Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм фиксации СО2 у зеленых нитчатых бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Механизм фиксации СО2 у зеленых нитчатых бактерий"

МОСКОВСКИМ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

РГБ 01

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

1 8 ДЕК 7ПП0

на правах рукописи

УГОЛЬКОВА Наталья Валентиновна

МЕХАНИЗМ ФИКСАЦИИ С02 У ЗЕЛЕНЫХ НИТЧАТЫХ БАКТЕРИЙ

Специальность: 03. 00. 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологическо! факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносов

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Р. Н. Ивановский

Официальные оппоненты : доктор биологических наук

В. К. Плакунов кандидат биологических наук В. В. Грошев

Ведущая организация - Институт фундаментальных проблем биологи РАН, Пущино-на-Оке.

Защита состоится 7 декабря 2000г. в 15 часов 30 минут на заседаш диссертационного совета Д.053.05.66. при Московском государственно университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Воробье! горы, МГУ, д. 1., корп. 12, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологическо факультета МГУ.

Автореферат разослан « 3 » 2000г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук

(Л. М. Захарчу

Е УУЗ./Г, О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Фиксация углекислоты, осуществляемая, в основном, автотрофными организмами - фото- и хемоавтотрофами, »шляется единственным способом синтеза органического вещества из С02 в природе. Приблизительно 10й тонн СОг ежегодно фиксируется на Земле с помощью различных путей ассимиляции углекислоты. В настоящее время известно 3 таких механизма: восстановительный пентозофосфатный путь (цикл Кальвина), восстановительный цикл трикарбоновых кислот (ВЦТК), нециклический восстановительный ацетил-КоА путь.

Вместе с тем, сведения относительно механизма автотрофной фиксации углекислоты у зеленых нитчатых бактерий ограничены. Эта группа микроорганизмов была открыта сравнительно недавно. В настоящее время в чистую культуру удалось выделить лишь представителей двух видов - Chloroflexus aurantiacus и OscillocHoris trichoides.

С. aurantiacus - зеленая нитчатая термофильная бактерия, которая, как и большинство фототрофных бактерий, способна к фотоавтотрофному росту. В разных лабораториях велись исследования двух штаммов этой бактерии, выделенных из разных мест обитания. У представителей обоих штаммов не были обнаружены ключевые ферменты цикла Кальвина (рибулозобисфосфаткарбоксилаза и фосфорибулокиназа), ВЩТС (2-оксоглутаратсинтаза и АТФ:цитратлиаза), и ацетил-КоА пути (СОдегидрогеназа/ацетил-КоА сшггаза). Это указывает на то, что у С. aurantiacus не функционирует ни один из вышеперечисленных путей фиксации углекислоты.

Было предложено две модели автотрофной фиксации СОг У С. aurantiacus. Первая схема (восстановительный цикл дикарбоновых кислот) базировалась на изучении штамма В-3, а вторая (З-гидроксипропионатный цикл), разработана при исследовании штамма ОК-70. В обоих случаях регенерация ацетил-КоА происходит в результате расщепления малил-КоА при участии малил-КоА лиазы. Основным продуктом цикла и в первой, и во второй схеме является глиоксилат.

Другая нитчатая бактерия О. trichoides также, как и С. aurantiacus, способна к фотолитоавтотрофному росту, используя Нз или H2S в качестве донора электронов. Механизм фиксации СОг у этого микроорганизма не известен.

Желание восполнить определенный пробел в знаниях о механизмах автотрофной ассимиляции СОг у зеленых нитчатых бактерий во многом определило цель настоящей работы. Всестороннее изучение особенностей метаболизма фототрофов может быть

использовано в практических целях, так как в последнее время эти микроорганизмы все

больше привлекают внимание как потенциальные объекты биотехнологии.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось подтверждение наличия

двух разных механизмов автотрофной фиксации углекислота у различных штаммов С.

аигапйасш.

Исследование механизма фиксации СОг у другого, менее изученного представителя зеленых нитчатых бактерий О. й-УсЛо/^е«, также было целью нашей работы. Для достижения поставленных целей решали следующие задачи:

• сравнить активность карбоксилирующих ферментов (первичных акцепторов СО2) у изучаемых штаммов С аигапиасш и исследовать их активность в зависимости от условий роста (автотрофных и гетеротрофных);

• изучить действие различных специфических ингибиторов на процесс автотрофной фиксации СО2 у С. аигапНасия;

• выяснить возможный путь утилизации глиоксилата, как конечного продукта обоих моделей автотрофной фиксации СОг, предложенных для С. аигапИасш;

• выяснить каков механизм автотрофной фиксации СО2 у мезофильной нитчатой зеленой аноксигенной бактерии 0.1пско1с1е$.

Научная новизна работы Впервые проведено сравнительное исследование автотрофного метаболизма СО2 у разных штаммов С. аигагиюсга. Впервые показано, что разные штаммы одного и того же вида способны использовать совершенно отличные друг от друга механизмы автотрофной ассимиляции углекислоты (восстановительный цикл дикарбоновых кислот у С. аигапИасш В-3 и 3-гидроксипропионатный цикл у С. аигаппаст ОК-70). Вместе с тем, были предложены две модификации ранее предложенных механизмов фиксации СОг у разных штаммов С. аигапЧасш. При этом конечным продуктом модифицированных циклов является не глиоксилат, как это предполагалось ранее, а ацетат, дальнейшая утилизация которого может проходить через реакции цикла трикарбоновых кислот.

Показано, что О. >пс}ю1(1гз способен фиксировать углекислоту через цикл Кальвина. Таким образом, О. /тчейои&и является первым представителем аноксигешшх зеленых бактерий у которого показано функционирование восстановительного пенгозофосфатного цикла автотрофной ассимиляции углекислоты. Предложена принципиальная схема метаболизма СО2 и некоторых органических кислот для этого микроорганизма.

Практическая ценность работы Данные, полученные в работе, дополняют сведения о механизмах автотрофной фиксации углекислоты в целом. Результаты исследований могут быть полезны при разработке методов использования зеленых нитчатых аноксигенных фототрофов в биотехнологических целях. Например, с целью их использования в смешанных культурах с другими фототрофами при очистке окружающей среды, а также для получения белка с помощью смешанных культур такого рода, позволяя оптимизировать условия роста и обеспечения высокой активности отдельных ферментов. Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-96» (Москва, 12-14 апреля 1996), конференции "Автотрофные микроорганизмы" памяти академика РАН Е. Н. Кондратьевой (Москва, 23-25 апреля 1996), 2-ом Всероссийском съезде фотобиологов (Пущино, 8-12 июня 1998), межрегиональной научной конференции «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 28-29 сентября 1998), IV международном симпозиуме по зеленым и гелиобактериям (Жерона, Испшшя, 28-31 августа 1999), научной конференции «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов» (Москва, 21 декабря 1999), и на заседании кафедры микробиологии биологического факультета МГУ (24 октября 2000). Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей в себя описание объектов и методов исследования, полученные результаты и их обсуждение, выводов, списка цитируемой литературы (/ Yff наименований). Работа изложена на / ^/страницах машинописного текста, содержит i таблиц и. '.''■ рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследований и культивирование бактерий Объектами исследований служили представители зеленых несерных нитчатых бактерий : два термофильных штамма С. aurantiacus и три мезофильных штамма О. trichoides. С. aurantiacus В-3 был выделен из горячего источника озера Байкал (Красильникова и др., 1986), а С. aurantiacus ОК-70 - из горячих источников штата Орегон (США) (Pierson, Castenholz, 1974). О. trichoides DG-6, был изолирован из сероводородсодержащих источников Кавказа, О. trichoides Р и О. trichoides Кр. -из водоемов Подмосковья. Все вышеупомянутые штаммы

были получены из коллекции фотосинтезирующих микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ.

Культуры выращивали в люминостате в анаэробных условиях при освещенности 1000 лк и температуре 55-60 °С (С. aurantiacus В-3 и OK-JO) или 28-30 °С (О. trichoides).

Культивирование бактерий проводили при pH 7,8-8,0 (С. aurantiacus) или pH 8,08,5 (О. trichoides) в анаэробных условиях на модифицированной (Keppen et al., 1994) среде DGN (Castenholz, Pierson, 1981). В качестве источника электронов использовали сульфид натрия (0.05%) или молекулярный водород.

О. trichoides, склонную к образованию матов, культивировали в анаэробных условиях при постоянном перемешивании на магнитной мешалке.

Определение включения в клетки "С-содержащш субстратов. При проведении экспериментов с целыми клетками их отделяли от культуралыюй среды центрифугированием (15 мин, 9000об/мин при 6-8 °С), отмывали и ресуспендировали в свежей минеральной среде. Полученными суспензиями (0,2-0,5 мг белка/мл) заполняли стеклянные шприцы на 5-10 мл, одновременно внося требующиеся по условиям опыта субстраты и ингибиторы. В ряде случаев в качестве источника электронов для автотрофной ассимиляции СО2 в шприцы добавляли 1 мл Н2, либо NajS^HjO (0,05%). Для изучения ассимиляции клетками углекислоты и ацетата в опытные суспензии добавляли 1мМ бикарбоната (NaH14C03 0.04 MBq) или 1мМ ацетата (1-14С ацетат 0.02 MBq). Суспензии инкубировали при 55-60 °С для С. aurantiacus или 28-30 °С для О. trichoides и освещенности 1000 лк Ассимиляцию клетками меченых соединений определяли путем периодического отбора проб через 15-30 мин в течение 1-1,5 часов. Отобранную суспензию фильтровали через мембранный фильтр "Сынпор" (диаметр пор 2 мкМ).

Радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике LKB RacBeta 1127. Скорость ассимиляции клетками меченых соединений выражали числом нано молей в 1 минуту в пересчете на 1 мг белка клеток (нм мг белка'1 мин"1).

Определение активности Ферментов. Для определения активности ферментов клетки отделяли от культуральной среды как описано выше, дважды отмывали в 0,05 М трис-НС1 буфере pH 7,8 и ресуспендировали в ТМ буфере (50 мМ трис-HCl, 5мМ MgCl, 5мМ ДТТ, 1мМ ЕДТА, pH 7,8). Затем клетки разрушали продавливанием на Х-прессе (LKB, Швейцария) или озвучиванием на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т под струей аргона. Гомогенат центрифугировали в атмосфере аргона (15-20 мин, 17000 об/мин, 3-4 °С) для осаждения крупных частиц и неразрушившихся клеток. Полученный экстракт использовали для определения активности ферментов.

Лакгатдегидрогеназу (НФ 1.1.1.27) определяли по методу Strauss и Fuchs (1993). Малатдегидрогеназу (НФ1.1.1.37) определяли по методу Rolstad и др. (1988). Сукцинатдегидрогеназу (НФ 1.3.99.1) определяли по Veeger и др. (1969). Лактоил-КоА гидратазу (НФ 4.2.1.54) определяли по методу Baldwin и др. (1965). Пропиопил-КоА дегидрогеназу (НФ 1.3.99.3) определяли по методу Strauss и Fuchs (1993). АТФ:цитратлиазу (НФ 4.1.3.8) определяли по методу Ивановского и др. (1980). АТФгмалатлиазу (НФ 4.1.3.24) определяли по Tuboi и Kikuchi (1962). L-серин-пируват аминотрансферазу (НФ 2.6.1. 51) определяли по методу Rowsell и др. (1969). Цитрамалатлиазу (НФ 4.1.3.22) определяли по Buckel и Bobi (1976). Активность пируват фосфатдикиназы (НФ 2.7.9.1) определяли по Buchanan (1974). Определение активности ферментов проводили при комнатной температуре (20-22 °С).

Для определения активности карбоксилирующих ферментов клетки отделяли от культуральной среды, отмывали и разрушали как описано выше. Полученный экстракт использовали для определения активности ферментов немедленно или после диализа на холоду (против буфера ТМ) или гельфильтрации (Сефадекс G-10) в буфере того же состава.

Определение активности карбоксилирующих ферментов проводили при 55°С (для С. aurantiacus) и 28 "С (для О. trichoides). Анаэробные условия поддерживались с использованием Ar или Н?. Содержание белка в реакционной смеси составляло 0,5-2,0 мг/мл.

Пируватсинтазу (НФ 1.2.7.1) определяли по модифицированному методу Holo и Sirevag (1986). Ацетил-КоА карбоксилазу (НФ 6.4.1.2) и пропионил КоА карбоксилазу (НФ 6.4.1.3) определяли по методу Strauss и др. (1992). Фосфоенолпируваткарбоксилазу (НФ 4.1.1.31) определяли по методу Holo и Sirevag (1986). 2-оксоглутаратсинтазу (НФ 1.2.7.3) определяли по Holo и Sirevag (1986). Рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазу (НФ 4.1.1.39) определяли по Shauder и др. (1987). Фосфорибулокиназу (НФ 2.7.1.19) определяли по Hart и Gibson (1975).

Выделение ферредоксина Ферредоксин из клеток С. aurantiacus был выделен по методу, описанному Серебряковой (1990).

Содержание белка в клетках определяли по методу Бредфорда (Bradford, 1976), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активность пируватсинтазы у С аигапИасш В-3 Клетки С. аигапНасш В-3 содержат все ферменты, необходимые для функционирования предложенного восстановительного цикла дикарбоновых кислот (рисунок 1), причем их активность" была сопоставима со скорость роста данного микроорганизма в автотрофных условиях (Гуагктку « а!., 1993). Исключение составила лишь пируватсинтаза (0,3 нм/мг белка мин). Такая низкая активность недостаточна для поддержания наблюдаемой скорости роста СЫого}1ехш в автотрофных условиях и может быть результатом недооценки реальной активности данного фермента в клетках этой бактерии. Поэтому нами были оптимизированы условия измерения активности пируватсинтазы для С. аигатйшеш В-3.

углерод клеток

I

С02 глиоксилат

^— ацетил-КоА < малат <—^ пируват оксалоацетат

i-<йгп----^

ФЕП-р

со2

Рисунок 1. Восстановительный цикл дикарбоновых кислот у С. аигапиасш В-3 (Гуаштку «а!., 1993).

Было показано, что уровень активности пируватсинтазы зависит от стадии роста культуры (рисунок 2). Максимум активности приходится на середину экспоненциальной фазы роста. Использование более молодых культур нецелесообразно, вследствие невозможности накопления культурой достаточного для определения активности фермента количества биомассы. В целях оптимизации метода измерения активности нами было испробовано несколько методов приготовления клеточного экстракта (разрушение клеток с помощью Х-пресса; разрушение клеток с помощью ультразвука в атмосфере аргона; разрушение клеток с помощью Х-пресса с последующим диализом; разрушение клеток с помощью ультразвука в атмосфере аргона с последующим диализом; разрушение клеток с помощью Х-пресса с последующей гельфильтрацией). Максимальная удельная

активность была получена при разрушении клеток с помощью Х-пресса с последующей гельфильтрацией, так как на уровень замеряемой активности пируватсинтазы может повлиять высокий уровень низкомолекулярных клеточных метаболитов (эндогенных ацетата, пирувата, гидроксипирувата, глиоксилата) (Thauer et al., 1970; Williams et a!., 1990). Также были определены оптимальные значения рН и концентрация метилвиологена для данной реакции, которые составили 8,0 и 2 мМ соответственно. Кроме того, показано, что присутствие в реакционной среде ферредоксина, выделенного из С. aurantiacits, и потенциально являющегося восстановителем для пируватсинтазы (Docampo et al., 1987; Meinecke et al., 1989; Williams et al., 1990), стимулировало активность данного фермента. Максимальная активность была получена при совместном использовании 2 мМ метилвиологена и 1 мМ ферредоксина.

Оказалось также, что по мере хода реакции происходит декарбоксилирование синтезированного пирувата, что можно объяснить наличием в экстракте декарбоксилирующих ферментов. Этот эффект снимали, внося в реакционную смесь субстраты трансаминаз, осуществляющих аминирование пирувата, что позволило вывести продукт пируватсинтазной реакции из сферы действия ферментов декарбохеширования и сместить равновесие исследуемой реакции в сторону образования пирувата. Наиболее предпочтительным оказалось использование в этом качестве серина (рисунок 3), который, как выяснилось, не поддерживает реакции фиксации СОг в отсутствие КоА и ацетата. Действительно, нами было показано, что в клетках С. aurantiacus В-3 функционирует достаточно активная (5 нм/мг белка мин) L-серин-пируват аминотрансфераза.

Таким образом, скорость фиксации С02 в реакции, катализируемой пируватсинтазой, в оптимизировшшых условиях составила 2,5 нм/мг белка мин в реакции синтеза пирувата и 10,1 нм/мг белка мин в реакции обмена пируват-'4С02 для автотрофно выращенного С. aurantiacus В-3, что вполне достаточно для поддержания роста данного микроорганизма в автотрофных условиях.

80 ■ 0,8

ц

- 60 К- / 0,6

S л у

40 у К 0,4

О у \

I20 0 i 0,2 0

s

■5._■

'i s S

í A 8 S

к

>< L.

9- s

50 100 150

время культивирования, часы

-белок, мг/мл -Ш-нм/мг белка мин

200

Рисунок 2. Влияние возраста культуры на активность пируватсинтазы С. aurantiacus В-3.

40 60

время, ыин

-контроль(-серин) —■— серин2мМ

Рисунок 3. Активность пируватсинтазы С aurantiacus В-3.

Активность пируватсинтазы и ацетил-КоА карбоксилазы у С. aurantiacus В-3 и OK-7Q в зависимости от условий роста При измерении активности пируватсшгтазы и ацетил-КоА карбоксилазы, являющихся ферментами, ответственными за первый акт карбоксилирования в восстановительном цикле дикарбоновых кислот (рисунок 1) и в 3-гидроксипропионатном цикле (рисунок 4) соответственно, были обнаружены серьезные

различия между двумя исследованными штаммами С. aurantiacus. В экстрактах клеток С. aurantiacus ОК 70, выращенных в разных условиях, не удалось замерить активность пируватсинтазы, что согласуется с данными, полученными ранее (Holo, Sirevag, 1986). В случае с С. aurantiacus В-3 картина была принципиально иной. Скорость реакции синтеза пирувата, была вполне достаточной для поддержания автотрофного роста бактерии (таблица 1). Оказалось, что этот организм синтезирует пируватсинтазу не только в фотоавтотрофных, но и в фотогетеротрофных условиях, (таблица 1).

У обоих исследованных штаммов С. aurantiacus было показано наличие достаточно высокой активности ацетил-КоА карбоксил азы. Однако, изменение активности этого фермента в зависимости от условий культивирования у исследуемых штаммов также различно. Активность ацетил-КоА карбоксилазы у С. aurantiacus В-3 сравнительно мало изменяется при переходе культуры от фотоавтотрофных к фотогетеротрофным условиям роста. Это позволяет сделать вывод о том, что у С. aurantiacus В-3 функции ацетил-КоА карбоксилазы ограничиваются ее участием в синтезе жирных кислот, как это происходит у множества организмов (Metzler,1977). У С. aurantiacus ОК-70 сравнительно низкая активность ацетил-КоА карбоксилазы обнаруживается при выращивании клеток на среде с ацетатом в качестве единственного источника углерода. Однако, активность ацетил-КоА карбоксилазы в экстрактах клеток С. aurantiacus ОК-70 значительно увеличивается после выращивания культур в фотоавтотрофных условиях. Это подтверждает участие ацетил-КоА карбоксилазы в системе автотрофной фиксации СО:. Кроме того, оказалось, что скорость данной реакции карбоксилирования в экстрактах клеток С. aurantiacus ОК-70, выращенных фотоавтотрофно, значительно превышает таковую у С. aurantiacus В-3 (таблица 1). Таким образом, отсутствие пируватсинтазы у С. aurantiacus ОК-70 и наличие достаточно высокой активности этого фермента у С. aurantiacus В-3 а также данные по изменению активности ацетил-КоА карбоксилазы хорошо согласуются со сделанными ранее предположениями о том, что исследуемые штаммы С. aurantiacus в процессе автотрофной ассимиляции СО2 могут использовать различные механизмы: 3-гидроксипропионатный цикл (рисунок 4) у С. aurantiacus ОК 70 и восстановительный цикл дикарбоновых кислот (рисунок 1) у С. aurantiacus В-3.

Таблица 1. Активность пируватсинтазы и ацетил-КоА карбоксилазы у С. aurantiacus В-3 и у С. aurantiacus ОК-70. (нм мг белка"1 мин"')

Субстраты в среде пируватсинтаза ацетил-КоА карбоксилаза культивирования__________

В-3 ОК-70 В-3 ОК-70

ацетат 3.4 <0.1 9,2 7,4

Н2 + СО2 2,5 <0.1 9,0 31,8

С02 мапонил-КоА

углерод клеток Î

глиоксилат

ацетил-КоА

X

малил-КоА t

малат

малоновый полуальдегид

i

3-гидроксипропионат

I

3-гидрокси-пропионил-КоА

акрилоил-КоА

I_.

пропионил-КоА

фумарат

^ <— малонат сукцинат

KoA-SH ----

сукцинил-КоА t

метилмапонил-КоА

Рисунок 4. 3-гидроксипропионатный цикл у С. aurantiacus ОК-70 (Strauss, Fuchs, 1993).

Фиксация СО; и ацетата целыми клетками С aurantiacus При изучении ассимиляции углекислоты целыми клетками было показано, что добавление водорода в присутствии ацетата в 1,5-2 раза стимулировало фиксацию С02 у С. aurantiacus В-3 и лишь на 10% у С.

aurantiacus OK - 70 (рисунок 5, 6). Это хорошо согласуется с тем, что первой реакцией фиксации углекислоты у штамма В-3 является зависящая от восстановителя пируватсшггазная реакция, а у штамма ОК-70 - ацетил-КоА карбоксилазная реакция, не требующая восстановителя.

Ассимиляция ацетата практически не зависела от наличия в среде ССЬ или молекулярного водорода в качестве экзогенного донора электронов (рисунок 7, 8). Эти данные свидетельствуют о том, что метаболизм ацетата у обоих исследованных штаммов С. aurantiacus осуществляется через реакции полного цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта (Sirevag, Castenholz, 1979; Loken, Sirevag, 1982; Красильникова и др., 1986), для функционирования которых не требуется ни С02, ни экзогенного восстановителя. Эти же данные могут быть интерпретированы как недвусмысленное указание на то, что и восстановительный цикл дикарбоновых кислот у С. aurantiacus В-3, и 3-пвдроксипрогшонатный цикл у С aurantiacus ОК-70 не вносят заметного вклада в утилизацию экзогенного ацетата, как это предполагалось ранее (Strauss et al., 1992; Strauss, Fuchs, 1993), поскольку их функционирование облигатно зависит от наличия в среде С02 и восстановителя.

I 0 20 40 60

время,мин -в-*С02+ацетат -*-*С02+ацетат+Н2

Рисунок 5. Фиксация ИС02 целыми клетками Chloroßexus aurantiacus В-3, выращенными на С02 и Н2.

время.кин —»-С0*2+ацетат СО*2+ацстат+Н2

Рисунок 6. Фиксация "СОг целыми клетками С. аигапйасш (Ж-70, выращенными на СО2 иН2

время,мин

ацетат* -«-ацетат*+С02 —А— ацетат*+С02+Н2

Рисунок 7. Фиксация ацетата целыми клетками С. аигапИасш В-3, выращенными на СОг и

Нг

время, мин

—•—ацетат* -в-ацетат*+С02 —А— ацетат*+С02+Н2

Рисунок 8. Фиксация ацетата целыми клетками С. аигаппасш ОК-70, выращенными на С02 и Н2.

В соответствии со схемой 3-гидроксипропионатного цикла (рисунок 4), одним из ферментов, участвующих в процессе автотрофной ассимиляции ССЬ у С. ангапИасж ОК-70, является сукцинатдегидрогеназа, которая, однако, не принимает участия в таковом у С. аигапИасия В-3 (рисунок 1). Это предполагает, что экзогенный малонат, являющийся сильным конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы (Veeger йаЦ 1969), должен подавлять ассимиляцию СОг у штамма ОК-70 и не оказывать на нее влияния у штамма В-3. Следовательно, действие этого ингибитора вполне может быть использовано как дискриминирующий фактор для решения вопроса о том, какая из предложенных схем автотрофной фиксации углекислоты в действительности функционирует у исследуемого организма. Но оказалось, что в фотоавтотрофных условиях высокие (до 40 мМ) концентрации малоната не подавляют фиксацию СО: обоими исследованными штаммами (таблица 2). Отсутствие действия малоната легко объясняется тем, что сукцинатдегидрогеназа не участвует в системе автотрофной ассимиляции углекислоты у С. аигамшсю В-3 (рисунок 1).

Таблица 2. Влияние малоната (40мМ) на фиксацию СОг целыми клетками С. auranliacus В-3 и С. aurontiacus ОК-70, выращенными в фотоавтотрофных условиях на среде с Н2 и

С02.

вариант С. auranliacus В-3 С. aurantiacus ОК-70

нм мин'1 % нм мин*1 %

мг.белка"1 от контроля мг.белка"1 от контроля

СО2+Н2 9,1 100 11,5 100

СО2 +Н2+ малонат 9,5 112,9 13,5 117,4

Отсутствие ингибирующего действия малоната на автотрофную ассимиляцию С02 у С. auranliacus ОК-70 может иметь два объяснения. Во-первых, сукцинатдегидрогеназа зеленых нитчатых бактерий может быть нечувствительна к действию данного ингибитора. Во-вторых, сукцинатдегидрогеназа может не принимать участия в последовательности реакций 3-гидроксипропионатного цикла.

Проверка первого предположения показала, что сукцинатдегидрогеназа, имеющая в клетках С. aurantiacus ОК-70, выращенных в фотоавтотрофных условиях, активность 7Î нм/мг белка мин, чувствительна к действию малоната. Малонат в концентрации 5 мМ более, чем на 90% подавлял активность данного фермента в экстрактах фотоавтотрофнс выращешшх клеток С. aurantiacus ОК-70. Эти данные позволяют сделать вывод о том, чтс сукцинатдегидрогеназа, по всей видимости, функционирует в составе цикла трикарбрновьи кислот, но не принимает участия в автотрофной ассимиляции СО2 у С. aurantiacus ОК-70.

Отсюда также следует, что судьба пропионата, являющегося предшественником сукцината в постулированном З-гидроксипропионатном цикле, иная, нежели это предсказывалось его авторами (Strauss, Fuchs, 1993). На возможность разрешения данного противоречия указывают результаты ингибиторного анализа (таблица 3). Мезаконат и итаконат в сравнительно низкой концентрации полностью блокируют автотрофную фиксацию углекислоты клетками С. aurantiacus ОК-70. Эти данные указывают на возможность участия в процессе автотрофной ассимиляции СО2 последовательности реакций (рисунок 9), в которой пропионат и глиоксилат, предполагаемый продукт 3-

гидроксипропионатного цикла, конденсируются в синтазной реакции с образованием 3-метилмалата. Последний в результате последовательных реакций дегидратации-гидратации превращается в цитрамалат, который, в свою очередь, распадается на ацетат и пируват.

пропионат

соон ¿н2

СН, Нзс"

+ . Г

сно соон

глиоксилат

соон

I

-СН

<!нон

¿оон

н2о

900н н2о

(_н3с-

-СН

н

оон

3-метилмалат

соон

I

-с—он

I

сн2 соон

цитрамалат

пируват соон

1г0

снэ +

сн3 соон

ацетат

Рисунок 9. Возможный путь конверсии пропионата и глиоксилата в пируват и ацетат.

Такая последовательность реакций не нова. Подобный механизм, например, имеет место при ассимиляции ацетата у пурпурной бактерии Rhodospirillum rubrum (Ivanovsky et al., 1997), расщеплении глутаминовой кислоты Clostridium tetanomorphum (Buckel, Bobi, 1976).

Таблица 3. Влияние итаконата и мезаконата на фиксацию СОг целыми клетками С. В-3 и ОК- 70 (им фиксированного С02 / мг белка мин).

вариант С. aurantiacus В-3 С. aurantiacus ОК-70

_____ __ __

С02+Н2+5мМ мезаконата 0,0 0,0

С02+Н2+5мМ итаконата 0,0 0,0

Это позволило нам предположить, что в процессе автотрофной фиксации С02 у С. аигапИасия ОК-70 функционирует модифицированный 3-гидроксипропионатный цикл, представленный на рисунке 10 (для упрощения схемы цепь реакций, субстратами которой являются разветвленные Сб-кислоты, заключена в скобки). В предлагаемой последовательности реакций сохранена та ветвь классического 3- гидроксипропионатного цикла, которая приводит к синтезу пропионата. Представленная схема объясняет

нечувствительность системы автотрофной ассимиляции углекислоты у С/1. аигапИасш ОК-70 к действию малоната, поскольку в ней отсутствует сукцинатдегидрогеназа.

СО,-у-ацетил-КоА

2-у

пируват-► ФЕП-^-С02

налонат \

малоновый

полуальдегид

| (цитрамалат)

3-гидрокси-пропионат

оксалоацетат

малат

пропионат-' 4-глиоксилат ——► ацетат

Рисунок 10. Модифицированный З-гидроксипропионатный цикл.

Ингибирующее действие итаконата, по-видимому, объясняется тем, что последний является полным структурным аналогом мезаконата, отличаясь от него лишь иным расположением двойной связи. Это делает вероятным его участие в качестве эффективного конкурентного ингибитора в реакциях с участием Cs разветвленных дикарбоновых кислот модифицированного 3-гидроксипропионатного цикла.

Возможность функционирования предложенного механизма подтверждается наличием в экстрактах автотрофно выращенных клеток С. aurantiacus ОК-70 основных ферментов (таблица 4). Первые два фермента принимают участие в конверсии глиоксилата и пропионата в пируват и ацетат (рисунок 9). Остальные вовлечены в преобразование пирувата в ацетат и глиоксилат, обеспечивая еще один акт карбоксилирования (рисунок 10).

Наличие АТФ: малат лиазы (7 нм/мг белка мин), осуществляющей АТФ-зависимое расщепление малата на ацетат и глиоксилат, в клетках С. aurantiacus ОК-70 было показано ранее (Strauss, Fuchs, 1993). Активность всех ферментов достаточна для поддержания наблюдаемой скорости роста С. aurantiacus ОК-70 в автотрофных условиях.

Таблица 4. Активность некоторых ферментов в клетках С. аигапПаст ОК-70, выросших в фотоавтотрофных условиях.

Фермент Активность (нм мг белка"' мин"1)

3-метилмалат синтаза 46

Цитрамалатлиаза 63

Пируватфосфатдикиназа 54

Фосфоенолпируват карбоксилаза 200

Малатдегидрогеназа 700

Аналогичный ингибиторный эффект мезаконата и итахоната на ассимиляцию углекислоты у С. аигапЧасиз В-3 также указывает на возможность участия этих соединений в данном процессе. Следовательно, для объяснения подавления фиксации С02 итаконатом и мезаконатом у С. аигапИасш В -3 можно предположить наличие механизма, представленного на рисунке 11.

акрилат

лактат

Рисунок 11. Модифицировашшй восстановительный цикл дикарбоновых кислот.

В данном случае продукт восстановительного цикла дикарбоновых кислот глиоксилат путем конденсации с пропионатом после ряда превращений образует цитрамалат. Последний распадается на ацетат и пируват в соответствии с реакциями, представленными на рисунке 9. Ацетат поступает в реакции цикла трикарбоновых кислот, а пируват при участии лактатдегидрогеназы преобразуется в лактат. На следующем этапе

^--пируват ч—^

ФЕП ацетил-КоА

С02

с<-)2 ^ -►глиоксилат——пропионат-.

оксалоацетат малат [цитрамалат]

1-* JL

ацетат ч—' 4—► пируват

мы предположили возможность существования последовательности реакций, в которой участвует лактоил-КоА дегидратаза (лактоил-КоА^акрилоил-КоА+НгО). Известно, что этот фермент активно участвует в метаболизме пропионата у ряда аэробных и анаэробных бактерий (Schweiger, Buckel, 1985). Образовавшийся таким образом акрилоил-КоА, при участии пропионил-КоА дегидрогеназы превращается в пропионат. Последний вновь подвергается конденсации с глиоксилатом. При наличии такого механизма реакции восстановительного цикла дикарбоновых кислот удачно сочетаются с последовательностью превращений, позволяющей включать продукт цикла глиоксилат в ЦТК. Проведенный энзиматический анализ также показал наличие необходимых для функционирования предложенного механизма ферментов в клетках С. aurantiacus В-3, выращенных в фотоавтотрофных условиях (таблица 5).

Таблица 5. Активность некоторых ферментов в клетках С. aurantiacus В-3, выращенных в фотоавтотрофных условиях

Фермент Активность (нм мг белка-1 мин-1)

Пропионил-КоА дегидрогеназа 10

Лактат дегидрогеназа 18,5

Лаетоил-КоА дегидратаза 10,8

АТФ:малатлиаза 21,8

Как видно из рисунков 10 и 11, продуктом функционировшшя обеих предложенных модифицированных схем автотрофной ассимиляции углекислоты у С. аигапИасж, в отличие от ранее предлагавшихся (рисунок 1, 4), является ацетат, который далее легко метаболизируется через реакции цикла трикарбоновых кислот. Это снимает не решенную до последнего времени проблему утилизации глиоксилата, являющегося конечным продуктом фиксации С02 у С. аигаШшсш в соответствии с ранее предложенными схемами (рисунок 1, 4), что является существенным достоинством предлагаемых нами механизмов.

Механизм автотрофной фиксации у СО; О. ЫсИоШех Значительный интерес для изучения представляет пока мало исследованный представитель зеленых нитчатых бактерий - О. Мско '^ь. Этот микроорганизм демонстрирует ряд серьезных отличий от С. аигапИасш, причем как физиолого- биохимических, так и генетических. Проведенные филогенетические исследования вкупе с целым набором физиологических,

биохимических и хемотаксономических данных показали, что различия между этими микроорганизмами настолько велики, что позволяют выделить представителей Oscillochloris вР отдельное семейство - Oscillochloridaceae (Keppen et al., 2000). За последнее время было изолировано несколько новых штаммов Oscillochloris. Выделенные из разных мест обитания мезофильные нитчатые аноксигенные фототрофиые бактерии способны расти в фотоавтотрофных условиях, используя Н2 или H2S в качестве донора электронов. Пируват и ацетат стимулируют рост данных микроорганизмов.

Автотрофная ассимиляция ССЬ у всех исследованных штаммов значительно подавляется в присутствии цианида, конкурентного ингибитора рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы (Takabe, Akazawa, 1977) (табл1ща 6). К такому же эффекту приводит внесете иодацетата - ингибитора восстановления фосфоглицеринового альдегида в цикле Кальвина (Smith, MacQuarrie, 1979) (таблица 6). Полученные данные указывают на возможность участия восстановительного пентозофосфатного цикла в процессе автотрофной фиксации С02 у представителей семейства Oscillochloridaceae. Это было подтверждено энзиматическими исследованиями. Было показано наличие в клетках О. trichoides DG-6 достаточно высокой активности ключевых ферментов восстановительного пентозофосфатного цикла - рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы и фосфорибулокиназы (таблица 7). Эти данные позволяют сделать вывод о функционировании у О. trichoides DG-6 восстановительного пентозофосфатного цикла фиксации углекислоты (цикла Кальвина).

Таблица 6. Фотоассимиляция С02 разными штаммами О. trichoides (нм фиксированного С02 мг белкамин"1).

Вариант Кр Р DG-6

C02+S2" 14,6 15,3 12

С02 +S*+CNT(1mM) 3,2 4,7 2,1

С02 +S2" + CN~( 1 мМ)+пируват(5мМ) 4,7 11,7 4,9

C02+S2"+CN"( 1мМ)+пропионат(5мМ) 5,1 12,3 7,2

C02 +S2+иодацетат(0,02мМ) 8,4 6,3 4,5

С02+8г*+иодацетат(0,02мМ)+пируват(5мМ) 18,4 13,3 8,3

С02+82"+иодацетат(0,02мМ)+прогшонат(5мМ) 11,1 19 9,6

Таблица 7. Активность некоторых карбоксилирукмцих ферментов у О. trichoides DG-6

Фермент Специфическая активность (нм мг белка'1 мин"1)

Рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилаза 33

Фосфорибулокиназа 48,7

Фосфоенолпируват карбоксилаза 1,5

Пропионил-КоА карбокешаза 3,1

2чжсоглутаратсинтаза 2,6

Пируватсинтаза 2,3

Кроме того, было показано, что пропионат и пируват довольно успешно снимают ингибирование фиксации углекислоты цианидом и йодацетатом у всех штаммов, (таблица 6). Это может свидетельствовать о наличии у данных организмов дополнительных систем карбоксилирования, в функционировании которых участвуют вышеупомянутые субстраты. В этом отношении О. trichoides похож на пурпурную серную бактерию Thiocapsa roseopersicina BBS, которая, являясь облигатным автотрофом, способна к ассимиляции данных субстратов только в присутствии СОг, используя их как дополнительный источник углерода (Кондратьева, 1996).

Проведенный энзиматический анализ О. trichoides DG-6 (таблица 7) показал, что г ассимиляцию ацетата, пирувата и пропионата у этого микроорганизма могут был вовлечены фосфоенолпируваткарбоксилаза, пируватсинтаза, 2-оксоглутаратсинтаза пропионил-КоА карбоксилаза. Пируватсинтаза и 2-оксоглутаратсингаза были обнаружснь также и в клетках О. trichoides Р (3,2 и 5,7 нм / мг белка мин соответственно). Эти данньк в совокупности с ранее полученными результатами о наличии у О. trichoides DG-t неполного, вследствие отсутствия 2-оксоглутаратдегидрогеназы, цикла трикарбоновы> кислот (Кеппен, Красильникова, 1995), позволили нам построить принципиальную схем} метаболизма СОг и некоторых органических кислот для этого микроорганизма (рисуно! 12).

( цикл у' (Кальвина]

со2

углеводы -«- -«—

пируват

<ЬРП -4-— ▼

С02—-См ацетал-КоА-*—ацетат

♦ I

С02 ^— малагм— оксалоацетат—► цитрат—^

^ фу марат изоцитрат

,__________ сукцинат

I ^С02

сукцинил-КоА

2-оксоглутарат

2-оксоглутарат

Рисунок 12. Принципиальная схема метаболизма ССЬ и некоторых органических кислот у О. >г:сИо1(1ех ПО-б.

ВЫВОДЫ

1. .Энзиматические исследования показали, что ферментами, осуществляющими первичную фиксацию СОг, являются ацетил-КоА карбоксилаза у С. аигапИасиз ОК-70 и пируватсшггаза у С. аигапИасш В-3, что согласуется с функционированием у этих микроорганизмов 3-гидроксипропионатного цикла и восстановительного цикла дикарбоновых кислот соответственно.

2. Для С. аигапНасш ОК-Ю предложена модифицированная схема 3-гидрокснпропионатного цикла, конечным продуктом функционирования которой, в отличие от ранее предложенной, является не глиоксилат, а ацетат.

3. Предложена схема утилизации глиоксилата - конечного продукта функционирования восстановительного цикла дикарбоновых кислот у С. аитапйасш В-3.

4. Показано, что ассимиляция углекислоты у О. 1гюИо1с!е$ ОО-б происходит при участии цикла Кальвина.

5. Установлено, что утилизация ацетата и пирувата в качестве дополнительных источников углерода у О. trichoides может происходить с участием пирувагсинтазы и 2-оксоглутаратсинтазы. Предложена принципиальная схема метаболизма COj и некоторых органических кислот у О. trichoides DG-6.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Уголькова Н. В. Пируватсинтаза как первичный акцептор СОг в новом цикле автотрофной фиксации СОг у Chloroflexits aurantiacus Н Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-96». Тезисы докладов. Биология. 1996. М. С. 24.

2. Уголькова Н. В. Активность пируватсинтазы у Chloroflexus aurantiacus И Тезисы конференции "Автотрофные микроорганизмы". Москва. 1996. М.: Диалог-МГУ. 1996. С.54.

3. Уголькова Н. В., Ивановский Р. Н. Сравнительное исследование механизмов автотрофной фиксации углекислоты у Chloroflexus aurantiacus В-3 и Chloroflexm aurantiacus OK-70JI И Материалы II Всероссийского съезда фотобиопогов. Пущино. 1998. С.

4. Уголькова Н. В., Ивановский Р. Н. Автотрофный метаболизм СОг у разных штаммов Chloroflexus aurantiacus // В сб. статей «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». 1998. Воронеж: ВГУ. С. 132-142.

5. Ivanovsky R. N., Fal Y. I., Berg I. A., Ugolkova N. V., Krasilnikova E. N., Keppen О. I., Zakharchuc L. M., Zyakun A. M Evidence for the presence of the reductive pentose phosphate cyclc in a filamentous anoxygenic photosynthetic bacterium Oscillochloris trichoides strain DG-6 // Microbiology. 1999. V. 145. P. 1743-1748.

6. Keppen О. I., Tourova T. P., Krasilnicova E. N., Ugolkova N. V., Ivanovsky R. N. Oscillochloridaceae fam. nov. a phylogenetic analysis of the morphological, physiological and biochemical properties of the filamentous anoxygenic phototrophic bacteria // Abstracts of IVth Workshop on Green and Heliobacteria, Girona, Spain, August 28-31 1999. P. 32.

7. Ivanovsky R. N., Ugolkova N. V., Krasilnicova E. N. New aspects of the autotrophic C02 fixation in Chloroflexus aurantiacus II Abstracts of IVth Workshop on Green and Heliobacteria, Girona, Spain, August 28-31 1999. P. 63.

8. Кеппен О. И., Красильникова Е. Н., Уголькова Н. В., Турова Т. П., Ивановский Р. Н. Углеродный метаболизм штаммов аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий // В

сб. трудов научн. Конф. «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов» Москва. 1999. М.: Диалог-МГУ. 2000. С.65. 9. Уголькова Н. В., Ивановский Р. Н. О механизме автотрофной фиксации углекислоты у СЫого/1ехи$ аигапНасич II Микробиология. 2000. Т. 69. С. 175-179.