Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм ассимиляции ацетата у пурпурных несерных бактерий, не имеющих глиоксилатного шунта

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Механизм ассимиляции ацетата у пурпурных несерных бактерий, не имеющих глиоксилатного шунта"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В.Ломоносова _Биологический факультет_

на правахрукописи

УДК 579.811.12.017.7

ФИЛАТОВА Людмила Владимировна

МЕХАНИЗМ АССИМИЛЯЦИИ АЦЕТАТА У ПУРПУРНЫХ НЕСЕРНЫХ БАКТЕРИЙ, НЕ ИМЕЮЩИХ ГЛИОКСИЛАТНОГО ШУНТА

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2004 г.

Работа выполнена на кафедре микробиологии Биологического факультета Московского государственного университета им М.В. Ломоносова

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Р.Н. Ивановский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ГЛ. Шапошников

доктор биологических наук, профессор В.К. Плакунов

Ведущая организация

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино-на-Оке

Защита диссертации состоится 07 октября 2004 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001. 21 по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан сентября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пискункова Н.Ф.

Актуальность проблемы. Основным механизмом ассимиляции ацетата является цикл трикарбоновых кислот (ЦТК). Поскольку субстраты цикла трикарбоновых кислот расходуются на биосинтетические нужды, при использовании ацетата в качестве единственного источника углерода у большинства бактерий в систему реакций ЦТК включается глиоксилатный шунт. Он восполняет потери субстратов ЦТК, расходуемых на биосинтетические функции [Cronan and LaPorte, 1996]. Ключевыми ферментами глиоксилатного цикла являются изоцитратлиаза и малатсинтаза.

Однако существует большая группа микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам, которые не имеют изоцитратлиазы, но тем не менее, сохраняющие способность расти на среде с ацетатом в качестве единственного источника углерода (так называемые ИЦЛ~ бактерии). Примерами могут служить пурпурные несерные бактерии Rhodospirillum rubrum, Rhodobactersphaeroides и Phaeospirillumfulvum [Kornberg and Lascelles, 1960, Albers and Goltschalk, 1976], некоторые метилотрофные бактерии с сериновым путем, например Methyfobacterium extorquens AMI [Korotkova et al., 2002, Dunstan et al., 1972], бесцветные серные бактерии Thiobacillus versutus (Claassen and Zehnder, 1986) и стрептомицеты Strep tomyces collinus [Han and Reynolds, 1997].

Высказывалось несколько предположений о механизме конверсии ацетата в глиоксилат у различных ИЦЛ" бактерий, в частности у метилотрофов, но они не нашли своего подтверждения и вопрос о пути ассимиляции ацетата у фототрофных ИЦЛ" бактерий до недавнего времени оставался открытым. Несколько лет назад было выдвинуто предположение и доказано существование у Rsp. rubrum -группа протеобактерий, порядок Rhodospirillales) нового аналлеротического механизма, участвующего в ассимиляции ацетата, получившего название цитрамалатного цикла (рис.1). Для доказательства существования новых метаболитических механизмов, которым является ЦМ-цикл, необходимо показать возможность его использования бактериями, относящимися к далеко отстоящим таксономическим группам. Поэтому, качестве объекта исследования была выбрана несерная пурпурная бактерия Rba. sphaeroides, относящейся к порядку Rhodobacterales а-группы протеобактерий.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было выяснение механизма ассимиляции ацетата у одного из представителей ИЦЛ" бактерий - пурпурной несерной бактерии Rhodobactersphaeroides.

Для достижения данной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать возможность участия иных, нежели цитрамалатный цикл, анаплеротических путей ассимиляции ацетата у Rba. sphaeroides.

2. Исследовать возможность участия ЦМ-цикла в симеляции оцетата у phaeroides.

3. Исследовать особенности функционирования ЦМ-цикла у Rba. sphaeroides. Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование механизма ассимиляции ацетата у Rba. sphaeroides in vivo с использованием ингибиторного анализа радиохимического, полярографического и других методов и in vitro, с использованием этимологических и хроматографических методов. Доказано, что у Rbas sphaeroides при росте в фототрофных условиях на среде с ацетатом анаплеротическую функцию конверсии. ацетата в глиоксилат выполняет описанный ранее для Rsp. rubrum циклический механизм, названный цитрамалатным циклом. В этом цикле, также как и в реакциях глиоксилатного шунта, происходит окисление ацетил-СоА с образованием глиоксилата. Особенностью функционирования данного цикла в процессе роста культуры Rba. sphaeroides является то, что преимущественным источником СОг, используемого для осуществления пропионил карбоксилазной реакции в цитрамалатном цикле, является не экзогенный, как у Rsp. rubrum, а эндогенный СО2, выделяющийся в процессе окисления ацетата. Этим объясняется отсутствие зависимости ассимиляции ацетата от экзогенного бикарбоната у Rba. sphaeroides. Практическое значение работы. Знание углеродного метаболизма фототрофных бактерий необходимо для получения и отбора высокопродуктивных штаммов и оптимизаций условий их культивирования с целью применения как продуцентов биомассы, богатой белком, витаминами, каротиноидами, поли -оксибутиратом, а также для получения молекулярного водорода.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов" (Москва, 1999) и "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 2000), на международных симпозиумах "10th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes" (Барселона, Испания, 2000) и " I" FEMS congress of European microbiologists" (Любляна, Словения, 2003). В целом работа обсуждена на заседании кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения результатов, списка литературы (¿^наименования). Работа изложена на //Г листах машинописного текста, включая

таблицы и рисунков. Список сокращений. ДТНБ - 5,5-дитиобис-(2-нитробензоат), ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ИЦЛ - изоцитратлиаза, ЦМ-цикл - цитрамалатный цикл, ЦТК-цикл трикарбоновых кислот, ФЕП - фосфоенолпируват.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В данной работе использовали штамм Rhodobacter sphaeroides 2R и Rhodospirillum rubrum 2R из коллекции кафедры микробиологии МГУ. Бактерии выращивали в фотогетеротрофных анаэробных условиях (2000 люкс, 33°С) на среде Ормерода (Ormerod et al., 1961) с ацетатом (1 г/л) в качестве источника углерода. В опытах использовали культуры, находящиеся в экспоненциальной фазе роста

Эксперименты по ассимиляции NaHMCOj, ИС пропионата суспензиями

клеток проводили в медицинских шприцах объёмом 10 мл на свету (3000 люкс, 30°С) (фототрофные анаэробные условия). Измерение дыхания клеток проводили полярографическим методом с применением электрода Кларка в затемненной ячейке объёмом 1 мл. Эксперименты по выделению кетокислот суспензиями клеток проводили в медицинских шприцах на свету (3000 люкс, 30°С). Суспензии инкубировали 6 ч в присутствии ацетата (1 г/л) и, при необходимости, бикарбоната (1 г/л). Выделившиеся. кетокислоты определяли в супернатанте в виде 2,4-денитрофенилгидразонов. Идентификацию кетокислот проводили с помощью тонкослойной хроматографии [Kornberg and Gotto, 1961].

Для измерения активности ферментов клетки разрушали ультразвуком (22 кгц), либо с помощью Х-пресса или Френч пресса. Не разрушенные клетки и крупные фрагменты осаждались центрифугированием (40000 g, 30 мин. 4°С).

Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного шунта определяли спектрофотометрически по стандартным методикам [Ivanovsky et al., 1997]. Пируваткиназу измеряли спектрофотометрически по окислению НАДН в присутствии лактатдегидрогеназы [Valentine and Tanaka 1966]. ФЕП карбоксилазу, ФЕП карбоксикиназу и ФЕП карбокситрансфосфорилазу определяли радиохимически [Ivanovsky et al., 1999]. Пропионил СоА-карбоксилазу измеряли радиохимически по пропионил-СоА-зависимой фиксации СОг [Berg et al., 2002]. Метилцитратсинтазу измеряли спектрофотометрически по глиоксилат-зависимому образованию СоА из пропионил-СоА (с 5,5'-дитиобис-(2-нитробензоатом), ДТНБ) (412 им, е=13.6 мКГ' см"1) [Textor et al., 1997]. Активность цитрамалатсинтазы определяли двумя методами: спектрофотометрически по пируват зависимому образованию СоА из ацетил-СоА (с ДТНБ) и по убыли пирувата в зависимости от присутствия ацетил-КоА. Концентрацию пирувата определяли спектрофотометрически с фенилгидразином. Активность 3-метилмалил-СоА лиазы определяли по убыли глиоксилата в зависимости от присутствия пропионил-СоА. Концентрацию глиоксилата определяли спектрофотометрически с фенилгидразином.

СоА-эфиры продукюв конденсации [14С]ацетил-СоА и пирувата и [14С]пропионил-СоА и глиоксилата анализировали с помощью ВЭЖХ (колонка с С18-обращенной фазой (LipcoCART; Merck). Органические кислоты анализировали с использованием колонки Aminex после щелочного гидролиза СоА-эфиров.

Белок измеряли по методу Лоури [Lowry et al., 1951].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Доказательства отсутствия глиоксилатного шунта у Rba. sphaeroides. Данные относительно присутствия изоцитратлиазы у Rba. sphaeroides в литературе противоречивы. В большинстве работ сообщается об отсутствии этого фермента Однако, Blasco с соавторами [Blasco et al., 1989] сообщили о возможности измерения низкой активности изоцитратлиазы у Rba. sphaeroides с помощью разработанного ими колориметрического метода с использованием 2,4-динитрофенилгидразина. В наших исследованиях активность изоцитратлиазы у Rba. sphaeroides штамм 2R не определялась ни стандартными методами, ни по методу, предложенному Blasco с сотрудниками. Определение другого фермента глиоксилатного шунта, малатсинтазы, показало, что он присутствует в клетках Rba. sphaeroides. Его активность составляла 23 нмоль мин-1 (мг белка)-1. На основании полученных данных мы можем утверждать, что исследуемый нами штамм Rba. Sphaeroides 2R относится к ИЦЛ бактериям (табл.1).

Рост Rba. sphaeroides на ацетате. Rba. sphaeroides способна расти в фотогетеротрофных условиях на среде, содержащей ацетат в качестве единственного источника углерода. Добавление бикарбоната в условиях периодического культивирования не только не стимулирует, но даже несколько подавляет рост бактерий (0.16 мг белка/мл после 24 ч роста на среде с ацетатом и 0.13 мг белка/мл - с ацетатом и бикарбонатом).

Аналогичные данные получены при выращивании Rba. sphaeroides в фотобиореакторе в условиях проточного культивирования в режиме . турбидостата. Рост культуры не стимулировался при добавлении СО2 к аргону, которым осуществлялась продувка фотобиореактора (табл.2). Более того, увеличение скорости продувки реактора аргоном, не содержащим СОг, с 20 до 100 мл/мин для более эффективного удаления из среды СОг, выделяющегося в процессе ассимиляции ацетата, также не снижало скорость роста культуры. Совершенно иные результаты получены для Rsp. rubrwn.

Таблица 1. Активность ферментов принимающих участие в ассимиляции ацетата в экстрактах клеток Rba. sphaeroides, выросших в фототрофных условиях на разных субстратах (в нмоль мин-1 (мг белка)-1).

Фермент

Условия роста

Ацетат

Малат

Ацетил-КоА-синтаза

Цитратсинтаза

Аконитаза

Изоцитратдегидрогеназа 2-Оксоглугаратгидрогеназа Сукцинатдегидрогеназа Фумараза

Малатдегидрогеназа

Малатсинтаза

Изоцитратлиаза

Малик-фермент

Пируваткиназа

Пропионил-КоА-карбоксилаза ФЕП-карбоксилаза ФЕП-карбоксикиназа ФЕП-карбокситрансфосфорилаза

206.2

39.5 217.1 100.6 21.8 18.9

165.0

517.1 233 0.0 4.19 12.4 96

14.6 6.9 0.0

36

9.6 523 49.7 0.5 123 68.0 442.0 20.9 0.0 8.1

не определяли

6.7 7.9 4.9 0.0

Удаление СО2 из газовой фазы приводит к значительному замедлению роста культуры, а увеличение скорости продувки до 100 мл/мин - к практически полной его остановке (табл.2).

Таблица 2. Удельная скорость роста (ц, I/час) Rba. sphaeroides и Rsp. rubrum в условиях непрерывного культивирования на среде с ацетатом в зависимости от скорости продувки фотобиореактора аргоном и наличия СО2 в газовой фазе.

Отсутствие зависимости ассимиляции ацетата у Rba. sphaeroides от СО2 (табл.3), что для Rsp. rubrum рассматривалось как характерный признак функционирования ЦМ-цикла, может свидетельствовать о том, что у Rba. sphaeroides данный цикл не функционирует, и метаболизм ацетата может происходить при участии иных механизмов. К ним относятся: 3-гидроксипропионатный цикл, метиласпартатный путь окисления ацетил-СоА до глиоксилата и восстановительное карбоксилирование ацетил-СоА с участием пируватсинтазы. Ниже рассматривается возможность участия этих механизмов в метаболизме ацетата у Rba. sphaeroides.

В 3-гидроксипропионатном цикле существует две стадии карбоксилирования: карбоксилирование ацетил-СоА с образованием малоната и карбоксилирование пропионата с образованием сукцината (Eisenreich et al., 1993, Strauss and Fuchs, 1993). Поэтому в случае функционирования данного цикла соотношение скорости меченого бикарбоната к скорости фиксации меченого ацетата должно быть довольно высоким (не ниже 2/1). Реальное соотношение СО2 /ацетат у Rba. sphaeroides не превышает 0,1, что не согласуется с возможностью участия 3-гидроксипропионатного цикла (табл. 3 и 4).

Метиласпартатный цикл, существование которого предполагалось для ряда бактерий (Ueda et al., 1981, Shimizu et al., 1984). В систему ферментов данного цикла входит аконитаза, ингибитором которой является фторацетат, поэтому следует ожидать, что добавление, фторацетата будет ингибировать появление глиоксилата в среде. Однако, добавление фторацетата к суспензиям клеток Rba sphaeroides, не оказывает ингибирующего действия на выделение глиоксилата (табл.5). Это указывает на невозможность функционирования метиласпартатного цикла у данной бактерии. Эти же данные указывают на то, что

ассимиляция ацетата у ЯЬа. sphaeroides может осуществляться с использованием механизма, в котором отсутствует аконитаза, что соответствует параметрам ЦМ-цикла (рис.1).

Таблица 3. Влияние бикарбоната и органических субстратов на фиксацию 2-|4С-ацетата и 2-14С-пропионата суспензиями клеток ЯЬа. sphaeroides на свету в анаэробных условиях (нмоль мин-1 (мг белка)-1).

Примечание: концентрация ацетата, органических субстратов и бикарбоната в среде 5 мМ.

Восстановительное карбоксилирование ацегил-СоА с участием пируватсинтазы,

рассматривалось радом авторов в качестве анаплеротического механизма при ассимиляции ацетата у некоторых фототрофных бактерий, в частности у ЯЬа. sphaeroides и Яхр. гиЬтЫ, [КопЛаНеуа, 1979, ¡тЬоНГ, 1995]. Однако ряд данных, полученных в данной работе, не согласуются с этим предположением. У ЯЬа sphaeroides скорость фиксации 14С-бикарбоната была значительно ниже, чем 14С-ацетата (соотношение СО2 /ацетат <0.1) и добавление ацетата не восстанавливало фиксации СО2 в присутствии ингибиторов цикла Кальвина (табл.3 и 4).

Таблица 4. Влияние органических субстратов и иодацетата на фиксацию 14С-бикарбоната клетками Rba. sphaeroides, выросшими в фотогетеротрофных условиях (нмоль мин-1 (мг белка)-1).

Бикарбонат

Бикарбонат + ацетат

Бикарбонат + пропионат

Бикарбонат + Н2

Бикарбонат + Нг + ацетат

Бикарбонат + йодацетат

Бикарбонат + Нг + йодацетат

Бикарбонат + Нг + йодацетат + ацетат

Бикарбонат + Н2 + йодацетат + пропионат

28 32 98 62 20 7 3 3 16

Примечание: концентрация бикарбоната, ацетата и пропионата 5 мМ, йодацетата 0.1 мМ.

Таблица 5. Выделение в среду глиоксилата суспензиями клеток Rkb. sphaeroides.

Субстраты в среде

Выделение глиоксилата, (мкмоль мл' )

Ацетат

Ацетат + СОг

Ацетат + фторацетат + СОг

0.011

0.011

0.019

Примечание: время инкубации 2 ч., концентрация ацетата и бикарбоната составляла 5мМ, фторацетата 1мМ, в опытах брались 8-часовые культуры.

Для пурпурных серных бактерий Thiocapsa roseopersicina и Ecthothiorhodospira shaposhnikovii, у которых участие пируватсинтазы в ассимиляции ацетата хорошо документировало, соотношение СОг/ацетат, было 1/1 или даже выше [Фирсов и Ивановский, 1975, Kondratieva et al., 1981]. Кроме того, у The. roseopersicina и

ЕеЬ 8каро8кткоуи фиксация бикарбоната блокируется в присутствии ингибиторов цикла Кальвина и полностью восстанавливается после добавления ацетата. Это свидетельствует о том что, несмотря на наличие пируватсинтазы реакции восстановительного карбоксилирования не принимают участия в ассимиляции ацетата у ЯЬа. spкaeroides.

Суммируя приведенные выше данные, можно сказать, что ни один из гипотетически возможных анаплеротических механизмов не участвует в ассимиляции ацетата у ЯЬа. spкaeroides.

Как указывалось выше, у Rsp. rubrum было показано существование нового СОг-зависимого механизма ассимиляции ацетата—ЦМ-цикла (рис. 1).

Рисунок 1. Механизм ассимиляции ацетата у Rsp.rubrum [Ivanovsky et al., 1997].

Основным интермедиатом этого цикла является цитрамалат, который образуется при конденсации ацетил-СоА и пирувата. Далее через ряд последовательных реакций цитрамалат распадается на пропионил-СоА и глиоксилат. Конечный продукт цикла - глиоксилат -конденсируется с другой молекулой ацетил-СоА в малатсинтазной реакции с образованием малата, который включается в ЦТК, восполняя, таким образом, убыль промежуточных субстратов цикла, расходуемых на биосинтетические нужды. Ключевыми реакциями ЦМ-цикла являются реакция конденсации ацетил-СоА и пирувата, катализируемая цитрамалатсинтазой и реакция распада 3-метилмалата на глиоксилат и пропионил-СоА, катализируемой 3-метилмалил-СоА лиазой.

Конденсация ацетил-СоА и пирувата. Наличие цитрамалатсинтазы в экстрактах ЯЬa. sphaeroides определялось двумя методами — по убыли пирувата в зависимости от присутствия ацетил-СоА (реакция с фенилгидразином) и по пируват-зависимому образованию СоА из ацетил-СоА (реакция с ДТНБ). Достаточно высокая активность цитрамалатсинтазы была обнаружена тем и другим методом. Синтез фермента регулируется в зависимости от условий роста. На среде с малатом, когда необходимость в анаплеротических системах отсутствует, уровень синтеза фермента снижается (табл. 7).

Таблица 7. Активность цитрамалатсинтазы в экстрактах ЯЬa. sphaeroides, выросших

фототрофных условиях на разных субстратах (в нмоль мин-1 (мг белка)-1).

Метод измерения Субстрат в среде культивирования

цитрамалатсинтазы Ацетат Малат

С фенилгидразином 36.0 25.8

С ДТНБ 27.79 15.92

Примечание: методики измерения фермента описаны в главе Материалы и методы.

Продукты конденсации ацетил-СоА и пирувата в экстрактах клеток ЯЬa. sphaeroides были исследованы с использованием ВЭЖХ па колонке Атпех, разделяющей органические кислоты. Было показано, что в экстрактах ЯЬa. sphaeroides при добавлении пирувата и [14С]ацетил-СоА образуется цитрамалат (рис. 2).

Скорость конденсации, по данным ВЭЖХ, составляла 20 нмоль/мин мг белка. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о протекании в экстрактах ЯЬa. sphaeroides следующей реакции:

Ацетил-СоА + пируват = цитрамалат + СоА Конденсация глиоксилата и пропионил-СоА. В экстрактах клеток ЯЬa. sphaeroides, обнаружен и другой ключевой фермент ЦМ-цикла — 3-метилмалил-СоА лиаза, осуществляющий конденсацию глиоксилата и пропионил-СоА (табл. 8).

Рисунок 2. Продукты конденсации 4С-ацетил-СоА и пирузата в экстрактах клеток ЯЬа. sphaeroides , выросших на среде с ацетатом. Хроматограммы получены с использованием ВЭЖХ (колонка Аштех), детектируется радиоактивность (14С).

Таблица 8. Активность 3-метилмалил-СоА лиазы в экстрактах ЯЬа. spкaeroides (в нмоль мин-1 (мг белка)-1).

Фермент Субстрат в среде культивирования

Ацетат Малат

(З-метилмалил-СоА лиаза 166 46.62

Активность данной реакции весьма высока - 166 нмоль мин-1 (мг белка)-1. Как и в случае с цитрамалатсинтазой, активность 3-метилмалил-СоА лиазы была ниже при росте клеток на среде с манатом.

Продукты конденсации были исследованы с использованием ВЭЖХ на колонке RP18 разделяющей СоА эфиры (рис. 3).

Показано, что в присутствии глиоксилата из 14С-пропионил-СоА образуется два продукта: 3-метилмалил-СоА и мезаконил-СоА. При этом в реакционной смеси сначала появляется 3-метилмалил-СоА, затем мезаконил-СоА. В контроле без глиоксилата никаких продуктов не обнаружено. Дня идентификации продуктов конденсации, пробы были подвергнуты щелочному гидролизу и нанесены на колонку Aminex, разделяющую органические кислоты (рис. 4). В присутствии глиоксилата, помимо [14С]пропионата, в пробах обнаруживался 14С-мезаконат и 14С-3-метилмалат.

Полученные данные свидетельствуют о протекании в экстрактах ЯЬа. spкaeroides следующих реакций:

пропионил-СоА + глиоксилат - 3-метилмалил-СоА - мезаконил-СоА

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в клетках ЯЬа spкaeroides, выросших на среде с ацетатом, может осуществляться следующая последовательность реакций, обеспечивающая конверсию ацетил-КоА и пирувата в глиоксилат и пропионил-КоА:

Ацетил-СоА + пируват цитрамалат - мезаконат - мезаконил-СоА -

3-метилмалил-СоА - пропионил-СоА + глиоксилат

Конденсация глиоксилата со второй молекулой ацетата, катализируемая малатсинтазой (табл. 1) приводит к образованию малата, который поступает в реакции цикла трикарбоновых кислот. При этом становится понятна и роль малатсинтазы у

Пропионил-СоА + глноксилат, 15'

время удерживания, мин Рисуиок 3. Продукты конденсации 14С-пропионил-СоА и глиоксилата в экстрактах клеток КЬа. sphaeroides , выросших на среде с ацетатом. Хроматограммы получены с использованием ВЭЖХ (колонка ЯР18 ), детектируется радиоактивность (14С).

КЬа. sphaeroides, поскольку она катализирует конденсацию ацетил-КоА с образовавшимся в цитрамалатном цикле глиоксилатом.

Окисление пропионил-СоА до пирувата. Для замыкания реакций в цикл, пропионил-СоА образовавшийся в 3-метилмалил-СоА лиазной реакции, необходимо окислить до пирувата -акцептора ацетил-СоА. Пропионил-СоА подвергается карбоксилированию при участии пропионил-СоА карбоксилазы с образованием метилмалонил-СоА, который изомеризуется в сукцинил-СоА. Образующийся сукцинил-СоА окисляется до оксалоацетата под действием ферментов ЦТК. Декарбоксилирование оксалоацетата до ФЕП и превращение ФЕП в пируват замыкают цикл. Активность ферментов, необходимых для функционирования этой

Рисунок 4. Продукты конденсации 4С-иропионил-СоА и глиоксилата в экстрактах клеток Яba. sphaeroides , выросших на среде с ацетатом. Хроматограммы получены с использованием ВЭЖХ (колонка Аштех), детектируется радиоактивность (14С)

последовательности реакций, обнаружена в экстрактах клеток Rba. sphaeroides, выросших на ацетате (табл.1).

Таким образом, в экстрактах Rba. sphaeroides обнаружена активность всех ферментов, необходимых для ассимиляции ацетата с использованием ЦМ-цикла.

Однако, при исследовании процесса ассимиляции ацетата у Rba sphaeroides было выявлено, что в отличие от Rsp. rubrum, бикарбонат не оказывает стимулирующего действия на рост данной культуры. С этим согласуются данные по фиксации меченого ацетата, пропионата и бикарбоната. Добавление бикарбоната не оказывает стимулирующего действия на ассимиляцию ацетата и пропионата (табл. 3), также как и добавление ацетата и пропионата не увеличивало скорости фиксации бикарбоната (табл. 4). Аналогичные данные были получены по дыханию в присутствии этих субстратов. Значительного увеличения скорости дыхания на среде, содержащей ацетат или пропионат, при добавлении бикарбоната не обпаружено (табл. 9).

Таблица 9. Потребление кислорода клетками Rba. sphaeroides (нмоль мин-1 (мг белка)-1).

Субстраты в среде Потребление кислорода,

Эндогенное дыхание 5.0

Эндогенное дыхание + бикарбонат 10.0

Ацетат 28.7

Ацетат + бикарбонат 30.0

Пропионат 27.8

Пропионат + бикарбонат 30.1

ОЬ-Цитрамалат 14.0

Мезаконат 12.0

Ацетат •+ БЬ-цитрамалат 35.5

Ацетат + мезаконат 34.8

Примечание: концентрация бикарбоната и всех органических субстратов в среде 5 мМ.

Таким образом, ассимиляция ацетата у Rba sphaeroides, в отличие от Rsp. rubrum, не зависит от присутствия бикарбоната Отсутствие стимулирующего эффекта СО2 Rba. sphaeroides можно объяснить различными причинами.

1. Окисление пропионил-СоА до пирувата происходит без участия реакции карбоксилирования. В настоящий момент известны следующие пути окисления

пропионил-СоА, идущие без реакции карбоксилирования пропионил-СоА, и которые могут привести к образованию пирувата:

метилцитратный путь, функционирующий у грибов [Tabuchi et al., 1974, Brock et al., 2000] и многих аэробных бактерий [Textor et al., 1997].

окисление пропионил-СоА через акрилоил-СоА, лактил-СоА и лактат до пирувата обнаружено у строгих анаэробных бактерий Clostridium propionicum и Megasphera elsdenii [Ladd and Walker, 1959, Hofmeister and Buckel, 1992,Textor et al., 1997]. Ключевой фермент акрилатного пути акрилатгидратаза.

прямой перенос СО2 на пропионил-СоА от оксалоацетата на метилмалонил-СоА при участии метилмалонил-СоА карбокситрансферазы как это происходит у пропионовокислых бактерий. СО2 переносится от оксалоацетата на метилмалонил-СоА оставаясь связанным с субъединицей карбокситрансферазы [Shenoy et al., 1992].

Проведенные нами исследования показали, что ключевые ферменты трех перечисленных выше путей - метилцитратсинтаза акрилатгидратаза и метилмалонил-СоА карбокситрансфераза sphaeroides отсутствуют.

2. Другой причиной отсутствия СО2 зависимости может быть высокое сродство пропионил-СоА карбоксилазы к бикарбонату. Однако, измерение Km для бикарбоната у пропионил-СоА карбоксилазы у Rsp. rubrum и Rhb. sphaeroides, показало, что сродство фермента к данному субстрату у обеих культур примерно равно (5.3 мМ у Rsp. rubrum и 4.4 мМ у Rhb. sphaeroides).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что отсутствие стимулирующего эффекта бикарбоната на ассимиляцию ацетата у Rba. sphaeroides нельзя объяснить ни наличием альтернативных механизмов метаболизма прогшоната ни разницей в сродстве пропионил-СоА карбоксилазы к бикарбонату.

3. Однако, не исключено, что ассимиляция ацетата у Rba. sphaeroides происходит в результате действия ЦМ цикла в том виде, как он был описан для Rsp. rubrum, но физиологические особенности Rba. sphaeroides позволяют компенсировать недостаток СО2 в среде культивирования. Можно предположить, что у Rba sphaeroides, для карбоксилирования пропионил-СоА используется эндогенный бикарбонат, выделяющийся в процессе окисления ацетата. При этом внутри клеток создается концентрация бикарбоната, достаточная для эффективного функционирования пропионил-СоА карбоксилазы. На возможность реализации такого механизма указывает тот факт, что скорость ассимиляции ацетата и, следовательно, выделения бикарбоната у Rba. sphaeroides значительно выше, нежели у Rsp. rubrum (табл. 10).

Таблица 10. Ассимиляция 1-[14С]ацетата и выделение из него 14С-бикарбоната у Rba. sphaeroides и Rsp. rubrum (нмоль мин-1 (мг белка)-1).

Измеряемая активность Rba. sphaeroides Rsp. rubrum

Ассимиляция ацетата 204,1 34,2

Выделение СОг 82,8 13,6

Кроме того, клетки Rba. sphaeroides обладают слизистой капсулой, которая может способствовать удержанию выделяющегося бикарбоната.

Для того чтобы исследовать влияние выделяющегося при ассимиляции ацетата бикарбоната, условия эксперимента были изменены следующим образом. С целью снижения скорости ассимиляции ацетата и, следовательно, выделения бикарбоната, концентрация ацетата последовательно уменьшалась с 5 до 0.05 мМ. Концентрация клеток была уменьшена с 0.1-0.2 мг белка мл-1 до 0.03 мг белка мл-1. Кроме того, в опыт брались культуры разного возраста (8, 18 и 24-часовые культуры, что соответствует началу, середине и концу экспоненциальной фазы роста) (табл. 11). Следует также отметить, что клетки 8-часовых культур сохраняли подвижность, что свидетельствует об отсутствии слизистой капсулы, образование которой приводит к утрате подвижности клеток.

В 8-часовой культуре Rba. sphaeroides стимуляция ассимиляции ацетата экзогенным бикарбонатом проявлялась при концентрации ацетата 0.5 мМ и ниже (табл. 10). Для 18-часовой культуры стимулирующий эффект бикарбоната наблюдался только при снижении концентрации ацетата до 0.1 мМ. В то же время, при использовании в опыте суспензий клеток 24-часовой культуры с большим содержанием белка (0.14 мг/мл) стимулирующего действия бикарбоната не наблюдалось, независимо от концентрации ацетата. Эти данные свидетельствуют о том, что при снижении скорости накопления эндогенного бикарбоната до уровня, который не обеспечивает эффективного функционирования пропионил-СоА карбоксилазы, становится возможным выявление стимулирующего действия экзогенного бикарбоната. Кроме того, стимулирующее действие экзогенного бикарбоната выявляется только у молодых культур, клетки которых не содержат капсулы, препятствующей выходу эндогенного СО2 .

Таким образом, полученные данные согласуются с предположением, что в клетках Rba. sphaeroides, функционирует цитрамалатный цикл, наличие которого было показано ранееуRsp. rubrum.

Таблица 11. Влияние бикарбоната на ассимиляцию ацетата клетками ЯЬа. sphaeroides в зависимости от концентрации ацетата и возраста культуры (нмоль мин-1 (мг белка)-1).

Субстраты в опыте Концентрация ацетата (мМ) Возраст культуры (в часах)

8 18 24

Ацетат Ацетат + N3110)3 5.0 231.1 212.3 393.9 344.9 271.4 241.5

Ацетат Ацетат + №НС03 0.5 111.0 152.9 134.8 113.0 92.9 93.7

Ацетат Ацетат+ КаНС03 0.2 86.0 103.6 107.6 107.1 35.5 35.9

Ацетат Ацетат + КаНС03 0.1 52.4 68Л 75.4 80.3 16.7 18.1

Ацетат Ацетат + КаНСОз 0.05 32.8 50.6 32.3 42.9 8.5 8.6

Примечание. Концентрация клеток в опыте с 8- и 18-часовыми культурами была 0.03 мг белка/мл, с 24-часовой культурой - 0.14 мг белка/мл.

На функционирование ЦМ цикла у Rba sphaeroides указывают также и следующие данные.

Способность клеток Rba. sphaeroides выделять в среду глиоксилат при инкубации клеток с ацетатом (табл. 5), что хорошо согласуется с функционированием ЦМ цикла, поскольку других путей образования глиоксилата из ацетата у этой бактерии не известно. Выделение глиоксилата стимулируется фторацетатом (ингибитором аконитазы). Это связано с отсутствием мишени для его действия в ЦМ цикле (рис.1), а также свидетельствует о том, что основным путем использования синтезированного глиоксилата является ЦТК.

Добавление DL-цитрамалата и мезаконата подавляет фиксацию ацетата у Rba sphaeroides (табл. 3). Ранее аналогичное действие этих соединений на метаболизм Rba. sphaeroides было показало японскими исследователями [Yamada and Kikuchi, 1968]. Было высказано предположение, что данный эффект связан с действием этих соединений на какие-то (не установленные) реакции метаболизма ацетата. Однако в рамках предположения

Рисунок 5. Взаимодействие цитрамалатного циклаи циклатрикарбоновых кжслот8рЬагго1йг8при ассим

о существовании цитрамалатного цикла этот факт находит другое объяснение: данные соединения включаются в метаболизм вместо ацетата, что проявляется в уменьшении скорости- фиксации меченого субстрата. С другой стороны, добавление цитрамалата и мезаконата стимулирует на фоне ацетата потребление кислорода суспензиями клеток КЬа sphaeroides (табл.9). Сочетание подавления фиксации ацетата цитрамалатом и мезаконатом со стимуляцией этими соединениями дыхания на ацетате свидетельствует об их участии в качестве промежуточных продуктов в процессе ассимиляции ацетата. Более того, цитрамалат и мезаконат сами могут быть субстратами для дыхания клеток (табл.9), что дает дополнительное подтверждение наличия у выросших на среде с ацетатом клеток КЬа. sphaeroides ферментов, необходимых для их ассимиляции.

Фиксация ацетата у КЬа. sphaeroides стимулируется различными органическими кислотами (табл.3). Стимулирующее действие этих кислот объясняется тем, что они

являются акцепторами ацетата в различных реакциях. Пируват является акцептором ацетата в цитрамалатсинтазной реакции. Экзогенный глиоксилат - акцептор ацетата в малатсинтазной реакции позволяет включать ацетат непосредственно в реакции цикла трикарбоновых кислот (рис.5).

Сопряжение реакций ЦМ цикла с реакциями ЦТК. Наличие ЦМ цикла, помимо вовлечения глиоксилата в реакции ЦТК, обеспечивает также возможность включения в ЦТК дополнительных молекул ацетил-СоА через конденсацию с оксалоацетатом при участии цитратсинтазы. Таким образом, ЦМ цикл является анаплеротическим механизмом, восполняющим убыль субстратов ЦТК, расходуемых на биосинтетические нужды. Он замещает отсутствующий у Rba sphaeroides глиоксилатный шунт. Интегральная схема вовлечения ЦМ цикла в углеродный метаболизм Rba. sphaeroides представлена на рис. 5

Таким образом, все полученные в настоящей работе результаты, а также литературные данные свидетельствуют о функционировании ЦМ цикла у Rba. sphaeroides.

ВЫВОДЫ

1. Анаплеротической последовательностью, используемой Rba sphaeroides для ассимиляции ацетата в качестве единственного источника углерода и электронов является цитрамалатный цикл. Конверсия ацетата до глиоксилата у Rba. sphaeroides осуществляется в результате функционирования следующей последовательности реакций:

ацетил-СоА + пируват—> цитрамалат—> мезаконат —> мезаконил-СоА—> 3-мстилмалил-

СоА—>глиоксилат + пропионил-СоА.

2. Регенерация пирувата из пропионата у Rba. sphaeroides, так же как и у Rsp. rubrum, происходит результате функционирования следующей последовательности реакций: пропионат (+СО2) — >сукцинат—>фумарат—>малат—>оксалоацетат—> пируват.

3. Несмотря на участие в ЦМ-цикле пропионил-СоА карбоксилазы бикарбонат не стимулирует ассимиляцию ацетата. Причиной отсутствия стимулирующего действия бикарбоната на рост и ассимиляцию ацетата у Rba sphaeroides является высокая скорость выделения СО2 в процессе метаболизма ацетата и наличие у клеток слизистой капсулы. Это позволяет Rba sphaeroides накапливать в среде и в клетках концентрацию бикарбоната достаточную для эффективного функционирования пропионил-СоА карбоксилазы лимитирующего этана ЦМ-цикла.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ивановский Р.Н, Красильникова Е.Н, Филатова Л.В "Метаболизм ацетата у Rhodobacter sphaeroides.. Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов. Научная конференция. МГУ им.М.В Ломоносова, биологический факультет, 21 декабря 1999 г.

2. LFilatova, E.Krasilnikova and R.Ivanovsky. "A modified citramalate cycle for acetate assimilation in Rhodobacter sphaeroides" 10lh International Symposium on Phototrophic Prokaryotes. August 26-31, 2000 Barcelona, Spain.

3. Филатова Л.В, Красильникова Е.Н, Ивановский Р.Н. "Механизм ассимиляции ацетата у пурпурной несерной бактерии Rhodobacter sphaeroides, не имеющей глиоксилатного шунта.". Автотрофные микроорганизмы. Материалы международной научной конференции. МГУ им.М.ВЛомоносова, биологический факультет, 13-15 декабря 2000г.

4. Berg, I. A., Filatova L. V., Ivanovsky R.N "Inhibition of acetate and propionate assimilation by itaconate via propionyl-CoA carboxylase in isocitrate lyase-negative purple bacteriumRhodospirillumrubrum". FEMS Microbiol. Lett.2002

5. L. Filatova, E. Krasilnikova, I. Berg, R. Ivanovsky. "The mechanism of acetate assimilation in isocitrate lyase-negative purple bacterium Rhodobacter sphaeroides FEMS congress of European microbiologists. June 29-July 3,2003 Ljubljana, Slovenia.

6. Филатова Л.В., Берг И. А., Красильникова Е.Н., Цыганков А.А., Лауринавичене Т.В., Ивановский Р.Н. Исследование механизма ассимиляции ацетата у пурпурных несерных бактерий, не имеющих глиоксилатного шунта. Ассимиляция ацетата клетками Rhodobacter sphaeroides. II Микробиология. Принято к печати.

7. Филатова Л.В., Берг И. А., Красильникова Е.Н., Ивановский Р.Н. Исследование механизма ассимиляции ацетата у пурпурных несерных бактерий, не имеющих глиоксилатного шунта. Ферменты цитрамалатного цикла у Rhodobacter sphaeroides. II Микробилогия. Принято к печати.

»15667

Подписано в печать 13.08.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 118 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Филатова, Людмила Владимировна

Список сокращений.

Введение.

1.0бзор литературы.

1.1. Общая характеристика фототрофных микроорганизмов.

1.2. Углеродный метаболизм пурпурных несерных бактерий.

1.2.1. Автотрофная ассимиляция СОг.

1.2.2. Гетеротрофный метаболизм.

1.2.3. Цитрамалатный цикл.

1.3. Задачи исследования.

2- Экспериментальная часть.

2.1. Материалы и методы исследования.

2.1.1. Бактерии и условия их культивирования.

2.1.2. Ассимиляция клетками меченых субстратов.

2.1.3. Измерение дыхания клеток.

2.1.4. Выделение клетками в среду кетокислот.

2.1.5. Получение экстрактов клеток.

2.1.6. Определение активности ферментов. щ 2.1.7. Идентификация продуктов конденсации ацетил-СоА - пируват и пропионил-СоА - глиоксилат.

2.1.8. Определение белка.

2.1.9. Реактивы.

2.2. Результаты.

2.2.1. Активность ферментов, принимающих участие в ассимиляции ацетата в экстрактах клеток Rba. sphaeroides.

2.2.2. Выделение глиоксилата суспензиями клеток Rba. sphaeroides, выросших в фототрофных условиях на среде с ацетатом.

2.2.3. Рост Rba. sphaeroides и Phs. fulvum в разных условиях.

2.2.4. Измерение Km для бикарбоната при его ассимиляции клетками

Rba. sphaeroides, Rsp. rubrum и Phs. fulvum, выросшими на ацетате.

2.2.5. Ассимиляция ацетата, бикарбоната и пропионата.

2.2.5.1. Фиксация ацетата и бикарбоната суспензиями клеток Rba. sphaeroides и Phs. fulvum, выросших в разных условиях на среде с ацетатом.

2.2.5.2. Действие ингибиторов ЦТК на фиксацию ацетата суспензиями клеток Rba. sphaeroides и Phs. fulvum, выросших в разных условиях на среде с ацетатом.

2.2.5.3. Действие С5 - дикарбоновых кислот на фиксацию ацетата суспензиями клеток Rba. sphaeroides и Phs. fulvum, выросших в разных условиях на среде с ацетатом.

2.2.5.4. Фиксация пропионата и бикарбоната суспензиями клеток Rba. sphaeroides, выросших в фототрофных условиях на среде с ацетатом.

2.2.5.5. Фиксация пропионата и бикарбоната суспензиями клеток Rba. sphaeroides и Phs. fulvum, выросших в фототрофных условиях на среде с пропионатом и бикарбонатом.

2.2.6. Потребление кислорода суспензиями клеток Rba. sphaeroides и Phs. fulvum.

2.2.7. Образование и взаимопревращения С5-дикарбоновых кислот (цитрамалата, 3-метилмалата) в экстрактах клеток Rba. sphaeroides, выросших в фототрофных условиях на среде с ацетатом.

2.2.7.1. Образование цитрамалил-СоА из ацетил-СоА и пирувата.

2.2.7.2. Конденсация пропионил-СоА и глиоксилата с образованием 3-метилмалил-СоА и мезаконил-СоА.

З.Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм ассимиляции ацетата у пурпурных несерных бактерий, не имеющих глиоксилатного шунта"

Цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт являются центральными механизмами осуществляющими конечные стадии окисления органических веществ и являются источником строительных блоков для синтеза белка и других структурных компонентов клеток - животных, растений и бактерий.

Эти ферментные системы относятся к числу наиболее изученным. Однако, несмотря на это, в последнее время, были открыты варианты модификаций цикла трикарбоновых кислот - восстановительный цикл трикарбоновых кислот, функционирующий у зеленых серных бактерий и некоторых архей. Метилцитратный путь, используемый при окислении пропионата, функционирующий у многих прокариот, и многочисленные варианты редуцированного цикла трикарбоновых кислот, функционирующие у фото- и хемолитотрофных бактерий. Тем не менее, до последнего времени, вне поля зрения исследователей оставался феномен существования бактерий, способных расти на ацетате, используя его в качестве единственного источника углерода и энергии, не обладая при этом полной системой ферментов глиоксилатного шунта, что является обязательным при утилизации ацетата. Такие бактерии встречаются в различных таксономических группах -бактерий и грибов. В конце прошлого века была открыта новая анаплеротическая последовательность, выполняющая функцию глиоксилатного шунта - цитрамалатный цикл. Существование данного цикла показано для несерных пурпурных бактерий Rhodospirillum rubrum, элементы этого цикла обнаружены так же у несерных зеленых бактерий, Chloroflexus aurantiacus. Целью данной работы было изучить возможность функционирвания данного цикла у других представителей фототрофных бактерий, что важно для выяснения путей эволюции углеродного метаболизма архей и бактерий.

1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика фототрофных микроорганизмов.

Бактерии, способные использовать свет как источник энергии, необходимой для роста, получили название фототрофов. Известно, что на ранних стадиях развития биосферы именно прокариотические организмы были ответственны за глобальную фототрофную фиксацию углерода. Сегодня высшие растения являются основными первичными продуцентами биосферы. Напротив, биомасса морских первичных производителей очень низка (0.2 %). Однако, оборот биомассы морских фотосинтетических микроорганизмов - приблизительно 700 раз быстрее, чем таковой высших растений. Таким образом, морские фотосинтетические организмы вносят значительный вклад общую продуктивность (55 109 тонн сухой биомассы/год"1, или 44% от общей продуктивности). Поскольку биомасса цианобактриального фитопланктона может составлять до 67 % от океанского планктона, их вклад в фотосинтез в морской воде может составлять до 80 % (Campbell, Nolla et al., 1994).

Все прокариоты, осуществляющие фотосинтез, принято подразделять на следующие группы:

Пурпурные бактерии.

Эритробактреии и другие аэробные бактерии, образующие бактериохлорофилл а.

Зеленые бактерии.

Гелиобактерии.

Прохлорофиты.

Цианобактерии

Галобактерии.

При этом все известные фототрофные микроорганизмы используют два функциональных и взаимно исключающих принципа для преобразования света в химическую энергию. Системы на основе хлорофилла широко распространены среди членов царства бактерии и состоят из светособирающих пигментов и реакционных центров (РЦ). Поток электронов по цепи переносчиков на определенных этапах сопряжен с направленным перемещением протонов через мембрану, что приводит к созданию протонного градиента, используемого для синтеза АТФ. Напротив, система основанная на каротиноидбелковом комплексе - бактериородопсине и найденная у бактерий входящих в группу Архей (галобактерии), не связана с переносом электронов по цепи переносчиков. Здесь, в результате работы протонной помпы, возникает градиент концентрации Н+, достигающий 200 мВ, в создании которого участвуют электрический и химический компоненты. В обеих системах, фотосинтетическое преобразование энергии в конечном счете кончается формированием богатых энергией химических связей.

В последнем издании руководства Bergey's (Bergey's manual of systematic bacteriology, 2001), царство (домен) Bacteria (Pfennig, 1989) разделено на ряд фил (phyla) в соответствии с данными, полученными в результате анализа 16S рРНК и других молекулярно-биологических исследований. Следует отметить, что данные по изучению нуклеотидных последовательностей 16S рРНК, а так же ДНК-РНК гибридизации свидетельствуют об искусственности существующей классификации, так как многие фототрофные микроорганизмы оказались филогенетически более близкими с некоторыми хемототрофами, чем между собой (Phillips, 1972).Фототрофные представители найдены в нескольких различных филах. Пурпурные бактерии и аэробные бактериохлорофилл ^-образующие фототрофные бактерии включены в филу Proteobacteria, которая подразделяется на четыре подкласса. Два семейства пурпурных серобактерий (Chromatiaceae, Ectothiorhodospiraceae) оказались филогенетически более близки и вошли в у -Proteobacteria. Большая часть исследованных пурпурных несерных бактерий относится к a- Proteobacteria и лишь представители родов Rhodocyclus, Rubrivivax, и Rhodoferax - к Proteobacteria. Зеленые несерные бактерии (нитчатые аноксигенные фототрофные бактреии) отнесены в филу Thermomicrobia (класс Chloroflexi), зеленые серобактреии - в филу Chlorobi, гелиобактерии (семейство Heliobacteriaceae) относятся к бактериям с неясным систематическим положением, близки к грамположительным бактериям группы Bacillus/Clostridium (рис.1).

Способность к фотосинтетическому преобразованию энергии на основе хлорофилла, была обнаружена в пяти группах бактерий: зеленых нитчатых бактерий относящихся к семействам Chloroflexaceae и Oscillochloridaceae, зеленые серные бактерии, Proteobacteria, Cyanobacteria, и Heliobacteriaceae (табл.1). За исключением Cyanobacteria, эти фототрофные бактерии осуществляют аноксигенный фотосинтез, который не сопровождается фотохимическим расщеплением воды и поэтому не ведет к образованию молекулярного кислорода. Основываясь на их фенотипических признаках, аноксигенные фототрофные бактерии был разделены на пять семейств: Rhodospirillaceae, Chromatiaceae, Ectothiorhodospiraceae, Chlorobiaceae, и Chloroflexaceae.

В пределах семейства Chloroflexaceae находятся предстатели трех родов: Chloroflexus, Chloronema и Heliothrix. Все три - термофилы и растут фотоорганогетеротрофно. Род Oscillochloris, ранее относимый к этому же семейству, был выделен в отдельное семемйство Oscillochloridaceae (Keppen, et al., 2000). Проведенное секвенирвание 16S рДНК у представителей рода Chloronema показало, что данная бактерия так же относится к Oscillochloridaceae, а не к Chloroflexaceae (Gich et al., 2000)

Зеленые серные бактерии (см. Семейство Chlorobiaceae) представляют изолированную группу. Они являются строгими фотолитотрофами. У зеленых бактерий основная масса светособирающих пигментов находиться в особых структурах (хлоросомах), прикрепленных к поверхности мембраны, но не являющихся ее компонентом (рис. 2). Особенность этой группы, то, что при окислении сульфида, элементная сера откладывается внутри клеток. Другая типичная особенность этой группы - самая ограниченная физиологическая гибкость.

Класс Proteobacteria, а - и p-Proteobacteria включает фотосинтетических представителей (называемые пурпурными несерными бактериями), которые не формируют отдельной филогенетической группы. Характерно, члены из этих двух групп показывают высокую метаболическую многосторонность и способны к фотоорганотрофному, фотолитоавтотрофному и хемоорганотрофному росту. Фотосинтетические пигменты -бактериохлорофил а или b и разнообразные каратиноиды (табл.1). Светособирающие пигменты, РЦ и компоненты электрон-транспортной цепи в виде комплексов с белками интегрированы в мембраны (рис. 2).

Семейство Heliobacteriaceae. К гелиобактериям принято относить все виды фототрофных бактерий, содержащие бакетриохлорофилл g (табл.1); другие бактериохлорофилы у них не обнаружены. Их фотосинтетический аппарат организован наиболее просто среди других фототрофов: все его компоненты находяться в ЦПМ, реакционные центры относятся к FeS-типу (Olson and Pierson, 1987), (Vermaas, 1994).

Для этих микроорганизмов предпочтительна фотогетеротрофия. Хотя могут расти и как облигатные фототрофы, так и осуществлять рост в темноте в анаэробных условиях в присутствии пирувата (Kimble and Madigan, 1992).

Рисунок 1. Филогенетическое дерево прокариот

Таблица 1. Особенности фотосинтезирующего аппарата у разных групп фототрофных бактерий.

Таксон Тип питания Светособирающие центры Тип реакционного центра

Cloroflexus (3) Аноксигенные БХл с, кар. Реакц.центр П-го фотоорганогетеротрофы типа

Аэробная хемоорганотрофия -

Зеленые серные (15) Аноксигенные Хлор; БХл cldle, кар. Реакц.центр 1-го бактерии фотолитотрофы типа a-Proteobacteria (31) Аноксигенные вкм; БХл aid, кар. Реакц.центр П-го фотоорганогетеротрофы типа

Аэробные хемоорганогетеротрофы a-Proteobacteria (23) Аэробные БХл а Реакц.центр Н-го аэробный хемооргангетеротрофы типа фотосинтезе)

P-Proteobacteria (4) Аноксигенные вкм; БХл а, кар Реакц.центр Н-го фотоорганогетеротрофы типа

Аэробные хемооргангетеротрофы

Chromatiaceae (31) Аноксигенные вкм; БХл alb, кар Реакц.центр Н-го

Ectothiorhodospiraceae (9) фотолитоавтотрофы типа

Hel iobacteriacea (5) Аноксигенные БХл g, кар Реакц.центр 1-го фотоорганогетеротрофы типа

Cyanobateria Оксигенные тил; Хлф а +ФБС Реакц.центр I+IIфотол итоавтотрофы или Хлф b или Хлф d; кар го типа тил; Хлф а/в\ кар.

Prochloron, (2) тил; Хлф а^в2\ кар (ФБС).

Prochlorothrix тил; Хлф a,d, кар (ФБС).

1)

Prochlorococcus

1)

Acaryochloris

Halobacteria (3) Аэробные Пурпурная мембрана; бактериородопси хемоорганогетеротрофы бактериородопсин н

Примечание: БХл-бактериохлорофил, кар. - каратиноиды, Хлф - хлорофилл, хлоре -хлоросомы, вкм - внутриклеточные мембраны, ФБС — фикобилисомы, тил. — тилакоиды т

Использование различных типов пигментов разными группами фототрофных бактерий позволяет им поглощать свет в разных областях спектра и определяет возможность распространения фототрофных микроорганизмов.

Поскольку данная работа выполнялась с использованием пурпурных несерных бактерий, то необходимо отметить, что основной акцент в обзоре литературы в дальнейшем, будет сделан именно на описании физиологии и метаболизма пурпурных несерных бактерий.

Пурпурные бактерии. В настоящее время известно около 70 видов пурпурных бактерий, распределенных по 33 родам. Первоначально все эти микроорганизмы были разделены на два семейства, на основании их способности окислять сероводород и накапливать при этом в клетках серу. В дальнейшем они были разделены на три семейства: Rhodospirillaceae (пурпурные несерные бактерии), а пурпурные серобактерии образуют два семейства: Ectothiorhodospaceae и Chromatiaceae. Относящиеся к ним виды способны окислять сероводород до молекулярной серы, а затем использовать ее с образованием сульфатов. При этом бактерии семейства Chromatiaceae могут накапливать молекулярную серу в клетках, как промежуточный продукт окисления сероводорода, а представители семейства Ectothiorhodospiraceae откладывают серу в среде. Исключение составляет ф бактерия Thiorhodospira sibirica, семейства Ectothiorhodospaceae. Эта бактерия откладывает серу в периплазматическом пространстве (Gerritse and Gottschal, 1993), (Bryantseva, et al., 1999)

По морфо-физиологическим признакам пурпурные бактерии довольно разнообразная группа. Здесь есть как подвижные, так и неподвижные формы. Подвижность определяется наличием полярно или субполярно расположенных жгутиков. Некоторые виды имеют и латеральное расположение жгутиков, a Rhodomicrobium vannielii относится к перитрихам. Наименьшими размерами (в диаметре - 0,3-0.7 мкм) обладают представители рода Rhodocyclus, наибольшими некоторые представители семейства Chromatiaceae. (3,5-4,5 мкм). Большинство видов бактерий размножается в результате бинарного деления клетки. Лишь у представителей рода Rhodopseudomonas и Rhodomicrobium имеет место почкование.

Способность пурпурных бактерий к фотосинтезу определяется наличием бактериохлорофиллов айв, длинноволновые максимумы поглощения которых находятся в инфракрасной области спектра (от 830 до 1035 нм). Помимо хлорофиллов пурпурные бактерии содержат каротиноиды (Bentley and Thiessen, 1957). У пурпурных бактерий это в

Бактерии

Структура фотохимического аппарата

Heliobacteriaceae

Зеленые серные бактерии

Chloroflexus sp

Heliothrix oregonensis

Proteobacteria

Cyanobacteria т РЦ тип 1 о РЦ тип II Хлоросома

• ССА тип 1 $ ССА тип II

Фикобилисома

Мембранные структуры содержащие фотохимический аппарат

Prochloron

Бактерии

Цианобактерии

Рисунок 2. Строение фотосинтезирующего аппарата фототрофных прокариот. основном алифатические соединения, содержащие гидроксильные, метоксильные и (или) кетогруппы. К ним относятся спириллоксантин, родопин, родопинал, сфероиден

Фотосинтезирующий аппарат пурпурных несерных бактерий локализован во внутрицитоплазматических мембранах (ВЦПМ) имеющих форму везикул, ламелл или трубочек. Строение ВЦПМ имеет систематическое значение. Фотосинтезирующий аппарат состоит из реакционного центра и включает переносчики электронов, образующих электронтранспортную цепь. В ее состав входят цитохромы типов с и Ь, убихиноны, родо- или менахиноны, а также флавины (Tholozan, et al., 1990). Поскольку редокс-потенциал хинона, входящего в РЦ пурпурных бактерий (Ео'«-50 мВ), более положителен, чем у НАД (Ео'«-320 мВ), синтез восстановителя (НАДН) осуществляется с помощью обратного переноса электронов. Флавины пурпурных бактерий в основном находятся в форме флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД). Присутствуют также ферредоксины (Bandell, et al., 1997). Отдельные виды способны к синтезу цитохрома типа а.

Пурпурные несерные бактерии - аноксигенные фототрофные бактерии, растущие фототрофно в аэробных условиях на свету. Все виды способны расти фотогетеротрофно с использованием органических субстратов как доноров электронов и материала для построения вещества клеток. Многие представители могут расти фотоавтотрофно, • используя в качестве доноров электронов серу или водород. Большинство известных видов пурпурных несерных бактерий - факультативные хемотрофы. Хемогетеротрофный рост в присутствии кислорода является общим практически для всех пурпурных несерных бактерий. Но вместе с тем, некоторые виды являются чувствительными к кислороду, а другие хорошо растут и в аэробных условиях в темноте. Для некоторых видов был показан хемоавтотрофный рост (Madigan and Gest, 1979).

Большинство пурпурных несерных бактерий могут расти в темноте, переключаясь с фотосинтеза на получение энергии в результате анэробного дыхания, брожения или, чаще аэробного дыхания. Некоторые виды серных бактерий способны расти в темноте, не только на органических средах, но и в хемолитоавтотрофных условиях. К ним относятся Т. roseopersicina, Chromatium vinosum, С. minus (Imhoff, 1995, Кондратьева, 1996).

В случае анаэробного дыхания многие несерные бактерии используют в качестве акцепторов электронов нитраты, нитриты, азотистую окись, диметилсульфоксид (ДМСО) или триметиламин - N - оксид (ТМАО) (Ferguson, et al., 1987). Единственный вид, Rhodobacter sphaeroides, вначале идентифицированный как подвид Rba. sphaeroides f. denitrificans (Satoh, et al., 1976), но позже отнесенный к виду Rba. sphaeroides (DeBont, ф etal., 1981, Imhoff, 1989, Imhoff, 1995) была первой пурпурной несерной бактерией, для которой было показано, что она может использовать нитрат как акцептор электронов при росте в темноте в анаэробных условиях. Позднее, способность к денитрификации была обнаружена и у некоторых других пурпурных несерных бактерий, например Rhodopseudomonas. palustris (Klemme, et al., 1980) и у Rba. capsulatus (McEwan, etal., 1984). Ни один из этих видов не может использовать нитрат как единственный источник азота, но образующийся в процессе динитрификации молекулярный азот может быть использован как источник азота (Dunstan, et al., 1982)

При отсутствии экзогенных акцепторов электронов, пурпурные несерные бактерии могут сбраживать различные субстраты. Продуктами брожения, помимо СОг и Нг являются различные органические кислоты (Uffen, 1978). Rhodospirillum rubrum может продуцировать сукцинат, ацетат, пропионат, формиат, СО2 и Н2 во время сбраживания фруктозы. При сбраживании пирувата образуется ацетат и формиат (Schultz and Weaver, 1982).

У разных видов пурпурных бактерий возможности использовать различные источники углерода, часто не одинаковы. Большинство пурпурных серных бактерий и значительное число пурпурных несерных бактерий, могут расти в автотрофных условиях. Часть серобактерий, таких как С. okenii, C.buderi, Т. roseopersicina штамм BBS являются облигатными автотрофами (Corzo and Tatum, 1953, Kondratieva, et al., 1981). Они щ используют небольшое число органических субстратов лишь в качестве дополнительных источников углерода

В зависимости от условий, при которых растут пурпурные несерные бактерии, органические углеродные соединения могут выполнять различные функции. В фототрофных условиях, углеродные соединения используются прежде всего как источник клеточного углерода, но кроме того, могут использоваться и как источник электронов для фотосинтетического транспорта электронов. В присутствии неорганических доноров электронов они могут фотоассимилироваться как дополнительный источник углерода. Если получение энергии идет за счет дыхания, то основная часть углеродных соединений полностью окисляется. Окисление данных соединений происходит в результате вовлечения реакций цикла трикарбоновых кислот (Beatty and Gest, 1981).

Большинство пурпурных несерных бактерий способно использовать разнообразные органические углеродные соединения. В первую очередь это органические кислоты, являющиеся промежуточными звеньями цикла трикарбоновых кислот, ацетат и пируват. Кроме того, рост пурпурных бактерий могут поддерживать другие органические кислоты, аминокислоты, спирты, углеводы. Многие виды могут использовать насыщенные жирные ф кислоты с длиной цепи 5-18 атомов углерода (Janssen and Harfoot, 1987). Некоторые органические соединения могут использоваться лишь ограниченным количество видов, например, цитрат используется лишь Rps. acidophila, Rhodocyclus gelatinosus, Rba. sphaeroides, Rps. viridis и Rps. palustris. Некоторые виды способны использовать ароматические соединения, такие как, бензоат, 3-гидроксибензоат, 4-гидроксибензоат и 1,3,5-тригидроксибензоат (Dutton and Evans, 1978), а так же фенол, дигидрокарбоксилированные и метоксикарбоксилированные ароматические кислоты (Harwood and Gibson, 1988, Gibson and Harwood, 1995)

Глюкоза и фруктоза потребляется практически всеми видами пурпурных несерных бактерий. Многие виды могут расти на этих субстратах как хемотрофно, так и фототрофно, но пути использования этих углеводов могут быть различными в зависимости от условий роста. К примеру, Rba. sphaeroides как в фототрофных условиях, так и в хемотрофных, метаболизирует глюкозу через путь Энтнера-Дудорова. Если в качестве источника углерода используется фруктоза, то при росте Rba. sphaeroides в хемотрофных условиях данный сахар метаболизируется через путь Энтнера-Дудорова. Если бактерия растет фототрофно, то фруктоза расщепляется в основном через путь Эмдена-Мейергофа (Conrad and Schlegel, 1977).

Ацетат ассимилируется практически всеми пурпурными несерными бактериями, при этом у пурпурных бактерий наблюдается большое разнообразие путей использования этого соединения. У многих бактерий первичная реакция метаболизма ацетата - это АТФ зависимое формирование ацетил-СоА, который является субстратом для дальнейших реакций. У большинства пурпурных бактерий присутствуют два дополнительных фермента, необходимых для использования ацетата - малатсинтаза и изоцитратлиаза (глиоксилатный цикл). Однако у некоторых видов, таких как Rba. sphaeroides, Rsp. rubrum и других, отсутствует один из ферментов глиоксилатного шунта, изоцитратлиаза. Более подробно метаболизм ацетата у фототрофных несерных бактерий будет рассмотрен в главе 1.2.2 "Гетеротрофный метаболизм".

Одноуглеродные соединения, такие как метанол, СО, формиат могут использоваться довольно небольшим количеством видов пурпурных несерных бактерий. Хороший рост на метаноле наблюдался лишь у вида Rps. acidophila (Douthit and Pfenning, 1976). Очевидно, что рибулозо-бисфосфатный путь вовлечен в ассимиляцию углерода у Rps. acidophila во время роста на метаноле или формиате. Оба субстрата здесь выступают в качестве доноров электронов (Quale and Pfenning, 1975, Sahm, et al., 1976). Rubrivivax gelatinosus может расти анаэробно в темноте, используя в качестве единственного источника углерода и энергии окись углерода. В этих условиях СО трансформируется в СОг и Нг. Образующийся СОг ассимилируется далее через цикл Кальвина (Uffen, 1983). Rsp. rubrum способен ассимилировать СО в фототрофных анаэробных условиях окисляя его до СОг через СО дегидрогеназу, чувствительную к кислороду (Bonam et al., 1989).

Большинству пурпурных несерных бактерий не требуются восстановленные соединения серы. В качестве источника серы они могут использовать сульфат. Сульфид, даже в низких концентрациях ингибирует рост многих пурпурных несерных бактерий. Однако некоторые виды могут использовать сульфид как донор электронов и их толерантность к этому соединению достаточно высока (Hansen and Imhoff, 1985, Imhoff, 1983a). Например, Rba. sulfidophilus обладает высокой устойчивостью к сульфиду и сопоставима с таковой у С. vinosum. Rm. vannielii выдерживает концентрации сульфида 23 мМ, в то время как рост Rba. capsulatus полностью прекращается при концентрации 2 мМ (Hansen and Gemerden , 1972).

Ни одна из пурпурных несерных бактерий, способных использовать сульфид как донор электронов, не накапливают элементарную серу (продукт окисления сульфида) внутри клетки, как это свойственно для серобактерий. Появление внеклеточной элементарной серы - заключительный этап окисление сульфида у Rba. sphaeroides, Rsp. rubrum, Rba. capsulatus (Hansen and Gemerden, 1972) и у Rsp. mediosalinum (Kompantseva and Gorlenko, 1984). У видов Rba. sulfidophilus, Rps. palustris, и Rps. sulfoviridis сульфид окисляется до сульфата без образования в качестве Ф промежуточного продукта элементарной серы (Hansen and Gemerden , 1972, Neutzling, et al., 1984). Кроме того, внеклеточная элементарная сера может являться промежуточным продуктом окисления сульфата, как это наблюдается у Rba. veldkampii, Rba. adriaticus и Rba. euryhalinus (Hansen and Imhoff, 1985, Neutzling, et al., 1984, Kompantseva, 1985, Brune, 1995, Glaeser and Overmann, 1999).

Многие пурпурные бактерии окисляют молекулярный водород, а некоторые в качестве единственного донора электронов при фотосинтезе используют соли двухвалентного железа (Ehrenreich and Widdel, 1994, Heising and Schink, 1998, Straub, et al., 1999).

Предпочтительным источником азота для большинства пурпурных бактерий является аммоний. Мочевину, аминокислоты используют некоторые виды как серных, так и несерных бактерий. Способность к ассимиляционной нитратредукции обнаружена у ограниченного числа видов (Т. roseopersicina, Ectothiorodospira shaposhnikovii, Rba. capsulatus, Rba. sphaeroides). Но рост с нитратом у этих бактерий значительно хуже, чем с другими источниками азота (Кондратьева, 1996). Ассимиляция нитратов ингибируется в присутствии ионов аммония и глутамата. Некоторые бактерии могут Ф использовать в качестве источника азота и нитриты. Кроме того, в качестве источника азота могут использоваться отдельными видами такие соединения как пептон, гидролизат казеина, различные пурины, пиримидины, а так же мочевая кислота. В анаэробных и микроаэробных условиях, при отсутствии других источников азота большинство пурпурных бактерий могут фиксировать молекулярный азот на свету и в TeMHOTe.(Winskill, 1983). Исключение составляют лишь некоторые виды Chromatium, Thiocystis sp. и Rhodocyclus purpureus.

Запасные вещества пурпурных бактерий - полифосфаты, поли-Р-гидроксибутират, у некоторых видов - глюкан типа гликогена.

Экологичесике ниши фототрофных а-протеобактерий, те анаэробные части вод и отложений, которые получают достаточное количество света, позволяющее осуществлять фототрофное развитие. Представители пурпурных несерных бактерий широко распространены в природе и были обнаружены в озерах, водоемах сточных вод, прибрежных лагунах и других водных средах обитания, а так же в сырых почвах и на полях. При этом, как правило, пурпурные несерные бактерии предпочитают среды с значительными количествами растворенного органического материала и низкой концентрацией кислорода. Они редко образуют цветные пятна, подобно тем, которые образуют серные бактерии. Однако их часто обнаруживают как спутники пурпурных серных бактерий в стратифицированных матах.

Большинство пурпурных несерных бактерий были выделены из пресноводных водоемов, но так же они встречаются в морской воде, и в областях, прилегающих к гиперсолончикам. Самое большое разнообразие видов было найдено в отложениях и воде эутрофных водоемов.

Пурпурные несерные бактерии, выделенные из пресных вод, имеют очень низкую устойчивость к сульфиду, в то время как толерантность к сульфиду у большинства морских изолятов намного выше, а многие даже используют сульфид и тиосульфат как донор электронов при фотосинтезе. Хотя некоторые виды, выделенные из морских сред обитания (Rps. palustris, и Rh.vannielii), не относятся к морским бактериям и не требуют соли для оптимального роста, большинство пурпурных несерных бактерий, найденных в морских средах обитания - типичные морские бактерии и не найдены в пресноводных средах обитания (Imhoff, 1988а). Морские формы включают виды родов Rhodovulum и Rhodobium (Neutzling, et al., 1984, Kompantseva, 1985, Imhoff, 1983a). Такой вид как Roseospira mediosalina был изолирован из горячего источника с низкими концентрациями соли (2 %) и рост этой бактерии оптимален при 5-7 % NaCl ((Kompantseva and Gorlenko, 1984).

Представители пурпурных несерных бактерий не достигают высокой численности в природных условиях, видимо, потому, что конкурируют за органические субстраты с хемоорганогетеротрофными микроорганизмами. В условиях стабильного анаэробиоза они менее конкурентоспособны по сравнению с пурпурными серобактериями

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Филатова, Людмила Владимировна

Выводы.

1. Анаплеротической последовательностью, используемой Rba. sphaeroides для ассимиляции ацетата в качестве единственного источника углерода и электронов является цитрамалатный цикл. Конверсия ацетата до глиоксилата у Rba. sphaeroides осуществляется в результате функционирования следующей последовательности реакций: ацетил-СоА + пируват —* цитрамалат —► мезаконат —> мезаконил-СоА —* 3-метилмалил-СоА —* глиоксилат + пропионил-СоА.

2. Регенерация пирувата из пропионил-СоА у Rba. sphaeroides, так же как и у Rsp. rubrum, происходит в результате функционарования следующей последовательности реакций: пропионат (+СО2)—>сукцинат —» фумарат —> малат —» оксалоацетат —> пируват.

3. Несмотря на участие в ЦМ-цикле пропионил-СоА карбоксилазы бикарбонат не стимулирует ассимиляцию ацетата. Причиной отсутствия стимулрующего действия бикарбоната на рост и ассимиляцию ацетата у Rba. sphaeroides является высокая скорость выделения СО2 в процессе метаболизма ацетата и наличие у клеток слизистой капсулы. Это позволяет Rba. sphaeroides накапливать в среде и в клетках концентрацию бикарбоната достаточную для эффективного функционирования пропионил-СоА карбоксилазы — лимитирующего этапа ЦМ-цикла.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филатова, Людмила Владимировна, Москва

1. Ивановский Р.Н. (1985). Метаболизм фототрофных бактерий в разных условиях роста. Автореф.дисс. доктор.биол. наук. — 9 с.

2. Ивановский Р.Н., Родова Н.А. (1975). Состав и содержание цитохромов у Rhodopseudomonas palustris в зависимости от условия роста // Микробиология. Т. 44. N 1. С. 16-22.

3. Кондратьева Е.Н. (1996). Автотрофные прокариоты. //Изд-во МГУ, Москва

4. Кондратьева Е.Н (1989). Способность фототрофных бактерий к хемоавтотрофии. Под. ред. М.В. Иванова. Хемосинтез: к 100-летию открытия С.Н. Виноградским. //Наука, М., С. 139-147.

5. Кондратьева Е.Н., Красильникова Е.Н. (1989). Фототрофные бактерии как продуценты поли-Р-гидроксибутирата //Прикладная биохимия и микробиология Т.-25. N.-6. С. 785-789.

6. Красильникова Е.Н. (1970). Изоцитратлиазная активность фотосинтезирующих бактерий в зависимости от присутствия углекислоты. //Научн.докл.высш. школы, биол. науки. С. 78-81.

7. Романова А.К. (1980). Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. //Наука, Москва.

8. Фирсов Н.Н., Ивановский Р.Н. (1975). Фотометаболизм ацетата у Ectothiorhodospira shaposhnikovii. //Микробиология Т.-44. С.197-201.

9. Albers Н., Gottschalk G. (1976). Acetate metabolism in Rhodopseudomonas gelatinosa and several other Rhodospirillaceae. Arch. Microbiol. V. 111.- P. 45-49.

10. Anderson L., Fuller R .(1967). Photosynthesis in Rhodospirillum rubrum. In: Metabolic control of reductive pentose phosphate and tricarboxylic acid cycle enzymes. Plant Physiol., pp 497-502.

11. Barker H.A., (1967). Citramalate lyase of Clostridium tetanomorphum. Arch1. Mikrobiol V.-59. pp.4-12

12. Bassham J.A., Calvin M. (1957). The path of carbon in photosintesis. In. Prentice Hall, Engelewood Cliffs, NJ, pp. 104

13. Beatty J.T., Gest H. (1981). Biosynthetic and bioenergetic funtion of acid cycle reaction in Rhodopseudomonas capsulata. J. Bacteriol. V.-148. pp.584-593

14. Bellion E, Kelley R.L. (1979). Inhibition by itaconate of growth of methylotrophic bacteria. J. Bacteriol. V.-138. pp. 519-22

15. Benedict C.R. (1962). Early products of I4C.acetate incorporation in resting cells of Rhodospirillum rubrum. Biochim. Biophys. Acta. V.-56. pp. 618620

16. Bentley R., Thiessen C.P. (1957). Biosynthesis of itaconic acid in Aspergillus terreus. I. Tracer studies with C14-labeled substrates. J. Biol. Chem. V. 226. pp.673-687

17. Berg I.A., Filatova L.V., Ivanovsky R.N. (2002). Inhibition of acetate and propionate assimilation by itaconate via propionyl-CoA carboxylase in isocitrate lyase-negative purple bacterium Rhodospirillum rubrum. FEMS Microbiol. Lett.

18. Berg I.A., Krasil'nikova E.N., Ivanovskii R.N. (2000). Investigation of the dark metabolism of acetate in photoheterotrophically grown cells of Rhodospirillum rubrum. Microbiology (translated from Mikrobiologiya) V.-69. pp. 13-18

19. Berg, P. (1956). Acyladenylates: an enzymatic mechanism of acetate activation. J. Biol. Chem. V.- 222. pp. 991-1013.

20. Bergey's manual of systematic bacteriology (2001). The Archae and the deeply branching and phototrophic Bacteria. In: Boone, D. R., Castenholz, R. W., and Garrity, G. M. (eds), 2 edn. Springer, New York, Berlin, Heidelberg.

21. Blasco R., Cardenas J., Castillo F. (1989). Acetate metabolism in purple non-sulfur bacteria. FEMS Microbiol. Lett. V.-58. pp. 129-132.

22. Blasco R. Cardenas J., Castillo F. (1991). Regulation of isocitrate lyase in Rhodobacter capsulatus E1F1. Curr Microbiol V.-22. pp.73-76.

23. Bowes G., Ogren W.L., Hagerman R.H. (1971). Phosphoglycolate production catalyzed by ribulose diphosphate carboxylase. Biochem. Biophys. res. Commun. V.- 45. pp.716-722.

24. Bowien В. (1989). Molecular biology of carbon dioxide assimilation in aerobic chemolithotrophs. In: Ed. by Schlegel, H. G. and Bowien B. (ed) Autotrophic bacteria. Sciens. Tech. Publisher, Madison, pp. 437-460.

25. Brock M., Fischer R., binder D., Buckel W. (2000). Methylcitrate synthase from Aspergillus nidulans: implications for propionate as an antifungal agent. Mol. Microbiol. V.-35. pp.961-973.

26. Brune D.C., (1995). Sulfur compounds as photosynthetic electron donors. In: Blankenship, R. E., Madigan, M. Т., and Bauer, С. E. (eds). Anoxygenic photosynthetic bacteria. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 885914.

27. Buchanan B.B., Evans M.C.W., Arnon D.I. (1967). Ferredoxin-dependent carbon assimilation in Rhodospirillum rubrum. Arch. Microbiol. V.-59. pp.32-40.

28. Buckel W., Barker H.A. (1974). Two pathways of glutamate fermentation by anaerobic bacteria. J. Bacteriol. V.-l 17. pp. 1248-1260.

29. Buckel W, Bobi A (1976) The enzyme complex citramalate lyase from Clostridium tetanomorphum. Eur. J. Biochem. V.-64. pp.255-62.

30. Campbell L., Nolla H.A., Vaulot D. (1994). The importance of Prochlorococcus to community structure in the central North Pacific Ocean. Limnol. Oceanogr. V.-39. pp.954-961.

31. Charon N.W., Johnson R.C., Peterson D. (1974). J. Bacteriol. V.-l 17. pp.203-211.

32. Claassen P.A.M., Zehnder A.J.B. (1986). Isocitrate lyase activity in Thiobacillus versutus grown anaerobically on acetate and nitrate. J. Gen. Microbiol. V.-132. pp.3179-3185.

33. Corzo R.H., Tatum E.L. (1953). Biosynthesis of itaconic acid. Federation Proc. V.-12. pp.470-474.

34. Cox R.B., Quayle J.R., (1976). Synthesis and hydrolysis of malylcoenzymeA by Pseudomonas AMI: an apparent malate synthase activity. J. Gen. Microbiol. V.-95. pp. 121-133.

35. DeBont J.A.M., Scholten A., Hansen T.A. (1981). DNA-DNA hybridization of Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas sphaeroides, and Rhodopseudomonas sulfidophila strain. Arch. Microbiol. V.-128. pp.271274.

36. Dixon G.H., Kornberg H.L. (1959). Assay methods for key enzymes of glyoxylate cycle. Biochem. J. V.-72. pp. 195-200.

37. Douthit H.A., Pfenning N. (1976). Isolation and growth rates of methanol utilizing Rhodospirillaceae. Arch. Microbiol. V.-107. pp.233-234.

38. Dunstan P.M., Anthony C., Drabble W.T. (1972). Microbial metabolism of C| and C2 compounds: the involvement of glycollate in the metabolism of ethanol and of acetate by Pseudomonas AMI. Biochem. J. V.-128. pp.99106.

39. Dunstan R.H., Kelley B.C., Nicholas D.J.D. (1982). Fixation of dinitrogen derived from denitrification of nitrate in a photosynthetic bacterium, Rhodopseudomonas sphaeroides forma sp. denitrificans. J. Bacterid. V,-150. pp. 100-104.

40. Dutton P.L., Evans W.C., (1978). Metabolism of aromatic compounds by Rhodospirillaceae. In: The photosynthetic bacteria, Clayton, R.K. //Sistrom, W.R edn. Plenium Press, New York, pp. 719-726.

41. Eggerer H., Remberger U., Grunewalder C.H. (1964). Biochem. V.- 339. pp.436-453.

42. Ehrenreich A., Widdel F. (1994). Anaerobic oxidation of ferrous iron by purple bacteria, a new type of phototrophic metabolism. Appl. Environ. Microbiol. V.-60. pp.4517-4526.

43. Eikmanns В., binder D., Thauer R.K., (1983). Unusual pathway of isoleucine biosynthesis in Methanobacterium thermoautotrophicum. Arch. Microbiol. V.-136. pp.111-113.

44. Eisenreich W., Strauss G., Werz U., Fuchs G., Bacher A. (1993). Retrobiosynthetic analysis of carbon fixation in the phototrophic eubacterium Chloroflexus aurantiacus. Eur. J. Biochem. V.-215. pp.619632.

45. Eley JH., Knobloch K., Han T.W. (1979). Effect of growth condition on enzymes of the citric acid cycle and the glyoxylate cycle in the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris. Antonie Van Leeuwenhoek. V.-45. pp.521-529.

46. Ferguson S.J., Jakson J.B., McEwan A.G. (1987). Anaerobic respiration in the Rhodospirillaceae: characterisation of pathways and evaluation of roles in redox balancing during photosynthesis. FEMS Microbiol. Reviews. V.-46. pp.l 17-143.

47. Gerike U., Hough D.W., Russell N.J., Dyall-Smith M.L., Danson MJ. (1998). Citrate synthase and 2-methylcitrate synthase: structural, functional and evolutionary relationships. Microbiology V.-144. ( Pt 4). pp.929-935.

48. Gerritse J., Gottschal J.C., (1993). Oxic and anoxic growth of a new Citrobacter species on amino acids. Arch. Microbiol. V.-160. pp.51-61.

49. Giachetti E., Pinzanti G., Vanni P. (1984). A new continuous optical assay for isocitrate lyase. Experimentia V.-40. pp.227-228.

50. Gich F.B et al. (2000). A deepper insight into the ecology, the pigment composition and the phylogeny of the filamentous green nonsulfur bacterium Chloronema sp. In: 10th International symposium on phototrophic procaryotes. Barselona, Spain, pp. 123.

51. Glaeser J., Overmann J. (1999). Selective enrichment and characterisation of Roseospirillum parvum, gen. nov. and sp. nov., a new purple nonsulfur bacterium with unusual light absorption properties. Arch. Microbiol. V.-171. pp.405-416.

52. Glover J., Kamen M.D., Van Genderen H. (1952). Studies on the metabolism of photosynthetic bacteria. XII. Comparative light and dark metabolism of acetate and carbonate by Rhodospirillum rubrum. Arch. Biochem. Biophys. V.-35. pp.384-408.

53. Gray C.T., Kornberg H.L. (1960). Enzymic formation of citramalate from acetyl-coenzyme A and pyruvate in Pseudomonas ovalis Chester, catalysed by "pyruvate transacetase". Biochim. Biophys. Acta V.-42. pp.371-372.

54. Han L, Reynolds K.A. (1997). A novel alternate anaplerotic pathway to the glyoxylate cycle in streptomycetes. J. Bacterio.l V.-179. pp. 5157-5164.

55. Hansen T.A., Gemerden H. (1972). Sulfide utilization by nonsulfur bacteria. Arch. Mikrobiol. V.-86. pp.49-56.

56. Hansen T.A., Imhoff J.F. (1985). Rhodobacter veldkampii, a new species of phototrophic purple nonsulfur bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. V.-35. pp. 115-116.

57. Harwood C.S., Gibson J. (1988). Anaerobic and aerobic metabolism of diverse aromatic compounds by the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris. Appl. Environm. Microbiol. V.-54. pp. 712717.

58. Heising S., Schink B. (1998). Phototrophic oxidation of ferrous iron by a Rhodomicrobium vannielii strain. Microbiology, V.-144. ( Pt 8). Pp. :2263-2269.

59. Herter S et al. (2001). Autotrophic C02 fixation by Chloroflexus aurantiacus: study of glyoxylate formation and assimilation via the 3-hydroxypropionate cycle. J. Bacteriol. V.-183. pp. 4305-4316.

60. Hofmeister A.E., Buckel W. (1992). (R)-lactyl-CoA dehydratase from Clostridium propionicum. Stereochemistry of the dehydration of (R)-2-hydroxybutyryl-CoA to crotonyl-CoA. Eur. J. Biochem. V.-206. pp. 547552.

61. Holo H., Sirevag R. (1986). Autotrophic growth and C02 fixation of Chloroflexus aurantiacus. Arch. Microbiol. V.-145. pp. 173-180.

62. Horswill A.R., Escalante-Semerena J.C. (1999). Salmonella typhimurium LT2 catabolizes propionate via the 2-methylcitric acid cycle. J. Bacteriol. V.-181. pp. 5615-5623.

63. Howell D.M., Xu H., White R.H. (1999). (R)-citramalate synthase in methanogenic archaea. J Bacteriol V.-181. pp. 331-333.

64. Hsu R.Y., Lardy H.A. (1969). Malic enzyme. Methods Enzymol. V.-13. pp. 230-235.

65. Imhoff J.F. (1989). Genius Rhodobacter. In: Staley, J. Т., Bryant, M. P., Pfennig, N., and Holt, J. G. (eds) Bergey's manual of systematic bacterioligy. Williams and Wilkins Baltimore, pp. 1668-1672.

66. Imhoff J.F. (1988a). Halophilic phototrophic bacteria. In: Rodriques-valera, F. (ed) Halophilic Bacteria. CRC Press. Boca. Raton, FL, pp. 85-108.

67. Imhoff J.F. (1983a). Rhodopseudomons marina sp. nov., a new marine phototrophic purple bacterium. Syst. Appl. Microbiol. V.-4. pp. 512-521.

68. Imhoff J.F. (1995). Taxonomy and physiology of phototrophic purple and green sulfur bacteria. In: Blankenship, M. T. and Madigan, С. E. (eds) Anoxygenic photosynthetic bacteria. Kluwer Academic Publisher, Bauer.-Dordrecht, pp. 1-15.

69. Inui M., Nakata K., Roh L.H., Zahn K., Yukawa H. (1999). Molekular and functional characterization of Rhodopseudomonas palustris No. 7phosphoenolpyruvate carboxykinase gene. J. Bacteriol. V.-181. pp. 26892696.

70. Ivanovskii R.N., Krasil'nikova E.N., Berg I.A. (1997). The mechanism of acetate assimilation in the purple nonsulfur bacterium Rhodospirillum rubrum lacking isocitrate lyase. Microbiology (translated from Mikrobiologiya) V.-66. pp. 744-749.

71. Ivanovsky R.N., et al. (1999). Evidence for the presence of the reductive pentose phosphate cycle in a filamentous anoxygenic photosynthetic bacterium, Oscillochloris trichoides strain DG-6. Microbiology 145 ( Pt 7): 1743-8

72. Ivanovsky R.N., Krasilnikova E.N., Berg I.A. (1997). A proposed citramalate cycle for acetate assimilation in the purple non-sulfur bacterium Rhodospirillum rubrum. FEMS Microbiol. Lett. V.-153. pp. 399-404.

73. Janssen P.H., Harfoot C.G. (1987). Phototrophic growth on n-fatty acids by members of the family Rhodospirillaceae. System. Appl. Microbiol. V.-9. pp. 9-11.

74. Kato Y., Asano Y. (1997). 3-Methylaspartate ammonia-lyase as a marker enzyme of the mesaconate pathway for (S)-glutamate fermentation in Enterobacteriaceae. Arch. Microbiol. V.-168. pp. 457-463.

75. Kikuchi G., Tsuiki S., Muto A., Yamada H. (1963). Metabolism of carboxylic acids in non-sulfur purple bacteria under light-anaerobic conditions. In: Microalgae & Photosynthetic Bacteria. Pp. 547-565.

76. Kimble L., Madigan M. (1992). Nitrogen fixation and nitrogen metabolism in heliobacteria. Arch. Microbiol. V.-158. pp. 155-161.

77. Klemme J.H., Chyla I., Preuss M. (1980.) Dissimilatory reduction by strains of the facultative phototrophic bacterium Rhodopseudomonas palustris. FEMS Microbiol. V.-9. pp. 137-140.

78. Kompantseva E.I. (1985). Rhodobacter euryhalinus new-species a new halophilic purple bacterial species. Mikrobiologiya V.-54. pp. 974-981.

79. Kompantseva E.I., Gorlenko V.M. (1984). A new species of moderately halophilic purple bacterium Rhodospirillum mediosalinum sp. nov.

80. Mikrobiologiya V.-53. pp. 954-961.

81. Kondratieva E.N., Ivanovsky R.N., Krasilnikova E.N. (1981). Light and dark metabolism in purple sulfur bacteria. In: Skulachev, V. P. (ed) Soviet Science Review. IPC Science and Technology Press, Guilford, England, New York, pp. 325-364.

82. Kornberg H.L., Gotto A.M. (1961). The metabolism of C2 compounds in microorganisms. 6. Synthesis of cell constituents from glycollate by Pseudomonas sp. Biochem. J. V.-78. pp. 69-82.

83. Kornberg H.L., Lascelles J. (1960). The formation of isocitratase by the Athiorhodaceae. J. Gen. Microbiol. V.-23. pp. 511-517.

84. Korotkova N., Chistoserdova L., Kuksa V., Lidstrom M.E. (2002). Glyoxylate regeneration pathway in the methylotroph Methylobacterium extorquens AMI. J Bacteriol. V.-184. pp. 1750-1758.

85. Kortstee G.J.J. (1980). The homoisocitrate-glyoxylate cycle in pink, facultative methylotrophs. FEMS Microbiol. Lett. V.-8. pp. 59-65.

86. Kuchta R.D., Abeles R.H. (1985). Lactate reduction in Clostridium propionocum. Purification and properties of lactyl-CoA dehydratase. J. Biol. Chem. V.-260. pp. 13181-13189.

87. Ladd J.N., Walker D.J. (1959). The fermentation of lactate and acrylate by the rumen micro-organism LC. Biochem. J. V.-71. pp. 364-373.

88. Loken O., Sirevag R. (1982). Evidence for the presence of the glyoxylate cycle in Chloroflexus. Arch. Microbiol. V.-132. pp. 276-279.

89. London R.E., Allen D.L., Gabel S.A., DeRose E.F. (1999). Carbon-13 nuclear magnetic resonance study of metabolism of propionate by Escherichia coli. J. Bacteriol. V.-181. pp. 3562-3570.

90. Losada M., Canovas J.L., Ruiz-Amil M. (1964). Oxaloacetate, citramalate and glutamate formation from pyruvate in baker's yeasts. Biochem. Z. V.-340. pp. 60-74.

91. Losada M., Trebst A.V., Ogata S., Arnon D.I. (1960). Equivalence of light and adenosine triphosphate in bacterial photosynthesis. Nature V.-186. pp. 753-760.

92. Lowry O.H., Rosenbrough M.S., Farr A.L., Randall R.S. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. V.-193. pp. 265275.

93. Madigan M.T., Gest H. (1979). Growth of photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas capsulata chemoautotrophically in darkness with H2 as energy source. J. Bacteriol. V.-137. pp. 524-530.

94. McEwan A.G., Ferguson S.J., Jackson J.B. (1984). Rationalization of properties of nitrate reductases in Rhodopseudomonas capsulata. Arch. Microbiol. V.-137. pp. 344-349.

95. McFadden B.A., Shively L.M. (1991). Bacterial assimilation of carbon dioxide by the Calvin cycle. In: Ed. by Shively, L. M and Barton, L. L. (eds) Variations in autotrophic life. Acad. Press, London, pp. 25-49.

96. Neutzling O., Imhoff J.F., Truper H.G. (1984). Rhodopseudomonas adriatica sp. nov., a new species of the Rhodospirillaceae, dependent on reduced sulfur compounds. Arch. Microbiol. V.-137. pp. 256-261.

97. Nielsen A.M., Rampsch B.J., Sojka G.A. (1979) regulaton of isocitrate lyase in a mutant of Rhodopseudomonas capsulata. Arch. Microbiol. V.-120. pp. 43-46.

98. Ohmori H., Ishitani H., Sato K., Shimizu S., Fukui S. (1971). Vitamin B12 dependent glutamate mutase activity in photosynthetic bacteria. Biochem. Biophys. Res. Commun. V.-43. pp. 156-162.

99. Olson J.M., Pierson B.K. (1987). Evolution of reaction centers in photyosynthetic prokaryotes. Int. Rev. Cytol. V.-108. pp. 209-248.

100. Ormerod J.G., Ormerod K.S., Gest H. (1961). Light-dependent utilization of organic compounds and photoproduction of molecular hydrogen by photosynthetic bacteria; relationships with nitrogen metabolism. Arch. Biochem. and Biophys. V.-94. pp. 449-463.

101. Osumi Т., Ebisuno Т., Nakano H., Katsuki H. (1975). Formation of beta-methylmalate and its conversion to citramalate in Rhodospirillum rubrum . J. Biochem. (Tokyo) V.-78. pp. 763-772.

102. Osumi Т., Katsuki H. (1977). A novel pathway for L-citramalate synthesis in Rhodospirillum rubrum. J. Biochem. (Tokyo) V.-81. pp. 771-778.

103. Payne J., Morris J.G. (1969). Acetate utilisation by Rhodopseudomonas spheroides. FEBS Lett. V.-4. pp. 52-54.

104. Peters R.A., Wakelin R.W., Rivett D.E.A., Thomas L.C. (1953). Fluoroacetate poisoning: comparison of synthetic fluorocitric acid with the enzymically synthesized fluorotricarboxylic acid. Nature V.-l71. pp. 11111112.

105. Pfennig N. (1989.) Multicellular filamentous green bacteria. In: Staley, J. Т., Briant, M. P., Pfennig, N., and Holt, J. G. (eds) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore, pp. 1697-1707.

106. Phillips A.T., Nuss J.I., Moosic J., Foshay C. (1972). Alternate pathway for isoleucine biosynthesis in Escherichia coli. J. Bacteriol. V.-l09. pp. 714719.

107. Porter J., Merrett M.J. (1972). Influence of light intensity on reductive pentose phosphate phosphate cycle activity during photoheterotrophic growth of Rhodospirillum rubrum. Plant. Physiol. V.-50. pp. 252-255.

108. Pronk J.T., van der Linden-Beuman A., Verduyn C., Scheffers W.A., van Dijken J.P. (1994). Propionate metabolism in Saccharomyces cerevisiae: implications for the metabolon hypothesis. Microbiology V.-l40. N.- 4. pp. 717-722.

109. Quale J.R., Pfenning N. (1975). Utilization of metanol by Rhodospirillaceae. Arch. Microbiol. V.-l02. pp. 193-198.

110. Quayle J.R., Fuller R.C., Benson A.A., Calvin M. (1954). Enzymatic carboxylation of ribulose diphosphate. J. Am. Chem. Soc. V.-76. pp. 36103611.

111. Rao G.R., McFadden B.A. (1965). Isocitrate lyase from Pseudomonas indigofera. IV. Specificity and inhibition. Arch. Biochem. Biophys. V.12. pp. 294-303.

112. Reed L.J., Mukherjee B.B. (1969). a-Ketoglutarate dehydrogenase complex from Escherichia coli. Methods Enzymol. V.-13. pp. 55-61.

113. Sahm H., Cox R.B., Quale J.R. (1976). Metabolism of methanol by Rhodopseudomonas acidophila. J. Gen. Microbiol. V.-94. pp. 313-322.

114. Sarles L.S., Tabita F.R. (1983). Derepression of the synthesis of D-ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from Rhodospirillum rubrum. J. Bacteriol. V.-153. pp. 458-464.

115. Sasaki K., Katsuki H. (1973). Enzymatic cleavage of (+)citramalate into pyruvate and acetyl-CoA in Bacillus sp. J. Biochem. V.-73. pp. 599-608.

116. Sasaki Т., Motokawa Y., Kikuchi G. (1970). Occurrence of both a-type and o-type cytochromes as the functional terminal oxidases in Rhodopseudomonas sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta. V.-197. pp. 284291.

117. Satoh Т., Hoshino Y., Kitamura H. (1976) .Rhodopseudomonas sphaeroides f. sp. denitrificans, a denitrifying strain as a subspecies of Rhodopseudomonas sphaeroides. Appl. Microbiol. V.-108. pp. 256-269.

118. Schafer S., Paalme Т., Vilu R., Fuchs G. (1989). 13C-NMR study of acetate assimilation in Thermoproteus neutrophilus. Eur. J. Biochem. V.-186. pp. 695-700.

119. Schultz J.E., Weaver P.F. (1982). Fermentation and anaerobic respiration by Rhodospirillum rubrum and Rhodopseudomonas capsulata. J. Bacteriol. V.-149. pp. 181-190.

120. Shenoy B.C. et al. (1992). The impportence of methionine residues of the catalysis of the biotin enzyme, transcarboxylase. J. of Biol. Chem. V.-267. pp. 18407-18412.

121. Shimi I.R., Nour Е.1., Dein M.S. (1962). Biosynthesis of itaconic acid by Aspergillus terreus. Arch. Mikrobiol. V.-44. pp. 181-188.

122. Smith R.E., MacQuarrie R. (1979). The role of cysteine residues in the catalytic activity of glycerol-3-phosphate dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta. V.-567. pp. 269-277.

123. Straub K.L., Rainey F.A., Widdel F. (1999). Rhodovulvum iodosum sp. nov. and Rhodovulvum robiginosum sp. nov., two new marine phototrophic ferrous-iron-oxidizing purple bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. V.-49. pp. 729735.

124. Strauss G., Fuchs G. (1993). Enzymes of a novel autotrophic CO2 fixation pathway in the phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus, the 3-hydroxypropionate cycle. Eur. J. Biochem. V.-215. pp. 633-643.

125. Subhash C.G., Dekker E.E. (1984). J. Biol. Chem. V.-259. pp. 10012-10019.

126. Suzuki S., Osumi Т., Katsuki H. (1977). Properties and metabolic role of mesaconate hydratase of an aerobic bacterium. J. Biochem. (Tokyo) V.-81. pp. 1917-1925.

127. Tabita F.R. (1988). Molecular and cellular regulation of autotrophic carbon dioxide fixation in microorganisms. Microbiol. Rev. V.-52. pp. 155-189.

128. Tabuchi Т., Serizawa N., Uchiyama H. (1974). A novel pathway for the , partial oxidation of propionyl-CoA to pyruvate via seven-carbontricarboxylic acids in yeasts. Agr. Biol. Chem. V.-38. pp.2571-2572.

129. Textor S et al. (1997). Propionate oxidation in Escherichia coli: evidence for operation of a methylcitrate cycle in bacteria. Arch. Microbiol. V.-168. pp. 428-436.

130. Thauer R.K., Rupprecht E., Jungermann K. (1970). Glyoxylate inhibition of clostridial pyruvate syntase. FEBS Lett. V.-9. pp. 271-273.

131. Tholozan J.L., Samain E., Grivet J.P., Albagnac G. (1990). Propionate metabolism in a methanogenic enrichment culture. Direct reductive carboxylation and acetogenesis pathway. FEMS Microbiol. Ecol. V.-73. pp. 291-298.

132. Ueda S., Sato K., Shimizu S. (1981). Glyoxylate formation from mesaconyl-CoA and its related reactions in a methanol-utilizing bacterium, Protaminobacter ruber. Agr. Biol. Chem. V.-45. pp. 823-830.

133. Uffen R.L. (1978). Fermentative metabolism and growth of photosynthetic bacteria. In: the Photosynthetic bacteria, Clayton, R.K. //Sistrom, W.R. edn. Plenum Press, New York, pp. 857-872.

134. Valentine W.N., Tanaka K.R. (1966). Pyruvate kinase: clinical aspects. Methods Enzymol. V.-9. pp. 468-473.

135. Vermaas W.F.J. (1994). Evolution of heliobacteria: implication for photosynthetic reaction centre complexes. Photosynth. Res. V.-41. pp. 285294.

136. Vollbrecht D. (1974). Three pathways of isoleucine biosynthesis in mutant strains of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. V.-362. pp. 382-389.

137. Watson G.M., Yu J.P., Tabita F.R. (1999). Unusual ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase of anoxic Archaea. J Bacteriol. V.-181. pp. 1569-1575.

138. Wegener W.S., Reeves H.C., Rabin R., Ajl S.J. (1968). Alternate pathways of metabolism of short-chain fatty acids. Bacteriol. Rev. V.-32. pp. 1-26.

139. Williams J.O., Roche Т.Е., McFadden B.A. (1971). Mechanism of action of isocitrate lyase from Pseudomonas indigo/era. Biochemistry V.-10. pp. 384390.

140. Willison J.C. (1993). Biochemical genetics revisited: the use of mutants to study carbon and nitrogen metabolism in the photosynthetic bacteria. FEMS Microbiol. Reviews V.-104. pp. 1-38.

141. Winskill N. (1983). Tricarboxylic acid cycle activity in relation to itaconic acid biosynthesis by Aspergillus terreus. J. Gen. Microbiol. V.-129. pp. 2877-2883.

142. Yakunin A.F., Hallenbeck P.C. (1997). Regulation of synthesis of pyruvate carboxylase in the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus . J. Bacteriol. V.-179. pp. 1460-1468.

143. Yamada Т., Kikuchi G. (1968). Inhibition of the metabolism of carboxylic acids and amino acids^by citramalate and other related compounds in Rhodopseudomonas sphdroides. J. Biochem. (Tokyo) V.-63. pp. 462-471. </

144. Yoshida A.(1969). L-Malate dehydrogenase from Bacillus subtilis. Methods

145. Enzymol. V.-13. pp. 141-145.m