Фенотипические и генотипические характеристики ацидофильных хемолитотрофов, окисляющих разные типы пиритов

Тупикина, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фенотипические и генотипические характеристики ацидофильных хемолитотрофов, окисляющих разные типы пиритов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фенотипические и генотипические характеристики ацидофильных хемолитотрофов, окисляющих разные типы пиритов"

На правах рукописи

Тупикина Ольга Владимировна

Фенотипические и генотипические характеристики ацидофильных хемолитотрофов, окисляющих разные типы

пиритов.

Специальность 03 00 07 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008

003168690

Работа выполнена в Институте микробиологии С Н. Виноградского РАН

Научный руководитель доктор биологических наук

Кондратьева Т Ф

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Эль-Регистан Г. И

доктор технических наук, профессор Седельникова Г В

Ведущая организация Московский Государственный

Университет им М В Ломоносова, Биологический факультет

Защита диссертации состоится 19 мая 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002 224 01 в Институте микробиологии им С Н Виноградского РАН по адресу 117312, г Москва, Проспект 60-летия Октября, д 7, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им С Н Виноградского РАН

Автореферат разослан « » апреля 2008 г

Учёный секретарь диссертационного совета, ¿У* Л

кандидат биологических наук Т В Хижняк

Актуальность работы Ацидофильные хемолитотрофные микроорганизмы получают энергию, окисляя такие неорганические субстраты, как закисное железо, элементная сера, ее восстановленные соединения и сульфидные минералы Пирит -самый распространенный сульфидный минерал на Земле [Андреев, 1992] В литературе описаны физические, химические, кристаллохимические и электрофизические особенности пиритов Все перечисленные характеристики природных пиритов могут сильно варьировать Однако практически не изучено влияние свойств пиритов на способность микроорганизмов использовать их в качестве источников энергии Большая часть исследований окисления пиритов микроорганизмами проводилась без анализа их свойств Например, в работе Грудева отмечено только, что один и тот же штамм АсШЬюЬасйиэ ¡еггоох^апэ может с разной активностью окислять различные пириты [Грудев, 1985]

Первые попытки изучить различия в характере бактериально-химического окисления А 1егтоох1бап5 пиритов с электронным (п) и дырочным (р) типами проводимости были сделаны Яхонтовой и Каравайко в 1976 году [Яхонтова и др , 1976] Была показана связь динамики и интенсивности выщелачивания железа из пирита с типом его проводимое™ Однако дальнейшего развития эта работа не получила Только в 1994 году Каравайко с соавторами вернулись к этим исследованиям [Кагауа1ко е1 а1, 1994] Было изучено окисление 6 образцов пиритов уже двумя видами микроорганизмов - А (еггоохкЗапв и ЭиНоЬасШив ШегтозиШдоох^апз Показаны различия как в характере окисления разных типов пиритов микроорганизмами, так и в окислении одного образца разными микроорганизмами

В начале 90-ых годов отечественными авторами для исследования штаммового разнообразия ацидофильных хемолитотрофов был применен анализ хромосомной ДНК, расщепленной эндонуклеазами рестрикции, методом пульс-электрофореза (ПФ) [Кондратьева и Каравайко, 1992] Всесторонне изучен штаммовый полиморфизм вида А Iёггоох1с1апз показано разнообразие фенотипических признаков, структуры хромосомной ДНК, разнообразие плазмидных профилей, содержания в геноме 1Б элементов Отмечены изменения в структуре хромосомной ДНК, плазмидных профилях и локализации 1Э элементов при адаптации штаммов к новым энергетическим субстратам [Агеева и др, 2001, 2003, Кондратьева и др , 1996 а, б, Кондратьева и др, 2002 а, б, Кагауа1ко е1 а1, 2003, Копс!гаГеуа е1 а1, 2005] Показано, что адаптация А ferгooxldans может сопровождаться изменениями в локализации 1Э элементов и, возможно, интеграцией плазмидной ДНК в хромосому Адаптация штаммов А fefгoox(cfaлs к новым энергетическим субстратам зависела от предыстории их существования от условий среды и, в первую очередь, от характеристик основного источника энергии в биотопе Штаммовое разнообразие и адаптивные характеристики видов Б МегтоШегапз и Реггар/аэта аскЯрЫит мало изучены

При адаптации штамма А ГеггоохкЗапэ ТЯВк к пиритам, выделенным из руд раоных месторождений, иногда наблюдали изменения в ХЬа1 рестриктах хромосомной ДНК Полученные результаты позволили предположить, что на генотипическую изменчивость штаммов А (еггоохиЗапэ влияет не только состав энергетического субстрата, но и физические, химические и электрофизические особенности минерала

Внимание к изучению кинетик и механизмов микробиологического окисления сульфидных минералов, в основном пирита, объясняется также экономической важностью биогидрометаллургических технологий выщелачивания цветных металлов и извлечения благородных металлов из сульфидных руд и концентратов и вредом, наносимым окружающей среде при окислении микроорганизмами пиритных руд с образованием кислых дренажных вод, содержащих ионы тяжелых металлов Долгое время интерес ученых был направлен, в основном, на изучение мезофильных представителей ацидофильных хемолитотрофов А (еггоохШапз, А Оиоох^апэ, ¡.ерЬэртНит fermoxldaпs Однако задачи интенсификации процесса бактериально-

химического окисления сульфидных субстратов стимулируют изучение умеренно термофильных и термофильных сообществ, выделение и описание новых видов ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов

В связи с вышеизложенным, исследования процесса окисления природных пиритов представителями различных филогенетических групп ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов представляют научный интерес и практическую значимость

Цели и задачи исследования Целью настоящей работы являлось изучение фенотипических и генотипических характеристик ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов при окислении разных типов пиритов

Конкретные задачи исследования состояли в следующем

1 Изучение физических, химических и электрофизических свойств пяти образцов природных пиритов из различных месторождений

2 Адаптация трех видов ацидофильных хемолитотрофов, принадлежащих к разным филогенетическим группам микроорганизмов (А 1етгоох!бгп$, 5 МегтоЫегапв, Ё вскйрШШт), к различным типам пиритов и изучение параметров их роста

3 Изучение генотипической изменчивости (структуры хромосомной ДНК и плазмидных профилей) этих микроорганизмов при росте на пиритах, различающихся по свойствам

4 Исследование электрофизических свойств пиритов до и после химического или бактериально-химического окисления

Научная новизна Впервые использован комплексный подход для изучения окисления природных пиритов микроорганизмами Были изучены свойства пиритов, адаптация различных представителей группы ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов к этим пиритам, изменение фенотипических и генотипических свойств микроорганизмов, адаптированных к различным типам пиритов, изменение электрофизических свойств пиритов в процессе их химического и бактериально-химического окисления Ацидофильные хемолитотрофные микроорганизмы, относящиеся к филогенетически отдаленным группам, Л ^ггоохч^апв, Б ^егтоШегапэ, Р аабрМит, различались способностью адаптации к пиритам, а также по скорости роста и окисления пиритов В процессе адаптации штамма А 1еггоох1ёап$ ТРВк к пиритам отмечены изменения в структуре хромосомной ДНК, а штамма ТР\Л1 - в плазмидных профилях Впервые были изучены электрофизические свойства пиритов, такие как КтермоЭДС И сопротивление, при химическом и бактериально-химическом окислении и показаны различия в их изменении при окислении разными видами микроорганизмов у А {еггоохк^апа и Э МегтоЫегапз эти изменения были схожи, а у Р ааЛрШит - отличны Установлена связь между плотностью, Ктермоэдс, значением 1п 14 пиритов и способностью микроорганизмов окислять их Предложены параметры прогнозирования возможности и скорости окисления разных типов пиритов микроорганизмами

Практическая значимость Изучение процессов окисления разных типов пиритов микроорганизмами важно с позиций экологии и экономики в разработке мер по предотвращению загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами и закислению почв и водоемов в зоне добычи сульфидных руд, в совершенствовании биогидрометаллургических технологий получения ценных металлов Очень важным является знание минералогического состава субстрата, выбор режимов рН, температуры, наличия органических веществ в воде, содержания минеральных солей, активности аэрации и массообмена Эти параметры определяются микроорганизмами, доминирующими в процессе Как правило, это ассоциация аборигенных микроорганизмов, обладающих высоким регуляторным потенциалом в условиях технологических процессов с перманентным изменением характеристик субстрата Полученные данные могут быть

использованы при разработке стратегий управления бактериально-химическими процессами извлечения металлов, выработке практических рекомендаций по их интенсификации

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на 11-ом и IV-om Московских международных конгрессах «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2003, 2007), Международном конгрессе «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения» (Апатиты, 2004), VII Международной конференции «Новые идеи в науках о земле», (Москва, 2005), 16-ом Международном симпозиуме по биогидрометаллургии (Кейптаун, 2005), l-ой Всероссийской молодежной школе-конференции и Ш-ей Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005, 2007) и международной научной конференции молодых ученых и студентов «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, 2007)

Публикации По материалам диссертации, включая тезисы, опубликовано 12 работ, две статьи сданы в печать

Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 159 страницах машинописного текста, включают 19 таблиц и 26 рисунков Диссертация состоит из введения, трёх глав («Обзор литературы», «Объекты и методы исследований», «Результаты и обсуждение»), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 216 наименований работ, в числе которых 45 на русском и 171 на иностранных языках

Место проведения работы Работа выполнена в лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов (зав лабораторией д б н Т Ф Кондратьева) Института микробиологии им С Н Виноградского РАН, Москва, Государственном научно-исследовательском институте горнохимического сырья ФГУП «ГИГХС», Московская обл, Люберцы, Всероссийском институте минерального сырья им Н М Федоровского (Министерство природных ресурсов РФ), Москва

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования являлись штаммы микроорганизмов Acidithiobacillus feirooxidans, TFV-1, TFBk, BKM B-458, Ferroplasma acidiphilum YT, Sulfobacillus thermotolerans Кг1т, выделенные из природных или технологических сред Штаммы хранятся в коллекции культур лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии им С Н Виноградского РАН

Среды и условия культивирования Периодическое культивирование штаммов A ferrooxidans проводили при температуре 28 ± 2 °С на среде Сильвермана и Люндгрена [Silverman, Lundgren, 1959] в колбах Эрленмейера объёмом 500 мл с 200 мл среды, на качалке (150 об/мин) или стационарно в бутылях объемом 2 л с 1 л среды при принудительном аэрировании (3 л/мин) Исходное значение рН среды составляло 1,8 -2,0 Периодическое культивирование F acidiphilum YT проводили при температуре 35 ± 0,5 °С на модифицированной среде Сильвермана и Люндгрена, рН 1,7 В среду дополнительно вносили 0,02 % дрожжевого экстракта, простерилизованного отдельно [Golyshma et al, 2000] Периодическое культивирование S thermotolerans Кг1т проводили при температуре 40 ± 0,5 °С на модифицированной среде Сильвермана и Люндгрена, рН 1,7-1,8 В среду дополнительно вносили 0,02 % дрожжевого экстракта и 1 мМ Na2S203x5H20, простерилизованных отдельно [Bogdanova et al, 2006]

Оценка роста Число клеток A ferrooxidans и S thermotolerans определяли методом прямого подсчета, микроскоп Olympus (Japan) с фазово-контрастной приставкой Клетки Facidiphilum размножались почкованием, поэтому определение числа клеток прямым подсчетом не представилось возможным О росте F acidiphilum судили по увеличению количества белка в единице объема культуральной жидкости (метод Лоури-Фолина) [Lowry et al ,1951]

Анализ образцов пирита Плотность всех образцов измеряли методом M M Василевского (метод микробюреток) по инструкции НСММИ № 31 [НСММИ № 31, 1991] Микротвердость пиритов определяли по методу M M Хрущева и Е С Барковича на микротвердомере ПМТ-3 при нагрузке 100 г и экспозиции 10 с [Лебедева, 1963] Исследования образцов пиритов выполнены на сканирующем электронном микроскопе JSM-5300 (Япония) Тип проводимости, величину сопротивления и Ктермоэдо измеряли на модифицированной установке по известной методике [Кузмин и др , 1999]

Аналитические методы Концентрацию ионов Fe3*/Fe2+ в жидкой фазе определяли спектрофотометрическим роданидным методом по модифицированной методике [Резников и др, 1970] pH и Eh среды измеряли на иономерах Эксперт 001 и рН-150М соответственно

Генетические методы

Выделение ДНК Осаждение и промывание биомассы, а также выделение нативной хромосомной ДНК проводили как описано ранее [Кондратьева, Каравайко, 1992] Ллазмидную ДНК выделяли по щелочной методике Бирнбойма и Доли [Birnboim, Doly, 1979] с некоторыми модификациями

Анализ ДНК Структуру хромосомной ДНК анализировали методом пульс-электрофореза (ПФ) [Кондратьева, Каравайко, 1992] Для разрезания нативной хромосомной ДНК применяли три эндонукпеазы рестрикции для A ferrooxidans - XbaI (40 ед / 30 мкл), сайт рестрикции TJ.CTAGA, для S thermotolerans - Not) (30 ед / 30 мкл), сайт рестрикции GCJ.GGCCGC, для F acidiphilum - Xho\ (40 ед / 30 мкл), сайт рестрикции CJ.TCGAG Плазмидный состав штаммов микроорганизмов анализировали электрофорезом по стандартной методике [Маниатис и др, 1984] Перед электрофорезом препараты плазмидной ДНК очищали от кольцевых форм с одноцепочечным разрывом прогреванием в течение 2 мин при температуре 95 °С и от линейных форм - обработкой экзснуклеазой рестрикции ExoIII (25 ед /10 мкл) [Martin et al, 1981]

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 Характеристика пиритов, использованных в работе

1 1 Места отбора и описание образцов

Пирит 1 был отобран в Свердловской области (Средний Урал) на горе Карпушиха В числе примесных минералов присутствует гипс, кварц, полевой шпат, гидроокислы железа Пирит 2 отобран на Ангренском месторождении угля (Узбекистан) Примесные минералы - кварц, слюда Пирит 3 отобран на Тетюхинском полиметаллическом месторождении Отдельные кристаллы похожи на марказит (ромбической формы) Скорее всего, здесь присутствует пирит и марказит На кристаллах наблюдается налет гипса Пирит 4 отобран в Соймановской долине Пермской области В ассоциации с пиритом отмечены барит и кварц того же размера, что и пирит Все они образуют единую монолитную массу Пирит 5 отобран на участке сульфидного месторождения Гайского ГОКа в Оренбургской области Этот образец отличается от предыдущих своей монолитностью

1.2 Плотность пиритов

Все пириты отличались по плотности (табл 1) Самой высокой плотностью обладал пирит 4 (6,10 г/см3) По химическому составу он мало отличался от других образцов Однако результаты электронной микроскопии показали, что кристаллы этого пирита состояли из микроблоков с плотной упаковкой Следующими по значению плотности были пирит 2 (5,72 г/см3) и пирит 1 (5,60 г/см3) Близкие и самые низкие значения плотности у пиритов 3 и 5 (5,20 и 5,26 г/см3 соответственно) Отличия в плотности пиритов можно объяснить разницей в условиях образования ка>вдого из пиритов (температуре, давлении), а также включением других минералов

1 3 Микротвердость пиритов

Результаты измерения микротвердости приведены в таблице 1 Минимальной микротвердостью обладал пирит 5 В пирите 1 микротвердость варьировала в широких пределах от 794 до 1786 кГс/мм2 Данный пирит содержал две генерации Наиболее развита первая генерация, в которой средняя величина микротвердости составляла 1458 кГс/мм2 В образце 3 по микротвердости наблюдались две разновидности сульфида железа Одна из них характеризовалась максимальными значениями микротвердости, которые менялись в узких пределах, и составляла, в среднем, 1612 кГс/мм2 В другой разновидности были зерна с меньшей микротвердосгью (от 635 до 861 кГс/мм2) Как правило, такие величины характерны для марказита Возможно, это псевдоморфозы пирита по марказиту

1 4 Кристаллохимические особенности пиритов

Анализ химического состава исследуемых пиритов был выполнен с поверхности как образцов естественной формы, так и с полированных образцов (табл 1) Результаты изучения зерен неправильной формы показали следующее Практически во всех образцах содержание серы выше стехиометрического (Ре - 46,6 %, в - 53, 4 %) Средние значения серы в исследуемых образцах колебалось от 54,20 до 57,55 %, а железа от 42,32 до 44,75 % Из анализа частных зерен каждого образца видно, что состав пиритов неоднороден Это, в первую очередь, касается конституционных элементов -серы и железа Например, содержание серы в отдельных зернах естественной формы пирита 1 колебалось от 49,45 до 59,08 %, а железа от 40,78 до 50,08 % Содержание микропримесей приведено в таблице 1

Анализ химического состава исследуемых пиритов, выполненный с поверхности полированных образцов и дающий более достоверные результаты, чем при изучении неполированных зерен, подтвердил их нестехиометричность Почти во всех образцах наблюдалось повышенное содержание серы (на 1 и более %) Исключение составлял пирит 5, где содержание серы самое низкое и максимально приближено к стехиометрическому

Ряд пиритов по возрастанию содержания в них серы выглядит следующим образом пирит 5 (53,76 %) -» пирит 1 (54,04 %) -> пирит 3 (54,40%) — пирит 2 (54,66 %) — пирит 4 (55,01 %) Количество железа, как правило, коррелирует с содержанием серы, хотя и не всегда Ряд пиритов по убыванию содержания железа выглядит так пирит 5 (45,88%) -» пирит 1 (45,59 %) -> пирит 3 (45,37 %) пирит 4 (44,97 %) -> пирит 2 (44,70 %)

Таблица 1 Основные физические параметры пиритов исследуемых образцов

№ обр Плотность, г/см5 Микротвердость, кГс/мм2 Электрические свойства Микропримеси Содержание**, %

Тип проводимости КтермоЭДС* мкВК"1 (П(7 сера железо

1* 5,60 1360-1786(1458) 794-824 (802) п (-203)-(-16) (-100 ±49) 5-11 (8,8 ±1,9) БЬ, Со 49,45-59,08 (56,20) 53,70-54,32 (54,04) 40,78-50,08 (43,94) 45,11-45,91 (45,59)

2 5,72 1119-1233(1162) Р 110-274 (192 4 36) 7,5-10 (8,8 ±0,8) Ад, Аз, N1, Со 56,27-59,09 (56,25) 54,52-54,77 (54,66) 40,35-44,64 (42,32) 44,67-44,73 (44,70)

3* 5,20 635-861 (810) 1482-1690 (1612) Р 112-508 (347 ±107) 7-9,5 (8,3 ±0,6) Со 48,80-58,71 (55,57) 54,24-54,72 (54,40) 40,22-51,35 (43,48) 45,15-45,57 (45,37)

4 6,10 1362-1434 (1386) Р 275-480 (399 ± 49) 5,3 -9,2 (6,8 ±1,1) N1, Со 50,27-58,92 (57,55) 54,85-55,16 (55,01) 40,46-50,83 (43,79) 44,38-45,32 (44,97)

5 5,26 824-910 (874) п-р -148-240 (- 57 ± 74) 4,6-7,7 (5,6 ±0,8) Си, Со, Бп, 2п, Аэ, Сг, Аи 52,99-55,95 (54,20) 53,44 -54,28 (53,76) 43,34-47,20 (44,75) 45,20-46,56 (45,88)

В скобках указаны средние значения

* пириты неоднородны по микротвердости, представлены двумя генерациями

** приведены результаты измерений, выполненные с естественной формы (верхняя строка) и с полированных образцов (нижняя строка)

1 5 Электрофизические свойства пиритов

—■—пирит 2 —А—пирит 3 -пирит 4

пирит 1

пирит 5

Рис 1 Распределение значения Ктермоэдс зерен образцов пиритов 1-5, выраженное в процентах

-200 -100 0 100 200 300 400 600 600 КтермоЭДС« МКВ К"1

В образцах пиритов 1-5 было исследовано три параметра электрических свойств тип проводимости, сопротивление, выраженное через логарифм (1п К), и значение коэффициента термоэлектродвижущей силы (КтбРмоэдс) Пирит 1 обладал электронной проводимостью (п-типа), пириты 2, 3, 4 - дырочной (р-типа), пирит 5 - смешанной проводимостью (п-р-типа) В таблице 1 представлены значения Ктермоэдс и 1п Я На рисунке 1 показано распределение значений КтерМОэдс зерен пиритов 1-5

Полученные данные по свойствам исследуемых образцов пиритов показали, что все очи отличались друг от друга Четкой связи между параметрами не было обнаружено Практически все образцы пиритов содержали сопутствующие микропримеси, которые могут влиять на активность микробного окисления

2. Фенотипические особенности ацидофильных хемолитотрофов, окисляющих пириты

У трех видов ацидофильных хемолитотрофов, относящихся к филогенетически отдаленным группам микроорганизмов, была изучена способность к адаптации, скорость окисления пиритов, скорость роста, время генерации, изменение значений рН и окислительно-восстановительного потенциала среды (Е1п) в процессе окисления пиритов

2 1 Адаптация и особенности роста штаммов А йеггоох/с/ал«, ТР\М и ТРВк, на пиритах 1-5

Как было показано ранее, штаммы А {еггоохкЗат различались по скорости окисления таких энергетических субстратов как закисное железо, элементная сера, сульфидные минералы, концентраты сульфидных руд разного состава [Грудев и др, 1985, Агеева и др , 2001] Причем, один и тот же штамм А {еггоохкЗапз с разной активностью окислял пириты, различающиеся по свойствам, а разные штаммы различались по скорости окисления одного и того же сульфидного минерала Была изучена динамика адаптации (параметры роста и окисления пиритов исходными (в первом пассаже) и адаптированными культурами) штаммов А Iёгтох^апэ, ТР\/-1 и ТРВк, к пиритам 1-5 при плотности 1 %

Продолжительность лаг-фазы в первом пассаже у штамма ТР\/-1 составила 48 ч на пирите 1 и 24 ч на пирите 2 Экспоненциальная фаза роста у штамма ТВ/И длилась 2 сут на пирите 1 и 3 сут на пирите 2, причем в конце этой фазы роста число клеток в 1 мл на

пирите 1 составило 7,57-Ю7, а на пирите 2 - 2,2-Ю8 В процессе адаптации штамма А ГеггоохнЗапз ТВЛ1 к 3 и 5 типам пиритов продолжительность лаг-фазы не изменялась и составила 2 и 5 суток соответственно Продолжительность экспоненциальной фазы роста снизилась с 10 до 5 суток на пирите 3 и с 8 до б суток на пирите 5 Штамм ТРУ-1 на пирите 4 рос только 2 пассажа, причем продолжительность лаг-фазы в первом пассаже составила 38 суток, а экспоненциальной - 12 суток

Штамм ТРВк сразу же начал активно расти на пиритах 1 и 2, экспоненциальная фаза роста длилась 2 сут, к концу которой число клеток на обоих пиритах составило 2,4-108 В процессе адаптации штамма А ferrooxldans ТРВк наблюдалось сокращение продолжительности лаг-фазы с 2, 3 и 1,5 суток соответственно на пиритах 3, 4, 5 до 0,1, и 1 суток и экспоненциальной фазы с 6, 9, и 4 суток соответственно до 5,4, и 3,5 суток

Штаммы различались по скорости роста на разных пиритах Скорость роста в первом пассаже была сравнительно низкой (рис 2, 3) и увеличивалась с каждым пассажем Наибольшую биомассу оба штамма накапливали на пирите 2

В процессе адаптации у обоих штаммов А {еггоохкЗапв повышалась максимальная удельная скорость роста, снижалось время генерации и более активно шло подкисление среды на пиритах 1 и 2 (табл 2) Не наблюдалось значительного изменения в активности подкисления среды исходными и адаптированными штаммами на пиритах 3, 4, 5

На всех этапах адаптации пирит 2 обоими штаммами окислялся активней, чем пирит 1 (рис 4), а пирит 3 - активней по сравнению с пиритом 5 (рис 5) Пирит 4 адаптированной культурой штамма ТРВк окислялся с наименьшей скоростью Штамм ТРВк с большей скоростью, чем штамм ТП/-1, окислял все типы пиритов Скорость роста и активность окисления обоими штаммами пиритов 3-5 была значительно ниже, чем пиритов 1 и 2 Скорость окисления пиритов штаммами была достаточно велика (близка к максимальной) уже во втором пассаже (данные не приводятся) Процессы энергетического метаболизма активировались при адаптации быстрее, чем конструктивного

По сложности для роста и окисления пириты можно расположить в следующем порядке пирит 4 р-типа, пирит 5 п-р-типа, пирит 3 р-типа, пирит 1 п-типа, пирит 2 р-типа

Большую эффективность адаптации к изученным пиритам у штамма ТРВк по сравнению с штаммом ТР\/-1 можно объяснить предысторией его существования на более сложном по составу золотомышьяковом концентрате, что способствовало развитию лабильной системы регуляции процессов окисления различных типов субстратов

Оба адаптированных штамма А (еггоох^апь не росли на пиритах 1 и 2 при плотности пульпы 3% и выше Была показана роль экспериментального повышения ЕЙ в способности микроорганизмов окислять мономинерал пирит при высокой плотности пульпы (2 3 %) путем внесения раствора трехвалентного железа При внесении пиритов не в свежую среду, а в культуральную жидкость в стационарной фазе роста бактерий, когда установилось высокое значение ЕЬ пульпы, устойчивость обоих штаммов А felтooxldans к повышению плотности пульпы была более высокой

12 12 исходные

12 12 адаптированные

Я О.Й

ТРВк

ТРУ-1

пирита 3 4 5 3 4 5

исходные

ТРВк

ТРУ-1

□

3 4 5 3 4 5

адаптированные

Рис. 2. Средняя скорость роста штаммов А. ferrooxidans, ТР\/-1 и ТРВк, на пиритах 1 и 2 у исходных и адаптированных культур.

ТРВк

Рис. 3. Средняя скорость роста штаммов А. fвrrooxidans, ТР\/-1 и ТРВк, на пиритах 3, 4 и 5 у исходных и адаптированных культур.

0,6 0,5 ? 0,4

^ 0,3 "£ 0,2 0,1 о

гтириты

ТРВк

ТРУ-1

а^ЕЕ

Шшф''""'

ШЕВ ШШ"""

шр

11г

ШЁВ

1 2 1 исходные

12 12 адаптированные

0,3

0,2

г-

£ о,1

пириггы

ТРВк

ТРУ-!

ТРУ-1

3 4 5 3 4 5

исходные

3 4 5 3 4 5

адаптированные

Рис. 4. Максимальная скорость окисления пиритов 1 и 2 штаммами А. ferrooxidans, ТР\/-1 и ТРВк, у исходных и адаптированных культур.

Рис. 5. Максимальная скорость окисления пиритов 3, 4 и 5 штаммами А. ferroox¡dans, ТР\/-1 и ТРВк, у исходных и адаптированных культур.

Таблица 2 Параметры роста и окисления пиритов у исходных и адаптированных культур штаммов А ГеггоохкЗапз, ТВ/И и ТРВк

Пирит Культура Штамм

ТРУ-1 ТРВк

Параметры роста и окисления пиритов Параметры роста и окисления пиритов

Удельная скорость роста (Ртах), Ч"1 Время удвоения клеток Начальные и конечные значения Удельная скорость роста (Ртах), ч"1 Время удвоения клеток («.ч Начальные и конечные значения

pH Eh pH Eh

1 исходная 0,011 ± 0,001 64,2 ± 5,5 2,05 1,84 639 725 0,02 ± 0,001 34,7 ±2,2 2,14 1,65 697 743

адаптированная 0,052 ± 0,004 13,3 ±0,9 1,88 1,36 673 735 0,065 ± 0,003 10,7 ± 0,5 1,86 1,32 679 757

2 исходная 0,016 ± 0,002 43,3 ±4,2 2,08 1,82 639 735 0,026 ± 0,001 26,7 ± 0,6 2,12 1,67 701 734

адаптированная 0,064 ± 0,005 10,8 ± 0,08 1,94 1,41 697 737 0,073 ± 0,001 9,5 ±0,1 1,85 1,30 689 775

3 исходная 0,009 ± 0,0004 75,3 ± 2,8 1,98 1,84 710 760 0,025 ± 0,002 27,7 ± 2,0 1,94 1,82 712 800

адаптированная 0,028 ± 0,005 24,8 ± 5,3 1,96 1,86 622 690 0,037 ± 0,001 18,8 ±0,5 1,99 1,89 645 810

4 исходная 0,007 ± 0,0003 100,4 ± 5,2 1,96 1,80 724 766 0,010 ± 0,0005 67,3 ±7,2 1,94 1,90 727 830

адаптированная - - - - 0,023 ± 0,005 30,7 ±7,8 2,13 1,86 768 808

5 исходная 0,009 ± 0,0002 79,7 ± 4,4 1,90 1,90 658 777 0,018 ± 0,001 38,1 ± 1,7 1,95 1,78 732 801

адаптированная 0,021 ± 0,002 33,4 ± 2,7 1,99 1,80 660 779 0,030 ± 0,002 23,1 ± 1,5 1,92 1,77 700 799

2.2. Адаптация и особенности роста штамма в #7елло(о/егал5 Кг1т на пиритах 3

и 5

Из сульфобацилл наиболее близким к мезофильной бактерии А (еггаох^апэ по оптимальной температуре роста (Тор! = 40 °С) был термотолерантный 3 №егтоШегапв Кг1т Он и был выбран для сравнительных исследований динамики адаптации и особенностей роста на пирите 3 (р-типа) и 5 (п-р-типа), чтобы уменьшить роль температурного фактора в этих процессах

Продолжительность лаг периода и логарифмической фазы у штамма Кг1т при росте на среде с 2 г/л Яе2+ составила 2 и 8 часов соответственно Максимальная скорость окисления двухвалентного железа - 0,22 г/(л ч)

У исходного и адаптированного штамма Кг1т на пирите 3 лаг период длился 3, а логарифмическая фаза 10 и 13 часов соответственно Удельная скорость роста на пиритах ниже, а время генерации больше, чем на закисном железе, но при этом при росте на пирите 3 исходный и адаптированный штамм Кг1т накапливал большую биомассу, чем на среде с содержанием железа 2 г/л (табл 3, рис 6) Максимальная скорость окисления железа при росте на пирите 3 была значителоно ниже, чем на среде с закисным железом (рис 7) Прирост числа клеток у адаптированного штамма по сравнению с исходным увеличился лишь на 15 % (рис 6), максимальная скорость окисления пирита - на 26 % (рис 7) На том же пирите 3 у штаммов А (еггоох^апь, ТВ/-1 и ТРВк, те же характеристики увеличивались примерно на 50 % в обоих случаях (рис 3, 5) Таким образом, эффективность адаптации штамма Кг1т к пириту 3 была невысокой Однако адаптированная культура штамма Кг1т окисляла пирит 3 более активно (0,34 г/(л сут)), чем штамм ТВМ (0,091 г/(л сут)) и ТРВк (0,27 г/(л сут)) По-видимому, это связано и с более активными химическими процессами при температуре 40 °С, чем при 28 °С

Таблица 3 Параметры роста и окисления пиритов 3 и 5 у исходной и адаптированной культур штамма й ШегтоШегапэ Кг1т

Параметры роста и окисления пиритов

Удельная Время Начальные и конечные

Субстрат Культура скорость удвоения значения

роста (Мшах). ч"1 клеток (¿а), ч рН ЕЙ

Ре*+ 0,32 ±0,01 2,2 ±0,1 1,77 1,97 580 733

Пирит 3 Исходная 0,19 ±0,01 3,6 ± 0,2 1,87 1,80 651 788

Адаптированная 0,25 ± 0,03 2,8 ± 0,3 1,99 1,90 618 796

Пирит 5 Исходная 0,15 ±0,01 4,2 ±0,1 1,96 1,87 691 790

Третий пассаж 0,09 ±0,01 7,7 ±0,8 1,99 1,93 630 756

Не наблюдалось процесса адаптации к пириту 5 (табл 3) В третьем пассаже скорость роста и активность окисления пирита были ниже, чем в первом пассаже (рис 6, 7) Однако штамм Кг1т был способен расти на пирите 5 достаточно большое количество пассажей (более 10)

Штамм Кг1т рос и окислял пирит 3 активней, чем пирит 5 Таким образом, пирит 3 р-типа являлся более легко окисляемым субстратом для 5 Мет?о?о/егал5 Кг1т, чем пирит 5 п-р-типа Это согласуется с полученными данными для А felтooxldans на пиритах 3 и 5

Рис. 6. Средняя скорость роста штамма Э. №егтоМегапв Кг1' на закисном железе (I), исходной и адаптированной культур на пирите 3 (II) и в первом и третьем пассажах на пирите 5

(Ш).

Рис. 7. Максимальная скорость окисления закисного железа (I), пирита 3 (II) исходной и адаптированной культурами и пирита 5 (III) в первом и третьем пассажах штамма S. thermotolerans Kr1т

Рис. 8. Средняя скорость роста штамма F. acidiphilum YT на Рис. 9. Максимальная скорость окисления закисного железа закисном железе (I), на пирите 3 (II) и на пирите 5 (III). (I), пирита 3 (II), пирита 5 (III) штаммом F. acidiphilum YT.

2 3 Адаптация и особенности роста штамма Я ааЛрМит Ут на пиритах 3 и 5

Третьим микроорганизмом в данных исследованиях была выбрана мезофильная архея Я аскйрМит У (Тор, = 35 °С) [во^Ита е{ а1, 2000]

Адаптация штамма Р аснЯрЬ/Шт У к пиритам 3 и 5 не наблюдалась (табл 4, рис 8, 9) Скорость роста и активность окисления пиритов в первых пяти пассажах были одинаковыми на соответствующих пиритах Можно заключить, что у этого микроорганизма не существует механизмов регуляции подобных А (еггоох^апэ, когда при пересеве со среды с железом на среду с пиритами происходит активизация ферментных систем, связанных с окислением серных соединений, и увеличение ростовых и окислительных характеристик Штамм Ут рос и окислял пирит 5 хуже, чем пирит 3

Таким образом, штаммы трех видов изученных микроорганизмов, А (еггоохкЛапз, Б Мегто{о1егапз, Р ас/сЛрЛ//ит, лучше окисляли пирит 3 р-типа, чем пирит 5 п-р-типа

Таблица 4 Параметры роста штамма Р аа/ЯрЬи/ит Ут на среде с закисным железом или пиритами 3 и 5 в первых пяти пассажах

Субстрат Параметры роста и окисления пиритов

Удельная скорость роста (^та»), Ч"1 Время удвоения клеток (У, ч Начальные и конечные значения

pH Eh

Ре'* 0,0140 ±0,0010 50,6 ±4,4 1,68 2,05 614 758

Пирит 3 0,0100 ±0,001 67,8 ±4,8 1,71 1,64 697 711

Пирит 5 0,0075 ± 0,0005 92,4 ± 5,8 1,71 1,62 700 734

2 4 Влияние свойств пиритов на их окисление микроорганизмами

В результате проведенных исследований не было выявлено прямой связи между типом проводимости, микротвердостью и скоростью бактериально-химического окисления пиритов Трудно было судить о роли состава микропримесей в окисляемости пиритов во всех образцах он был различным Не прослеживалось прямой связи между содержанием железа и серы в пиритах и скоростью их окисления микроорганизмами У пирита 5 (п-р-типа) было наименьшее содержание серы и наибольшее - железа Далее в ряду убывания содержания железа шел пирит 1 (п-типа), за ним - три пирита р-типа (3, 4 и 2) Наиболее легко окисляемый штаммами А ¡еггоохкЛапз пирит 2 имел среднее содержание серы и наименьшее железа

Некоторые закономерности были отмечены при анализе скорости окисления пиритов, отличающихся по плотности и значениям коэффициента термоэлектродвижущей силы (Ктермоэдс) и сопротивления (1п И)

Наиболее легко окислялись пириты, относящиеся к разным типам проводимости, пирит 1 (п-типа) и пирит 2 (р-типа), имеющие средние величины плотности, 5,60 и 5,72 г/см3 соответственно, по сравнению с пиритами 3 и 5, обладающими более низкой плотностью (5,20 и 5,26 г/см3), или более высокой - пирит 4 (6,10 г/см3)

Пирит 3 являлся самым разнородным из всех 5 пиритов по значению коэффициента термоэлектродвижущей силы (Ктермоэдс) (рис 1) Максимум зерен приходился на область значений КтермоЭдс 400-500 мкВ К"1 и совпадал с максимумом пирита 4 Максимум зерен пирита 2 с дырочным типом проводимости приходился на область значений Ктермоэдс около 200 мкВК"1 Пирит 2 был самым легко окисляемым Можно предположить, что пириты с таким значением Ктерноэдс будут окисляться легче, чем с более высоким значением КтерМоэдс, как у пиритов 3 и 4 У пирита 1 максимум зерен приходился на область -100 мкВ К"1 Пирит с таким значением Ктермоэдс легко окислялся Максимум зерен

пирита 5 приходился на область значений Ктер„0эдс около 0 мкВК"1 с преобладанием зерен с отрицательными значениями Пирит с таким значением Ктериоэдс более сложно окислялся Таким образом, пириты с абсолютными значениями в области 200-100 мкВК"1 окислялись легче, чем 400-500 мкВК"1 или близкими к 0 Для подтверждения этой гипотезы было бы интересно исследовать пирит с Ктермоэдс в области около - 400 мкВ К"1 для сравнения с уже изученными пиритами

По величине 1п Я пириты р-типа можно выстроить в ряд пирит 4 (6,8 ± 1,1), пирит 3 (8,3 + 0,6), пирит 2 (8,8 ± 0,8), в котором логарифм сопротивления увеличивался, а проводимость падала Пирит 1 п-типа имел высокие значения 1п 14, как у пирита 2 р-типа, при самом широком диапазоне (8,8 ± 1,9) Пирит 5 п-р-типа обладал самым низким 1п И (5,6 ± 0,8) из всех пяти изученных пиритов Пириты 4 и 5 были наиболее сложно окисляемые, а 1 и 2 наиболее легко окислялись микроорганизмами Не зависимо от типа проводимости сопротивление образцов пиритов - свойство, которое связано со скоростью их окисления В ряду 1п К от 5,6 до 8,8 пириты с более высокими значениями окислялись легче, чем с более низкими У пиритов одного типа проводимости (р-типа в данной работе) ряды по степени окисляемости и значению 1п 14 совпадали

Для прогнозирования скорости окисления пиритов микроорганизмами должен быть использован комплексный подход с анализом всех свойств, наиболее важными из которых являются плотность, значения Ктврыоэдс и 1п И

3 Генотилические свойства ацидофильных хемолитотрофов, окисляющих пириты

31 Особенности структуры хромосомной ДНК штаммов ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, адаптированных к разным типам пиритов

У штамма ТР\Л1 изменения структуры хромосомной ДНК были обнаружены после 10 пассажей на пирите 1 (рис 10 А, дорожка 2) В образце ХЬаI рестрикции видна новая полоса, состоящая из фрагментов размером 202 т п н На пиритах 2 и 3 после 10 пассажей изменения структуры хромосомной ДНК у этого штамма обнаружены не были

У штамма ТЯВк после 10 пассажей на пиритах 1 и 2 были обнаружены одинаковые изменения структуры хромосомной ДНК (рис 10 Б, дорожки 7, 8) В образцах ХЬаI рестрикции видны по две новые полосы, состоящие из фрагментов размером 114 т п н и 96,5 тп н У штамма ТРВк после более чем 10 пассажей на пирите 3 были обнаружены изменения структуры хромосомной ДНК в области крупных фрагментов (рис 11 А, дорожка 1) В образце ХЬа\ рестрикции видна новая полоса, состоящие из фрагментов размером 177 тпн У штамма ТРВк после более чем 10 пассажей на пирите 4 были обнаружены изменения структуры хромосомной ДНК в области мелких фрагментов В образце ХЬаI рестрикции видна новая полоса, состоящие из фрагментов размером ~ 67 тпн (рис 11 Б, дорожки 3, 4) Изменений в структуре хромосомной ДНК после адаптации к пириту 5 у штамма А (епооыбапв ТРВк выявлено не было

Анализ хромосомной ДНК методом пульс-электрофореза после более чем 10 пассажей на пиритах 3 и 5 изменений в структуре хромосомной ДНК у штаммов Э МегтоЫегапз Кг1т (при расщеплении эндонуклеазой рестрикиции /\foil) и Р аа&рЫит Ут (при расщеплении эндонуклеазой рестриции ХЛо1) не выявил

Таким образом, разные культуры микроорганизмов (грамотрицательные бактерии А ferгooxldans, грамположительные бактерии Э ШгтоШегап5, ахеи Р асМрМит) ведут себя по-разному при переключении их метаболизма на окисление нового энергетического субстрата Из четырех изученных культур наиболее лабильным геномом обладал штамм А Iеггоох^апэ ТРВк Реакция на один субстрат - пирит была различна в одних случаях мы наблюдали изменения структуры хромосомной ДНК, в других нет Это, вероятно, связано с разнообразием природных пиритов, с особенностями их физических, химических и электрофизических свойств

'^ШШ щшш*1' '

«?*» й» *»т т* '

320 230 202 179 165 147 129

147 129

Рис. 10. Образцы ХЬаI рестрикции хромосомной ДНК штаммов А. 1еггоох\бапз. Условия пульс-электрофореза: А напряжение 12 В/см, температура 13 °С, время пульса 25 с, продолжительность 44 ч; Б напряжение 13 В/см, температура 13 °С, время пульса 10 с,

продолжительность 68 ч. Обозначения, штамм ТР\/-1 на среде с Яе2+ (1), с пиритом 1 (2), с пиритом 2 (3); штамм ВКМ В-458 на среде с Ре2+ (4, 5); штамм ТРВк на среде с (6), с пиритом 1 (7), с пиритом 2 (8). Стрелками указаны новые фрагменты ДНК. Сбоку панелей указаны размеры фрагментов ДНК в т.п.н.

1 2 3 1 2 3 4 5 6

Рис. 11. Образцы ХЬа/-рестрикции хромосомной ДНК штамма А. ferrooxidans ТРВк, (А) выращенного на среде с пиритом 3 (1), на среде с Ре2+ (2), и штамма ВКМ В^458, выращенного на среде с Ре2+(3). Условия ПФ: напряжение 12 В/см, время пульса 25 с, температура 15 °С, продолжительность 44 ч; (Б) выращенного на среде с Ре2+ (1, 2), выращенного на среде с пиритом 4 (3, 4), и штамма ВКМ В-458, выращенного на среде с Ре (5, 6). Условия ПФ: напряжение 13 В/см, время пульса 10 с, температура 15 °С, продолжительность 64 ч. Стрелками указаны новые фрагменты ДНК. Сбоку панелей указаны размеры фрагментов ДНК в т.п.н.

3 2 Ппазмидные профили штаммов ацидофильных хемопитотрофных микроорганизмов, адаптированных к разным типам пиритов

Оба штамма А /епоох^апз содержали плазмиды у штамма ТР\/-1 на различных субстратах выявлялось от двух до шести плазмид, а у штамма ТРВк - всегда две плазмиды [Агеева и др , 2003] Плазмиды у штаммов Р асМрМит Ут и Э ШгтоЫегапз Кг1т не изучались ранее При росте на среде с закисным железом плазмиды у штаммов Ут и Кг1т нами не были обнаружены

Изменений в плазмидном составе у штамма ТРВк, адаптированного к пиритам 1, 2, 3, 4 и 5 выявлено не было, сохранялись две плазмиды, обнаруженные при росте на железе При адаптации к пиритам 1, 2 и 3 были отмечены изменения плазмидного профиля только у штамма ТП/-1 (рис 12 А, дорожки 3, 4, Б, дорожка 3) При росте на среде с Ре2+ у штамма ТРУИ ранее выделяли две плазмиды [Кондратьева и др , 2002 а, Агеева и др , 2003] После года культивирования штамма ТР^-1 на среде с двухвалентным железом были выявлены три плазмиды, две из которых соответствовали ранее обнаруженным, третья была большей по размеру (рис 12 Б, дорожка 2) У штамма ТРУ-1, адаптированного к пириту 1 при плотности пульпы 1%, после 10 пассажей также было обнаружено две плазмиды, одна из которых соответствовала плазмиде, выявленной при росте на железе, а другая - была более крупного размера (рис 12 А, дорожка 3) У штамма ТР\/-1, адаптированного к пириту 2, после 10 пассажей было обнаружено три плазмиды, одна соответствовала плазмиде, выявленной при росте на железе и пирите 1, две другие были отличны по размеру (рис 12 А, дорожка 4) После 10 пассажей штамма ТВ/-1 на пирите 3 было выявлено 4 плазмиды, три из которых были схожи с плазмидами, выявляемыми при росте на закисном железе, одна - отличная (рис 12 Б, дорожка 3) В данном случае наблюдалось либо изменение копийности разных плазмид, либо изменение в популяции содержания клонов с разным числом плазмид в клетках при адаптации к различным энергетическим субстратам При росте на пирите 4 штамм погибал на третьем пассаже При росте на пирите 5 штамм ТПМ накапливал биомассу не достаточную для выделения и анализа плазмидной ДНК

При уплотнении пульпы до 7% на пирите 1 и до 10% на пирите 2 у штамма А Тетюхк1ап5 ТВМ было отмечено большее число плазмид, чем при сравнительно низкой плотности пульпы 1% Причем, на пирите 1 было обнаружено шесть плазмид (рис 12 В, дорожка 3), а на пирите 2-4 (рис 12 В, дорожка 4)

После 10 пассажей на пиритах 3 и 5 плазмид у штаммов Р ас/с//рЛ//ит УТ и Б МегтоШегапв Кг1т не обнаружено

Спонтанное изменение числа выявляемых данным методом плазмид при поддержании штамма ТВ/-1 на среде с двухвалентным железом трудно объяснить Фенотип плазмид А ferrooxldans до сих пор не определен, и их считают криптическими Тем не менее, в клетках большинства штаммов А (еггоох^апэ они сохраняются несмотря на дополнительные затраты энергии, требующиеся для их поддержания

При адаптации к новому источнику энергии у штаммов А ¡еггоохкЗапз наблюдались либо изменения в структуре хромосомной ДНК, либо в плазмидных профилях У штамма ТРВк с большим числом копий ^-элементов и постоянным плазмидным составом при смене энергетического субстрата наблюдались изменения в структуре хромосомной ДНК, а у штамма ТР\/-1 с относительно стабильным по структуре хромомсомной ДНК геномом и низким содержанием 1в-элементов наблюдались изменения в составе плазмид при смене источника энергии Функции плазмцц и 13-элементов у А ¡еггоохкЗапз не ясны Предположительно, и те, и другие участвуют в регуляции процессов метаболизма

Рис. 12. Плазмидные профили штаммов A. ferrooxidans TFV-1, выращенных на среде с Fe2+ (2) или адаптированных к пириту 1 (А, 3; В, 3), пириту 2 (А, 4; В, 4) и пириту 3 (Б, 3) при плотности пульпы 1% (А, Б) и 7 % (В). ДНК фага лямбда, расщеплённая эндонуклеазой рестрикции HindU\ (1). Сбоку панелей указаны размеры фрагментов ДНК в т.п.н.

4. Электрофизические характеристики пиритов при их химическом и бактериально-химическом окислении

Структура минерала (отклонение от стехиометрического состава, наличие электроактивных примесей рассеянных элементов) оказывает большое влияние на кинетику окисления пирита при химическом и бактериально-химическом процессах. Оценить эти параметры можно, измерив электрофизические свойства образцов: тип проводимости, величину сопротивления и Ктермоэдс-

При химическом окислении пиритов 1 и 2 наблюдалось расширение диапазона значений КтерМоэдс в сторону увеличения абсолютных значений (рис. 13-А1,-Б1,-А2, -Б 2). У пирита 1 с п-типом проводимости это может быть связано с относительным повышением содержания фракции с большей микротвердостью и большим содержанием микропримесных элементов (кобальта), а у пирита 2 с р-типом проводимости - с выходом микропримесей никеля и кобальта.

При бактериально-химическом окислении пирита 1 штаммом A. ferrooxidans TFBk значения КТеРмоэдс кристаллов изменились незначительно и оказались в интервале от 0 до -150 мкВ-К"1 (-79 ± 50 мкВ-К"1) (рис. 13 - В 1). Это может свидетельствовать о том, что при бактериально-химическом окислении пирита 1 железо и сера извлекались практически пропорционально. Однако зерен в интервале от - 200 до -150 мкВ-К"1 не наблюдалось, они все окислились. Штамм TFBk предпочтительно окислял зерна пирита 1 с более низкими значениями Ктермоэдс- После бактериально-химического окисления пирита 2 штаммом A. ferrooxidans TFBk диапазон значений Ктермоэдс сместился в область 50-200 мкВ-К"1 (119 ± 24 мкВ-К"1) (рис. 13 - В 2). Это может быть связано с более активным извлечением из пирита 2 серы, чем железа, либо, если процесс идет активно, это может быть связано с выходом мышьяка. Величина In R при химическом и бактериально-химическом окислении пиритов 1 и 2 находилась в тех же границах, что и у исходных образцов.

Пириты 3-5 являлись более сложноокисляемыми Изменения, происходящие в процессе окисления во всех образцах, были менее выражены Поэтому полученные данные были проанализированы с помощью программы Microsoft Exel Были построены гистограммы распределения значений Ктермоэдс и представлены в виде графиков (рис 14, 15)

При химическом окислении пирита 3 при всех трех температурах не наблюдалось существенных изменений значений КтерИоэдс (рис 14 - А 3, - Б 3) После бактериально-химического окисления штаммами A ferrooxidans TFBk и S thermototerans Кг1т (данные не приводятся) значения Ктермоэдс находились в том же интервале, что и у исходного образца, однако соотношения зерен в образце изменились - процент зерен с более высоким значением Ктермоэдс увеличился (рис 14 - А 3) Это может быть связано с двумя причинами 1 - более активное окисление железа, чем серы, в пирите и выход кобальта, 2 - бактерии предпочитают окислять зерна с более низким значением KrepM03flc Вероятней вторая причина, так как мы не наблюдали смещения диапазона значений КтермоЭдс, как в случае пирита 2 После бактериально-химического окисления пирита 3 штаммом F acidiphilum YT значения Ктермоэдс находились в том же интервале, однако мы наблюдали смещение максимума значений Ктермоэдс в сторону понижения (рис 14- Б 3), в отличие от образцов после бактериально-химического окисления штаммами A ferrooxidans TFBk и S thermototerans Kr1T F acidiphilum YT - архея, не имеющая клеточной стенки Клетки F acidiphilum окружены только цитоплазматической мембраной, в состав которой входят уникальные липиды [Batrakov et al, 2002] Возможно, особенности окисления пирита 3 связаны с поверхностными структурами клеток и их зарядом

В случае пирита 4 изменения образцов после химического и бактериально-химического окисления штаммом A ferrooxidans TFBk были одинаковы - значения Ктермоэдс зерен пирита остались в тех же пределах, что и у исходного образца, однако количество зерен с более высоким значением Ктермоэдс увеличилось (рис 15) Пирит 4 был самым трудно окисляемым для A ferrooxidans Так как и изменения в обоих случаях были одинаковы, и оба образца отличны от исходного, можно предположить, что такой эффект был связан с выходом примесных металлов никеля и кобальта в процессе окисления Это привело к увеличению количества зерен в образцах с более высоким

КтермоЭДС

При химическом окислении пирита 5 во всех температурных режимах и бактериально-химическом окислении штаммом F acidiphilum YT при температуре 35 °С мы не наблюдали заметных изменений в численном распределении зерен с разными значениями Ктермоэдс (рис 14 - А 5, - Б 5) Вероятно, это связано с низкой активностью окисления пирита 5 При бактериально-химическом окислении пирита 5 A ferrooxidans TFBk и S thermototerans Кг1т (данные не приводятся) уменьшалось количество зерен с значениями Ктерисэдс близкими к нулю (рис 14 - А 5), увеличивалось содержание зерен с положительными значениями Ктермоэдс, а количество зерен со значениями Ктермоэдс в районе -100 мкВ-К1 осталось на уровне исходного образца Вероятно, оба микроорганизма предпочитали окислять фракцию с значениями Ктермоэдсблизкими к нулю и, возможно, они предпочтительней окисляли железную часть пирита, чем серную

А 1

Б 1

В 1

ш 2

200

100 -

-100 --200

-300

1п К (К, Ом)

200

-600

1п I* (14, Ом)

-300

1п К (И, Ом)

А 2

Б 2

В 2

300

6 8 10 12 1п Ом)

Ш х 2

200

6 8 10 12 1п Ом)

ьг ¡в

в 8 10 12 1п Г* (Р., Ом)

Рис. 13. Соотношение величины Ктермоэдс и 1п И в образцах пиритов 1 и 2: А - исходных, Б - после химического окисления, В - после бактериально-химического окисления штаммом А. ferrooxidans ТРВк.

Рис 14 Распределение значения Ктермоэдс зерен пиритов 3 и 5, выраженное в процентах, исходных пиритов (1), после химического окисления (2) и бактериально-химического окисления штаммами (3) А - А ГеггоохкЗапв ТРВк, Б - Я ааФрМит при температурах А - 28 °С и Б - 35 °С

О 200 400 600 800

КтермоЭДС> МКВ К"1

Рис 15. Распределение значения Ктермоэдс зерен пирита 4, выраженное в процентах, исходного пирита (1), после химического окисления (2) и бактериально-химического окисления штаммом А ferroQXldans ТРВк (3), 28 °С

Сопротивление (1п 14) при химическом и бактериально-химическом окислении штаммом А 1егтох!бап5 ТРВк пирита 3 практически не изменялось (8,2 ± 0,8) (1 = 28 °С) При повышении температуры наблюдалось увеличение значений 1п И при химическом окислении - 8,5 ± 0,9, при бактериально-химическом штаммом Р ас/д1р1и1ит УТ • 8,6 ± 0,9 (1 = 35 °С), при химическом окислении - 8,8 ± 0,8, при бактериально-химическом окислении штаммом в МегтойЯегапэ Кг1Т - 8,9 ± 0,8 (1 = 40 °С) Причем, эти изменения были выражены сильнее, когда происходило более активное бактериально-химическое окисление Возможно, это связано с увеличением растворимости минералов при более высокой температуре, что приводило к выходу примесей и повышению стехиометрии образцов (чистый пирит- изолятор) При химическом и бактериально-химическом окислении штаммом А IегтоохШапз ТРВк пирита 41п Я увеличивался по сравнению с исходным (6,8 ± 1,1) соответственно до (7,2 ± 0,5) и (7,3 ± 0,7) Это также можно объяснить растворением примесей и повышением стехиометрии пирита 4

При химическом окислении пирита 5 при температуре 28 °С значения 1п К практически не изменялись - 5,7 ± 0,8, а при бактериально-химическом увеличивались до 6,3 ±1,1 При повышении температуры экспериментов 1п Я увеличивался, как и в случае с пиритом 3 при химическом окислении - 5,9 ± 0,9, при бактериально-химическом штаммом Р ас1б1р1и1ит Ут - 6,1 ± 1,0 (1 = 35 °С), при химическом окислении - 6,0 ± 1, при бактериально-химическом окислении штаммом Э /ИегтоМегапэ Кг1т - 6,6 ± 1,1 (1 = 40 °С)

При бактериально-химическом окислении пиритов 1,2, 3 и 5 штаммом А (еггоохШапэ ТРУ-1 характер изменения образцов пирита был аналогичен изменениям образцов при окислении штаммом ТРВк (данные не приводятся)

Таким образом, было показано, что в процессе химического и бактериально-химического окисления электрофизические свойства пиритов могут изменяться В случае химического окисления наблюдалось либо расширение диапазона значений Ктермоэдс - пирит 1 и 2 (которые были самыми легкоокиспяемыми), либо диапазон не изменялся - пирит 3 и 5 (низкая активность окисления химическим путем) В пирите 4 (самом спожноокиспяемом пирите) изменялось соотношение зерен с разными значениями Ктермоэдс в образце увеличивалось количество зерен с более высокими значениями Такие же изменения наблюдались и при бактериально-химическом окислении пирита 4, которые, вероятно, были связаны с выходом примесей никеля и кобальта Изменения при химическом и бактериально-химическом окислении других пиритов были отличны Из пяти изученных пиритов только при химическом окислении пирита 4 при температуре 28 °С было показано изменение 1п Р в сторону увеличения, что также подтверждает предположение о выходе примесей и повышении стехиометрии образца При повышении температуры проведения экспериментов 1п К возрастал, причем при более активном бактериально-химическом окислении 1п Я возрастал в большей степени, чем при химическом При бактериально-химическом окислении А ¡еггоох^апэ ТРВк (1 = 28 °С) наблюдалось повышение 1п К только при окислении пирита 4 и 5

При бактериально-химическом окислении пиритов происходило пропорциональное окисление А Ьеггоох^апэ серы и железа в пирите 1, более активное окисление А !еггоох!дапз серы в пирите 2, более активное окисление железа А 1еггоохк}ап$ и Э 1Ьегто1о!егап5 в пиритах 3 и 5 Показано предпочтительное окисление определенных фракций образцов пиритов с более низкими значениями Ктермоэдс пирита 1 штаммами А (еггоохн^апэ, с более высокими значениями КтерыоЭдС пирита 3 штаммом Р аскйр/иЛ/т и средней фракции из образца пирита 5 штаммами А 1ет>ох1с1ап5 и 5 йеппо^о/егалв При сравнительной оценке бактериально-химического окисления пиритов тремя видами микроорганизмов направленность изменений значений Ктер1ЖзЭдс была одинаковой в случае бактерий А (еггоох/бапв и Э МегтоШегапь и отлична в случае архей Р аскЛрМня

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение микробного окисления пиритов представляет не только научный интерес, но имеет и большую практическую значимость, так как этот сульфидный минерал является одним из основных, входящих в состав руд, содержащих благородные и цветные металлы

В работе был впервые применен комплексный подход к изучению взаимодействия ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, относящихся к отдаленным филогенетическим группам, с их энергетическим субстратом - природными пиритами Показано разнообразие свойств пиритов и уникальность каждого образца Изучен процесс адаптации штаммов А Геггоох^апэ, Э Пегто^/егапз и Р асккрЬМит к этим пиритам Они отличались по способности к адаптации к одним и тем же образцам пиритов, по скорости роста и окисления разных пиритов Исследованы генотипические характеристики у адаптированных культур микроорганизмов Из трех видов изученных микроорганизмов только А fenxюxldaпs при смене энергетического субстрата с закисного железа на различные типы пиритов обнаружил лабильность генома, причем у штамма ТРВк наблюдались изменения только в структуре хромосомной ДНК, а у штамма ТВ/-1, в основном, - в плазмидных профилях Полученные результаты говорят о необходимости изучения шгаммового разнообразия внутри одного вида микроорганизмов и тщательного подбора штаммов для научных исследований и технологических процессов Показаны неоднозначные изменения электрофизических свойств самих пиритов в процессе их химического и бактериально-химического окисления разными микроорганизмами пропорциональное окисление в пирите железа и серы, или предпочтительное окисление железа или серы, или фракций образцов пиритов с определенным значением коэффициента термоэлектродвижущей силы (Ктермоэдс), или выщелачивание примесных элементов При сравнительной оценке бактериально-химического окисления пиритов тремя видами микроорганизмов направленность изменений значений Ктер„оэдс была одинаковой в случае бактерий А !еггоох!бап8 и Э ИюгглоМегапэ и отличной в случае архей Р ас/йрЫит Сопротивление (1п И) при химическом и бактериально-химическом окислении пиритов 1 и 2 находилось в тех же границах, что и у исходных образцов При повышении температуры, при которой проводились эксперименты, при окислении пиритов 3 и 5 наблюдалось повышение значений 1п К Эти изменения были выражены сильнее при более активном бактериально-химическом окислении, чем химическом

На основе полученных данных можно заключить, что для прогнозирования скорости окисления пиритов микроорганизмами необходимо знание их свойств, наиболее важными из которых являются плотность, значения КтермоЭдс и 1п Я

выводы

1 В работе было использовано пять образцов пиритов разного происхождения, которые различались по плотности, микротвердости, содержанию серы и железа, наличию и составу микропримесей, типу проводимости, величине Ктерыоэдс, сопротивлению

2. Ацидофильные хемолитотрофные микроорганизмы, принадлежащие к филогенетически отдаленным группам, А ¡егтохк1апз, Э IЬегтоЫегапз, Р аскйрМит, отличались по способности к адаптации к одним и тем же типам пиритов Не отмечена адаптация к пиритам 3 (с дырочным типом проводимости) и 5 (со смешанным типом проводимости) у археи Р асМрЫит Наибольшей способностью к адаптации обладал А (еггоохкЗапэ

3 Микроорганизмы различались по скорости роста и окисления пиритов Максимальную скорость окисления пирита 3 показал штамм Б íftem^oíoteraлs КМ , а минимальную -Р аскйрЫит Ут Из штаммов А Iёггоох^апз, ТВМ и ТРВк, наибольшей скоростью роста на разных пиритах обладал штамм ТРВк, выделенный из более сложного по составу сульфидных минералов золотомышьякового концентрата

4 Для прогнозирования скорости окисления пиритов микроорганизмами необходим комплексный анализ их физических, химических и электрофизических свойств, важнейшими из которых являются плотность, значение КтвРмоэдс и сопротивление

5 В процессе адаптации к разным типам пиритов отмечены изменения в структуре хромосомной ДНК у штамма А {епгоохкЗапз ТРВк при постоянном плазмидном составе и в плазмидных профилях - у штамма ТВ/-1 при относительной стабильности структуры хромосомной ДНК У 3 01егтоШегапз Кг1т и Г аскАрЫит УТ не выявлено изменений в структуре хромосомной ДНК при адаптации к пиритам 3 и 5 У этих видов микроорганизмов при росте на закисном железе, пиритах 3 и 5 в клетках не обнаружено плазмид

6 В процессе бактериально-химического окисления разных типов пиритов тремя видами микроорганизмов отмечены неоднозначные изменения их электрофизических свойств При сравнительной оценке бактериально-химического окисления пиритов тремя видами микроорганизмов направленность изменений значений Ктер»,оэдс была одинаковой в случае бактерий А /ёгоохкйлз и 5 ФегтоЫегапз и отличной в случае архей Р аасЬрЫит

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Экспериментальные статьи

1 Kondrat'eva Т F , Tupikina О V, Ageeva S N , Samorukova V D , Karavaiko G I Variability of chemohthotrophic microorganisms as a basis for the regulation of their activity under extreme conditions // Biotechnology and the environment including biogeotechnology / Eds GE Zaikovetal New York Nova Science Publishers, Inc 2004 P 133-145

2 Тупикина О В , Кондратьева Т Ф , Саморукова В Д , Рассулов В А , Каравайко Г И Зависимость фенотипических характеристик штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans от физических, химических и электрофизических свойств пиритов И Микробиология 2005 Т 74 №5 С 596-603

3 Тупикина О В, Кондратьева Т Ф, Каравайко Г И Зависимость генотипических характеристик штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans от физических, химических и электрофизических свойств пиритов // Микробиология 2005 Т 74 № 5 С 604-608

4 Tupikina О V, Kondrat'eva T F , Samorukova V D , Rassulov V A , Karavaiko G I Pheno- and genotypic characteristics of Acidithiobacillus ferrooxidans as effected by physicochemica! properties of pyrites II Hydrometallurgy 2006 V 83 P 255-262

5 Тупикина О В, Саморукова В Д, Кондратьева Т Ф Особенности роста и окисления природных пиритов представителями ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов // Микробиология (в печати)

6 Тупикина О В , Рассулов В А, Кондратьева Т Ф Особенности окисления пиритов разными микроорганизмами II Микробиология (в печати)

Тезисы конференций

1 Кондратьева Т Ф , Тупикина О В , Агеева С Н , Саморукова В Д, Каравайко Г И Изменчивость хемолитотрофных микроорганизмов как основа регуляции их жизнедеятельности в экстремальных условиях // Тезисы 2-го Московского Международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва 2003 Часть 2 С 255

2 Тупикина О В, Кондратьева Т Ф, Каравайко Г И Влияние физико-химических свойств пиритов на фенотипические и генотипические характеристики штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans II Материалы международного конгресса «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения» Апатиты 2004 Часть 2 С 32-34

3 Tupikina О V, Kondrat'eva Т F , Samorukova V D , Rassulov V А, Karavaiko G I Pheno- and genotypic characteristics of Acidithiobacillus ferrooxidans as effected by physicochemical properties of pyntes // Abstracts of the 16lh internat'onal biohydrometallurgy symposium / Eds STL Harnson et al 2005 P 287

4 Тупикина О В , Кондратьева Т Ф , Саморукова В Д, Рассулов В А , Каравайко Г И Влияние свойств пиритов на характеристики штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans II Материалы VII международной конференции «Новые идеи в науках о земле» Москва 2005 Т 1 С 303

5 Тупикина О В , Кондратьева Т Ф Зависимость фенотипических и генотипических характеристик штаммов Acidithiobacillus ferrooxidans от физических, химических и электрофизических свойств пиритов И Тезисы всероссийской молодежной школы конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» Москва 2005 С 110111

6 Кондратьева Т Ф , Пивоварова Т А , Цаплина И А , Богданова Т И , Тупикина О В, Меламуд В С , Каравайко Г И Биоразнообразие ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, окисляющих соединения серы и железа // Тезисы 4-го Московского Международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва 2007 Часть 2 С 320-321

7 Tupikina О, Kondrat'eva Т The study of adaptation of Sulfobacillus thermotolerans strain Kr1 to two types of natural pyrites II Abstracts of the young scientist' and students' international scientific conference «Modern problems of Microbiology and Biotechnology» Odessa 2007 P 52

8 Тупикина О В, Кондратьева Т Ф Особенности роста и окисления двух природных пиритов ацидофильными хемолитотрофными микроорганизмами // Тезисы 3-ей Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» Москва 2007 С 117

Подписано в печать 14 04 2008 Печать трафаретная

Заказ № 266 Тираж 100 зкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тупикина, Ольга Владимировна

Введение 5 Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Разнообразие ацидофильных хемолитотрофов

1.2. Характеристика А. /еггоох1С^ат

1.2.1. Таксономическое положение А.еггоох'к1ат

1.2.2. Морфология и структурная организация клеток

А ,/еггоохгс1ат

1.2.3. Физиология и метаболизм А. /еггоох1с1ат

1.2.4. Генетическая система А./еггоох1с1ап

1.2.4.1. Мобильные нуклеотидные повторяющиеся последовательности в геноме А. /еггоох1с1а№

1.2.4.2. Плазмиды в геноме А. /еггоох1с1ап

1.2.5. Штаммовый полиморфизм А./еггоох1с1ат

1.3. Характеристика 5". ЖегтоШегат

1.4. Характеристика аЫсИрИИит

1.5. Механизмы бактериального окисления Ре2+, Б0, сульфидных минералов

1.5.1. Участие экзометаболитов микроорганизмов в процессах окисления Ре2+, 8°/82", сульфидных минералов

1.5.2. Механизм окисления железа

1.5.3. Окисление элементной серы и ее восстановленных соединений

1.5.4. Окисление пирита и других сульфидных минералов

1.5.4.1. Структура природных пиритов, их свойства

1.5.4.2. Механизм окисления пирита и других сульфидных минералов

1.6. Практическое значение ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фенотипические и генотипические характеристики ацидофильных хемолитотрофов, окисляющих разные типы пиритов"

Актуальность работы. Ацидофильные хемолитотрофные микроорганизмы получают энергию, окисляя такие неорганические субстраты, как закисное железо, элементная сера, ее восстановленные соединения и сульфидные минералы. Пирит - самый распространенный сульфидный минерал на Земле [Андреев, 1992]. В литературе описаны физические, химические, кристаллохимические и электрофизические особенности пиритов. Все перечисленные характеристики природных пиритов могут сильно варьировать. Однако практически не изучено влияние свойств пиритов на способность микроорганизмов использовать их в качестве источников энергии. Большая часть исследований окисления пиритов микроорганизмами проводилась без анализа их свойств. Например, в работе Грудева отмечено только, что один и тот же штамм АЫсИШоЬасШш /еггоохгс1ат может с разной активностью окислять различные пириты [Грудев, 1985].

Первые попытки изучить различия в характере бактериально-химического окисления А. /еггоох1с1ат пиритов с электронным (п) и дырочным (р) типами проводимости были сделаны Яхонтовой и Каравайко в 1976 году [Яхонтова и др., 1976]. Была показана связь динамики и интенсивности выщелачивания железа из пирита с типом его проводимости. Однако дальнейшего развития эта работа не получила. Только в 1994 году Каравайко с соавторами вернулись к этим исследованиям [КагауаНсо е! а1., 1994]. Было изучено окисление 6 образцов пиритов уже двумя видами микроорганизмов - А. /еггоох1(1ат и 8и1/оЬасШи8 1кегто8и1А<Лоох1<Лат. Показаны различия как в характере г окисления разных типов пиритов микроорганизмами, так и в окислении одного образца разными микроорганизмами.

В начале 90-ых годов отечественными авторами для исследования штаммового разнообразия ацидофильных хемолитотрофов был применен анализ хромосомной ДНК, расщепленной эндонуклеазами рестрикции, методом пульс-электрофореза (ПФ) [Кондратьева и Каравайко, 1992]. Всесторонне изучен штаммовый полиморфизм вида А. /еггоох1с1а№-. показано разнообразие фенотипических признаков, структуры хромосомной ДНК, разнообразие плазмидных профилей, содержания в геноме 18 элементов. Отмечены изменения в структуре хромосомной ДНК, плазмидных профилях и локализации 18 элементов при адаптации штаммов к новым энергетическим субстратам [Агеева и др., 2001, 2003; Кондратьева и др., 1996 а, б; Кондратьева и др., 2002 а, б; КагауаПсо еИ а1., 2003; Копёга^еуа й а1., 2005]. Показано, что адаптация А^еггоох1(1ат может сопровождаться изменениями в локализации 18 элементов и, возможно, интеграцией плазмидной ДНК в хромосому. Адаптация штаммов А ^еггоох1с1ат к новым энергетическим субстратам зависела от предыстории их существования: от условий среды и, в первую очередь, от характеристик основного источника энергии в биотопе. Штаммовое разнообразие и адаптивные характеристики видов 5". МегтоШегат и ЕеггорШБта аЫШркйнт мало изучены.

При адаптации штамма А. /еггоох1с1ат ТБВк к пиритам, выделенным из руд разных месторождений, иногда наблюдали изменения в ХЬа\ рестриктах хромосомной ДНК. Полученные результаты позволили предположить, что на генотипическую изменчивость штаммов А. ferrooxidans влияет не только состав энергетического субстрата, но и физические, химические и электрофизические особенности минерала.

Внимание к изучению кинетик и механизмов микробиологического окисления сульфидных минералов, в основном пирита, объясняется также экономической важностью биогидрометаллургических технологий выщелачивания цветных металлов и извлечения благородных металлов из сульфидных руд и концентратов и вредом, наносимым окружающей среде при окислении микроорганизмами пиритных руд с образованием кислых дренажных вод, содержащих ионы тяжелых металлов. Долгое время интерес ученых был направлен, в основном, на изучение мезофильных представителей ацидофильных хемолитотрофов: А. /еггоох1с1ат, А. Шоох1йап8, ЬерЬоБртИит /еггоох1с1ат. Однако задачи интенсификации процесса бактериальнохимического окисления сульфидных субстратов стимулируют изучение умеренно термофильных и термофильных сообществ, выделение и описание новых видов ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов.

Цели и задачи исследования. Целыо настоящей работы являлось изучение фенотипических и генотипических характеристик ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов при окислении разных типов пиритов.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Изучение физических, химических и электрофизических свойств пяти, образцов природных пиритов из различных месторождений.

2. Адаптация трех видов ацидофильных хемолитотрофов, принадлежащих к разным филогенетическим группам' микроорганизмов (А. /еггоохгсХат, 8лкегтоЫегап8, ¥.ас1сИрЫ1ит), к различным типам пиритов и изучение параметров их роста.

3. Изучение генотипической изменчивости (структуры хромосомной ДНК и плазмидных профилей) этих микроорганизмов при росте на пиритах, различающихся по свойствам.

4. Исследование электрофизических свойств пиритов до и после химического или бактериально-химического окисления.

Научная новизна. Впервые использован комплексный подход для изучения окисления природных пиритов микроорганизмами. Были изучены свойства пиритов; адаптация различных представителей группы ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов к этим пиритам; изменение фенотипических и генотипических свойств микроорганизмов, адаптированных к различным типам пиритов; изменение электрофизических свойств пиритов в процессе их химического и бактериально-химического окисления. Ацидофильные хемолитотрофные микроорганизмы, относящиеся к филогенетически отдаленным группам, А. /еггоохгс^апБ, 5". //гегтоШегапз, Г.асгсИрИИит, различались способностью адаптации к пиритам, а также по скорости роста и окисления пиритов. В процессе адаптации штамма А./еггоох1<Запз ТБВк к пиритам отмечены изменения в структуре хромосомной ДНК, а штамма ТТАМ - в плазмидных профилях. Впервые были изучены электрофизические свойства пиритов, такие как Ктермоэдс и сопротивление, при химическом и бактериально-химическом окислении и показаны различия в их изменении при окислении разными видами микроорганизмов: у А. /еггоох{Лап5 и & ЖегтоШегат эти изменения были схожи, а у Г. ас'кИркПит - отличны. Установлена связь между плотностью, КтермоЭдс, значением 1п Я пиритов и способностью микроорганизмов окислять их. Предложены параметры прогнозирования возможности и скорости окисления разных типов пиритов микроорганизмами.

Практическая значимость. Изучение процессов окисления разных типов пиритов микроорганизмами важно с позиций экологии и экономики: в разработке мер по предотвращению загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами и закислению почв и водоемов в зоне добычи сульфидных руд, в совершенствовании биогидрометаллургических технологий получения ценных металлов. Очень важным является знание минералогического состава субстрата, выбор режимов рН, температуры, наличия органических веществ в воде, содержания минеральных солей, активности аэрации и массообмена. Эти параметры определяются микроорганизмами, доминирующими в процессе. Как правило, это ассоциация аборигенных микроорганизмов, обладающих высоким регуляторным потенциалом в условиях технологических процессов с перманентным изменением характеристик субстрата. Полученные данные могут быть использованы при разработке стратегий управления бактериальнохимическими процессами извлечения металлов, выработке практических рекомендаций по их интенсификации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на II-ом и IV-ом Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003, 2007), Международном конгрессе «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения» (Апатиты, 2004), VII Международной конференции «Новые идеи в науках о земле», (Москва, 2005), 16-ом Международном симпозиуме по биогидрометаллургии (Кейптаун, 2005); 1-ой Всероссийской молодежной школе-конференции и Ш-ей Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005, 2007) и международной научной конференции молодых ученых и студентов «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, 2007).

Публикации. По материалам диссертации, включая тезисы, опубликовано двенадцать работ; две статьи сданы в печать.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тупикина, Ольга Владимировна

выводы

1. В работе было использовано пять образцов пиритов разного происхождения, которые различались по плотности, микротвердости, содержанию серы и железа, наличию и составу микропримесей, типу проводимости, величине Ктермоэдс> сопротивлению.

2. Ацидофильные хемолитотрофные микроорганизмы, принадлежащие к филогенетически отдаленным группам, А. /еггоохгсЬж, 5. //гегто1о1егат, Р.аЫсИркИит, отличались по способности к адаптации к одним и тем же типам пиритов. Не отмечена адаптация к пиритам 3 (с дырочным типом проводимости) и 5 (со смешанным типом проводимости) у археи Т7. ас1<ИрЫ1ит. Наибольшей способностью к адаптации обладал А. /еггоохгс(ат.

3. Микроорганизмы различались по скорости роста и окисления пиритов. т

Максимальную скорость окисления пирита 3 показал штамм 51IНегтоЫегат Кг1 , а

Т1 минимальную - Г.асгсИркИит У . Из штаммов А. /еггоох1с1ат, ТРУ-1 и ТРВк, наибольшей скоростью роста на разных пиритах обладал штамм ТРВк, выделенный из более сложного по составу сульфидных минералов золотом!л т ья кового концентрата.

4. Для прогнозирования скорости окисления пиритов микроорганизмами необходим комплексный анализ их физических, химических и электрофизических свойств, важнейшими из которых являются плотность, значение Кхермоэдс и сопротивление.

5. В процессе адаптации к разным типам пиритов отмечены изменения в структуре хромосомной ДНК у штамма А. ferrooxidans ТРВк при постоянном плазмидном составе и в плазмидных профилях — у штамма ТРУ-1 при относительной стабильности структуры хромосомной ДНК. У 51 1кегтою1егат Кг1 и Г. аскИрЫЫт

Ут не выявлено изменений в структуре хромосомной ДНК при адаптации к пиритам 3 и 5. У этих видов микроорганизмов при росте на закисном железе, пирптах 3 и 5 в клетках не обнаружено плазмид.

6. В процессе бактериально-химического окисления разных типов пиритов тремя видами микроорганизмов отмечены неоднозначные изменения их электрофизических свойств. При сравнительной оценке бактериально-химического окисления пиритов тремя видами микроорганизмов направленность изменений значений КтерМОэдс была одинаковой в случае бактерий А. ferrooxidans и БлкегтоШегат и отличной в случае архей /л а^хркИит.

Заключение

В работе был впервые применен комплексный подход к изучению взаимодействия ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, относящихся к отдаленным филогенетическим группам, с их энергетическим субстратом — природными пиритами. Показано разнообразие свойств пиритов и уникальность каждого образца. Изучен процесс адаптации штаммов А. /еггоохгсЯат, БлкегтоЫегат и К аысИркИит к этим пиритам. Они отличались по способности к адаптации к одним и тем же образцам пиритов, по скорости роста и окисления разных пиритов. Исследованы генотипические характеристики у адаптированных культур микроорганизмов. Из трех видов изученных микроорганизмов только А. /еп'оох1с1ат при смене энергетического субстрата с закисного железа на различные типы пиритов обнаружил лабильность генома, причем у штамма ТТВк наблюдались изменения только в структуре хромосомной ДНК, а у штамма ТТУ-1, в основном, - в плазмидных профилях. Полученные результаты говорят о необходимости изучения штаммового разнообразия внутри одного вида микроорганизмов и тщательного подбора штаммов для научных исследований и технологических процессов. Показаны неоднозначные изменения электрофизических свойств самих пиритов в процессе их химического и бактериально-химического окисления разными микроорганизмами: пропорциональное окисление в пирите железа и серы, или предпочтительное окисление железа или серы, или фракций образцов пиритов с определенным значением коэффициента термоэлектродвижущеи силы (КгерЧ10эдс)э или выщелачивание примесных элементов. При сравнительной оценке бактериально-химического окисления пиритов тремя видами микроорганизмов направленность изменений значений Ктермоэдс была одинаковой в случае бактерий А. /еггоохгсЗапя и

8лЪегто1о1егат и отличной в случае архей Т7. аЫсИркИит. Сопротивление (1п Я) при химическом и бактериально-химическом окислении пиритов 1 и 2 находилось в тех же границах, что и у исходных образцов. При повышении температуры, при которой проводились эксперименты, при окислении пиритов 3 и 5 наблюдалось повышение значений 1п К Эти изменения были выражены сильнее при более активном бактериально-химическом окислении, чем химическом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тупикина, Ольга Владимировна, Москва

1. Агеева С. Н., Кондратьева Т. Ф., Каравайко Г. И. Фенотипические особенности штаммов ТЫоЪасШт /еггоох1с1ат // Микробиология. 2001. Т. 70. № 2. С. 226-234.

2. Агеева С. Н., Кондратьева Т. Ф., Каравайко Г. И. Плазмидные профили штаммов Ас1с1ИЫЪасШи$ /еггоох1с1ат, адаптированных к разным субстратам окисления // Микробиология. 2003. Т. 72. № 5. С. 651-657.

3. Андреев Б. С. Пирит золоторудных месторождений // Наука / М: 1992.

4. Берри Л., Мейсон Б., Дитрих Р. Минералогия // М.: Мир, 1987.

5. Бетехтин А. Г. Минералогия // М.: Государственное издание геологической литературы, 1950.

6. Воган Д., Крейг Д. Химия сульфидных минералов // М.: Мир, 1981.

7. Головочева Р. С., Каравайко Г. И. Бгй/оЬасШиз новый род термофильных спорообразующих бактерий // Микробиология. 1978. Т. 47. №5. С. 815-822.

8. Головачева Р. С., Голышина О. В., Каравайко Г. И., Дорофеев А. Г., Пивоварова Т. А., Черных Н. А. Новая железоокисляющая бактерия ЬерШярггШит 1Ьегто/еггоохЫат эр. поу. // Микробиология. 1992. Т. 61. №6. С. 1056-1065.

9. Громова Л. А. Ультраструктурная организация ТЫоЬасШт/еггоох1'с1ат в связи с окислением элементарной серы: Дис. канд. биол. наук. М., 1983.

10. Грудев С. Н. Различия между штаммами ТЫоЪасШиз /еггоох1'с1ат по способности окислять сульфидные минералы. В кн.: Биогеотехнология металлов / Ред. Каравайко Г. И., Грудева С. Н. // М.: Центр международных проектов ГКНТ, 1985. С. 85-89.

11. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика // М.: Мир, 1991.

12. Инструкция по определению плотности методом М. М. Василевского (метод микробюреток) // М.: НСОММИ № 31, 1991.

13. Каляева Э. С., Холодин Г. Я., Басс И. А., Горленко Ж. М., Юрьева О. В., Никифоров В. Г. Тп5037-Тп21 -подобный ртутный транспозон обнаруженный у ТЫоЬасШт/еггоохгс^ат //Генетика. 2001. Т. 37. № 8. С. 1160-1164

14. Каравайко Г. И., Авакян А. А. Механизм размножения ТЫоЬасШш ¡еггоох1йап8 II Микробиология. 1970. Т. 39. № 6. С. 950-952.

15. Каравайко Г. И., Кузнецов С. И., Голомзик А. И. Роль микроорганизмов в выщелачивании металлов из руд. М.: Наука, 1972.

16. Каравайко Г. И., Миллер Ю. М., Капустин О. А., Пивоварова Т. А. Фракционирование стабильных изотопов серы при её окислении ТЫоЪасШш¡еггоох1(1ат И Микробиология. 1980. Т. 49. № 6. С. 849-854.

17. Каравайко Г. И. Микроорганизмы и их роль в биогеотехнологии металлов // Биогеотехнология металлов / Ред. Каравайко Г. И., Росси Д., Агате А., Грудев С., Авакян 3. А. Москва: Центр Международный проектов ГКНТ. 1989.

18. Каравайко Г. И., Дубинина Г. А., Кондратьева Т. Ф. Литотрофные микроорганизмы окислительных циклов серы и железа // Микробиология. 2006. Т. 65. № 5. С. 593-629.

19. Коваленко Е. В., Малахова П. Т. Спорообразующая железоокисляющая бактерия 8и1/оЪасШш Мегто5и1/гс1оох1с1ап$ II Микробиология. 1983. Т. 52. С. 962-966.

20. Кондратьева Т. Ф., Каравайко Г. И. Рестрикционный анализ ДНК ТЫоЬасШиз /еггоох1с1а№ с использованием электрофореза в пульсирующих разнонаправленных электрических полях // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1992. № 3-4. С. 9-12.

21. Кондратьева Т. Ф., Пивоварова Т. А., Мунтян Л. Н., Каравайко Г. И. Изменение структуры хромосомной ДНК ТЫоЪасШш /еггоох1с1ат на средах с разными субстратами окисления // Микробиология. 1996 а. Т. 65. № 1.С. 67-73.

22. Кондратьева Т. Ф., Пивоварова Т. А., Каравайко Г. И. Структурные особенности хромосомной ДНК у штаммов ТЫоЪасШш /еггоох1с!ат, адаптированных к росту на средах с пиритом или элементной серой // Микробиология. 1996 б. Т. 65. № 5. С. 675-681.

23. Кондратьева Т; Ф., Каравайко Г. И. Изменчивость генома ТЫоЪасШш /еггоохгс!ат и её значение в биогидрометаллургии // Микробиология.1997. Т. 66. №6. С. 735-743.

24. Кондратьева Т. Ф., Агеева С. Н., Мунтян Л. Н., Пивоварова Т. А., Каравайко Г. И. Штаммовый полиморфизм плазмидных профилей у АЫсИМоЬасШш/еггоох1с!ат // Микробиология. 2002 а. Т. 71. № 3. С. 373380.

25. Кондратьева Т. Ф., Агеева С. Н., Пивоварова Т. А., Каравайко Г. И. Характеристика рестракционных профилей хромосомной ДНК у штаммов Ас'к1ИЫоЬасИ1т/еггоох1с!ст$ II Микробиология. 2002 б. Т. 71. № 4. С. 514-520.

26. Кондратьева Т. Ф., Данилевич В. Н., Агеева С. Н., Каравайко Г. И. Взаимодействие хромосомной и плазмидной ДНК у штаммов А&с1иЫоЪасЩт /еггоох1с1ат, адаптированных к разным субстратам окисления. Микробиология. 2004. Т. 73. № 3. С. 368-376.

27. Кузмин В. И., Болохонцева С. В., Ожогина Е. Г., Хитаров Д. Н., Горобец Б. С., Горбатов Г. А., .Руб А. Б. Минералогические методы поисков и оценки месторождений рудных полезных ископаемых // Минеральное сырье. 1999. № 5. С. 64-70.

28. Лебедева С. И. Определение микротвердости минералов // М: Издательство Академии Наук СССР, 1963.

29. Лодейщиков В. В. Технология извлечения золота из упорных руд. Иркутск: Иргиредмет. 1999. Т. 1. С. 149.

30. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984.

31. Маркосян Г. Е. Новая железоокисляющая бактерия ЬерШБртИит /еггоох1с!ат II Биол. журнал Армении. 1972. Т. 35. № 2. С. 26.

32. Меламуд В. С., Пивоварова Т. А., Турова Т. П., Колганова Т. В., Осипов Г. А., Лысенко А. М., Кондратьева Т. Ф., Каравайко Г. И. Новая термофильная бактерия &и^оЪасШи$ бШНсш эр. поу. // Микробиология. 2003. Т. 72. №5. С. 681-688.

33. Пивоварова Т. А., Миллер Ю. М., Крашенникова С. А., Капустин О. А., Каравайко Г. И. О роли фосфолипидов в фракционировании стабильных изотопов серы при её окислении ТЫоЪасШт fгrrooxidans II Микробиология. 1982. Т. 51. № 4. с. 552-554.

34. Пивоварова Т. А., Кондратьева Т. Ф., Батраков С. Г., Есипов С. Е., Чешенко В. И., Быкова С. А., Лысенко А. М., Каравайко Г. И. Фенотипические особенности штаммов У и У-2 Реггор1азта а^гркИит //Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С. 809-818.

35. Резников А. А., Муликовская Е. П., Соколов И. Ю. Методы анализа природных вод // М: Недра. 1970. С. 138 139.

36. Шуй Р. Т. Полупроводниковые рудные минералы // Ленинград: Недра. 1979.

37. Яхонтова Л. К. Механизм окисления сульфидных минералов тионовыми бактериями // Ред. Каравайко Г. И. Биогидротехнология металлов / М: Центр международных проектов ГЕНТ. 1985.

38. Яхонтова Л. К., Сергеев В. М., Каравайко Г.И. Реальная конституция сульфидов и процесс их бактериального окисления // Ред. Иванов М. В. Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов / Пущено. 1976.

39. Amils R., Irazabal N., Moreira D., Abad J. P., Marin I. Genomic organization analysis of acidophilic chemolithoautotrophic bacteria using pulsed field gel electrophoretic techniques//Biochemic. J. 1998. V. 80. № 11. P. 911-921.

40. Backer B. J., Banfield J. F. Microbial communities in acid mine drainage // FEMS Microbiology Ecology. 2003. V. 44. P. 139-152.

41. Barreto M., Jedlicki E., Holmes D. S. Identification of a gene cluster for the formation of extracellular polysaccharide precursors in the chemolithoautotroph Acidithiobacillus ferrooxidans II Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. № 62. P. 902-909.

42. Birnboim H. C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. № 6. P. 1513 — 1523.

43. Blake R. C., Shute E. A. Respiratory components in acidophilic bacteria that respire on iron // Geomicrobiology. J. 1992. V. 10. № 3 4. P. 173 - 192.

44. Blake R. C., Shute E. A., Greenwood M. M., Spencer G. H., Ingledew W. J. Enzymes of aerobic respiration on iron // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. № 1 3. P. 9- 18.

45. Blake R. C., Shute E. A. Respiratory Enzymes of Thiobacillus ferrooxidans. Kinetic Properties of an Acid-Stable Iron: Rusticyanin Oxidoreductase // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 9220-9228.

46. Bond P. L., Druschel G. K., and Banfield J. F. Comparison of Acid Mine Drainage Communities in Physically and Geochemically Distinct Ecosystems // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. № 11. P. 4962-4971.

47. Brierley C. L. Bacterial oxidation. // Engineering and Mining Journal. 1995. V. 196. P. 42-45.

48. Brierley J. A., Brierley C. L. Present and Future Commercial Applications of Biohydrometallurgy // Hydrometallurgy. 2001. V. 59. P. 233-239.

49. Brock T. D., Brock K. M., Belly R. T., Weiss R. L. Sulfolobus: a new genes of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature // Arch. Mikrobiol. 1972. V. 84. P. 54-68.

50. Burton N. P. and Norris P. R Microbiology of acidic, geothermal springs of Montserrat: environmental rDNA analysis // Extremophiles. 2000. V. 4. № 5. P. 315-320

51. Cadiz R., Gaete L., Jedlicki E., Yates J., Holmes D. S., Orellana O. Transposition of IST2 in Thiobacillus ferrooxidans II Mol. Microbiol. 1994. V. 12. № 1. P. 165-170.

52. Chakraborty R., Deb C., Lonia A., Roy P. Cloning and characterization of a high-copy-number novel insertion sequence from chemolithotrophic Thiobacillus ferrooxidans II Plasmid. 1997. V. 38. № 2. P. 129-134.

53. Colmer A. R., Hinkle M. E. The Role of Microorganisms in Acid Mine Drainage: A Preliminary Report // Science. 1947 V. 106. № 2751. P. 253-256.

54. Crundwell F. K. How do bacteria interact with minerals // Biohydrometallurgy: fundamentals technology and sustainable development / Eds. Ciminelli V. S. T., Garcia O. Ir. Elsevier Science. 2001. Part A. P. 149-157.

55. Dbminy C. N., Coram N. J., Rawlings D. E. Sequence analysis of plasmid pTF-5, 19,8 kb geographically widespread member of the Thiobacillus ferrooxidans pTFI 91-like plasmid family // Plasmid. 1998. V. 40. № 1. P. 5057.

56. Dorrington R. A., Bardien S., Rawlings D. E. The broad host-range plasmid pTF-FC2 requires a primase-like protein for autonomous replication in Escherichia coli II Gene. 1991. V. 108. № 1. P. 7-14.

57. Dresher W. H. Producing Copper Nature's Way // Bioleaching. Copper Development Association. 2004.

58. Dufresne S., Bousquet J., Boissinot M., Guay R. Sulfobacillus disulfidooxidans sp. nov., a new acidophilic, disulfide-oxidizing, gram-positive, spore-forming bacterium. //Intern. J. System. Bacteriol. 1996. V. 46. №. 4. P. 1056-1054.

59. Edwards K. J., Gihring T. M., Banfield J. F. Seasonal variations in microbial populations and environmental conditions in an extreme acid mine drainage environment// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. № 8. P. 3627-3632. .

60. Edwards K. J., Bond P. L., Gihring T. M. and Banfield J. F. An archaeal iron-oxidizing extreme acidophile important in acid mine drainage // Science. 2000. V. 287 № 5459. P. 1796-1799.

61. Edwards K. J., Hu B., Hamers R. J., Banfield J. F. A new look at microbial leahing patterns on sulfide minerals // FEMS Microbiology Ecology. 2001. V. 34. №3. P. 197-206.

62. Espejo R., Romero P. Growth of Thiobacillus ferrooxidans on elementary sulfur // Appl. Environ. Microbiol. 1987. V. 53. № 8. P. 1907-1912.

63. Fernando A. Present and future of bioleaching in developing countries. EJB Electronic // Journal of Biotechnology. 2002. V. 5. № 2.

64. Ferrer M., Golyshina O. V., Beloqui A., Golyshin P. N., Timmis K. N. The cellular machinery of Ferroplasma acidiphilum is iron-protein-dominated // Nature. 2007. V. 445. P. 91-94.

65. Fowler T. A., Crundwell F. K. Leaching of zinc-sulfide by Thiobacillus ferrooxidans experiments with a controlled redox poterial mechanism // Appl. Environ. Microbiology. 1998. V. 64. № 10. P. 3570-3575.

66. Fowler T. A., Holmes P. R., Crundwell F. K. On the kinetics and mechanism of the dissolution of pyrite in the presence of Thiobacillus ferrooxidans // Hydrometallurgy. 2001. V. 59. № 2-3. P. 257-270.

67. Fry I. J., Garcia E. Cloning and characterization of Thiobacillus ferrooxidans genes involved in sulfur assimilation // Biohydrometallurgy / Eds. Salley J., McCready R. G. L., Wichlacz P. L Ottawa, Canada: CANMET. 1989. P. 171185.

68. Fuchs T., Huber H., Teiner K., Burggraf S., Stettter K. O. Metallosphaera prunea, sp. nov., a novel metal-mobilizing, thermoacidophilic Archaeum, isolated from a uranium mine in Germany // Syst. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 560-566.

69. Fuchs T., Huber H., Burggraf S., Stettter K. O. 16SrDNA-based phylogeny of the archaeal order Sulfolobales and reclassification of Desulfurolobus ambivalens as Acidianus ambivalens comb. nov. // Syst. Appl. Microbiol. 1996. V. 19. P. 56-60.

70. Gardner M. N., Rawlings D. E. Evolution of compatible replicons of the related IncQ-like plasmids, pTC-F14 and pTF-FC2 // Microbiology. 2004. V. 150. P. 1797-1808.

71. Gehrke T., Telegdi J., Thierry D., Sand W. Importance of ectracellular polymeric substances from Thiobacillus ferrooxidans for bioleaching // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. № 7. p. 2743-2747.

72. Gehrke T., Hallman R., Kinzler K., Sand W. The Eps of Acidithiobacillus ferrooxidans a model for structure function - relationships of attached bacteria and their phisiology // Water Science and Technology. 2001. V. 43. № 6. P. 159-167.

73. Giudici-Orticoni M. T., Leroy G., Nitschke W., Brushi M. Characterization of a new dihemic c (4) type cytochromes isolated from Thiobacillus ferrooxidans // Biochemistry. 2000. V. 39. № 24. P. 7205 - 7211.

74. Golyshina O. V., Timmis K. N. Ferroplasma and relatives, recently discovered cell wall-lacking archaea making a living in extremely acid, heavy metal-rich environments//Environ. Microbiol. 2005. V. 9. P. 1277-1288.

75. Gonzalez-Tori 1 E., Llobet-Brossa E., Casamayor E. O., Amann R., Amils R.

76. Microbial ecology of an extreme acidic environment, the Tinto River. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 8. P. 4853-4865.

77. Grogan D., Palm P., Zillig W. Isolate B12, which harbours a virus-like element, represents a new species of the archaebacterial genus Sulfolobus, Sulfolobus shibatae, sp. nov. // Arch. Microbiol. 1990. V. 154. № 6. P. 594599.

78. Hallberg K. B., Lindstrom E. B. Characterization of Thiobacillus caldus sp. nov., a moderately thermophilic acidophile // Microbiology (UK). 1994. V. 140. P. 3451-3456.

79. Harrison A. P. Characteristics of Thiobacillus ferrooxidans and other iron-oxidizing bacteria with emphasis on nucleic acid analyses // Biotechnol. Appl. Biochem. 1986. V. 8. № 4. P. 249-257.

80. Hawkes R. B., Franzmann P. D., O'hara G., Plumb J. J. Ferroplasma cupricumulans sp. nov., a novel moderately thermophilic, acidophilic archaeon isolated from an industrial-scale chalcocite bioleach heap // Extremophiles. 2006. V. 10. №6. P. 525-530.

81. He Z. G., Zhong H., Li Y. Acidianus tengchongensis sp. nov., a new species of acidothermophilic archaeon isolated from an acidothermal spring // Curr. Microbiol. 2004. V. 48. № 2. P. 159-163.

82. Holmes D.S., Zhao H. L., Levican G., Ratouchniak J., Bonnefoy V., Varela P., Jedlicki E. ISAfel, an ISL3 family insertion sequence from Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 19859 //J. Bacteriol. 2001 b. V. 183. № 14. P. 4323-4329.

83. Huber G., Sprinnler C., Gambacorta A., Stetter K. O. Metallosphaera sedula gen. and sp. nov. Represents a New Genus of Aerobic, Metal-Mobilizing, Thermoacidophilic Archaebacteria // System. Appl. Microbiol. 1989. V. 12. P. 38-47.

84. Huber G., Stetter K. O. Sulfolobus metallicus, sp. nov., a novel strictly chemolithoautotrophic thermophilic archaeal species of metal-mobilizers // Syst. Appl. Microbiol. 1991. V. 14. P. 372-378.

85. Hurlbut C. S., Klein C. Manual of Mineralogy // New York: John Wiley and Sons. 1985. P. 285-286.

86. Iwahori K., Takeuchi F., Kamimura K., Sugio T. Ferrous iron-dependent- • volatilization of mercury by the plasma membrane of Thiobacillus ferrooxidans II Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. № 9. P. 3823-3827.

87. Jan R. L., Wu J., Chaw S. M., Tsai C. W., Tsen S. D. A novel species of thermoacidophilic archaeon, Sulfolobus yangmingensis sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. № 4. P. 1809-1816.

88. Johnson D. B. Biodiversity and ecology of acidophilic microorganisms // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 307 317.

89. Johnson D. B., Hallberg K. B. The microbiology of acidic mine water // Research in Microbiol. 2003. V. 154. P. 466 473.

90. Johnson D.B., Okibe N., Hallberg K.B. Differentiation and identification of iron-oxidizing acidophilic bacteria using cultivation techniques and amplified ribosomal DNA restriction enzyme analysis // J. Microbiol. Methods. 2005. V. 60. №3. P. 299-313.

91. Kanao T., Kamimura K, Sugio T. Identification of a gene encoding a tetrathionate hydrolase in Acidithiobacillus ferrooxidans // J. Biotechnol. 2007. V. 132. № l.P. 16-22.

92. Karavaiko G. I. Microbiological processes for the leaching of metals from ores. M.: Center of International Projects, GKNT. Ch. I-II. 1985.

93. Karavaiko G. I., Smolskaja L. S., Golyshina O. K., Jagovkina M. A., Egorova E. Y. Bacterial pyrite oxidation: Influence of morphological, physical and chemical properties // Fuel Processing Technology. 1994. V. 40. P. 151-165.

94. Kelly D. P. Thermodynamic aspects of energy conservation by chemolithotrophic sulfur bacteria in relation to the sulfur oxidation pathways // Arch. Microbiol. 1999. V. 171. P. 219-229.

95. Kelly D. P., Wood A. P. Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 511-516.

96. Kondratyeva Т. F., Muntyan L. N., Karavaiko G. I. Zinc and arsenic-resistant strains of Thiobacillus ferrooxidans have increased copy numbers of chromosomal resistanse genes // Microbiology. 1995. V. 141. № 5. P. 11571162.

97. Kondrat'eva T. F., Danilevich V. N., Karavaiko G. I. The primary structure and characteristics of the ISAfe600 an early described insertion sequence from Acidithiobacillus ferrooxidans strains // Микробиология. 2008. (в печати)

98. Konishi J., Asai S., Ohshige H. // Shiden to sozai J. Mining and Mater. Process. Inst. Jap. 1994. V. 110. № 1. P. 2. Цит. по. Лодейщиков В. В. Технология извлечения золота из упорных руд. Иркутск: Иргиредмет. 1999. Т. 1.С. 149.

99. Kusano T., Ji G., Inoue C., Silver S. Constitutive synthesis of a transport functions encoded by the Thiobacillus ferrooxidans mer C gene cloned in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1990. V.172. P. 2688-2692.

100. Kusano T., Takeshima T., Inoue C., Sugawara K. Evidence for two sets of structural genes coding for ribulose bisphosphate carboxylase genes in Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1991. V. 173. № 22. P. 7313-7323.

101. Kusano T., Sugawara K., Inoue C., Takeshima T., Numata T., Shiratory T. Electrotransformation of Thiobacillus ferrooxidans with plasmids containing a mer-determinant // J. Bacteriol. 1992 a. V. 174. № 20. P. 6617-6623.

102. Kusano T., Takeshima T., Inoue C., Sugawara K. Evidence for two sets of structural genes coding for ribulose bisphosphate carboxylase genes in Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1992 b. V. 173. № 22. P. 7313 7323.

103. Lawrence R.W. Biooxidation for the treatment of refractory gold ores and concentrates // Canadian perspective. CIM Bulletin. 1994. № 87. P. 58-65.

104. Lehner S., Savage K. The effect of As, Co and Ni impurities on pyrite oxidation kinetics: Batch and flow-through reactor experiments with synthetic pyrite // Geochimica et Cosmochimica Acta. 2008. V. 72. P. 1788-1800.

105. Lorbach S. C., Shivelly J. M., Buonfiglio V. Kinetics of sulfur oxidation by Thiobacillas ferrooxidans II Geomicrobiology J. 1992. V. 10. № 3-4. P. 219226.

106. Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. № 1. P. 265-275.

107. Lui Z., Borne F., Ratouchnian S., Bonnefoy V. Genetic transfer of Inc P, Inc Q, Inc W plasmids to four Thiobacillus ferrooxidans strains by conjugation // Hydrometallurgy. 2001. V. 59 № 2-3. P. 339-345.

108. Lipps G. Plasmids and viruses of the thermoacidophilic crenarchaeote Sulfolobus / Extremophiles. 2006. V. 10. P. 17-28.

109. Mahmoud K. K., Leduc L. G. and Ferroni G. D. Detection of Acidithiobacillus ferrooxidans in acid mine drainage environments using fluorescent in situ hybridization (FISH) // J. Microbiol. Methods. 2005. V. 61. P. 33-45.

110. Mackintosh M. E. Nitrogen fixation by Thiobacillus ferrooxidans II J. Gen. Microbiol. 1978. V. 105. P. 215 218.

111. Martin P. A. W., Dugan P. R., Tuovinen O. H. Plasmid DNA in acidophilic, chemoautolithotrophic Thiobacilli II Can. J. Microbiol. 1981. V. 27. № 8. P. 850-853.

112. Nestor D., Valdiva U., Chaves A. P. Mechanism of bioleaching of a refractory minerals of gold with Thiobacillus ferrooxidans // Int. J. Mineral. Processing. 2001. V. 62. № 1-4. P. 187-189.

113. Neyt C. M., Iriarte V., Ha Thi, Cornelis G. R. Virulence and arsenic resistance in Yersiniae. II J. Bacteriol. 1997. P. 179. № 3. P. 612-61.

114. Norris P.R., Clark D.A., Owen J.P., Waterhouse S. Characteristics of Sulfobacillus acidophilus sp.nov. and other moderately thermophilic mineral-sulphide-oxidizing bacteria. // Microbiology. 1996. V. 142. P. 775-783.

115. Okibe N., Johnson B. Bioleaching of pyrite by defined cultures of moderately thermophilic acidophiles // Biohydrometallurgy: Fundamentals and Sustainable Development, Part A. / Ciminelli V. S. T. and Garcia Jr. 2001. P. 443-451.

116. Okibe N., Gericke M., Hallberg K. B., Johnson D. B. Enumeration and characterization of acidophilic microorganisms isolated from a pilot plantstirred-tank bioleaching operation // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 4. P. 1936-1943.

117. Oppon J. C., Sarnovsky R. J., Craig N. L., Rawlings D. E. A Tn 7-ike transposon is present in the glm US region of the obligately chemoautolithotrophic bacterium Thiobacillus ferrooxidans // J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 11. P. 3007-3012.

118. Peng J. B., Yan W. W., Bao X. Z. Plasmid and transposon transfer to Thiobacillus ferrooxidans // J. Bacteriol. 1994. V. 176. № 10. P. 2892-2897.

119. Pretorius I. M., Rawlings D. E., Woods D. R. Identification and cloning of Thiobacillus ferrooxidans structural nif genes in Escherichia coli // Gene. 1986. V. 45. № l.P. 59-65.

120. Rawling D. E., Pretorius I. M., Woods D. R. Expression of Thiobacillus ferrooxidans origin of replication in Escherichia coli. II J. Biotechnology 1984 b. V. 158. №2. P. 737-738.

121. Rawlings D. E., Jones W. A., O'Neill E. G., Woods D. R. Nucleotide sequence of the glutamine synthetase gene and its controlling region from the autotroph Thiobacillus ferrooxidans II Gene. 1987. V. 53. P. 211-217.

122. Rawlings D. E., Dorrington R. A., Rohrer J., Clennel A. M. A molecular analysis of the replication and mobilization regions of a broad-host-range plasmid, isolated from Thiobacillus ferrooxidans II FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. № 1-3. P. 3-8.

123. Rawlings D. E., Kusano T. Molecular genetics of Thiobacillus ferrooxidans U Microbiol. Rev. 1994. V. 58. № 1. P. 39-55.

124. Rawlings D. E., Silver S. Mining with microbes // Biotechnology. 1995. V. 13. P. 773-775.

125. Rawlings D. E. The molecular genetics of Thiobacillus ferrooxidans and other mesophilic, acidophilic, chemolithotrophic iron- or sulfur-oxidizing bacteria // Hydrometallurgy. 2001. V. 59. № 2-3. P. 187-201.

126. Rawlings D. E. Heavy metal mining using microbes // Ann. Rev. Microbiol. 2002. V. 56. P. 65-91.

127. Rawlings D. E. The evolution of pTF-FC2 and pTC-F14, two related plasmids of the IncQ-family // Plasmid. 2005. V. 53. P. 137-147.

128. Rensing C., Chosh M., Rosen B. P. Families of soft-metal-iron-transporting ATPases // J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 19. p. 5891-5897.

129. Rojas-Chapana J. A., Tributsch H. Interfacial activity and leaching patterns of Leptospirillum ferrooxidans on pyrite // FEMS Microbiology Ecology 2004. V. 47. P. 19-29.

130. Sanchez H., Hevia E., Caceres B., Venegas A. Studies on native strains of Thiobacillus ferrooxidans. IV. Isolation, physical map and partial cloning of a cryptic plasmid // Biotechnol. Appl. Biochem. 1986. V. 8. № 4. P. 300-308.

131. Sand W., Gehrke T., Hallman R., Shippers A. Sulfur chemistry, biofilm and the (in) direct attack mechanism a critical evaluation of bacterial leaching // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 43. P. 961-966.

132. Sand W., Gehrke T., Jozca P. G., Shippers A. Biochemistry of bacterial leaching direct versus indirect bioleaching // Hydrometallurgy. 2001. V. 59. №2-3. P. 159-175.

133. Schrader J. A., Holmes D. S. Phenotypic switching of Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 3915-30223.

134. Schrenk M. O., Edwards K. J., Goodman R. M., Hamers R. J., Banfield J. F. Distribution of Thiobacillus ferrooxidans and Leptospirillum ferrooxidans: implications for generation of acid mine drainage // Science. 1998. V. 279. № 5356. P. 1519-1522.

135. Shippers A., Jozsa P. G., Sand W. Sulfur chemistry in bacterial leaching of pyrite // Appl. Env. Microbiol. 1996. V. 62. № 9. P. 3424-3431.

136. Shippers A., Sand W. Bacterial leaching of metal sulfides proceeds by two indirect mechanisms via thiosulphate or via polysulphides and sulfur // Appl. Env. Microbiol. 1999. V. 65. № 1. P. 319-321.

137. Shiratory F., Inoue C., Sugawara K., Kusano T., Katagama Y. Cloning end expressing of Thiobacillus ferrooxidans mercury ion resistance genes in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1989. V. 171. № 4. P. 3458-3464.

138. Shiratory T., Inoue C., Numata M., Kusano T. Characterization and cloning of plasmid from the iron-oxidizing bacterium Thiobacillus ferrooxidans II Curr. Microbiol. 1991. V. 23. P. 321-326.

139. Silverman M. P., Lungren D. C. Study on the chemoautotrophic iron bacterium Ferrobacillus ferrooxidans I. An improved medium and harvesting procedure for securing high cell yield // J. Bacteriol. 1959. V. 77. № 5. P. 642-647.

140. Silverman M. P., Ehrlich H. L. Microbial formation and degradation of minerals // Adv. Appl. Microbiol. 1964. V. 6. P. 153-206.

141. Stevens C. J., Dugan P. R., Tuovinen O. H. Acetylene reduction (nitrogen fixation) by Thiobacillus ferrooxidans II Biotechnol. Appl. Biochem. 1986. V. 8. №4. P. 351 -359.

142. Sugio T., Mizunashi W., Inagaki K., Tano T. Purification and some properties of sulfur: ferric ion oxidoreductase from Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1987. V. 169. № 11. P. 4916-4992.

143. Suzuki I. Microbial leaching of metals from sulfide minerals // Biotechnol. Adv. 2001. V. 19. № 2. P. 119-132.

144. Takayanagi S., Kawasaki H., Sugimori K., Yamada T., Sugai A., Ito T., Yamasato K. and Shioda M. Sulfolobus hakonensis sp. nov., a novel species of acidothermophilic archaeon // Int J Syst Bacteriol. 1996. V. 46. № 2. P. 377382.

145. Teschke O. Volume of extracellular polymeric substance coverage of individual Acidithiobacillus ferrooxidans bacterium measured by atomic force microscopy // Microsc. Res. Tech. 2005. V. 67. № 6. P. 312-316.

146. Tributsch H. Direct versus indirect bioleaching // Hydrometallurgy. 2001. V. 52. №2-3. P. 177-185.

147. Trudinger P. The metabolism of inorganic sulfur compounds by Thiobacilli II Rev. Pure and Appl. Chem. 1967. V. 17. P. 1.

148. Tuovinen O. H., Kelly D. P. Biology of Thiobacillus ferrooxidans in the microbiological leaching of sulfide ores // Z. Allg. Microbial. 1972. V. 12. P. 311 -346.

149. Tuovinen O. H., Panda F. A., Tsuchiya H. M. Nitrogen requirement of iron-oxidizing Thiobacilli for acidic ferric sulfate regeneration // Appl. Environ. Microbiol. 1979. V. 37. № 5. P. 954 958.

150. Valdes J., Veloso F., Jedlicki E., Holmes D. Metabolic reconstruction of sulfur assimilation in the extremophile Acidithiobacillus ferrooxidans based on genome analysis // BMC Genomics. 2003. V. 4. № 1. P. 51.

151. Visser J. M., De Jog GAH, Robertson L. A., Kuenen J. G. A novel membrane-bound flavocytochrome c sulfide dehydrogenase from the colourless sulfur bacterium Thiobacillus sp. W5 // Arch. Microbiol. 1997. V. 167. P. 295-301.

152. Waksman S. A., Joffe I. S. Microorganisms concerned with the oxidation of sulfur in soil. II Thiobacillus thiooxidans, a new sulfur oxidizing isolated from the soil // J. Bacteril. 1922. V. 7. № 2. P. 239-256.

153. Wiertz I. V. Ferrous and sulfur oxidation by Thiobacillus ferrooxidans I I Eds. Torma A. E., Apel M. L. Brierley Biohydrometallurgical Techlogies / 1993. V. II. P. 463-471.

154. Xiang X., Dong X. and Huang L. Sulfolobus tengchongensis sp. nov., a novel thermoacidophilic archaeon isolated from a hot spring in Tengchong, China I I Extremophiles. 2003. V. 7. № 6. P. 493-498.

155. Yamashiro K., Yokobori S., Oshima T., Yamagishi A. Structural analysis plasmid pTAl isolated from the Thermoacidophilic archaeon Thermoplasma acidophilum / Extremophiles. 2006. V 10. P. 327-335.

156. Yasuda M., Yamagishi A., Oshima T. The plasmids found in isolates of the acidothermophilic archaebacterium Thermoplasma acidophilum / FEMS Microbiology Letters. 1995. V. 128. P. 157-162.

157. Yates J. R., Holmes D. S. Two families of repeated DNA sequences in Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. 1987. V. 169. № 5. P. 1861-1870.

158. Yates J. R., Cunnigham R. P., Holmes D. S. IST2: An insertion sequence from Thiobacillus ferrooxidans II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 72847287.

159. Zhao H. L., Holmes D.S. Insertion sequence IST1 and associates phenotypic switching in Thiobacillus ferrooxidans II Biohydrometallurgical technologies / Eds. Torma A. E., Apel M. L., Brierley C. L. Wyoming, 1993. V. 2. P. 667671.

160. Zillig W., Stetter K. O., Wunderl S., Schulz W., Priess H., Scholz I. The Sulfolobus-"Caldariella" group: taxonomy on the basis of the structure of DNA-dependent RNA polymerases // Arch. Microbiol. 1980. V. 125. P. 259269.

161. Zillig W., Yeats S., Holz I., Bock A., Gropp F., Rettenberger M. Lutz S. Plasmid-related anaerobic autotrophy of the novel archaebacterium Sulfolobus ambivalens / Nature. 1985. V. 313. P. 789-791.

162. Zillig W., Yeats S., Holz I., Bock A., Rettenberger M., Gropp F., and Simon G. Desulfurolobus ambivalens, gen. nov., sp. nov., an autotrophic archaebacterium facultatively oxidizing or reducing sulfur // System. Appl. Microbiol. 1986. V. 8: 197-203.

163. Zillig W., Prangishvilli D., Schlper C., Elferink M., Holz I., Albers S., Janekovic D., Götz D. Viruses, plasmids and other genetic elements of thermophilic and hyperthermophilic Archaea II FEMS Microbiology Reviews. 1996. V. 18. P. 225-236.

Информация о работе

Тупикина, Ольга Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Фенотипические и генотипические характеристики ацидофильных хемолитотрофов, окисляющих разные типы пиритов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы