Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биология пресноводных аэробных бактерий, содержащих бактериохлорофилл А

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биология пресноводных аэробных бактерий, содержащих бактериохлорофилл А"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

институт гмрошолопш

На правах рукописи УДК 579.81.053.

ЮРКОВ Владимир Валентинович

Биология пресноводных аэробных бактерий, содержащих бактериохлорофиял а

Специальность 03.00.07 - микробиология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Иксти-туте микробиологии АН СССР Научный руководитель: доктор биологических наук В.М.Горленко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Р.Н.Ивановский

кандидат биологических наук Л.М.Герасименко

Ведущее учреждение: Институт почвоведения и Фотосинтеза АН СССР

¿адата ^диссертации состоится ■ 6 " 991 г.'

в /^-£-^часов на заседании специализированного совета Д. 002.64.01. в Институте микробиологии АН СССР по адресу: 117312, г.Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан "

1990г.

о-—

Ученый секретарь специализированного совета, к.б.н. с^Сос^*^***** Л.Е.Никитин

[ I

' !

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Фототрофные бактерии являются важными объектами изучения фотосинтеза, его эволюции, азотфиксаши, метаболизма углерода, серы, а также при решении других проблем общебиологического и прикладного значения.

Аэробные бактерии родов Етх№гоЪасгег и НозеоЪасЪег, содержащие бактериохлорофилл а, предположительно находятся в родстве с несерньми пурпурными бактериями, представляют особый интерес с точки зрения таксономии и эволюции. Для этих аэробных фототрофов, не выделяющих кислород в процессе фотосинтеза, свет является дополнительны;/ источником энергии. Однако, меха'пггм фотосинтеза нмэ-ет существенные отличия от фотосинтеза других фототрофных бактерий.

Описанные ранее штаммы родов Егу-ЬЬго'ЬасЪег ИйоБеоЬа^ег являются умеренными галофилаии. Они были выделены с поверхности морских растений или из морских донных осадков.

Представляет интерес изучение распространения подобных бактерий в пресноводных экосистемах. С этой целью бьии исследова.-с:.. альгобактериальные маты, формирующиеся при умеренных температурах в области выходка щелочных термальных источников.

Выделение и таксономическое исследование новых, ранее не известных видов и родов аэробных бактерий, содержащих бактериохлорофилл а, расширит представление о дивергированносги этой группы микроорганизмов. Детальное изучение их морфология, цитология, пигггент-ного состава, темнового и светозависи?/ого метаболизма позволят глубже разобраться в уникальном, характерном для них, типе бактериального фотосинтеза.

Цель и задачи исследования. Долью нзстогпцз.Ч работы яшлось изучение экологии, морфо-фнзиояогичзскнх особенностей, метаболизма и таксоною1ческого статуса новых втагаов пресноводных азройггх бактерия, содерзагих бактериохлорофилл а.

Б этоП связи были посчявяены следуйте задачи:

1. Выделить из цкснобактертальних !.!Этоп, разгиЕСкплхея в горячих и теплых источниках, культура аэробшх бактерий, содержащих бактериохлорофилл а.

2. Изучить из морфхз-физиологичаские своЗстса с цзльи таксономического описания. Используя метод молекулярной ДКК-ДНК гибридизации, определить систематическое полозегае косых нт2.жов.

3. Изучить особенности углеродного уетзболигмэ ногого ЕИдаЕгуЬЬ-

гоЬасгЬег.'

4. Исследовать способность выделенных видов к использованию восстановленных серных соединений.

5. Проанализировать влияние света и кислорода на метаболизм вы* деленных бактерий.

Научная новизна. Дано таксономическое описание двум новым родам - Егу^ЬгошасгоЫип И Нозевсоссиз и шести новым видам -йозеооосоал ЪЫ.ози1£аЬорЫ1из, Ег^Ьгаш.сг«Ъ1иа з1Ыг1сиз, Еи.игз1псо1а, Вш.еготЛсиз, Ет.Ъуйго1у1;1сиз, Ет.гапоБиз пресноводных, аэробных бактерий, содержащих бактериохлорофилл а.

Впервые подробно изучены пути метаболизма органических кислот и Сахаров у данной физиологической группы .микроорганизмов.

У двух видов ( Н.-Ы1±оги1£а^орЬИаэ и Кп.11ус1го1у1;1сиз) установлена, ранее не известная, способность к использованию восстановленных соединений серы С тиосульфата) в диссимиляторном метаболизме. Изучены биохимические пути окисления тиосульфата у этих бактерий.

Теоретическая значимость. Существенно расширено представление об экологии, разнообразии свойств и филогенетической дивергирован-ности группы аэробных фотосинтезирующих бактерий, содержащих бактериохлорофилл а.

Практическая ценность. Выделенные микроорганизмы с необычным типом фотосинтеза открывают новые практические возможности для реализации биоконверсии солнечной энергии. Некоторые штаммы могут быть продуцентами поли-£-оксимасляной кислоты и полисахаридов, гидролитических ферментов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на У1 Симпозиуме "Фототрофные прокариоты" ( Нидерланды, 1988 >.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 и сдано в печать II работ.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, 9 глав, включающих обзор литературы и экспериментальную часть, заключения и выводов. Раббта изложена на 152 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 27 рисунков. Список литературы содержит 13 отечественных и 102 иностранных наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектами лабораторных исследований служили чистые культуры аэробных бактерий, содержащих бактериохлорофилл а, вьщеленнке на--ми из термальных источников.

На содержание бактериохлорофилла а в клетках было проверено порядка 120 штаммов аэробных пигментированных бактерий,' Из них выявлено.8 штаммов с бактериохлорофиллом а - EB-16-17J ВВ-?а? НЗ-7; KE-99S E-I; Е4(1); Е4(2); Е-5.

В экспериментах по молекулярной ДНК-ДНК гибридизации были использованы также типовые штаммы Rhodobacte:? sphaereid.es АТСС, Bhodobaoter capsulatus BSM и Rhodocyclus gelatinosus DSM.

При изучении светозависимого метаболизма для сравнения использовали -штамм пурпурной несерной бактерии Ehodepseudenonas Plastica,

»выделенный нами из Бодьяереченского термального источника.

Объектами полевых исследований служили Болъшереченские и Езовские термальные источники. ПолеЕыэ работы проводились в 1986 и 198Э годах.

Методы полевых исследований.

Больаую часть физико-химических определений проводили в полевых условиях.

Температуру воды определяли ртутным максимальным термометром. pH среды и окислительно-восстановительный потенциал измеряли потен-циометрически на полевом йономере И-102. Кислород в воде источников определяли методом Винклера ( Резников с соавт.,1970). Поскольку вода содержала сероводород, в пробы предварительно вносили . ацетат кадмия. В результате сульфид удалялся в виде осадка С53. Надосадочная жидкость использовалась для определения кислорода.

Определение содержания карбонатоз, сульфида в полевых условиях проводили по Резникову ( Резников о соавт.,1970). Калориметрическое определение сульфида -проводилось по методу, описанному Тротером ( Trupar, Schlegel,1964 ).'

Численность фототрофных бактерий, входящих в состав бентосных микробиальных сообществ, учитывали методой посева серийных разведений природного материала на среду для фотосинтезирувдих бактерий ( Efennis»1965 ).'

Дополнительные сведения о видовом составе фототрофнцх бактерий получали также путем прямого микроскопированяя природных об-

разцов в полевых и лабораторных условиях, а также просчетом стекол обрастания под сканирующим электронным микроскопом по описанному ранее методу ( Юрков, Горленко,1939 ).

Методы лабораторных исследований.

Для выделения пресноводных аэробных бактерий, содержащих бак-териохлорофилл а, использовали плотную среду на основе картофельного агара со следующими добавками< г/л ): ~ ацетат 1,0; малат Na - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,4; витамин Brg - 20 мкг/л.

Яри получении чистой культуры накапливали биомассу и определяли наличие бактериохлорофилла в клетках по спектрам поглощения в ацетоновых экстрактах на спектрофотометре "Unicao" Ш-1800.

Для культивирования аэробных бактериохл|:офилл-а содержащих бактерий за основу использовали жидкую среду для фототрофных бактерий по Пфеннигу ( Pfennig,1465 ) с добавлением ( г/л ): iragS^j-O,^; ацетат На -1,5; дрожжевой экстракт - 0,4; витамин Bj2 ~ 20 мкг/л; раствор микроэлементов ( Pfennig, Idppert,.1966) - 1 I мл/л.

Выделение и культивирование аэробных бактерий, содержащих бактериохлорофилл а, проводили при pH 7,5-7,8, температуре 26-30° на чашках или в колбах на качалке при 150 об/мин.

Препараты для сканирующего микроскопа готовили по описанной ранее методике С Юрков, Горленко,1959 ), тотальные препараты для просвечивающей электронной микроскопии контрастировали ФВК или напылением углерода. При изучении тонкого строения бактерий клетки фиксировали по Ритер ( Eiter et.al.,1958 ),препараты окрашивали по Рейнольдсу ( Reynolds,1965).

Пигментный состав бактерий изучали по спектрам поглощения целых клеток,, а также их экстрактов в ацетоне на спектрофотометре "Unlearn" m-1800 или "Specord" *

Расчет количества синтезированных клетками пигментов проводили по следующим уравнениям:

Behl = 25,2 х Dr?j0 х J С Takahushi, Ichimura,1968 ) Ск = 4,0 x E450 x E ( Бульон, 39B3 ).

Солетолерантность проверяли на жидкой среде с добавлением 5,10, 15,20,25,30,50 г ЛаС1/л.

Чувствительность к антибиотикам изучали на, плотных средах с по—

• мозью дисков пропитанных антибиотиками.

Оксидазную активность устанавливали с помощью оксидаэного теста ( Герхардт и др.,1983 ), присутствие кагалази - по реакции с Ж раствором Н202. Изучали способность к гидролизу крахмала, Твина-50 ■ или Гвина-80 ( Егоров,1933 ), желатина ( Герхардт и др.,1983; Егоров, 1983 ).

Белок в культуральной жидкости определяли с кукаси синим ( Bradford, 1976 )>в экстрактах - по методу Лоури (Lowry et al.,1951 ).

Содержание сульфида и тиосульфата в.среде определяли титрованием по Резникову ( Резников.с соавт.,1970). Количество сульфатов в среде определяли нефелометрически по реакции с BaGIg. Показания еш:;/али на спектрокалориметре "Specol" прИ 650 нм, сравнивая их со стандартной калибровочной кривой. Тетратионат определяли ( после его восстановления сульфитом в щелочной среде ) иодометрически.

Интенсивность дыхания измеряли в ячейке Кларка с кислородным электродом.

Все ферменты углеродного метаболизма ¿лределяли спектрофотокет-рически С Красильникова.с соавт. ,1973).

Рибулезобисфосфат карбоксилаэу и фосфоенолпйруват карбоксилаэу определяли радиокэотопнкм методом ( Романова, 1980).

Тиосульфатредуктазу определяли по скорости выделения сероводорода из тиосульфата в присутствии дитиотреитола С Петушкова, Ивановский, 1976). Активность роданазы измеряли колориметрически по скорости образования тиоционата ( Steimietz,Pischer,1935). Тиосульфат-окисляющий фермент, сульфит:цитохром-с-оксидоредуктазу ( Петушкова, Ивановский, 1976) и АФС-редуктазу (Peck et al.,1965 ) определяли слекгрофотсметрнчесним методом по восстановлен;^ феррнциани-да.

Выделение ДНК и процентное содержание ГЦ в ДНК определяли по описаннш методам (Iiar=.ur, 19Й-1; Магнат, Hot-y,1962 ).

Молекулярную ДНК-ДНК .гибридизацию проводили по методу Де Лей (Ve Ley et al.,1970 ) и на основе радиоактивного зонда. Б качестве реперного был взят типовой вид2rythrebacter longus итамм OohlOl любезно предоставленный доктором Т.Шибой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Морфо-фтаиологическая характеристика пресноводных аэробных бактерий, содержашх бактериохлороФилл а.

При исследовании таксономического положения восьми новых штаммов, кроме фенотипических признаков был использован метод диагностики их генетического родства на основании ДНК-ДНК гибридизации и содержании Щ в ДНК ( табл.1, рис.1 ).

На рисунке I схематически изображена степень филогенетического родства новых таксонов в виде дендрограммы.

Результаты исследований приведенные в таблице I и на рисунке I позволили нам отнести выделенные микроорганизмы к двум новым родам: Erythromicrobium и Roseococcus. В составе рода Ejythromicrohium описаны цять новых видов: Em.sibiricus,штамм RB-16-17; Em.ursincola, штамм КН-99; Em»ezov±cusf штамм E-Ij Em.ramosus, штаммы Е-5 и Е4(2), . Bm.bydrolyticus, Е4(1). Род Roseococcus в настоящий момент" представлен одним видом - R.-thiosulfatophilus, штамм ЕВ-7* ..

Род Roseococcus обладает характерными признаками, отличающими его от известного соленоводного рода Reseobacter. Это пресноводные, аэробные, розовоокрашенные, грамотрицательные бактерии, клетки имеют кокковидную форму. Подвижны с помощыо полярного жгутика. Содержание ГЦ в ДНК 70,4 иол.%, в отличие от рода Hoseobacter ГЦ в ДНК которого составляет 56-59,6 молД..Типовой, и пока единственный, вид этого рода - r.thlosulfafc ophilus, отличительной чертой которого является способность к аэробному окислению тиосульфата до сульфата в присутствии органических соединений.

Характерными признаками другого описанного нами рода Erythromicrobium являются следующие. Это прес&одные, аэробные, оранжево-окрашенные, грамотрицательные палочковидные клетки, у некоторых видов ветвящиеся. У. ветвящихся форм наблюдается тройное деление. Могут быть подвижными с помощыо полярных жгутиков. Содержание ГЦ в ДНК от 62,5 до 68,5 иол.%. - -

Основными чертами, отличающими новый род Erythriraicrobiua от ранее известного оранжёвопигментированнЬго рода Brythrobacter являются: довольно низкий уровень гомологии в ДНК с типовым видом е,lengua, более высокое содержание ГЦ в ДНК, пресноводность, морфологический полиморфизм некоторых представителей и их способность к тройному делению в результате истинного ветвления клеток наряду с бинарным делением.

Все описанные виды содержат бактериохлорофилл а и каротиноидные пигменты.( рис.2). Наличие на абсорбционных спектрах in vivo различающихся максимумов поглощения каротиноидных пигментов и бактериохлорофилла а говорит о разном устройстве фотосинтетических пигмент-

Таблица I. Основные характеристики выделенных штаммов аэробных бактерий, содержащих бактериохлорот филл а.

Штам* мол% Форма кл. Цвет Основные карот. ( пик.нм) бхл-а (пик 1п VI УО нм) И с п ОЛЬ э о в а н и е окисл.

гидр каэ. орг. кис. сахара ■4 спирт крахмал желатин Гвин 80

Е.1оп&из Е4(2)

Е-5

$

Е-1 Е4(1) ПН-99 НВ-16-17 ив-7

58,7 палочки

62,5 палочки, ветвление

64,2 палочки, Еет-вление

62,5 палочки

65,2 палочки, ветз-ленио

65.4 овонд-ные .

68.5 палочки

70,4 кокки

ораня оранж

ораня орашз

opaii.it оран.*

орана розов.

448,473 306,510 466, 478

466,478 466,478 466,478

430,458 485

424,450 474

466,494 . 518

800 863

803 836 871

803 836 871

798 836 868

798 840 868

798 830 865

817 863 875 800 859

•о

Егу ЬЬхоЪа^ег Хоп^иБ

Еозесооооиз -ЬШозиЗ-Са-Ьо-рМЛ-из, ЕБ-7

ЕгзгЬкгвписгоЬхшп. в1Ъ1хх-, СПБ, ЕВ—16-17

Em.ursin.cola, КК-99

| ¡____ Ет..е го-Лсив, Е-1

_ Ет.Ьус1го1уЬ1сиз, Е4(1)

ч

с

Ет.гатозиз

Е-5 •

20 40 60 80 100 гомология

в ДОК {%)

Рис.1. Дендрограмма филогенетического родства исследованных микроорганизмов.

белковых комплексов.( табл.1).

Пресноводные аэробные батериохлорофилл-а содержащие бактерии -типичные гетеротрофы, использующие широкий спектр органических соединений - сахара, органические кислоты и аминокислоты в составе гидролизата казеина. Метанол не используют. Три вида способны к потреблению этанола ( табл.1). Ни один из известных видов не растет анаэробно на свету. Некоторые виды обладают гидролитическими ферментами. Среди выделенных нами видов Ет..з1Ъ1г1сиБ и Ет.игз1псо1а способны к гидролизу Твина-80, а Еи.Ьу|1го1у-Ысиз гидролизует кроме этого крахмал и желатин.

Таким образом, пресноводные, аэробные бактериохлорофилл-а содержащие бактерии являются полигетеротрофами, способными к использованию разнообразных как простых, так и слоеных органических субстратов.

2.Ультраструктура выделенных микроорганизмов.

Изучение ультраструктуры бактерий родов Еезеососсиэ и Егу-ЬЬго-т1сгоЪ1ша показало, что для описанных нами представителей изучаемой группы бактерий строение клеточной стенки типичное для грамот-

Рис.2. Спектры поглощения пигментов Еа.гапозиз.

1 -1п

2 - в ацетоновом зкстраяте.

рицательных бактерий. Клетки некоторых видов ( Ея..н1Ыг1сиз, Ел.егот!-сиБ, Ео.гатозиз, Еа.Ьус1го1уЫе'аэ) имеют рыхлую слизистую капсулу и выделяют в среду полисахариды. Установлено, что полкфосфаты и поли- -оксимасляная кислота г/огут служить резервными веществами для представителей родов Ег^}ц?о.а1сгоЪд.ш1 и Козеоссссиз.

£>отосинтетические внутрицитоплазматические мембранные структуры у исследованных наш видов развиты довольно слабо и представлены ВМС смешанного типа ( небольшие везикулы и ламеллы, инЕагинаты ЦП,',!). У разовоокраяенногоВ^йаоги1Га'Ьор2111и.з типичного везикулярного

фотосинтетического aiffiäpäTa не обнаружено, как это было показано для представителей рода Rdöeobacter.

Таким образом, фотосйнтетические пигменты, очевидно, локализованы в ЦПМ и ее инвагинатах.

3. Гетеротрофный метаболизм углевода у Em.sibiricus и E.lon^s .

Подробное исследование углеродного метаболизма аэробных бакте-риохлорофилл-а содержащих бактерий было выполнено впервые.

Установлено, что в клетках En.sibiricus проявляется активность всех ферментов ЦТК. У E.longus также обнаружена активность ферментов данного цикла, за исключением 2-оксоглутарагдегидрогеназы, что указывает на разомкнутость цикла. Наличие изоцитратлиазь'»и малатсин-тазы у обоих микроорганизмов указывает на функционирование глиокси-латного шунта.

Исследуемые организмы при росте на среде с глюкозой образуют глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и фосфо-2-кето-З-дезоксиглюконат-аль-долазу. Отсюда сделано заключение, что у Em.sibiricus и E.lon^us разложение углеводов может происходить по пути Энтнера-Дудорова, причем он имеет основное значение.

Обнаруживается так же активность ключевого фермента пути Эмб-дена-Мейергофа - фруктозобисфосфат-альдолазн. Однако, активность данного фермента очень низкая ( 6 и 39 нмоль/мин/мг белка 5.Вероятно, он участвует только в биосинтетических путях.

У Эп.sibiricus 6-фосфоглюконатдегидрогеназа не обнаружена, а у. S.longus проявляется в следовых количествах. Это указывает на то, что пентозомонофосфатный путь разложения Сахаров у Em.sibiricus не функционирует. У E.longus можно предположить использование данного пути в качестве дополнительного.

Определение активности ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного шунта было проведено также для остальных выделенных видов. Установлено Функционирование замкнутого ЦТК у всех других представителей родов Ery-thronicrobiua и Hoceococcus. Глиоксилатный шунт также функционировал у большинства изучаемых видов, за исключением Em.ezovicus и одного из штаммов вида Еа.rano3us ( Е-5 )•

Можно заключить, что разные представители аэробных бактериохлорофилл а содержащих бактерий незначительно отличаются по метаболизму органических кислот, что выражается в разомкнутосоиЦТК у отдельных видов и наличии или отсутствии глиоксилатного шунта.

4. Влияние света и кислорода на метаболизм бактерий изучаемой Физиологической группы.

Особое внимание в работе уделялось изучению роли света и кислорода в метаболизме изучаемой группы бактерий. Установлено неодинаковое действие этих факторов на рост и синтез пигментов разных видов изучаемой группы.

Свет ингибировал кислородное дыхание всех изученных представителей родов Егт-ЬЬгош-сгоЫип и Еозеососсиз, использоваваих эндогенные субстраты,^ что было ранее показано для пурпурных бактерий, а также .для в.аопйиз.'

Добавление С1ССР ( 8J4.fi) к суспензиям клеток полностью устраняло фотоингибирование дыхания ( рис.3 ).

Оотоингибирование кислородного дыхания является доказательством наличия светозависимой электроннотранспортной цепи. Характер влияния С1ССР на фотоингибирование дыхания предполагает, что све-тозэеисимый электронный транспорт образует градиент рН на мембранах и фотюфосфорилирование имеет место.

, Свет и кислород репрессируют синтез бактериохлорофилла а у Еа.а1Ыг1сив штамм 11В-16-17. Синтез пигмента осуществлялся наиболее активно при недостатке кислорода в темноте и составил 0,22 мкг/мг белка ( табл.2). Влияние света и кислорода на синтез бактериохлорофилла у Еа.з1Мг1сиа подобно таковому для НозеоЪа^ег а.еп±^1^1сапз штамм ОсМ14, показанное японскими исследователями.

У Ео.ЬусЬ:о1уг1сиз бактериохлорофилл синтезируется в больших количествах в хоротго аэрируемых условиях в темноте ( 0,6 мкг/мг белка). Недостаток кислорода и свет заметно ингибируют синтез этого пигмента. В этих условиях количество синтезированного бактериохлорофилла понижается в 10 раз,- ( табл.2 ).

Синтез бактериохлорофилла а у й.-ьыозиЗ.Га-ьорМ.д.из репрессировался светом только при нэдостатке кислорода.

Из вышесказанного мсгло заключить, что свет ингпбирующе действует на синтез бактериохлорофилла у большинства известных аэробных бактерий, содержащих бактериохлорофилл а. Концентрация кислорода по разному влияет на этот ингибирую^ий эффект.

Однако, если сравнивать прирост биомассы ь разных условиях, аз-метно, что на свету на качалке у этих представителей урожай клето:: болыле, чем в темноте. Это монет служить одним из доказательств того, что микроорганизмы на свету осуцествлгаат фотосинтез.

Отмечено, что на свету при хоропей аэрации происходило понлге-

Рис.3. Вл.ияние света на нислоррдное дыхание.

Зт.Ьус1го1у1;1сив (1) и Н.Ъ1азЪ1са (2).

ние активности ключевых ферментов ЦТК - цитратсинтазы, 2-оксоглу-таратдегидрогеназы и изоцитратлиазы у,Ет.в1Ыг1сиа ( табл.3 ).

Можно предположить, что клетки Еш.з±Ыг1сиз в этих условиях в меньшей степени нуждаются в АТФ, образуемой в цикле и им в меньшей мере необходим дополнительный синтез ЩУК. ЦТК на свету, в основном, работает на конструктивные цели. Это также подтверждает получение клетками исследуемых бактерий дополнительной энергии на свету.

Небольшой прирост биомассы на свету и относительно малое количество синтезированного клетками бактериохлорофилла указывает на низкую активность фотосинтеза. Поэтому влияние света и кислорода на. активность ферментов ЦТК сравнительно невелико.

Проведенные исследования позволили установить, что уровень фиксации углекислоты у Еш.'з1Ъ1г1сиз штаммКБ-16-17 как на свету, так и в темноте, не превышает уровня гетеротрофной фиксации. Однако, по

Синтез пигментов Еи.Ьу<1го1у1;л.сиз,Е4(1)} Б.1;Шози1£а-1;орШ1из,НВ-7? Ел. з1Ъ1г1сиз,НВ-1б-17 в зависимости от освещения и условий аэрирования.

Вариант Количество Количество Белок

бактериохлорофилла а каротиноидов ( мкг/мл )

(мкг/мг белка) ( мкг/мг белка)

I 2 3 I 2 3 I 2 3

Стационар-свет 0,0 б 0,03 0,17 0,6 0,4 0,9 80 125 125

Стационар-темнота 0,09 0,06 0,22 0,6 0,6 0,9 55 125 115

Качалка-свет 0,2 0,06 . 0,03 0,9 0,4 . 0,76 530 230 260

Качалка-темнота 0,6 0,06 0,14 1,2 0,4 0,9 500 160. 215

Примечание: 1 - Ea.hydrolyticu.st 2 - К^Мовч1£а<;орМ1ив,ЕВ-7» 3 - Еп.зШ.г1сиэ,

Влияние света и кислорода на активность ферментов ЦТК Еп.е1Мг1сшз штаммКВ-16-17 ( нмоль/мин/мг белка).

Ферменты

Свет

Темнота

качалка|стационар

качалка стационар

Цитратсинтаза 2-оксоглутарат-

69 84,8

3,1 7,1 О 2,1

99,7 108,4

5,4 8,9

2,3 4,5

дегидрогеназа Изоцитратлиаэа

результатам эксперимента можно отметить, что на свету за счет эндогенных продуктов, а также на средах с ацетатом, бутиратом и глюкозой фиксация С0£ выше, чем.в темноте С 1,5-45% ). Отмечено, что при росте на глюкозе уровень фиксации СО2 был самым высоким.

Ключевой фермент цикла Кальвина - рибулеэобисфосфат карбоксила-за не обнаружен ни у одного из штаммов.

Таким образом, были получены доказательства функционирования у изученных штаммов светозависимого транспорта электронов. Свет является дополнительным источником энергии, что дает возможность микроорганизмам в большей степени расходовать органические соединения на конструктивные цели.

5. Метаболизм тиосульфата у Егт-ЬЬхса1сгоМит ЬудгоХуЫсиз и НоЕеососсиз "№1озц1Р а"ьори11из.

Установлено, что ни один из выделенных видов не ускоряет окисления сульфида по сравнению с контролем. Однако, бактерии ЕтЛуйго-1у1;1сиз и н.-ЫПоБиЛ^а^рЬИив способны к использованию тиосульфата в присутствии органического субстрата.Еа.Ъу<1го1уй1-си8 окисляют в темноте и на свету тиосульфат до тетратионата, а Е.^лзи^а-Ъо-рЫ1из- до сульфатов.

Добавление в среду тиосульфата ( до 3 г/л ) увеличивает урожай исследуемых видов на 13 и 44%, соответственно ( рис.4 ). Тиосульфат наряду с ацетатом стимулирует скорость дыхания клеток, что позволило предположить возмокность получения клетками обоих едкое энергии

Рис.4. Прирост биомассы Еп.Ьу<1го1уЫсаа, Е4(1) - а

и й.Ч;Мови1£эЛврЫ1из, ЕВ-7 - б, в зависимости от концентрации тиосульфата в. среде. '

■ при окислении тиосульфата.

При росте на свету в присутствии тиосульфата у изучаемых видов выход биомассы несколько выше, чем в темноте. Потребление тиосульфата в этих условиях идет также активнее ( рис.5 ).

У двух указанных видов установлена активность ряда ферментов, которые могут принимать учрстие в метаболизме тиосульфата (табл.4).

Поскольку при росте ЕаЛуам^^сиз, Е4С1)г на среде с ацетатом

(время,ч)

Рис.5. Рост и использование тиосульфата в.-илозиХСа-Ьо-рЫ1ис, ЕВ—7» в зависимости от освещения. - на свету; ----в темноте.

1,2 - потребление тиосульфата; 3,4 - образование сульфата; 5,6 - прирост биомассы; 7,8 - потребление ацетата.

Активность ферментов метаболизма тиосульфата у B.thiosulfatophllus И Em.hydrolytlcus (нмоль/мин/мг белка).

Фермент

S.thiosulfatophllus Em.bydroljticus

Гиосульфатокисляющий фермент

Роданаза

Тиосульфатредуктаза

Сульфит:цитохром-с-оксидоредуктаэа

А5С-редуктаза

75 16 640

345

86 23 2800

47,3

•л тиосульфатом в среде обнаруживался только тетратионат и в клетках содержался тиосульфатокисляющий фермент, можно считать, что тиосульфат используется в диссимиляторном метаболизме штамма Е4(1). Катализирует реакцию тиосульфатокисляющий фермент: 2S203 ----w O3S403 + 2с

Ранее было показано, что акцептором электронов при действии этого Фермента в клетках служат цитохромы типа С. Возможность такого метаболизма тиосульфата'обнаружена у Chromatium sp.,R.palustris и ряда тионовых бактерий. В настоящее,время трудно объяснить высокую активность тиосульфатредуктазы у Em.hydrolyticus.

У R.thiosnifatophllus, нв-7наиболее активными были ферменты тиосульфатредуктаза и сульфит:цитохром-с-оксидоредуктаза. Поскольку у этого вида единственным обнаруженным продуктом окисления, тиосуль-• фата является сульфат, можно предположить, что у штата RB-7 метаболизм тиосульфата происходит следующим путем:

1. Под действием тиосульфатредуктазы происходит восстановительное расщепление молекулы до. сульфида и сульфита:

S2o|- + 2е -> S2- V sof-

2. Далее может окисляться до в реакции, катализируемой сульфит:цитохром-с-оксидоредуктазой:

sc|~ + 1^0 -> S0|- + 2Н+ + 2в

Каким образом идет превращение сульфидного иона нами не изуча-_ лось. Однако, очевидно, по крайней мере частичное, окисление его до сульфата. Подобный механизм окисления тиосульфата был описан для

представителей сем. СЬгста-Ыасеае, а также для некоторых пурпурных несерных бактерий.

Исследуемые виды в периодической культуре не росли на чисто минеральной среде. Как указывалось, ключевой фермент .цикла Кальои-на рибулезобисфосфат карбоксилаза не обнаружен. У Еа.ЪуйгоДогЫсиз и н.?Ысаи1^аЬорЫ1иБ установлено наличие фермента гетеротрофной фиксации углекислоты - фосфоенолпируват карбоксилазы.

Приведенные выше результаты позволяют сделать следующее заключение. Еп.Ьудго1у1;1сив, штамм Е4С1) и Н.йМози1£ айорЬИиБ, ЕВ-7 используют тиосульфат в качестве дополнительного донора электронов в энергетическом метаболизме, окисляя его разными путями. Полное отсутствие автотрофного роста вместе с отсутствием даже очень низких количеств ключевого фермента цикла Кальвина и способность использовать тиосульфат в энергетическом метаболизме позволяют предположить, что эти организмы являются факультативными хемоли-тогетеротрофаыи.

Таким образом, наша работа показала, что распространение аэробных бактериохлорофилл-а содержащих бактерий не ограничивается морскими экосистемами. Пресноводные циано-бактериальные маты являются характерным местообитанием для этой физиологической группы бакте-■ рий. Представители этой группы объединяются по ряду общих признаков: наличие бактераохлорофилла а; факультативная способность к бактериальному фотосинтезу, зависимому от кислорода; полигетеротрофный метаболизм по типу дыхания.

Выявленное нами таксономическое и физиологическое разнообразие отражает высокую дивергированность аэробных бактериохлорофилл-а содержащих микроорганизмов.

ВЫВОДЫ.

1. Из цианобастериальных матов, развивающихся в термальных источниках, ввделено и описано два новых рода пресноводных, аэробных бактерий, .содержащих бактериохлорофилд¿а - Ег^Ьгва1огоЪ1ш1 -.

и Еоэвесссоиа- -и шесть новых .видов: Епи'егечЛсиз, ,Еи.Ьус1го17^;1-сиз, -Еф.гаповиа, Ет.еПоАПеиа, Ев.игБ±оео1а и К.'гМоЕиЛХаЪ»-рйНие.

2. Изученные бактерии являются облигатныш аэробами и полигетеро-трофами. Установлено, что органические кислоты у данной физиологической группы используются в цикле трикарбонорых кислот, который ыожет быть замкнутым или разомкнутым. Глиоксилотный щунт

функционирует лишь у некоторых представителей аэробных бактерио-хлорофилл-а содержащих бактерий.

Путь Эктнзра-Дудорова является основным для использования углеводов yBa.sibixic.us и E.lmgua.'

3. Обнаружено, что у изучаемых видов отсутствует ключевой- фермент цикла Кальвина - рибулезобисфосфат карбоксюгаза. У Enu'slbiiicus уровень ассимиляции углекислоты не выше гетеротрофного. Однако, на свету происходило увеличение скорости фиксации СО^-

4. За счет энергии света органические вещества более активно используются на конструктивные цели, что приводит к большему выходу биомассы в этих условиях.

Отмечено фотоингибирование кислородного дыхания для.всех изученных представителей родов Erythremicrobiua и Beseececcus следовательно, эти микроорганизмы являются факультативными аэробными фотогетеротрофами.

5. Впервые установлена способность аэробных бакгериохлорофилл-а содержащих бактерий.к использованию тиосульфата.в диссимилятор-ном метаболизме (Em.hydrelyticus и R.thiesulfatephilus) и их способность к хемолитогетеротрофш.

6. 'Пресноводные цианобактериальные маты являются специфическим местообитанием аэробных бактериохлорофилл-а содержащих бактерий, в которых* они выполняют функцию аэробных деструкторов.

В сульфидных источниках обитают виды приспособленные к использованию восстановленных серных, соединений.

По материалам дйсс^тации опубликованы следующие статьи:

•I. Gerleako V.li. ,Yurkov Ecology o£ phototrephlc microorgaxiisias.

of. Belsheret^ensky .-fcbKcBal springs.-.In Yl'InteynaW Symp» Ehete-syathetio Erolmryetea, The Ketkerlands, 1988, p.179.

2. Юрков В.В., Горленно В.М. Применение электронной сканирующей микроскопии для анализа вертикальной структуры микробных сообществ альгобактериальных матов на стеклах обрастания.- Микробиология, 1989, т.53, М, с.676.

3. Юрков Е.В., Горленко.В.Ы. Новый эид пресноводных аэробных бактерий Erythrofcacter aiblricua spvnvir., содержащих бактериохло-рофилл а.- Микробиология, 1990, т.59, »1, с.121.

4. Юрков B.B., Митюшина JI.JI., Горленко В.М. Ультраструктура аэробных бактериохлорофилл-а содержащих бактерий Erythrobactex Б1Ыг±сие.-ыИКр0(5иологиЯ1 J590 С в печати ).

5. Юрков В.В., Красильникова E.H., Горленко В.М. Ферменты гетеротрофного углеродного метаболизма азро.бных бактерий, содержащих бактериохлорофилл а Е,Bibiricos и E.lengus.-Микробиология, 1990 ( в печати).

6. Юрков В.В., Горленко В.М., Митюшина Л.Л., Старынин'.Д.А. Влияние лимитирующих факторов на структуру фототрофных сообществ в Большереченских термальных источниках.- Микробиология, 1990 ( в печати ).

7. Юрков В.В., Горленко В.М. Экофизиологические особенности фототрофных микробных сообществ Большереченских термальных источников.- Микробиология, 1990 ( в печати ).

8. Юрков В.В., Красильникова E.H., Горленко'В.М. Влияние света и кислорода на метаболизм аэробных бактерий Exythrcbaoter sibiri-сиз.- Микробиология, 1990 ( в печати ). .

9. Юрков Б.В., Горленко В.М. Новый штамм RB-5 пурпурной несерной бактерии Bhodepseudcaenas tüastica, ввделенноЯ из сульфидного щелочного источника.- Микробиология, 1990 ( в печати ).

10. Юрков В.В., Лысенко A.M., Горленко В.М. Анализ геносистемати-ческого положения пресноводных, аэробных бактерий, содержащих бактериохлорофилл а.- Микробиология, 1990 ( в печати ).

11. ЮркоЕ В.В.,- Горленко В.М. Новые виды аэробных бактерий рода Erythroaiorcbiuii, содержащих бактериохлорофилл а.- '^:крсбио-логия, 1990 ( в печати ).

12. Юрков В.В., Горленко B.W., Компанцева Е.И. Новый род пресноводных, аэробных, оранжевоокрашенных бактерий, содержащих бактериохлорофилл а, Eiythroaicrefcium gen.nov.- Микробиология, 1990 ( в печати ).

13. Юрков В.В., Горленко В.М. Ноеый род пресноводных, аэробных бактерий, содержащих бактериохлорофилл a, Boseococcus gexi.nev.- Микробиология, 1990 ( в печати ).

14. Юрков Б.В., Красильникова E.H., Горленко В.М. Метаболизм тиосульфата у аэробных бактерий Roscococcus thiosulfatophilus

к Ery-throaicrobixin bydxolyticus, содержащих бактериохлорофилл а. Микробиология, 1990 ( в печати ).