Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Управляемое культивирование пурпурных бактерий в изучении метаболизма водорода и азотфиксации
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Управляемое культивирование пурпурных бактерий в изучении метаболизма водорода и азотфиксации"
- #
г #
Ч Со /
На правах рукописи УДК 576.8
ЦЫГАНКОВ Анатолий Анатольевич
гправляемое культивирование пурпурных бактерий в изучении метаболизма водорода и азотфиксации
03.00.07 - Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Пущино-1998
Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии фототрофных микроорганизмов Института почвоведения и фотосинтеза РАН
Официальные оппоненты: Д°И0Р биологических нате
профессор В.М.Горленко
доктор биологических наук профессор В.К.Ерошин
доктор биологических наук профессор Н.П.Львов
Ведущая организация: кафедра микробиологии биологического факультета IV
Защита состоится "24"\998 г. в^ час на заседании специализирован] совета (Д 002.69.01) при "Йнстшуте биохимии и физиологии микроорганизмов Р 142292, г.П>тци11о Московской обл.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологи микроорганизмов РАН
Автореферат разослан " " _1998 г.
Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук
В.М.Вагабов
Введение.
Актуальность темы.
Пурпурные бактерии, относящиеся к порядку ЛЛс>Л«/>/л7Ые.у, - это грамотрицательные микроорганизмы, осуществляющие аноксигенный тип фотосинтеза. Эти бактерии обладают удивительной подвижностью своего метаболизма, проявляя способность к росту в фотоавтотрофных, фотогетеротрофных, хемоавтотрофных и хемогетеротрофных (аэробных и анаэробных) условиях. Они относятся к числу наиболее активных азотфиксаторов вследствие высокой скорости роста в азотфиксирующих условиях. Эти микроорганизмы способны к образованию Нг за счет действия нитрогеназы, а также к его использованию при участии гидрогеназы. Благодаря этим особенностям они широко распространены в природных экосистемах и поэтому привлекают внимание исследователей самых разных областей.
Знание ростовых характеристик пурпурных бактерий необходимо для понимания их роли в экологических системах. Однако к началу наших исследовании знания скоростей роста и выхода пурпурных бактерий при использовании разных соединений, в том числе света, были фрагментарны. Это было обусловлено прежде всего недостаточным развитием методов управляемого культивирования этих бактерий.
Гидрогеназа н нитрогеназа являются ключевыми ферментнымн системами в метаболизме Нг у пурпурных бактерий.
К началу наших исследований гидрогеназы уже были выделены и охарактеризованы из ряда хемотрофных, а также пурпурных бактерий. В то же время данные о регуляции синтеза гидрогеназ у пурпурных бактерий были немногочисленны и противоречивы (Кондратьева, Гоготов, 1981). Это было обусловлено прежде всего проведением исследований с использованием культур, выросших в неконтролируемых периодических условиях, поскольку гакие факторы как фаза роста культур, концентрация субстратов, рН, средняя интенсивность света при культивировании могут влиять на синтез гидрогеназ. Таким образом, для изучения факторов, влияющих на синтез гидрогеназ пурпурными бактериями, необходимо было использование управляемого культивирования фототрофных микроорганизмов.
Известно было, что синтез нитрогеназы всеми изученными азотфиксаторами репрессируется аммонием. Азотфиксация является очень энергоемким процессом не только вследствие больших затрат энергии на
фиксацию молекулы N2, но и из-за того, что содержание компонентен
нитрогеназы в клетках пурпурных бактерий может достигать 40% от всегс *
клеточного белка (Vignais et al., 1985). Однако мало было известно о том, i каких условиях происходит полная дерепрессия синтеза нитрогеназь пурпурными бактериями. Данные о влиянии факторов внешней среды, у прежде всего источника азота, на синтез и нитрогеназную активность клето* были противоречивы, что также обусловлено использованием периодически? неконтролируемых культур. Исследования такого плана требуют тщательного контроля условий выращивания культур.
К началу наших исследований считалось твердо установленным, чте нитрогеназа содержит в активном центре молибден (Лихтенштейн, 1979), Однако в начале 80х годов появились сообщения о возможности синтеза хемотрофными бактериями нитрогеназ в отсутствие молибдена в присутствии ванадия и даже без указанных металлов (Bishop et al., 1980). Данные с возможности синтеза альтернативных нитрогеназ пурпурными бактериями, особенностях их синтеза и каталитических свойств отсутствовали.
Наряду с фундаментальной значимостью изучение фототрофных бактерий имеет и большое прикладное значение. Биомасса пурпурных бактерий содержит много белка, витаминов, богата пигментами, которые могут быть использованы не только в качестве естественных красителей, но и при разработке фотосенсибилизаторов, используемых при фотодинамической терапии онкозаболеваний. В определенных условиях эти бактерии способны к синтезу значительных количеств полигидроксибутнрата. Однако практическое применение фототрофных бактерий в значительной мере сдерживается недостатком знаний их ростовых характеристик и отсутствием удовлетворительной технической базы для лабораторных исследований.
Пурпурные бактерии способны к светозависимому образованию Нг за счет действия нитрогеназы. В этой связи усилия многочисленных в последние годы исследователей направлены на изучение процессов фотообразования водорода фототрофными бактериями как потенциальными элементами в системах биоконверсии солнечной энергии. В 1992 г. в Японии и в США разработаны специальные Программы исследований, направленные на изучение возможности использования фототрофных микроорганизмов для преобразования энергии Солнца в энергию Нг. В Германии • в рамках Национального проекта уже разрабатывается полупромышленная установка получения водорода с использованием фототрофных микроорганизмов.
Однако требуется проведение дальнейших исследований как с растущими культурами или суспензиями клеток, так и с иммобилизованными бактериями, находящимися в строго определенных и контролируемых условиях, прежде чем внедрение фототрофных бактерий в промышленность станет реальностью. Для этого прежде всего необходима разработка методологии управления культурами фототрофных микроорганизмов. Цель и задачи исследования
Целью исследований явилось изучение метаболизма водорода и азотфиксации у пурпурных бактерий в контролируемых условиях.
Задачи, определяемые целью исследований:
1. Разработка и применение методологии управляемого культивирования фототрофных микроорганизмов при изучении метаболизма водорода и азотфиксацни.
2. Изучение ростовых характеристик пурпурных бактерий.
3. Выявление основных . принципов регуляции синтеза гидрогеназ у турпурных бактерий.
4. Изучение влияния факторов внешней среды на активность и синтез штрогеназнои системы пурпурных бактерий.
5. Оценка скоростей образования Н: культурами и иммобилизованными <летками пурпурных бактерий и цианобактерий в лабораторных {ютобнореакторах.
Научная новизна работы
Разработана методология управляемого непрерывного культивирования фототрофных микроорганизмов. Разработаны и изготовлены фотобиореакторы нового типа для интенсивного лабораторного сультивнрования фототрофных микроорганизмов и программно-управляемые сомплексы для контроля и управления процессом культивирования. 1редложен простой эмпирический критерий сравнения производительности [ютобпореакторов разных конструкций.
Определены ростовые характеристики ряда пурпурных бактерий (скорости гаста, эффективность использования энергии света и лактата, выходы при ^пользовании органических кислот, Нг и минеральных соединений). Впервые токазано, что культуры ЮюёоЬас1ег сарьикма адаптируются не только к :редней интенсивности света, но реагируют и на распределение светового юля.
Полученные в работе результаты вносят вклад в понимание механизмо! регуляции гидрогеназ и нитрогеназной системы у фототрофных бактерий.
Проведено изучение влияния ряда факторов (рН, t°C, интенсивность света тип питания, источник азота) на синтез гидрогеназ пурпурными бактериями Показано, что синтез водородпоглощающих гидрогеназ у пурпурных бактерий регулируется прежде всего доступностью донора электронов, причем возможны разные типы регуляции с участием как органических, так и неорганических доноров электрона:
- Органический донор в большей, а неорганические доноры электронов (тиосульфат и Нг) в меньшей степени репрессируют синтез гидрогеназы путем катаболитной репрессии (как у Ectothiorhodospira shaposhnikovii);
-Молекулярный водород необходим для синтеза гидрогеназы, тогда как органические соединения практически не влияют на ее синтез (как у Rhodobacter sphaeroides)',
-Органический донор электронов вызывает репрессию синтеза гидрогеназы. Молекулярный водород не обязателен для синтеза гидрогеназы, однако его наличие приводит к индукции синтеза гидрогеназы (как у Rhodobacter capsulatus);
-Синтез гидрогеназы происходит конститутивно. Органические кислоты, тиосульфат и молекулярный водород не оказывают действия на ее синтез (как у Thiocapsa roseopersicina).
Определены оптимальные условия для синтеза нитрогеназы пурпурными бактериями (лимитирование источником азота, насыщение светом, оптимальные рН и температура). Показано, что регуляция активности нитрогеназы, осуществляемая путем АДФ-рибозилирования Fe-белка нитрогеназы у Rb. capsulatus и Е. shaposhnikovii, определяется доступностью азота. С увеличением степени лимитирования культур азотом (причем как аммонийным, так и N2, и глутаматом) содержание активной формы нитрогеназы возрастает. Обнаружено, что оптимальные значения рН и температуры для нитрогеназной активности клеток зависят не только от вида бактерии, но и от условий ее выращивания. При изменении рН или температуры культивирования Rb. capsulatus и Anabaena variabilis изменялись не только оптимальные рН и температура для проявления нитрогеназной активности клеток, но и световые характеристики культур.
Обнаружено, что Rb. capsulatus способна, в дополнение к нитрогеназе, содержащей Мо в активном центре, к синтезу альтернативной нитрогеназы,
не содержащей ни Mo, ни V, тогда как Rb. sphaeroides такой способностью не обладает. Впервые показано, что в условиях избытка N2 Rb. capsulatus на одну молекулу поглощенного N2 образует 1 молекулу Нг независимо от того, синтезирует эта бактерия НГ-1 или НГ-3. Однако в условиях пониженного содержания молекулярного азота культуры этой бактерии образуют значительно больше Н2 когда синтезируют НГ-3. Установлены закономерности и особенности кинетического механизма функционирования НГ-1 и НГ-3.
Впервые установлено, что азотфиксирующие культуры Rb. capsulatus и А. variabilis, синтезирующие альтернативные нитрогеназы, приобретают способность к росту при более щелочных рН, чем культуры, синтезирующие Мо-нитрогеназу.
Практическая ценность работы
Разработанная методология управляемого культивирования фототрофных микроорганизмов, а также фотобиореакторы и алгоритмы управления процессом культивирования могут быть использованы в лабораторных исследованиях фототрофных бактерий при изучении не только метаболизма водорода и азота, но также метаболизма других элементов и соединений. Особенно полезны они могут быть при исследованиях, где необходимо вести количественный учет поглощенной энергии света.
Полученные данные о ростовых характеристиках изученных фототрофных бактерий могут . явиться основой для разработки регламентов их промышленного культивирования. На основе данных материально-энергетического баланса роста Rb. capsulatus возможно предсказание продуктивности и эффективности использования света этой пурпурной эактерией в зависимости от плотности культур, интенсивности освещения и конфигурации фотобиореактора.
Проведена оценка возможности использования пурпурных бактерий в :истемах преобразования солнечной энергии в энергию молекулярного зодорода. Разработаны лабораторные установки, позволяющие одновременно ; очисткой сточных вод от органических соединений на свету образовывать Ъ.
Определены условия, в которых Rb. sphaeroides способна к накоплению юлигидроксибутирата до 42% от веса сухой биомассы, что позволяет зекомендовать эту бактерию для дальнейших исследований синтеза юлигидроксибутирата пурпурными бактериями.
Апробация работы
Основные результаты работы были доложены на всесоюзных и международных симпозиумах, конференциях, совещаниях и съездах, в том числе: на 6, 8 и 9 Баховских коллоквиумах по азотфиксации (Тбилиси, 1983; Кобулети, 1988; Москва, 1995), Всесоюзной конференции "Анаэробные микроорганизмы" (Пущино, 1982), Симпозиуме ФЕМО "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды" (Пущино, 1983), Международных Симпозиумах по молекулярной биологии гидрогеназ (Сегед, Венгрия, 1985; Альбервилль, Франция, 1997), 3 и 4 Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Кобулети, 1986; Ташкент 1988), 4 Всесоюзной конференции "Управляемое культивирование микроорганизмов" (Пущино, 1986), на Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" (Красноярск, 1987), 6 Международной конференции по прикладной альгологии (Чешски Будейовицы, Чешская Республика, 1993), 2 Европейском рабочем совещании по прикладной альгологии (Потсдам, Германия, 1995), на 10 Международном Конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), на 10 Международном Конгрессе по фотосинтезу (Монпелье, Франция, 1995).
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, описания объектов и методов исследования, 5 глав экспериментальной части с изложением результатов работы и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 280 стр машинописного текста, включают 73 рисунка и 45 таблиц. Список литературы включает 380 наименований.
Публикации
По результатам исследований опубликовано 47 работ и получено 3 авторских свидетельства СССР и патента РФ. 1. Объекты и методы исследования
Объекты исследования и источники их получения приведены в Табл. 1.
Гидрогеназную активность клеток по выделению Ш и нитрогеназную активность измеряли методом газовой хроматографии.
Ферментативные активности выражали в нмоль Нг (СгШ)- (мин мг белка)1.
В случае измерений, сопряженных с определением количества поглощенной световой энергии интенсивность падающего света (1пад) определяли как интенсивность света в диапазоне 400-900 нм на поверхности культуры.
2. Фотобиореакторы и системы управления ими
2.1. Фотобиореакторы.
К настоящему времени можно выделить несколько типов ФБР, получивших наибольшее распространение. Это ФБР в виде плоскопараллелной кюветы, трубчатые реакторы, ФБР на основе коаксиальных цилиндров, в которых культура находится в кольцевом зазоре между цилиндрами, а также ФБР на основе обычных ферментеров. Автором предложены усовершенствования трубчатого реактора. ФБР на основе коаксиальных цилиндров и на основе эбычных ферментеров.
Таблица 1.
Фототрофные микроорганизмы, использованные в исследованиях
Объекты исследований
Штамм
Источник
Пурпурные несерные бактерии
Rhodobacter capsulatus Rhodobacter sphaeroides
Rhodopseudomonas palustris Rhodospirillum fulvum Rhodospirillum rubrum Пурпурные серные бактерии Ectothiorhodospira shaposhnikovii Thiocapsa roseopersicim Цианобактерни Anabaena variabilis
Anabaena sphaerica Chroococcidiopsis thermalis
Gloeocapsa alpicola Gleotrichia raceborxkii Gloeothece sp. Nostoc muscorum Synechococcus sp. Зеленые микроводоросли Chlamydomonas reinhardii Chlorella vulgaris_
BIO. St Louis 2R. GL1 RY
ATCC 1682
K.5
1R
IK
BBS
ATCC 29413.
PK84
TB082
HINDAC С ALU 758
CALU 743 HN03
TB080
137mt+ spk
Кафедра микробиологии МГУ Кафедра микробиологии МГУ Кафедра микробиологии МГУ Кафедра микробиологии МГУ NIBH. Tsukuba, Japan Кафедра микробиологии МГУ Кафедра микробиологии МГУ' Кафедра микробиологии МГУ
Кафедра микробиологии МГУ
Кафедра микробиологии МГУ
Кафедра генетики МГУ Кафедра генетики МГУ Коллекция НЦНИ (Вьетнам) Коллекция водорослей ЛГУ
Коллекция водорослей ЛГУ Коллекция НЦНИ (Вьетнам) Коллекция НЦНИ (Вьетнам) Коллекция НЦНИ (Вьетнам) Коллекция НЦНИ (Вьетнам)
Коллекция ИПФС РАН Коллекция ИПФС РАН
Для устранения ингибпрования или лимитирования культур в трубчатом ФБР за счет излишней длины трубок предложено осуществлять масштабирование ФБР последовательным соединением базовых элементов, максимальный размер которых определяется исходя из скорости фотосинтеза культур (рис. 1). В указанном ФБР все элементы реактора соединены последовательно, причем скорость движения жидкости не зависит от количества базовых элементов (на рис. 1 базовый элемент обведен пунктирной линией).
К достоинствам такой конструкции ФБР следует отнести возможность использования поролоновых пыжей для очистки стенок, возможность проведения процесса культивирования без неконтролируемого лимитирования или ингибпрования. легкость масштабирования и возможность полного переноса лабораторных данных, полученных на одном элементе ФБР, на ФБР любого размера.
• Рис. 1. Блок-схема трубчатого ФБР с последовательным соединением
элементов. 1-газомассообменик; 2 -¡(исходящая ветвь; 3 - свстопрнемная часть; 4 - восходящая ветвь; 5 - вход гдзовой смеси
Разработанный нами ФБР на основе коаксиальных цилиндров (рис. 2) состоит из концентрично установленных внешнего (1). среднего (2) и внутреннего (3) стеклянных цилиндров, закрытых общими днищем (4) и крышкой (5). Внизу кольцевого зазора между внешним и средним цилиндрами расположено перемешивающее устройство (6) с лопастями (7). Благодаря наличию перемешивающего устройства в культуральной суспензии достигается интенсивное перемешивание газожидкостной смеси.
Для дополнительного введения света с целью интенсификации процесса культивирования была разработана модификация описанного ФБР. В этом ФБР (рис. 3) свет вводится не только от внутреннего источника света, но и через специальные окна (1) в днище ФБР от внешнего источника света.
На перемешивающем устройстве устанавливают не лопасти, а свегопрозрачные стержни (2). При вращении перемешивающего устройства прозрачные стержни перемешивают кулыуральную суспензию и одновременно при прохождении стержня над освещаемым окошком передают световую энергию внутрь культуральной суспензии. Такое распределение света позволяет более равномерно распределять свет внутри ФБР вследствие чего возможно введение большего количества света без ингибирования культур.
Большое разнообразие описанных в литературе ФБР свидетельствует, что необходимы какие-то критерии сравнения ФБР на основе их геометрических и конструктивных особенностей. С целью поиска такого критерия было проведено экспериментальное сравнение 4 типов ФБР при выращивании в них одной и той же пурпурной несерной бактерии Rb .capsulatus BIO. На основании полученных данных сделан вывод, что в условиях, когда культура испытывает одновременно пшитирование средней интенсивностью света и ингибирование падающей штенсивностью света, в качестве простого критерия для сравнения разных ФБР ложно использовать отношение поверхности к объему ФБР, деленное на толщину слоя суспензии.
Рис. 2. ФБР на основе Рис. 3. ФБР на основе коаксиальных
коаксиальных цилиндров цилиндров с введением
с перемешивающим дополнительного освещения,
устройством
2.2. Система управления
Для поддержания культур
ФБР
в
Рис. 4. Блок-схема программно-аппаратного комплекса. в котором функции сбора данных и контроля за процессом аппаратно и программно отделены от функций анализа данных, калибровки датчиков и установки режимов культивирования.
контролируемых условиях необходимы автоматические системы регулирования. Нами был разработан и изготовлен ряд установок дая непрерывного
культивировашм фототрофных
микроорганизмов, в которых функции управления переданы вычислительной системе, в одной из которых управление осуществляется специачыю разработанным блоком (рис. 4).
Блок выполнен на основе процессорного блока АТ-286 без клавиатуры, монитора и жесткого диска, но дополненного первичными преобразователями и анатого-цифровыми преобразователями. Программа управления блоком (программа нижнего уровня) записана на загрузочной дискете. Блок выполняет следующие функции:
Сбор показаний датчиков (каждые 2 сек); вычисление средних, максимальных и минимальных значений показаний дагчиков
в физических единицах за 60 сек; управление воздействиями на культур)", вычисление средних, минимальных и максимальных значений показаний датчиков за час; запись информации на дискету. Блок также реализует аварийный сброс всех управляющих воздействий при сбое работы программы (через 50 мсек).
Блок управления соединен с компьютером по последовательному канату. Программа обработки данных в компьютере (программа верхнего уровня) работает под управлением Windows 3.1 (и более поздних версий) и предусматривает возможность одновременного управления несколькими блоков управления.
Компьютер с программой верхнего уровня выполняет следующие функции: калибровка датчиков; подстройка датчиков в процессе культивирования; установка и изменение заданных значений t°, рН, оптической плотности (для режима турбидостата), режима освещения и перемешивания; отображение на экране значений всех датчиков в виде таблицы и графика (с дискретностью 2 сек);
отображение состояния каждого управляемого элемента; ручное управление всеми управляемыми элементами.
3. Ростовые характеристики пурпурных бактерий
3.1. Скорости роста фототрофных бактерий в различных условиях
Полученные нами данные позволяют дать сравнительную оценку скоростей роста некоторых фототрофных бактерий (табл.2). Максимальной скорости роста изученные пурпурные бактерии достигали при росте в фотогетеротрофных анаэробных условиях с использованием аммония в качестве источника азота.
Таблица 2
Скорости роста некоторых фототрофных бактерий в разлитых условиях
Условия выращивания Бактерия -1
Фотогетеротрофные
Лактат + аммоний Rb. sphaeroides 2R 0,290
и Rb. sphaeroides GL-1 0,350
и Rb. capsulatus BIO 0,226
п R. rubrum R1 0,080
п R. fulvum K5 0,040
Матат + аммоний Rb. capsulatus BIO 0,300
и R. rubrum R1 0,110
Лактат + N2 Rb. sphaeroides 2R 0,220
Rb. sphaeroides GL-1 0,220
П Rb. capsulatus BIO 0,192
Ацетат + тиосульфат + аммоний Ect. shaposhnikovii 1K 0,520
_ и _ T. roseopersicina BBS 0,037
Фотоавтотрофные
н2 + со2 Rb. capsulatus BIO 0,110
Rb. sphaeroides GL-1 0,044
If R. rubrum 1R 0,022
ft R. fulvum K5 0,030
Н20 + СО2 + Mo A. variabilis ATCC 29413 0,044
н2о + C02 + V A. variabilis ATCC 29413 0,04-0,05
Н2О + СО2-V-Mo A. variabilis ATCC 29413 0,03
Хемогетеротрофные
Лактат + аммоний, 0,0001 атм О2 Rb. capsulatus BIO 0,120
При росте в азотфиксирующих фотогетеротрофных условиях максимальная скорость роста составляла 63-85% от скорости роста в присутствии аммония.
3.2. Влияние физихо-химических факторов.
Изучено влияние 1°С, интенсивности света, кислорода и рН на рост пурпурных бактерий. Обнаружено, что диапазон рН, доступный доя роста, зависит от условий культивирования. Так например, при выращивании культур В.Ь. саряиЫиз В10 в азотфиксирующих условиях в присутствии Мо оптимальный диапазон рН для роста составлял 6,5-8,5. Доступный дня роста диапазон рН составлял 5,5-8,9. Удаление Мо из ростовой среды приводило к синтезу альтернативной нитрогеназы в клетках, причем культуры имели более широкий диапазон оптимальных рН для роста (6,28,7). Кроме того, эти культуры сохраняли способность к росту и при рН 9,3.
3.3. Использование закономерностей материажьно-энергетического баланса, при изучении ростовых характеристик НЪ. сарзи1аЬиз .
В задачи нашей работы входило изучение влияния интенсивности света на ростовые характеристики ИЬ. сарзиЫиь. При экспериментах использовали два способа лимитирования: изменение концентрации биомассы при постоянной интенсивности света (способ 1) и интенсивности падающего света при низкой концентрации биомассы (способ 2), которые значительно различаются в способе светоснабжения: при первом способе при увеличении степени лимитирования культур возрастала и неравномерность освещения, тогда как при втором способе изменение светового поля внутри ФБР не превышаю 40-60% и не зависело от степени лимитирования.
При увеличении лимитирования светом, достигаемом способом 1 или способом 2, снижались скорость роста культур КЬ. сарзи1аШ, увеличиватся уровень восстановленности биомассы, и снижался выход биомассы по углероду.
Культуры, лимитированные светом способом 2, проявляли большую эффективность использования энергии лахтата и света для роста (до 29%) и содержали больше бактериохлорофилла в клетках (рис.5) практически при всех скоростях роста, меньше максимальной. В этих условиях культуры содержали примерно в 1,5 раза больше фотосинтетических единиц практически при всех скоростях роста (рис. 5). На основании полученных
Рис. 5. Общее содержание Behl а (А) и отношение содержание Behl a/BChl-RC (В) у Rb. capsulatus выросшей в турбндостате с переменной концентрацией биомассы (D ,V ) и с переменной интенсивностью света (О, Д)
данных сделан вывод, что для культур пурпурных бактерий важны не только средние значения интенсивности света, определяющие их скорость роста, но и изменения этой шгтенсивности внутри ФБР.
3.4. Фотомиксотрофные условия
В наших исследованиях показано, что рост Rb. capsulatus в фотомиксотрофных условиях (в присутствии Нг и лактата) происходит в широком диапазоне скоростей протока. Одновременное потребление Н2 и лактата имело место при скоростях разбавления, существенно превышающих максимальную скорость роста этой культуры в фотоавтотрофных условиях.
При росте Rb.- capsulatus на среде с Нг, СОг и лактатом суммарный выход биомассы был значительно выше, чем можно было ожидать на основании значений выходов по использованию Н2 и лактата, полученных при выращивании культуры на среде с Н2+СО2 или лактат + СО2, и измеренных скоростей потребления лактата и водорода в фотомиксотрофных условиях. Возможно, это связано с тем, что при росте в фотомиксотрофных условиях клетки Rb. capsulatus используют лактат преимущественно в конструктивном метаболизме, тогда как водород служит донором электронов при фотосшггезег
Однако такое эффективное совместное действие водорода и лактата наблюдается не у всех бактерий. При выращивании R. rubrum и R. fulvum на свету в
фотогетеротрофных условиях в присутствии лактата и при добавлении в газовую фазу углекислоты ее скорость роста составляла 0,075ч"1 доя R. rubrum и 0,04ч"1 для R. fulvum. Удаление из газовой фазы углекислоты практически не сказывалось на скорости роста ку льтур.
Добавление в этих условиях молекулярного водорода (25%) значительно подавляло скорость роста культур R. rubrum и R. fulvum. При введении в газовую фазу 2% СО2 скорость роста культур R. rubrum быстро возвращалась к уровню , близкому к наблюдаемому при выращивании с использованием в качестве газовой фазы чистого аргона.
Подавление роста в условиях одновременного присутствия водорода и фруктозы без углекислоты (так называемый водородный эффект) был отмечен у ряда водородных бактерий. Считается, что причиной водородного эффекта является перевосстановленность пула пиридиннуклеотидов внутри клеток (Schlegel and Eberhardt, 1972). Наши данные свидетельствуют о том, что изменение уровня восстановленное™ пула НАД и НАДФ не является причиной водородного эффекта у пурпурных бактерий, поскольку при добавлении Нг их измените носит противоположную направленность у R. rubrum и R. fulvum, причем не коррелирует во времени с изменениями скорости роста.
4. Физиологические особенности синтеза гидрогеназ пурпурными бактериями
4.1. Роль органических, доноров электронов
Данные, полученные с использованием периодических и непрерывных культур, а также инкубируемых в присутствии различных ингибиторов синтеза белка клеток, свидетельствуют о том, что синтез гидрогеназы у Rb. capsulatus BIO и St. Louis репрессируется органическиш! соединениями. Наибольшей гидрогеназной активностью обладали клетки, выросшие в условиях лиимтирования лактатом. Наименьшей гидрогеназной активностью обладали клетки, выросшие в режиме турбидостата при избытке лактата.
В отличие от Rb. capsulatus гидрогеназная активность Rb. sphaeroides 2R и GL-1 практически не зависела от скорости протока при выращивании этих штаммов в режиме хемостата с лимитированием лактатом в присутствии аммония. Таким образом, лимитирование Rb. sphaeroides лактатом недостаточно для сшггеза или активации гидрогеназы у этих культур независимо от используемого штамма.
При выращивании в фотогетеротрофных условиях на среде с ацетатом и тиосульфатом клетки Ret. s hüposh n iko v i i проявляли низкую гидрогеназную активность (табл. 3). При переходе культур в режим хемостата с лимитированием
ацетатом наблюдали увеличение гидрогеназной активности клеток, измеряемой как по выделению, так и по поглощению Нг. Содержание цАМФ у Ect. shaposhnikovii, выросшей в условиях лимитирования ацетатом, значительно выше, чем при избытке ацетата. Следовательно, синтез гидрогеназы у Ect. shaposhnikovii регулируется ацетатом путем катаболитной репрессии.
4.2. Роль молекулярного водорода
Дерепрессия синтеза гидрогеназы у Rb. capsulatus BIO присходит в отсутствие молекулярного водорода. Однако в его присутствии синтез гидрогеназы наступает раньше, и гидрогеназная активность клеток достигает большего значения. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что Нг является индуктором синтеза гидрогеназы у Rb. capsulatus .
Таблица 3
Q
Гидрогеназная активность и внутриклеточное содержание цАМФ у Ect. shaposhnikovii, выросших в разных условиях
Гидрогеназная активность Внутрикл.
Условия выращившшя содержание
цАМФ,
поглощение выделение пмоль/мг
н2 н2 белка
Фотогетеротрофные условия
Турбидостат, 50 шМ ацетата, 60 тМ тиосульфата, D=0,52 ч"1
Хемостат с лимитированием ацетатом, 60 тМ тиосульфата D=0,30 D=0,22 D=0,15 D=0,074
5,7
9,0 11,0 14,0
0,3
10,7
24.7 28,0
34.8
Турбидостат, 32 тиосульфата, D=0,I I ч'1
Фотоавтотрофные условия тМ 25,0 9,0
0,9
10,9
2,9
3,0
1,5
При выращивании Rb. sphaeroides 2R в фотогетеротрофных периодических условиях замена в газовой фазе аргона на молекулярный водород не оказывала влияния на скорость роста культур. Однако в этих условиях в начале экспоненциальной фазы роста в клетках появлялась гидрогеназная активность, которая возрастала до середины экспоненциальной фазы и дальше оставалась на постоянном уровне (6 нмоль-минмг-1 белка по выделению II:). Таким образом, в отличие от Rb. capsulatus для появления гидрогеназной активности в клетках Rb. sphaeroides необходимо присутствие Н:.
Для того, чтобы выяснить, синтезируется ли гидрогеназа de novo или в присутствии Н2 происходит активация уже синтезированного апобелка, клетки, взятые из середины экспоненциальной фазы роста на среде с малатом, инкубировали без добавления органических соединений (рис. 6).
Наличие в среде к моменту начала инкубации хлорамфеникола (Ю-4 М), рифампицина (Ю-5 М) или актиномицина (lO5 М) препятствовало появлению гидрогеназной активности (рис. 6) Таким образом, для появления и развития гидрогеназной активности в клетках Rb. sphaeroides требуется не только стадия синтеза белка, но и стадия транскрипции. При добавлении хлорамфеникола к суспензиям клеток, синтезирующих гидрогеназу, через 3 ч после начала инкубации, гидрогеназная активность продолжала возрастать, хотя и с меньшей скоростью, в течение 2 ч, а затем оставалась на постоянном уровне (рис. 6, кривая 5). Возможно, что некоторое увеличение гидрогеназной активности в этом случае связано с активацией уже синтезированного фермента, как и в случае добавления хлорамфеникола за 2 ч до достижения постоянного значения гидрогеназной активности (кривая 6). ..Однако для продолжения увеличения гидрогеназной активности клеток необходима стадия синтеза белка.
При добавлении в суспензии клеток, инкубируемых в атмосфере II:. актиномицина D через 2 часа после начала инкубации возрастание гидрогеназной активности происходило без существенных изменений, то есть для продолжения биосинтеза гидрогеназы синтез мРНК не требуется.
На основании полученных данных сделан вывод о том, что молекулярный водород вызывает индукцию синтеза гидрогеназы на стадии транскрипции, а для дальнейшего ее биосинтеза Н: не требуется.
Рис. 6. Гидрогеназная
активность клеток КЬ. $р1хаегоЫе$ при их инкубации в минеральной среде Ормеруда в атмосфере Н2 (1) с добавлением
хлорамфеникола
(2),
10
актиномицина 1> (3) или рифампицина (4). Во время, указанное стрелкой, из инкубационного сосудика без антибиотиков отбирали часть суспензии п помещали в сосудики с Н2 и хлорамфениколом (5,6), Н2 и актиномицином (7), без Н2 (8) и без Н2 с добавлением 2,8 мМ малата (9).
Полученные с использованием Н2, 02 и трития данные свидетельствуют о ом. что действие Нз на синтез гидрогеназы опосредовано через изменение едоке потенциала в ее окружении в клетках ЯЬ. врНаего'ьйез. В присутствии юлекулярного водорода происходит понижение редокс-потенциала, который рямо или через медиаторы вызывает изменения конформации белка-епрессора. Последний .в таких условиях теряет сродство к оператору и окидает ДНК, разрешая транскрипцию структурного гена гидрогеназы.
Кинетические измерения локализации гндрогеназной активности в роцессе индукции синтеза гидрогеназы подтверждают предположение, что в летках присутствует еще одна гидрогеназа, которая синтезируется онститутивно, локализуется в цитоплазме и выполняет основную функцию гнеора, определяющего наличие Нг.
Исследования с использованием /ш/Гмутантов ЯЬ. сар.т!а!ч.з, содержащими жже большое количество генов ЫрТиУ, доказали, что клетки этой бактерии эладают второй гидрогеназой, в функцию которой входит генерация сигнала слючения синтеза гидрогеназы при наличии Н2 (У^гшв е1 а1., 1997).
В отличие от ЯЬ. сарьиЫиз и ЯЬ. ¡рИаего1<1е5 синтез гидрогеназы Ее!. \aposhnikovii не зависит от присутствия в среде молекулярного водорода. Так, эи выращивании этой бактерии в режиме хемостата с лимитированием шонием, когда в клетках синтезируется нитрогеназа и в процессе роста зразуется молекулярный водород, гидрогеназная активность клеток была
даже «иже, чем при росте в турбидостате при избытке аммония, когда молекулярный водород не выделялся. В тоже время синтез гидрогеназы у Г. гоьеорегыапа не регулируется донорами электронов и осуществляется конститутивно.
Таким образом, полученные нами данные позволяют заключить, что основными внешними факторами, определяющими регуляцию синтеза гидрогеназ пурпурными бактериями являются органические соединения и молекулярный водород, причем возможны различные комбинации их действия.
5. Физиологические особенности регуляции синтеза и активности нитрогеназ у пурпурных бактерий.
5.1. Возможность синтеза альтернативных нитрогеназ Л£>. сарзи1аЬив В10 и ЯЬ. зрЬаегохёсв 2Я.
После исключения М0О42" из состава среды скорость роста клеток ВЬ. сарзикгш и фотообразование С2Ш уменьшались в 2-3 раза, тогда как скорость фотовыделения Н2 сохранялась на прежнем уровне (табл. 4). Растущие при недостатке Мо клетки ЯЬ. сарзиШиз , как и ЛююЬас!ег (ОН\гаг1Ь е1 а1., 1987), восстанавливали С2Н2 не только до С2Н4, но и до СгШ, хотя и со скоростью I % от С2Н4. Ванадий не увеличивал скорость роста ЛЬ. сарвиШиБ при недостатке молибдена, а скорости образования С2Н4, С2Ш и Н2 в присутствии V даже несколько уменьшались (табл.4). Способность клеток ЛЬ. сар$и1аШ к образованию СгНв подавлялась Мо независимо от наличия в среде V. Добавление Мо приводило также к увеличению скорости роста клеток и изменению соотношения скоростей катализируемых нитрогеназой реакций.
Таблица 4
Скорость роста (ц) и ннтрогеназная активность азотфиксирующих клеток
пурпурных бактерий, выросших в разных условиях
Бактерия и условия роста ц, ч-1 Фотообразование
СгНб I С2Н4 1 Н2
ЛЬ. сарзи1аш
+Мо 0,200 0 127 52
-Мо 0,121 0,43 41 51
-Мо+У 0,108 0,28 24 30
+Мо+\У 0,203 0 113 49
-Мо+'ЭД' 0,055 0 5 2
-Мо+У+\\Г 0,100 0,24 22 32
+Мо+У 0,206 0 97 43
+Мо+У+У/ 0,167 0 121 45
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о способности Rb. capsulatus к синтезу альтернативной ннтрогеназы при росте в условиях недостатка Мо. Поскольку V не стимулировал рост этой бактерии и синтез ею нитрогеназы при недостатке Мо, синтезируемая в этих условиях альтернативная нитрогеназа является нитрогеназой-3, не содержащей в своем составе ни Мо, ни V. Одновременно и независимо от наших исследований к такому же выводу относительно Rb. capsulatus пришли и другие авторы (Schneider et al., 1991). В отличие от Rb. capsulatus, клетки близкого в таксономическом отношении вида Rb. sphaeroides, как следует из наших данных, не способны к синтезу альтернативных нитрогеназ.
В процессе роста в азотфиксирующих условиях культуры Rb. capsulatus образовывали Н,. Скорость его образования возрастала с увеличением степени лимитирования роста культур молекулярным азотом (рис. 7) как при росте их в присутствии Мо, так и без него. Следует отметить, что культуры, росшие в условиях недостатка молибдена, увеличивали скорость образования Ш даже при таком уменьшении концентрации азота, которое не сказывалось на скорости роста. Это наблюдение также свидетельствует о том, что клетки, синтезирующие НГ-3. обладают меньшим сродством к молекулярному азоту по сравнению с клетками, содержащими Мо-нитрогеназу.
N2, кПа
Рис. 7. Скорость азотфнксацни (1, 2) и образования водорода (3, 4) растущими культурами Rb. сарзиШт при росте в присутствии молибдена (1, 3) и без него (2, 4) при разных концентрациях N2 в газовой фазе. N2: нмоль (мин мг белка)-!, Нг: нмоль (мин мг белка)-1.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях избытка донора электронов и молекулярного азота культуры, обладающие Мо-ннтрогеназой
л НГ-3, имеют примерно одинаковую эффективность азотфиксации с точки зрения использования восстановителя.
5.2. Нитрогеназная активность и синтез двух форм нитрогеназы ЯЬ. сарБи1аЬиз и ЕсЬ. shaposhnikovii в непрерывных культурах при росте на различных источниках азота
При выращивании культур в режиме хемостата с лимитированием аммонием клетки обладали нитрогеназной активностью. Следует отметить, что концентрация аммония внутри ФБР не превышала 10 мкМ при всех скоростях протока в данном режиме культивирования. Таким образом, репрессия синтеза нитрогеназы при росте в присутствии аммония, характерная практически для всех азотфиксаторов (Кондратьева, Гоготов, 1981), обусловлена не наличием аммония в среде, а его концентрацией. При концентрациях аммония, лимитирующих рост пурпурных бактерий (табл. 5), происходит дерепрессия синтеза этой ферментной системы.
Таблица 5
Влияние условий выращивания на нитрогеназную активность и содержание активной формы нитрогеназы (НГа, %) у Е.Ь. сарьиЫиз при росте без
кислорода на свету
Условия выращивания D, ч-1 НГ активность НГд, %
Хемостат с лимитированием 0,020 360 70
аммонием
II 0,030 530 100
II 0,040 510 100
и 0.060 330 30
0,080 210 5
Турбидостат- (аммоний, 20 мМ) 0,256 0 -
Хемостат с лимитированием 0,040 350 100
глутаматом
То же 0,063 350 99
(1 0,105 260 83
Турбидостат (глутамат) 0,220 180 70
Периодическое культивирование. 20 87 100
мМ глутамата
Хемостат с лимитированием N2 0,010 89 91
То же 0,041 165 -
и 0,066 122 95
и 0,083 220 -
0,100 310 81
Турбидостат (N2) 0,190 150 70
Периодическое культивирование, N2 31 100
Изменение скорости протока при росте Rb. capsulatus п условиях лимитирования источником азота оказывало влияние не только на нитрогеназную активность клеток, но и на соотношение в них двух форм нитрогеназы (табл. 5). При минимальной скорости протока нитрогеназа находилась практически полностью в активной форме (НГд) независимо от используемого источника азота. С увеличением скорости протока в клетках появлялась регулируемая форма нитрогеназы (АДФ-рибозилированная форма Fe-бвлка нитрогеназы, Ludden and Roberts, 1995). Наибольшее количество регулируемой формы нитрогеназы находилось в клетках, выросших в режиме хемостата с лимитированием аммонием (до 95%), тогда как при использовании глутамата или N2 ее содержание не превышало 30% даже в режиме турбидостата. Таким образом, степень обепеченности культур азотом определяет соотношение активной и неактивной форм нитрогеназ.
В наших исследованиях показано, чго Eel. shaposhtiikovii также способна к синтезу регулируемой формы нитрогеназы. Эта форма, как и у Rb. capsulatus, появляется при повышенных скоростях протока. когда степень лимитирования культур аммонием понижена.
5.3. Действие физико-химических факторов.
5.3.1. Rb. capsulatus
Как следует из наших экспериментов, только Mo-дефицитные культуры оказались способны расти при рН выше 9. Кроме того, эти культуры имеют больший адаптационный потенциал к изменениям рН по сравнению с культурами, растущими в присутствии Мо. В частности, оптимальный диапазон рН для обеих нитрогеиазных реакций у них зависел от того, при каком рН выращивали культуры. Этим объясняется способность безмолибденовых культур фиксировать азот и расти при повышенных рН, чго в соответствующих природных условиях может давать им преимущества.
Однако, механизм такой адаптации у Rb. capsulatus пока не ясен.
5.3.2. Л. variabilis
Изменение рН при проведении реакции ацегиленредукции действовало неодинаково у клеток, выросших при различных рН. Клетки A. variabilis, выросшие при рН 7,0; 8,0 и 8,5, имели рН-оптнмум для проведения реакции ацетиленредукции в диапазоне 7-9. 8-9 и 9-10 соответственно. Следовательно, диапазон рН, оптимальный для проявления нитрогеназной активности по реакции восстановления С2Н2. зависит от предыстории культур не только у
одноклеточной пурпурной бактерии Rb. capsulatus, но и гетероцистной цианобактерии/4. variabilis.
Нитрогеназная активность A. variabilis, выросшей при разных температурах, различалась и характером зависимости удельной активности от температуры проведения реакции. Клетки, выросшие при 30°С, проявляли максимальную активность при температуре 29-34°С (рис. 8). У клеток, выросших при 41°С, диапазон оптимальных температур при проведении реакции смещался в область еще более высоких значений (39-43°С). Таким образом, культуры, выросшие при определенных значениях рН и температуры, адаптируют свою нитрогеназную систему, чтобы ее функционирование было оптимально в данных условиях.
Клетки A. variabilis, выросшие при разных температурах, различались также в чувствительности к интенсивности света при измерении нитрогеназной активности. Нитрогеназная активность клеток, выросших при 26-30°С, возрастала при увеличении интенсивности света вплоть до 80 Вт/м2, достигая насыщения при дальнейшем его увеличении. Клетки, выросшие при 37-44°С, проявляли максимальную нитрогеназную активность при 40-60 Вт/м2. При дальнейшем увеличении интенсивности света происходило снижение нитрогеназной активности. Напротив, клетки, выросшие при 21°С не достигали насыщения и при 100 Вт/м2. Таким образом, температура культивирования оказывает влияние не только на оптимальное значение температуры при проведении реакции, но и на световую зависимость нитрогеназной активности.
Рис. 8. Влияние t>C в процессе проведения реакции ацетнленредукции на нитрогеназную активность клеток А. variabilis, выросших в азотфиксирующих условиях в режиме турбидостата в присутствии Мо при температуре 30 (1); 38 (2) и 41"С (3).
6. Оценка возможности использования фототрофных бактерий в системах преобразования солнечной энергии в энергию Ш и других энергоемких соединений.
6.1. Образование Нг растущими культурами пурпурных бактерий
Пурпурные бактерии ДЬ. сарьиШш и ЯЬ. $рИаего1<1е$, как следует и из наших исследований, относятся к высокоактивным азотфиксаторам и именно поэтому способны к образованию Нг с высокими скоростями. Нами показано, что скорость фотообразования Н: хемостатными культурами ЯЬ. сарзиШм может достигать 100 мл/час/л суспензии. Удаление Н: из ФБР приводило к увеличению скорости фотообразования Н:.
6.2^. Образе вание Нг иммобилизованными культурами пурпурных бактерий
6.2.1. Иммобилизация фототрофных микроорганизмов
С точки зрения обеспечения культур светом стекло является одной из лучших матриц для иммобилизации фототрофных микроорганизмов. Отрицательно заряженные микроорганизмы слабо адсорбируются на отрицательно заряженной поверхности стекла.. Мы подобрали метод модификации заряда поверхности стекла для ускорения адсорбции микроорганизмов. Активация стекла для придания поверхности положительного заряда имела наибольший эффект на адсорбцию ЯЬ. Бр}1аего1с1ез IIV на матрице (рис. 9).
А 3
Рис. 9. Фотографии, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа неактивпрованпого (А) и модифицированного с помощью ЬЭ-2480 (В) пористого стекла после ннкубации в суспензии микроорганизмов. Длина светлых отрезков на фотографиях соответствует 10 мкм.
Разработанный метод был проверен на других фототрофных микроорганизмах (табл. 6). Из 17 тестированных организмов, относящимся к разным семействам (ЛЛ ойоьрмШа сеае, СЬготаПасеае, ЕсюМогкойасеае, СЫогоркусеае, СуапорИусоШ), 11 обнаружили достаточно высокую способность к такой иммобилизации.
Таблица 6
Иммобилизация разных фототрофных микроорганизмов на активированном стекле
Микроорганизм Доля занятой поверхности, %
Anabaena variabilis 22,9
Anabaena sphaerica 25,2
Chlamydomonas reinhardii 26,3
Chlorella vulgaris 31,9
Chroococcidiopsis thermalis 10,2
Ectothiorhodospira shaposhnikovii 3,0
Glceocapsa alpicola 38,7
Gleotrichia raceborxkii 36.4
Gloeothece sp. 14,7
Mastigocladus laminosum 22,4
Nostoc muscorum 25.8
Rhodobacler capsulatus 19,0
Rhodobacter sphaeroides 38,0
Rhodopseudomonas palustris 2,6
Rhodospirillum rubrum 4,3-8,5
Synechococcus sp. 29,9
Thiocapsa roseopersicina 10,3
6.2.2. Фотобиореактор с ЯЬ. врЬаего1с1ев ЯУ, иммобилизованной на пористом стекле, для фотообразования Н2.
Для проверки возможности фотообразования II: пурпурными бактериями, иммобилизованными на пористом стекле, был разработан ФБР, представляющий собой плоскопараллельную кювету с пластинами пористого стекла. Указанный реактор работал при 30°С и 40 Вт/м2 со средой Ормеруда с 10 мМ сукцнната, 1 мМ глутамата и 0,05° о дрожжевого экстракта.
Образование водорода начиналось через 15 час после установки пластины пористого стекла с иммобилизованными бактериями в ФБР и заполнения его средой. Это образование было стабильным уже через 20-25 ч после начала
его работы. Таким образом, разработанный нами метод иммобилизации не только позволяет ускорить процесс адсорбции бактерий на пористом стекле, но также и не нарушает целостность бактерий.
Способность ФБР с иммобилизованной ИЬ. ¡р!шего1с!е$ к длительной работе проверяли при 40 Вт/м2 и скорости подачи среды 0,3ч'1. Фотообразование Н; было стабильным в течение 40 дней, причем дальнейшее продолжение работы ФБР в таком режиме не имело принципиальных ограничений.
Скорость фотообразования Ш ФБР зависит прежде всего от вида и штамма иммобилизованной бактерии. Так, в оптимальных условиях с наибольшей скоростью образование Нг наблюдали при иммобилизации ИЬ. $ркаего1(1е$ СТ.-1. причем эффективность использования лактата этой бактерией достигала 75% (табл. 7).
6.2.3. Возможность использования пурпурных бактерий для очистки сточных вод с одновременным получением Нг.
Несмотря на относительно высокие скорости фотообразования Н: пурпурными бактериями, получение Нг таким способом не может иметь практического применения вследствие использования синтетических сред. В связи с этим нами была проверена возможность использования некоторых сточных вод различными пурпурными бактериями, а также способность к образованию Н: в ФБР с одновременной очисткой сточных вод от органического соединения.
Таблица 7
Максимальные скорости фотообразования водорода разными пурпурными бактериями, иммобилизованными на пористом стекле_
Бактерия Условия в ФБР Скорость Эффективн.
обр. Н:, использования
мл/ч/мл органического
матрицы соединения, %
КЬ. хр/шегоПех 10 мМ сукцината, 1,3 55
ЗС0 Вт/м"2, проток 0,3
Д. рг1\'шп К5 ч 10 мМ лактата. 30 0,2 13
Вт/м2, проток 0,33 ч-'
ЯЬ. зр}шего\йгз СЬ-1 10 мМ лактата, 300 3,6 75
Вт/м2, проток 0,3 ч-1 Уже через 20 час после иммобилизации В.. \ilvum в ФБР. заполнения его средой Ормсруда и при освещении 30 Вт/м2 было отмечено образование Нг, и после включения протока среды Ормеруда через реактор (5 мл/ч) образование водорода наблюдалось с постоянной скоростью. Через 96 час среду Ормеруда
в ФБР заменили на сточную воду Серпуховского молокоперерабатывающего завода. ФБР с иммобилизованной R. fulvum не только образовывал Н2 со средней скоростью около 0,26 мл/ч/мл пористого стекла, но и удалял до 80% лактата из сточной воды, что свидетельствует о возможности одновременной очистки сточных вод от органических соединений и фотообразования Нг с использованием пурпурных бактерий.
6.3. Образование Н2 растущими культурами цианобактерий
В отличие от аноксигенных фототрофных прокариот, к которым относятся пурпурные бактерии, азотфиксирующие цианобактерии способны к образованию Н2 при биофотолизе воды за счет действия двух фотосистем, что не требует наличия восстановителя.
При выращивании культур A. variabilis в присутствии молибдена, в присутствии ванадия и без указанных металлов максимальная нитрогеназная активность клеток и скорость фотообразования ими Нг наблюдались в начальной стадии роста и далее снижались независимо от наличия в среде Мо и V, что обычно связывают с недостатком -восстановителя в гетероцистах (Chen et al., 1989). Возможно, недостаток восстановителя в гетероцистах обусловлен недостатком света в более поздних фазах роста, поскольку при выращивании A. variabilis и A.azollae в трубчатом ФБР с оптимальным светообеспечением нитрогеназная активность клеток была неизменной в течение 100 час, тогда как удельная скорость фотообразования Нг даже несколько возрастала. Если при культивировании A. variabilis без Мо в присутствии V в сосудах максимальная нитрогеназная активность наблюдалась у культур с оптической плотностью 0,18 о.е., то при культивировании в ФБР максимальной нитрогеназной активностью обладали культуры с плотностью до 1,2 о.е. (14 мкг Chi а/мл).
При росте A. variabilis в азотфиксирующих условиях образования Нг в процессе роста не происходило. Замена воздуха на аргон (в присутствии) углекислоты) также не приводила к образованию водорода в ФБР. При изменении газовой смеси с 98% воздуха+ 2% СОг на 100% аргона парциальное давление растворенного кислорода снижалось (рис. 10) и через 2ч инкубации стабилизировалось, что свидетельствует об исчерпании углекислоты в ФБР. В выходящем из ФБР газе появлялся водород уже через 10 мин после изменения газовой фазы. Скорость его образования увеличивалась на протяжении всего периода инкубации культуры под аргоном и достигала 15 мл/ч/л суспензии.
Рис. 10 Влияние газовой фазы на скорость образования Ш растущими
культурами в ФБР. 1-рН; 2- рОг (в % от насыщения воздухом); 3-скорость образования Ш
Литературные данные о влиянии углекислоты на образование Н: цианобактериями противоречивы. Проведенные нами исследования показали, что фотообразование Н; A. variabilis АТСС 29413 и A.azollae подавляется не углекислотой, а кислородом, выделяющимся на свету в присутствии углекислоты. Полученные данные позволяют также заключить, что снижение скорости фотообразования Н: растущими в ФБР клетками при повышенном рО: обусловлено не снижением нитрогеназной активности, а увеличением скорости поглощения Н: за счет действия гидрогеназы.
6.4. Возможности получения полигидроксибутирата с помощью пурпурных бактерий.
В литературе имеется ряд сообщений о синтезе поли-Р-(гидроксибутирата) пурпурными несерными бактериями (Dierstein and Drews. 1974: Brandl et al.. 1989; Fuller, 1995). Согласно нашим данным Rb. sphaeroides RV при росте в периодической культуре с использованием ацетата без контроля pH и в присутствии аммония накапливала значительные количества ПГБ. В экспоненциальной фазе роста его содержание составляло около 15%. При переходе культур в линейную фазу роста его содержание начинало возрастать и достигало максимального значения (43%) в начале стационарной фазы роста. Следует отметить, что в этих условиях pH культивирования постоянно повышался от 7.2 в начале культивипования до 9.8 в начале стационарной фазы.
Для проверки влияния pH культуры Rb. sphaeroides RV выращивали в периодическом режиме при различных pH. У культур, росших при pH 7,0 содержание ПГБ было минимальным и не зависело от фазы роста. Культуры
Rb. sphaeroides росшие при более высоких рН, обладали меньшей скоростью роста и изменяли внутриклеточное содержание ПГБ не в конце, а начале роста. Содержание ПГБ было выше у клеток, росших при рН 8,5 (до 32%).
Известно, что синтез ПГБ хемотрофными микроорганизмами зависит от обеспеченности культур азотом. При росте в условиях лимитирования аммонием A. eulrophus накапливала значительно больше ПГБ (Fuller, 1995). Однако Rb. sphaeroides RY при росте в режиме хемостата с лимитированием аммонием накапливала очень мало ПГБ. Как и в случае периодических культур содержание ПГБ зависело от рН культивирования, однако не превышало 2,3%. Культуры обладали нитрогеназной активностью и выделяли Н;. Очевидно, значительная часть избытка восстановителя в этих условиях сбрасывалась в виде Нг.
Выводы
1. Разработана методология управляемого непрерывного культивирования фототрофных микроорганизмов. Созданы новые типы фотобиореакторов для интенсивного лабораторного культивирования фототрофных микроорганизмов и программно-управляемые комплексы управления процессом культивирования. Предложен простой эмпирический критерий сравнения производительности фотобиореакторов разных конструкций.
2. Определены ростовые характеристики ряда пурпурных бактерий (скорости роста, эффективность использования энергии света и лактата, выходы по использованию органических и минеральных соединений) в разных условиях роста. Показано, что культуры Rb. capsulatus адаптируются не только к средней интенсивности света, но реагируют и на неравномерность светового поля в культуре. Обнаружено, что одновременное присутствие Нг и лактата может приводить к увеличению эффективности использования этих доноров электронов или подавлять рост пурпурных бактерий, в зависимости от наличия углекислоты и вида бактерии.
3. Проведено сравнительное изучение влияния ряда факторов (рН, t°C, интенсивность света, тип питания, источник азота) на синтез гидрогеназ пурпурными бактериями. Основным фактором, определяющим синтез гидрогеназ . пурпурными бактериями, является доступность донора электронов, причем у разных пурпурных бактерий наблюдается индукция синтеза молекулярным водородом и/или репрессия синтеза органическими донорами электронов в различных комбинациях.
4. Определены оптимальные условия для синтеза нитрогеназы пурпурными бактериями (лимитирование источником азота, насыщение светом, оптимальные рН и температура). Обнаружено, что ннтрогеназная система Rb. capsulatus и гетероцистной цнанобактерии A. variabilis адаптируется к изменению рН и температуры культивирования таким образом, чтобы проявлять максимальную активность в заданных условиях культивирования.
5. Регуляция активности нитрогеназы, осуществляемая путем ДДФ-рибозилирования Fe-белка нитрогеназы у Rb. capsulatus и Ect. shaposhnikovii, определяется доступностью азота. С увеличением степени лимитирования культур азотом (причем как аммонийным, так и N2, и глутаматом) содержание дерибозилированной (активной) формы нитрогеназы возрастает.
6. Rb. capsulatus способна, в дополнение к нитрогеназе, содержащей Mo в активном центре, к синтезу альтернативной нитрогеназы, не содержащей ни Mo, ни V, тогда как Rb. sphaeroides такой способностью не обладает. Азотфикснрующие культуры Rb. capsulatus и A. variabilis, синтезирующие альтернативные нитрогеназы, приобретают способность к росту при более щелочных рН, чем культуры, синтезирующие Мо-нитрогеназу.
7. Лимитированные аммонием хемостатные культуры Rb. capsulatus способны образовывать Н2 в фотобиореакторе со скоростью до 100 мл/час/л суспензии. Основными факторами, ограничивающими скорость образования !!;, являются доступность лактата. светообеспечение и концентрация Нг в газовой фазе.
8. Цнанобактерии A. variabilis и A. azollae образуют Н; в лабораторном фотобиореакторе со скоростью до 13 мл/час/л суспензии (отсутствие N; и СО:, низкое рОг. насыщающий свет). Снижение образования Нг прн повышении О: обусловлено увеличением скорости поглощения Н: за счет действия водородпоглощающей гидрогеназы. но не ингнбированием нитрогеназной активности кислородом.
9. Разработан метод иммобилизации фототрофных микроорганизмов на пористом стекле и показано, что этот метод применим к широкому спектру фототрофных микроорганизмов. Иммобилизованные на пористом стекле клетки Rb. sphaeroides способны выделять Нг более 900 часов, причем скорость этого процесса в оптимальных условиях может достигать 3,5 л/час/л носителя. Показана возможность одновременной очистки сточных вод молочного комбината от органических соединений и образования Нг.
10. Rb. sphaeroides RV способна к накоплению полигидроксибутнрата в значительном (до 42% от веса сухой биомассы) количестве. Увеличение pH выше оптимального значения для роста приводит к повышению содержания полигидроксибутнрата в клетках. Показано, что накопление полигидроксибутнрата и фотообразование II; - конкурирующие процессы и в условиях недостатка азота происходит преимущественное образование Нг.
Список опубликованных работ по теме диссертации
1. Цыганков A.A., Гоготов И.Н. Непрерывное культивирование фототрофных бактерий. // Прикл. Биохим. Микробиол. 1979., т.15, №5. С.665-669.
2. Цыганков A.A., Казанцев А.П. Установка для непрерывного культивирования фототрофных микроорганизмов с системой автоматического управления на основе программируемого калькулятора 15ВСМ-5. // В сб.: Описания научных принципов устройства новых приборов и методики пользования ими. Аппаратура для культивирования микроорганизмов. ОНТИ НЦБИ: Пущино. 1980. С. 16-21.
3.Цыганков A.A., Павлова Е.А., Гоготов И.Н. Активность некоторых ферментов, участвующих в метаболизме Н2 у Rhodopseudomonas capsulata в зависимости от условий роста культур. // Микробиология. 1982 т. 51, №2, С.188-192.
4. Цыганков A.A., Гоготов И.Н. Влияние температуры и pH среды на нитрогеназную и гидрогеназную активность у Rhodopseudomonas capsulata при азотфиксации. // Микробиология. 1982. т. 51, № 3, С.396-401.
5. Цыганков A.A., Якунин А.ф., Гоготов И.Н. Гидрогеназная активность у Rhodopseudomonas capsulata при росте на органических средах. // Микробиология. 1982. т. 51, №4, С.533-537.
6. Цыганков A.A., Якунин А.Ф., Гоготов И.Н. Влияние рО: на рост, гидрогеназную и нигрогеназную активности клеток Rhodopseudomonas capsulata и Azotobacter vinelandii. II Микробиология. 1983. т. 52, № 3, С.543-547.
7. Цыганков A.A., Гоготов И.Н., Кондратьева E.H. Рост и синтез гидрогеназы Rhodopseudomonas capsulata при непрерывном культивировании. // Микробиология. 1984. т. 53, № 3, С.392-397.
8.Якунин А.Ф., Цыганков A.A., Гоготов И.Н. Соотношение двух форм нитрогеназы и эффект ее выключения в клетках Rhodopseudomonas capsulata,
выросших в условиях лимитирования по аммонию. // Докл. АН СССР. 1985. т. 281, №2, С.482-485.
9.Gogotov I.N., Yakunin A.F., Tsygankov А.А. Regulation of hydrogenase, nitrogenase and ferredoxin synthesis in Rhodopseudomonas capsulcita. II In: Environ. Regul. of Microbial Metabolism. (Kulaev I.S. et al. eds) Acad. Press, London. 1985. C.221-231
10.Tsygankov A.A., Suvorova L.G. Synthesis regulation of hydrogenases from phototrophic bacteria. // In: Abstr. Int. Symp. on molecular biology of hydrogenases. BRC Hungarian Acad. Sci.: Szeged. 1985. Hungary. C.45.
П.Киселев Г.Г., Ннконов B.IL, Сорокина А.Б., Цыганков А.А. Автоматизированный комплекс программно-управляемого
культивирования фототрофных микроорганизмов. // В сб.: Приборы для исследований в области физико-химической биологии и биотехнологии. ОНТИ НЦБИ АН СССР: Пущино. 1986. С.69-76.
И.Якушш А.Ф.. Цыганков А.А., Гоготов И.Н. Регуляция двух форм нитрогеназы в непрерывной культуре Rhodobacter capsulatus. II Микробиология. 1987. т. 56. №6, С.916-921
И.Васильева Л.Г., Цыганков А.А.. Гоготов И.Н. Регуляция биосинтеза гидрогеназы у Rhodobacter sphaeroides. II Микробиология. 1988. т. 57. №1. С.5-10.
14.Васильева Л.Г.. Цыганков А.А.. Гоготов И.Н. Роль органических соединений и цАМФ в регуляции биосинтеза гидрогеназы у Rhodospirillum rubrum. //Докл. АН СССР. 1988. т. 301, №2, С.477-479.
15.Якунин А.Ф..' Цыганков А.А., Трошина О.Ю.. Гоготов И.Н. Синтез двух форм нитрогеназы и активность ферментов ассимиляции аммония в непрерывной культуре Ectothiorhodospira shaposhnikovii. // Докл. АН СССР. 1988. т. 300, №4, С.1009-1012.
!6.Лауринав»чене Т.В.. Васильева Л.Г., Цыганков А.А., Гоготов И.Н. Пурпурная несерная бактерия Rhodobacter sphaeroides, выделенная из почвы рисового поля южного Вьетнама. И Микробиология. 1988. т. 57, №5, С.810-815.
17.Цыганков А.А.. Букатин В.Е., Киселев Г.Г., Гоготов И.Н. Аппарат для культивирования фототрофных микроорганизмов. // Авт. Свидет. № 1521404 Бюлл. Изобрет. 1989. № 42.
18.Васильева Л.Г.. Цыганков А.А. Рост Ectolhiorhodospira shaposhnikovii li катаболитная репрессия сшпсза гндрогеназы. // Микробиология. 1989. т. 58, № 5. С.693-697.
19.Цыганков А.А., Васильева Л.Г.. Зорин Н.А., Гоготов И.Н. Индукция синтеза гндрогеназы молекулярным водородом у Rhodobacter sphaeroides. I/ Микробиология. 1989. т. 58. №4, С.544-548.
20.Цыганков А.А.. Гоготов И.Н. Получение биомассы пурпурных бактерий. // Прикл. биох. и мпкробиол. 1990. т. 26. №6, С.819-824.
21.Tsygankov A.A.. Vasilieva L.G. Catabolic repression of hydrogenase synthesis in Ectolhiorhodospira shaposhnikovii. II FEMS Microbiol. Lett. 1990. Y.67, P.171-174.
22.Цыганков A.A. Фототрофные микроорганизмы: культивирование, скорости роста и выход биомассы. // В кн: "Экспериментальная экология", М.: Наука. 1991. С.76-85.
23.Цыганков А.А.. Чан Ван Ни. Гоготов И.Н. Рост Лпараепа variabilis в непрерывной культуре и адаптационные возможности ее нитрогеназной системы. // Микробиология. 1991. т. 60, №5. С.853-859.
24Лкунин А.Ф.. Цыганков А.А.. Гоготов И.Н. Возможности образования альтернативных ннтрогеназ пурпурными несерными бактериями. // Докл. АН СССР. 1991. т. 316. №2. С.497-500.
25.Якунин А.Ф.. Цыганков А.А.. Трошина О.Ю.. Гоготов И.Н. Рост и нитрогеназная активность непрерывных культур Rhodobacter capsulatus и Rhodobacter sphaeroides в зависимости от наличия среде Mo. W и V. // Микробиология. 1991. т. 60, №1. С.41-46.
26.Цыганков А.А.. Лауринавичене Т.В.. Краснльникова Е.Н., Гоготов И.Н. Водородный эффект у Rhodospirillum rubrum и Rhodospirillum fulvum. I/ Микробиология. 1992. т. 61. №4. С.571-576.
27.Цыганков А.А.. Лауринавичене Т.В. Рост и азотфиксация Rhodobacter capsulatus в присутствии Мо и без него. // Микробиология. 1993. т. 62, №5, С.855-862.
28.Tsygankov А.А., Hirata Y.. Asada Y., Miyake J. Immobilization of the purple non-sulfur bacterium Rhodobacter sphaeroides on glass surfaces. // Biotechnology Techniques. 1993. Y.7. P.283-286.
29.Цыганков A.A., Букатин B.E.. Гоготов И.Н. Аппарат для культивирования фототрофных микроорганизмов. // Патент SU 1833128 A3, от 07.08.93. Бюлл. 1993. N29.
30.Цыганков A.A.. Букатнн В.Е.. Гречихин О.П. Устройство для культивирования фототрофных микроорганизмов. Патент SU 1833219 A3 от 07.08.93 г. Бюлл. 1993. N29.
31.Tsygankov, Y. Hirata. M. Miyake, Y. Asada. J. Miyake. Hydrogen evolution by photosynthetic bacterium Rhodobacler sphaeroides immobilized on porous glass. // In: Proc. 1st Int.Conf. New Energy Systems and Conversions (New Energy Systems Society). Yokohama. 1993. P.229-233
32.Suzuki, A.A. Tsygankov, J. Miyake. Y. Tokiwa. Y. Asada Production of poly-(hydroxybutyrate) by photosynthetic microorganisms. // In: Proc. 3rd Int. Sei. Workshop Biodegradable Plastics Polymers. Osaka. 1993. P.62-68
ЗЗ.Лауринавичене Т.В., Цыганков A.A.. Гоготов И.H. Сходства и различия альтернативной и Мо-содержащеи нитрогеназ в клетках Rhodobacler capsulatus. // Прнкл. биох. мнкробнол. 1994. т. 30. №3. С.389-395.
3-4.Tsygankov A.A., Laurinavichene T.Y.. Gogotov I.N. Laboratory scale photobioreactor. // Biotechnol. Techniques. 1994. Y.8. P.575-578.
35.Suzuki, A. A. Tsygankov. J. Miyake. M. Miyake. Y. Tokiwa. Y. Asada Production of poIy(3-hydroxybutyrate) by photosynthetic microorganisms. // Stud. Polyrn. Sei. 1994. 12. P. 387-393
36.Tsygankov A.A.. Hirata Y.. Miyake M.. Asada Y.. Miyake J. Photobioreactor with photosynthetic bacteria immobilized on porous glass for hydrogen photoproduction. J. of Ferm. and Bioengineering. 1994. Y.77, P.575-578.
37.Suzuki T.. Tsygankov A.A.. Miyake J., Tokiwa Y., Asada Y. Accumulation of poly-(hydroxybutyrate) by a non-sulfur photosynthetic bacterium, Rhodobacler sphaeroides RY at different pH. // Biotechnol. Letters. 1995. У17. P.395-400.
38.Tsygankov A.A.. Laurinavichene T.V.. Bukatin Y.E.. Gogotov I.N.. Hall D.O. Comparison of different photobioreactors in biomass production: a search for simple estimation critérium. // In: Proc. Workshop on Algal Biotechnol. Potsdam. 1995. P.48-51
39.Tsygankov A.. Laurinavichene T., Gogotov I.. Miyake J., Asada Y. Nitrogenase activity of Rhodobacler capsulatus during switching from over light to ammonium limitation of chemostat cultures. //' In: Proc. X Int. Cong, on Nitr. Fixation. St. Petersburg, Russia, May 28-June 3, 1995. (Tikhonovich et al. eds) KIuwer Acad. Publ.. P. 240.
40.Tsygankov A.A., Laurinavichene T.Y. Different modes of light limitation of turbidostat cutures of Rhodobacler capsulatus. II In: Proc. X Congr. on
Photosynthesis. Montpellier, France, July, 20-27. 1995. (Mathis ed.) Elsevvier.V. Ill, P. .866-869
41.Zhu, J. Miyake, Y. Asada, A.A. Tsygankov Hydrogen production from highly concentrated organic wastewater by photosvnthetic bacteria and anaerobic bacteria. // Water Treat. 1995. Y.10. P.6I-68
42.Tsygankov. T. Laurinavichene, I. Gogotov, Y. Asada, J. Miyake, Swiching over from light illumination to ammonium limitation of chemostat cultures of Rhodobacter capsulatus grown in different types of photobioreactors. // J. Marine Biotechnol. 1996. Y.4. P.43-46
43.Цыганков A.A., Лауринавичене Т.В. Зависимость роста и нитрогеназной активности от освещенности и рН у Rhodobacter capsulatus в присутствии и отсутствие Мо. // Микробиология. 1996. т. 65. №4, С.499-504
44.Tsygankov A., Laurinavichene Т. Influence of the degree and mode of light limitation on growth characteristics of Rhodobacter capsulatus continuous culture. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.51, P.605-612
45.Цыганков A.A., Лауринавичене T.B., Гоготов И.Н.; Асада Й., Мияки Дж. Влияние света на нитрогеназную активность хемостатных культур Rhodobacter capsulatus. // Прикл. биохим. микробиол. 1997. т. 33, №1, С.24-27
46.Цыганков А.А.. Лауринавичене Т.В., Букатин В.Е., Гоготов И.Н., Холл Д. Получение биомассы при непрерывном культивировании Rhodobacter capsulatus в различных фогобиореактора.х. /V Прикл. Биохим. Микробиол. 1997. т. 33, №5, С.544-549
47.Tsygankov A., Serebryakova L., Sveshnikov D., Rao К.. Gogotov I.. Hall D. Hydrogen production by three different nitrogenases in whole cells of Anabaena variabilis and the dependence on pH. // Int. J. of Hydrogen Energy. 1997. V.22, P.859-867
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Цыганков, Анатолий Анатольевич, Пущино
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА
На правах рукописи УДК 576.8
ЦЫГАНКОВ Анатолий Анатольевич
Управляемое культивировйние пурпурных бактерий в изучении метаболизма водорода и азотфиксации
03.00.07 - Микробиология
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Пущийо-1997
Содержание
Список сокращений........................................................................................5
Введение...........................................................................................................7
Актуальность темы.........................................................................................7
Цель и задачи исследования...........................................................................№
Научная новизна работы...............................................................................Ю
Практическая ценность работы..................................................................12
Апробация работы.........................................................................................13
Структура и объем диссертации......*..........................................................14
Публикации......................................................................................................14
Глава 1. Объекты и методы исследования................................................15
1.1. Объекты исследования............................................................................15
1.2. Среды для культивирования....................................................................16
1.3. Определение ферментативных активностей.......................................17
1.3.1. Гидрогеназная активность..................................................................................17
1.3.2. Нитрогеназная активность..................................................................................17
1.4. Определение концентраций различных соединений...............................19
1.4.1. Определение содержания в среде органических кислот....................................19
.. 1.4.2. Определение аммония......................................................................................... 19
1.4.3. Определение концентрации сухой биомассы, белка, хлорофилла а и бактериохлорофилла а...................................................................................................19
1.4.4. Измерение р02.....................................................................................................20
1.4.5. Измерение образования Н2 в ФБР й иммобилизованными клетками...............20
1.4.6. Измерение восстановленных пиридиннуклеотидов и АТФ..............................21
1.5. Измерение интенсивности света...........................................................21
1.6. Активация поверхноти стекла и иммобилизация фототрофных микроорганизмов............................................................................................22
1.7. Используемые сточные воды..................................................................23
1.8. Другие определения..................................................................................24
1.9. Точность и воспроизводимоть измерений.............................................26
Глава 2. Фотобиореакторы и системы управления ими.........................27
2.1. Фотобиореакторы..................................................................................27
2.1.1. Плоскопараллельные кюветы.............................................................................29
2.1.2. Трубчатые ФБР....................................................................................................30
2.1.2.1. Недостатки трубчатого ФБР....................................................................32
2.1.2.2. Улучшения конструкции трубчатого реактора........................................34
2.1.2.3. Модификация трубчатого ФБР с возможностью масштабирования, предложенная в данной работе...............................................................................36
2.1.3. ФБР на основе коаксиальных цилиндров...........................................................36
2.1.3.1. Модификации, предложенные в данной работе.........................................38
2.1.4. ФБР на основе адаптации ферментеров.............................................................43
2.1.4.1. Адаптации ферментеров для культивирования фототрофных бактерий, предложенные в данной работе..............................................................................44
2.1.5. Другие типы ФБР.........,......................................................................................46
2.1.6. Критерии оценки ФБР......................:..................................................................48
2.1.7. Экспериментальное сравнение различных ФБР................................................52
2.2. Системы управления фотобиорбакторами...........................................59
2.3. Заключение...............................................................................................72
Глава 3. Ростовые характеристики пурпурных бактерий......................75
3.1. Скорости роста фототрофных бактерий в различных условиях.......77
3.2. Влияние физико-химических факШоров..................................................79
3.2.1. Температура.........................................................................................................79
3.2.2. рН.........................................................................................................................81
3.2.3. Интенсивность света...........................................................................................84
3.2.4. Рост в темноте в присутствии кислорода...........................................................86
3.4. Использование закономерностей материально-энергетического баланса при изучении ростовых характеристик ЯЬ. сартШш.................87
3.4.1. Теоретические аспекты.......................................................................................88
3.4.2. Экспериментальные данные...............................................................................89
3.5. Фотомиксотрофные условия................................................................101
3.7. Заключение.............................................................................................105
Глава 4. Физиологические особенности синтеза гидрогеназ пурпурными бактериями...........................................................................110
4.1. Гидрогеназы...........................................................................................ПО
4.2. Действие физико-химических факторов..............................................113
4.3. Роль органических доноров электронов...............................................118
4.3.1. Rb. capsulaîus.....................................................................................................118
4.3.2. Rb. sphaeroides...................................................................................................122
4.3.3. Ect. shaposhnikovii..............................................................................................122
4.4. Роль молекулярного eodopçda................................................................124
4.4.1. Rb. capsulaîus.....................................................................................................124
4.4.2. Rb. sphaeroides...................................................................................................125
4.4.3. Ect. shaposhnikovii..............................................................................................134
4.5. Совместное действие органических соединений и Н2........................135
4.5.1. Rb. capsulaîus.....................................................................................................135
A.S.l.Rb. sphaeroides...................................................................................................138
4.5.3. Thiocapsa roseopersicina....................................................................................139
4.6. Влияние кислорода.................................................................................140
4.7. Взаимосвязь синтеза гидрогеназы и нитрогеназы у пурпурных бактерий.......................................................................................................141
4.8. Заключение.............................................................................................143
Глава 5. Физиологические особенности регуляции синтеза и активности нитрогеназ у пурпурных бактерий......................................149
5.1. Возможность синтеза альтернативных нитрогеназ Rb. capsulaîus BIO
и Rb. sphaeroides 2R......................................................................................152
5.1.1. Poct^ô. capsulaîus в присутствии Mo и без него...........................................155
5.1.2. Сходства и различия альтернативной и Мо-содержащей нитрогеназ у Rb. capsulaîus.....................................................................................................................160
5.2. Нитрогеназная активность и синтез двух форм нитрогеназы Rb. capsulaîus и Ect shaposhnikovii в непрерывных культурах при росте на различных источниках азотц......................................................................167
5.2.1. Rb. capsulaîus.....................................................................................................167
5.2.2. Ect. shaposhnikovii..............................................................................................172
5.3. Действие физико-химических факторов..............................................173
5.3.1. рН и температура...............................................................................................174
5.3.1.1. Rb. capsulatus..............................................................................................174
5.3.1.2. A. variabilis..................................................................................................178
5.3.3. Интенсивность света.........................................................................................183
5.4. Заключение.............................................................................................192
Глава 6. Оценка возможности использования фототрофных бактерий в системах преобразования солнечной энергии в энергию Н2 и других
энергоемких соединений............................................................................195
6.1. Образование Н2 растущими культурами пурпурных бактерий.........197
6.2. Образование Н2 иммобилизованными культурами пурпурных бактерий206
6.2.1. Иммобилизация фототрофных микроорганизмов................. ..........................206
6.2.2. Фотобиореактор с Rb. sphaeroides RV, иммобилизованной на пористом стекле, для фотообразования Н2.............................................................................................211
6.2.3. Возможность использования пурпурных бактерий для очистки сточных вод с одновременным получением Н2.................................................................................213
6.3. Образование Н2 растущими культурами цианобактерий..................218
6.4. Возможности получения полигидроксибутирата с помощью пурпурных бактерий.....................................................................................228
6.5. Заключение.............................................................................................233
Общее заключение......................................................................................239
Выводы.........................................................................................................246
Литература...................................................................................................250
Список сокращений
ФБР - фотобиореактор
10 - полная интенсивность света на поверхности культуры 1пад - доля интенсивности света на поверхности культуры в диапазоне 400900 нм
1ср - средняя интенсивность света внутри ФБР с длиной волны 400-900 нм 11тр - интенсивность света, прошедшегб сквозь культуру без поглощения 10х - доля световой энергии, излучаемдй источником света при длине волны X
1шт - минимальная интенсивность све*а внутри ФБР С>св -скорость потребления энергии света культурой в ФБР Эг - поверхность культуры, освещенная источником света Ф - скорость фотосинтеза
Кцв - доля энергии света в диапазоне 400-900 нм от полного светового потока
К1 - поправочный коэффициент, учитывающий неравномерность интенсивности света по высоте ФБР (1 - толщина слоя суспензии
кх - коэффициент экстинкции культуры при длине волны X
е - коэффициент экстинкции культуры, усредненный в диапазоне 400-900
нм
- выход биомассы по использованию субстрата 8 с учетом энергии поддержания
У3 - выход биомассы по использованию субстрата Б без учета энергии поддержания
ш3 - энергетический коэффициент поддержания жизнедеятельности при использовании субстрата Э
С2б - скорость запасания тепловой энергии в биомассе, находящейся в ФБР
С^лак - скорость потребления тецловой энергии, запасенной в потребленном лактате культурой в ФБР
qs - скорость потребления энергии света или лактата культурой в ФБР у - уровень восстановленности биомассы
С (моль/л) - равновесная концентрация биомассы в ФБР, выраженная в молях углерода биомассы в 1 л
Стах(тт) - максимальная (минимальная) концентрация лимитирующего или ингибирующего фактора V (л) - объем культуры в ФБР
X (г/л) - равновесная концентрация биомассы в ФБР, выраженная ^ г сухой биомассы/л
г| - энергетический выход биомассы
ц - скорость роста культуры
цт - максимальная скорость роста культуры
Б - концентрация исследуемого субстрата в среде (г/л)
К8 - константа насыщения
К1 - константа ингибирования
Кт - константа Михаэлиса
у - выход по углероду
НАД(Ф) - никотинамиддинуклеотид (фосфат) цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
*Применены символы в соответствии с рекомендациями ШРАС (ЕгояЫп, 1992)
Введение.
Актуальность темы.
Пурпурные бактерии, относящйеся к порядку Rhodospirillales, - это грамотрицательные микроорганизмы, осуществляющие аноксигенный тип фотосинтеза. Эти бактерии обладают удивительной подвижностью своего метаболизма, проявляя способность к росту в фотоавтотрофных, фотогетеротрофных, хемоавтотрофнь<х и хемогетеротрофных (аэробных и анаэробных) условиях. Они относятся к числу наиболее активных азотфиксаторов вследствие высокой скорости роста в азотфиксирующих условиях. Эти микроорганизмы способны к образованию Нг за счет действия нитрогеназы, а также к его использованию при участии гидрогеназы. Благодаря этим особенностям они широко распространены в природных экосистемах и поэтому привлекают внимание исследователей самых разных областей.
Знание ростовых характеристик пурпурных бактерий необходимо для понимания их роли в экологический системах. Однако к началу наших исследований знания скоростей роста и выхода пурпурных бактерий при использовании разных соединений, в том числе света, были фрагментарны. Это было обусловлено прежде всего недостаточным развитием методов ! управляемого культивирования этих бактерий.
Гидрогеназа и нитрогеназа являются ключевыми ферментными системами в метаболизме Н2 у пурпурных бактерий.
К началу наших исследований гидрогеназы уже были выделены и « охарактеризованы из ряда хемотрофных (Haschke and Campbell, 1971; Arp and Burns, 1979; Adams and Hall, 1979a; Van Dijk et al., 1979; Schoenmaker et al., 1979; Пинчукова и др., 1979; Chen and Blanchard, 1978; Glick et al., 1980), a также пурпурных (Gitlitz and Krasna, 1975; Strecas et al., 1980; Зорин и др., 1976; Adams and Hall, 1979b; Hirua et al., 1979) бактерий. В то
же время данные о регуляции синтеза гидрогеназ у пурпурных бактерий были немногочисленны и противоречйвы (Кондратьева, Гоготов, 1981). Это было обусловлено прежде всего проведением исследований с использованием культур, выросших в неконтролируемых периодических -условиях, поскольку такие факторы как фаза роста культур, концентрация субстратов, рН, средняя интенсивность света при культивировании могут влиять на синтез гидрогеназ. Таким образом, для изучения факторов, влияющих на синтез гидрогеназ пурпурными бактериями, необходимо было использование управляемого культивирования фототрофных микроорганизмов.
Известно было, что синтез нитрогеназы всеми изученными азотфиксаторами репрессируется аммонием. Азотфиксация является очень энергоемким процессом не только вслествие больших затрат энергии на фиксацию молекулы N2, но и из-за того, что содержание компонентов нитрогеназы в клетках пурпурных бактерий может достигать 40% от всего • клеточного белка (Vignais et al., 1985). Однако мало что было известно о том, в каких условиях происходит полЁая дерепрессия синтеза нитрогеназы пурпурными бактериями. Данные о Влиянии факторов внешней среды, и прежде всего источника азота, на синтез и нитрогеназную активность клеток были противоречивы, что также обусловлено использованием периодических неконтролируемых культур. Исследования такого плана f требуют тщательного контроля условий выращивания культур.
К началу наших исследований ©читалось твердо установленным, что нитрогеназа содержит в активном центре молибден (Лихтенштейн, 1979). Однако в начале 80х годов появились сообщения о возможности синтеза : хемотрофными бактериями нитрогеназ в отсутствие молибдена в присутствии ванадия и даже без указанных металлов (Bishop et al., 1980). Данные о возможности синтеза альтернативных нитрогеназ пурпурными
бактериями, особенностях их синтеза и каталитических свойств отсутствовали.
Наряду с фундаментальной значимостью изучение фототрофных бактерий имеет и большое прикладное значение. Биомасса пурпурных бактерий содержит много белка, витаминов, богата пигментами, которые могут быть использованы не только Ш качестве естественных красителей, но и при разработке фотосенсйбилизаторов, используемых при фотодинамической терапии онкозаболеваний. В определенных условиях эти бактерии способны к синтезу значительных количеств полигидроксибутирата. Однако практическое применение фототрофных бактерий в значительной мере сдерживается недостатком знаний их ростовых характеристик и отсутствием удовлетворительной технической базы для лабораторных исследований»
Пурпурные бактерии способны к светозависимому образованию Н2 за счет действия нитрогеназы. В этой связи усилия многочисленных в последние годы исследователей направлены на изучение процессов фотообразования водорода фЬтотрофными бактериями как потенциальными элементами в системах биоконверсии солнечной энергии. В 1992 в Японии и в США разработаны специальные Программы исследований, направленные на изучение возможности использования фототрофных микроорганизмов для преобразования энергии Солнца в энергию Н2. В Германии в ракках Национального проекта уже разрабатывается полупромышленнай установка получения водорода с использованием фототрофных микроорганизмов. Однако требуется проведение дальнейших исследований как с растущими культурами или суспензиями клеток, так и с иммобилизованными бактериями, находящимися в строго определенных и контролируемых условиях, прежде чем внедрение фототрофных бактерий в промышленность станет
реальностью. Для этого прежде всего необходима разработка методологии управления культурами фототрофных микроорганизмов.
Цель и задачи исследования
Целью исследований явилось изучение метаболизма водорода и азотфиксации у пурпурных бактерий 6 контролируемых условиях.
Задачи, определяемые целью исследований:
1. Разработка и применение методологии управляемого культивирования фототрофных микроорганизмов при изучении метаболизма водорода и азотфиксации.
2. Изучение ростовых характеристик пурпурных бактерий.
3. Выявление основных принципов регуляции синтеза гидрогеназ у пурпурных бактерий.
4. Изучение влияния факторов внешней среды на активность и синтез нитрогеназной системы пурпурных б&ктерий.
5. Оценка скоростей Образования Н2 культурами и иммобилизованными клетками пурпурных бактерий и цианобактерий в лабораторных фотобиореакторах.
Научная новизна рабо
-
Цыганков, Анатолий Анатольевич
-
доктора биологических наук
-
Пущино, 1997
-
ВАК 03.00.07
- Оптимизация роста фототрофных бактерий в проточных условиях в связи с метаболизмом водорода
- Фотогетеротрофные пурпурные бактерии в почвах, загрязненных углеводородами
- Метаболизм водорода у фототрофных микроорганизмов
- Генетические подходы к изучению гидрогеназы HydSL пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina
- Изучение механизмов адаптации пурпурных бактерий в ответ на действие природных оксидантов
