Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оксигенные фототрофные микроорганизмы, ассоциированные с гидроидом Dynamena pumila

ВАК РФ 03.02.10, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Оксигенные фототрофные микроорганизмы, ассоциированные с гидроидом Dynamena pumila"

На правах рукописи

Кравцова Татьяна Робертовна

ОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ГИДРОИДОМ ОШАМЕт РиМІЬА

Специальность 03.02.10. - гидробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

1 2013

005538140

Работа выполнена на кафедрах биоинженерии и гидробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени МВ. Ломоносова»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Ильяш Людмила Васильевна

(Биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова)

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Кокшарова Ольга Алексеевна (Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Симаков Юрий Георгиевич

(Московский государственный университет технологий и управления)

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Куликов Алексей Михайлович (Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН)

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки

Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН)

Защита диссертации состоится «28» ноября 2013 г. в Пчасов 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 00155 при Московском государственном совете имени М.В .Ломоносова, по адресу: 119234 Москва, Ленинские горы, 1, 12, МГУ имени М.В Ломоносова, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» октября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

/7

// //

Карташева Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Эпибиоз - это ассоциация, состоящая из организма-хозяина (базибионта) и живущих на нем организмов (эпибионтов). Эпибиоз широко распространен в водных экосистемах, при этом в качестве базибионта выступают водная растительность, простейшие и многоклеточные животные, в том числе гидроидные полипы (Di Camillo et al., 2005, 2008; Romagnoli et al., 2007; Martínez-García et al., 2011; Burke et al., 2011). Обязательным компонентом всех эпибионтных сообществ, обитающих в фотической зоне, являются оксигенные фототрофные микроорганизмы (ОФМ): цианобактерии и одноклеточные водоросли. Исследования эпибионтных ОФМ актуальны с точки зрения оценки видового разнообразия, биотических взаимоотношений между компонентами и продуктивности водных экосистем.

Проведенные ранее исследования эпибионтных ОФМ, ассоциированных с гидроидным полипом Dynamena pumita, обитающим в Белом море, выявили присутствие разнообразных цианобактерии и эукариотных водорослей, которые, за исключением диатомовых водорослей, не были идентифицированы (Лобакова и др., 2008; Gorelova et al., 2013). Идентификация многих ОФМ представляет значительную трудность, и для уточнения их систематического положения с успехом используются молекулярно-генетические методы (Ernst et al., 2003; Taylor et al., 2007; Perkerson et al., 2011 и др.). Именно на основе их применения выявлено, что значительная часть видов ОФМ в природных водных экосистемах еще не идентифицирована, отсутствуют сведения об их ареалах и функциональной роли в экосистемах (Follows et al.. 2007).

В предыдущих исследованиях показано, что среди ОФМ, ассоциированных с D. pumita, по численности преобладают цианобактерии и диатомовые водоросли (Горелова и др., 2009; Gorelova et al., 2013), тогда как оценки их биомассы, а также сведения о динамике биомассы в течение летнего периода до настоящего времени отсутствовали.

Цель работы - оценка численности и биомассы оксигенных фототрофных микроорганизмов, ассоциированных с гидроидным полипом Dynamena pumita и

определение таксономического положения ОФМ, выделенных из ассоциации с гидроидом.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

- Оценить численность и биомассу диатомовых водорослей и цианобактерий -основных компонентов эпибионтного сообщества беломорского гидроида Вупате па ритИа в июне и августе.

- Получить изоляты ОФМ, из ассоциаций с гидроидом О. рит'йа.

- Охарактеризовать морфологию, ультраструктуру и состав пигментов ОФМ, изолированных из ассоциаций с гидроидом П. ритИа микроорганизмов.

- Провести молекулярно-генетическое типирование и филогенетический анализ ОФМ, изолированных из ассоциации с гидроидом О. ритИа.

Научная новизна. Выявлена выраженная сезонная и пространственная изменчивость биомассы эпибионтных диатомей и цианобактерий на молодых междоузлиях беломорского гидроида Вупатепа ритИа. Показано достоверное различие в трендах величины биомассы диатомовых водорослей и цианобактерий в летний период. Впервые в ассоциации ОФМ с гидроидом О. ритИа идентифицированы цианобактерии 5упесИососсия Бр., Leptolyngbya эр., ИоМос Бр. Установлено, что ближайшие родственники этих ОФМ обитают как в морских, так и пресных водоемах разных широт. Цианобактерии 1.ер1о1ущЪуа ер. 2Пр86Е и Дг£Шос эр. 1(Шр66Е являются новыми видами для биоты Белого моря. В ассоциации с Мю/ос Бр. впервые выявлена гетеротрофная бактерия рода Сеттайтопаз. Практическая значимость работы. Полученные данные расширяют представления о видовом разнообразии и обилии ОФМ, ассоциированных с беспозвоночными животными, обитающими в Белом море. Результаты могут быть использованы при оценке продукционного потенциала Белого моря, а также при решении таких фундаментальных задач гидробиологии и экологии, как выявление механизмов формирования видовой структуры и поддержания видового разнообразия эпибионтных сообществ. ЗупесИососсш ь-р., Ьер1о1уп%Ъуа Бр., Ыо$1ос ер., Веата(1азтш ер. ведутся как лабораторные культуры, которые могут быть использованы в биотехнологических проектах в качестве продуцентов биологически

активных соединений. Результаты могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по гидробиологии.

Апробация работы и публикации. Диссертационная работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании кафедр гидробиологии и биоинженерии, на заседании международного биотехпологического центра МГУ имени М.В.Ломоносова. Результаты работы доложены и обсуждены на международной научной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» (Апатиты, 2009), на международной научно-практической конференции «Водоросли и цианобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах» (Киров, 2010), на 2-ой и 3-ей Московских международных конференциях «Молекулярная филогения» (Москва, 2010, 2012), на 4-ой международной Европейской конференции микробиологов РЕМЭ (Женева, 2011), на Всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010), на 4-ой международной конференции «Актуальные проблемы современной альгологии» (Киев, 2012), на международной конференции «Физиология и биотехнология микроводорослей» (Москва, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 статьи опубликованы в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 26 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературных источников, включающего 361 наименований.

Глава 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Освещены вопросы, касающиеся закономерностей формирования эпибионтных сообществ. Рассмотрены состав эпибионтных ОФМ и их пространственно-временная изменчивость на разных группах организмов-

базибионтах. Дана общая характеристика колониального гидроида Dynamena pumita и состава ассоциированных с ним ОФМ. В Белом море D.pumila распространен в сублиторали, обитает в основном на фукусах, встречается также на камнях, аскофиллумах и ламинариях. Высота колоний редко превышает 7 см. Тело гидроида представляет собой разветвленную двухслойную трубу, часть которой - столоны гидроризы прикреплены к субстрату. Вдоль столон гидроризы примерно через каждые 2,5 мм образуются вертикально поднимающиеся побеги, которые также ветвятся. Ствол побега состоит из междоузлий длиной 2-3 мм, отделенных друг от друга сужением ствола. Гидранты располагаются на стволе побега друг против друга, лишены ножки и приплюснуты к стволу, имеют внешний скелет - гидротеку (Марфенин, 1993). Удлинение колонии происходит моноподиальным способом с терминально расположенными зонами роста. При средней температуре воды 12-18 С новое терминальное междоузлие может развиваться за 24-72 ч (Косевич, Федосов, 2008; Gorelova et al., 2013).

Также обсуждены современные молекулярно-генетические методы и их применение для исследований ОФМ, обитающих в водных экосистемах.

Глава 2.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Образцы колоний гидроида D. pumila отбирали в верхнем горизонте сублиторали Ругозерской губы Кандалакшского залива Белого моря в районе Беломорской биологической станции МГУ имени H.A. Перцова в июне и августе 2006 г. и 2007 г. С апикальной части колоний 3-5 гидроидов срезали первые 4-5 междоузлий. В лаборатории с помощью светового микроскопа Leica DM2500 делачи фотографии поверхности гидроида, включая фронтальную сторону междоузлия, зону слияния ствола и гидротеки. В июне было сделано 30 фотографий, в августе -16. По фотографиям на участках определенной площади, выбранных случайным образом, подсчитывали количество эпибионтных ОФМ. Количество клеток (N) пересчитывали на 1 мм2 поверхности гидроида. Объемы клеток определяли методом геометрического подобия (Hillebrand et al., 1999). Величину биомассы в единицах углерода (В) рассчитывали по аллометрическим уравнениям (Menden-Deuer, Lessard,

2000). Площадь поверхности колонии гидроида рассчитывали по средним линейным размерам междоузлия (Марфенин, 1993) методом геометрического подобия, принимая, что высота побега составляет 20-25 междоузлий с учетом бокового ветвления 30-300% в зависимости от возраста колонии (Марфенин, 1993). Достоверность различий средних значений N и В оценивали по критерию Манна-Уитни с использованием программы PAST (PAleontological STatistics) Version 2.04 (http://folk.uio.no/ohammer/past/).

В работе использованы накопительные культуры ОФМ, выделенные из ассоциаций с D. pumila сотрудниками каф. биоинженерии биологического факультета МГУ. Выделение моновидовых изолятов цианобактерий и эукариотных водорослей из накопительных культур проведено с участием автора. Изоляты культивировали на жидкой и твёрдой (1.5% агара) минеральной среде BG-11 и её безазотном аналоге BG-1 lo (Stanier et al., 1971).

Спектры поглощения клеточных суспензий в видимом и ближнем ИК-диапазоне снимали на спектрофотометре Hitachi 150-20, снабженном интегрирующей сферой. Компенсацию на вклад светорассеяния осуществляли, как описано в работе (Merzlyak, Razi Naqvi, 2000).

Выделение хромосомной ДНК из цианобактерий проводили согласно методике (Koksharova et al., 1998). Амплификацию фрагментов нуклеотидных последовательностей генов 16S pPHK-23S рРНК проводили по методике (Papaefthimiou et al., 2008). В качестве праймеров применяли опубликованные нуклеотидные последовательности (Niibel et all., 1997; Taton et al)., 2003) и праймеры, дизайн которых был осуществлен в настоящей работе. Нуклеотидные последовательности ni/H гена амплифицировали с помощью праймеров (Ben-Porath, Zehr, 1994). Для амплификации фрагментов нуклеотидных последовательностей 18S рРНК в качестве праймеров применяли нуклеотидные последовательности (Katana et al, 2001). Все праймеры синтезировали в компании «Сшггол» (Россия). Амплификацию проводили в амплификаторе ТЕРЦИК (НПФ «ДНК-Технология», Россия).

Ампликоны клонировали в векторе pJET 1.2/blunt с помощью набора для клонирования ПЦР фрагментов CloneJetTM PCR Cloning Kit # K1231 фирмы Fermentas (EU). Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer в ЦКП «Геном».

Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программ BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) и BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer) с использованием нуклеотидных баз данных секвенированных геномов микроорганизмов. Нуклеотидные последовательности изучаемых ОФМ сравнивали с последовательностями, представленными в генном банке (GenBank) с помощью программы BLAST с отбором их по степени сходства, обеспечивающей достаточное разнообразие видов. Последовательности отобранных видов выравнивали посредством программы MEGA 5.1 (http://www.megasoftware.net/) с использованием алгоритма ClustalW v.l.6. Для филогенетических построений использовали метод кластеризации - метод ближайшего соседа (Neighbor-Joining) с предварительным выбором оптимальной эволюционной модели нуклеотидных замен (MEGA 5.1). Статистическую надежность топологий получаемых деревьев оценивали с помощью бутстреп-анализа в 1000 повторностях (MEGA 5.1).

Глава 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Пространственно-временная динамика ОФМ, ассоциированных с колониальным гидроидом Dynamena pumila. В летний период на первых пяти междоузлиях беломорских гидроидов D. pumila присутствуют одноклеточные и трихомные цианобактерии, диатомовые и зеленые водоросли.

Диатомовые водоросли. В июне встречались только «прикрепленные» формы Cocconeis scutellum, С. costata и Licmophora sp. В августе видовое богатство диатомей увеличилось до 20 таксонов. В июне средние значения численности (N) и биомассы (В) диатомей составили 2,09±1,85 тыс, кл./мм2 и 0,130 ±0,115 мкг С/мм2),

соответственно. В августе значения N и В были достоверно (р<0,02) ниже, чем в июне, средние значения составили 1,45 ±2,74 тыс. кл./мм2 и 0,091 ±0.170 мкг С/мм2. По биомассе в июне и в августе доминировал С. sculellum.

Цианобактерии. Как в июне, так и в августе, отмечены трихомные формы, по морфологическим признакам принадлежащие к III и IV субсекциям, и одноклеточные формы. В июне N цианобактерии менялась от 0,53 до 292,50 тыс. кл./мм2 в зависимости от локализации на побегах гидроида. Наибольшая N отмечалась в местах слияния гидротеки со стволом гидроида. В июне средние значения N и В составили 27,02±60,86 тыс. кл./мм2 и 0,54±1,23 мкг С/мм2, соответственно. В августе N и В были высоко достоверно (р< 0,01) больше, чем в июне, средние значения составили 100,73±124,00 тыс. клЛш2и 2,03±2,44 мкг С/мм2, соответственно.

В июне величины биомассы диатомей и цианобактерий достоверно не различались (р=0,72), тогда как в августе биомасса цианобактерий была высоко достоверно (р< 0,01) больше биомассы диатомей.

Сравнительный анализ полученных результатов с опубликованными данными показал следующее. Состав эпибионтных диатомей в целом согласуется с ранее опубликованными данными (Лобакова и др., 2008; Горелова и др., 2009). Такие диатомеи, как Cocconeis costata, Ceratoneis closterium, Nit-cshia cf. sigma, Navícula spp., Fragilaria sp. на D. pumi/a отмечены впервые. Некоторые диатомеи, выявленные на гидроиде ранее, в исследованных нами образцах отсутствовали. Вариабельность состава может быть обусловлена как сезонной динамикой, так и зависимостью от локальных гидрологических условий, в которых обитают колонии гидроида. Доминирование среди диатомей водоросли Cocconeis scutellum, которая является «приросшей» формой, свидетельствует о начальном этапе развития эпибионтного сообщества. Это согласуется с возрастом исследованных междоузлий - максимум 2 недели. В зрелых эпибионтных сообществах преобладают диатомеи, прикрепляющиеся к субстрату слизистым тяжом. Видовое богатство эпибионтных диатомей на молодых междоузлиях D. pumita меньше такового в зрелых эпибионтных сообществах на беломорских макрофитах (Бондарчук, 1970; Георгиев,

2010) и на средиземноморском гидроиде Eudendriiim racemosum (Romagnoli et al., 2007), тогда как величины численности и биомассы диатомей оказались сопоставимыми. Численность и биомасса эпибионтных цианобактерий на гидроиде D. pumita были больше, чем аналогичные оценки для Е. racemosum (Romagnoli et al., 2007). Сезонная динамика обилия эпибионтных диатомей и цианобактерий на D. pumita сходна с таковой на Е. racemosum. Выявленная пространственная изменчивость обилия эпибионтных диатомей и цианобактерий может быть обусловлена разным возрастом междоузлий, наличием благоприятных для колонизации зон на теле гидробионта, а также микромасштабной неоднородностью гидрологических условий.

3.2. Идентификация оксигсиных фототрофных микроорганизмов, ассоциированных с колониальным гидроидом Dynamena pumita. Из ассоциаций с D. pumita было выделено четыре изолята ОФМ, которые идентифицированы по совокупности морфологических, ультраструктурных характеристик, составу пигментов и филогенетическому анализу (табл. 1).

3.2.1. Цианобактерия Syttechococcus sp. lDp66E-l. Морфология, ультраструктура и пигментный состав. Одноклеточная цианобактерия, клетки не имеют слизистых чехлов. Деление происходит перетяжкой поперечно в одной плоскости. Бинарное деление приводит к образованию двух дочерних клеток как одинаковой, так и разной длины. Форма клеток — палочки, длина 1,5-2,0 мкм, диаметр 0,6-0,8 мкм. Рельеф поверхности клеток складчатый. В протопласте находятся по 2-3 периферически расположенных тилакоида, в центре нуклеотид, карбоксисомы. Резервные полимеры представлены гранулами поли-Р-гидроксибутирата, цианофициновые гранулы отсутствуют (Koksharova et al., 2013). Молекулярно-генетическое типирование и филогенетический анализ. Определен фрагмент ДНК размером 2277 пар нуклеотидов (п.н.), содержащий большую часть гена 16S рРНК, внутренний транскрибируемый спейсер 16S-23S рРНК и часть гена 23 S рРНК. Сравнение полученной нуклеотидной последовательности с общей коллекцией последовательностей ДНК в GenBank показало, что Synechococcus sp. lDp66E-l не имеет полного сходства ни с одним ранее исследованным организмом.

Полная нуклеотидная последовательность была депонирована в генный банк (СепВапк) как ^упескососсиа йр. Шр66Е-1 (НМ064496.1) (Кокшарова и др., 2010; Кгаугоуа й а1., 2012; КокБЬагоуа й а1., 2013).

Таблица 1. Таксономическое положение типированных изолятов.

Изолнт Номенклатура бактерий (Са51епЬо1г, 2001) Ботаническая номенклатура (ivww.algatbase.org) ОФМ

Шр66Е-1 Субсекция I (СЬгоососсакз) Фила СуапоЬааепа Класс СуапорЬусеае Порядок ЭупесЬососсакз Семейство БупесЬососсасеае Род 5'упесИососсия Хупескососсив ер. Шр66Е-1

20р8бЕ Субсекция III (ОзаИаишакэ) Фила СуапоЬа^епа Класс СуапорЬусеае Порядок РяеЫапаЬаепакх Семейство РзеЫапаЬаепасеае Род Lepto!yngbya /.е/ио'.уп^Ьуа 5р. 20р86Е

1(Юр66Е Субсекция IV (Ко81оса1ез) Фила СуапоЬас1епа Класс СуапорЬусеае Порядок Ыозйсакз Семейство М^осасеае Род N01(00 МозЮс кр. ЮОрббЕ

30р86Е-1 - Тип СЫогорЬу1а Класс СЫогорЬусеае Порядок 8рЬаегор1еа1ез Семейство ЗсспЫезтасеае Род Ое8тос1езтиз Ве$тос1ехтих Бр. ЗЭр86Е-1

Филогенетический анализ показал, что ¿¡уиесЛососсих яр. Шр66Е-1 образует кладу, сформированную штаммами БупесИососсиз врр. и СуапоЫит Брр. Клада поддерживается референтным штаммом ЗупесИососсиз ер. РСС 7009 и объединяет несколько кластеров. Ближайшие родственники беломорского БупесИососсих эр. Юрб6Е-1 - планктонные формы, обитающие в разных географических зонах, в пресных и солоноватоводных экосистемах (табл. 2).

Таблица 2. Результаты анализа BLAST, полученные с помощью сравнения нуклеотидных последовательностей генного кластера 16S-23S рРНК Synechococcus sp. lDp66E-l с гомологичными последовательностями из GenBank.

Ближайший родственник из Генного Канка Номер клона 1 пли штамма в Генном банке Scorc, Идентичность, % Происхождение штамма или клопа, литературный источник

Svnechococcus sp. BGS 171 AF330246.1 3422 93 Озеро Балатон (46"50N; 17и44Е), (Ernst et al., 2003).

Synechococcus sp. B08806 AF317072.1 3388 94 Боденское озеро (47°39N; 9°19Е), (Ernst et al., 2003).

Synechococcus sp. B0983115 AF317078.1 3377 94

Synechococcus sp. B0981502 AF317077.1 3341 94

Cyanobium sp. Sai004 GU935365.1 3296 94 Водохранилище, Саксония, Европа, (не опубл.).

Synechococcus sp. PCC 7009 АМ709628.1 3431 94 Озеро, Калифорния, США. Референтный штамм, (не опубл.).

Cyanobium sp. Sui?etsu-CR3 АВ610888.1 3465 95 Меромиктическое озеро Суйгецу (35" 35V; 135° 52'Е), отделившееся от Японского моря, (Ohki et al., 2009).

Cyanobium sp. Suigetsu-CR4 АВ610887.1 3465 95

Cyanobium sp. Suigetsu-CGl АВ610890.1 3465 95

Cyanobium sp. Suigetsu-CG3 АВ610892.1 3469 95

Synechococcus sp. BS20 AF330254.1 3321 94 Балтийское море, (Emst et al., 2003).

3.2.2. Цианобактерия ЬерЫущЪуа ер. 2Бр86Е. Морфология, ультраструктура и пигментный состав. Однорядные неветвящиеся трихомы сильно изогнуты или переплетены между собой, окружены слоистыми чехлами. Клетки цилиндрические или бочковидные, длина 1,5-2,5 мкм, диаметр 1,0-1,5 мкм, делятся бинарно в одной плоскости. Дифференцированные клетки отсутствуют. В центре клетки расположен компактный нуклеоид, рибосомы и карбоксисомы, по периферии вдоль продольной клеточной стенки располагаются тилакоиды (КокэЬагоуа еі аі., 2013). Молекулярно-генетическое титрование и филогенетический анализ. Определена нуклеотидная последовательность рибосомального кластера (1732 п.н.), содержащего большую часть гена 168 рРНК, внутренний транскрибируемый спейсер 168-238 рРНК и часть гена 238 рРНК. Последовательность ІеріоІущЬуа зр.

2Dp86E депонирована в GenBank как Oscillatoriales cyanobacterium 2Dp86E (GU265558.1). Эта цианобактерия не имеет полного сходства ни с одним ранее исследованным организмом (Кокшарова и др., 2009; Лобакова и др., 2010; Горелова и др., 20126; Кравцова и др., 2012; Koksharova et al., 2010, 2013; Kravzova et al., 2012).

Филогенетический анализ выявил общую кладу для последовательностей Leptolyngbya sp. 2Dp86E и цианобактерий родов Leptolyngbya, Nodosolinea, Phormidium, а также других представителей порядков Pseudanabaenales и Oscillatoriales. Ближайшие родственники Leptolyngbya sp. 2Dp86E обитают как в наземных, так и водных экосистемах, они отмечены в планктоне и бентосе пресных и морских водоемов (табл. 3).

3.2.3. Цианобактерия Nostoc sp.lODp66E. Морфология, ультраструктура и пигментный состав. Трихомы этой цианобактерии окружены мощными слизистыми чехлами, клетки округлой формы 2,5-3,5 мкм в диаметре. Между вегетативными клетками располагаются гетероцисты и акинеты. Трихомы объединены колониальной слизью. Тилакоиды располагаются неупорядоченно, присутствуют цианофициновые гранулы (Горелова и др., 20126; Koksharova et al., 2013).

Молекулярное генетическое титрование и филогенетический анализ. Определен фрагмент ДНК размером 1902 п.н., содержащий большую часть гена 16S рРНК, внутренний транскрибируемый спейсер 16S-23S рРНК и часть гена 23S рРНК. Последовательность Nostoc sp.l0Dp66E депонирована в GenBank (JQ259187.1). Она не имеет полного сходства ни с одним ранее исследованным организмом (Горелова и др., 20126; Кравцова и др., 2012; Kravzova et al., 2012; Koksharova et al., 2013). Филогенетический анализ выявил, что Nostoc sp. 10Dp66E образует отдельную ветвь и проявляет наибольшее сходство с Nostoc commune NCI, Nostoc commune NC5, Calothrix spp. (табл. 4). Сравнение морфологических признаков Nostoc sp. 10Dp66E с диагнозами Nostoc commune (Komärek, Anagnotidis, 1989) и по результатам сравнения вставок и потерь парных и одиночных нуклеотидов, Nostoc sp. 10Dp66E и Nostoc commune NCI (EU586149.1) являются разными видами (идентичность 94%). Ближайшие родственники Nostoc sp. 10Dp66E обитают в наземных экосистемах.

Таблица 3. Результаты анализа BLAST, полученные с помощью сравнения нуклеотидных последовательностей генного кластера 16S-23S рРНК Leptolyngbya sp. 2Dp86E с гомологичными последовательностями из GenBank.

Ближайший родственник И] Генного Банка Номер клона или штамма в Генном банке Score, -Ідентичності,, % Происхождение штамма пли клона, литературный источник

Leptolyngbya РСС7104 АВ039012.1 2035 99 Моитаукский национальный парк, Нью-Йорк, США, (Ыш1а е1. а1„ 2001).

Leptolyngbya sp. LEGE 07298 НМ217044.1 2013 99 Донные отложения устьев рек Португалии, (ЬореБ с1. а1., 2012).

Leptolyngbya sp. 0BB24S04 AJ639893.1 2082 99 Озера Бубано, Басин, Имола, север Италии, (CastigIioni е! а1„ 2004).

Leptolyngbya sp. 0BB32S02 AJ639894.1 2033 99

Leptolyngbya sp. 0BB19S12 AJ639895.1 2046 99

Phormidium sp. SAG 61.90 EU624415.1 2013 98 Морской штамм, коллекция культур Ю. Карстен (Университет Росток, Германия), (Siegesmund е1 а1„ 2008).

Pseudanabaenaceae cyanobacterium DPG1-KK5 EF654067.1 2771 96 Коллекция культур Ю. Карстен (Университет Росток, Германия), (Siegesmund е1.а1. 2008).

Oscillatoria neglecta IAM M-82 АВ003168.1 1956 98 ДО. кЫс1а е1 а!., 1997.

Nodosolinea nodulosa UTEX 2910 EF122600.1 1954 99 Планктон, Южно-Китайское море, (Регкегеоп е1 а1., 2011).

Leptolyngbya N. bijugata str. Kovacikl986/5aa EU528669.2 2475 92 Прибрежная зона озера Розплуце, Польша, (СазатаИа, Мшиеп, не опубл.).

Leptolyngbya sp. SEV4-5-C1 EU528667.2 2152 97 Почвы пустыни, (Сазатайа, ^оЬапгеп, не опубл.).

Nodosolinea sp. FI2-2HA2 НМ018678.1 2596 95 Почвы пустыни Форт Ирвин Мойове, Калифорния, США, (Регкегеоп е! а!., 2011).

Примечание: д о. - данные отсутствуют

В ассоциации с Ми/ос яр. 1(Шр66Е в результате молекулярно-генетического типирования выявлена некультивируемая гетеротрофная бактерия ОеттаИтопах (1X437625) (925 п.н.). Эта бактерия является представителем новой бактериальной XXIV филы «Сеттаїітопасіеіез». Идентифицированная бактерия имеет наибольшее сходство с Оеттайтопаз аигапИаса Т-27т (ТакаБакі еі аі., 2012).

Таблица 4. Результаты анализа BLAST, полученные с помощью сравнения нуклеотидных последовательностей генного кластера 16S-23S рРНК последовательности Nostoc sp. 10Dp66E с гомологичными последовательностями из GenBank.

Ближайший родственник из Генного банка Номер клона или штамма в Генном банке Score, Идентичность, % Происхождение штамма или клона, литературный источник

Nostoc commune NCI EU586726.1 2693 94 до. ^оЬагаеп сЧ а!., не опубл.).

Nostoc commune NC5 clone 11 EU586728.1 2666 94 Д.О. (.ГоЬашеп е! а1., не опубл.).

Nostoc commune NCI EU784149.1 2681 94 Луговые почвы, вблизи Врбенских прудов, Ческе-Будеевице, Чехия, (ЁеЬакоуае! а1., 2007, не опубл).

Calothrix sp. HA4356-MV2 JN385289.1 2634 92 Стены пещеры Гавайи, (Vассаппо, .Мюлвеп, 2011).

Calothrix sp. HA4356-MV2 JN385288.1 2232 96 Стены пещеры, Гавайи, (Уассалпо, ЬЬапзеп, 2011).

Примечание: д.о. - данные отсутствуют

3.2.4. Зелёная водоросль Оеьтоиехтиь ер. ЗБр86Е-1. Морфология, ультраструктура и пигментный состав. Одноклеточная водоросль, клетки округлой формы 4,5-9 мкм в диаметре, без жгутиков. Размножение осуществляется автоспорами (по 8 и более в одном спорангии). Клеточная стенка состоит из спорополленинового и полисахаридного слоев. На внешнем слое клеточной стенки располагаются структуры в виде трубочек и бородавок. Хлоропласт имеет лопастную форму, окружен оболочкой из двух мембран, содержит пиреноид. Запасные продукты представлены липидными глобулами, крахмальными зёрнами и гранулами, подобными полифосфатным или фенольным (Горелова и др., 2012а; Лобакова и др., 2012). Состав пигментов соответствует таковому представителей СЫогорЬу1а.

Молекулярно-генетическое титрование изолята проведено сотрудниками кафедры биоинженерии. Филогенетический анализ проведен автором. Получен фрагмент ядерной ДНК (всего 500 п.н.), содержащий внутренний транскрибируемый межгенный спейсер 1Т81-5,8-1Т82. Последовательность Пезтос1езтш- ер. ЗОр86Е-1

депонирована в СепВапк (7(^313132.1) и не имеет полного сходства ни с одним ранее исследованным организмом.

При анализе последовательности Desmodesmus ер. ЗОр86Е-1 выявлено, что водоросль кластеризуется со значениями бутстрэп-поддержки не ниже 50% с представителями рода Безтос1езтш (табл. 5). В кластере объединились Оезтоскзтий эрр., различающие по биотопическим характеристикам (планктонные и эпибионтные формы) и по отношению к солености (обитают как в пресных, так и морских водах).

Таблица 5. Результаты анализа BLAST, полученные с помощью сравнения нуклеотидных последовательностей, содержащих внутренние транскрибируемые спейсеры ITS-l-5,8-ITS-2 ядерной ДНК микроводоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-l, с гомологичными последовательностями из GenBank.

Ближайший родственник из Генного Банка Номер клона штамма в Генном банке Score, Идентичность, % Происхождение штамма или клопа, литературным источник

Desmodesmus sp. FG JX046421.1 897 99 Планктон морских прибрежных вод, юго-восток побережья Аргентины, (Do Nascimento et al., 2012).

Desmodesmus sp. Ml-20 JX046420.1 897 99

Desmodesmus sp. 2CL66E JQ313131.1 886 99 Ассоциация с гидроидом Согупе lovenii, Белое море, (не опубл.).

Desmodesmus sp. lPm66B JQ313134.1 886 99 Ассоциация с трохофорной личинкой полихеты Phyllodoce maculate, Белое море, (не опубл.).

Desmodesmus sp 1Нр86Е-2 JQ313133.1 883 99 Ассоциация с губкой Halichondria panacea, Белое море, (не опубл.).

Desmodesmus bicellularis isolate NDem 9/21 T-17d DQ417558.1 655 90 Пруд Итаского Национального парка, Миннесота (не опубл.).

Desmodesmus komarekii isolate Tow 10/11 T-16W DQ417562.1 655 90

Desmodesmus multivariabilis var. turskensis isolate 1 Mary 8/18 T-1W DQ417525.1 767 94 Озеро Мери, Итаский Национальный парк, Миннесота, (не опубл.).

Анализ характера замен нуклеогидов в высоко консервативном фрагменте внутреннего транскрибируемого межгенного спейсера (1Т81) ядерной ДНК даёт основания отнести водоросли ¿'ел/иос/е.уяшл ер. 30р86Е-1, йезтоскзтш ер. 1Рт66В, Ое$тос1е$ти$ эр. 2С166Б и Деияо^езин« зр. 1Нр86Е-2, выделенные из беспозвоночных животных Белого моря, к близкородственным видам одной монофилетической группы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе было оценено обилие эпибионтных диатомей и цианобактерий на первых пяти (молодых) междоузлиях гидроида Т). ритИа. На междоузлиях большего возраста, начиная с шестого, присутствует уже многослойная пленка обрастаний с гораздо более высокой численностью эпибионтных ОФМ (Сюге1оуа е! а1., 2013). Количественные данные по обилию эпибионтных ОФМ на междоузлиях О. ритИа большего возраста отсутствуют. Мы рассчитали биомассу эпибионтных ОФМ на поверхности одной колонии гидроида О. ритИа с учетом средней биомассы ОФМ на молодых побегах и площади поверхности колонии О. ритИа, понимая, что эти оценки являются заниженными. Тем не менее, полученные ориентировочные оценки дают возможность сравнить величины биомассы эпибионтных ОФМ и биомассы бентосных водорослей. Даже заниженные оценки биомассы эпибионтных ОФМ на одной колонии гидроида оказались сопоставимыми с биомассой микрофитобентоса под 1 см2 (Удалов и др., 2004). А если учесть, что на 1 см2 субстрата может в среднем обитать 4 колонии гидроида О. ритПа (Марфенин, 1993), то биомасса эпибионтных ОФМ окажется даже больше таковой микрофитобентоса.

Исходя из биомассы эпибионтных ОФМ и рассчитанной максимальной удельной скорости роста разных размерных классов ОФМ, мы оценили максимальную величину первичной продукции эпибионтных ОФМ. Согласно расчетам, эпибионтные ОФМ на гидроиде Б. ритПа могут вносить существенный вклад в процессы первичного продуцирования в прибрежной зоне.

Из ассоциации с гидроидом D. pamila было выделено четыре изолята ОФМ, которые успешно поддерживаются в лабораторных культурах. Эти ОФМ идентифицированы как цианобактерии Synechococcus sp., Leptofyngbya sp., Nostoc sp. и зеленая водоросль Desmodesmus sp. Генотипы всех четырех ОФМ оказались уникальными. Филогенетический анализ типированных Synechococcus sp., Leptofyngbya sp., Nostoc sp. и Desmodesmus sp. показал, что их ближайшие родственники обитают в разных биотопах как морских, так и пресных водоемов разных широт на нескольких материках. Мы полагаем, что сезонная вариабельность абиотических условий в Белом море, в частности, широкие диапазоны варьирования температуры, освещенности, солености, концентрации биогенных элементов способствует отбору генотипов, которые обеспечивают адаптацию к широкому набору условий. По-видимому, этим обусловлено близкое родство беломорских Synechococcus sp., Leptofyngbya sp., Nostoc sp. и Desmodesmus sp. с пресноводными формами.

Вследствие способности адаптироваться к широкому диапазону условий, многие арктические ОФМ могут быть выведены в культуры. Помимо культур, типированных как Synechococcus sp., Leptofyngbya sp., Nostoc sp. и Desmodesmus sp., из ассоциаций с другими беломорскими беспозвоночными животными было выделено несколько десятков культур цианобактерии и 19 культур эукариотных одноклеточных водорослей, не имеющих жестких панцирей (Лобакова и др., 2012; Горелова и др., 2012а), которые успешно ведутся в музее культур кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Полученные культуры беломорских Synechococcus sp., Leptofyngbya sp., Nostoc sp. и Desmodesmus sp. в перспективе могут быть использованы в практических целях для получения биотехнологически ценных соединений.

Для Белого моря показано наличие пикоцианобактерий в планктоне, оценены их численность и биомасса, однако идентификация до вида не проводилась (Ильяш, 1998; Белевич, Ильяш, 2012). Согласно литературным данным, в полярных водах планктонные пикоцианобактерии представлены почти исключительно родом Synechococcus (Vincent, 2000). Это дало основание предполагать, что виды рода

Synechococcus присутствуют и в планктоне Белого моря (Белевич, Ильяш, 2012). Результаты наших исследований доказывают присутствие Synechococcus sp. в биоте Белого моря. Учитывая связь между планктонным и эпибионтными сообществами (Wahl, 1989, 2009), можно ожидать присутствие Synechococcus sp. Шр66Е-1 и в планктоне Белого моря.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что в Белом море в ассоциациях с гидроидами Dynamena pumifa, Coryne lovenii, губкой Halichondria panicea и трохофорными личинками полихеты Phyllodoce maculate обитают близкородственные виды Desmodesmits, представители одной монофилетической группы. Это может свидетельствовать о специфичности представителей рода Desmodesmus в выборе базибионта.

В биоте Белого моря ранее было идентифицировано несколько видов цианобактерий рода Leptolyngbya и Nostoc (Белякова, 1996; Уланова, 2003; Давыдов, 2006). Сравнение нуклеотидных последовательностей, депонированных в Генном банке, и морфологических признаков с диагнозами ранее идентифицированных видов этих родов, показало, что Leptolyngbya sp. 2Dp86E и Nostoc sp. 10Dp66E являются новыми видами для биоты Белого моря. Идентификация новых видов расширяет современные представления о биоразнообразии оксигенных фототрофных организмов Белого моря и Арктики в целом.

ВЫВОДЫ

1. Впервые количественно оценена биомасса диатомовых водорослей и цианобактерий в эпибионтном сообществе на молодых междоузлиях беломорского гидроида Dynamena pumila в летний период. Биомасса эпибионтных диатомей и цианобактерий на отдельных участках междоузлий варьирует в значительной степени.

2. Обилию эпибионтных диатомовых водорослей и цианобактерий присуща выраженная сезонная изменчивость. Биомасса диатомей снижалась от июня к августу, тогда как биомасса цианобактерий возрастала. В июне величины биомассы

диатомовых водорослей и дианобактерий достоверно не различались, тогда как в августе биомасса дианобактерий была больше биомассы диатомей.

3. Впервые в ассоциации с гидроидом Dynamena pumila идентифицированы цианобактерии Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostac sp. и гетеротрофная бактерия Gemmatimonas sp. (ассоциирована с Nostoc sp.). Подтверждено присутствие в ассоциации зеленой водоросли Desmodesmus sp.

4. Филогенетический анализ типированных Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp. и Desmodesmus sp. показал, что их ближайшие родственники обитают в разных биотопах как морских, так и пресных водоемов разных широт на нескольких материках.

5. Зеленая водоросль Desmodesmus sp., ассоциированная с гидроидом Dynamena pumila, формирует одну монофилетическую группу с представителями рода Desmodesmus, ассоциированными с другими беспозвоночными животными Белого моря.

6. Цианобактерии Leptolyngbya sp. 2Dp86E и Nostoc sp. 10Dp66E являются новыми видами для биоты Белого моря.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Горелова O.A., Баулина О.И., Соловченко А.Е., Федоренко Т.А., Кравцова Т.Р. Чивкунова О.Б., Кокшарова O.A., Лобакова Е.С. Зелёные микроводоросли, изолированные из ассоциации с беспозвоночными Белого моря // Микробиология. 2012а. Т. 81. № 4. С.505-507.

2. Кравцова Т.Р„ Лазебная И.В., Лазебный O.E., Волкова Е.Ю., Федоренко Т.А., Горелова O.A., Баулина О.И., Лобакова Е.С., Васетенков А.Е., Кокшарова O.A. Молекулярная филогения зелёной микроводоросли, изолированной из Halichondria panicea (P., 1766) Белого моря // Физиология растений. 2013. Т. 60. № 4. С. 569-573.

3. Koksharova O.A., Kravzova T.R., Lazebnaya I.V., Gorelova O.A., Baulina O.I., Lazebny O.E., Fedorenko T.A., Lobakova E.S. Molecular identification, ultrastructural and phylogenetic study of cyanobacteria from association with the White sea hydroid Dynamena Pumila (L., 1758) // BioMed Research International. 2013. V. 2013. (11 pages), http://dx.doi.org/10.1155/2013/760681

Материалы конференций и тезисы:

1. Лобакова Е.С., Кокшарова O.A., Федоренко Т.А., Баулина О.И., Кравцова Т.Р.. Омарова Е.О., Горелова O.A. Азотфиксирующие цианобактерии в симбиозе с беломорским гидроидным полипом Dynamena pumila (L.,1758) // Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера. Тезисы докладов Международной научной конференции. 7-11 июня 2009 года, г. Апатиты, Россия. Апатиты: ООО «КаэМ», 2009. С. 193-195.

2. Кокшарова O.A., Федоренко Т.А., Кравцова Т.Р.. Омарова Е.О., Горелова O.A., Лобакова Е.С. Идентификация цианобактерий, изолированных из гидроидного полипа Dynamena pumila (L.,1758) // Бюллетень МОИП. Отд. биологический. 2009. Т. 114. Вып. 2. Прилож. 1. С. 137-139.

3. Кокшарова O.A., Горелова O.A., Кравцова Т.Р., Федоренко Т.А., Лазебная И.В., Баулина О.И., Лобакова Е.С. Цианобактерии - симбионты гидроидного полипа Dynamena pumila (L.,1758) // Водоросли и цианобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах. Материалы Международной конференции к 100-летию со дня рождения проф. Э. А. Штины. 11-15 октября 2010 года, г. Киров, Россия. Киров: Вятская ГСХА, 2010. С. 167-171.

4. Koksharova O.A., Kravzova T.R.. Fedorenko Т.А., Omarova E.O., Gorelova O.A., Baulina О.1., Lobakova E.S. Associations between the White Sea invertebrates and oxygen-evolving phototrophic microorganisms: a phylogenetic study // Molecular Phylogenetics. Materials 2nd Moscow international conference. May 18-21, 2010, Moscow, Russia. M.: Torus Press, 2010. P. 118.

5. Лобакова E.C., Кравцова T.P.. Федоренко T.A., Косевич И.А., Баулина О.И., Кокшарова O.A., Горелова O.A. Нитчатая цианобактерия - симбионт гидроидных полипов // Автотрофные микроорганизмы. Материалы Всероссийского симпозиума к 80-летию биологического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова, 85-летию со дня рождения акад. E.H. Кондратьевой. 23-26 декабря 2010 года, г. Москва, Россия. М.: Макс Пресс, 2010. С. 65.

6. Лобакова Е.С., Баулина О.И., Соловченко А.Е., Федоренко Т.А., Кравцова Т.Р.. Горелова O.A. Микроводоросли, ассоциированные с беспозвоночными животными Белого моря II Биологически активные вещества микроорганизмов. Прошлое, настоящее, будущее. Материалы Всероссийского симпозиума к 90-летию заслуженного проф. Московского ун-та Н.С. Егорова. 27-29 января 2011года, г. Москва, Россия. М.: Макс Пресс, 2011. С. 77.

7. Gorelova О., Koksharova О., Kravzova Т.. Lazebnaya I., Baulina О., Fedorenko Т., Kosevich I., Lobakova E. Cyanobacteria associated with the White sea hydroid II Proceedings of the 4th Congress of European Microbiologists. FEMS. June 26-30, 2011, Geneva, Switzerland. 2011. P. 2408.

8. Лобакова E.C., Баулина О.И., Федоренко T.A., Кравцова Т.Р., Кокшарова O.A., Горелова O.A. Микроводоросли, ассоциированные с беспозвоночными Белого моря: выделение и ультраструктура // Актуальные проблемы современной альгологии. Тезисы докладов IV Международной конференции. 23-25 мая 2012 года, г. Киев, Украина. Киев: Институт ботаники им. Н.Г. Холодного HAH, 2012. С. 170-171.

9. Горелова О .А, Кравцова Т.Р., Кокшарова О.А., Лазебная И.В., Баулина О.И., Федоренко Т.А., Лобанова Е.С. Морфологическое и молекулярное типирование цианобактерий, ассоциированных с колониальным гидроидом Dynamena pumila // Актуальные проблемы современной альгологии. Тезисы докладов IV Международной конференции. 23-25 мая 2012 года, г. Киев, Украина. Киев: Институт ботаники им. Н.Г. Холодного НАН, 20126. С. 81-82.

10. Кравцова Т.Р. Горелова О.А., Кокшарова О.А., Баулина О.И., Федоренко Т.А., Ильяш Л.В., Лобакова Е.С. Фототрофные микроорганизмы, изолированные из беломорских ассоциаций с колониальным гидроидом Dynamena pumila (L., 1758) // Физиология и биотехнология микроводорослей. Тезисы докладов Международной, конференции к 80-летию со дня рождения В.Е. Семененко. 16-19 октября 2012 года, г. Москва, Россия. М.: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 2012. С. 81.

11. Kravzova T.R.. Lazebnaya I.V., Fedorenko Т.А., Gorelova O.A., Lobakova E.S., Koksharova O.A. Phylogenetic study of new cyanobacteria associated with the White Sea invertebrates // Molecular Phylogenetics. Materials 3td Moscow international conference. July 31 - August 4, 2012, Moscow, Russia. M.: Torus Press, 2012. P. 143.

Автор приносит глубокую и искреннюю благодарность научным руководителям проф. Л.В. Ильяш и д.б.н. O.A. Кокшаровой за постоянную помощь в работе и поддержку. Автор выражает особую благодарность проф. Е.С. Лобаковой, д.б.н. O.A. Гореловой и д.б.н. О.И. Баулиной за совместную экспериментальную работу, неоценимую помощь при проведении лабораторных исследований и обсуждение полученных результатов. Автор благодарен своим друзьям и коллегам к.б.н. Т.А. Федоренко, к.б.н. О.Б. Чивкуновой, к.б.н. И.В. Лазебной, A.A. Поповой и всем сотрудникам кафедры биоинженерии за помощь в работе, внимание и теплую дружескую атмосферу, сложившуюся в коллективе. Автор признателен проф. H.H. Марфенину за высококвалифицированные консультации.

Подписано в печать:

23.10.2013

Заказ № 8951 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кравцова, Татьяна Робертовна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Ломоносова БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

04201363801

КРАВЦОВА Татьяна Робертовна

ОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ГИДРОИДОМ DYNAMENA PUMILA

03. 02. 10 - гидробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук

профессор Л.В. Ильяш доктор биологических наук O.A. Кокшарова

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. ОФМ как компонент эпибионтных сообществ 9

1.1.1. Эпибионтные ОФМ в ассоциациях с одноклеточными водорослями 13

1.1.2. Эпибионтные ОФМ в ассоциациях с макрофитами 15

1.1.3. Эпибионтные ОФМ в ассоциациях с беспозвоночными животными 17

1.1.4. Эпибионтные ОФМ в ассоциациях с гидроидными полипами 20

1.2. Характеристика колониального гидроида Dynamena pumila и 22 эпибионтных ОФМ, ассоциированных с ним

1.2.1. Состав эпибионтного сообщества, ассоциированногос гидроидом 26 D. pumila

1.3. Применение молекулярно-генетических методов в гидробиологии 29

1.4. Методы молекулярного типирования микроорганизмов 33

1.4.1. Определение Г-Ц состава молекул 34

1.4.2. ДНК - ДНК и ДНК — РНК гибридизации 34

1.4.3. Диагностика микроорганизмов, основанная на ПЦР 35 со специфическими праймерами

1.4.4. Полимеразно-цепная реакция 35

1.4.5. ДНК фингерпринтинг, различные модификации ПЦР, RLFP 36

1.4.6. Филогенетический анализ 40 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Количественный анализ обилия эпибионтных ОФМ 44

2.2. Выделение ОФМ из ассоциаций с гидроидом D. pumila 45 и их исследование

2.2.1. Условия культивирования изолятов 47

2.2.2. Световая микроскопия 47

2.2.3. Трансмиссионная электронная микроскопия 48

2.2.4. Сканирующая электронная микроскопия 48

2.3. Молекулярно-генетические методы

2.3.1. Выделение ДНК 48

2.3.2. Амплификация генов 16S рРНК, межгенного спейсера 51 16S-23S рРНК и части гена 23S рРНК

2.3.3. Амплификация ДНК со специфическими праймерами к гену nifH 55

11

< i

i * < 1 1 >, 11

и -i /

2.3.4. Амплификация генов 18S рРНК 55

2.3.5. Очистка фрагментов ПЦР 56

2.3.6. Приготовление компетентных клеток бактерии Escherichia coli 57

2.3.7. Лигирование ДНК 58

2.3.8. Трансформация клеток Escherichia coli плазмидной ДНК 58

2.3.9. Селекция трансформированных колоний и выделение плазмидной ДНК 59

2.3.10. Подготовка плазмидной ДНК для секвенирования 59

2.3.11. Секвенирование фрагмента плазмидной ДНК 60

2.3.12. Анализ межгенного спейсера ITSl-5,8-ITS2 60

2.3.13. Анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей 61 и филогенетический анализ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Пространственно-временная динамика ОФМ, ассоциированных 62 с колониальным гидроидом Dynamena pumila

3.2. Идентификация ОФМ, ассоциированных с колониальным 76 гидроидом Dynamena pumila

3.2.1. Цианобактерия Synechococcus sp. lDp66E-l 77

3.2.2. Цианобактерия Leptolyngbya sp. 2Dp86E 87

3.2.3. Цианобактерия Nostoc sp. 10Dp66E 98

3.2.4. Молекулярно-филогенетический анализ бактерии Gemmatimonas 106

3.2.5. Зелёная водоросль Desmodesmus sp. 3Dp86E-l 110 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 121 ВЫВОДЫ 124 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 125 ПРИЛОЖЕНИЕ 152

СОКРАЩЕНИЯ

ОФМ — оксигенные фототрофные микроорганизмы

ЭОФМ — эпибионтные оксигенные фототрофные микроорганизмы

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

п.н. - пар нуклеотидов

СМ — световая микроскопия

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

GenBank - База данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)

NCBI - National Center for Biotechnology Information

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Эпибиоз - это ассоциация, состоящая из организма-хозяина (базибионта) и живущих на нем организмов (эпибионтов). Эпибиоз широко распространен в водных экосистемах, при этом в качестве базибионта выступают водная растительность, простейшие и многоклеточные животные, в том числе гидроидные полипы (Di Camillo et al., 2005, 2008; Romagnoli et al., 2007; Martínez-García et al., 2011; Burke et al., 2011). Обязательным компонентом всех эпибионтных сообществ, обитающих в фотической зоне, являются оксигенные фототрофные микроорганизмы (ОФМ): цианобактерии и одноклеточные водоросли. Исследования эпибионтных ОФМ актуальны с точки зрения оценки видового разнообразия, биотических взаимоотношений между компонентами и продуктивности водных экосистем.

Проведенные ранее исследования эпибионтных ОФМ, ассоциированных с гидроидным полипом Dynamena pumila, обитающим в Белом море, выявили присутствие разнообразных цианобактерий и эукариотных водорослей, которые, за исключением диатомовых водорослей, не были идентифицированы (Лобакова и др., 2008; Горелова и др., 2009а; Gorelova et al., 2013а). Идентификация многих ОФМ представляет значительную трудность, и для уточнения их систематического положения с успехом используются молекулярно-генетические методы (Ernst et al., 2003; Taylor et al., 2007; Perkerson et al., 2011 и др.). Именно на основе их применения выявлено, что значительная часть видов ОФМ в природных водных экосистемах еще не идентифицирована, отсутствуют сведения об их ареалах и функциональной роли в экосистемах (Follows et al., 2007).

В предыдущих исследованиях показано, что среди ОФМ, ассоциированных с D. pumila, по численности преобладают цианобактерии и диатомовые водоросли (Горелова и др., 2009а; Gorelova et al., 2013а), тогда как оценки их биомассы, а также сведения о динамике биомассы в течение летнего периода до настоящего времени отсутствовали.

Цель работы - оценка численности и биомассы оксигенных фототрофных микроорганизмов, ассоциированных с гидроидным полипом Иупатепа ритПа и определение таксономического положения ОФМ, выделенных из ассоциации с гидроидом.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

- Оценить численность и биомассу диатомовых водорослей и цианобактерий

- основных компонентов эпибионтного сообщества беломорского гидроида Е>упатепа ритПа в июне и августе.

- Получить изоляты ОФМ, из ассоциаций с гидроидом £>. ритПа.

- Охарактеризовать морфологию, ультраструктуру и состав пигментов ОФМ, изолированных из ассоциаций с гидроидом £>. ритПа микроорганизмов.

- Провести молекулярно-генетическое типирование и филогенетический анализ ОФМ, изолированных из ассоциации с гидроидом И. ритйа. Научная новизна. Выявлена выраженная сезонная и пространственная изменчивость биомассы эпибионтных диатомей и цианобактерий на молодых междоузлиях беломорского гидроида Иупатепа ритйа. Показано достоверное различие в трендах величины биомассы диатомовых водорослей и цианобактерий в летний период. Впервые в ассоциации ОФМ с гидроидом £>. ритПа идентифицированы цианобактерии Бупескососсш эр., ЬерШу^Ъуа эр., Ыоб^с эр. Установлено, что ближайшие родственники этих ОФМ обитают как в морских, так и пресных водоемах разных широт. Цианобактерии Leptolyngbya Бр. 2Бр86Е и Ыоз^с эр. 1(Юр66Е являются новыми видами для биоты Белого моря. В ассоциации с Иоб^с эр. впервые выявлена гетеротрофная бактерия рода СеттаИтопаз.

Практическая значимость работы. Полученные данные расширяют представления о видовом разнообразии и обилии ОФМ, ассоциированных с беспозвоночными животными, обитающими в Белом море. Результаты могут быть использованы при оценке продукционного потенциала Белого моря, а также при решении таких фундаментальных задач гидробиологии и экологии, как выявление механизмов формирования видовой структуры и

поддержания видового разнообразия эпибионтных сообществ. БупесЪососсш эр., Ьер1о1упфуа Бр., Мигос эр., Оезтойезтт Бр. ведутся как лабораторные культуры, которые могут быть использованы в биотехнологических проектах в качестве продуцентов биологически активных соединений. Результаты могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по гидробиологии.

Апробация работы и публикации. Диссертационная работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании кафедр гидробиологии и биоинженерии, на заседании международного биотехнологического центра МГУ имени М.В.Ломоносова. Результаты работы доложены и обсуждены на международной научной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» (Апатиты, 2009), на международной научно-практической конференции «Водоросли и цианобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах» (Киров, 2010), на 2-ой и 3-ей Московских международных конференциях «Молекулярная филогения» (Москва, 2010, 2012), на 4-ой международной Европейской конференции микробиологов БЕМБ (Женева, 2011), на Всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010), на 4-ой международной конференции «Актуальные проблемы современной альгологии» (Киев, 2012), на международной конференции «Физиология и биотехнология микроводорослей» (Москва, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 статьи опубликованы в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Работа выполнена на кафедрах биоинженерии и гидробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Глава 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

К оксигенным фототрофным микроорганизмам (ОФМ) относятся цианобактерии и одноклеточные эукариотные организмы, способные к оксигенному фотосинтезу. Эукариотные ОФМ представлены целым рядом филогенетических групп: Glaucophyta, Chlorophyta, Bacillariophyta, Haptophyta, Rhodophyceae, Chiysophyceae, Dictyochophyceae, Eustigmatales, Pelagophyceae, Phaeothamniophyceae, Raphidophyceae, Xanthophyceae, Phaeophyceae, Cryptophyceae, Synurales, Pinguiochrysidales, Dinozoa, Euglenozoa (Adl et al., 2012).

ОФМ обитают как в наземных, так и в водных экосистемах (Carpenter, 2002; Cuzman et al., 2010; Perkerson et al., 2011). В водных экосистемах они являются основными продуцентами (Stockner, Antia, 1986; Stockner, 1991; Field et al., 1998; Callieri, Stockner, 2002). Некоторые цианобактерии способны к фиксации молекулярного азота (Carpenter, 1972; Carpenter et al., 1999; Moreno et al., 2003; Lesser et al., 2004; Kayanne et al., 2005; Charpy-Roubaud, Larkum, 2005; Abed et al., 2006; Bergman et al., 2007; Charpy et al., 2010). В масштабах биосферы ОФМ играют исключительно важную роль в глобальных циклах углерода, азота и фосфора (Falkowski, Raven, 1997; The ecology of cyanobacteria..., 2000; Arrigo, 2005).

ОФМ обитают во всех климатических зонах и в разнообразных биотопах (Graham, Wilcox, 2000). Так, в наземных экосистемах ОФМ обитают в почве, на почве, на высшей растительности, на поверхности горных пород, камней, и даже на стенах зданий и на памятниках (Mahmoud et al., 1992; Костяев, 1993; Домрачева, 2005; Graham, Wilcox, 2000; Carpenter, Janson, 2000; Cuzman et. al., 2010; Johansen et al., 2007). В водных экосистемах ОФМ являются компонентом планктона, бентоса, криофильных и эпибионтных сообществ (Graham, Wilcox, 2000; Vincent et al., 2004; Stat et al., 2006; Taton et al., 2006; Johnson et al., 2007; Dubovskaya et al., 2005; Ohki et al., 2009; Jasser et al., 2010; Radea et al., 2010; Gorelova et al., 2013a).

8

^ * l i ^ 1 N ¥

1.1. ОФМ как компонент эпибионтных сообществ

Эпибиозом (греч. epi - «на вершине», bios - «жизнь») называется разновидность комменсализма, при которой один организм поселяется на поверхности другого (Дедю, 1990). Организм, на поверхности которого поселяются другие организмы, является базибионтом. Организмы, живущие на поверхности тела базибионта, являются эпибионтами.

Однако при эпибиозе отношения между базибионтом и эпибионтами не ограничиваются только комменсализмом (Wahl, 1989, 2009), поэтому далее под эпибиозом понимается «не симбиотическая ассоциация между эпибионтами и базибионтом» (Wahl, 1989, с. 175). Рассмотрение эпибиоза как ассоциации подразумевает, что если между эпибионтами и базибионтом существуют трофические связи, то они факультативные.

Термины эпибионт и базибионт характеризуют топическую роль организма. Как правило, эта роль не является видоспецифичной. Многие прикрепленные организмы могут быть как базибионтом, так и эпибионтом, а иногда и тем и другим одновременно (Faucci, Воего 2000; Fraschetti et al., 2002; Fraschetti et al., 2008). Например, гидроид Dynamena pumila часто обитает на макрофитах (Марфенин, 1981; Henry, 2002), т.е. является эпибионтом. При этом на поверхности самого гидроида обитают бактерии, ОФМ, красные многоклеточные водоросли (Горелова и др., 2009а; Gorelova et al., 2013а), для которых гидроид является базибионтом. Как правило, на базибионте обитает не один вид организмов, а несколько, при этом они различаются по трофическому статусу (фотоавтотрофы, гетеротрофы, миксотрофы), т.е. на базибионте формируется эпибионтное сообщество.

Формирование эпибионтного сообщества проходит несколько основных стадий, которые практически не зависят от вида базибионта и его географического местоположения (Wahl, 1989). После появления «новой» поверхности на теле базибионта (например, появление нового гидранта у гидроидов, рост поверхности талломов макрофитов и т.д.) на первом этапе происходит абсорбция органических макромолекул из воды на вновь

образовавшейся поверхности (Bos et al., 1999). У этого процесса (на разделе фаз твердое тело - жидкость) чисто физическая природа. Он начинается в течение нескольких секунд после появления «новой» поверхности (субстрата) и достигает динамического равновесия в течение нескольких часов. В итоге на поверхности субстрата образуется пленка из органических макромолекул.

Вторая стадия характеризуется колонизацией субстрата бактериями. Эта стадия представлена обратимой (абсорбцией) и необратимой («прилипание») фазами. Как и абсорбция органических молекул, абсорбция бактериальных клеток имеет неспецифическую физико-химическую природу. Она включает броуновское движение, электростатическое взаимодействие, гравитацию (Van Loosdrecht, 1988; Раилкин, 1998). К такому типу абсорбции способны как живые, так и мертвые клетки микроорганизмов (Piette, Idziak, 1992). Когда бактериальная клетка входит в контакт с поверхностью субстрата, она попадает в тонкий (40-100 мкм) гидродинамически инертный пограничный слой. Далее за счет установления ковалентных связей между гликокаликсом бактериальной клетки и макромолекулами органической пленки бактерии «прилипают» к субстрату. Некоторые авторы считают, что «прилипание» происходит и за счет наличия у микроорганизмов поверхностных структур - жгутиков и пилей, а также специфических «липких молекул» - лектинов и адгезинов, которые локализуются на поверхности микроорганизмов и обеспечивают узнавание поверхности и прикрепление к ней (London, 1991; Николаев, Плакунов, 2007). Аналогичный механизм прикрепления к субстрату описан и для одноклеточных водорослей (Tosteson et al., 1983), спор (Fletcher, Bai er, 1984), личинок полихет (Kirchman, Mitchell, 1984). Как правило, первыми субстрат колонизируют палочковидные бактерии, за ними коккоидные, и только потом — нитчатые. Бактерии начинают активно размножаться, их биомасса растет. Бактерии и секретируемая ими слизь вместе с органической пленкой

образуют так называемую первичную биопленку (Sutherland, 2001; Brand et al., 2005).

Через несколько дней начинается третья стадия колонизации, которая характеризуется появлением в первичной биопленке одноклеточных эукариотных организмов: грибов, диатомовых и других водорослей, простейших. Четвертая стадия колонизации начинается через одну -несколько недель, в зависимости от локальных условий проживания базибионта. На этой стадии в эпибионтом сообществе появляются меропланктонные личинки и споры водорослей (Hadfleld, 1986; Butman, 1987; Wahl, 1989). Эта стадия соответствует зрелой биопленке. Сложность организации биопленки и многообразие взаимоотношений между составляющими её микроорганизмами дало основание ряду авторов рассматривать эти сообщества, как аналоги многоклеточных организмов (Заварзин, 1993, 1995).

Описанная выше последовательность стадий формирования эпибионтных сообществ является универсальной, и отмечается на всех типах субстратов — от неживых (камни, стекло, погруженные в воду железобетонные конструкции, обшивка кораблей, пластик и т.д.) до живых организмов, начиная одноклеточными водорослями, простейшими и заканчивая водными млекопитающими (Harder, 2009; Grossart et al., 2003). Последовательность: «макромолекулы —► бактерии —> плюс эукариотные водоросли (диатомовые и др.) и простейшие —> плюс личинки и споры», в определенной степени обусловлена тем, что ранжирование обилия перечисленных компонентов в воде соответствует последовательности стадий (Harder, 2009). т.е. чем больше тех или иных компонентов в воде, тем выше вероятность их включения в эпибионтное сообщество. С другой стороны, начиная со второй стадии, колонизация происходит тогда, когда субстрат уже обладает определенными свойствами. Например, достижение концентрации аминокислот и Сахаров определенного уровня является сигналом для хемотаксиса гетеротрофных бактерий (Characklis, 1981).

Накопление в первичной биопленке секретируемых бактериями витаминов и других веществ является биохимическим сигналом для колонизации пленки бентосными диатомовыми водорослями (Lynch et al., 1979). Таким образом, в формирование эпибионтных сообществ включена целая цепь сигнальных факторов как химической (Hadfield, Scheuer,1985; Lambert et al., 1997; Krug, Manzi, 1999), так и физической природы (Mullineaux, Butman, 1991; Maida et al., 1994; Berntsson et al., 2000; Qian et al., 2000). Химические сигналы могут поступать и от самого базибионта, при этом выделяемые базибионтом вещества могут привлекать потенциальных эпибионтов (Kato et al., 1975; Yvin et al.,1985; Kossevitch et al., 2001) или наоборот, препятствовать ко