Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Окислительно-восстановительное взаимодействие Mn-бикарбонатных комплексов с реакционными центрами типа II аноксигенных фотосинтезирующих бактерий

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Окислительно-восстановительное взаимодействие Mn-бикарбонатных комплексов с реакционными центрами типа II аноксигенных фотосинтезирующих бактерий"

005059466

Терентьев Василий Валерьевич

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ Мп-БИКАРБОНАТНЫХ КОМПЛЕКСОВ С РЕАКЦИОННЫМИ ЦЕНТРАМИ ТИПА II АНОКСИГЕННЫХ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 Р май 2013

Пущино - 2013

005059466

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

доктор биологических наук, профессор Климов Вячеслав Васильевич

Ерохин Юрий Евдокимович

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, заведующий лабораторией молекулярной организации фотосинтетического аппарата

Горленко Владимир Михайлович доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, заведующий лабораторией экологии и геохимической деятельности микроорганизмов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится 13 июня 2013 г. в ІЗ30 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук. Автореферат разослан (№ &ЩЄМ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Появление оксигенных фотосиптезирующих организмов более 2,5 млрд лет назад привело к резкому увеличению маштабов фотосинтеза, накоплению 02 в атмосфере Земли, кардинальной перестройке биосферы и возникновению аэробной жизни [Holland and Rye, 1998; Des Marais, 2000; Dismukes and Blankenship, 2005].

Кислород-выделяющая фотосистема 2 (ФС-2) растений и цианобактерий состоит из двух основных функциональных блоков: (1) фотохимического реакционного центра (РЦ), в котором происходит превращение энергии возбуждения хлорофилла, поглотившего квант света, в энергию разделенных зарядов, в результате чего образуется самый сильный биологический окислитель - катион-радикал первичного донора электрона — хлорофилла Рбво (Р«*), и (2) водоокисляющего комплекса (ВОК), который многократно окисляется с помощью Р68о+ через вторичный донор электрона, Yz, и, в свою очередь, окисляет Н20 до 02 [подробнее см. Renger, 2001]. Накопление окислительных эквивалентов, необходимых для четырехэлектронного окисления воды, происходит в Mn-кластере ВОК, содержащем четыре катиона Мп и один катион Са [Umena et al., 2011].

Наиболее вероятными эволюционными предшественниками ФС-2 являются РЦ пурпурных бактерий, которые, так же как и РЦ ФС-2, относятся к типу II [Blankenship, 1992; Allen and Williams, 1998], хотя путь эволюционного перехода от аноксигенного фотосинтеза к оксигенному остается неясным. В бактериохлорофилл-содержащих РЦ аноксигенных бактерий значение среднеточечного окислительно-восстановительного потенциала (Ещ) пары Pg70+/P870 составляет лишь около 0,50 В [Lin et al., 1994], которого достаточно для окисления ионов железа, некоторых органических и сульфидных соединений, используемых аноксигенными фототрофами в качестве доноров электрона, но недостаточно для окисления марганца.

В последнее время развиваются представления о возможной роли Мп -бикарбонатных комплексов в эволюционном происхождении Mn-кластера ВОК [Dismukes et al., 2001; Kozlov et al., 2004; Dasgupta et al., 2006]. Электрохимические и ЭПР-измерения [Козлов с соавт., 1997; Kozlov et al., 2004; Dasgupta et al., 2006] показали, что в присутствии ионов бикарбоната окисление ионов Мп2+ значительно облегчается: потенциал одноэлектронного окисления Мп2+, равный 1,18 В для водного комплекса, понижается до 0,61 и 0,52 В при формировании, соответственно, комплексов [Мп(НС03)]+ и [Мп(НС03)2]. Образование таких «легкоокисляемых» Мп2+-бикарбонатных комплексов облегчает фотоокисление Мп2+ в процессе фотоиндуцированного формирования неорганического ядра ВОК из фотосистемы 2, не содержащей Mn-кластер (апо-ВОК-ФС-2) и неорганических кофакторов Мп и Са [Klimov et al., 1995а, b; 1997а; Allakhverdiev et al., 1997; Baranov et al., 2000; Baranov et al., 2004; Kozlov et al., 2004]. Кроме того, потенциал окисления Mn2+-бикарбонатных комплексов настолько низок (0,52 В), что можно ожидать их фотоокисление даже РЦ аноксигенных фотосиптезирующих бактерий.

Вследствие этого было предположено, что такие комплексы могли использоваться аноксигенными бактериями в качестве доноров электронов и «строительных блоков» в процессе формирования первых 02-выделяющих РЦ Р^тикев а а1., 2001; Ког1оу е1 а1., 2004; Оаз§ир1а а1., 2006].

Целью данной работы было экспериментальное исследование возможности допирования электрона от Мп2+ в присутствии бикарбоната на реакционный центр типа II аноксигенных фотосинтезирующих бактерий дикого типа. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) с помощью дифференциальной абсорбционной спектрофотометрии и ЭПР-спектрометрии исследовать возможность окислительно-восстановительного взаимодействия Мп2+в присутствии бикарбоната с РЦ типа II аноксигенных фотосинтезирующих бактерий;

2) изучить специфичность окислительно-восстановительного взаимодействия пары «МпС12 плюс ЫаНС03» с РЦ исследуемых бактерий;

3) провести сравнительные исследования взаимодействия Мп2+ в присутствии бикарбоната с РЦ бактерий, различающихся по величине Ет пары Р+/Р.

Научная новизна работы. Впервые с помощью методов оптической спектрофотометрии показана способность катиона Мп2+ в присутствии бикарбоната к редокс-взаимодействию с Р+ в РЦ типа II аноксигенных фотосинтезирующих бактерий дикого типа: Якос1оуи1ит (Шг.) юскзэит, Кк robiginosum, ТКюгко(1озр1га (Гк) 51Ыпса, Шю<1оЬаЫег (ЯЬ.) вркаего'гйез Я-26. С помощью ЭПР-спектроскопии выявлено, что N811003 стимулирует фотоокисление Мп2+ до Мп3+ реакционными центрами ЯЛ. юс1о.тт. Установлено, что наблюдаемый в присутствии пары «МпС12 плюс ЫаНС03» эффект ускорения темнового ре-восстановления Р+ является специфичным для Мп2+-бикарбонатных комплексов: добавление МпС12 и ЫаНСОз отдельно друг от друга, так же как и замена Мп2+ в присутствии N811003 на другие двухвалентные катионы (М£2+, Са2+) или замена бикарбоната (в присутствии Мп2+) на схожие по структуре анионы (формиат, ацетат, оксалат) приводит к потере эффекта. Результаты исследований зависимости эффекта от концентрации бикарбоната позволяют предположить участие электронейтрального комплекса [Мп(НС03)2] (с потенциалом окисления Мп2+, равным 0,52 В) в донировании электрона на Р+ бактериальных РЦ (хотя не исключено и участие комплекса [Мп(НС03)]+ в этой реакции). Обнаружено, что способность Мп2+ (в присутствии бикарбоната) к донированию электрона на Р+ зависит от величины окислительно-восстановительного потенциала пары Р+/Р, что подтверждает окислительно-восстановительную природу взаимодействия между Мп2+ и Р+.

Практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в решение фундаментальной проблемы - изучение механизмов формирования и эволюции Мп-содержащего водоокисляющего комплекса фотосистемы 2, а также могут послужить основой для разработки принципов создания искусственных систем на основе пигмент-белковых комплексов, преобразующих и запасающих солнечную энергию.

Апробация работы. Результаты и основные положения работы были представлены на международной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, январь 2008 г.), 15-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011 г.), международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ - Улаанбаатар, 5-16 сентября 2011 г.), VI-м съезде Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, Краснодарский край, 15-22 сентября 2011 г.), школе-конференции молодых ученых на базе Института фундаментальных проблем биологии РАН «Биосистема: от теории к практике» (Пущино, 4-5 октября 2012 г.), международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика'12» (Пущино, 22-24 октября 2012 г.).

Личный вклад соискателя. Исследования по теме диссертации выполнены самостоятельно. Автор участвовал в постановке и решении всех экспериментальных задач, обработке результатов и формулировке выводов. Соавторы, принимавшие участие в совместных исследованиях, указаны в соответствующих разделах диссертации.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе _4_ статьи: J_ статья в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), JL в реферируемом зарубежном журнале, _2_ в периодических научных изданиях и 6 в материалах коференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 112 страницах, иллюстрирована 47 рисунками. Список литературы содержит 181 источник (из них 172 на английском языке).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы составляет первую часть диссертации. В нем изложены основные представления о происхождении и эволюции фотосинтеза, молекулярных основах фотосинтетического преобразования энергии солнечного излучения, а также современные данные о структурно-функциональной организации фотосинтетических реакционных центров типа II (РЦ пурпурных и зеленых нитчатых бактерий, РЦ фотосистемы 2), локализации и функции бикарбоната в ФС-2 и предполагаемой роли Мп2+-бикарбонатных комплексов в эволюционном происхождении неорганического ядра ВОК фотосистемы 2.

Объекты и методы исследований. Пигмент-белковые «коровые» комплексы, представляющие собой комплекс РЦ с ближайшей светособирающей антенной (РЦ-LHl), выделяли из Rh. iodosum, Rh. robiginosum, Th. sibirica и Chromatium (Ch.) minutissimum с помощью солюбилизации хроматофоров неионным

детергентом додецил-мальтозидом, центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы и последующей очистки на ионообменной колонке с DEAE-целлюлозой [Qian et al., 2000]. Комплексы РЦ из Rb. sphaeroides R-26 и Cloroflexus (Cf.) aurantiacus выделяли путем обработки хроматофоров пеионным детергентом лаурилдиметиламиноксидом с последующей очисткой па ионообменной колонке с DEAE-целлюлозой [Shuvalov et al., 1986; Zabelin et al., 2011].

Оптические спектры поглощения препаратов измеряли на спектрофотометрах «Hitachi» U-2800 (Япония) и «Shimadzu» UV-1601 PC (Япония). Кинетику фотоиндуцированных изменений поглощения (ДА), связанных с обратимым фотоокислением первичного донора электрона РЦ, измеряли с помощью фосфороскопической установки [Климов с соавт., 1975] и спектрофотометра «Agilent» 8453 (США).

Для накопления РЦ в «долгоживущем» окисленном состоянии препараты освещали в течение 30 с красным светом (>- > 600 нм, 1900 цмоль фотон с"'м"2). Дифференциальные спектры поглощения «свет минус темнота» получали путем вычитания из спектров поглощения, измеренных после выключения действующего света, спектров поглощения, измеренных перед освещением препаратов.

Измерение фотоокисления Мп2+ бактериальными РЦ проводили с помощью ЭПР-спектрометра «Bruker ЕМХ-6/1» (Германия) при комнатной температуре. Сигнал ЭПР измеряли в плоской кварцевой кювете в стандартном резонаторе «ТМ102» при микроволновой частоте, равной 9,70 ГГц. Спектр ЭПР Мп2+ регистрировали как в темноте, так и при освещении образцов с помощью светодиода (880 нм, 32 мВт/см2). Сигнал ЭПР Мп3+ измеряли при 5К с помощью спектрометра «Bruker Elexsys 580 X-band» с использованием резонатора «Bruker ER 9601 DM» (Германия) и гелиевого проточного криостата «Oxford ESR 900» (Oxford inst.). Подготовку образцов (в том числе, освещение светом) проводили при 0°С, после чего препараты охлаждали в течение 5 с на бане из метанола и сухого льда, а затем погружали в жидкий азот. Моделирование сигнала ЭПР Мп3+ было выполнено с использованием пакета программ «MATLAB EasySpin» [Stoll and Schweiger, 2006].

Для удаления С02/НС03" растворы продували воздухом, который был пропущен через 20-см слой аскарита и 50 %-ый раствор NaOH [Klimov et al., 1995].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение возможности окислительно-восстановительного взаимодействия Мп2+ в присутствии бикарбоната с PIJ типа II аноксигенных фотосинтезирутощих бактерий

Rh. iodosum и Rh. robiginosum — апоксигенные пурпурные несерные Fe-окисляющие бактерии. Эти бактерии используют Fe2+ в качестве донора электрона для аноксигенного фотосинтеза [Straub et al., 1999]. Исходя из этой функциональной специфичности, нами было предположено наличие структурных особенностей в РЦ этих бактерий, облегчающих взаимодействие РЦ с редокс-активными металлами, такими как Fe2+ или Мп2+, что позволило рассматривать данные бактерии в качестве подходящих объектов для изучения окислительно-восстановительного взаимодействия Мп2+-бикарбонатных комплексов с РЦ.

Известно, что при освещении РЦ инициируется процесс первичного разделения зарядов, сопровождающийся образованием редокс-пары P+Qa", время рекомбинации которой в обычных условиях для пурпурных бактерий составляет около 100 мс [Blankenship, 1994; Cogdell and Lindsay, 2000; Katona et al., 2005]. Однако, как было показано ранее, при длительном освещении некоторая часть РЦ может переходить в так называемое «долгоживущее» окисленное состояние, характеризующееся медленной кинетикой темнового ре-восстановления Р+ в отсутствие экзогенных доноров электрона. В этом случае время полной релаксации Р+ может составлять от нескольких минут [Kaiman and Maroti, 1997; Mourik et al., 2001; Andreasson and Andreasson, 2003; Katona et al., 2005] до нескольких часов [Pierson et al., 1983; Volk et al., 1991] в зависимости от длительности и интенсивности предосвещения препаратов.

Как показали наши исследования, фотоокисление первичного донора электрона РЦ в «коровых» комплексах Rh. iodosum сопровождается характерным обратимым выцветанием полосы поглощения при 890 нм и сдвигом при 800 нм в близкой инфракрасной области спектра (рис. 1а), что было ранее показано для других пурпурных бактерий [Shuvalov and Klimov, 1976; Moskalenko et al, 2005].

Из кинетики фотонакопления Р+ и его темнового ре-восстановления (рис. 16), полученной при измерении изменений поглощения при 790 нм (ДА790) (использование основной полосы поглощения Р+ при 870 нм было затруднено присутствием интенсивной полосы поглощения антенны при 890 нм) хорошо видно, что в результате освещения препаратов в течение 30 с (X > 600 нм, 1900 цмоль фотон с-'м-2), в отсутствие экзогенных доноров электрона около 50 % фотоактивных РЦ обладали замедленной кинетикой темнового ре-восстановления Р+ («долгоживущие» окисленные РЦ).

С помощью окислительно-восстановительного титрования фотоиндуци-рованных АА790 (при добавлении K3[Fe(CN)6] и K4[Fc(CN)6]) в «коровых» комплексах Rh. iodosum и Rh. robiginosum было определено значение среднеточечного окислительно-восстановительного потенциала (Em) пары Р /Р, которое составило 0,48-0,49 В. Полученное значение сходно с известными из

литературы значениями Em пары Р+/Р для других пурпурных бактерий [Klimov et al., 1977; Lin et al., 1994].

В присутствии 0,1 мМ K4[Fe(CN)6], известного экзогенного донора электрона для РЦ пурпурных бактерий, кинетика темновой релаксации окисленных РЦ Rh. iodosum значительно ускорялась, так что через 30 с после выключения действующего света в окисленном состоянии оставалось менее 15 % РЦ (рис. 16, кинетика 2). Ускорение темнового ре-восстановления Р+ наблюдалось также при добавлении 0,5 мМ МпСЬ совместно с 50 мМ NaHC03, что особенно отчетливо проявлялось для «долгоживущей» компоненты релаксации Р+ (рис. 16, кинетика 3). Время 50%-го ре-восстановления «долгоживущих» окисленных РЦ (ti/î) составляло: 110 с - в отсутствие добавок (контроль), 5 с — в присутствии 0,1 мМ iC,[Fc(CN)6] и 63 с - в присутствии 0,5 мМ МпС12 и 50 мМ ЫаНСОз.

Ускорение темнового ре-восстановления Р+ с помощью K4[Fe(CN)6] и пары «Мп2+ плюс НСОз"» проявлялось также при измерении дифференциального спектра поглощения «свет минус темнота»: через 150 с после выключения света амплитуда ДА, связанных с Р+, уменьшалась, соответственно, на 85 % и 25 % по сравнению с измерением, проведенным в отсутствие добавок (рис. 1а).

Рис. 1. а - дифференциальные спектры поглощения «свет минус темнота» «коровых» комлексов Ш Шотт, полученные через 150 с после выключения действующего света: 1 - в отсутствие добавок, 2 - в присутствии 0,1 мМ К4[Ре(СМ)6], 3 - в присутствии 0,5 мМ МпС12 и 50 мМ ЫаНСОз; б - кинетика фотонакопления Р+ и его темнового ре-восстановления при освещении «коровых» комплексов Юг. юс!о$ит. Измерения проведены в среде, содержащей 50 мМ Нерсз (рН 8,3), обедненной по СО2/НСО3'. Т-1 - включение и выключение действующего света.

Исследование кинеггики темнового ре-восстановления Р+ по разнице АА790-ДА8ю (АА79о-8ю) на дифференциальном спектре поглощения «свет минус темнота» показало, что ускорение темновой релаксации фотоокисленных РЦ в присутствии Мп2+ зависело от концентрации добавленного бикарбоната. Ускорение темнового ре-восстановления Р+ в присутствии 0,5 мМ МпС12 практически полностью отсутствовало при добавлении 10-15 мМ №НС03,

начинало проявляться при 30 мМ бикарбоната и достигало максимума при 5075 мМЫаНСОз (рис. 2а).

Изучение зависимости эффекта от концентрации Мп2+ показало, что в присутствии 50 мМ №НСОз ускорение темнового ре-восстановления Р+ в препаратах наблюдалось уже при добавлении 10 мкМ МпС12 и достигало максимума при 0,5 мМ МпС12 (рис. 26). Добавление 0,5 мМ МпС12 и 50 мМ ИаНСОз отдельно друг от друга (рис. 2), а также замена Мп2+ на катионы других двухвалентных металлов - Мс2+ или Са2+ (в присутствии ЫаНСОз), или замене бикарбоната на схожие по структуре анионы — формиат, ацетат или оксалат (в присутствии МпС12) приводит к потере эффекта стимулирования темнового ре-восстановления Р+ с помощью Мп2+ (данные не показаны).

Время, мин

Рис. 2. Кинетика темнового ре-восстановления Р+ в «коровых» комплексах Ш. іосіоіит при различных концентрациях ИаНСОз (а) и МпСЬ (б). Кинетика в отсутствие добавок (контроль) - В. а -0,5 мМ МпСЬ в отсутствие других добавок (О) и при добавлении КаНСОз: 30 мМ (А), 40 мМ (О), 50 мМ (•), 75 мМ (V); 6-50 мМ ЫаНСОз в отсутствие других добавок (О) и при добавлении МпСЬ: 0,01 мМ (Д), 0,1 мМ (О), 0,5 мМ (•), 0,75 мМ (V). Измерения проводили в среде, содержащей 50 мМ Нереэ (рН 8,3), обедненной по ССЬ/НСОз".

Аналогичные результаты были получены на «коровых» комплексах, выделенных из другой пурпурной Ре-окисляющей бктерии - Юг. гоЪ'щтоьит (не показано).

Таким образом, отсутствие ускорения ре-восстановления Р+ в наших экспериментах при добавлении к «коровым» комплексам отдельно друг от друга МпС12 и ЫаНСОз или при замене Мп2+ на или Са2+ (в присутствии бикарбоната), или замене бикарбоната на формиат, ацетат или оксалат (в присутствии МпСЬ) свидетельствует о том, что именно Мп2+-бикарбонатные комплексы участвуют в окислительно-восстановительном взаимодействии с Р+ в РЦ исследованных бактерий.

Были проведенны также эксперименты на «коровых» комплексах, выделенных из серной алкалофилыюй пурпурной бактерии ТИ. згЫгка. обитающей в «содовых» озерах со щелочным значением рН воды (рН 9,2-9,7) [ВгуагПзеуа е1 а1., 1999]. Выбор данного объекта был обусловлен тем, что при щелочных значениях рН в растворе присутствует значительное количество бикарбоната (до нескольких десятков мМ). В природной среде обитания Тк я^Ыпса с большой долей вероятности могут присутствовать Мп2+-бикарбонатные комплексы, которые могут выступать в качестве естественного донора электрона для фотосинтеза данной бактерии.

Как показано на рис. 3, совместное добавление к «коровым» комплексам, выделенным из Тк яШпса, 0,5 мМ МпС12 и 50 мМ №НС03, сопровождающееся формированием «низкопотенциальных» Мп2+-бикарбонатных комплексов, значительно ускоряет ре-восстановление Р .

Используя константы равновесия для Мп2"-бикарбонатных комплексов, приведенные в работах [Тихонов с соавт., 2006; Оа5§ир1а е! а!., 2006], нами было рассчитано соотношение аква-катиона Мп2+ и Мп2+-бикарбонатных комплексов в растворе в зависимости от концентрации ЫаНС03. Как показано на рис. 4, количество комплексов [Мп(НС03)2] значительно возрастает с увеличением концентрации ЫаНСОэ и при 50 мМ бикарбоната на долю комплексов [Мп(НС03)2] приходится около 40% от общего количества Мп24.

Рис. 3. Кинетика темнового ре-восстановления Р+ в «коровых» комплексах 77г. ¡¡Ы/чса в отсутствие экзогенных добавок (М) и в присутствии 0,5 мМ МпС12, добавленного совместно с 50 мМ ИаНСОз (•). Измерения проводили в среде, содержащей 50 мМ НереБ (рН 8,3), обедненной по СО2/НСО3".

Рис. 4. Доля Мп2+-бикарбонатных комплексов и аква-комплексов (Мпач2^ в водной среде (рН 8,3) в зависимости от концентрации КаНСОз. Для расчета графика использовали константы равновесия, приведенные в работах [Тихонов с соавт., 2006; Оаз§ир1а й а!., 2006].

Можно утверждать, что зависимость эффекта ускорения темновой релаксации Р+ с помощью Мп2+ от концентрации бикарбоната в наших экспериментах отражает возрастание в растворе количества электронейтральных «низкопотенциальных» комплексов [Мп(НС03)2], характеризующихся сравнимым с РЦ исследуемых бактерий потенциалом окисления Мп2+ (0,52 В), и поэтому термодинамически способных к взаимодействию с Р+. Нельзя полностью исключить возможность донирования электронов на Р+ и от комплексов [Мп(НСОэ)]+(с потенциалом окисления Мп2" около 0,61 В).

Исследование фотоокисления Мп2+ в присутствии ионов НС О/ реакционными центрами Кк ¡оЫозит с помощью ЭПР-спектросокопии

С целью подтверждения фотоокисления МтГ* (вероятно, до Мп3+) в присутствии ионов НСОз'бактериальными РЦ были проведены эксперименты с использованием метода ЭПР-спектроскопии.

На рис. 5 показан характерный шестилинейчатый сигнал ЭПР катиона Мп2+, возникающий в результате сверхтонкого взаимодействия с ядром 55Мп (I = 5/2), [Па8§ир1а Ы а1., 2006]. Данный спектр был получен при комнатной температуре в темноте в присутствии «коровых» комплексов Як. ¡ос1охшп, 0,25 мМ МпС12 и 50 мМ ИаНСОз (рН 8,3) и отражал содержание Мп2+ в растворе.

При освещении образцов с использованием светодиодов (880 нм, 32 мВт/см2) при комнатной температуре интенсивность ЭПР-сигнала Мп2+ уменьшалась вследствие фотоокисления Мп2+, и появлялся узкий сигнал (§ = 2), обусловленный образованием катион-радикала Р+.

По изменению интенсивности ЭПР-сигнала Мп2+ в точке 3201 Гс. которая максимально удалена от сигнала катион-радикала Р+, оценивали изменение концентрации Мп2+ в ходе эксперимента.

В темноте в присутствии «коровых» комплексов Як ¡ос1о.тт и 50 мМ ЫаНСОз интенсивность ЭПР-сигнала Мп2+ монотонно снижалась, так что 50%-ое уменьшение интенсивности сигнала происходило примерно в течение 30 мин (рис. 6, кинетика 1). Потеря интенсивности сигнала ЭПР, по-видимому, происходила в результате образования нерастворимого осадка МпСОэ [Dasgupta е1 а!., 2006]. Данная кинетика принималась в качестве контрольной («темновой»).

¡ i J

j í > pj [ A

Í>

í'á 1 j í 1 f

i i f; f / }

«¡»JW' i ! 1 j

1 ¡ j i i i ^

j/ i i í I f

í ! ,1 i ! ¥

3000 3200 3400 3600 3800

Магнитное поле, Гс

Рис. 5. Измерение ЭПР-сигнала Мп2+ при комнатной температуре образцов, содержащих 3 мкМ РЦ Ш. юйохит, 0,25 мМ МпСЬ, 50 мМ ЫаНСОз, 20 мМ Тп5-НС1 (рН 8,3), в темноте (сплошная линия) и при освещения светодиодом (880 нм, 32 мВт/см2). Условия измерения: частота СВЧ равна 9,7 ГГц, мощность СВЧ = 20 дБ.

I

ъ

О 200 400 600 S00 1000 1200 Время, с

Рис. 6. Кинетика интенсивности ЭПР-сигнала Мп2+ в точке 3201 Гс в образцах, содержащих 3 мкМ РЦ Rh. iodosum, 0,25 мМ МпС12, 20 мМ Tris-HCl (рН 8,3) в отсутствие (2) и в присутствии (3) 50 мМ ЫаНСОз в темноте (1) и при освещении (2, 3). ~ включение и выключение действующего света. Условия измерения: постоянная времени равна 0,655 с, амплитуда модуляции - 7,84 Гс, мощность СВЧ = 20 дБ.

Освещение «коровых» комплексов Юг. іосіошт в присутствии 0,25 мМ МпС12 и 50 мМ ИаНСОз приводило к немедленному снижению сигнала ЭПР Мп2+ (рис. 6, кинетика 3), обратимому в темноте. Никаких изменений ЭПР-сигнала Мп2+ не наблюдалось, если образцы освещали в отсутствие «коровых» комплексов Як. \odosum (не показано).

Некоторое фотоокисление Мп2+ «коровыми» комплексами Як. \odosum наблюдалось и в отсутствие добавленного бикарбоната (рис. 6, кинетика 2), хотя оно было в 3 раза ниже, чем в присутствии 50 мМ ЫаНС03, и могло быть связано с наличием бикарбоната в образце вследствие растворения в нем атмосферного С02.

Для подтверждения того, что потеря интенсивности ЭПР-сигнала Мп связана с фотоокислением Мп2+ до Мп3+ были проведены измерения ЭПР в параллельных модах при криогенных температурах (5К). На рис. 7 представлен дифференциальный «свет минус темнота» спектр ЭПР, возникающий в результате фотоокисления Мп2+ бактериальными РЦ. Основываясь на значении g-фaктopa и сверхтонком ращеплении 55Мп, данный сигнал (обнаруженный ранее при фотоокислении Мп2+ в препаратах ФС-2 [ТугуяЬкіп й а!., 2006]), можно отнести к Мп3+. Данный шестилинейчатый спектр в районе § = 8,18 возникал только в результате освещения образцов в присутствии 50 мМ бикарбоната, то есть в тех же условиях, в которых наблюдалось уменьшение ЭПР-сигнала Мп2+ (рис. 6).

3

600 700 800 900 1000 1100

Рис. 7. Сигнал ЭПР фотогенерируемого Мп3+ (верхний спектр), полученный в параллельных модах ЭПР-измерений образцов, содержащих 3 мкМ РЦ Юг. іосіошп, 0,25 мМ МпСЬ, 50 мМ ИаНСОз, 20 мМ Тгія-НСІ (рН 8,3), и моделированный ЭГТР-сигнал Мп3+ (нижний спектр). Условия измерения: частота СВЧ равна 9,3 ГГц, мощность СВЧ = 50,53 мВт, амплитуда модуляции = 10,49 Гс, частота модуляции = 100 кГц, постоянная времени = 81,92 мс, Т = 5К.

Магнитное поле, Гс

Таким образом, с помощью ЭПР-спектроскопии показано, что бикарбонат стимулиует фотоокисление Мп2+ до Мп3+ реакционными центрами пурпурной бактерии Як. Мохит.

Влияние величины F.„ пары РУР и стерической доступности Р+ на донирование электрона от Мп2+ на PIJ типа II аноксигенных фотосинтезирующих бактерий в присутствии бикарбоната

а) Rb. sphaeroides R-26

РЦ пурпурной бактерии Rb. sphaeroides R-26 является «классическим» и хорошо изученным объектом для исследования первичных процессов бактериального фотосинтеза. Значение Ега пары Р+/Р в РЦ этой бактерии, составляет около 0,50 В [bin et al., 1994].

В работе Кальмана с соавт. было показано, что в результате искусственного повышения величины Ет пары Р+/Р в мутантных РЦ Rb. sphaeroides R-26 до значения, равного 0,77 В, становится возможным фотоокисление Мп3+ в присутствии 15 мМ NaHC03 окисленными бактериальными РЦ, о чем свидетельствовало подавление светоиндуцированных спектральных изменений, связанных с фотоокисленным Р (экспериментально не было показано фотоокисления Mn2+) [Kaiman et al., 2003]. Однако, несмотря на это, исследователям не удалось выявить окислительно-восстановительного взаимодействия Мп2+ в присутствии бикарбоната с фотоокисленными РЦ Rb. sphaeroides R-26 дикого типа.

В ходе нашей работы в условиях, описанных выше для Rh. iodosum, освещение препаратов РЦ Rb. sphaeroides R-26 в течение 30 с переводило в «долгоживущее» окисленное состояние около 30 % фотоактивных РЦ. Время полного темпового ре-восстановления Р+ в таких РЦ составляло несколько минут, что хорошо видно из кинетики фотоокисления и темнового ре-восстановления первичного донора электрона, измеренной по изменению поглощения при 865 им (рис. 8). Значение Тщ восстановления «долгоживущих» окисленных РЦ в отсутствие добавок (контроль) составляло, примерно, 445 с (рис. 8, кинетика 1). В то же время, добавление 0,1 мМ K4[Fe(CN)6] приводило к быстрому и полному ре-восстановлению Р+, так что через 10 с после выключения действующего света фотоиндуцированные ДА полностью исчезали (рис. 8, кинетика 3).

В присутствии 0,5 мМ МпСЬ, добавленного совместно с 50 мМ NaHC03, также было выявлено ускорение темповой релаксации Р+ подобно тому, как это наблюдалось в экспериментах с K4[Fe(CN)6] (рис. 8, кинетика 2). При этом значение т1/2 восстановления «долгоживущих» окисленных РЦ уменьшалось более, чем в 4 раза по сравнению с контролем (в отсутствие добавок) и составляло около 100 с.

На рис. 9 показано сравнение дифференциальных спектров поглощения «свет минус темнота», измеренных через 420 с после выключения действующего света. Результаты свидетельствуют о практически полном ре-восстановлении Р+ в присутствии пары «0,5 мМ МпС12 плюс 50 мМ NaHC03» в данном интервале времени, и только примерно о 50%-ом ре-восстановлении «долгоживущих» окисленных РЦ в отсутствие добавок.

0,06 0,05 0,04 § 0,03

-200 0 200 400 600 800 ^ Время, с

Рис. 8. Кинетика фотоокисления Р и темнового ре-восстановления Р+ в РЦ КЬ. $ркаего\йе$ Я-26, измеренная по фотоиндуцированному изменению поглощения при 865 нм: 1 - в отсутствие добавок (контроль), 2 - в присутствии 0,5 мМ МпСЬ и 50 мМ ИаНСОз, 3 - в присутствии ОД мМ КдР^ООо]. Измерения проводили в среде, содержащей 50 мМ НереБ (рН 8,3), обедненной по СО2/НСО3". Т4- - включение и выключение действующего света.

700 750 800 850 900 950 Длина волны, нм

Рис.9. Дифференциальные спектры поглощения «свет минус темнота» РЦ КЬ. зр1игеюскз 11-26, регистрируемые через 10 с (1, 2 и 5 - сплошные линии) и через 420 с (3, 4 — прерывистые линии) после выключения действующего света в отсутствие добавок (1, 3) и в присутствии: 0,5 мМ МпСЬ плюс 50 мМ ЫаНСОз (2, 4), 0,1 мМ 1С,[Ке(СЫ)б] (5). Измерения проводили в среде, содержащей 50 мМ Нереэ (рН 8,3), обедненной по С02/НС03\

Как и в экспериментах, проведенных на препаратах из других пурпурных бактерий, которые были описаны выше, добавление к РЦ ЯЬ. ьркаегоМез Я-26 отдельно друг от друга МпС12 и ЫаНС03, так же как и замещение Мп2+ на ї^2+ или Са2+ (в присутствии №НС03), или замена бикарбоната на формиат, ацетат или оксалат (в присутствии МпС12), приводило к потере эффекта ускорения темнового ре-восстановления Р+ с помощью Мп2+ (рис. 10), что свидетельствовало о специфичности редокс-взаимодействия между Мп -

Рис. 10. Кинетика темнового ре-восстановления Р+ в РЦ Шз.ьркаегоісіез 11-26 в отсутствие добавок (контроль) (Ш) и в присутствии: а - 0,5 мМ МпСЬ (О); 50 мМ ИаНСОз (Д); 0,5 мМ МпС12 плюс 50 мМ КаНСОз (•); б - 0,5 мМ МёС12 плюс 50 мМ ИаНСОз (о); 0,5 мМ СаСЬ плюс 50 мМ ЫаНСОз (п); 0,5 мМ МпС12 плюс 50 мМ КаНСОг (V). Измерения проводили в среде, содержащей 50 мМ Нерея (рН 8,3), обеднеішой по СО2/НСО3".

Ускорение темнового ре-восстановления Р+ при добавлении МпС12 зависело от концентрации добавленного бикарбоната: в присутствии 0,5 мМ МпС12 эффект не наблюдался при концентрации ЫаНСОз, равной

бикарбонатными комплексами и Р+.

10-15 мМ, начинал проявляться только при 30 мМ бикарбоната и достигал максимума при 50-75 мМ бикарбоната (то есть в условиях, благоприятных для формирования и увеличения в растворе количества «низкопотенциальных» Мп2+-бикарбонатых комплексов).

б) С/. аигапИаст

РЦ зеленой нитчатой бактерии С/. аигаШ'шсш также относятся к РЦ типа II, однако характеризуются более низким значением Ет пары Р+/Р по сравнению с ЯЬ. sphaeraid.es 11-26. Согласно литературным данным, значение Ет пары Р+/Р в РЦ аигаЫ'шсив составляет 0,364),42 В [Вгисе Й а1., 1982; 81ш\'а1о\' е1 а1., 1986; УеШигоН апс!2аппош, 1988].

На рис. 11 показано, что при освещении препаратов в «долгоживущее» окисленное состояние переходило более 60 % фотоактивных РЦ, со временем жизни несколько десятков минут.

Согласно полученным данным, значение Тш восстановления «долгоживущих» окисленных РЦ в отсутствие добавок (контроль) составляло около 50 минут. Присутствие 0,1 мМ К4[Ре(СЫ)6] значительно ускоряло кинетику релаксации окисленных первичных доноров электрона в исследуемых препаратах, так что полное ре-восстановление Р+ наблюдалось через 400 с после выключения действующего света (рис. 11, кинетика 3). Добавление МпС12 совместно с №НС03 в условиях, характерных для формирования в растворе «низкопотенциальных» Мп2+-бикарбонатных комплексов (0,5 мМ МпС12 плюс 50 мМ ЫаНСОз, рН 8,3), не приводило к ускорению ре-восстановления Р+ (рис. 11 и 12).

Время, с Время, мин

Рис. 11 Кинетика фотоокисления Р и темнового ре-восстановления Р+ в РЦ С/. аигапИасиз, измеренная . по фото-индуцироваиным ДА при 865 нм: 1 - в отсутствие добавок (контроль), 2 - в присутствии 0,5 мМ МпС12 плюс 50 мМ ИаНСОз, 3 - в присутствии 0,1 мМ К4Ре(СМ)6] Измерения проводили в среде, содержащей 50 мМ Нерез (рН 8,3), обедненной по СО2/НСО3". Т4- - включение и выключение действующего света.

Рис. 12. Кинетика темнового ре-вос-сгановления Р+ в РЦ С/, аигапііаст, полученная на основе значений ДА при 865 нм, вычисленных из дифференциальных спектров поглощения «свет минус темнота» в отсутствие добавок (контроль) (■) и в присутствии 0,5 мМ МпС12 плюс 50 мМ №НСОз (О). Измерения были сделаны в среде, содержащей 50 мМ Нереї (рН 8,3), обедненной по СО2/НСО3".

По-видимому, недостаточно высокий Ет пары Р+/Р С/. аигапНаст, по сравнению с потенциалом окисления Мп2+ в составе Мп +-бикарбонатых комплексов, делает термодинамически затруднительным допирование электрона от Мп2+ к окисленным РЦ данной бактерии.

в) Ск ттиНяятит

В отличие от описанных выше бактерий, в состав РЦ серной пурпурной бактерии СИ. тіпи^ітит помимо характерной «триады» белковых субъединиц (II, МиЦ входит мультигемная цитохромная субъединица (С-субъединица), образующая прочный комплекс с РЦ [СЬашогоузку еі аі, 1998].

Согласно литературным данным, величина Ел, пары Р/Р в РЦ СИ. тіпиґ^ітит составляет 0,50 В [Проскуряков с соавт., 1978] (как и Ешпары Р+/Р в РЦ КЬ. ьрИаегоШх 11-26).

Кинетика фотоокисления и темнового ре-восстановления Р в РЦ СИ. тгпШштит, измеренная по изменению поглощения при 790 нм, представлена на рис. 13. В результате освещения «коровых» комплексов Ск тіпи^ітит в течение 30 с, в «долгоживущее» окисленное состояние переходило около 30% фотоактивных РЦ (рис. 13). В присутствии ОД мМ К4|Ре(СЫ)б] происходило значительное ускорение темповой релаксации Р+(рис. 13 кинетика 3). Однако, в присутствии пары «0,5 мМ МпС12 плюс 50 мМ ШНСОз» не наблюдалось ускорения темновой релаксации Р+ рис. 13 (кинетика 2), в отличие от того, как это было показано ранее на препаратах Ш Шояит, Як гоЫ&поьит, Тк зіЬігіса и ЯЬ. ярИаегоісІез К.-26.

Рис. 13. Кинетика фотоокисления Р и темнового ре-восстановления Р Ск. тіпШіїзітит, измеренная по фотоиндуцированиым ДА при 790 нм: 1 -в отсутствие добавок (контроль), 2 - в присутствии 0,5 мМ МпСЬ плюс 50 мМ МаНСОз, 3 - в присутствии 0,1 мМ К4[Ре(СМ)о]. Измерения проводили в среде, содержащей 50 мМ Нереэ (рН 8,3), обедненной по СО2/НСО3". 1"4- -включение и выключение действующего света.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что цитохром, прочно связанный с РЦ Ск тти^тит на донорной стороне, по-видимому, не позволяет Мп2+-бикарбонатным комплексам взаимодействовать непосредственно с Р+, как это возможно в РЦ ЯЬ. $рИаего1с1гз 11-26. В то же время, даже высокопотенциальный гем цитохрома, окисляемый непосредственно катион-радикалом Р+, не способен к окислению «низкопотенциальных» комплексов [Мп(НС03)2], поскольку его Ет равен 0,39 В [СЬашогоУБку й а1., 1998], что недостаточно для окисления Мп2+ в составе комплекса с бикарбонатом (хотя достаточно для окисления К4[Ре(СМ)б])-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об окислительно-восстановительном взаимодействии катионов Мп2+ в присутствии бикарбоната (рН 8,3) с Р+ в РЦ типа II, выделенных из аноксигенных пурпурных бактерий Ш. ¡ос1о$ит, НИ. гоЫ^шоьит, Тк. й'гЬтса и ЯЬ. $ркаего'к1е$ 11-26. В присутствии 0,5 мМ МпС12 и 50 мМ ЫаНСОз отмечалось ускорение ре-восстановления генерируемого на свету Р+, а также фотоиндуцированное окисление Мп2+ до Мп3+ бактериальными РЦ. Было показано, что наблюдаемый в присутствии пары «МпС12 плюс ЫаНС03» эффект ускорения ре-восстановления Р+ является специфичным для Мп2+-бикарбонатных комплексов, поскольку добавление к препаратам отдельно друг от друга МпС12 и ЫаНС03 или замена Мп2+ (в присутствии бикарбоната) на другие двухвалентные катионы (Мд2+ или Са2+), или замена бикарбоната (в присутствии МпС12) на другие схожие с ним по структуре анионы (формиат, ацетат или оксалат) приводило к потере эффекта. Результаты исследований зависимости эффекта от концентрации бикарбоната позволяют предположить электронейтральный комплекс [Мп(ИСОз)2] (с потенциалом окисления Мп2+, равным 0,52 В) в качестве донора электрона на Р+ бактериальных РЦ (хотя не исключено и участие комплекса [Мп(НСОэ)]+ в этой реакции).

Способность Мп2+ (в присутствии бикарбоната) к допированию электрона на Р+ зависела от величины Еш пары Р+/Р в РЦ исследуемых бактерий, а также от стерической доступности Р+ для взаимодействия с экзогенными донорами электрона, что потверждало окислительно-восстановительную природу взаимодействия между Мп2+-бикарбонатными комплексами и Р+. Так, недостаточно высокое значение Ет пары Р+/Р в РЦ С/. аигапИасия (равное, согласно разным источникам, 0,36-0,42 В), как и присутствие прочно связанного с РЦ СИ. ттиНьяШит цитохрома (высокопотенциальный гем которого, окисляемый непосредственно Р+, также характеризуется недостаточно высоким значением Еш, равным 0,39 В) приводило к потере изучаемого эффекта ускорения ре-восстановления Р+ в присутствии пары «МпС12 плюс ЫаНСОз».

Полученные результаты рассматриваются нами в качестве экспериментального подтверждения гипотезы о возможной ключевой роли Мп2+-бикарбонатных комплексов в эволюционном переходе от аноксигенного к оксигенному фотосинтезу, согласно которой, в архейский период в условиях, благоприятных для образования «низкопотенциальных» Мп2+-бикарбонатных комплексов, аноксигенные бактерии могли использовать их сначала в качестве донора электрона, а затем в качестве «строительных» блоков для формирования Мп-содержащего энзиматического центра, способного к окислению воды, что могло привести к появлению первых 02-выделяющих цианобактерий.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена способность катионов Мп2+ в присутствии бикарбоната к окислительно-восстановительному взаимодействию с окисленным первичным донором электрона, Р+, реакционных центров (РЦ) типа II в препаратах из аноксигенных фотосинтезирующих бактерий ЮюйохиЫт \odosum, Юю(1ош1ит гоЬ'^тозит, ТЫогкойозр'и-а я1Ыпса и ВкойоЪасгег БрЫегохйез 11-26, что проявляется как в ускорении ре-восстановления генерируемого на свету Р+, так и в фотоиндуцированном окислении экзогенного Мп2+ до Мп3+.

2. Показано, что наблюдаемый в присутствии пары «МпС12 плюс ЫаНСОз» эффект ускорения ре-восстановления Р+ в РЦ исследуемых пурпурных бактерий является специфичным для Мп2+-бикарбонатных комплексов, поскольку добавление к препаратам отдельно друг от друга МпС12 и ЫаНСОз или замена Мп2+ на М§2+ или Са2+ (в присутствии бикарбоната), или замена бикарбоната на формиат, ацетат или оксалат (в присутствии МпС12) приводит к потере эффекта. Зависимость эффекта ускорения темновой релаксации Р+ с помощью Мп2+ от концентрации бикарбоната позволяет предположить участие «низкопотенциальных» комплексов [Мп(НС03)2] (характеризующихся потенциалом окисления Мп2+ до Мп равным 0,52 В) в окислительно-восстановительном взаимодействии с Р+.

3. Показано, что способность Мп2+ (в присутствии бикарбоната) к дотированию электрона на Р+ в РЦ исследуемых аноксигенных фотосинтезирующих бактерий зависит от величины Ет пары Р /Р, что подтверждает окислительно-восстановительную природу взаимодействия между Мп2+-бикарбонатными комплексами и Р .

4. Полученные данные можно рассматривать в качестве экспериментального подтверждения гипотезы о возможной ключевой роли Мп -бикарбонатных комплексов в эволюционном переходе от аноксигениого к оксигенному фотосинтезу, согласно которой, в архейский период в условиях, благоприятных для образования «низкопотенциальпых» комплексов [Мп(НСЮ3)2], аноксигенные бактерии могли использовать их сначала в качестве донора электрона, а затем в качестве «строительных» блоков для формирования Мп-содержащего энзиматического центра, способного к окислению воды, что могло привести к появлению первых 02-выделяющих цианобактерий.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Khorobrykh А.А., Terentvev V.V.. Zharmukhamedov S .К. and Klimov V.V. (2008) Redox interaction of Mn-bicarbonate complexes with reaction centres of purple bacteria. Phil. Trans Я Soc. В., 363, 1245-1251.

2. Терентьев В.В.. Шкуропатов А.Я., Шкуропатова В.А., Шувалов В.А. и Климов В.В. (2011) Исследование окислительно-восстановительного взаимодействия Мп-бикарбонатных комплексов с реакционными центрами Rhodobacter sphaeroides R-26, Chromatium minutissmum и Chloroflexus aurantiacus. Биохимия, 76, 1686-1694.

Статьи в периодических научных изданиях:

3. Хоробрых А.А., Терентьев В.В.. Яныкин Д.В. и Климов В.В. (2010) Возможная роль Мп-бикарбонатных комплексов в эволюционном переходе от аноксигенного фотосинтеза к оксигенному. Труды Института микробиологии им. С.Н. Вииоградского, вып. 15: Фотосинтезирующие микроорганизмы (отв. ред. В.Ф. Гальченко). 117-133.

4. Хоробрых А. А.. Терентьев В.В. и Климов В.В. (2011) Роль Мп-бикарбонатных комплексов в эволюционном переходе от аноксигенного фотосинтеза к оксигенному. Геобиологические процессы в прошлом: Проблемы ранней эволюции фотосинтеза (отв. ред. В.М. Горленко и C.B. Рожнов). 107-124. Москва, ПИН РАН.

Материалы конференций и тезисы докладов:

5. Термггьев В.В.. Хоробрых А.А., Жармухамедов С.К. и Климов В.В. Окислительно-восстановительное взаимодействие Мп-бикарбонатных комплексов с реакционными центрами пурпурных бактерий. Экспериментальное доказательство гипотезы об участии Мп-бикарбонатных комплексов в эволюционном происхождении оксигенного фотостггеза // Международная конференция «Биология: теория, практика, эксперимент», Саранск, январь 2008. Сборник материалов в 2-х кн, кн.1.251-256.

6. Климов В.В., Хоробрых А.А. и Терентьев В.В. Возможная роль Мп-бикарбонатных комплексов в эволюционном происхождении оксигенных микроорганизмов // Международная конференция «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний», Улан-Удэ - Улаанбаагар, 5-16 сентября 2011 г. Материалы международной конференции, 100-103.

7. Терентьев В.В.. Шкуропатов А.Я., Шкуропатова В.А., Шувалов В.А. и Климов В.В. Окислительно-восстановительное взаимодействие Мп-бикарбонатных комплексов с реакционными центрами типа II из аноксигенных фотостггезирующих бактерий // VI Съезд Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, 15-22 сентября 2011. Материалы съезда, С. 28.

8. Терентьев В.В.. Шкуропатов А.Я., Шкуропатова В.А., Шувалов В.А. и Климов В.В. Влияние Мп-бикарбонатных комплексов на темновое ревосстановление фотоокисленных реакционных центров типа II m аноксигенных фотосинтезирующих бактерий: Rhodobacter shaeroides R-26, Chromatium minutissimum и Chloroflexus aurantiacus // 15-я междунродная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 18-22 апреля 2011 г. Сборник тезисов, С. 421.

9. Терентьев В В.. Хоробрых А.А., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. и Климов В.В. Фотоокисление Мп2+ бактериальными реакционными центрами типа П из аноксигенных фотосинтезирующих бактерий в присутствии бикарбоната // Школа-конференция молодых ученых на базе Института фундаментальных проблем биологии РАН «Биосистема: от теории к практике», Пущино, 4-5 октября 2012 г. Программа конференции, тезисы докладов, 21-22.

10. Терентьев В.В- Хоробрых Â.A., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. и Климов В.В. Фотоокисление Mn+ в присутствии бикарбоната бактериальными реакционными центрами типа II // Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и

Подписано в печать:

24.04.2013

Заказ № 8421 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Объем: 1 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Терентьев, Василий Валерьевич, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

п4?иі~ => А9

ТЕРЕНТЬЕВ ВАСИЛИИ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ Мп-БИКАРБОНАТНЫХ КОМПЛЕКСОВ С РЕАКЦИОННЫМИ ЦЕНТРАМИ ТИПА II АНОКСИГЕННЫХ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Климов

ПУЩИНО -2013

(

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ..............................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................8

1.1. ПОЯВЛЕНИЕ ФОТОСИНТЕЗА........................................................................................8

1.2. КЛАССИФИКАЦИЯ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХБАКТЕРИЙ..................................10

1.3. МЕХАНИЗМ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЭНЕРГИИ СВЕТА ПРИ ФОТОСИНТЕЗЕ.........11

1.4. РЕАКЦИОННЫЕ ЦЕНТРЫ ПУРПУРНЫХ И ЗЕЛЕНЫХ НИТЧАТЫХ БАКТЕРИЙ.......................................................................................................................12

1.5. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФОТОСИСТЕМЫ 2.........17

1.6. ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ БИКАРБОНАТА В ФОТОСИСТЕМЕ 2...................26

1.7. СОСТАВ И ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСОВ

Мп2+ С БИКАРБОНАТОМ...............................................................................................32

1.8. ГИПОТЕЗА О КЛЮЧЕВОЙ РОЛИ Мп2+-БИКАРБОНАТНЫХ КОМПЛЕКСОВ В ЭВОЛЮЦИОННОМ ПЕРЕХОДЕ ОТ АНОКСИГЕННОГО К ОКСИГЕННОМУ ФОТОСИНТЕЗУ..............................................................................35

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................................................................39

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................................39

2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ «КОРОВЫХ» КОМПЛЕКСОВ ИЗ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ:

Як юйоъит, Як. robiginosum, Тк хШНса и Ск ттийвьшит......................................39

2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ КОМПЛЕКСОВ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ ИЗ

С/. аигапНасш и ЯЪ. sphaeroid.es Я-26............................................................................40

2.3. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ «КОРОВЫХ» КОМПЛЕКСОВ БАКТЕРИЙ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ОКРАСКА ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХГЕЛЕЙ

НА ГЕМЫ ЦИТОХРОМА................................................................................................41

2.4. ИЗМЕРЕНИЕ СРЕДНЕТОЧЕЧНОГО ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛА ПАРЫ Р+/Р В «КОРОВЫХ» КОМПЛЕКСАХ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ.................................................................41

2.5. УДАЛЕНИЕ С02/НС03~ ИЗ РАСТВОРОВ.....................................................................42

2.6. ИЗМЕРЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫХ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ...................42

2.7. ИЗМЕРЕНИЕ КИНЕТИКИ ФОТООКИСЛЕНИЯ Р И РЕ-ВОССТАНОВЛЕНИЯ

Р+ В РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ БАКТЕРИЙ.............................................................43

2.8. ЭПР-ИЗМЕРЕНИЕ ФОТООКИСЛЕНИЯ Мп2+ РЕАКЦИОННЫМИ ЦЕНТРАМИ ПУРПУРНОЙ БАКТЕРИИ Як Шояит..................................................44

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................45

3.1. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Мп2+ В ПРИСУТСТВИИ БИКАРБОНАТА

С РЕАКЦИОННЫМИ ЦЕНТРАМИ ТИПА IIАНОКСИГЕННЫХ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ......................................................................45

3.1.1. Исследование окислительно-восстановительного взаимодействия Мп2+ в

присутствии бикарбоната с РЦ аноксигенных пурпурных Ее-окисляющих бактерий ЯН. юйоьит и Як гоЪщтозит.....................................................................45

3.1.2. Исследование окислительно-восстановительного взаимодействия Мп2+ в

присутствии бикарбоната с РЦ серной алкалофильной бактерии

Тк згЫпса........................................................................................................................60

3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТООКИСЛЕНИЯ Мп2+В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ НС03~ РЕАКЦИОННЫМИ ЦЕНТРАМИ Як Шоиит С ПОМОЩЬЮ ЭПР-СПЕКТРОСКОПИИ...............................................................................................67

3.3. ВЛИЯНИЕ ВЕЛИЧИНЫ Ет ПАРЫ РУР И СТЕРИЧЕСКОЙДОСТУПНОСТИ Р+НА ДОНИРОВАНИЕ ЭЛЕКТРОНА ОТ Мп2+ НА РЕАКЦИОННЫЕ ЦЕНТРЫ ТИПАП АНОКСИГЕННЫХ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ПРИСУТСТВИИ БИКАРБОНАТА.........................................................73

3.3.1. Исследование окислительно-восстановительного взаимодействия Мп2+

в присутствии бикарбоната с реакционными центрами ЯЬ. зркаего1с1е5Я-2б.....1Ъ

3.2.2. Влияние величины Ет пары Р+/Р на допирование электрона от Мп2+

на реакционный центр С/. аигапНасиз в присутствии бикарбоната......................82

3.2.3. Влияние цитохромной субъединицы на допирование электрона от Мп2+

на реакционный центр Ск ттиШвШит в присутствии бикарбоната..................87

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................................................95

ВЫВОДЫ................................................................................................................................97

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................98

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

РЦ - реакционный центр

Хл - хлорофилл

БХл - бактериохлорофилл

Р - первичный донор электрона

Фео - феофитин

БФео - бактериофеофитин

<}а, <Зв - первичный и вторичный хиноновые акцепторы электрона

Уг (Туг■£) -вторичный донор электрона ФС-2

Кар - каротиноид

ФС-1 - фотосистема 1

ФС-2 - фотосистема 2

ЬН - светособирающий комплекс

ВОК - водоокисляющий комплекс ФС-2

апо-ВОК-ФС-2 - фотосистема 2 с удаленным Мп-кластером

БК - бикарбонат

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

Ет - среднеточечный окислительно-восстановительный потенциал АР - фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции Хл ФС-2

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Появление оксигенных фотосинтезирующих организмов более 2,5 млрд лет назад привело к накоплению О2 в атмосфере Земли, кардинальной перестройке биосферы и возникновению аэробной жизни [Holland and Rye, 1998; Des Marais, 2000; Dismukes and Blankenship, 2005].

Кислород-выделяющая фотосистема 2 (ФС-2) растений и цианобактерий состоит из двух основных функциональных блоков: (1) фотохимического реакционного центра (РЦ), в котором происходит превращение энергии возбуждения хлорофилла, поглотившего квант света, в энергию разделенных зарядов, в результате чего образуется самый сильный биологический окислитель - катион-радикал первичного донора электрона - хлорофилла Рб80 (Рб80+')> и (2) водоокисляющего комплекса (ВОК), который многократно окисляется с помощью Р680+ через вторичный донор электрона, Yz, и, в свою очередь, окисляет Н2О до Ог [подробнее см. Renger, 2001]. Накопление окислительных эквивалентов, необходимых для четырехэлектронного окисления воды, происходит в Mn-кластере ВОК, содержащем четыре катиона Мп и один катион Са [Umena et al., 2011].

Наиболее вероятными эволюционными предшественниками ФС-2 являются РЦ пурпурных бактерий, которые, так же как и РЦ ФС-2, относятся к типу II [Blankenship, 1992; Allen and Williams, 1998], хотя путь эволюционного перехода от аноксигенного фотосинтеза к оксигенному остается неясным. В бактериохлорофилл-содержащих РЦ аноксигенных бактерий значение среднеточечного окислительно-восстановительного потенциала (Ет) пары Р870+/Р87о составляет лишь около 0,50 В [Lin et al., 1994], которого достаточно для окисления ионов железа, некоторых органических и сульфидных соединений, используемых аноксигенными фототрофами в качестве доноров электрона, но недостаточно для окисления марганца.

В последнее время развиваются представления о возможной роли Мп -бикарбонатных комплексов в эволюционном происхождении Mn-кластера ВОК [Dismukes et al., 2001; Kozlov et al., 2004; Dasgupta et al., 2006]. Электрохимические и ЭПР-измерения [Козлов с соавт., 1997; Kozlov

et al., 2004; Dasgupta et al., 2006] показали, что в присутствии ионов бикарбоната окисление ионов Мп значительно облегчается: потенциал одноэлектронного

■ух

окисления Мп , равный 1,18 В для водного комплекса, понижается до 0,61 и 0,52 В при

формировании, соответственно, комплексов [Мп(НСОз)]+ и [Мп(НСОз)г]. Образование таких

«легкоокисляемых» Мп2+-бикарбонатных комплексов облегчает фотоокисление Мп2+ в

процессе фотоиндуцированного формирования неорганического ядра ВОК из фотосистемы

2+ 2+

2, не содержащей Mn-кластер (апо-ВОК-ФС-2) и неорганических кофакторов Мп и [Klimov et al., 1995a, b; 1997a; Allakhverdiev et al., 1997; Baranov et al., 2000; Baranov et al.,

2004; Ког1оу й а1., 2004]. Кроме того, потенциал окисления Мп2+-бикарбонатных комплексов настолько низок (0,52 В), что можно ожидать их фотоокисление даже РЦ аноксигенных фотосинтезирующих бактерий. Вследствие этого было предположено, что такие комплексы могли использоваться аноксигенными бактериями в качестве доноров электронов и «строительных блоков» в процессе формирования первых 02-выделяющих РЦ ^этикев сг а1„ 2001; Ког1оу й а1., 2004; Баз£ир1а й а1., 2006].

Целью данной работы было экспериментальное исследование возможности донирования электрона от Мп в присутствии бикарбоната на реакционный центр типа II аноксигенных фотосинтезирующих бактерий дикого типа. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) с помощью дифференциальной абсорбционной спектрофотометрии и ЭПР-

спектрометрии исследовать возможность окислительно-восстановительного взаимодействия 2+

Мп в присутствии бикарбоната с РЦ типа II аноксигенных фотосинтезирующих бактерий;

2) изучить специфичность окислительно-восстановительного взаимодействия пары «МпСЬ плюс МаНСОз» с РЦ исследуемых бактерий;

3) провести сравнительные исследования взаимодействия Мп2+ в присутствии бикарбоната с РЦ бактерий,

различающихся по величине Ет пары Р /Р.

Научная новизна работы. Впервые с помощью методов оптической спектрофотометрии показана способность катиона Мп2+ в присутствии бикарбоната к редокс-взаимодействию с Р+ в РЦ типа II аноксигенных фотосинтезирующих бактерий дикого типа: Ккойо\и1ит (Як.) юйозит, Як robiginosum, ТЫогкойозргга (ТИ.) згЫпса, КкойоЪа^ег (ЯЬ.) sphaeroid.es 11-26. С помощью ЭПР-спектроскопии выявлено, что №НСОз стимулирует фотоокисление Мп2+ до Мп3+ реакционными центрами Як юйоьит.

Установлено, что наблюдаемый в присутствии пары «МпСЬ плюс ЫаНСОз» эффект

+ 2+ ускорения темнового ре-восстановления Р является специфичным для Мп -бикарбонатных

2+

комплексов: добавление МпСЦ и ЫаНСОз отдельно друг от друга, так же как и замена Мп в присутствии КаНСОз на другие двухвалентные катионы (М§2+, Са2+) или замена бикарбоната (в присутствии Мп ) на схожие по структуре анионы (формиат, ацетат, оксалат) приводит к потере эффекта. Результаты исследований зависимости эффекта от концентрации бикарбоната позволяют предположить электронейтральный комплекс [Мп(НСОз)2] (с потенциалом окисления Мп2+, равным 0,52 В) в качестве донора электрона на Р+ бактериальных РЦ (хотя, не исключено и участие комплекса [Мп(НСОз)]+ в этом процессе). Обнаружено, что способность Мп (в присутствии бикарбоната) к донированию электрона на Р+ зависит от величины окислительно-восстановительного потенциала пары Р+/Р, что подтверждает окислительно-восстановительную природу взаимодействия между Мп2+ и Р+.

Практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в решение фундаментальной проблемы - изучение механизмов формирования и эволюционного происхождения Мп-содержащего водоокисляющего комплекса фотосистемы 2, а также могут послужить основой для разработки принципов создания искусственных систем на основе пигмент-белковых комплексов, преобразующих и запасающих солнечную энергию.

Апробация работы. Результаты и основные положения работы были представлены на международной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, январь 2008 г.), 15-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011 г.), международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ -Улаанбаатар, 5-16 сентября 2011 г.), У1-м съезде Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, Краснодарский край, 15-22 сентября 2011 г.), школе-конференции молодых ученых на базе Института фундаментальных проблем биологии РАН «Биосистема: от теории к практике» (Пущино, 4-5 октября 2012 г.), международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика'12» (Пущино, 22-24 октября 2012 г.).

Личный вклад соискателя. Диссертация выполнена самостоятельно. Автор участвовал в постановке и решении всех экспериментальных задач, обработке результатов и формулировке выводов. Соавторы, принимавшие участие в совместных исследованиях, указаны в соответствующих разделах диссертации.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе _4 статьи: _1_ статья в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), _1_ в реферируемом зарубежном журнале, 2 в периодических научных изданиях и б в материалах коференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 112 страницах, иллюстрирована 47 рисунками. Список литературы содержит 181 источник (из них 172 на английском языке).

I

Ч I

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ПОЯВЛЕНИЕ ФОТОСИНТЕЗА

Фотосинтез - важнейший процесс в биосфере Земли, в результате которого энергия солнечного излучения, поглощенная растениями и бактериями, используется для синтеза органических молекул.

Согласно современным представлениям, фотосинтезирующие организмы были одними из первых жизненных форм на Земле [Blankenship, 1992; Braiser et al., 2002; Olson and Blankenship, 2004; Dismukes and Blankenship, 2005; Rashby et al., 2007]. Возникновение аноксигенного фототрофного метаболизма, по-видимому, произошло сразу же после

появления хемосинтетического метаболизма, а в начале архейской эры он приобрел

2+ 2

широчайшее распространение, поскольку восстановительные субстраты (такие как Fe , S восстановленные углеводы и др.) и СО2 были в избытке [Holland and Rye, 1998; Des Marais, 2000; Dismukes and Blankenship, 2005]. В пользу раннего возникновения фототрофного метаболизма свидетельствуют различные факты. Например, дата появления фототрофных микроорганизмов (около 3,5-3,7 млрд. лет назад), определенная с помощью сравнительного исследования генов 16S рибосомальной РНК (рРНК) (метод молекулярных часов), хорошо совпадает со временем происхождения наиболее древних строматолитов, которые многими исследователями признаются окаменелыми остатками цианобактериальных матов [Awramik, 1992; Buick, 1992; Schopf et al., 2007]. Однако цианобактерии легко спутать с нитчатыми аноксигенными бактериями эволюционно древней группы Cloroflexi, морфологически неотличимыми от цианобактерий. Учитывая анаэробные условия атмосферы и гидросферы в то время, нельзя исключить, что древнейшие бактериальные маты формировались не цианобактериями, а анаэробными нитчатыми фототрофными бактериями при участии одноклеточных пурпурных и зеленых серных бактерий.

Данные изотопных исследований, касающихся автотрофной фиксации углерода (эффект фракционирования стабильных изотопов С12/С13, сопровождающий фотосинтез), отодвигают эту дату еще дальше, до 3,8 млрд. лет назад [Schidlowski, 1988; Schopf et al., 2007] и, в свою очередь, подтверждают, что организмы, останками которых являются строматолиты, были фотосинтетиками.

Таким образом, согласно литературным данным фототрофные организмы появились 3,5-3,8 млрд. лет назад. Оксигенный фотосинтез возник гораздо позже. Принято считать, что оксигенные фотоавтотрофы (цианобактерии) появились 2,5 - 2,7 млрд. лет назад.

Описаны остатки цианобактерий из провинции Трансвааль (2,55 млрд. лег назад) в Южной Африке и в более древних толщах серии Фортескью (2,7 млрд. лет назад) в Западной Австралии. Органические породы из Пилбары (Австралия), которым около 2,7 млрд. лет, сохранили биомаркеры цианобактерий - диметилгопаны [Summons, 1999]. Молекулярный кислород начал накапливаться в атмосфере Земли 2,3- 2,2 млрд. лет назад [Buick, 1992; Holland and Rye, 1998] и, вернее всего, он был фотосинтетического происхождения [Holland and Rye, 1998; Farquhar et al, 2000; Kasting and Seifert, 2002].

Появление фотоавтотрофных организмов и оксигенных цианобактерий показано на геохронологической шкале времени (рис. 1).

Рис. 1. «Биологические часы» Земли. Предполагаемое время важнейших биосферных событий. Возникновение фототрофных организмов - 3,5-3,8 млрд. лет назад, возникновение цианобактерий и начало накопления 02 в атмосфере - 2,7 млрд. лет назад. Рисунок взят из работы [Des Marais, 2000].

Современные цианобактерии являются наиболее простыми из кислород-выделяющих организмов, тем не менее, по организации фотосинтетического аппарата они обнаруживают довольно сильное сходство с высшими растениями.

Примитивная оксигенная бактерия, которая могла быть эволюционным предшественником цианобактерий не обнаружена.

1.2. КЛАССИФИКАЦИЯ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Процесс фотосинтеза, как в прокариотах, так и в эукариотах обнаруживает поразительное сходство, что дает полное основание считать, что все (бактерио-)хлорофилл-содержащие фотосинтезирующие организмы произошли от единого фотосингезирующего предка.

Аноксигенные фотосинтетики, которые абсолютно все являются прокариотами, традиционно классифицируются на семейства на основе фенотипа, содержащихся в них пигментов и особенностей метаболизма [Pfenning and Trüper, 1983; Imhoff, 1995; Madigan and Ormerod, 1995; Pierson and Castenholz, 1995; Gemerden and Mas, 1995]. Однако существует и другая классификация, получившая сейчас довольно широкое п�