молока // Прикл. биохим. микробиол. 1999. Т. 35. №3. С.358-365.
109. Хансон Р., Филлипс Дж. Химический состав бактериальной клетки // В кн. "Методы общей бактериологии" под ред. Герхарда Ф.М. М.: Мир. 1984. Т.2. С. 295-297.
110. Цаплина И.А., Богданова Т.И., Саякин Д.Д., Каравайко Г.И. Влияние органических веществ на рост Sulfobacillus thermosulfidooxidans 1269 и окисление пирита. // Микробиология. 1991. Т. 60. №6. С. 34-40.
111. Цаплина И.А., Осипов Г.А., Богданова Т.И., Недорезова Т.П., Каравайко Г.И. Жирно-кислотный состав липидов термоацидофильпых бактерий рода Sulfobacillus. И Микробиология. 1994. Т.63. № 5. С. 821-830.
112. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М. Мир. 1971. 508 С.
113. Чернядьев И.И., Кондратьева Е.Н., Доман Н.Г. Ассимиляция углекислоты у Rhodopseudomonaspalustris И Изв. АН СССР. Сер. биол. 1969. №5. С.670-675.
114. Alexander В., Leach S., Ingledew W.S. The relationship between chemiosmotic parameters and sensivity to anions and organic acids in the acidophile Thiobacillus ferrooxidans. II J. Gen. Microbiol. 1987. V. 133. P.l 171-1179.
115. Anderson L.E., Fuller R.C. Photosynthesis in Rhodospirillum rubrum: III. Metabolic control of reductive pentose phosphate and tricarboxylic acid cycle enzymes // Plant Physiol. 1967. V.42. №4. P.497-502.
116. Anfmsen C.B. Aconitase from pig heart muscle. // In: Methods in enzymology. / Ed. Colowick
117. P., Kaplan N.O. New York: Acad.Press. 1955. V. 1. P. 695-698.
118. Ashida H., Saito Y., Kojima C., Kobayashi K., Ogasawara N., Yokota A. A functional link between RuBisCO-like protein of Bacillus and photosynthetic RuBisCO // Science. 2003. V.302. P.286-290.
119. Ashida H., Dancin A., Yokota A. Was photosynthetic RuBisCO recruited by acquisitive evolution from RuBisCO-like proteins involved in sulfur metabolism? // Res. Microbiol. 2005. V.156. № 5-6. P.611-618.
120. Ashwell G. Colorimetric analysis of sugars. Anthrone reaction. // Methods Enzymol. 1957. V.3.P.84-85.
121. Apel W.A., Dugan P.R., Tuttle J.H. Adenosine 5'-triphosphate formation in Thiobacillus ferrooxidans vesicles by H+ ion gradients comparable to those of environmental condition. // J. Bacterid. 1980. V. 142. №. 1. P. 295-301.
122. Atkinson Т., Cairns S., Cowan D.A., Danson M.J., Hough D.W., Johnson D.B., Norris P.R., Raven N., Robinson C., Robson R., Sharp R.J. A microbial survey of Montserrat island hydrothermal biotopes. // Extremophiles. 2000. V. 4. P. 305-313.
123. Babcock G.T., Wikstrom M. Oxygen activation and the conversation energy in cell respiration // Nature. 1992. V.356. P.301-309.
124. Bacelar-Nicolau P., Johnson D.B. Leaching of pyrite by acidophilic heterotrophic iron-oxidizing bacteria in pure and mixed cultures. // Appl. Environm. Microbiol. 1999. V. 65. № 2. P. 585-590.
125. Baker В. J., Banfield J.F. Microbial communities in acid mine drainage. // FEMS Microbiol. Ecol., 2003. V. 44. P. 139-152.
126. Bakker E.P. The role of alkali-cation transport in energy coupling of neutrophilic and acidophilic bacteria: an assessment of methods and concepts. // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 75. №2-3. P. 319-334.
127. Bartsch R.G. Cytochromes // The photosynthetic bacteria. Plenum Press. New York. 1978. P.249-280.
128. Barr D.W., Ingledew W.J., Norris P.R. Respiratory chain components of iron-oxidizing, acidophilic bacteria. // FEMS Microbiol. Lett. 1990. V. 70. № 1. P. 85-90.
129. Bassham J. A., Calvin M. The path of carbon in photosynthesis. Englewood Cliffs, NJ: Prentice Hall. 1957.104 P.
130. Beatty J.T., Gest H. Generations of succinyl-coenzyme A in photosynthetic bacteria // Arch.Microbiol. 1981. V.129. №5. P335-340.
131. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Ed. by Boone D.R., Castenholz R.W. 2nd edition. Springer. 2001. V.l.
132. Bergmeyer H.U. Methods of enzymatic analysis. Acad. Press. 1963. P.543-573.
133. Bergmeyer H.U., Gawehn K., Grasse M. Enzymes as biochemical reagents. // In: "Methods of enzymatic analysis". Acad, press. New York. San Francisco. London. 1974. V. 1. P. 425-522.
134. Beudeker R.F., Gottschal J. C., Kuenen J.G. Reactivity versus flexibility in thiobacilli. // Antonie van Leeuvenhoek. 1982. V. 48. № 1. P. 39-51.
135. Blake R.C., Shute E.A., Greenwood M.M., Speacer G.H., Ingledew W.J. Enzymes of aerobic respiration on iron. // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. P. 9-18.
136. Bond P.L., Smriga S.P., Banfield J.F. Phylogeny of microorganisms populating a thick, subaerial, predominantly lithotrophic biofilm at an extreme acid mine drainage site. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. № 9. p. 3842-3849.
137. Bond P.L., Druschel G.K., Banfield J.F. Comparison of acid mine drainage microbial communities in physically and geochemically distinct ecosystems. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. № 11. P. 4962-4971.
138. Bonjour F., Aragno M. Bacillus tusciae, a new species of thermoacidophilic, facultatively chemolithoautotrophic, hydrogen oxidizing sporeformer from a geothermal area. // Arch. Microbiol. 1984. V. 139. P. 397-401.
139. Borris R., Ohmann R. Citrate synthase as a key enzyme in the regulation of heterotrophic and autotrophic metabolism of Rhodopseudomonas //Biochem. Physiol. Pflanz. 1972. V.163. №3. P.328-333.
140. Bowes G., Ogren W. L., Hagerman R. H. Phosphoglycolate production catalyzed by ribulose diphosphate carboxylase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. V. 45. № 3. P. 716-722.
141. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. // Anal. Biochem. 1976. V.42. P.248-254.
142. Bridge T.A.M., Johnson D.B. Reduction of soluble iron and reductive dissolution of ferric iron-containing minerals by moderately thermophilic iron-oxidizing bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. №6. P. 2181-2186.
143. Brierley J.A. Thermophilic iron-oxidizing bacteria found in copper leaching dumps. // Appl. Environ. Microbiol. 1978. V. 36. P. 523-525.
144. Brierley J.A., Norris P.R., Kelly D.P., LeRoux N.W. Characteristics of a moderately thermophilic and acidophilic iron-oxidizing Thiobacillus. II Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1978. V. 5. P. 291-299.
145. Brock T.D., Gustafson J. Ferric iron reduction by sulfur- and iron-oxidizing bacteria. // Appl. Environm. Microbiol. 1976. V. 32. № 4. P. 567-571.
146. Brune D. C. Sulfur oxidation by phototrophic bacteria // Biochim. Biophys Acta. 1989. V.975. P. 189-221.
147. Brune D. C. Sulfur compounds as photosynthetic electron donors // Anoxygenic photosynthetic bacteria / Ed. by R. E. Blankenship, M. T. Madigan, С. E. Bauer. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1995. P. 847-870.
148. Bryantseva I., Gorlenko V.M., Kompantseva E.I., Imhoff J.F., Suling J., Mityushina L. Thiorhodospira sibirica gen.nov., sp.nov., a new alkaliphilic purple sulfur bacterium from a Siberian soda lake // Int.J.Syst.Bacteriol. 1999. V. 55. P.697-703.
149. Buchanan B.B., Arnon D.I. A reverse Krebs cycle in photosynthesis: consensus at last // Photosynth. Res. 1990. V. 24. P. 47-53.
150. Buchanan B.B., Evans M.C.W., Arnon D. Ferredoxin-dependent carbon assimilation in Rhodospirillum rubrum II Arch.Microbiol. 1967. V.59. №1. P. 32-40.
151. Buchanan B.B. Ferredoxin-Linked Carboxylation Reactions // The Enzymes. London.: Acad.Press. 1972. V.6. P. 193-216.
152. Buchanan B.B. Ferredoxin-Linked Carbon Dioxide Fixation in Photosynthetic bacteria //Enceclopedia of Plant physiology / Eds. Gibbs M., Natzko E. Berlin, Heidelberg. 1979. P.416-424.
153. Bucher Т., Peleiderer G. Pyruvate kinase from muscle. // In: Methods in enzymology. / Ed. Colowick S.P., Kaplan N.O. New York: Acad.Press. 1955. V. 1. P. 435-440.
154. Castenholz R.W., Pierson B.K. Isolation of members of the family Chloroflexaceae. // In The Prokaryotes / Eds. Starr P., Stolp H., Trtiper H.G., Balows A., Schlegel H.G. Springer-Verlag. Berlin. Heidelberg. New York. 1981. V. 1. P. 291-298.
155. Castenholz R.W., Pierson B.K. Ecology of thermophilic Anoxygenic Phototrophs // Anoxygenic Photosynthetic Bacteria /Eds. Blankenship R.E., Madigan M.T., Bauer C.E./Kluwer Academic Publishers. 1995. P.87-103.
156. Cavicchioli R., Thomas T. Extremophiles. // In Encyclopedia of Microbiology. 2000. V. 2. P. 317-337.
157. Chain P. and 14 co-authors Complete genome sequence of the ammonia-oxidizing bacteriumand obligate chemolithoautotrophs Nitrosomonas europaea II J.Bacteriol. 2003 V. 185. P.2759-2773.
158. Ciferri O. Carbohydrate metabolism of Prototheca zopfii. 1. Enzymes of the glycolytic and hexose monophosphate pathways. // Enzymologia. 1962. V. 24. № 5. P. 283.
159. Claassen P.A.M., Kortstee G.J.J., Oosterveld-van Vliet W.M., van Neerven A.R.W. Colonial heterogeneity of Thiobacillus versutus. II J. Bacteriol. 1986, V. 168, № 2, P. 791-794.
160. Clark D.A., Norris P.R. Acidimicrobium ferrooxidans gen. nov.,sp. nov.: mixed culture ferrous iron oxidation with Sulfobacillus species. // Microbiology. 1996 a. V. 142. P. 785-790.
161. Clark D.A., Norris P.R. Acidophilic bacteria and their activity in mineral sulfide oxidation // In: Microbial Mineral Recovery / Eds. Ehrlich H.L. and Brierley C.L. McGraw-Hill, New York, NY. 1996 b. P. 3-27.
162. Claassen P.A.M., Korstee G.J.J., Dijken J.P., Harder W. Tricarboxylic acid and glyoxylate cycle enzyme activities in Thiobacillus versutus, an isocitrate lyase negative organism // Arch.Microbiol. 1986. V.145. P.148-152.
163. Clarke W.A., Konhauser K.O., Thomas J.C., Bottrell S.H. Ferric hydroxide and ferric hydroxysulfate precipitation by bacteria in an acid mine drainage lagoon. // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20, P. 351-361.
164. Colmer A.R., Hinkle M.E. The role of microorganisms in acid mine drainage: a preliminary report. // Science. 1947. V.106. P. 253-256.
165. Conrad R., Schlegel G.H. Regulation of glucose, fructose ans sucrose catabolism in Rhodopseudomonas capsulata. //J.Gen. Microbiol. 1978. V.105. №2. P.305-313.
166. Corbett C.M., Ingledew W.J. Is Fe3+/2+ cycling on intermediate in sulphur oxidation by Fe -grown Thiobacillus ferrooxidansl //FEMS Microbiol. Lett. 1987. V. 41. № 1. P. 1-6.
167. Daron H.H. Grunsalus J.C. Citratase and isocitratase. I I In: Methods in enzymology. / Ed. Colowick S.P., Kaplan N.O. New York: Acad.Press. 1962. V. 5. P. 622-633.
168. Dijkhuizen L., Harder W. Regulation of autotrophic and heterotrophic metabolism in Pseudomonas oxalaticus 0X1. Growth on mixtures of acetate and formate in continuous culture. // Arch. Microbiol. 1979. V. 123. № 1. P. 47-53.
169. Dispirito A.A., Dugan P.R., Tuovinen O.H. Inhibitory effects of particulate materials in growing cultures of Thiobacillus ferrooxidans. II Biotechnol. Bioeng. 1981. V. 23. P. 2761-2769.
170. Dopson M., Lindstrom E.B. Potential role of Thiobacillus caldus in arsenopyrite bioleaching // Appl. Environ. Microbiol. 1999. P. 65. № 1. P. 36-40.
171. Duda V.I., Suzina N.E., Severina L.O., Dmitriev V.V. Karavaiko G.I. Formation of flat lamellar intramembrane lipid structures in microorganisms. // J.Membr. Biol. 2001. V. 180. № 3. P. 33-48.
172. Dufresne S., Bousquet J., Boissinot M., Guay R. Sulfobacillus disulfidooxidans sp. nov., a new acidophilic, disulfide-oxidizing, gram-positive, spore-forming bacterium. //Intern. J. System. Bacteriol. 1996. V. 46. №. 4. P. 1056-1054.
173. Dukhuizen L., Harder W. Current views on the regulation of autotrophic carbon dioxide fixation via Calvin cycle in bacteria // Antonie van Leeuwenhoek. V.50.1984. №5. P.473-487.
174. Dunn M.F. Tricarboxylic acid cycle and anaplerotic enzymes in rhizobia. // FEMS Microbiol. Rev. 1998. V. 22. P. 105-123.
175. Edwards K.J., Ни В., Hamers R.J., Banfield J.F. A new look at microbial leaching patterns on sulfide minerals. // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 34. № 1. P. 197-206.
176. Edwards, U., Rogall Т., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA//Nucl.Acids Res. 1989. V.17.P.7843-7853.
177. Eidels L., Preise J. Citrate syntase: a regulatory enzyme from Rhodopseudomonas capsulata // J. Biol. Chem. 1970. V.245. №11. P.2937-2945.
178. Eigener U. Adenine nucleotide pool variation in intact Nirobacter winogradskyi cells. // Arch. Microbiol., 1975. V. 102. P. 233-239.
179. Eisenreich W., Strauss G., Weiz U., Fuchs G., Bacher A. Retrobiosynthetic analysis of carbon fixation in the phototrophic eubacterium Chlorojlexus aurantiacus II Eur.J.Biochem. 1993. V.215.P.619-632.
180. Englard S., Siegel L. Mitochondrial L-malate degydrogenase of beef heart. // In: Methods in enzymology. / Ed. Lowenstein. New York etc.: Acad.Press. 1969. V. 13. P. 99-106.
181. English R.S., Williams C.A., Lorbach S.C., Shively J.M. Two forms of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from Thiobacillus denitrificans //FEMS Microbiol. Lett. 1992. V.94.№ 1,2. P.l 11-119.
182. Evans M. C. W., Buchanan В. В., Arnon D. I. A new ferredoxin-dependent carbon reduction cycle in a photosynthetic bacterium // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1966. V. 55. № 4. P. 928-934.
183. Fennol C., Ramirez J.M. Simultaneous presence of two terminal oxidases in the respiratory system of dark aerobically grown Rhodospirillum rubrum //Arch.Microbiol. 1984. V.134. №1. P.42-46.
184. Finn M.W., Tabita F.R. Modified pathway to synthesis ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase in archaea // J.Bacteriol. 2003. V.185. №10. P.3049-3059.
185. Friedrich C.G., Friedrich В., Bowien B. Formation of enzymes of autotrophic metabolism during heterotrophic growth of Alcaligenes eutrophus. //J.Gen. Microbiol. 1981. V. 122. P. 69-78.
186. Friedrich C.G. Derepression of hydrogenase during limitation of electron donors and derepression of ribulosebisphosphate carboxylase during carbon limitation of Alcaligenes eutrophus. HI. Bacteriol. 1982. V. 149. № 1. P. 203-210.
187. Friedrich C.G. Physiology and genetics of sulfur-oxidizing bacteria. // Adv.Microb. Physiol. 1998. V.39. P.235-289.
188. Friedrich C.G., Quentmeier A., Bardischewsky F., Rother D., Kraft R., Kostka S., Prinz H. Novel genes coding for lithotrophic sulfur oxidation of Paracoccus pantotrophus GB17 // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 4677-4687.
189. Friedrich C.G., Rother D., Bardischewsky F., Quentmeier A., Fischer J. Oxidation of reduced inorganic sulfur compounds by bacteria: emergence of a common mechanism? // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 7. P. 2873-2882.
190. Frundjian V.G., UgarovaN.N., Brovko L.Yu. Bioluminescent method to control bactericidal effect of blood. // Bioluminescence and chemiluminescence. 2000. P.277-280.
191. Fuchs G. Oxidation of organic compounds //In: Biology of the Prokaryotes./ Eds.Lengerer J.W., Drews G., Schlegel H.G. Stuttgart, Georg Thieme Verlag. 1999. V.l. P. 236-293.
192. Fuchs Т., Huber H., Burggraf S., Stetter O.K. 16S rDNA-based phylogeny of the archaeal order Sulfolobales and reclassification of Desulfurolobus ambivalens as Acidianus ambivalens comb. nov. //Syst.Appl.Microbiol. 1996. V.19.P.56-60.
193. Fuller R.C. Photosynthetic Carbon Metabolism in the Green and Purple Bacteria //The Photosynthetic Bacteria. London. Plenun Press. 1978. P.691-705.
194. Gadkari D., Stolp H. Energy metabolism of Bdellovibrio bacterivorus. Energy production, ATP pool, energy charge. // Arch. Microbiol., 1975. V. 102. P. 179-183.
195. Gadkari D., Stolp H. Energy metabolism of Bdellovibrio bacterivorus. 2. P/O ratio and ATP pool turnover rate//Arch. Microbiol., 1976. V. 108. P. 125-132.
196. Gehrke Т., Telegdi J., Thierry D., Sand W. Importance of extracellular polymeric substances from Thiobacillus ferrooxidans for bioleaching. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. № 7. P. 2743-2747.
197. Gemerden H., Beeftink H.H. Specific rates of substrate oxidation and product fermentation in autotrophically growing Chromatium vinosum cultures //Arch. Microbiol. 1978. V.l 19. №2. P.135-144.
198. Gibson J.L., Tabita F.R. Isolation and preliminary characterization of two forms of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase from Rhodopseudomonas capsulata // J.Bacteriol. 1977. V.132. № 3. P.818-823.
199. Giffhorn F., Kuhn A. Phototrophic growth on citrate and regulation of citrate lyase in three strains of Rhodopseudomonaspalustris //FEMS Microbiol. Lett. 1980. V. 7. №3. P.225-228.
200. Gleissner M., Elferink M.G.L., Driessen A.J.M., Konings W.N., Anemuller S., Schafer G. Generation of proton-motile force by an archaeal terminal quinol oxidase from Sulfolobus acidocaldarius //Eur. J. Biochem. 1994. V. 216. P.985-990.
201. Gonzales-Toril E., Llobet-Brossa E., Casamayor E.O., Amann R., Amils R. Microbial ecology of an extreme acidic environment, the Tinto river. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 8. P. 4853-4865.
202. Gottschal J.C., Pol A., Kuenen J.G. Metabolic flexibility of Thiobacillus A2 during substrate transition in the chemostat. //Arch. Microbiol. 1981. V. 129. № 1. P. 23-28.
203. Griffiths M.W. The role of ATP bioluminescence in the food industry: new light on old problems. // Food Technol. 1996. V.50. P.62-72.
204. Glide H., Strohl W.R., Larkin J.M. Mixotrophic and heterotrophic growth of Beggiatoa alba in continuous culture //Arch. Microbiol. 1981. V.129. P.357-360.
205. Guffanti A.A., Davidson L.F., Mann T.M., Krulwich T.A. Nigericin induced death of an acidophilic bacterium. // J. Gen. Microbiol. 1979. V. 114. P. 201-206.
206. Hagen K.D., Nelson D.C. Organic carbon utilization by obligately and facultatively autotrophic Beggiatoa strains in homogeneous and gradient cultures. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. №3.P. 947-953.
207. Hallberg K.B., Lindstrom E.B. Characterization of Thiobacillus caldus sp.nov., a moderately thermophilicacidophile. //Microbiology. 1994. V. 140. P. 3451-3456.
208. Hallberg K.B., Yahya A., Bridge T.A.M., Johnson D.B. Sulfobacillus montserratensis sp. nov., and Sulfobacillus ambivalens, sp. nov., represent the first two mesophilic species of the genus Sulfobacillus to be described. // 2000. Direct submission.
209. Hansen T.A. Aerobic growth of Rhodopseudomonas sulfidophila in the dare and in the light //Abstr.Intern. Symp. Phototrophic Procaryotes. Oxford. 1979. P. 13-26.
210. Hansen S., Vollan V.B., Hough E., Andersen K. The crystal structure of Rubisco from Alcaligenes eutrophus reveals a novel central eight-stranded beta-barrel formed by beta-strands from four subunit // J.Mol.Biol. 1999. V.288. № 4. P.609-621.
211. Hanson T.E, Tabita F.R. A ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO)-like protein from Chlorobium tepidum that is involved with sulfur metabolism and response to oxidative stress // Proc. Nat. Acad. Sci. 2001. V.98. № 8. P.4397-4402.
212. Hanson T.E, Tabita F.R. Insights into the stress response and sulfur metabolism revealed by proteome analysis of a Chlorobium tepidum mutant lacking the Ribulose-like protein // Photosynth. Res. 2003. V.78.№3.P.231-248.
213. Harrison A.P. The acidophilic thiobacilli and other acidophilic bacteria that share their habitat // Annu. Rev. Microbiol. 1984. V.38. P.265-292.
214. Hastings J.W., Weber G. Total quantum flux of isotopic source // Opt. Soc. Am. 1963.V.53. №12. P.1410-1415.
215. Heinhorst S., Baker S.H., Johnson D.R., Davies P.S., Cannon G.C., Shively J.M. Two copies of form I RuBisCO genes in Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 //Curr.Microbiol. 2002.V.45. №2. P. 115-117.
216. Hernandez J.M., Baker S.H., Lorbach S.C., Shively J.M., Tabita F.R. Deduced amino form II ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase from the chemoautotrophic bacterium Thiobacillus denitrificans // J.Bacteriol. 1996. V.178. № 2. P.347-356.
217. Holden P.J. Characterisation of carbon fixation in the iron-oxidizing moderate thermophile NMW6. // In: Biohydrometallurgikal Technologies. / Ed. Torma A.E., Wey J.E., Lakshmanan V.L. The Minerals, Metals and Material Society. 1993. P. 705-714.
218. Horken K., Tabita F.R. The «green» form I ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from nonsulfur purple bacterium Rhodobacter capsulatus Hi. Bacteriol. 1999. V. 181. № 13. P.3935-3941.
219. Huber G., Spinnler C., Gamba-Corta A., Stetter К. O. Metallosphaera sedula of gen.and sp. nov., represents a new genus of aerobic metal-mobilizing, thermoacidophilic archae bacteria // Syst. Appl. Microbiol. 1989. V. 12. № 1. P. 38 47.
220. Huber G., Stettler K. 0. Sulfolobus metallicus, sp. nov., a novel strictly chemolithotrophic thermophilic archaea species of metal-mobilizers // Syst. Appl. Microbiol. 1991. V. 14. № 4. P. 372 -378.
221. Hudig H., Drews G. Respiratory deficient mutant of Rhodopseudomonas capsulata // Abstr. Intern. Symp.Photosynt. Procaryotes. Grindelwald, Switzerland. 1985. P.233.
222. Hiigler M., Huber H., Stetter K.O., Fuchs G. Autotrophic СОг fixation pathways in archaea (1Crenarchaeota). //Arch. Microbiol. 2003. V. 179. P. 160-173.
223. Imhoff J.F. Taxonomy and physiology of phototrophic purple and green sulfur bacteria /In: Anoxygenic photosynthetic bacteria. Kluwer Academic Publischer. 1995. P.l-15.
224. Imhoff J.F., Suling J., Petri R. Phlogenetic relationship and taxonomic reclassification of Chromatium species and related purple sulfur bacteria. // Int.J.Syst.Bacteriol. V.48.1998. P.1029-1043.
225. Inui M., Dumay V., Zahn K., Yamagata H., Yukawa H. Structural and functional analysis of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene from the purple nonsulfur bacterium Rhodopseudomonas palustris No. 7 // J. Bacteriol. 1997. V. 179. № 15. P. 4942-4945.
226. Inui M., Nakata K., Roh J. H., Zahn K., Yukawa H. Molecular and functional characterization of the Rhodopseudomonas palustris No. 7 phosphoenolpyruvate carboxykinase gene // J. Bacteriol. 1999. V. 181. №9. P. 2689-2696.
227. Ivanovsky R. N., Sintsov N.V., Kondratieva E.N. ATP-linked citrate-lyase activity in the green sulfur bacterium Chlorobium limicola f. thiosulfatophilum II Arch. Microbiol. 1980. V.128. P.239-241.
228. Ivanovsky R. N. Calvin cycle in a green mesophilic filamentous bacterium Oscillochloris trichoides strain DG-6.// EMBO Workshop on Green and Heliobacteria. Nyborg. 1993. P.42.
229. Ivanovsky R. N., Krasilnikova E. N., Fal Y. I. A pathway of the autotrophic CO2 fixation in Chloroflexus aurantiacus //Arch. Microbiol. 1993. V. 159. № 3. P. 257-264.
230. Iwata S., Ostermeier C., Ludwig В., Michel H. Structure at 2.8 A resolution of cytochrome с oxidase from Paracoccus denitrificans //Nature. 1995. V.376. P.660-669.
231. Johnson D.B., McGinness S. Ferric iron reduction by acidophilic heterotrophic bacteria. // Appl. Environm. Microbiol. 1991. V. 57. № 1. P. 207-211.
232. Johnson D.B. Selective solid media for isolating and enumerating acidophilic bacteria. // J. Microbiol. Meth. 1995. V. 23. P. 205-218.
233. Johnson D.B., Roberto F.F. Heterotrophic acidophiles and their roles in the bioleachin of sulfide minerals. // In: Biomining: Theory, Microbes and Industrial Processes. / Ed Rawling D.E. Springer, Berlin, 1997. P. 259-279.
234. Johnson D.B. Biodiversity and ecology of acidophilic microorganisms. //FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 307-317.
235. Johnson D.B., Hallberg K.B. The microbiology of acidic mine waters. // Research in Microbiology. 2003. V. 154. P. 466-473.
236. Johnson D.B., Okibe N., Roberto F.F. Novel thermo-acidophilic bacteria isolated from geothermal sites in Yellowstone national park: physiological and philogenetic characteristics. // Arch. Microbiol. 2003. V. 180. P. 60-68.
237. Jones G.E., Starkey R.L. Surface-active substances, produced by Thiobacillus thiooxidans. // J. Bacteriol. 1961. V. 82. № 5. P. 788-789.
238. Jong G.A.H., Hazeu W., Bos P., Kuenen G.J. Isolation of the tetrathionate hydrolase from Thiobacillus acidophilus II Eur. J.Biochem. V.243. 1997 a. V. 243. P.678-683.
239. Jong G.A.H., Hazeu W., Bos P., Kuenen G.J. Polythionate degradation by tetrayhionate hydrolase of Thiobacillus ferrooxidans II Microbiology. 1997. V. 143. P.499-504.
240. Jordan D.B., Ogren W.L. Species variation in the specificity of ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase // Nature. 1981. V.291. P.513-515.
241. Joshi M., Tabita R.F. Induction of carbon monoxide dehydrogenase to facilitate redox balancing in a ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase-deficient mutant strain of Rhodospirillum rubrum //Arch.Microbiol. 2000. V.173.P.193-199.
242. Jouanneau Y., Tabita F.R. Independent regulation of synthesis of form I and form II ribulose bisphosphate carboxylase-oxygenase in Rhodopseudomonas sphaeroides //J.Bacteriol. 1986. V.165. № 2. P.620-624.
243. Kahru A., Liiders M., Vanatalu K, Vilu R. Adenylate energy charge during batch culture of Thermoactinomyces vulgaris 42 // Arch. Microbiol. 1982. V.133. P.142-144.
244. Kahru A., Vilu R. On characterization of the growth of Escherichia coli in batch culture // Arch. Microbiol. 1983. V.135. P.12-15.
245. Kampf C., Pfennig N. Capacity of chromatiaceae for chemotrophic growth. Specific respiration rates of Thiocystis violaceae and Chromatium vinosum //Arch.Microbiol. 1980. V.127. №2. P.125-135.
246. Kappler U., Dahl K. Enzymology and molecular biology of prokaryotic sulfite oxidation. // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 203. № 1. P. 1-9.
247. Karavajko G.I., Bulygina E.S., Tsaplina I.A., Bogdanova T.I., Chumakov K.M. Sulfobacillus thermosulfidooxidans: a new lineage of bacterial evolution? // FEBS Letters. 1990.1. V. 261. №1. P. 8-10.
248. Karavaiko G.I., Smolskaja L.S., Golyshina O.K., Jagovkina M.A., Egorova E.Y. Bacterial pyrite oxidation: influence of morphological, physical and chemical properties. // Fuel Processing Technology. 1994. V. 40. P. 151-165.
249. Karavaiko G.I. Microbial aspects of biohydrometallurgy. // Journal of Mining and Metallurgy. 1997. V. 33. P. 51-68.
250. Kelly D.P. The incorporation of acetate by the chemoautotroph Thiobacillus neapolitanus strain С // Arch.Mikrobiol. 1967. V.58. P. 99-116.
251. Kelly D.P. Autotrophy concepts of lithotrophic bacteria and their organic metabolism // Annu. Rev.Microbiol. 1971 .V.25.P. 177-210.
252. Kelly D.P. Phsiology and biochemistry of unicellular sulfur bacteria//Autotrophic bacteria /Eds. Schlegel H.G., Bowien B. London. Publ. Madison. Wise. Science Techn. 1989. P.193-217.
253. Kelly D.P., Shergill J.K., Lu W.-P., Wood A.P. Oxidative metabolism of inorganic sulfur compounds by bacteria. // Antonie van Leeuwenhoek. 1997. V. 71. P. 95-107.
254. Kelly D.P. The Chemolithotrophic Procaryotes. // In The Procaryotes. / Eds. Balow A., et al.-New-York; Berlin; Heidelberg; London; Paris; Tokyo; Hong Kong; Barcelona; Budapest: Springer -Verlag, 1992. V. l.P. 331-343.
255. Kelly D.P. Thermodynamic aspects of energy conservation by chemolithotrophic sulfur bacteria in relation to the sulfur oxidation pathways .//Arch. Microbiol. 1999. V. 171. № 3.P 219-229.
256. Kelly D.P., McDonald I.R., Wood A.P. Proposal for the reclassification of Thiobacillus novellus as Starkeya novella gen. nov., comb, nov., in the a-subclass of the Proteobacteria. // Int. J. System. Bacterid. 2000. V.50. P. 1797-1802.
257. Kelly D.P., Wood A.P. Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov. // Int. J. System. Bacteriol. 2000. V.50. P. 511-516.
258. Keppen O.I., Baulina O.I.,Kondratieva E.N. Oscillochloris trichoides neotype strain DG-6// EMBO Workshop on Green and Heliobacteria. Nyborg. 1993. P.51.
259. Key J.O., Suzuki, I. Isolation and characterization of membrane-associated thiosulphate-oxidizing system of Thiobacillus novellus. J. Gen. Microbiol. 1977. V. 99. P. 397-412.
260. Khanna S., Kelley B.C., Nicholas D.I. Oxygen inhibition of the photoassimilation of CO2 in Rhodopseudomonas capsulata / Arch. Microbiol. 1981. V.128. № 5. P. 421-423.
261. Kingma J.G., Silver M. Autotrophic growth of Thiobacillus acidophilus in the presence of a surface-active agent, tween 80. // Appl. Environm. Microbiol. 1979. V. 38. № 5. P. 795-799.
262. Knight M. The photometabolism of propionate by the Rhodospirillum rubrum. /Biochem. J. 1962. V.84. № l.P. 170-185.
263. Knouw B.T., McCurdy U.D. Tricarboxylic asid cycle enzymes and morphogenesis in Blastocladiella emersonii. II J. Bacteriol. 1969. V. 99. № 1. P. 197-206.
264. Komnitsas K., Paspaliaris I., Zilberchmidt M., Groudev S. Environmental impacts at coal waste disposal sites efficiency of desulfiirization technologies. // Global Nest: the Int. J. 2001. V. 3. № 2. P. 109-116.
265. Kondratieva E. N., Ivanovsky R. N., Krasilnikova E. N. Carbon metabolism in Chlorojlexus aurantiacusll FEMS Microbiol. Lett. 1992. V. 100. P. 269-272.
266. Konishi Y., Asai S., Yoshida N. Growth kinetics of Thiobacillus thiooxidans on the surface of elemental sulfur. //Appl. Environm. Microbiol. 1995. V. 61. № 10. P. 3617-3622.
267. Kuenen J.G., Beudeker R.F. Microbiology of thiobacilli and other sulfur-oxidizing autotrophs, mixotrophs and heterotrophs / Phil.Trans. R.Soc. London. 1982. V.298. P.473-497.
268. Kuenen J.G., Pronk J.T., Hazeu W., Meulenberg R., and Bos P. A rewiew of bioenergetics and enzymology of sulfur compound oxidation by acidophilic thiobacilli. // In Biohydrometallurgical technologies. / Eds. Torma A.E. et al. 1993. V. 2. P. 487-494.
269. Kuenen J.G. Oxidation of neorganic compounds by chemolithotrophs //In: Biology of the Prokaryotes./ Eds.Lengerer J.W., Drews G., Schlegel H.G. Stuttgart, Georg Thieme Verlag. 1999. V.l.P. 303-334.
270. Kuenen J.G., Robertson L.A. Combined nitrification-denitrification processes //FEMS Microbiol. Rev. 1994. V.15. P. 109-117.
271. Kusano Т., Takeshima Т., Inoue C., Sugawara K. Evidence for two sets of structural genes coding for ribulose bisphosphate carboxylase in Thiobacillus ferrooxidans //J.Bacteriol. 1991. V.173. №22. P.7313-7323.
272. Kusian В., Bowien B. Organization and regulation of CO2 assimilation genes in autotrophic bacteria//FEMS Microbiol. Rev.1997. V.21. № 2. P.135-155.
273. Kusian В., Bednarski R., Husemann M., Bowien B. Characterization of the duplicate ribulose1,5-bisphosphate carboxylase genes and ebb promoters of Alcaligenes eutrophus II J.Bacteriol. 1995. V.177. № 15. P.4442-4450.
274. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature. 1970. V.227. №259. P. 680-685.
275. Lane D.J., Harrison A.P., Stahl D., Pase В., Giovannoni S.J., Pase N.R. Evolutionary relationships among sulfur- and iron-oxidizing eubacteria.//J.Bacteriol. 1992.V.174. № 1. P.269-278.
276. Larsen H. On the culture and general physiologie of the green sulfur bacteria // J.Bacteriol. 1952. V. 64. №2. P. 187-194.
277. Lascelles J. Regulation of pyrrole synthesis /In: The Photosynthetic Bacteria. Plenum Press, New York. 1978. P.795-808.
278. Lea P.J., Chen Z.H., Leegooa R.C., Walker R.P. Does phosphoenolpyruvate carboxykinase have a role in both amino acid and carbohydrate metabolism //Amino Acids. 2001. V.20. P.225-241.
279. Ling K.N., Paetkau V., Marcus F., Lardy H.A. Phosphofructokinase. // In: "Methods in enzymology". Acad, press. New York. London. 1966. V. 9. P. 425-429.
280. London J., Rittenberg S.C. Effects of organic matter on the growth of Thiobacillus intermedius. //J. Bacteriol. 1966. V. 91. №3. P. 1062-1069.
281. Lowry, O.H., Rosenbrough, H.J., Farr, A.L.Randell, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.
282. Lovley D.R. Dissimilatory metal reduction. // Annual Rev. Microbiol. 1993. V. 47. P. 263-290.
283. Lyric R.M., Suzuki I. Enzymes involved in the metabolism of thiosulfate by Thiobacillus thioparus. I. Survey of enzymes and properties of sulfite: cytochrome с oxidoreductase. // Can. J. Biochem. 1970 a. V. 122. № 1. P. 334-343.
284. Lyric R.M., Suzuki I. Enzymes involved in the metabolism of thiosulfate by Thiobacillus thioparus. II. Properties of the adenosine-5'-phosphosulfate reductase. // Can. J. Biochem. 1970 b. V. 122. № l.P. 344-354.
285. Madigan M.T., Gest H. Growth of the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas capsulata chemoautotrophically in darkness with H2 as the energy sourcec //J.Bacteriol. 1979. V.137. №1. P. 524-530.
286. Maeda N., Kanai Т., Atomi H., Imanaka T. The unique pentagonal structure of an archaeal rubisco is essential for its high thermostability. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 35. P. 3165631662.
287. Manning H.L. New medium for isolating iron-oxidizing and heterotrophic acidophilic bacteria from asid mine drainage. //Appl. Microbiol. 1975. V. 30. P. 1010-1015.
288. Marsh R.M., Norris P.R. The isolation of some thermophilic, autotrophic iron- and sulfur-oxidizing bacteria//FEMS Microbiol. Lett. 1983. V. 17. P. 311-315.
289. Massey V. Fumarase. // In: Methods in enzymology. / Ed. Colowick S.P., Kaplan N.O. New York: Acad.Press. 1955. V. 1. P.729-735.
290. Matin A., Rittenberg S.C. Utilization glucose in heterotrophic media by Thiobacillus intermedius. II J. Bacteriol. 1970 a. V. 104. № 1. P. 234-238.
291. Matin A., Rittenberg S.C. Regulation of glucose metabolism in Thiobacillus intermedius. II J. Bacteriol. 1970 b. V. 104. № 1. P. 239-246.
292. Matin A. Keeping a neutral cytoplasm: the bioenergetics of obligate acidophiles. // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 75. № 2-3. P. 307-318.
293. McFadden B. A. Assimilation of one-carbon compounds // The bacteria/Eds.Ornson L.N., Sokatch J.R. / Acad. Press. 1978. V.6. P.219-304.
294. McFadden B. A., Shively J. M. Bacterial assimilation of carbon dioxide by the Calvin cycle // Variations in autotrophic life / Ed. by J. M. Shively. London: Acad. Press, 1991. P. 25-49.
295. Merrick J.,M. Metabolism of reserve material. //The Photosynthetic bacteria. Plenum Press, New York. 1978. P. 199-222.
296. Meulenberg R., Scheer E.J., Pronk J.T., Hazeu W., Bos P., Kuenen J.G. Metabolism of tetrathionate in Thiobacillus acidophilus. // FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 112. P.167-172.
297. Miernyk J.A., Trelease R.N., Choinsky G.S. Malate synthase activity in cotton and other ungerminated oilseeds. // Plant physiology. 1979. V. 63. № 6. P. 1068-1071.
298. Miculic K, Benada O., Andernova M. Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase of thermophilic hydrogen-oxidizing microorganism Bacillus schlegelii. II Biochem. Biophys. Res. Comm. 1992. V. 182. №1. P. 425-431.
299. Miziorko H.M., Lorimer G.H. Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxigenase // Annu. Rev.Biochem. 1983. V.52. P.507-535.
300. Moreira D., Amilis R. Philogeny of Thiobacillus cuprinus and other mixotrophic thiobacilli: proposal for Thiomonas gen. nov. // Int. J. System. Bacteriol. 1997. V.47. P. 522-528.
301. Morohashi M., Winn E.E., Borisuk M.T., Balouri H. Doyle I.J., Kitano H. Robustness as a measure of plausibility in models of biochemical networks // J.Theor.Biol. 2002. V.216. P.19-30.
302. Nelson D.C, Castenhoz R.W. Use of reduced sulfur compounds by Beggiatoa sp. /J.Bacteriol. 1981. V.147. P.140-154.
303. Nelson D.C., Hagen K.D. Physiology and Biochemestry of Symbiotic and Free-Living Chemoautotrophic Sulfur Bacteria. // Amer. Zool. 1995. V. 35. P. 91-101.
304. Nelson D.C, Jannasch H.W, Chemoautotrophic growth of marine Beggiatoa in sulfide gradient cultures //Arch. Microbiol. 1983. V.136. P,262-269.
305. Nelson D.C, Jorgensen B.B, Revsbach N.P. Growth pattern and yield of hemoautotrophic Beggiatoa sp. in oxygen -sulfide microgradients I I Appl. Environ.Microbiol. 1986. V. 52. P. 225233.
306. Nielsen A.M., Sojka G.A., Photoheterotrophic utilisation of acetate by the wild type and acetate-adapted of Rhodopseudomonas capsulata //Arch.Microbiol. 1979. V.120. №1. P.39-42.
307. Norris P.R., Murrell J.C., Hinson D. The potential for diazotrophy in iron- and sulfur-oxidizing acidophilic bacteria. // Arch. Microbiol. 1995. V. 164. № 2. P. 294-300.
308. Norris P.R., Clark D.A., Owen J.P., Waterhouse S. Chracteristics of Sulfobacillus acidophilus sp.nov. and other moderately thermophilic mineral-sulphide-oxidizing bacteria. //Microbiology. 1996. V. 142. P. 775-783.
309. Oelze J., Drews G. Membrane of phototrophic bacteria /In: Organisation of prokaryotic cell membranes.CRC Press. 1981. V.2. P.131-195.
310. Okibe N., Johnson B. Bioleaching of pyrite by defined mixed cultures of moderately thermophilic acidophiles. // Biohydrometallurgy: Fundamentals, Technology and Sustainable Development, Part A. / Ed. Ciminelli V.S.T., Garcia 0.2001. P. 443-451.
311. Okibe N., Gericke M., Hallberg K.B., Johnson D.B. Enumeration and characterization of acidophilic microorganisms isolated from a pilot plant stirred tank bioleaching operation. //Appl. Environm. Microbiol., 2003, V. 69, № 4, P. 1936-1943.
312. Olson et al., Iverson W.P. Brinkman F.E. Valatilization of mercury by Thiobacillus ferrooxidans ///Curr. Microbiol. 1981. V.5. № 2, P. 115-118.
313. Ormerod J.G., Sirevag R. Essential Aspects of Carbon Metabolism //The Phototrophic Bacteria: Anaerobic Life in the Light. Oxford, London. Blackwell Sci Publications. 1983. P. 11-119.
314. Oyaizu H., Debrunner-Vossbrinck В., Mandello L., Studier J.A., Woese C.R. The green non-sulfur bacteria: a deep branching in the eubacterial line of descent // System. Appl. Microbiol. 1987. V.9.P.47-53.
315. Paavilainen S. Carbohydrate catabolism in alkaliphilic bacilli. // Academic dissertation. Turku. Finland. 1995.123 P.
316. Padden A.N., Kelly D.P., Wood A.P. Chemolithoautotrophy and mixotrophy in the thiophene-2-carboxylic acid-utilizingXanthobacler tagetidis. II Arch. Microbiol., 1998. V. 169, № 3, P. 249256.
317. Park S.S., DeCicco B.T. Hydrogenase and ribulose diphosphate carboxylase during autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth of scotochromogenic mycobacteria. // J. Bacteriol., 1976. V. 127. №2. P. 731-738.
318. Perez R.S, Matin A. Carbon dioxide assimilation by Tiobacillus novellus under nutrient-limited mixotrophic conditions. //J. Bacteriol. 1982. V. 150. № 1. P. 46-51.
319. Pierson B.K., Castenholz R.W. Studies of Pigments and Growth in Chloroflexus aurantiacus a Phototrophic Filamentous Bacterium // Arch. Microbiol. 1974. V.100. P.283-305.
320. Pierson B.K., Castenholz R.W. The Family Chloroflexaceae //The Prokaryotes/ Eds. Balows A. et al. Berlin,Heidelberg. Springer-Verlag. 1992. V.4.P.3754-3774.
321. Pierson B.K. Giovannoni S.J., Stahl D.A., Castenholz R.W. Heliothrix oregonensis, gen.nov.,sp., nov., a phototrophic gliding filamentous bacterium containing bacteriochlorophyll a // Arch.Microbiol. 1985. V.142. P.164-167.
322. Porter J., Merret M.J. Influence of light intensity on reductive pentose phosphate cycle activity during photoheterotrophic growth of Rhodospirillum rubrum //Plant Cell Phisiol. 1972. V.50. №1. P.252-255.
323. Pronk J.T., Meesters P.J.W., van Dijken J.P., Bos P., Kuenen J.G. Heterotrophic growth of Thiobacillus acidophilus in batch and chemostat cultures. // Arch. Microbiol. 1990 a.1. V. 153. №4. P. 392-398.
324. Pronk J.T., Meulenberg R., Van den Berg D.J.C., Batenburg-van der Verge W., Bos P., Kuenen J.G. Mixotrophic and heterotrophic growth of Thiobacillus acidophilus on glucose and thiosulfate. // Appl. Environm. Microbiol. 1990 b. V. 56. P. 3395-3401.
325. Pronk J.T., Meulenberg R., Hazeu W., Bos P., Kuenen J.G. Oxidation of redused inorganic sulfur compaunds by acidophilic thiobacilli. // FEMS Microbiol. Rev. 1990 с. V. 75. P. 239-306.
326. Pronk J.T., Meijer W.M., Hazeu W., van Dijken J.P., Bos P. Growth of Thiobacillus ferrooxidans on formic acid. // Appl. Environm. Microbiol. 1991 a. V. 57. № 7. P. 2057-2062.
327. Pronk J.T., Liem K., Bos P., Kuenen J.G. Energy transduction by anaerobic ferric iron respiration in Thiobacillus ferrooxidans. II Appl. Env. Microbiol. 1991 b. V. 57. № 7. P. 2063-2068.
328. Pronk J.T., Johnson D.B. Oxidation and reduction of iron by acidophilic bacteria. // Geomicrobiol. 1992. V. 10. P. 153-171.
329. Quayle J. R., Fuller R. C., Benson A. A., Calvin M. Enzymatic carboxylation of ribulose diphosphate // J. Am. Chem. Soc. 1954. V. 76. P. 3610-3611.
330. Rainey F.A., Fritze D., Stackebrandt. The philogenetic diversity of thermophilic members of the genus Bacillus as revealed by rDNA analysis. // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V.115. №2. P. 205-212.
331. Rajagopalan R., Altekar W. Characterization and purification of ribulose bisphosphate carboxylase from heterotrophically grown halophilic archaebacterium, Haloferax mediterranei // Eur.J.Biochem. 1994. V.221. № 2. P.863-869.
332. Rawlings D.E., Characteristics and adaptability of iron- and sulfur-oxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates //Microbial Cell Factories. 2005. V.4. P.13-18.
333. Rippel S., Bovien B. Phosphoribulokinase from Rhodopseudomonas acidophila//Arch. Microbiol. 1984. V.139. №2. P.207-212.
334. Rippka R., Stanier R.Y., Waterbury J.B. Cyanobacteria. //J.Gen.Microbiol. V.l l.P. 1-61.
335. Rittenberg S.C. The roles of exogenous organic matter in the physiology of chemolithotrophic bacteria//Adv. Microbiol.Physiol. 1969. V.3. P.159-196.
336. Rittenberg S.C. The obligate autotroph the demise of a concept //Antonie van Leeuwenhoek. 1972. V.38.P.457-478.
337. Rohwerder Т., Sand W. The sulfane sulfur of persulfides is the actual substrate of the sulfur-oxidizing enzymes from Acidithiobacillus and Acidiphilium spp. // Microbiology.2003. V. 149. P. 1699-1710.
338. Sahl H.G., Triiper H.G., Malic enzyme of Chromatium vinosum //Arch Microbiol. 1980; V.127. №1. P.17-24, № 6. P. 961-966.
339. Sahm H., Cox R.B., Quayle J.R. Metabolism of methanol by Rhodopseudomonas acidophila /J.Gen.Microbiol. V.94. № 2. P. 313-322.
340. Sand W., Gerke Т., Hallmann R., Schippers A. Sulfur chemistry biofilm, and the (in) direct attack mechanism a critical evaluation of bacterial leaching. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V 43. № 6. P. 961-966.
341. Sarles L.S., Tabita F.R. Derepression of the synthesis of D-ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from Rhodospirillum rubrum //J.Bacteriol. 1983. V.153. №1. P.458-464.
342. Schaeffer W. I., Umbreit W.W. Phosphotidylinositol as a wetting agent in sulfur oxidation by Thiobacillus thiooxidans. II J. Bacteriol. 1963. V. 85. № 2. P. 492-493.
343. Schippers A., Jozsa P.G., Sand W. Sulfur chemistry in bacterial leaching of pyrite. // Appl. Environm. Microbiol. 1996. V. 62. № 9. P. 3424-3431.
344. Schippers A., Sand W. Bacterial leaching of metal sulfides proceeds by two indirect mechanisms via thiosulfate or via polysulfides and sulfur. // Appl. Environm. Microbiol. 1999. V. 65.№ l.P.319-321.
345. Schlegel H.G. General Microbiology./The University Press. Cambridge. 1992.442 P.
346. Schneider G., Lundqvist Y., Lundqvist T. Crystallographic refinement and structure of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase from Rhodospirillum rubrum at 1,7 A resolution // J.Mol.Biol. 1990. V.211. № 4. P.989-1008.
347. Schobert P., Bowien B. Unusial Сз and C4 metabolism in the chemoautotroph Alcaligenes eutrophus. II J. Bacteriol. 1984. V. 159. № 1. P. 167-172.
348. Schultz J.E., Weaver P.F. Fermentation and anaerobic respiration by Rhodopseudomonas capsulatus and Rhodospirillum rubrum. //J.Bacteriol. 1982. V.149. №1. P.181-190.
349. Schiitz M., Shahak I, Padan E., Hauska D. Sulfide-quinone reductase from Rhodobacter capsulatus: purification, cloning and expression. // J.Biol.Chem. 1997. V.272.P.9890-9894.
350. Shimizu S., Ueda S., Sato K. Physiological role of vitamin B12 in a methanol utilizing bacterium Protaminobacter rubber /In: Microbial growth on CI compounds. Amer. Soc.Microbiol. Washington. 1984. P.113-117.
351. Shively J., Devore W., Strattford L., Porter L., Medlin L., Stevens S.E. Molecular evolution of the large subunit of ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO) // FEMS Microbiol. Lett. 1986. V.37. P.251-257.
352. Shively J.M., van Keulen G., Meijer W.G. Something from almost nothing: Carbon dioxide fixation in chemoautotrophs. // Annual Rev. Microbiol. 1998. V. 52. P. 191-230.
353. Smith A.L., Kelly D.P. Competition in the chemostat between an obligately and a facultatively chemolithotrophic Thiobacillus // J.Gen. Microbiol. 1979. V.l 15.P.377-384.
354. Smith A.L., Kelly D.P., Wood A.P. Metabolism of Thiobacillus A2 grown under autotrophic, mixotrophic and heterotrophic conditions in chemostat culture. // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 121. P. 127-138.
355. Sojka G.A. Metabolism of nonaromatic compounds /In: The Photosynthetic Bacteria, Plenum Press, NewYork. 1978. P.707-718.
356. Solaiman D., Uffen R. Influence of cyclic AMF on photosynthetic development in Rhodospirillum rubrum II J.BacterioU984.V.159.№2. ?.190-192.
357. Sorbo B. A colorimetric Method for the determination of thiosulfate. // Biochim. Biophys. Acta. 1957. V.23. P. 412-416.
358. Srere P.A. Citrate synthase. // In: Methods in enzymology. / Ed. Lowenstein. New York etc.: Acad.Press. 1969. V. 13. P. 3-11.
359. Stanier R.Y., Pfennig N., Truper H.G. Introduction to the phototrophic procaryotes /ЯЬе Procaryotes. Springer-Verlag. 1981. P.l97-211.
360. Stetter K.O., Fiala G., Huber G., Huber H., Segerer A. Hyperthermophilic microorganisms //FEMS Microbiol. Rev. 1990. V.75. P.l 17-124.
361. Stoner M.T, Shively J.M. Cloning and expression of the D-ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase form II gene from Thiobacillus intermedius in Escherichia coli II FEMS Microbiol. Lett. 1993. V.l07. № 2,3. P.287-292.
362. Storro J., McFadden B.A. Glycolate excretion by Rhodospirillum rubrum II Arch. Microbiol. 1981. V.l29. №4. P.317-320.
363. Stouthamer A.H. A theoretical study on the amount of ATP required for synthesis of microbial cell material //J.Microbiol.Serol. 1973. V.39. № 3. P.545-565.
364. Straub K.L., Benz M., Schink B. Iron metabolism in anoxic environments at near neutral pH. // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 34. P. 181-186.
365. Strauss G., Fuchs G. Enzymes of a novel autotrophic CO2 fixation pathway in the phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus, the 3-hydroxypropionate cycle // Eur. J. Biochem. 1993. V. 215. №3. P. 633-643.
366. Strom E., Dinarieva Т., Netrusov A. The novel cbo oxidase of an obligate methylotroph Methylobacillus Jlagellatus KT //FEBS Lett. 2001. V.505. № 1. P. 109-112.
367. Stumpf P.K. Metabolism of fatty acids//Annu.Rev.Biochem.l969.V.38.P. 159-212.
368. Sugio Т., Mizunashi W., Inagaki К., Tano T. Purification and some properties of sulfunferric iron oxidoreductase from Thiobacillus ferrooxidans. //J. Bacteriol. 1987. V. 169. № 11. P. 49164922.
369. Sugio Т., Hirose Т., Li-Zhen Ye., Tano T. Purification and some properties of sulfite:ferric iron oxidoreductase from Thiobacillus ferrooxidans // J.Bacteriol. 1992. V. 174. №10. P. 4189-4192.
370. Suzuki I., Silver M. The initial product and properties of the sulfur-oxidizing enzyme of Thiobacilli. // Biochem. Biophys. Acta. 1966. V. 122. № 1. P. 22-33.
371. Suzuki I., Chan C.W., Takeuchi T.L. Oxidation of inorganic sulfur compounds by thiobacilli. // In Enviromental Geochemistry of sulfide oxidation. /Edited by Alpers C.N. and Blowes D.W. -American Chemical Society Washington. 1994. P. 60-67.
372. Suzuki I. Microbial leaching of metals from sulfide minerals. // Biotechnology Advances. 2001. V. 19. P. 119-132.
373. Sybley J.A., Lehninger A.L. Determination of aldolase in animal tissues. // J. Biol. Chem. 1949. V.177. №2. P. 859-872.
374. Tabita F.R. Molekular and cellular regulation of autotrophic carbon dioxide fixation in microorganisms. // Microbiol. Rev. 1988. V. 52. № 2. P. 155-189.
375. Tabita F.R. The biochemistry and metabolic regulation of carbon metabolism and CO2 fixation in purple bacteria // In: Anoxygenic photosynthetic bacteria/ Blankenship R.E. et al. Eds. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1995. P.885-914.
376. Tabita F.R. Approaches to understand the biochemistry and regulation of CO2 fixation in photosynthetic prokaryotes //10th International symposium on phototrophic prokaryotes. Univ. of Barcelona. 2000. P.48.
377. Tholozan J.L., Samain E., Grivet J.P., Albagnas G. Propionate metabolism in a ethanogenic enrichment culture. Direct reductive carboxylation and acetogenesis pathway. // FEMS Microbiol. Ecol. V.73. P.291-293.
378. Tian K.L., Lin J.Q., Liu X.M., Liu Y., Zhang C.K., Yar W.M. Conversion of an obligate autotrophic bacteria to heterotrophic growth: 2003;
379. Tigerstrom M., Campbell J.J.R. The accumulation of a-ketoglutarate by suspensions of Pseudomonas aeruginosa. U Can. J. Microbiol. 1966, V. 12, № 5. P. 1005-1013.
380. Toledo-Cuevas M., Barquera В., Gennis R.B., Wikstrom M., Garsia-Horstman J.A., The cbby type cytochrome с oxidase from Rhodobacter sphaeroides, a proton-pumping heme -copper oxidase //Biochim.Biophys. Acta. 1998. V.1365. P.421-434.
381. Tourova T.P., Poltoraus A.B., Lebedeva I.A., Tsaplina I.A., Bogdanova T.I., Karavajko G.I. 16S Ribosomal RNA (rDNA) Sequence Analysis and Phylogenetic Position of Sulfobacillus thermosulfidooxidans. //System. Appl. Microbiol. 1994. V. 17. P. 509-512.
382. Truper H.G., Ectothiorhodospira mobilis pelsh, a photosynthetic sulfur bacterium depositing sulfur outside the cells. // J.Bacteriol. 1968. V.95. № 5. P.1910-1920.
383. Truper H.G., Fischer U. Anaerobic oxidation of sulfur compounds as electron donors for bacterial photosynthesis.//Phil. Trans. R.Soc.Lond. В 298.1982. P.529-542.
384. Truper H.G. Phototrophic bacteria and their sulfur metabolism //Studies in Inorganic Chemistry. Amsterdam.: Elsevier Science Publishers. 1984. V.5. P.367-382.
385. Truper, H.G., Schlegel, H.G., Sulfur metabolism in Thiorhodaceae: 1. Quantitative measurements on growingcCells of Chromatium okenii. II Antonie van Leeuwenhoek. 1964. V.30. P. 225-238.
386. Ueda S., Sato K, Shimizu S. Glyoxylate formation from mesaconyl-CoA and its related reactions in a methanol-utilizing bacterium Protaminobacter ruber. H Agr.Biol. Chem. 1981. V.45. P.823-830.
387. Uffen R.L. Fermentative metabolism and growth of photosynthetic bacteria IIThe Photosynthetic bacteria. Plenum Press, New York. 1978. P.857-872.
388. Varzabal A., Brasseur G., Ratouchniak J., Lund K., Lemesle-Meunier D., De Moss J.A., Bonefoy V. The high molecular weight cytochrome с cyc2 of Acidithiobacillus ferrooxidms is an outer membrane protein //J. Bacteriol. 2002. V.184. P.313-317.
389. Veeger C., Der Vartanian D.V., Zeylemaker W.P. Succinate dehydrogenase. // In: Methods in enzymology. / Ed. Lowenstein. New York etc.: Acad.Press. 1969. V. 13. P. 81-90.
390. Visca P., Bianchi E., Polidoro M., Buonfiglio V., Valenti P., Orsi N. A new solid medium for isolating and enumerating Thiobacillus ferrooxidans. II J. Gen. Appl. Microbiol. 1989.1. V. 35. P. 71-81.
391. Wachtershauser G. Evolution of the first metabolic cycles. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V.87. P.200-204.
392. Wang X., Modak H.V., Tabita R.F. Photolithoautotrophic Growth and control of C02 Fixation in Rhodobacter sphaeroides and Rhodospirillum rubrum in the Absence of Ribulose Bisphospate Carboxylase-Oxygenase //J.Bacteriol.V.175.1993. №21.P.7109-7114.
393. Waterbury J.B. The Cyanobacteria. Isolation, purification and identification. // In The Procaryotes. /Eds. Balow A., et al.- New-York; Berlin; Heidelberg; London; Paris; Tokyo; Hong Kong; Barcelona; Budapest: Springer-Verlag, 1992. V. 2. P. 2058-2078.
394. Watson G.M.F., Tabita F.R. Microbial ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a molecule for philogenetic and enzymological investigation. // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 146. № 1. P. 13-22.
395. Watson G.M.F., Yu J.P., Tabita F.R. Unusual ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase of anoxic Archaea. Hi. Bacteriol. 1999. V. 181. № 5. P. 1569-1575.
396. Wood W.A. Assay of enzymes representative of metabolic pathway. // Methods microbiol. 1971. V. 6. P. 411-424.
397. Wood H.G. Past and Present of C02 utilisation // Autotrophic Bacteria / Eds. H.G.Shlegel, B.Bowien/ Springer-Verlag. 1989. P.33-52.
398. Wood A.P., Aurikko J.P., Kelly D.P. A challenge for the 21st century molecular biology and biochemistry: what are the causes of obligate autotrophy and metanotrophy? //FEMS Microbiol. Rev. 2004. V.28. P.335-352.
399. Wood H.G., Ljungdahl L.G. Autotrophic character of the acetogenic bacteria // In: Variations in autotrophic life/ Shively J.M., Barton L.L. (Eds.). London: Academic Press. 1991. P.201-250.
400. Wood A.P., Kelly D.P. Triple Catabolic Pathways for glucose in a fast-growing strain of Thiobacillus A2. II Arch. Microbiol. 1978. V.l 17. № 4. P. 309-310.
401. Wood A.P., Kelly D.P. Autotrophic and mixotrophic growth of three thermoacidophilic iron-oxidizing bacteria. // FEMS Microbiol. Lett. 1983. V. 20. P. 107-112.
402. Wood A.P., Kelly D.P. Growth and Sugar Metabolism of a Thermoacidophilic Iron-oxidizing Mixotrophic Bacterium. // J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130. P. 1337-1349.
403. Wood H. G., Ragsdale S. W., Pezacka E. The acetyl-CoA pathway of autotrophic growth // FEMS Microbiol. Reviews. 1986. V. 39. P. 345-362.
404. Wood A.P., Kelly D.P., Norris P.R. Autotrophic growth of four Sulfolobus strains on tetrathionate and the effect of organic nutrients. // Arch. Microbiol. 1987. V. 146. № 4. P. 382-389.
405. Writtenbury R., Kelly D.P. Autotrophy: aconceptual phoenix //Symp. Soc.Gen. Microbiol. 1977. V.27. P.121-149.
406. Yahya A., Hallberg K.B., Roberto T.T., Johnson D.B. Sulfobacillus yellowstonensis, sp. nov., a facultatively anaerobic moderately thermophilic acidophile, isolated from a geothermal pool in Yellowstone National Park. // 2000. Direct submission.
407. Yarzabal A., Brasseur G., Bonnefoy V. Cytochromes с of Acidithiobacillus ferrooxidans II FEMS Microbiol. Lett. 2002. V.209. P.189-195.
408. Zychlinsky E., Matin A. Effect of starvation on cytoplasmic pH proton motive force, and viability of an acidophilic bacterium Thiobacillus acidophilus. II J. Bacteriol., 1983, V. 153. № 1. P. 371-374.1. Благодарности:
409. Автор выражает сердечную благодарность своему учителю академику РАН Е.Н. Кодратьевой и научному консультанту чл.-корр.РАН Г.И.Каравайко,
410. Автор искренне благодарен профессору А.И.Нетрусову за поддержку идеи работы, большую помощь и постоянное внимание.
411. Особая благодарность профессору Р.Н.Ивановскому за многолетнее сотрудничество, интерес к работе, помощь и ценные замечания.
412. Автор также выражает особую благодарность ст.н.сотр. Е.Н.Красильниковой за многолетнее сотрудничество, помощь, внимание и интерес к работе; д.б.н. А.Д.Исмаилову за сотрудничество, помощь в работе и моральную поддержку.
413. Автор искренне благодарен ст.н.с. Т.Ю.Динариевой за сотрудничество и помощь в работе, к.б.н. М.А.Егоровой за многолетнее сотрудничество, помощь и искреннее участие, к.б.н. А.Л.Брюханову за содействие, помощь и постоянную поддержку.
414. Автор искренне благодарит сотрудников ИНМИ ст.н.с. И.А.Цаплину и Т.И Богданову за многолетнее сотрудничество, помощь и ценные замечания.
415. Автор сердечно благодарит за помощь и поддержку сотрудников каф. микробиологии биологического факультета МГУ ст.н.сотр. О.И.Кеппен, к.б.н. И.А.Берга, к.б.н. Н.Ф.Пискункову, д.б.н А.М.Семенова.
-
Захарчук, Леонид Михайлович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2006
-
ВАК 03.00.07
- Управляемое культивирование пурпурных бактерий в изучении метаболизма водорода и азотфиксации
- Механизм ассимиляции ацетата у пурпурных несерных бактерий, не имеющих глиоксилатного шунта
- Оксигенные фототрофные микроорганизмы, ассоциированные с гидроидом Dynamena pumila
- Биоразнообразие аноксигенных фототрофных бактерий и их роль в продукции органического вещества в меромиктических водоемах
- Микробные сообщества щелочных гидротерм
