Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль марганец-бикарбонатных комплексов в каталазной и водоокисляющей активностях фотосистемы 2

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль марганец-бикарбонатных комплексов в каталазной и водоокисляющей активностях фотосистемы 2"

На правах рукописи

Тихонов Константин Геннадьевич

РОЛЬ МАРГАНЕЦ-БИКАРБОНАТНЫХ КОМПЛЕКСОВ В КАТАЛАЗНОЙ И ВОДООКИСЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТЯХ ФОТОСИСТЕМЫ 2

03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2008

003168701

Работа выполнена в Институте фундаментальных проблем биологии РАН

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор

Климов Вячеслав Васильевич

кандидат химических наук Козлов Юрий Николаевич

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Любимов Валерий Юрьевич

доктор биологических наук Семенов Алексей Юрьевич

Ведущая организация Институт биохимии

им АН Баха РАН

Защита состоится 22 мая 2008 г в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002 066 01 в Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу 142290, Московская обл , г Пущино, ул Институтская, д 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН

Автореферат разослан « » апреля 2008 г

Ученый секретарь, кандидат биологических наук

ГН Назарова

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Способность окислять воду с выделением молекулярного кислорода за счет энергии поглощенного света - одно из важнейших эволюционных приобретений живой природы Фотосинтетическое окисление воды - основной источник как электронов, используемых для восстановления С02 при фотосинтезе, так и молекулярного кислорода в атмосфере Окисление воды и выделение 02 при фотосинтезе осуществляется в фотосистеме 2 (ФС-2) - пигмент-белковом комплексе, погруженном в тилакоидную мембрану ФС-2 состоит из трех основных функциональных частей 1) светособирающего комплекса, улавливающего кванты света и передающего энергию возбуждения хлорофилла на реакционный центр ФС-2, 2) фотохимического реакционного центра, в котором происходит преобразование энергии возбужденного хлорофилла в энергию разделенных зарядов, 3) водоокисляющего комплекса (ВОК), окисляемого реакционным центром и, в свою очередь, окисляющего воду с выделением 02. ВОК расположен на люменальной стороне тилакоидной мембраны Он включает неорганическое ядро, состоящее из 4 атомов Мп и одного атома Са, три водорастворимых белка с мол м 17, 23 и 33 кДа, ионы СГ и, возможно, НСОз" Механизм фотосинтетического окисления воды остается малоизученным, что во многом связано со сложностью строения ВОК и его неустойчивостью при выделении из хлоропластов

В ряде работ было показано стимулирующее влияние бикарбоната на устойчивость ВОК к повреждающим воздействиям, на Мп-индуцируемое восстановление переноса электронов и выделения 02 в препаратах ФС-2 с разрушенным ВОК Согласно одному из предположений, действие бикарбоната обусловлено образованием комплексов с ионами Мп Изменение окислительно-восстановительных свойств Мп при образовании комплексов с бикарбонатом может быть важным для функционирования Мп в составе ВОК или для формирования ВОК из неорганических составляющих Выяснение свойств Мп-бикарбонатных комплексов и их возможной роли во взаимодействии Мп с ФС-2 может дать сведения как о строении и функционировании ВОК, так и о его эволюционном возникновении

Модельной системой для изучения влияния бикарбоната на свойства ионов Мп в окислительно-восстановительных реакциях может также служить известная каталитическая активность комплексов Мп" с бикарбонатом в разложении Н202 на 02 и воду Сведения о каталазной активности Мп-бикарбонатных комплексов могут быть полезны для объяснения природы предполагаемой каталазной активности ВОК Литературные данные о наличии каталазной активности у ВОК противоречивы, что во многом связано с высокой активностью фермента каталазы, присутствующей в препаратах ФС-2 Изучение взаимодействия ВОК с Н202 - возможным

промежуточным продуктом реакции окисления воды - важно для выяснения природы окислительно-восстановительных состояний ВОК ^-состояний) и их переходов и может помочь в раскрытии механизма фотосинтетического окисления воды

Таким образом, изучение свойств Мп-бикарбонатных комплексов важно для понимания механизма взаимодействия ионов Мп" с ФС-2 и выяснения роли бикарбоната в функционировании ФС-2

Цель и задачи. Цель работы - исследование роли марганец-бикарбонатных комплексов в окислительно-восстановительном взаимодействии ионов марганца с безмарганцевыми препаратами ФС-2, а также в каталазной активности ФС-2 Были поставлены следующие основные задачи

1 Изучение влияния бикарбоната, ацетата и формиата на светозависимый перенос электронов от ионов Мп11 к реакционным центрам препаратов ФС-2, не содержащих неорганического кластера ВОК

2 Определение потенциала окисления Мп" до Мп1" в присутствии бикарбоната, ацетата и формиата, а также состава и констант устойчивости образующихся комплексов Мпш при электрохимическом окислении Мп"

3 Определение состава и констант устойчивости комплексов Мп" с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при электрохимическом восстановлении Мп"

4 Выяснение природы каталазной активности Мп"-бикарбонатных комплексов

5 Изучение каталазной активности ВОК

Научная новизна. Обнаружено, что ацетат и формиат, в отличие от бикарбоната, не способствуют переносу электронов от ионов Мп" к реакционным центрам препаратов ФС-2, не содержащих энзиматического Мп-содержащего центра ВОК Показано, что в присутствии бикарбоната, формиата и ацетата потенциал электрохимического окисления (Е°) Мп" до Мп"1 (равный 1,18 В для аква-катиона Мп") значительно понижается, причем бикарбонат вызывает более сильное (до 0,67 В) по сравнению с формиатом (до 0,77 В) и ацетатом (до 0,69 В) понижение Е° Выявлено, что в присутствии бикарбоната кроме водного комплекса Мп" окисляться электродом могут и МпП-бикарбонатные комплексы (Мп"НСОз+, Е0, = 0,61 В, Мпп(НСОз)2, Е< и = 0,52 В) Обнаружено, что бикарбонат образует с Мп электронейтральный комплекс Мпш(НС0з)з ф = 1,73хЮ14 М3), тогда как формиат и ацетат - положительно заряженные комплексы Мпш(НСОО)2+ (Р = 2,86х1012 М2) и Мпш(СН3СОО)2+ (р = 7,9x1013 М'2) Вольтамперометрическим методом показано, что бикарбонат образует с Мп" комплексы состава МпНС03+ (при 10-100 мМ БК, Р = 10 М"1) и Мп(НС03)2 (при 100-600 мМ БК, Р = 350М ) На основании сопоставления данных по светозависимому окислению Мп11 препаратами ФС-2 и электрохимических данных предположено, что фотоокислению безмарганцевыми препаратами ФС-2 подвергается водный комплекс Мп" и что необходимость бикарбоната

в этом процессе может обуславливаться снижением потенциала окисления Мп" в результате образования комплекса Мпш с НС03\ электронейтральностью Мп -бикарбонатного комплекса и участием бикарбоната в связывании ионов Н+, образующихся при окислении воды или при гидролизе водного комплекса Мп111

Показано, что в присутствии бикарбоната Мп" обладает каталазной активностью и что порядок каталазной реакции с участием Мп-бикарбонатных комплексов по НС03" равен 4, а порядок по Мп равен 2 при рН 7,4 Показано, что комплексы Мп1 с формиатом и ацетатом не имеют каталазной активности На основании кинетических закономерностей и электрохимических данных предложен новый механизм реакции разложения Н2О2 с участием двух молекул комплекса Мп(НС03)2 Предположено, что необходимость бикарбоната для каталазной активности Мп1 обусловлена как снижением потенциала окисления Мп", так и способностью бикарбоната связывать ионы Н4", выделяющиеся на стадии окисления Н2О2

Практическая значимость. Полученные результаты могут использоваться при исследовании механизма окислительно-восстановительных реакций с участием марганца, для создания искусственных химических систем, способных к светозависимому окислению воды, при разработке защиты биохимических систем от Н202

Апробация. Материалы диссертации докладывались на 16-й зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 10-13 февраля 2004 г , на 8-й международной пущинской школе-конференции молодых ученых, Пущино, 17-21 мая 2004г, на 18-х Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Пущино, 19-23 июня 2005 г

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации, заключалось в проведении биохимических, электрохимических и физико-химических исследований, в обработке и интерпретации экспериментальных данных, теоретическом обобщении научной литературы и формулировке выводов Большая часть результатов получена автором самостоятельно Флуориметрические исследования переноса электронов в препаратах фотосистемы 2 были проведены совместно с к б н С К Жармухамедовым Электрохимические измерения были проведены совместно с к х н ЮН Козловым и к б н А А Казаковой

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи

Структура. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть (объекты и методы исследования, результаты и

обсуждение), выводы, список цитируемой литературы Диссертация содержит 96 страниц, 23 рисунка Список литературы включает 67 ссылок, из них 48 - на английском языке

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературных данных составляет первую часть диссертации В нем изложены современные представления о структурно-функциональной организации ФС-2, о механизме фотосинтетического окисления воды, о влиянии бикарбоната на функциональные характеристики ФС-2, о составе, термодинамических свойствах и каталазной активности марганец-бикарбонатных комплексов, о каталазной активности препаратов ФС-2

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Субхлоропластные препараты ФС-2 («ВВУ-частицы») выделяли обработкой тилакоидов шпината тритоном-ХЮО (Berthold et al, 1981) с модификациями (Ford and Evans, 1983) «Ядерные» комплексы ФС-2 выделялись с помощью обработки н-гептилтиоглюкозидом (Enami et al, 1989) Удаление неорганического Mn-содержащего ядра ВОК из ВВУ проводили обработкой 1 М трис-HCl (рН 8,0) и 0,5 М MgCl2 (Klimov et al, 1982) Подавление активности гемовой каталазы в ВВУ осуществляли 3-амино-1,2,4-триазолом (Sheptovitsky andBrudvig, 1998)

Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла а (АФ), связанные с фотовосстановлением первичного акцептора электрона ФС-2 - Qa, измерялась на фосфороскопической установке (Klimov et al, 1982) в плотно закрытой кювете Удаление бикарбоната из препаратов ФС-2 достигалось 200-кратным разбавлением концентрированной суспензии препаратов ФС-2 средой, из которой были удалены С02 и НС03" с помощью продувания воздухом, пропущенным через 50%-ный раствор NaOH и 20-сантиметровый слой аскарита

Вольтамперометрические измерения окисления и восстановления Мп" проводились с использованием полярографа РА-3 (LP, Чехословакия) в трехэлектродной ячейке (Козлов с соавт, 1997) Измерялся потенциал максимального тока (Ер) При изучении окисления Мп11 рабочим электродом служил платиновый полусферический анод с площадью поверхности 0,01 см2 Вспомогательным электродом (катодом) служила платиновая пластина (10 х 10 мм) Потенциалы измерялись по отношению к насыщенному каломельному электроду, а затем пересчитывались к нормальному водородному электроду Точность измерений потенциалов составляла 10 мВ Фоном служил раствор 0,1 М NaC104 Рабочий электрод очищался перед каждым измерением от продуктов электролиза При изучении восстановления Мп11 рабочим электродом (катодом) служила висящая ртутная капля диаметром 0,72 мм, обновлявшаяся перед каждым измерением Электроды сравнения и вспомогательный, а также фоновый

раствор были теми же, что при окислении Точность измерения потенциалов составляла 2 мВ Для устранения поверхностных эффектов в среду добавляли 0,005% агара Перед каждым измерением из среды удаляли кислород продуванием аргоном

Каталазная активность комплексов Мп" и препаратов ФС-2 определялась по скорости выделения 02 из Н202 Концентрация кислорода в растворе измерялась амперометрическим методом с помощью кислородного электрода типа Кларка (Наг^есЬ, Великобритания) в ячейке объемом 1 мл, при 25 °С Для измерений выделения 02 из Н202 препаратами ФС-2 в ответ на отдельные микросекундные вспышки света использовалась высокочувствительная установка для измерений кинетики выделения 02 с помощью кислородного электрода, покрытого мембраной толщиной 1 микрон (Ананьев, Закржевский, 1982)

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Влияние бикарбоната, ацетата и формиата на реактивацию переноса электронов от Мп 1 к реакционным центрам ФС-2.

На рис 1 показано, что удаление марганца из препаратов ФС-2 приводит к значительному уменьшению фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла (ДФ) (кривая 1), что связано с подавлением переноса электронов на реакционный центр и далее на 0А, по сравнению с исходными ВВУ (пунктир) Эффективная реактивация АФ в присутствии 0,2 мкМ Мп11 (4 Мп/реакционный центр ФС-2), вызываемое переносом электронов от Мп" на реакционный центр ФС-2, наблюдается только при добавлении бикарбоната (кривая 4), что отмечалось и ранее (КЬшоу е1 а1, 1995) Концентрация бикарбоната, необходимая для насыщения эффекта, составляла 1-2 мМ, а для 50% эффекта - 0,1-0,2 мМ В отличие от бикарбоната, сходные по строению анионы формиат (кривая 5) и ацетат (кривая 7) не способствовали переносу электронов от Мп" к ФС-2 При совместном добавлении бикарбоната с формиатом (кривая 6) или с ацетатом (кривая 8) наблюдалась реактивация ДФ, что указывает на избирательность изучаемой реакции к бикарбонату

Таким образом, только бикарбонат (а не ацетат или формиат) ускоряет светозависимое окисление ионов Мп" препаратами ФС-2, не содержащими Мп-содержащего энзиматического центра ВОК

Рис 1 Кинетика фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла, связанных с

фотовосстановлением Qa, в препаратах ФС-2, не содержащих Мп, в среде без добавок (1) и после добавления 0,2 мкМ МпС12 (2), 5 мМ NaHC03 (3), 0,2 мкМ МпС12 и 5мМ NaHC03 (4), 0,2 мкМ МпС12 и 5 мМ формиата (5), 0,2 мкМ МпСЬ, 5 мМ формиата и 5 мМ ЫаНСОз (6), 0,2 мкМ МпС12 и 5 мМ ацетата (7), 0,2 мкМ МпС12, 5 мМ ацетата и 5 мМ NaHCCb (8) Пунктиром показана кинетика ДФ исходных ВВУ Среда содержала 0,1 М MES-NaOH, рН 6,2, 35 мМ NaCl, и не содержала С02 Д - включение измерительного света (480 нм, 0,15 Вт/м2) J и | ■ включение и выключение действующего света (> 600 нм, 100 Вт/м2)

4.2 Определение состава комплексов Мпш с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при электрохимическом окислении Мп г.

С целью выяснения природы стимулирующего действия бикарбоната на перенос электронов от Мп1 к реакционному центру ФС-2 и отсутствия такого эффекта при добавлении формиата и ацетата были проведены электрохимические исследования состава и термодинамических свойств комплексов Мп" с этими лигандами Измерение потенциала окисления Мп" до Мп"1 вольтамперометрическим методом при изменении концентрации лиганда в среде позволяет определить стандартный окислительно-восстановительный потенциал (Е°), состав и константу устойчивости ((3) образующегося комплекса между ионом Мп1" и лигандом Вольтамперная кривая окисления Мп" на платиновом аноде имеет вид волны с максимумом, положение которого обозначается потенциалом пика (Ер) (рис 2, кривая 1) Известно, что при рН > 0 потенциал окисления аква-катиона Мп" в водном растворе по реакции Мп(Н20)62+ - ё <- Мп(Н20)63+ равен 1,18 В (Liang, Bard, 1973) Как показано на рис 2 и рис 3, при добавлении ионов, образующих комплекс с продуктом окисления - Мп1П, потенциал окисления Мп" понижается, и это понижение линейно по отношению к логарифму концентрации анионов Для вычисления состава и констант устойчивости комплексов Мп'", образующихся на аноде, в соответствии с реакцией

Мп"-ё + рХ*-> МпшХр,

использовали уравнение

в котором Еушт и Е</1КОч - потенциалы полуволн окисления водного комплекса Мп" соответственно в отсутствие и в присутствии лиганда X, /? -полная константа устойчивости комплекса Мп1", Сх - концентрация лиганда X в растворе, р - число лигандов в комплексе, п - число электронов, участвующих в реакции В настоящей работе вместо потенциала полуволны (Е./а) использовали потенциал максимального тока (Ер), который отличается от Ей на 28 мВ для одноэлектронной реакции и на 14 мВ для двухэлектронной При продолжении линейной зависимости к значению логарифма концентрации лиганда, равному нулю Сх = 0), определяется стандартный потенциал окисления Мп11 в присутствии данного лиганда (Е°т,,) и константа устойчивости комплекса, образуемого с Мп"1

п

Число участвующих в реакции лигандов можно определить из наклона линейной зависимости

Д£р/Д1§Сл =РШ (Щ) п

На рис 3 показана зависимость потенциала максимального тока окисления Мп" от логарифма концентраций ацетата (1), формиата (2) и бикарбоната (3) Величины наклона линейной зависимости АЕР/Д1§СХ для ацетата и формиата составляют 120 и 131 мВ/^ Сх, соответственно, что означает участие двух ионов ацетата/формиата в реакции окисления Мп" - ё +2СН3СОО" — Мп1"(СН3СОО)2+, Мп" - ё +2НСОО" -» Мпш(НСОО)2+ Анализ этих данных показывает, что для Мпш-ацетатного комплекса Е° = 0,69 В, Р = 7,9=<1013М2, для Мпш-формиатного комплекса Е° = 0,78В, (3 = 2,86х10'2 М'2 Наклон

линейной зависимости ДЕр/Д^Сх для бикарбоната составляет 173 мВ/^ С, что означает участие трех ионов бикарбоната в реакции окисления

Мп" - ё +ЗНС03" -> Мп"'(НСОз)з, Для Мп"'-бикарбонатного комплексаЕ° = 0,67 В, р = 1,73хЮ14 М3

При концентрации бикарбоната (в отличие от ацетата и формиата) от 40 мМ и выше на полярограмме наблюдается возникновение новой волны и исчезновение наблюдавшейся при более низких концентрациях волны окисления Мп" (рис 2, кривая 8) В ответ на дальнейшее увеличение концентрации бикарбоната потенциал новой волны снижается, что приводит к образованию на графике двух линейных участков, экстраполяция которых к ^ С = 0 дает значения Е°1 = 0,61 В и Е°ц = 0,52 В (рис 3, график 4) С учетом данных, описанных в разделе 3 данной главы, было предположено, что новая волна соответствует окислению Мп"-бикарбонатных комплексов, обозначенных как комплекс I и комплекс II

Мп"-НС03" комплекс I - ё +НС03" — Мпш(НС03)з Мпп-НС03" комплекс II - ё +2НС03" -> Мпш(НС03)3 Сопоставление этих данных с исследованием зависимости образования Мп"-бикарбонатных комплексов от концентрации бикарбоната методом ЭПР

(Оаз§ир1а й а1,2006) и по электрохимическому восстановлению Мп" до Мп° (раздел 3 данной главы) позволило предположить, что комплекс I соответствует комплексу Мп"НСОз+, а комплекс II - комплексу Мпп(НСОз)г

0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Е, В отн НВЭ

Рис 2 Вольтамперные кривые окисления 0,5 мМ Мпп804 на платиновом электроде в водном растворе 0,1 М 1>]СЮ4 до (1) и после (2-8) добавления №НС03 в концентрациях 2 мМ (2), 6 чМ (3), 18 мМ (4), 30 мМ (5), 32 мМ (6), 51 мМ (7), 83 мМ (8) Кривая 0 показывает фон (0,1 М 1лСЮ4) Скорость сканирования 50 мВ/с

Рис 3 Зависимость потенциала окисления Мп" от логарифма концентрации комплексующих ионов ацетата (1), формиата (2) и бикарбоната для исходной волны окисления Мп" при концентрации ЫаНСОз от 3 мМ до 50 мМ (3) и для новой вочны, выявляемой при концентрации ЫаНСОз выше 40 мМ (4)

Таким образом, показано, что все изученные анионы вызывают значительное (на 0,5-0,6 В) снижение потенциала окисления Мп" до Мп1", причем этот эффект наиболее выражен для ионов бикарбоната В отличие от ацетата и формиата, бикарбонат способен образовывать электронейтральный комплекс Мпш(НСОз)з, тогда как формиат и ацетат формируют с Мп положительно заряженные комплексы Мп'"(НСОО)2+ и Мп"'(СНзСОО)2+

4.3 Определение состава комплексов Мп11 с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при электрохимическом восстановлении Мп" до Мп°.

Состав Мп"-бикарбонатных комплексов изучали по зависимости потенциала восстановления Мп" на стационарном ртутном катоде от

логарифма концентрации бикарбоната Восстановление осуществляется на стационарном ртутном катоде согласно уравнению

Мп2" + 2ё ■

■ Мп

На зависимости выявлено три линейных участка с наклонами 0, -14 и -58 мВ/1§ С, соответствующие преобладанию в растворе водного комплекса Мп" и двух Мп"-бикарбонатных комплексов с числом лигандов равным 0,5 и 2 (согласно уравнению 3 при п = 2) (рис 4) Участок с наклоном -14 мВ/'1£ С наблюдается при концентрации бикарбоната 10-100 мМ и предполагает образование комплекса, в котором бикарбонат образует две связи с двумя ионами Мп" (двуядерный комплекс Мпп2НС033+) или две связи с одним ионом Мп" (хелатный комплекс Мп"НС03+) Методом ЭПР не удалось показать существования двуядерных комплексов в системе Мп" - НС03' [Dasgupta а1, 2006] Поэтому наиболее вероятным комплексом с я = 0,5 может быть хелатный комплекс МппНСОз+ О такой возможности свидетельствуют данные ЭПР [Dasgupta й а1, 2006], показывающие, что в комплексе Мп"(НСОз)2 один из (би)карбонатных лигандов бидентатно связан с Мп , и что при образовании комплекса МппНС03+ из шестиводного комплекса Мп(Н20)62+ вытесняются 1-2 молекулы воды Участок с наклоном -58мВ/^С наблюдается при концентрации бикарбоната 100-600 мМ и предполагает образование комплекса Мпи(НСОз)2 Константы устойчивости комплексов Мп"НСОз+ и Мп"(НСОз)2 согласно уравнению 3 равны ЮМ ' и 350 М"2, соответственно

О 1Е 3

1 гъ-нм—

№Нсо3 м 001 0 1

1 271 261 25-

ш 124: ш"1 23: 1 221 211 204.

-58 мВ * <? = 2.

<7 = 0

-14 мВ , 4 = 0 5/ .И*

1 28 127 1 26 1 25 1 24 1 23 1 22 1,21 1 20

-3 0 -2 5 -2 0 1,5 -1 0 -0 5 0 0 1д(№НС03 М)

Рис 4 Зависимость потенциала пика восстановления Мп2+ на стационарном ртутном катоде от концентрации ЫаНСОз в среде, содержащей 0,1 М ЫаС104, 0,476 мМ МпС12,

рН 8,3, г = 21,5 °С

Рис 5 Кинетические выделения 02 содержащей 10 мкММпС12, бикарбоната присутствии концентрации

кривые Н202 в среде, содержащей 10 мМ Н202 без (кривая 1) и в бикарбоната в 100 мМ (2), 150 мМ (3), 200 мМ (4), 250 мМ (5), I = 25 °С Стрелка обозначает момент добавления 10 мкМ МпС12

Добавление к раствору 0,5 мМ МпБС^ ионов ацетата или формиата, начиная с концентрации 0,02 М, приводит к сдвигу потенциала восстановления Мп11 с наклоном -30 мВ/^С, что указывает на образование комплекса вида МгЛС* Константы устойчивости комплексов Мп"СН3СОО+ и Мп"НСОО+ равны соответственно 11 М"1 и 34 М"1 Сравнение этих данных с данными по электрохимическому окислению Мп" (глава 4 2) показывает, что комплексы Мп" с формиатом и ацетатом не проявляются при электрохимическом окислении Мп" Кроме того, в присутствии ацетата и формиата не были обнаружены электронейтральные комплексы вида МппХ2

4.4 Каталазная активность Мпп-бикарбонатных комплексов.

Было проведено исследование механизма каталазной активности ионов Мп" в присутствии бикарбоната С этой целью была исследована зависимость скорости выделения 02 из Н202 в системе Мп" - НСОз' - трис -Н2С>2 от концентраций Мп", НаНСОз и Н4" Как показано на рис 5, бикарбонат в концентрации 100 мМ и выше приводит к появлению каталазной активности у ионов Мп11, что отмечалось и ранее (Сычев с соавт , 1981) При концентрации бикарбоната менее 100 мМ каталазная активность Мп" незначительна В области концентрации бикарбоната 100-300 мМ скорость выделения 02 из Н202 прямо пропорциональна концентрации бикарбоната в степени 4 как при рН 8,3 (рис 6), так и при рН 7,4 в буфере трис-НС1 (не показано) Это указывает на участие в реакции четырех ионов бикарбоната При концентрации бикарбоната выше 300 мМ наблюдается уменьшение порядка реакции, что вероятно связано с образованием нерастворимого МпСОз

Скорость выделения 02 из Н202 прямо пропорциональна концентрации Мп" в степени 2 при рН 7,4 (рис 7, график 1), в степени 1,4 при рН 8,0 (не показано), и в степени 1 при рН8,3 (рис 7, график 2) При замене бикарбоната на ацетат или формиат каталазной активности Мп" не обнаруживалось

Необходимость бикарбоната в концентрации выше 100 мМ, в соответствии с нашими данными о зависимости состава Мп-бикарбонатных комплексов от концентрации бикарбоната, позволяет сделать вывод о том, что каталазной активностью обладает комплекс Мп"(НСОз)2, тогда как у МппНС03+ и водного комплекса Мп" каталазная активность не обнаруживается Линейная зависимость скорости реакции разложения Н202 от концентрации бикарбоната в четвертой степени и от концентрации Мп11 во второй степени при рН7,4 может свидетельствовать о включении двух молекул комплекса Мп"(НСОз)2 в лимитирующую стадию реакции Участие двух молекул комплекса Мп"(НС03)2 предполагается также и при рН 8,3, где порядки реакции по Мп" и НС03" равны 1 и 4 соответственно, так как присоединение четырех лигандов НСОз" к одному иону Мп" представляется маловероятным В предыдущих работах порядки реакции разложения Н202 по Мп1 и бикарбонату сообщались равными 1 и 2 (Сычев с соавт, 1981) или

1 и 3 ^асктап е! а1, 1990), соответственно Отличие наших результатов может быть объяснено использованием кислородного электрода, измеряющего концентрацию растворенного 02 Предыдущие исследования были выполнены измерением объема или давления образованного газа, при этом на опытные данные могли повлиять образование С02 из НС03', насыщение водного раствора образуемым 02 и временная задержка выхода

02 из раствора Кроме того, использование в нашей работе буфера (трис) позволило избавиться от изменения рН в среде, содержащей бикарбонат

£

# 1

ё, о

Рис 6 скорости Н202 от NaHC03 10 мкМ МпС12 сила

-08 -06 1д(№НСО, М)

Зависимость логарифма выделения кислорода из логарифма концентрации в среде, содержащей ЮмМН202, ионная раствора

Рис 7

-45 -40

lg(MnCI2 M)

Зависимость

I = 0,475 (NaHC03 + NaC104), t = 25 °С Прямая соответствует функции у = ах4 в логарифмических координатах

логарифма скорости выделения 02 из Н202 от логарифма концентрации МпС12 в среде, содержащей 7 — 20 мМ ИаНСОз, 100 мМ трис-НС1, рН 7,4, 2 мМ Н202, прямая соответствует функции у = ах в логарифмических координатах, 2 ~ 100 мМ КаНСОз, 100 мМ трис-НС1, рН 8,3, 2 мМ Н202, прямая соответствует функции у = Ъх' в логарифмических координатах, 1=25 °С

Каталазная активность системы Мп" - НС03" увеличивается при увеличении рН от 7,4 до 8,7 (рис 8, график 1) Присутствие 50 мМ триса увеличивает активность в 3-40 раз в зависимости от рН (рис 8, график 2) При этом максимальный эффект триса наблюдается при рН 8,0 Другие использованные в нашей работе буферы (Hepes, Mes, фосфатный) каталазную активность системы подавляли

НА

20Н"

(Н)ОС,

О

Рис 8 Зависимость скорости выделения Ог из Н2О2 от рН в среде, содержащей 100 мкМ МпС12, 50 мМ КаНСОз, 0,5 М №СЮ4, 10 мМ Н202, в отсутствие (7) или в присутствии (2) 50 мМ трис-НС104, а также (3) в отсутствие НСОз~ и триса, ? = 25 °С

Рис 9 Предполагаемый механизм разложения Н2О2 с участием комплексов Мп(НС03)2 Катионы Мп" показаны на рисунке без лигандов

нсо3-

По результатам наших исследований был предложен новый механизм участия бикарбоната в каталазной активности ионов Мп" Известно, что при рН 7,4-8,35 потенциал двухэлектронного восстановления Н202 до Н20 и ОРТ равен 1,14-1,12 В Поэтому снижение потенциала окисления аква-иона Мп" (равного 1,18 В) в результате образования комплекса с бикарбонатом может быть необходимым для окисления ионов Мп" перекисью водорода на начальных стадиях катализа Однако, как следует из наших данных, ацетат и формиат, снижая потенциал окисления Мп", не вызывают появления каталазной активности у Мп" Наблюдаемая зависимость каталазной активности Мп"-бикарбонатных комплексов от рН и усиливающее действие триса позволяют сделать вывод о значительном влиянии стадии отщепления протона от молекулы Н2О2 на скорость каталазной реакции Бикарбонат, имея рКа1 = 6,35 и рКа2 =10,3, может акцептировать протоны в области рН 68, в отличие от ацетата (рКа = 4,78) и формиата (рКа = 3,76) Кроме того, в составе комплекса поляризующее влияние иона Мп может уменьшать рКг2 связанного бикарбоната, что, вероятно, обуславливает высокую активность изучаемой системы при рН 8-9 Рис 9 показывает предложенный нами механизм каталитического разложения Н202 при участии Мп" и бикарбоната, в котором роль бикарбоната состоит в снижении потенциала окисления Мп" и в способности акцептировать протоны

4.5 Каталазная активность ФС-2.

Каталазная активность выделенных нами препаратов ВВУ составляла около 500 мкмоль 02/мг Хлхч*мМ Н2О2 Обработка ВВУ 50 мМ аминотриазолом и ЮмМ аскорбатом при 30 °С в течение двух часов (с целью инактивации гемовой каталазы, наличие которой в ФС-2 было показано ранее (Sheptovitsky and Brudvig, 1996, 1998)) приводила к уменьшению каталазной активности до 0,5% от исходной, а добавление к среде измерения 20 мМ аминотриазола - до 0,04% (остаточная каталазная активность) Выделение «ядерных» комплексов ФС-2 (минимальной структуры, способной к фотосинтетическому окислению воды и выделению 02), сопровождающееся удалением большей части мембранных белков и каталазы, связанной с мембраной, приводит к уменьшению каталазной активности до 1,5% Присутствие в среде измерения 20 мМ аминотриазола уменьшало каталазную активность ядерных комплексов до 0,06% от активности необработанных ВВУ В отличие от результатов, описанных ранее (Veithuys and Kok, 1978, Frash and Mei, 1987, Mano et al, 1987), при изменении окислительно-восстановительного состояния водоокисляющего комплекса (S-состояния) в ВВУ и тилакоидах с помощью освещения серией микросекундных насыщающих вспышек света не было обнаружено изменения остаточной каталазной активности Эти данные могут свидетельствовать об отсутствии каталазной активности у водоокисляющего комплекса, что согласуется с данными Sheptovitsky and Brudvig (1998)

4.6 Заключение.

Данные настоящей работы и других работ (Khmov et al, 1995, Allakhverdiev et al, 1997, Baranov et al, 2000) показывают, что перенос электронов от Мп" к реакционному центру ФС-2 ускоряется при концентрациях НСОз", при которых, как следует из наших электрохимических данных, не происходит предварительного образования Мп"-бикарбонатных комплексов (рис 4 и 10) Это означает, что перенос электронов происходит при окислении водного комплекса Мп" до Мп1" в присутствии бикарбоната В этом случае роль бикарбоната может состоять в его связывании с Мп1", образованным при фотоокислении Мп" реакционным центром ФС-2, с образованием комплекса Мпш(НС0з)з, что приводит к снижению потенциала окисления Мп1! вследствие того, что константы устойчивости комплексов бикарбоната с Мпга и Мп" различаются на 12 порядков Не исключено также, что в процессе реконструкции ВОК образуется тройной комплекс Мпи-НС03" -ФС-2, который подвергается фотоокислению (Baranov et al, 2004)

В нашей работе показано, что в присутствии ацетата и формиата также уменьшается потенциал окисления Мп", но перенос электронов от Мп" к ФС-2 не ускоряется Мы предполагаем, что важным отличием бикарбоната от ацетата и формиата при взаимодействии с ФС-2 может быть способность бикарбоната связывать ионы Н4", освобождающиеся при окислении воды или при гидролизе гексааквакатиона Мп111 Еще одним отличием бикарбоната

является образование электронейтрального комплекса МпП1(НСОз)з при окислении Мп", что может быть существенным для взаимодействия ионов Мп с реационным центром ФС-2 Предполагается, что способность бикарбоната снижать потенциал окисления Мп может реализовываться и в нативном Мп-содержащем ВОК

(НСОз;

Катапазная активность Мп

Рис 10 Области

концентраций бикарбоната, при которых наблюдались активация переноса электронов от экзогенного Мп" в препаратах ФС-2,

образование комплексов Мпш и Мп", и каталазная активность Мп"

Ю"4 103 10* 10'

Бикарбонат, М

Несмотря на то, что бикарбонат необходим как для фотоокисления Мп" реакционными центрами ФС-2, так и для проявления каталазной активности Мп", в этих реакциях участвуют разные виды комплексов Каталазная активность проявляется при концентрации бикарбоната выше 100 мМ, что, согласно нашим электрохимическим данным, соответствует образованию комплекса Мпп(НС03)2 (рис 10) Комплексы Мп"(НС03)2 способны к донированию электронов на реакционные центры аноксигенных бактерий (КЬогоЬгукЬ й а1, 2008) В то же время, светозависимое окисление Мп" в ФС-2 происходит без предварительного образования Мп"-бикарбонатных комплексов, но с последующим образованием Мп'"-бикарбонатных комплексов, как описано выше

5 ВЫВОДЫ

1 Показано, что стандартный потенциал электрохимического окисления Мп11 до Мп'" в водном растворе (равный 1,18 В) снижается в присутствии бикарбоната до 0,67 В, что может лежать в основе известного эффекта стимуляции бикарбонатом фотопереноса электрона от экзогенного Мп" к реакционному центру ФС-2 в субхлоропластных препаратах, не содержащих Мп-содержащего водоокисляющего комплекса

2 Показано, что несмотря на значительное снижение стандартного потенциала окисления Мп" в присутствии формиата и ацетата (до

0,77 В и 0,69 В, соответственно), ни один из этих анионов (в отличие от бикарбоната) не способен стимулировать фотоокисление Мп" реакционным центром ФС-2

3 Электрохимическим исследованием окисления Мп" до Мп1" и восстановления Мп" до Мп° выявлено, что бикарбонат образует с Мп1" электронейтральный комплекс Мп'"(НС03)3 (р = 1,73x10м М3), тогда как формиат и ацетат - положительно заряженные комплексы Мпш(НСОО)2+ (Р = 2,86х1012 М"2) и Мпш(СН3СОО)2+ (Р = 7,9x1013 М2) С Мп" бикарбонат образует заряженный комплекс Мп"НС03+ (Р = ЮМ"1) и электронейтральный комплекс Мп"(НС03)2 (р = 350 М ), тогда как в присутствии формиата и ацетата образуются только положительно заряженные комплексы Мп"(НСОО)+ и Мп"(СН3СОО)+

4 Сравнение электрохимических данных с данными по восстановлению электронного транспорта в препаратах ФС-2 позволило выдвинуть предположение о том, что фотоокислению безмарганцевьши препаратами ФС-2 подвергается водный комплекс Мп" Необходимость бикарбоната в этом процессе может обуславливаться а) снижением потенциала окисления Мп" вследствие образования комплекса Мп"'(НС03)3,

б) электронейтральностью Мп'"-бикарбонатного комплекса и

в) участием бикарбоната в связывании протонов, освобождающихся при окислении воды или при гидролизе гексааквакатиона Мп"1

5 Показано, что комплекс Мп"(НС03)2 обладает каталазной активностью, тогда как водный комплекс Мп" и комплекс МппНС03+ (а также комплексы МппСН3СОО+ и МппНСОО+) не активны Предложен механизм каталитического разложения Н202 Мп-бикарбонашыми комплексами, предполагающий участие двух молекул Мпя(НС03)2 Предположено, что необходимость бикарбоната для проявления каталазной активности Мп11 обусловлена образованием в его присутствии электронейтрального комплекса Мп"(НС03)2, сопровождающимся снижением потенциала окисления Мп11, а также способностью бикарбоната связывать ионы Н+, выделяющиеся на стадии окисления Н202

6 Показано, что каталазная активность препаратов ФС-2 связана с присутствием в них связанной с мембраной гемовой каталазы, и не связана с функционированием Мп-содержащего водоокисляющего комплекса

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Kozlov Yu N, Zharmukhamedov S К, Tikhonov К G, Dasgupta J, Kazakova A A , Dismukes G С and Khmov V V (2004) Oxidation potentials and electron donation to photosystem II of manganese complexes containing bicarbonate and carboxylate ligands //Physical Chemistry Chemical Physics, 6(20), 4905-4911

2 Тихонов К Г , Застрижная О M, Козлов Ю H , Климов В В (2006) Состав и каталазоподобная активность марганец(П)-бикарбонатных комплексов //Биохимия, 71(11), 1561-1569

3 Kozlov Yu N, Zharmukhamedov S К, Tikhonov К G, Dasgupta J, Kazakova A A , Dismukes С G, Klimov V V (2004) Oxidation potentials and electron donation to Photosystem II of manganese complexes containing bicarbonate and carboxylate ligands //Proceedings of the XIII Internetional Congress on Photosynthesis, 408-410

4 Тихонов КГ, Застрижная ОМ, Козлов ЮН, Климов ВВ. (2004) Исследование каталазной активности марганец-бикарбонатных комплексов //XVI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 10-13 февраля 2004 г

5 Тихонов КГ, Застрижная ОМ, Козлов ЮН, Климов В В (2004) Изучение состава и каталазной активности марганец-бикарбонатных комплексов //Биология - наука XXI века 8-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых 17-21 мая 2004 г Сборник тезисов Пущино, 2004, 69-70

6 Козлов Ю H, Жармухамедов С К, Тихонов К Г, Дасгупта Д ж, Казакова А А , Дисмюкс Ч, Климов В В (2005) Потенциалы окисления и донирование электронов к фотосистеме 2 от комплексов марганца, содержащих бикарбонат и карбоксилатные лиганды //XVIII Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе» 19-23 июня 2005 г / под ред И И Проскурякова - M НИА-Природа, 2005, 55-56

Подписано в печать 17 04 2008 Печать трафаретная

Заказ № 285 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тихонов, Константин Геннадьевич

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. О строении фотосистемы 2.

2.2. О механизме фотосинтетического окисления воды.

2.3. Об участии бикарбоната в функционировании донорной стороны фотосистемы 2.

2.4. Об активности комплексов марганца с бикарбонатом в реакции разложении перекиси водорода.

2.5. О каталазной активности фотосистемы 2.

3. Методы и материалы.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Влияние бикарбоната, ацетата и формиата на реактивацию переноса электронов от Мп11 к реакционным центрам ФС-2.

4.2. Определение состава комплексов Мп111 с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при окислении Мп11 на платиновом электроде.

4.3. Определение состава Мпп-бикарбонатных комплексов при восстановлении Мп11 на стационарном ртутном катоде.

4.4. Каталазная активность МпП-бикарбонатных комплексов.

4.5. Каталазная активность препаратов фотосистемы 2.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль марганец-бикарбонатных комплексов в каталазной и водоокисляющей активностях фотосистемы 2"

Актуальность темы. Способность окислять воду с выделением молекулярного кислорода за счёт энергии поглощённого света - одно из важнейших эволюционных приобретений живой природы. Фотосинтетическое окисление воды - основной источник как электронов, используемых для фиксации С02 при фотосинтезе, так и молекулярного кислорода в атмосфере. Окисление воды и выделение 02 при фотосинтезе осуществляется в фотосистеме 2 (ФС-2) - пигмент-белковом комплексе, погружённом в тилакоидную мембрану. ФС-2 состоит из трёх основных функциональных частей: 1) светособирающего комплекса, улавливающего кванты света и передающего энергию возбуждения хлорофилла на реакционный центр ФС-2, 2) реакционного центра, в котором происходит преобразование энергии возбуждённого хлорофилла в энергию разделённых зарядов, 3) водоокисляющего комплекса (ВОК), окисляемого реакционным центром и, в свою очередь, окисляющего воду с выделением 02. ВОК расположен на люменальной стороне тилакоидной мембраны. Он включает марганцевый кластер, состоящий из 4 атомов Мп и 1 атома Са, три водорастворимых белка с мол. м. 17, 23 и 33 кДа, ионы СГ и, возможно, НСОз". Механизм фотосинтетического разложения воды остаётся малоизученным, что во многом связано со сложностью строения ВОК и его неустойчивостью при попытках выделения из хлоропластов.

В ряде работ нашей лаборатории (см. обзор Klimov and Baranov, 2001) было показано стимулирующее влияние бикарбоната на устойчивость ВОК к повреждающим воздействиям, на восстановление переноса электронов и выделения 02 в препаратах ФС-2 с разрушенным ВОК при добавлении ионов Мп". Согласно одному из предположений, действие бикарбоната обусловлено образованием комплексов с ионами Мп, имеющим место в составе ВОК или при сборке ВОК из апо-ВОК и неорганических кофакторов [Klimov and Baranov, 2001]. Выяснение свойств и возможной роли Мпбикарбонатных комплексов во взаимодействии с ФС-2 может дать сведения как о строении и функционировании ВОК, так и о его эволюционном возникновении.

Модельной системой для изучения влияния бикарбоната на свойства ионов Мп в окислительно-восстановительных реакциях может служить известная каталитическая активность комплексов Мп11 с бикарбонатом в реакции разложения Н202 на 02 и воду (каталазная активность) [Сычёв, Исак, 1990]. Сведения о составе, константах устойчивости и каталазной активности Мп-бикарбонатных комплексов могут быть полезны также для выяснения природы каталазной активности ФС-2, предположительно связанной с переходами S-состояний. В пользу наличия каталазной активности у ВОК свидетельствовали колебания количества выделенного 02 из Н2О2 у тилакоидов с периодом в 2 вспышки при освещении короткими вспышками света в присутствии ингибитора каталазы NaN3 [Velthuys and Kok, 1978]. По другим данным, каталазная активность мембранных препаратов ФС-2 ВВУ-типа не обнаруживалась после обработки 3-амино-1,2,4-триазолом — ингибитором гемовой каталазы [Sheptovitsky and Brudvig, 1998]. Изучение взаимодействия ВОК с Н202 - возможным промежуточным соединением реакции окисления воды - важно для выяснения свойств S-состояний и их переходов и может помочь в раскрытии механизма фотосинтетического окисления воды.

Таким образом, изучение свойств Мп-бикарбонатных комплексов важно для понимания особенностей взаимодействия ФС-2 с ионами Мп11, выяснения роли бикарбоната в функционировании ФС-2 и источника каталазной активности ФС-2.

Цель и задачи. Цель работы - исследование роли марганец-бикарбонатных комплексов в окислительно-восстановительном взаимодействии ионов марганца с безмарганцевыми препаратами ФС-2, а также в каталазной активности ФС-2. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучение влияния бикарбоната, ацетата и формиата на светозависимый перенос электронов от ионов Мп11 к реакционным центрам препаратов ФС-2, не содержащих неорганического кластера ВОК;

2. Определение потенциала окисления Мп" до Мп111 в присутствии бикарбоната, ацетата и формиата, а также состава и констант устойчивости образуемых комплексов Мп111 при электрохимическом окислении Мп11;

3. Определение состава и констант устойчивости комплексов Мп11 с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при электрохимическом восстановлении Мп11;

4. Выяснение природы каталазной активности Мп"-бикарбонатных комплексов;

5. Изучение каталазной активности ВОК.

Научная новизна. Показано, что ацетат и формиат, в отличие от бикарбоната, не способствуют переносу электронов от ионов Мп11 к реакционным центрам препаратов ФС-2, не содержащих энзиматического Mn-содержащего центра ВОК. Показано, что в присутствии бикарбоната, формиата и ацетата потенциал электрохимического окисления (Е°) Мп11 до Мп111 (равный 1,18 В для аква-катиона Мп11) значительно понижается, причём бикарбонат вызывает более сильное (до 0,67 В) по сравнению с формиатом (до 0,77 В) и ацетатом (до 0,69 В) снижение Е°. Показано, что в присутствии бикарбоната кроме водного комплекса Мп11 окисляться электродом могут и МпП-бикарбонатные комплексы (MnnHC03+, E°i = 0,61B; Мпи(НС03)2, Е°ц = 0,52 В). Обнаружено, что бикарбонат образует с Мп111 электронейтральный комплекс Мп1П(НС03)з ((3 = 1,73x1014 М"3), тогда как формиат и ацетат - положительно заряженные комплексы Мпш(НСОО)2+ (Р = 2,86х1012 М"2) и Мпш(СН3СОО)2+ ф = 7,9х1013 М"2).

Вольтамперометрическим методом показано, что бикарбонат образует с Мпп комплексы состава МпНСОэ+ (при 10-100 мМ БК, р= ЮМ"1) и Мп(НС03)2 (при 100-600 мМ БК, Р = 350М"2). На основании сопоставления данных по светозависимому окислению Мп11 препаратами ФС-2 и электрохимических данных предположено, что фотоокислению безмарганцевыми препаратами ФС-2 подвергается водный комплекс Мп", и что необходимость бикарбоната в этом процессе может обуславливаться снижением потенциала окисления Мп11 при образовании комплекса с Мп111, электронейтральностью Мпш-бикарбонатного комплекса и участием бикарбоната в связывании ионов ИГ, образующихся при окислении воды или при гидролизе Мпш. Показано, что порядок каталазной активности Mn-бикарбонатных комплексов по НС03~ равен 4, а порядок по Мп равен 2 при рН 7,4. Показано, что комплексы Мп11 с формиатом и ацетатом не имеют каталазной активности. На основании кинетических закономерностей и электрохимических данных предложен новый механизм реакции разложения Н202 с участием двух молекул комплекса Мп(НС03)2. Предположено, что необходимость бикарбоната для каталазной активности Мп11 обусловлена как снижением потенциала окисления Мп , так и способностью связывать ионы выделяющиеся при окислении Н202.

Практическая значимость. Полученные результаты могут использоваться при исследовании механизма окислительно-восстановительных реакций с участием марганца, для создания искусственных химических систем, способных к светозависимому окислению воды, при разработке защиты биохимических систем от Н202.

Апробация. Материалы диссертации были представлены на 16-й зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 10-13 февраля 2004 г.; на 8-й международной пущинской школе-конференции молодых учёных, Пущино, 17-21 мая 2004 г.; на 18-х Пущинских чтениях по фотосинтезу и

Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Пущино, 19-23 июня 2005 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи: 1 статья в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), 1 статья в реферируемом международном журнале и 4 тезисов конференций.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации, заключалось в проведении биохимических, электрохимических и физико-химических исследований, в обработке и интерпретации экспериментальных данных, теоретическом обобщении научной литературы и формулировке выводов. Основная часть результатов получена автором самостоятельно. Флуориметрические исследования переноса электронов в препаратах фотосистемы 2 были проведены совместно с к.б.н. С.К. Жармухамедовым. Электрохимические измерения были проведены совместно с к.х.н. Ю.Н. Козловым и к.б.н. А.А. Казаковой.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тихонов, Константин Геннадьевич

5. Выводы

Показано, что стандартный потенциал электрохимического окисления Мп11 до Мп111 в водном растворе (равный 1,18 В) снижается в присутствии бикарбоната до 0,67 В, что может лежать в основе известного эффекта стимуляции бикарбонатом фотопереноса электрона от экзогенного Мп11 к реакционному центру ФС-2 в субхлоропластных препаратах, не содержащих Мп-содержащего водоокисляющего комплекса.

Показано, что несмотря на значительное снижение стандартного потенциала окисления Мп11 в присутствии формиата и ацетата (до 0,77 В и 0,69 В, соответственно), ни один из этих анионов (в отличие от бикарбоната) не способен стимулировать фотоокисление Мп11 реакционным центром ФС-2.

Электрохимическим исследованием окисления Мп11 до Мпш и восстановления Мп11 до Мп° выявлено, что бикарбонат образует с Мп111 электронейтральный комплекс Мпш(НСОз)з (Р = 1,73x1014 М"3), тогда как формиат и ацетат - положительно заряженные комплексы Мпш(НСОО)2+ ф = 2,8 6х 1012 М"2) и Мпш(СН3СОО)2+ ((3 = 7,9x1013 М"2). С Мп11 бикарбонат образует заряженный комплекс МппНС03+ (Р = 10 М"1) и электронейтральный комплекс Мпи(НС03)2 ((3 = 350 М-"), тогда как в присутствии формиата и ацетата образуются только положительно заряженные комплексы Мпп(НСОО)+ и Мпп(СН3СОО)+.

Сравнение электрохимических данных с данными по восстановлению электронного транспорта в препаратах ФС-2 позволило выдвинуть предположение о том, что фотоокислению безмарганцевыми препаратами ФС-2 подвергается водный комплекс Мп11. Необходимость бикарбоната в этом процессе может обуславливаться: а) снижением потенциала окисления Мп11 вследствие образования комплекса Мпш(НСОз)з, б) электронейтральностью Мпш-бикарбонатного комплекса и в) участием бикарбоната в связывании протонов, освобождающихся при окислении воды или при гидролизе водного комплекса Мп111.

5. Показано, что комплекс Мпп(НСОз)2 обладает каталазной активностью, тогда как водный комплекс Мп11 и комплекс Мп1ГНС03+ (а также комплексы МппСН3СОО+ и МппНСОО+) не активны. Предложен механизм каталитического разложения Н202 Мп-бикарбонатными комплексами, предполагающий участие двух молекул Мпп(НС03)2. Предположено, что необходимость бикарбоната для проявления каталазной активности Мп11 обусловлена образованием в его присутствии электронейтрального комплекса Мпп(НС03)2, сопровождающимся снижением потенциала окисления Мп", а также способностью бикарбоната связывать ионы Н+, выделяющиеся на стадии окисления Н202.

6. Показано, что каталазная активность препаратов ФС-2 связана с присутствием в них связанной с мембраной гемовой каталазы, и не связана с функционированием Mn-содержащего водоокисляющего комплекса.

4.6. Заключение

Данные настоящей работы и других работ (Klimov et al., 1995; Allakhverdiev et al., 1997; Baranov et al., 2000) показывают, что перенос электронов от Мп11 к реакционному центру ФС-2 ускоряется при концентрациях НСОз", при которых, как следует из наших электрохимических данных, не происходит предварительного образования Мпп-бикарбонатных комплексов (рис. 23). Это означает, что перенос электронов происходит при окислении водного комплекса Мп11 до Мп111 в присутствии бикарбоната. В этом случае роль бикарбоната может состоять в его связывании с Мпш, образованным при фотоокислении Мп11 реакционным центром ФС-2, с образованием комплекса Мпш(НСОз)з, что приводит к снижению потенциала окисления Мп11 вследствие того, что константы устойчивости комплексов бикарбната с Мп111 и Мп11 различаются на 12 порядков. Не • исключено также, что в процессе реконструкции ВОК образуется тройной комплекс Мпп-НС03" -ФС-2, который подвергается светозависимому окислению [Baranov et al., 2004].

В нашей работе показано, что в присутствии ацетата и формиата также уменьшается потенциал окисления Мп11, но перенос электронов к ФС-2 не ускоряется. Мы предполагаем, что важным отличием бикарбоната от ацетата и формиата при взаимодействии с ФС-2 может быть способность связывать ионы Н1", освобождающиеся при окислении воды или при гидролизе водного комплекса Мп111 в области рН 6-7, в которой ФС-2 имеет наивысшую активность. Ещё одним отличием бикарбоната является способность образовывать электронейтральный комплекс Мп (НСОз)з при окислении Мп11, что может уменьшать электростатическое отталкивание ионов Мп11 и таким образом облегчить их доступ к реакционному центру ФС-2. шттттж рД е^тв ие^н а^р^^

ШШ мп^нсошШШр

ШШУ//У/Ш МгУ'НСО* ■щжж шшш

Каталазная активность Мп" —- ш

I-1-1—I—I I I I I I-1-1—I—I I I I I I-1-1—I—I I I I I I-1-1—I—I I I I I I

1СУ4 1СГ3 1СГ2 10~1 1

Бикарбонат, M

Рис. 23. Области концентраций бикарбоната, при которых наблюдались активация переноса электронов от экзогенного Мп11 в препаратах ФС-2, образование комплексов Мпш и Мп", и каталазная активность Мпп.

Несмотря на то, что бикарбонат необходим как для фотоокисления Мп11 реакционными центрами ФС-2, так и для проявления каталазной активности Мп11, в этих реакциях участвуют разные виды комплексов. Каталазная активность проявляется при концентрации бикарбоната выше 100 мМ, что, согласно нашим электрохимическим данным, соответствует образованию комплекса Мпп(НС03)2 (рис. 23). Комплексы Мпп(НС03)2 способны к донированию электронов на реакционные центры аноксигенных бактерий (Khorobrykh et al., 2008). В то же время, светозависимое окисление Мп11 в ФС-2 происходит без предварительного образования Мпп-бикарбонатных комплексов, но с последующим образованием Мпш-бикарбонатных комплексов, как описано выше.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тихонов, Константин Геннадьевич, Пущино

1. Ананьев Г.М., Закржевский Д.А. (1982) Избирательное подавление ингибиторами фотосинтеза отдельных фаз кинетики выделения 02 клетками хлореллы при импульсном освещении //Физиология растений, 29(6), 1114-1119.

2. Ананьев Г.М., Климов В.В. (1989) Взаимодействие системы люминол-пероксидаза с марганцем водоокисляющего комплекса фотосистемы II //Биохимия, 54, 1386-1393.

3. Ананьев Г.М., Климов В.В. (1989) Исследование фотообразования «связанного» пероксида водорода в донорной части фотосистемы II //Биохимия, 54, 1587-1596.

4. Бонд A.M. (1983) Полярографические методы в аналитической химии: Пер. с англ./Под ред. С.И. Жданова. М.: Химия, 1983. - 328 е., ил.

5. Гавриленко В.Ф. (2003) Большой практикум по фотосинтезу: Учеб. пособие для студ. вузов / В.Ф. Гавриленко, Т.В. Жигалова; под ред. И.П. Ермакова. М.: Издательский центр «Академия», 2003. - 256 с.

6. Гейровский Я., КутаЯ. (1965) Основы полярографии. М.: Мир, 1965. -559 с.

7. Гороновский И.Т., Назаренко Ю.П., НекрячЕ.Ф. (1974) Краткий справочник по химии. Киев: Наукова думка, 1974. - 991 с.

8. Жармухамедов С.К., Ширшикова Г.Н., Маевская З.В., Антропова Т.М., Климов В.В. (2007) Бикарбонат защищает водоокисляющий комплекс фотосистемы II от термоинактивации в интактных клетках Chlcimydomonas reinhardtii //Физиология растений, 54, 1-8.

9. Климов В.В., Аллахвердиев С.И., Шувалов В.А., Красновский А.А. (1982) Действие обратимой экстракции марганца на световые реакции препаратов фотосистемы 2 //Доклады Академии наук СССР, 263, 10011005.

10. Козлов Ю.Н., Казакова А.А., Климов В.В. (1997) Изменение окислительно-восстановительного потенциала и каталазной активности ионов Мп2+ при образовании Мп-бикарбонатных комплексов //Биологические мембраны, 14(1), 93-97.

11. Лурье Ю.Ю. (1971) Справочник по аналитической химии. 4-е изд., перераб. и доп. -М.: Химия, 1971. -456 с.

12. Россотти Ф., РоссоттиХ. (1965) Определение констант устойчивости и других констант равновесия в растворах. пер. с англ. - М., Мир, 1965. -564 с.

13. Справочник химика (1964), M.-JL: Химия, 1964. т. 3. - 756 с.

14. Сычёв А.Я., ИсакВ.Г., ЛапД.В. (1977) Каталитические свойства карбонатных комплексов Mn(II) и Co(II) в реакциях разложения Н202 //Журнал физической химии, 51, 363-366.

15. Сычёв А.Я., ИсакВ.Г., Дао Ван Лап (1978) Механизм реакции каталитического разложения перекиси водорода карбонатами Mn(II) //Журнал физической химии, 52(1), 107-112.

16. Сычёв А.Я., Пфанмеллер У., ИсакВ.Г. (1981) Термодинамика комплексообразования бикарбонатных комплексов марганца (II) //Журнал физической химии, 55, 365-368.

17. Сычёв А.Я., ИсакВ.Г., Пфаннмеллер У. (1983) Высокие состояния окисления комплексов марганца в катализе. II. Механизм распада Н202 в присутствии бикарбонатных комплексов марганца(П) //Журнал физической химии, 57(3), 760-762.

18. Сычёв А.Я., ИсакВ.Г. (1990) Координационные соединения марганца в катализе. Кишинёв: Штиинца, 1990. —320 с.

19. Сычёв А.Я., ИсакВ.Г. (1993) Каталазные, пероксидазные и оксидазные свойства координационных соединений марганца //Успехи химии, 62, 303-315.

20. Холл Д., Рао К. (1983) Фотосинтез: Пер. с англ. М.: Мир, 1983. - 134 е., ил.

21. Aebi Н. (1984) Catalase. In: Methods of enzymatic analysis, ed. Bergmeyer H.U., 1984, v. 3,273-285.

22. Allakhverdiev S., YruelaL, Picorel R. and Klimov V. (1997) Bicarbonate is an essential constituent of the water-oxidizing complex of photosystem II //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 5050-5054.

23. Ananyev G.M., ZaltsmanL., Vasko C. and Dismukes G.C. (2001) The inorganic biochemistry of photosynthetic oxygen evolution / water oxidation //Biochimica et Biophysica Acta, 1503, 52-68.

24. Aoyama C., Suzuki H., Sugiura M. and Noguchi T. (2007) Flash-induced FTIR difference spectroscopy shows no evidence for the structural coupling of bicarbonate to the oxygen-evolving Mn cluster in photosystem II //Biochemistry, 47, 2760-2765.

25. Berthold D.A., BabcockG.T. and Yocum C.F. (1981) A highly resolved, oxygen-evolving photosystem II preparation from spinach thylakoid membranes //FEBS Letters, 134, 231-234.

26. Clausen J., Beckmann K., Junge W., Messinger J. (2005) Evidence that bicarbonate is not the substrate in photosynthetic oxygen evolution //Plant Physiology, 139, 1444-1450.

27. Dasgupta J., Tyryshkin A.M., Kozlov Yu.N., Klimov V.V. and Dismukes G.C. (2006) Carbonate complexation with Mn in aqueous phase: redox behavior and ligand binding modes by electrochemistry and EPR //Journal of Physical Chemistry В, 110, 5099-5 111.

28. Dismukes G.C. (1996) Manganese enzymes with binuclear active sites //Chemical Reviews, 96(7), 2909-2926.

29. Dismukes G.C., Klimov V.V., Baranov S.V., Kozlov Yu.N., Dasgupta J. and Tyryshkin A. (2001) The origin of atmospheric oxygen on earth: the innovation of oxygenic photosynthesis //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2170-2175.

30. Dounce A.L. (1983) A proposed mechanism for the catalatic action of catalase //Journal of Theoretical Biology, 105(4), 553-567.

31. DunahayT., Staehelin L.A., SeibertM., Ogilvie P.D. and Berg S.P. (1983) Structural, biochemical and biophysical characterization of four oxygen-evolving photosystem II preparations from spinach //Biochimica et Biophysica Acta, 764, 179-193.

32. Ferreira K.N., Iverson T.M., Maghlaoui K., Barber J., Iwata So (2004) Architecture of the photosynthetic oxygen-evolving center //Science, 303, 1831-1838.

33. Ford R.C. and Evans M.C.W. (1983) Isolation of a photosystem 2 preparation from higher plants with highly enriched oxygen evolution activity //FEBS Letters, 160, 159-164.

34. Frasch W.D. and Mei R. (1987) Hydrogen peroxide as an alternate substrate for the oxygen-evolving complex //Biochimica et Biophysica Acta, 891, 8-14.

35. Frash W.D. and Mei R. (1987) Kinetics of 02 evolution from H202 catalyzed by the oxygen-evolving complex: investigation of the S-dependent reaction //Biochemistry, 26, 7321-7325.

36. Hillier W., Messinger J., Wydrzynski T. (1998) Kinetic determination of the fast exchanging substrate molecule in the S3-state of photosystem II //Biochemistry, 37(48), 16908-16914.

37. Hillier W., Wydrzynski T. (2000) The affinities for the two water binding sites in the 02-evolving complex of photosystem II vary independently during S-state turnover//Biochemistry, 39(15), 4399-4405.

38. Hulsebosch R.J., Allakhverdiev S.I., Klimov V.V., Picorel R. and Hoff A.J. (1998) Effect of bicarbonate on the S2 multiline EPR signal of the oxygen-evolving complex in photosystem II membrane fragments //FEBS Letters, 424, 146148.

39. Khorobrykh A.A., Terentyev V.V., Zharmukhamedov S.K. and Klimov V.V. (2008) Redox interaction of Mn-bicarbonate complexes with reaction centres of purple bacteria //Philosophical Transactions of the Royal Society B, 363, 1245-1251.

40. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Shuvalov V.A., Krasnovsky A.A. (1982) Effect of extraction and re-addition of manganese on light reactions of photosystem II preparations //FEBS Letters, 148, 307-312.

41. Klimov V., Ananyev G., Zastryzhnaya O., Wydrzynski Т., Renger G. (1993) Photoproduction of hydrogen peroxide in photosystem II membrane fragments: a comparison of four signals //Photosynthesis Research, 38, 409416.

42. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Baranov S.V. and Feyziev Ya.M. (1995) Effects of bicarbonate and formate on the donor side of photosystem II //Photosynthesis research, 46, 219-225.

43. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Feyziev Ya.M. and Baranov S.V. (1995) Bicarbonate requirement for the donor side of photosystem II //FEBS Letters, 363, 251-255.

44. Klimov V.V., Baranov S.V. and Allakhverdiev S.I. (1997) Bicarbonate protects the donor side of photosystem II against photoinhibition and thermoinactivation //FEBS Letters, 418, 243-246.

45. Klimov V.V., Hulsebosch R., Allakhverdiev S.I., Wincencjusz H, van Gorkom H. and Hoff A. (1997) Bicarbonate may be required for ligation of manganese in the oxygen evolving complex of photosystem II //Biochemistry, 36, 1627716281.

46. Klimov V.V., Baranov S.V. (2001) Bicarbonate requirement for the water-oxidizing complex of photosystem II //Biochimica et Biophysica Acta, 1503, 187-196.

47. Mano J., Takahashi M. and AsadaK. (1987) Oxygen evolution from hydrogen peroxide in photosystem II: flash-induced catalatic activity of water-oxidizing photosystem II membranes //Biochemistry, 26, 2495-2501.

48. Mano J., Kawamoto K., Dismukes G.C. and AsadaK. (1993) Inhibition of the catalase reaction of photosystem II by anions //Photosynthesis Research, 38, 433-440.

49. Nelson N., Yocum C.F. (2006) Structure and function of photosystems I and II //Annual Review of Plant Biology, 57, 521-565.

50. Ono T. and Inoue Y. (1984) Ca~ -dependent restoration of 02-evolving activity m CaCb-washed PS II particles depleted of 33, 24 and 16 kDa proteins //FEBS Letters, 168, 281-286.

51. Radmer R. and Ollinger O. (1980) Isotopic composition of photosynthetic 02 flash yield in the presence of H2180 and HC1803" //FEBS Letters, 110, 57-61.

52. Renger G. (2001) Photosynthetic water oxidation to molecular oxygen: apparatus and mechanism //Biochimica et Biophysica Acta, 1503, 210-228.

53. Sheptovitsky Ye.G. and BrudvigW.G. (1996) Isolation and characterization of spinach photosystem II membrane-associated catalase and polyphenol oxidase //Biochemistry, 35, 16255-16263.

54. Sheptovitsky Ye.G. and BrudvigW.G. (1998) Catalase-free photosystem II: the 02-evolving complex does not dismutate hydrogen peroxide //Biochemistry, 37, 5052-5059.

55. Shevela D.N., Khorobrykh A.A. and Klimov V.V. (2006) Effect of bicarbonate on the water-oxidizing complex of photosystem II in the super-reduced S-states //Biochimica et Biophysica Acta, 1757, 253-261.

56. Shevela D., Klimov V., Messinger J. (2007) Interactions of photosystem II with bicarbonate, formate and acetate //Photosynthesis Research, 94, 247-264.

57. Stadtman E.R., BerlettB.S., and Chock P.B. (1990) Manganese-dependent disproportionation of hydrogen peroxide in bicarbonate buffer //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 384-388.

58. StemlerA. (1986) Carbonic anhydrase associated with thylakoids and photosystem II particles from maize //Biochimica et Biophysica Acta, 850, 97-107.

59. Van Rensen J.J.S. and Klimov V.V. (2005) Bicarbonate interactions //in: Photosystem II: The light-driven water:plastoquinone oxidoreductase (Wydrzynski T. and Satoh K. eds), Springer, Dordrecht, 329-345.

60. Velthuys B. and KokB. (1978) Photosynthetic oxygen evolution from hydrogen peroxide //Biochimica et Biophysica Acta, 502, 211-221.

61. Wincencjusz H., Allakhverdiev S.I., Klimov V.V. and van GorkomH.J. (1996) Bicarbonate-reversible formate inhibition at the donor side of photosystem II //Biochimica et Biophysica Acta, 1273, 1-3.

62. Wintermans J.F., De Mots A. (1965) Spectrophotometric characteristics of chlorophylls a and b and their pheophytin in ethanol //Biochimica et Biophysica Acta, 109, 448-453.