Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биодеструкция сераорганических компонентов нефти с применением биопрепарата на основе микромицета в процессах очистки нефтешламов и загрязненных почв

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биодеструкция сераорганических компонентов нефти с применением биопрепарата на основе микромицета в процессах очистки нефтешламов и загрязненных почв"

На правах рукописи

САФАРОВ АЛЬБЕРТ ХАМИТОВИЧ

БИОДЕСТРУКЦИЯ СЕРАОРГАНИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ НЕФТИ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ МИКРОМИЦЕТА В ПРОЦЕССАХ ОЧИСТКИ НЕФТЕШЛАМОВ И ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ

03.00.23 -Биотехнология 03.00.16-Экология

Автореферат

диссертации на соискание степени кандидата технических наук

Казань-2004

Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета

Научные руководители: доктор технических наук, профессор

Ягафарова Гузель Габдулловна

доктор химических наук, чл.-корр. Академии наук Республики Башкортостан Ляпина Нафися Кабировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мелентьев Александр Иванович

доктор химических наук, профессор Половняк Валентин Константинович

Ведущая организация: Татарский научно-исследовательский и

проектный институт нефтяной промышленности ОАО «Татнефть», г. Бугульма

Защита состоится 23 июня 2004 года в 14 ° часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.02 при Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68, зал заседаний Ученого совета (А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета

Автореферат разослан

мая 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор технических наук

А.С.Сироткин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Загрязнение окружающей среды - проблема, которая приобрела в настоящее время мировое значение. Демографический взрыв и урбанизация; научно - технический прогресс и рост индустриализации с концентрацией производства, химизация всех аспектов жизнедеятельности человека и связанный с этим бурный рост предприятий химической и нефтегазопере-рабатывающей промышленности - все это создало широкие предпосылки для прогрессирующего загрязнения окружающей среды.

Ежегодно в мире при добыче; транспорте, хранении и использовании теряется большое количество нефти и нефтепродуктов. Попадая в окружающую среду, углеводороды нефти оказывают угнетающее действие на локальные экологические системы: губят живые организмы и существенно изменяют условия их обитания. К сожалению, помимо углеводородов в нефти и нефтепродуктах содержатся значительные количества других вредных веществ (сернистые соединения, фенол, тетраэтилсвинец и др.). Особенно острой эта проблема является в Башкортостане и других регионах, где в основном добывается высокосернистая нефть.

Процессы восстановления природных экосистем после нефтяного загрязнения весьма продолжительны по времени, а главными агентами их самоочищения являются естественные деструкторы - углеводородокисляющие микроорганизмы.

Биологические методы очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, основанные на применении активных микробных штаммов, проявляющих способность расти и использовать в качестве источника углерода и энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов, получили сегодня широкое развитие и применение. Известно, что не все микроорганизмы способны окислять серусодер-жащие компоненты нефти. Поэтому поиск, выделение и изучение особенностей микроорганизмов, способных окислять соединения серы, являются актуальными задачами.

Цель работы - изучение особенностей биодеградации сераорганических компонентов нефти нефтеокисляющим штаммом Fusariwn species № 56, и исследование биопрепарата на основе микромицета Fusariwn species № 56 и Thiobacillns species в процессах очистки нефтешламов и загрязненных почв.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: изучение биодеградации сераорганических компонентов нефти посредством выделенного и идентифицированного нефтеокисляющего штамма микромицета Fusariwn species № 56и ассоциации Fusarium species №56 и Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1;

изучение начального этапа биодеструкции фенилпропилсульфида посредством ассоциации нефтеокисляющего микромицета Fusarium species № 56 и Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1; изучение биодеградации высокосернистой нефти

i РОЮМЦРОКДЛЬНЛЯ БИБЛИОТЕКА СП««1 09 J00

разработка технологии биоочистки нефтешлама от нефти и нефтепродуктов биопрепаратом «Фузарин» путем аэрирования;

разработка принципиальной схемы производства биопрепарата на основе микромицета Fusarium species № 56н Thiobacillus species; проведение опытно-промышленных испытаний с использованием биопрепарата «Фузарин» в условиях Крайнего Севера (Тюменская область, г. Пыть-Ях).

Научная новизна работы. Выявлены новые свойства нефтеокисляющего микромицета Fusarium species № 56 биодеградировать сераорганические соединения класса сульфидов, таких как дигексилсульфид, бутилгексилсульфид, этилдецилсульфид, фенилгексилсульфид, фенилбутилсульфид, этилбензил-сулъфид, фенилпропилсульфид; дисульфидов: дибутилдисульфид, диамилди-сульфид, диизопропилдисульфид и тетрагидротиофена. Установлено, что биодеструкция сераорганических соединений и высокосернистой нефти ассоциацией культур Fusarium species № 56 и Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1, происходит в среднем на 20% полнее, чем монокультурой Fusarium species № 56.

Выявлено, что при биодеструкции представителя класса сульфидов - ди-гексилсульфида не образуются высокотоксичные соединения, такие как меркаптаны и сероводород.

Изучен начальный этап биодеструкции сераорганического соединения фенилпропилсульфида посредством нефтеокисляющих микроорганизмов ассоциации Fusarium species № 56и Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1. Выявлено, что при расщеплении фенилпропилиульфида образуется бензол.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований явились основой для разработки технологии очистки нефтешламов и биочистки почв, загрязненных нефтью путем использования биопрепарата «Фузарин», биодобавок и системы аэрирования. Разработанная технология может быть использована для очистки почвы и воды от высокосернистой нефти, нефтепродуктов и биодеградации нефтешламов в нефтегазодобывающей и нефтегазопе-рерабатывающей отраслях промышленности.

В результате промышленных испытаний по ликвидации нефтяных загрязнений в Тюменской области в районе г. Пыть-Ях, в условиях Крайнего Севера с резко континентальным климатом и высокой влажностью, показано, что биопрепарат «Фузарин» способен очищать почву, загрязненную нефтью и нефтепродуктами. Степень биодеградации за вегетационный период (90 сут.) составила 68,4 %, при этом содержание общей серы снизилось с 0,25 до 0,07%.

Предложена принципиальная схема производства биопрепарата «Фуза-рин» на основе микромицета Fusarium species№56и Thiobacillus species, включающая 2 линии производства.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XIV Международной научно-технической конференции «Реактив -2001», Уфа, 2001; на Школе-семинаре "Химическая экология", Уфа,

2001, на научно-практической конференции «Промышленная экология: Проблемы и перспективы», Уфа, 2001, на XIV Международной научно-технической конференции «Перспективные процессы и продукты малотоннажной химии», Выпуск 5, Уфа: 2001, на 50,51, 52,53-й научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ, Уфа, 2000 - 2003 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе получено 2 патента РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методики, экспериментальной части, главы «Разработка принципиальной технологической схемы получения биопрепарата «Фузарин» на основе микромицета Fusarium species№ 56», главы «Опытно-промышленные испытания биопрепарата «Фузарин» на основе нефтеокисляющего микромицета Fusarium sp. № 56 и Thiobacillns species», выводов, списка литературы и приложений, включает 16 таблицы, 9 рисунков. Список литературы включает 115 литературных источников, в том числе иностранных - 28.

Аналитический обзор литературы. В обзоре произведен анализ влияния нефти, нефтепродуктов и нефтешламов на экосистему. Рассмотрены микроор~ ганизмы, биопрепараты предлагаемые для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. Дана характеристика месторождений, где добываются высокосернистые нефти. Приведены сведения об особешюстях микробиологических превращений сернистых соединений нефти. Рассмотрены группы гетеротрофных микроорганизмов, способных окислять серу.

Материалы и методы исследований. В исследованиях использовались сераорганические соединения, полученные в лаборатории сераорганических соединений ИОХ УНЦ РАН, нефтешлам, отобранный из шламонакопителя НГДУ «Южарланнефть» (ОАО «Башнефть»). В качестве микроорганизмов- - . деструкторов сераорганических соединений и нефти использовали выделенный и идентифицированный при участии автора Fusarium sp. № 56ти Thiobacillus sp.

При проведении экспериментов применяли микробиологические методы исследований: определение количества клеток чашечным методом Коха; определение микробной биомассы в жидкой минеральной среде с помощью мембранных фильтров.

Содержание сераорганических соединений оценивали потенциометриче-ским титрованием, методами УФ-, ИК-спектрометрии, газожидкостной хроматографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Изучение особенностей биодеградации ссраорганических соединений

Первая серия опытов по биодеградации сераорганических соединений нефти микромицетом Fusarium sp. № 56 и ассоциацией Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus .ур.была проведена со следующими сульфидами: дигексилсульфид, бутилгексилсульфид, этилдецилсульфид. В качестве питательной среды использовалась модифицированная среда Чапека-Докса, в которую в качестве углерода и энергии добавляли сераорганические соединения в количестве 1 г/л. Культивирование осуществляли в термостатированной качалке при температуре 28-30 °С и в течении 7 суток.

Результаты исследований приведены в таблице 1. Таблица 1 - Изменение содержания серы через 7 суток культивирования

Соединения Содержание сульфидной серы после биодеградации, г/ 100 мл среды Биодеградация, %

СбН^СбН^дигексил-сульфид): + Fusarium sp. № 56 +смесь 1:1 {Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp.) Контроль 0,0011 0,0008 0,0087 87,4 90,8

QHj з ЗСдН^бутилгексил-сульфид): + Fusarium sp. № 56 +смесь 1:1 (Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp.) Контроль 0,0020 0,0014 0,0090 78,5 84,4

С10H21 БСгЩэтилдецил-сульфид): + Fusarium sp. № 56 +смесь 1:1 (Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp.) Контроль 0,0022 0,0011 0,0053 58,9 79,3

В результате полученных данных выявлено, что штамм Fusarium sp. № 56, а также его ассоциация с Thiobacillus sp. способны разлагать органические соединения серы: дигексилсульфид, бутилгексилсульфид, этилдецилсульфид. Так дигексилсульфид биодеградируется штаммом Fusarium sp. № 56 на 87,4%, бутилгексилсульфид и этилдецилсульфид на 78,5 и 58,9% соответственно.

Использование ассоциации Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp., взятых в соотношении 4:1, несколько усиливает эффект биодеградации сераорганических соединений и составляет для: CeH^SCeHij - 90,8 %

C6H,3SC4H9-84(4% C10H21SC2H5 - 79,3%

В первой серии опытов видно, что биодеградация ассоциацией культу] Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp., взятых в соотношении 4:1 происходит ин тенсивнее (до 20%), чем монокультурой Fusarium sp. № 56, поэтому было при нято решение, что дальнейшие опыты необходимо проводить с ассоциацией культуры Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp. При увеличении содержание Thiobacillus sp. в инокуляте ( выше 20% ) степень биодеградации сераорганиче ских соединений практически не изменяется. Поэтому дальнейшие исследования проводились с ассоциацией выше названных культур в соотношении 4:1.

В следующей серии опытов для изучения степени биодеградиии ассоциа цией Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp. были использованы сераорганическш соединения класса сульфидов (фенилгексилсульфид, фенилбутилсульфид этилбензилсульфид, фенилпропилсульфид), а также в качестве сравнения -выше изученные сульфиды (дигексилсульфид, бутилгексилсульфид, этилде цилсульфид), дисульфидов (дибутилдисульфид, диамилдисульфид, диизопро-пилдисульфид) и тетрагидротиофен. Результаты представлены в таблице 2. ,

Таблица 2 - Биодеградация сераорганических соединений ассоциацией

Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp. через 7 суток культивирования

. рн Биомасса, г/л Содержание сульфидной Био-дегра

Соединение нач. кон. нач. кон. серы после биодеградации, г/100 мл среды да- ция, %

1 2 3 4 5 6 7

Дигексилсульфид+ассоциация Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp. Контроль 7,02 7,01 7,15 7,01 0,05 0 0,21 0 0,0008 0,0087 90,8

Бутилгексилсуль-фид+ассоциация Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp. Контроль 7,02 7,01 7,14 7,01 0,05 0 0,09 0 0,0014 0,0090 84,4

Этилдецилсульфид+ ассоциация Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp. Контроль 7,03 7,00 7,14 7,00 0,05 0 0,12 0 0,0011 0,0053 79,3

Фенилгексилсульфид+ ассоциация Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp. Контроль 7,02 7,01 7,12 7,01 0,05 0 0,15 0 0,0032 0,0061 48,3

Продолжение таблицы 2

1 2 3 4 5 6 7

Дибутилдисуль-фид+ассоциация Fusarium sp. Ns 56 и Thiobacillus sp. Контроль 7,01 7,00 7,12 7,00 0,05 0 0,17 0 0,0012 0,0068 82,4

Диамилдисульфид+ ассоциация Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp. Контроль 7,25 7,23 7,49 7,23 0,05 0 0,18 0 0,0021 0,0053 59,4

Тетрагидротиофен+ ассоциация Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp. Контроль 7,28 7,28 7,51 7,28 0,05 0 0,20 0 0,0101 0,0127 20,1

Диизопропилдисульфид+ ассоциация Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp. Контроль 7Д9 7,25 7,50 7,25 0,05 0 0,21 0 0,0047 0,0100 53,3

Фенилбутилсульфид+ ассоциация Fusarium sp. № 56 vi Thiobacillus sp. Контроль 7,55 7,53 7,77 7,53 0,05 0 0,140 0 0,0026 0,0035 25,7

Этилбензилсульфид+ ассоциация Fusarium sp. № 56 к Thiobacillus sp. Контроль 7,65 7,62 7,79 7,62 0,05 0 0,100 0 0,0062 0,0093 33,4

Фенилпропилсульфид+ ассоциация Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp. Контроль 7,55 7,55 7,78 7,55 0,05 0 0,095 0 0,0109 0,0137 20,4

Из полученных результатов можно сделать вывод, что на деградацию се-раорганических соединений ассоциацией Fusarium sp. № 56 к Thiobacillus sp. влияло количество и четность атомов углерода в радикалах, симметричность и расположение атомов серы. Например, симметричный дигексилсульфид дест-руктировался, в среднем, на 60 % больше, чем несимметричный этилдецил-сульфид, а сульфиды с четным числом атомов углерода в радикалах были более подвержены биодеградации, чем с нечетным. Так, степень деградации фенил-бутилсульфида за 7 дней составила более 25,7, а фенилпропилсульфида только 20,4 %.

В результате исследований выявлено, что деградация сераорганических компонентов нефти зависит от количества и расположения атомов серы, например, биодеструкция сульфидов ассоциацией Fusarium sp. Ns 56 и Thiobacillus sp. протекала полнее, чем дисульфидов. Кроме того, полученные результаты позволили выявить, что наличие ароматического кольца уменьшает деградацию

сульфидов. Например, за 7 суток степень биодеградации ароматических сульфидов, таких как фенилпропилсульфид, этилбензилсульфид и фенилбутил-сульфид, не превышала 48 %, в то время как степень биодеградации неароматических сульфидов, например дигексилсульфида, бутилгексилсульфида, этил децилсульфида, составляла более чем 80 %.

На основе полученных результатов было установлено, что сераорганиче ские вещества, в которых атом серы находился в цикле, биодеградировались труднее, чем вещества с атомом серы в линейной структуре. Так, степень биодеградации за 7 суток тетрагидротиофена составила всего 20,4, а этилбензил-сульфида более 33 %.

Выводы, сделанные на основе анализа степени биодеградации сераорга-нических соединений, подтверждались косвенными данными: по изменению рН и приросту биомассы. В тех опытах, в которых степень биодеградации серг органических компонентов была наиболее высокой, наблюдалось существеннс изменение биомассы. Так, например, для опыта с дигексилсульфидом, в котором наблюдалась наибольшая степень биодеградации (90,8%), прирост биомассы составлял 0,16 г/л. Также в опытах происходило изменение рН среды в сторону подщелачивания, например, для дигексилсульфида значение рН увели чилось с 7,01 до 7,15, а для диизопропилдисульфида - с 7,29 до 7,50.

Используя метод ИК-спектроскопии выявили, что после биодеструкции представителя класса сульфидов: дигексилсульфида не образуются высокотоксичные соединения такие как сероводород и меркаптаны. Более подробно изучен начальный этап биодеградации фенилпропилсульфида (глава 3)

Таким образом, ассоциация Fusarium sp. №56и Thiobacillus sp., взятых в соотношении 4:1, способна эффективно деградировать сераорганические компоненты нефти класса сульфидов, дисульфидов и тетрагпдротиофена.

2 Фнтотоксическая активность продуктов микробиологической деградации сераорганических соединений в жидкой среде

С целью изучения токсичности продуктов биодеградации, после 7 суток культивирования, сераорганических соединений были поставлены опыты с сульфидами (дигексилсульфид, фенилгексилсульфид, этилбензилсульфид), дисульфидом (дибутилдисульфид) и тетрагидротиофеном. Опыты ставили с ассоциацией Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp. в модифицированной минерально) среде Чапека-Докса. Начальная концентрация сераорганических соединений составляла 1 г/л. Опыт проводили на проростках кукурузы, которые первоначально проращивали в течение 3-х суток, а затем отбирали проростки имеющие . одинаковую длину центрального корешка. Тестирование культуралыюй жидко ста проводили в течение 25 суток при температуре 25-26°С. Контролем являлось среднее значение длины центрального кореянка кукурузы, инкубированно! в водопроводной воде.

В результате полученных данных видно, что фитотоксичность культу-ралыюй жидкости в среде с дигексилсульфидом и с ассоциацией уменьшается уже на 5 сутки. Процентное соотношение к контролю с водопроводной водой составляет 80% на 5 сутки. После 5 суток фитотоксичность постепенно уменьшается и составляет на 20-25 сутки 95% и 97% соответственно.

Для остальных сераорганических соединений выявлено, что фитотоксич-ность также уменьшается и на 25 сутки в среднем составляет 95-98%.

3 Изучение начального этапа биодеградации фенилпролилсульфида

Дня определения начального этапа биодеградции сераорганических соединений ассоциацией Fusarium sp. N2 56 и Thiobacillus sp.Q качестве примера использовали фенилпропилсульфид, начальная концентрация которого составляла 1 г/л. Для анализов использовали методы УФ-спектроскопии, ИК-спектроскопии и газожидкостную хроматографию.

Для определения остаточного количества сульфида проводили экстракцию гексаном по выше описанной методике.

На спектрометре "SPECORD М 400'* снимали УФ - спектры, в программе UV, т.е. в диапазоне волн от 299 нм до 350 нм. В результате исследований выявлено наличие ароматического соединения, характерного для бензольного кольца.

Анализы ИК - спектроскопии проводили на аппарате "SPECORD М 82". Длина волны 4000см*1 - 400 см' .ИК-спектр дает более полную картину о наличии различных веществ. В отличие от контроля результаты анализов с опытом выявили наличие двух пиков в области 1570 и 1534 см*1, которые характерны для бензольного кольца.

Газожидкостную хроматографию проводили на приборе CHROM 5. В приборе используется пламенно-ионизационные детекторы. Принцип работы заключается в следующем: в потоке газовой смеси (воздух-водород) сгорают поступающие вещества, которые далее распадаются на ионы. Результаты фиксируются прибором на самописце.

Длина колонки составляет 3 м., диаметр - 0,5 см. Рабочая температура прибора Т=100°С.

В качестве газ-носителя используется гелий. Скорость гелия по колонке составляет 30 мл/мин. Фаза колонки - ApL 10% на носителе Inerton N-AW. В качестве контроля служила смесь гексан+бензол. В опытном образце, после биодеградации фенилпропилсульфиДа Fusarium species № 56и Thiobacillus species, появился пик в области характерной для бензола.

В начальном этапе биодеградации фенилпропилсульфида ассоциацией Fusarium sp. № 56и Thiobacillus sp. образуется бензол:

продукты метаболизма

4 Исследование биодеградации высокосернистой нефти в

водной среде

Полученные результаты позволили продолжить исследования по биодс градации нефти ассоциацией Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp. в водной сре де. В качестве объекта исследования была взята высокосернистая нефть (сс держание общей серы 2,3, сульфидной серы -1,1 % масс.) Арланского месте рождения Республики Башкортостан.

Биодеградацию высокосернистой нефти (1% масс.) проводили в колба на 250 мл, в модифицированной среде Чапека-Докса.

В ходе работы определялись такие характеристики нефти как содержали общей и сульфидной серы по общепринятым методикам.

Содержание нефти определяли с помощью газожидкостной хроматогра фии на CHROM 5 (пламенно-ионизационные детекторы, длина колонки — 1.; м., диаметр - 0,5 см, рабочая температура прибора 50 - 300°С, газ-носитель -гелий, скорость гелия по колонке составляет 50 см3/мин, фаза колонки - SE-3C размер пор 0,125-0,160 мм). Предварительно для этого проводили экстракции пентаном остаточных углеводородов из культуральной жидкости.

В результате исследований биодеградации высокосернистой нефти НГД5 Южарланнефть РБ с помощью ассоциации Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp.. выявлено, что микроорганизмы способны расти в среде, содержащей высокосернистую нефть. При этом они способны использовать в качестве источника углерода и энергии как легкие фракции нефти, так и тяжелые.

В ходе исследований также было отмечено значительное снижение содержания общей и сульфидной серы после биодеструкции арланской нефти ассоциацией Fusarium sp. № 56и Thiobacillus sp. Например, если первоначальное содержание общей серы в арланской нефти составляло 2,3 % масс, а сульфидной - 1,1 % масс, то после 7 суток биодеструкции соответствующие показател] составляли всего 1,4 и 0,05% масс, соответственно.

Полученные результаты позволяют перейти к следующему этапу экспе римента, связанного с разработкой технологии биоочистки нефтешлама, со держащего высокосернистые компоненты, от нефти и нефтепродуктов биопре паратом на основе микромицета Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp. («Фуза рин») путем аэрирования.

5 Технология биоочистки нефтешлама от нефти и нефтепродуктов биопрепаратом «Фузарин»

Известные способы очистки и утилизации нефтяных отходов (особенно донных отложений нефтешламов) - механические, химические и физические -не всегда эффективны, а также часто экологически небезопасны. В связи с этим наиболее перспективным способом очистки нефтяных отходов от нефти, нефтепродуктов является использование комплекса мер, с обязательным включением биотехнологического метода.

Целью исследований явилась разработка технологии биоочистки нефтеш-лама, содержащего высокосернистые компоненты биопрепаратом на основе микромицета Fusarium sp. №56 и тиобактерии Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1 («Фузарин») путем аэрирования. В соответствии с целью исследований были поставлены следующие задачи:

- изучить процесс биоочистки нефтешлама на модельной установке от нефти и нефтепродуктов биопрепаратом «Фузарин» путем использования системы аэрирования;

установить необходимость дополнительного внесения биостимулятора (биотрин) и минеральной добавки (диаммофос).

Разработанная технология биоочистки предусматривала обработку неф-тешлама биопрепаратом «Фузарин», внесение совместно с биопрепаратом биостимулятора (биотрин) и минеральной добавки (диаммофос), впесение опилок, чернозема и песка, проведение ряда агротехнических мероприятий (полив, рыхление)

Объектом очистки служил нефтешлам, отобранный из шламонакопителя ИГДУ «Южарланнефть» (ОАО «Башнефть»). Влажность нефтешлама составляла 30,5%. Содержание нефти и нефтепродуктов в нефтешламе - 11,0% масс.

Биоочистку проводили с помощью биопрепарата «Фузарин», основу которого составлял активный нефтеокисляющий штамм Fusarium sp. №56 и тиобактерии Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1. Косвенно о биодеградации судили по изменению ферментативной активности объекта исследований.

Жидким концентратом биопрепарата «Фузарин» (титр ассоциации приблизительно 109 кл/мл) обрабатывали непосредственно нефтешлам, после чего вносили опилки (1 часть на 10 частей нефтешлама по массе) и перемешивали и располагали на установке по следующей схеме: песок (высота 5 см), нефтешлам (10 см) и чернозем (5 см). Для аэрирования в нефтешламе располагали перфорированные трубки диаметром 5 см.

В качестве контроля был заложен опыт без внесения биопрепарата «Фу-зарин» и системы аэрирования (контроль).

Отбор проб производился из среднего слоя на глубине 10 см каждые 30 сут. Эксперимент проводился при температуре 22 - 24°С в течении 540 сут.

В ходе очистки нефтешлама от нефти и нефтепродуктов осуществляли периодическое рыхление и орошение почвы для поддержания влажности на уровне 60% от полной влагоемкости.

В опытах изучали динамику биодеградации углеводородов нефти, определяли ферментативную активность почвы (каталазную, дегидрогеназную), а также изменение количества аэробных целлюлозоразрушающих, гетеротрофных и нитрифицирующих микроорганизмов.

В опытах с внесением ассоциации Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp. в составе биопрепарата «Фузарин» наблюдался устойчивый прирост гетеротрофных микроорганизмов в нефтешламе. Так, уже на 90 сут. в опытах с «Фузари-

ном» численность гетеротрофных микроорганизмов возросла на два порядка и составила в среднем 10* кл/г грунта. В то время как в контроле численность гетеротрофных микроорганизмов увеличилась с 0,5х103 только до 2,0х103 кл/г грунта за 90 сут. В дальнейшем их максимальное количество составило всего 6,0х103 кл/г грунта при резких колебаниях численности на протяжении всего времени культивирования (таблица 3).

Таблица 3 - Общая численность гетеротрофов при биоочистке нефтешлама от

нефти и нефтепродуктов биопрепаратом «Фузарип»

Вариант Численность гетеротрофных микроорганизмов, х106 кл/г грунта

0 сут. 90 сут. 150 сут. 180 сут. 210 сут. 240 сут. 270 сут. 360 сут.

Нефтешлам без «Фузарина» и системы аэрации (контроль) 0,0005 + 0,0001 0,002± 0,0002 0,001± 0,0002 0,002± 0,0002 0,003± 0,0003 0,005± 0,0012 0,002± 0,0002 0,006± 0,0013

Нефтешлам + «Фузарин» + система аэрации 2,0± 0,2 98,0± 16,2 146,7± 20,0 320,0± 29,0 460,0± 28,3 420,0± 33,5 360,0± 35,0 306,7± 32,9

Известно, что активности дегидрогеназы и каталазы значительно коррелируют с дыханием почвы. Поэтому по активности этих ферментов можно

косвенно судить об нефтеокисляющей активности микроорганизмов.

Анализ данных таблицы 4 показал, что внесение «Фузарина» позволило повысить дегидрогеназную активность нефтешлама. При очистке нефтешлама с помощью «Фузарина» и системой аэрирования на 270 сут. дегидрогеназная активность составила 0,23 мг формазана/(1г грунта за 24 ч) по сравнению с 0,09 мг формазана/(1 г грунта за 24 ч) контроля (таблица 4).

Таблица 4 - Динамика активности дегидрогеназы в нефтешламе

Вариант Активность дегидрогеназы, мг формазана/1 г почвы за 24 ч

0 сут. 30 сут. 60 сут. 90 сут. 120 сут. 150 сут. 180 сут. 270 сут. 360 сут.

Чистая почва (контроль) 0,23 0,21 0,24 0,21 0,18 0,20 0,21 0,17 0,20

Нефтешлам без «Фузарина» и системы аэрации (контроль) 0,07 0,07 0,09 0,09 0,07 0,10 0,08 0,09 0,10

Нефтешлам + «Фузарин» + система аэрации 0,07 0,13 0,18 0,23 0,21 0,21 0,14 0,23 0,20

При этом наблюдалось также повышение и каталазной активности.

В опыте с «Фузарином» и системой аэрирования при высокой численности и активности гетеротрофных микроорганизмов, значительную часть которых на протяжении всего эксперимента составляли интродуцированная ассоциация Fusarium sp. № 56 я Thiobacillus sp., наблюдалось повышение степени биодеградации нефти и нефтепродуктов в нефтешламе по сравнению с контролем. Результаты исследований приведены на рисунке I.

180 IM J50 МО

Врвмя,суг.

□Контроль; нвфтешлам Бол Фузэринанжстема аэрацми □ Нефтешлам* Фузарин+сисгема аэрацми -

Рисунок 1 - Степень очистки нефтешлама при использовании биопрепарата «Фузарин».

Как видно из полученных результатов (рис. 1) в опыте с внесением активных нефтеокисляющих микромицетов в составе биопрепарата «Фузарин» наблюдался устойчивый прирост микромицетов в нефтешламе. Так, уже на 90 сут. в опыте с «Фузарином» степень биодеструкции составила в среднем 38%, тогда как в контроле - 10%. В дальнейшем степень биодеструкции нефти и нефтепродуктов возросла и составила на 360 сут. 90,8% для опыта с «Фузарином» и с системой аэрирования, а в контроле - 20,0 %.

Известно, что аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы и нитрифицирующие бактерии наиболее чувствительны к загрязнению почвы нефтью и длительное время испытывают ее угнетающее воздействие, отвечая на это уменьшением численности микробных клеток. В результате подсчета численности аэробных целлюлозоразрушающих и нитрифицирующих микроорганизмов видно, что при применении «Фузарина» и системы аэрирования процесс очистки нефтешлама от нефти и нефтепродуктов происходит более интенсивно в любой период времени по сравнению с контролем без «Фузарина» и без аэрирования. При применении «Фузарина» и системы аэрирования содержание нитрифицирующих микроорганизмов в нефтешламе на 540 сут. достигло уровня 56,9x10'' кл/г а.с.п., а аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов — 3,2x10' кл/г а.с.п., в то время как в контроле только 0,05х104 и 0,03х103 кл/г ах.п. соответственно.

Таким образом, в результате использования биопрепарата «Фузарин» за 540 сут. достигнута высокая степень очистки (99,7 %) высокосернистого неф-тешлама от нефти и нефтепродуктов.

5.1 Оценка необходимости дополнительного внесения биопрепарата «Фузарин», биостимулятора (биотрин) и минеральной добавки (диаммофос)

Численность интродуцированных микроорганизмов в нефтезагрязненной почве может со временем уменьшаться. Анализ гетеротрофных: микроорганизмов, к которым относятся Fusarium sp. № 56тл Thiobacillus sp., показал, что их численность в нефтешламе в с «Фузарином» и системой аэрирования (таблица 3) достигла максимума на 210 сут. (460,3 млн. кл/г). Через 210 сут. количество микроорганизмов, растущих на МПА, стало снижаться, но это уменьшение было постепенным (таблица 3).

На промежутке 150-180 суток наблюдалось снижение дегидрогеназной на 33,0% (таблица 4) и каталазной (на 20,6%) активностей в опыте с «Фузари-ном» и системой аэрирования. Анализ содержания азота (таблица 5) показал низкую обеспеченность азотом нефтешлама: содержание аммонийной формы азота на 180 сут. составило только 6,1 мг/кг в опыте с «Фузарином» и системой аэрирования.

Таблица 5 - Содержание Ы-№1( в нефтешламе при биоочистке от нефти и нефтепродуктов биопрепаратом «Фузарин»__

Вариант Содержание N-NTL», мг/кг

0 сут. 150 сут. 180 сут. 210 сут. 270 сут. 360 суг.

Неф гбшлам без «Фузари-на» и системы аэрации (контроль) 1,2 1,1 1,0 - 1,3 1.0

Нефтсшлам + «Фузарин» + система аэрации 260,0 16,7 6,1 180,2 87,1 16,0

Поэтому после 180 сут. культивирования предлагается внести биотрин и диаммофос по 0,25% масс.

6 Разработка принципиальной технологической схемы получения биопрепарата «Фузарин» на основе микромицета Fusarium species № 56

Разработана технология производства биопрепарата «Фузарин» на основе непатогенных микроорганизмов микромицета Fusarium species № 56и тиобак-терии Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1, кроме того, в качестве стимулятора роста в состав биопрепарата был введен биотрин (0,1 -1 % масс).

Биопрепарат «Фузарин» предназначен для очистки нефтешламов, почвы и воды от высокосернистой нефти и нефтепродуктов.

В технологии производства биопрепарата «Фузарин» из-за физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp предусматриваются 2 линии производства

Описание технологической схемы производства 1-й линии на основе микромицета Fusarium sp. №56

Технологический процесс производства биопрепарата является периодическим. Он состоит из следующих стадий:

1) приготовление раствора питательных солей;

2) выращивание чистой культуры микроорганизмов;

3) выращивание биомассы в производственных ферментаторах;

4) сгущение биомассы с помощью фильтра;

5) сушка и упаковка готового продукта.

Подобная принципиальная схема предлагается и для производства Thiobacillus sp.

Для получения биопрепарата «Фузарин» сухая биомасса 2-х линий смешивается в соотношении 4 {Fusarium sp. № 56) : 1 {Thiobacillus sp.) и добавляется биотрин в количестве 1% масс.

7 Опытно-промышленные испытания биопрепарата «Фузарин» на

основе нефтеокисляющего микромицета Fusarium sp.№56u

Thiobacillus species

Объекты исследований

8 условиях Крайнего Севера в Тюменской области в районе г. Пыть-Ях 22 июня 2001 г, где наблюдается резко континентальный климат (резкие колебания температуры и влажности), была проведена обработка жидким биопрепаратом «Фузарин» почвы и углеродного сорбента, которые загрязнены нефтью и нефтепродуктами. Начальное количество нефти в контрольных пробах составило в среднем 0,483 г/г почвы. Содержание общей серы в отобранных образцах не превышала 0,25 % масс. В данном биопрепарате в качестве микробного компонента использовалась ассоциация микромицета Fusarium species № 56 и тиобактерии Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1, кроме того, в качестве стимулятора роста в состав биопрепарата был введен биотрин (0,1 -0,5 % масс).

Обработка образцов углеродного сорбента и песчано-лесного грунта проводилась в 5 картах площадью 1 м2 и высотой 10-15 см.

Периодически проводили рыхление и при необходимости — орошение.

О результатах биоочистки судили по остаточному количеству нефти, которое определяли но известной методике, измеряя количество нефти весовым методом, а также судили косвенно - по приросту микроорганизмов. Количество микроорганизмов определяли чашечным методом Коха.

Через 3 месяца были отобраны пробы из 5 карт. Данные результатов ана лиза приведены в таблице 6. Начальное количество нефти в контрольных пробах (карты № 1 и 4) составило 0,483 и 0,294 г/г, соответственно.

Таблица 6 - Результаты биоочистки «Фузарином» образцов углеродного сорбента и почво- грунта, загрязненных нефтью

Таким образом, опытно-промышленные испытания показали высокую эффективность биопрепарата «Фузарин». Так за 1 вегетационный период (90 сут.) максимальный эффект очистки почво-грунта составил 68,4 % (проба №5): углеродного сорбента с добавками лесной почвы - 57,8%. Наряду со снижение содержания углеводородов в отобранных образцах наблюдалось снижение содержания общей серы с 0,25% до 0,07 % масс.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Выявлены новые свойства нефтеокисляющего микромицета Fusarium species № 56 биодеградировать сераорганические соединения класса сульфид< (дигексилсульфид, бутилгексилсульфид, этилдецилсульфид, фенилгексилсуль фид, фенилбутилсульфид, этилбензилсульфид, фенилпропилсульфид), дисуль

фидов (дибутилдисульфид, диамилдисульфид, диизопроиилдисульфид) и гет-рагадротиофена.

2. Изучен начальный этап биодеструкции фенилпропилсульфида посредством ассоциации нефтеокисляющего микромицета Fusarium species №56 и Thiobacillusspecies, взятых в соотношении 4:1. Выявлено, что при расщеплении фенилпропилсульфида образуется бензол.

3. Выявлено, что микромицет Fusariian sp №56 способен биодеградиро-вать как легкую, так и тяжелую фракции высокосернистой нефти (НГДУ Южарланнефть РБ) с общим содержанием серы 2,3% в водной среде и использовать ее в качестве источника углерода и энергии.

4. Предложена технология биодеградации высокосернистого нефтешлама с помощью биопрепарата «Фузарин». Внесение различных добавок (биотрин 0,25% масс, диаммофос 0,25% масс.) и использование системы аэрирования позволило на модельной установке, в которой послойно расположены песок, нефтешлам (содержание нефти до 11% масс.) с добавками опилок, чернозем, за 540 сут. достигнуть высокой степени очистки 99,7%.

5. Предложена принципиальная схема производства биопрепарата «Фузарин» на основе микромицета Fusarium species № 56 и Thiobacillus species. В технологии производства биопрепарата «Фузарин» из-за физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов Fusarium sp. №56и Thiobacillus sp. предусматриваются 2 линии производства. Технологический процесс производства биопрепарата является периодическим. Он состоит из следующих стадий: приготовление раствора питательных солей; выращивание чистой культуры микроорганизмов; выращивание биомассы в производственных ферментаторах; сгущение биомассы с помощью фильтра (для Fusarium sp. №56) и с помощью сепаратора (для Thiobacillus sp); сушка и упаковка готового продукта. Для получения биопрепарата «Фузарин» сухая биомасса 2-х линий смешивается в соотношении 4 (Fusarium sp. № 56) : 1 {Thiobacillus sp.) и добавляется биотрин в количестве 1% масс.

6. Проведены опытно-промышленные испытания биопрепарата «Фузарин» на основе нефтеокисляющего микромицета Fusarium sp. №56 и Thiobacillus species в условиях Крайнего Севера (в Тюменской области в районе г. Пыть-Ях) с резко континентальным климатом и высокой влажностью. Была проведена обработка почвы и углеродного сорбента жидким биопрепаратом «Фузарин», загрязненных сернистой нефтью и нефтепродуктами. Степень очистки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами за вегетационный период (90 сут.) составила 68,4 %, при этом содержание общей серы снизилось с 0,25 до 0,07% масс.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Патент РФ № 2126041. Штамм микромицета Fusarium species №56 для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / Г.Г. Ягафарова, Э.М. Гатауллина, В.Б. Барахнина, И.Р. Ягафаров, А.Х. Сафаров // Изобретения. -1999.-№4.-С. 593.

2. Патент РФ № 2179953. Способ очистки сточных вод от нефти и нефтепродуктов / Г.Г. Ягафарова, В.П. Сафронов, В.Б. Барахнина, И.Р. Ягафаров, Э.М. Гатауллина, А.Х. Сафаров // Изобретения. - 2002. - № 6.

3. Применение микроорганизмов для очистки буровых отходов от СЖК / М.Р. Мавлютов, Р.А Мулюков, Э.М. Гатауллина, Т.Д. Дихтярь, А.Х. Сафаров // Всероссийская конференция по химическим реактивам «Реактив-97». - Тез. докл. - Уфа, 1997. - С. 214.

4. Влияние физико-химических факторов на рост нефтеокисляющих микроорганизмов / Г.Г. Ягафарова, А.Г. Бикчентаева, В.Б. Барахнина, А.Х. Сафаров // Материалы 49-й науч.-техн. конф. студ., аспир. и мол. ученых УГНТУ. -Уфа, 1998.

5. Гатауллина Э.М., Барахнина В.Б., Сафаров А.Х. Штамм микроми-цета Fusarium sp. №56, используемый для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов // II Республиканский конкурс научных работ студентов вузов РБ «Безопасность жизнедеятельности». - Тез. докл. - Уфа, 1998. - С. 12-13.

.. 6. Перспективы применения Fusarium specium №56 в очистке почвы и воды от нефти, нефтепродуктов и отработанных буровых отходов / Г.Г. Ягафарова, Э.М. Гатауллина, А.Х. Сафаров, В.Б. Барахнина//Конф. «И.П.Павлов и современные проблемы биологии и медицины». - Тез. докл. - Уфа, 1999. - С. 36.

7. Особенности действия экотоксикантов на клетки бактерий / Г.Г. Ягафарова, В.Б. Барахнина, Е.Г. Ильина, А.Х. Сафаров // Всероссийская конференция по химическим реактивам «Реактив - 99». - Тез. докл. - Уфа, 1999. -С. 116.

8. Технология биоочистки нефтешламов и буровых отходов / Г.Г. Ягафарова, М.Р. Мавлютов, Е.Г. Ильина, В.Б. Барахнина, Э.М. Гатауллина, И.Р. Ягафаров, А.Х. Сафаров // Материалы второй Всероссийской научно-практической конференции «Отходы 2000». - Уфа, 2000. - Ч.З. - С. 63-73.

9. Биорекультивация нефтезагрязненной почвы / Г.Г. Ягафарова, Е.Г. Ильина, В.Б. Барахнина, Э.М. Гатауллина, А.Х. Сафаров // Материалы второго Международного симпозиума «Наука и технология углеводородных дисперсных систем». - Уфа, 2000. - Т.2, - С. 247-248.

10. Ягафарова Г.Г., Гатауллина Э.М., Барахнина В.Б., Сафаров А.Х., Ильина Е.Г. Оценка экотоксического действия зарубежных и отечественных буровых реагентов / Г.Г. Ягафарова, Э.М. Гатауллина, В.Б. Барахнина, А.Х. Сафаров, Е.Г. Ильина // Башкирский экологический вестник. - 2000.- №2 (9). -С. 36-38.

11. Новый нефтеокисляющий микромицет Fusarium sp. IГ.Г. Ягафаро-ва, Э.М. Гатауллина, В.Б. Барахнина, И.Р. Ягафаров, А.Х. Сафаров // Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. - Т.37. - №1. - С. 77-79.

12. Ягафарова Г.Г. Ляпина Н.К., Сафаров А.Х. Изучение биодеградации некоторых сульфидов // Международная конференция по химическим реактивам «Реактив - 2001» . - Тез. докл. - Уфа, 2001. - С. 74-75.

13. Ляпина Н.К., Ягафарова Г.Г., Сафаров А.Х. Изучение процесса биодеструкции некоторых сульфидов // Школа-семинар "Химическая экология". - Тез. докл. - Уфа, 2001. - С. 182.

14. Биодеструкция некоторых сульфидов нефти / Н.К. Ляпина, Г.Г. Ягафарова, В.Б. Барахнина, А.Х. Сафаров // Материалы научно-практической конференции «Промышленная экология: Проблемы и перспективы». - Уфа, 2001.-С. 84-85.

15. A New Oil-Oxidizing Mycromycete Fusarium sp. / G.G.Yagafarova, E.M. Gataullina, V.B. Barakhnina, A.Kh. Safarov, I.R. Yagafarov.// Applied Biochemistry and Microbiology. - 2001. - Vol. 37. - № 1. - pp. 68-70.

16. Использование диспергаторов для биоочистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов / ТТ. Ягафарова, В.Б. Барахнина, А.Х. Сафаров, И.Р. Ягафаров // 55-я Юбилейная межвузовская студенческая научная конференция «Нефть и газ - 2001». - Тез. докл. - Москва, 2001. - С. 27.

17. Биоремедиация нефтезагрязненной почвы / Г.Г. Ягафарова, В.Б. Барахнина, ЕТ. Ильина, А.Х. Сафаров, И.Р. Ягафаров // Материалы секции Д111 Конгресса Нефтепромышленников России "Нефтепереработка и нефтехимия: проблемы и перспективы". - Уфа, 2001. - С. 207-208.

Соискатель

Сафаров А.Х.

Подписано в печать 11.05.2004. Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Печать трафаретная. Печ. л. 1,3- Тираж 100 экз. Заказ 176.

Типография Уфимского государственного нефтяного технического университета. Адрес типографии: 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1.

*4 о 3 6 9

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Сафаров, Альберт Хамитович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Нефть, ее состав, свойства и влияние на окружающую среду

1.2. Сераорганические соединения нефти

1.3. Нефть и продукты ее переработки - источники загрязнения окружающей среды

1.4. Микроорганизмы - деструкторы нефти, нефтепродуктов и органических реагентов бурового раствора

1.4.1 Микробиологический состав загрязненных нефтью почв и воды

1.4.2 Физиолого-биохимические, морфо-популяционные особенности бактерий, утилизирующих нефтепродукты

1.5. Особенности микробиологических превращений сернистых соединений нефти

1.6. Окисление соединений серы гетеротрофными микроорганизмами

1.6.1 Видовой состав группы гетеротрофных сероокисляющих микроорганизмов

1.6.2 Физиологические особенности гетеротрофных сероокисляющих микроорганизмов

1.6.3 Биохимия гетеротрофного сероокисления

1.6.4 Роль гетеротрофов в окислении соединений серы в природных экосистемах 45 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Питательные среды

2.2. Методы исследования 51 2.2.1. Микробиологические методы

2.2.1.1 Биодеградация сераорганических соединений

2.2.1.2 Биодеградация высокосернистой нефти

2.2.2. Определение микробной биомассы в жидкой минеральной среде

2.2.3. Определение количества клеток микроорганизмов оценивали методом Коха

2.3. Приготовление сульфидного индикаторного электрода

2.4. Определение содержания сульфидной серы в нефтепродуктах методом потенциометрического титрования

2.5 Определение меркаптанной серы методом потенциометрического титрования

2.6 Метод определения дисульфидной серы

2.7 Определение остаточного количества сульфидов

2.8 Методы изучения фитотоксической активности продуктов микробиологической деградации фенилпропилсульфида в жидкой среде

2.9 Методы определения содержания нефти и нефтепродуктов

2.10 Метод биоочистки нефтешлама (донные отложения) от нефти и нефтепродуктов биопрепаратом «Фузарин» путем аэрирования

2.11 Методы определения активностей дегидрогеназы и каталазы 66 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Изучение биодеградации сераорганических соединений

3.2 Фитотоксическая активность продуктов микробиологической деградации сераорганических соединений в жидкой среде

3.3 Изучение начального этапа биодеградации фенилпропилсульфида

3.4 Исследование биодеградации высокосернистой нефти в водной среде

3.5 Технология биоочистки нефтешлама от нефти и нефтепродуктов биопрепаратом «Фузарин»

3.5.1 Оценка необходимости дополнительного внесения биопрепарата «Фузарин», биостимулятора (биотрин) и минеральной добавки (диаммофос)

4 РАЗРАБОТКА ПРИНЦИПИАЛЬНОЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА «ФУЗАРИН» НА ОСНОВЕ МИКРОМИЦЕТА FUSARIUMSPECIES №

4.1 Основные технические требования, предъявляемые к биопрепарату по

ТУ ОП 64-92-12

4.2 Описание технологической схемы производства 1-й линии на основе микромицета Fusarium sp. №

4.2.1 Приготовление раствора питательных солей

4.2.2 Выращивание чистой культуры микроорганизмов

4.2.3 Выращивание биомассы в производственных ферментаторах

4.2.4 Сгущение биомассы

4.2.5 Сушка и упаковка готовой продукции

5 ОПЫТНО-ПРОМЫШЛЕННЫЕ ИСПЫТАНИЯ БИОПРЕПАРАТА «ФУЗАРИН» НА ОСНОВЕ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩЕГО МИКРОМИЦЕТА FUSARIUM SP. № 56 И ТИОБАКТЕРИЙ ТНЮВА С ILL US SP. 95 ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 98 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100 ПРИЛОЖЕНИЕ А 111 ПРИЛОЖЕНИЕ Б 112 ПРИЛОЖЕНИЕ В 113 ПРИЛОЖЕНИЕ Г 114 ПРИЛОЖЕНИЕ Д 115 ПРИЛОЖЕНИЕ Е 117 ПРИЛОЖЕНИЕ Ж

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

УГНТУ - Уфимский государственный нефтяной технический

ПДК - предельно-допустимая концентрация

ХГЖ - химическое потребление кислорода

ВПК — биологическое потребление кислорода

ПДС - предельно-допустимые сбросы сут. - сутки

АТФ - аденозинтрифосфат

АН РБ - академия наук Республики Башкортостан УНЦ - Уфимский научный центр ИОХ - институт органической химии

РАСХН - Российская академия сельско-хозяйственных наук

ДБТ - дибензотиофен

4,6-ДМДБТ - 4,6-диметилдибензотиофен

НАДН - никотинамид адениндинуклеотид с.в. — сухое вещество

АФС - аденозин фосфосульфат об. - объемный масс. - массовый

ИК - инфрокрасная

УФ - ультрафиолетовая чда - чистый для анализов

АСВ - абсолютно сухое вещество

ОКЖ - отработанная культуральная жидкость

БОС - биологически очистные сооружения

УНС - установка непрерывной стерилизации

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биодеструкция сераорганических компонентов нефти с применением биопрепарата на основе микромицета в процессах очистки нефтешламов и загрязненных почв"

Предприятия нефтегазодобычи, нефтегазопереработки, транспорта нефти и нефтепродуктов являются основными источниками загрязнения почвы и воды нефтью и нефтепродуктами и наносят огромный урон окружающей среде. Аварийные ситуации могут приводить к многолетним экологическим катастрофам на значительных площадях, например, при авариях танкеров и нефтепроводов [1].

Попадая в окружающую среду, углеводороды нефти оказывают угнетающее действие на локальные экологические системы: губят живые организмы и существенно изменяют условия их обитания. Нефтяная пленка нарушает энерго-, тепло-, влаго- и газообмен загрязненной водной поверхности с атмосферой, изменяет цвет воды, рН, придает ей специфический вкус и запах, а главное - вызывает нарушение физиологической активности у гидро-бионтов. Обитатели морских и пресных водоемов, подвергаясь токсическому действию нефтепродуктов, обладают способностью аккумулировать их в своих тканях. Углеводороды могут затем по пищевым цепям передаваться в организм человека (например, канцерогенные полициклические компоненты нефти) и отрицательно воздействовать на его здоровье.

Проблема охраны окружающей среды от загрязнений нефтью, нефтепродуктами, а также их утилизации приобретает все большую остроту в связи с ограниченностью возможностей, а иногда и экологической небезопасностью применения для этих целей механических, физических и химических способов очистки. В связи с этим актуальной является очистка почвы и воды от нефти, нефтепродуктов и нефтешламов путем использования нефтеокис-ляющих микроорганизмов.

Биологические методы очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, основанные на применении активных микробных штаммов, проявляющих способность расти и использовать в качестве источника углерода и энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов, получили сегодня широкое развитие и применение, но недостаточно изучена биодеструкция серусодержащих компонентов нефти и очистка нефтешламов, содержащих высокосернистые соединения.

Таким образом, существует необходимость разработки эффективных методов борьбы с загрязнением воды и почвы от нефти, нефтепродуктов и нефтешлама, содержащих высокосернистые соединения. Важная роль в этом процессе принадлежит изучению биодеградации отдельных серусодержащих компонентов нефти и нефтепродуктов и разработка биопрепарата, способного окислять данные компоненты.

Актуальность проблемы. Ежегодно в мире при добыче, транспорте, хранении и использовании теряется большое количество нефти и нефтепродуктов. Попадая в окружающую среду, углеводороды нефти оказывают угнетающее действие на локальные экологические системы: губят живые организмы и существенно изменяют условия их обитания. К сожалению, помимо углеводородов в нефти и нефтепродуктах содержатся значительные количества других вредных веществ (сернистые соединения, фенол, тетраэтилсви-нец и др.). Особенно острой эта проблема является в Башкортостане и других регионах, где в основном добывается высокосернистая нефть.

Процессы восстановления природных экосистем после нефтяного загрязнения весьма продолжительны по времени, а главными агентами их самоочищения являются естественные деструкторы - углеводородокисляющие микроорганизмы.

Известно, что не все микроорганизмы способны окислять серусодер-жащие компоненты нефти. Поэтому поиск, выделение, изучение, особенности микроорганизмов, способных окислять соединения серы, является актуальной проблемой.

Цель работы - изучение особенностей биодеградации сераорганиче-ских компонентов нефти нефтеокисляющим штаммом Fusarium species № 56 и разработка технологии производства биопрепарата на основе микромицета Fusarium species М 56 и Thiobacillus species и выдача практических рекомендаций для очистки нефтешламов.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: изучение биодеградации сераорганических компонентов нефти посредством выделенного и идентифицированного нефтеокисляющего штамма микромицета Fusarium species №56 и ассоциации Fusarjum species № 56 и Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1; изучение начального этапа биодеструкции фенилпропилсульфида посредством ассоциации нефтеокисляющего микромицета Fusarium species j 56 и Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1; изучение биодеградации высокосернистой нефти в водной среде; разработка технологии биоочистки нефтешлама от нефти и нефтепродуктов биопрепаратом «Фузарин» путем аэрирования; разработка принципиальной схемы производства биопрепарата на основе микромицета Fusarium species №56 и Thiobacillus species. проведение опытно-промышленных испытаний с использованием биопрепарата «Фузарин» в условиях Крайнего Севера (Тюменская область, г. Пыть-Ях).

Научная новизна работы. Выявлены новые свойства нефтеокисляющего микромицета Fusarium species № 56 биодеградировать сераорганиче-ские соединения класса сульфидов, таких как дигексилсульфид, бутилгек-силсульфид, этилдецилсульфид, фенилгексилсульфид, фенилбутилсульфид, этилбензилсульфид, фенилпропилсульфид; дисульфидов: дибутилдисульфид, диамилдисульфид, диизопропилдисульфид и тетрагидротиофена. Установлено, что биодеструкция сераорганических соединений и высокосернистой нефти ассоциацией культур Fusarium species №56 и Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1, происходит полнее (на 20%), чем монокультурой Fusarium species № 56.

Выявлено, что при биодеструкции представителя класса сульфидов: дигексилсульфида не образуются высокотоксичные соединения такие как меркаптаны и сероводород.

Изучен начальный этап биодеструкции сераорганического соединения фенилпропилсульфида посредством нефтеокисляющих микроорганизмов ассоциации Fusarium species №56 и Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1. Выявлено, что при расщеплении фенилпропилсульфида образуется бензол.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований явились основой для разработки технологии очистки нефтещламов и биочистки почв, загрязненных нефтью путем использования биопрепарата «Фузарин», биодобавок и системы аэрирования. Разработанная технология может быть использована для очистки почвы и воды от высокосернистой нефти, нефтепродуктов и нефтешламов в нефтегазодобывающей и нефтегазоперера-батывающей отраслях промышленности.

Предложена принципиальная схема производства биопрепарата «Фузарин» на основе микромицета Fusarium species №56 и Thiobacillus species, включающая 2 линии производства.

В результате промышленных испытаний по ликвидации нефтяных загрязнений в Тюменской области в районе г. Пыть-Ях, в условиях Крайнего Севера с резко континентальным климатом и высокой влажностью, показано, что биопрепарат «Фузарин» способен очищать почву, загрязненную нефтью и нефтепродуктами. Степень биодеградации за вегетационный период (90 сут.) составила 68,4 %, при этом содержание общей серы снизилось с 0,25 до 0,07% масс.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XIV Международной научно-технической конференции «Реактив - 2001», Уфа, 2001; на Школе-семинаре "Химическая экология", Уфа, 2001, на научно-практической конференции «Промышленная экология: Проблемы и перспективы», Уфа, 2001, на XIV Международной научно-технической конференции «Перспективные процессы и продукты малотоннажной химии», Выпуск 5, Уфа: 2001, на 50, 51, 52, 53-й научнотехнических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых УГ-НТУ, Уфа, 2000-2003 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе получено 2 патента РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методики, экспериментальной части, главы «Разработка принципиальной технологической схемы получения биопрепарата «Фузарин» на основе микромицета Fusarium species № 56», главы «Опытно-промышленные испытания биопрепарата «Фузарин» на основе нефтеокисляющего микромицета Fusarium sp. № 56 и Thiobacillus sp.», выводов, списка литературы и приложений, включает 16 таблиц, 9 рисунков. Список литературы включает 115 литературных источников, в том числе иностранных - 28.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Сафаров, Альберт Хамитович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Выявлены новые свойства нефтеокисляющего микромицета Fusarium species № 56 биодеградировать сераорганические соединения класса сульфидов (дигексилсульфид, бутилгексилсульфид, этилдецилсульфид, фенилгексилсуль-фид, фенилбутилсульфид, этилбензилсульфид, фенилпропилсульфид), дисульфидов (дибутилдисульфид, диамилдисульфид, диизопропилдисульфид) и тет-рагидротиофена.

2. Изучен начальный этап биодеструкции фенилпропилсульфида посредством ассоциации нефтеокисляющего микромицета Fusarium species N2 56 и Thiobacillus species, взятых в соотношении 4:1. Выявлено, что при расщеплении фенилпропилсульфида образуется бензол.

3. Выявлено, что микромицет Fusarium sp. №56 способен биодеградировать как легкую, так и тяжелую фракции высокосернистой нефти (НГДУ Южарланнефть РБ) с общим содержанием серы 2,3% в водной среде и использовать ее в качестве источника углерода и энергии.

4. Предложена технология биодеградации высокосернистого нефтешлама с помощью биопрепарата «Фузарин». Внесение различных добавок (биотрин 0,25% масс., диаммофос 0,25% масс.) и использование системы аэрирования позволило на модельной установке, в которой послойно расположены песок, нефтешлам (содержание нефти до 11% масс.) с добавками опилок, чернозем, за 540 сут. достигнуть высокой степени очистки 99,7%.

5. Предложена принципиальная схема производства биопрепарата «Фузарин» на основе микромицета Fusarium species № 56 к Thiobacillus species. В технологии производства биопрепарата «Фузарин» из-за физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов Fusarium sp. №56 и Thiobacillus sp. предусматриваются 2 линии производства. Технологический процесс производства биопрепарата является периодическим. Он состоит из следующих стадий: приготовление раствора питательных солей; выращивание чистой культуры микроорганизмов; выращивание биомассы в производственных ферментаторах; сгущение биомассы с помощью фильтра (для Fusarium sp. №56) и с помощью сепаратора (для Thiobacillus sp); сушка и упаковка готового продукта. Для получения биопрепарата «Фузарин» сухая биомасса 2-х линий смешивается в соотношении 4 (Fusarium sp. № 56) : 1 (Thiobacillus sp.) и добавляется био-трин в количестве 1% масс.

6. Проведены опытно-промышленные испытания биопрепарата «Фузарин» на основе нефтеокисляющего микромицета Fusarium sp. №56 и Thiobacillus species в условиях Крайнего Севера (в Тюменской области в районе г. Пыть-Ях) с резко континентальным климатом и высокой влажностью. Была проведена обработка почвы и углеродного сорбента жидким биопрепаратом «Фузарин», загрязненных сернистой нефтью и нефтепродуктами. Степень очистки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами за вегетационный период (90 сут.) составила 68,4 %, при этом содержание общей серы снизилось с 0,25 до 0,07% масс.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Сафаров, Альберт Хамитович, Казань

1. Ягафарова Г.Г. Экологическая биотехнология в нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности: Учеб. пособие. Уфа: Изд-во УГНТУ, 2001.-214 с.

2. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы деструкторы нефти в водных бассейнах. - Киев: Наукова думка, 1981. - 132 с.

3. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем // Под. ред. М.А. Глазовской. М.: Наука, 1988. - 254 с.

4. Сергиенко С.Р., Таимова Б.А., Талалаев Е.И. Высокомолекулярные неуглеводородные соединения нефти. М.:Наука, 1970. - 270 с.

5. Андресон Р.К. Биотехнологические методы ликвидации загрязнений нефтью и нефтепродуктами. М.: ВНИИОЭНГ, 1993. - 24 с. - (Обзор, информ. Сер. Защита от коррозии и охрана окружающей среды).

6. Киреева Н.А., Кузяхметов Г.Г. Способы ускорения биологического разрушения нефтяных углеводородов в почве: Тез. докл. научн. конф. "Университеты России". Уфа, 1995. - С. 61-62.

7. Шустов С.Б., Шустова JI.B. Химические основы экологии. М.: Просвещение, 1995. - 239 с.

8. Иоками Э.Г., Гербер В.Я., Губанова Г.Д. Доочистка биологически очищенных сточных вод НПЗ биосорбционным методом: Тез. докл. межд. конф. "Проблемы защиты окружающей среды на предприятиях нефтепереработки и нефтехимии". Уфа, 1997. - 92 с.

9. Шицкова А.П., Новиков Ю.В., Гурвич JI.C., Климкина Н.В. Охрана окружающей среды в нефтеперерабатывающей промышленности. М.: Химия, 1980.- 176 с.

10. Биохимическая очистка сточных вод предприятий химической промышленности. -М.: ГСИ, 1962. 232 с.

11. Смирнов Д.Н., Дмитриев А.С. Автоматизация очистки сточных вод химической промышленности. Л.: Химия, 1972. - 168 с.

12. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. -М.: Наука, 1988.-254 с.

13. Наметкин С.С. Химия нефти. Изд. 2-е. ГОНТИ, 1939. 250 с.

14. Сергиенко С.Р. Высокомолекулярные соединения нефти. М.: Гос-топтехиздат, 1959. — 412 с.

15. Великовский А.С., Павлова С.Н. Советские нефти. М.: Гостоптехиз-дат, 1947.-20 с.

16. Большаков Г.Ф. Сераорганические соединения нефти. Новосибирск: Наука, 1986.-245 с.

17. Мельникова Л.А., Ляпина Н.К., Карманова Л.П. и др. // Нефтехимия. -1978. т. 18, №2. - с. 899-906.

18. Solans А.М., Pares R. Degradation of aromatic petroleum hydrocarbons by pure microbial cultures //Chemochera. 1984. - V. 13, №5. - P. 593-601.

19. Settl L., Rossi M., Lanzarini G., Pifferi P.G. The effect of n-alkanes in the degradation of dibenzothiophene and of organic sulfur compounds in heavy pil by a Pseudomonas sp. // Biotechnol. Lett. 1992. - 14, №6 - P. 515-520.

20. A.C. СССР, МКИ C02 3/34 F 1/20. Штамм бактерий Bacillus subtilis, осуществляющий деградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты/ Т.В. Мар-кушева, B.C. Никитина, И.Н. Скворцова, Г. Г. Ягафарова, Р.Н. Хлесткин// Изобретения. 1992, №23. - С. 112.

21. Rontany J. F., Bosser-JoulakF., Rambeloarison E., Bertrans J. C., Guisfi C. Analitycal study of Asthart cruide oil asphaltens bio-degradation // Chemoshere. -1985, №14, №9. P. 1413-1422.

22. Davies J.M., Addy J.M., Blackman R.A., Blanchard J.R. at all Environmental effects of the use of oil-based drilling muds in the North sea //Marine pollution bulletin, 1984. - P. 363-370.

23. Биоповреждения /под. ред. В.Д. Ильичева, М.: Высш. шк., 1987. - С. 252-294.

24. Исмаилов Н.М. Влияние нефтяного загрязнения на круговорот азота в почве //Микробиология. 1983. - Т.52, №6. - С. 1003-1007.

25. Ягафарова Г.Г. Разработка биотехнологии очистки почвы и воды от некоторых хлорфенольных соединений и углеводородов нефти: Дис. на соискание уч. ст. д-ра технических наук. Уфа, 1994.

26. Jobson А. М., Cook F.D., Westlak D.W. Microbial utilization by marine hydrocarbonodactic bacteria //Biotechnol. and Bioeng. 1973, №2. - 285 p.

27. Исмаилов Н.М. Биодеградация нефтяных углеводородов в почве, ин-нокулированной дрожжами //Микробиология. 1985. - №5. - С. 835-841.

28. Martines J. М., Farreras J.H. Impact and health concequences of microbiological contamination of water in the treatment plants of the Lobregat River Basin// Int. conf. on Environmental pollution, Sept. 1993, Sitges (Barselona), - 1993. -Vol.1.-p. 361.

29. Sarkar A. Isolation and characterization of thermophilic, alkaliphilic, ctllu-lose-degrading bacillus thermoalcaliphilus sp. nov. from termite (Odontotermes obe-sus) mound soil of a semiarid area //Geomicrobiol. J. 1991,№4. - P. 225-232.

30. Atagana H. Microbiological profile of crude oil in storage tanks// Environ. Monit. and Assess. 1996. - 41, №3. - P. 301-308.

31. Миронова Р.И., Носкова В.П., Расулова Г.Е., Холоденко В.П. // Биотехнология. 1996. - №7. - С. 44-48.

32. Banca-Coker М.О., Ekindayo J.A. Applicability of evaluating the ability of microbes isolated from an oil spill site to degrade oil. Environ //Motit and Assess. -1997. 45, №3. - C. 259-272.

33. Грищенков В.Г., Гаязов P.P., Токарев В.Г., Кочетков B.B. и др. Бактериальные штаммы-деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях //Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т.ЗЗ, №4. - С. 423-427.

34. Пономарева Л.В., Цветкова Н.П., Торгованова В.А., Осипов А.И. Консорциум микроорганизмов-деструкторов: Тез. докл. Всерос. конф. "Микробиология почв и земледелие". Санкт-Петербург, 1998. - 133с.

35. Stewart R.S., Emmons С., Porfirio D., Wiggers R.J. Distribution of multiple oil tolerant and oil degrading bacteria around a site of nutrial crude oil seepage// Tex. J. Sci. 1997. - 49, №4. - P. 339-344.

36. Гузев B.C., Халимов Э.М. Волде М.И. и др. Регуляторное действие глюкозы на активность углеводородокисляющих микроорганизмов в почве //Микробиология. 1997. -Т.66, №2. - С. 154-159.

37. Ягафарова Г.Г., Скворцова И.Н. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erythropolis AC-1339 Д //Прикладная биохимия и микробиология. 1996. -Т.32, №2. - С. 224-227.

38. Корнелли Т.В., Комарова Т.И. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью //Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т.ЗЗ, №2. - С. 198-201.

39. Ivanov V.N., Kachur T.L. at all. Degradation of the oil hydrocarbons by thermophilus denitrifying bacteria//Microbiol. 1995. -57, №2. -P. 85-94.

40. Bacteries marines pour depolluer// Biofutur. 1996, №156. - P. 15-16.

41. Емцев B.T., Селицкая O.B., Алехин В.Г. Новый микробный биопрепарат "Псевдомин" для рекультивации почв, загрязненных нефтепродуктами: Тез. докл. Всерос. конф. "Микробиология почв и земледелие". Санкт-Петербург, 1998. - С. 133.

42. Atlas R.M., Bartha R. Biodegradation of petroleum in sea water at low temperatures //Can. I. Microbiol. 1972. -Vol. 18, №12. - P. 1851.

43. Соловых Т.Н. Характеристика бактериопланктона реки Урала в районе г. Оренбурга //Микробиология. 1973. - Т.42, № 2. - С. 336.

44. Кудрявцев В.М. Бактериальная способность окисления углеводородов нефтепродуктов в водохранилищах Волги //Водные ресурсы. 1978, №5. - С. 209.

45. Гусев М.В., Линькова М.А., Коронешли Т.В. Влияние нефтяных углеводородов нарост цианобактерий //Микробиология. -1982. Т. 51, №6. - С. 932.

46. Гусеев М.В., Коронешли Т.В. Физиолого-биохимические свойства микробиологического окисления нефтепродуктов в море //Человек и биосфера. -М., 1982.-№7.-С. 20-34.

47. Лебед Л.А. Изучение влияния некоторых факторов на процесс окисления нефти //Экология моря. Киев, 1986. - №2. - С. 79-82.

48. Atagana Harrison Iteanyichukwi Microbiological profile of crude oil in storage tanks //Environ. Monit. and Assess. -1996. 41, №3. - P. 301-308.

49. Ягафарова Г.Г. Биотехнология очистки сточных вод и почвы от загрязнения нефтью, продуктами химии и нефтехимии. М.: ВНИИОЭНГ, 1994. -24 с. - (Обзор, информ. Сер. Защита от коррозии и охрана окружающей среды).

50. Пат. РФ №2019527 МКИ (51) С 02 F 3/34, Е 02 В 15/04 Новый способ очистки почв от нефтяных загрязнений // Изобретения, 1994, №4, - С. 51.

51. Пат. РФ №2093478 МКИ (51) С 02 F 3/34, В 09 С 1/10 Способ очистки почвы и воды от нефти, нефтепродуктов и полимерных добавок в буровой раствор // Изобретения, 1997, №5, - С. 32.

52. Ягафарова Г.Г., Мавлютов М.Р., Гатауллина Э.М. Биодеструкция нефти и полимеров в отходах буровых растворов //Нефтяное хозяйство. 1996. -№4.- С. 86-87.

53. Пат. 785357, МКИ С 12 15/00 Кузнецова В.Д., Зайцев Т.А., Вейсман Я.И., Вакулико JI.B. Штамм Streptomyces albixiolis "С", используемый для очистки сточных вод от нефти и нефтепродуктов //Открытия. Изобретения. 1983, №5. - 121 с.

54. Таранова Л.В., Жданова Е.Б. Влияние бактерий и дрожжей на биохимическое окисление нефти: Тез. докл. Междунар. науч.-техн. конф. "Нефть и газ Западной Сибири". Тюмень, 1996. - С. 126.

55. Герасимов В.Н., Ермоленко З.М., Штучная Г.В. и др. Физиологические, ультраструктурные, морфо-популяционные особенности бактерий Mycobacterium flavescens, утилизирующих нефтепродукты //Биотехнология. -1996. №5.-С. 17-24.

56. СтабниковаЕ.В., Селезнева М.В. и др. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв //Прикладная биохимия и микробиология. 1995. -Т.31, №5. -С. 537-539.

57. Van Dyke Michele Т., Lee Hung, Trevors Jack T. Applications of microbial surfactans //Biotechnol. Adv. 1991. - Vol. 9, №2. - P. 241-252.

58. Андресон P.K. Биотехнологические методы ликвидации загрязнений почв нефтью и нефтепродуктами. М.: ВНИИОЭНГ, 1993. - с. 24.- (Обзор, ин-форм. Сер. Защита от коррозии и охрана окружающей среды).

59. Oberbremer A., Multer-Hurtig R. Aerobic step wise hydrocarbon degradation and formation of biosurfactans by organical soil population in a stirred reactor //Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1989. - Vol. 31, №5 - P. 582-589.

60. Francy D.S., Thomas J.M., Raymond R.L., Ward C.H. Emulsification of hydrocarbons by subsurfase bacteria //J. Ind. Microbiol. 1991. - Vol. 8, №4. - P. 237-246.

61. Rocha C., Infante C. Enhanced oil sluge bioremediation by a biosurfactant isolated from Pseudomonas aeruginosa USB-CS1 //10-th Int. Conf. Glob. Impacts Appl. Microbiol, and Biotechnol., Elsinore, 6-12 Aug. 1995. P. 115.

62. Genet G. Bacterium livin in petroleum //Eng. and Biotechnol. Monit. -1995.-2, №3.-P. 65.

63. Фомченко B.M., Холоденко В.П., Ирхина И.А., Петрухина Т.А. Влияние загрязнения водной среды нефтью и нефтепродуктами на барьерные свойства цитоплазматических мембран бактериальных клеток //Микробиология. -1998. Т. 67, №3. - С. 333-337.

64. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды, М.: Мир, 1987.411 с.

65. Шицкова А.П., Новиков Ю.В., Гурвич Л.С., Климкина Н.В. Охрана окружающей среды в нефтеперерабатывающей промышленности. М.: Химия, 1980.-176 с.

66. Dyreborg S., Arvin Е., Broholm К. Concomitant aerobic biodegradation of benzene and thiophene // Environ. Toxicol and Chem. 1998. — 17, № 5. - p.851-858.

67. Окисление сульфида и элементарной серы до тетратионата хемоорга-ногетеротрофными бактериями / Под ред. Сорокина Д.Ю. // Микробиология. -1996. №1. - С.5-9.

68. Сулейманов Р.А., Галиев М.А., Галимханов Р.Г. // Медицина труда и промышленная экология 1996. - №6. - С.36-37.

69. Daniel P. Chang Biodegradation of Mercaptans. Enviro. Toxicol and Chem. 1998. - 17, №1. - p. 751-758.

70. Финкелыптейн З.И., Баскунов Б.П., Вавилова Л.Н., Головлева Л.А. Превращение дибензотиофена микроорганизмами. // Микробиология. 1997. -№4.-С. 481-487.

71. Микробная деградация дибензотиофена Nocardiodes // Биология. -1996.-№7.-191 с.

72. Degradation of dibenzothiophene sulfoxide and sulfone by Arth. Strain DBTS1. // Sato Hidroyuki, ClarkDavide. /Microbios. 1995. - 336. -p.145-159.

73. Zhang A., Han S., Ma J. Aerobic biodegradation of aromatic sulfur-containing compounds and effect of chemical structures // Chemosphere. 1998. -36, №15.-p. 3033-3041.

74. Kelly D.P., Kuenen J.G. Ecology of the colourless sulfur bacteria / Aspects of Microbial Metabolism and Ecology / Ed. J.A.Good. N.Y.: Acad. Press., 1984. P. 211.

75. Kelly D.P. Physiology and biochemistry of unicellular sulfur bacteria / Autotrophic bacteria/Ed. H.G. Schlegel. Madison Wi: Springer Verland., 1989. -P.211.

76. Friedrich C, Mitrenga G. Oxidation of thiosulfate by Paracoccus Denitrifi-cans and other hydrogen bacteria / FEMS Microbial. Lett. 1981. V. 10. P.209.

77. Kipke G.A., Enermark J.H., Sunder R.A. Purification of prosthetically intact sulfite oxidase frome chiken liver using a modified procedure / Arch. Biochem. Biophys. 1989. V. 270. -P.383.

78. Сорокин Д.Ю. Окисление соединений серы гетеротрофными микроорганизмами. Изв. АН СССР. Сер. биол. 1991. №4 558 с.

79. Сорокин Д.Ю. Бактериальное окисление тиосульфата в Черном море / Изв. АН СССР. Сер. биол. 1991. Т.24. 100 с.

80. Киреева Н.А. Микрофлора почв Башкирии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Ботанические исследования на Урале. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. - с.23-26.

81. Сорокин Д.Ю. Окисление соединений азота гетеротрофными микроорганизмами / Успехи микробиологии. 1990. - Т. 59. - 26 с.

82. Оболенцев Р.Д., Машкина А.В. Гидрогенолиз сераорганических соединений нефти. М.: Гостоптехиздат, 1961. - 145 с.

83. Патент РФ № 2126041 // Штамм микромицета Fusarium species №56 для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Ягафарова Г.Г., Гатаул-лина Э.М., Барахнина В.Б., Ягафаров И.Р., Сафаров А.Х. // Изобретения. -1999.-№4.-С. 593.

84. Теппер В.З., Шильникова Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1983.-211 с.

85. Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова. М.: Моск. унт, 1976.-307 с.

86. Руководство к практическим занятиям по микробиологии // Под ред. Н.С. Егорова. -М.:МГУ, 1983.-С.210.

87. Гатауллина Э.М. Биотехнологический способ очистки буровых отходов от нефти и полимерных реагентов: Дисс. . канд. техн. наук. Уфа. - 1996. -185.

88. Лурье Ю.Ю. Унифицированные методы анализа вод. М.: Химия, 1973.-376 с.

89. Барышников Л.М., Грищенков В.Г., Аринбасаров М.У. и др. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т.37. - №5. - С. 542-547.

90. Берне Ф., Кордонье Ж. Водоочистка / Перевод с француз, под ред. к.х.н. И.А. Роздина и к.х.н. Е.И. Хабаровой. М.: Химия, 1997. - 288 с.

91. Ягафарова Г.Г., Гатауллина Э.М. и др. Испытания биопрепарата "Ро-дотрин" для ликвидации нефтяных загрязнений // Башкирский химический журнал. 1995. - Т.2, №3-4. - С. 69 - 70.

92. Ягафарова Г.Г., Хлесткин Р.Н., Барахнина В.Б. Испытания биопрепарата "Родотрин" для ликвидации нефтяных загрязнений на территории Татарстана//Нефтехимия и нефтепереработка. 1998. -№7 - С. 21-23.

93. Агрохимические методы исследования почв. -М.: Наука, 1975.676с.

94. Аристовская Т.В., Владимирская М.Е., Голлербах М.М и др. Большой практикум по микробиологии. М.: Высшая школа, 1962. - 491 с.

95. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв. -М.: Наука, 1976.177 с.

96. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. М.: Наука, 1989. - 288 с.

97. Исмаилов Н.М. Влияние нефтяного загрязнения на круговорот азота в почве // Микробиология. 1983. - Т.52. - №6. - С. 1003 - 1007.

98. Киреева Н.А., Ямалетдинова Г.Ф., Мифтахова A.M. и др. Комплексная система показателей биологической активности почв для индикации токсичности нефтяных загрязнений // Башкирский экологический вестник. 2000.- №2 (9). С. 26 - 29.

99. Тейт Р. Органическое вещество почвы. М.: Мир, 1991. - 399 с.

100. К.Наканиси Инфракрасные спектры и строение органических соединений. М.: Мир, 1965. - 209 с.

101. Оболенцев Р.Д., Байкова А.Я. Сераорганичесьсие соединения нефтей Урало-Поволжья и Сибири. М.:Наука, 1973. - 264 с.

102. Грей Дж. Р., Дарли Г.С.Г. Состав и свойства буровых агентов (промывочных жидкостей): Пер. с англ. М.: Недра, 1985. - 509 с.

103. Сидоров Д.Г., Борзенко И.А., Милехина Е.И., Беляев С.С., Иванов М.В. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата "Деворойл" // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т.34.- №3. С. 281 -286.

104. Бортников И.И., Босенко A.M. Машины и аппараты в микробиологических производствах. М.:Высшая школа, 1982.-288с.

105. Расчеты основных процессов и аппаратов нефтепереработки. Справочник под ред. Е.Н.Судакова, 3-е издание, переработанное и дополненное, М.: Химия, 1979.

106. Зиновьев А.П. Расчет распылительной сушилки с дисковым распылителем с помощью ЭВМ. Уфа: УНИ, 1991.-25с.1. Гексан+контрол ь