Производные серосодержащих гетероциклов - антиоксиданты и блокаторы неферментативного гликозилирования белков - для коррекции экспериментального сахарного диабета

Саватеева, Екатерина Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Производные серосодержащих гетероциклов - антиоксиданты и блокаторы неферментативного гликозилирования белков - для коррекции экспериментального сахарного диабета
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Производные серосодержащих гетероциклов - антиоксиданты и блокаторы неферментативного гликозилирования белков - для коррекции экспериментального сахарного диабета"

На правах рукописи

САВАТЕЕВА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА

ПРОИЗВОДНЫЕ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ - АНТИОКСИДАНТЫ И БЛОКАТОРЫ НЕФЕРМЕНТАТИВНОГО ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ -ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА

03.01.04 - биохимия

9 СЕН 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань, 2015

005562042

Работа выполнена в Химико-технологическом институте ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»

Научный руководитель: академик РАН, доктор медицинских наук, профессор

Черешнев Валерий Александрович кандидат медицинских наук Емельянов Виктор Владимирович

Официальные оппоненты:

Цейликман Вадим Эдуардович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет», г. Челябинск

Шумаев Константин Борисович - доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота, Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук», г. Москва

Ведущая организация:

ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, г. Москва

Зашита диссертации состоится «24» сентября 2015 года в 13.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008 г. Казань, ул. К.Маркса, д.74, ауд.206. Телефон: 7(843)23-37-842.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д.35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» www.kpfu.ru.

Автореферат разослан «<<?/ »л/г^/гт 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета, у /

доктор биологических наук, профессор с 6-у—Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Современная медицина испытывает потребность в новых лекарственных средствах для лечения сахарного диабета (СД) - распространенного социально значимого заболевания (Дедов И.И. Инновационные технологии в лечении и профилактике сахарного диабета и его осложнений // Сахарный диабет. 2013. № 3. С. 4 - 10). В поиске новых противодиабетических средств широко применяется экспериментальное моделирование заболевания на животных. С целью оптимизации данного этапа поиска противодиабетических средств необходимо четко представлять, на какие механизмы развития экспериментального и клинического СД способно повлиять новое соединение.

К числу потенциальных мишеней противодиабетических средств можно отнести два патохимических процесса, реализующихся в условиях хронической гипергликемии, -неферментативное гликозилирование белков (НГБ) и оксидативный стресс (Балаболкин М.И. Диабетология // М.: Медицина, 2000. 672 е.; Monnier V.M., Sell D.R. Prevention and repair of protein damage by the Maillard reaction in vivo II Rejuvenation Res. 2006. V. 9, № 2. P. 264 - 273; Aldini G., Vistoli G., Stefek M. et al. Molecular strategies to prevent, inhibit, and degrade advanced glycoxidation and advanced lipoxidation end products // Free Radical Research. 2013. V.47, (Suppl. 1). P. 93 - 137). НГБ - спонтанная химическая реакция между аминогруппами молекулы белка и карбонильными группами моносахаридов и последующие превращения образовавшегося соединения, протекающие без участия, ферментов. Происходящие изменения нарушают ионные взаимодействия в белковой молекуле, изменяют конформацию, растворимость, а вследствие этого - функциональные свойства и чувствительность к действию протеаз. Так, показано, что инсулин, неферментативно гликозилированный in vitro, частично утрачивает способность снижать уровень глюкозы в крови и стимулировать транспорт глюкозы в клетки при введении животным (Hunter S. J., Boyd А. С., O'Harte F. P.M. et al. Demonstration of glycated insulin in human diabetic plasma and decreased biological activity assessed by euglycemic-hyperinsulinemic clamp technique in humans // Diabetes. 2003. V. 52. P. 492 - 498; McKillop A.M., Mooney M.H, Harriott P. et al. Evaluation of glycated insulin in diabetic animals using immunocytochemistry and radioimmunoassay // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011. V. 286. P. 524 - 528).

Комплекс метаболических нарушений, характерных для СД, приводит к оксидативному стрессу - дисбалансу между про- и антиоксидантами, с накоплением продуктов свободнорадикального окисления (СРО) липидов, белков, нуклеиновых кислот (Evans J.L., Maddux В.А., Goldfine I.D. et al. The molecular basis for oxidative stress-induced insulin resistances И Antioxid. Redox Signal. 2005. V. 7, № 7-8. P. 1040 - 1052; Меньшикова Н.Б., Зенков H.K., Ланкин В.З. и соавт. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания // Новосибирск: АРТА, 2008. 284 е.; Шумаев К.Б., Губкина С.А., Кумскова Е.М. и соавт. Механизм образования супероксидного радикала при взаимодействии L-лизина с дикарбонильными соединениями // Биохимия. 2009. Т. 74, №4. С. 568 - 574). Имеются весомые доказательства эффективности серосодержащего антиоксиданта и блокатора НГБ - липоевой кислоты (ЛК) - в терапии СД и его осложнений (Стаховская Л.В., Гусева О.И. а-липоевая кислота: фармакологические свойства и клиническое применение. Обзор литературы // М., РГМУ, 2003. 63 е.; Ziegler D., Tritschler H.-J., Строков И.А., Аметов А.С. et al. Лечение диабетической полиневропатии тиоктовой кислотой (обзор литературы) // Фарматека. 2008. Т. 17, №171. С. 28 - 35; Shay К.Р., Moreau R.F., Smith E.J. et al. Alpha-lipoic acid as a dietary supplement: molecular mechanisms and therapeutic potential // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1790. P. 1149 - 1160). Однако остается открытым вопрос, можно ли улучшить результаты лечения СД путем применения синтетических серосодержащих соединений, обладающих свойствами антиоксидантов и блокаторов НГБ.

В связи с этим привлекают внимание синтетические серосодержащие соединения ряда 1,3,4-тиадиазина (1,3,4-ТД) и 2,4-замещенных тиазолов. Имеются сведения об антиоксидантной и радиозащитной активности представителей этих классов соединений (Pfeiffer W.-D.

1,3,4-Oxadiazines and 1,3,4-Thiadiazines // Compr. Heterocycl. Chemistry III. 2008. V. 9. P. 401 -455; Расина JI.H., Перова H.M., Новикова А.П., Чупахин О.Н. Структура, поведение в организме и биологическая активность производных тиазола // Материалы Первой Международной конференции «Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов»; под ред. В.Г. Карцева и Г.А. Толстикова. - М., 2001. - Т. 2. - С. 246). Производные 2-аминотиазола и тиазолидиндиона обладают противодиабетической активностью (De S., Adhikari S., Tilak-Jain J. et al. Antioxidant activity of an arainothiazole compound: possible mechanisms // Chem. Biol. Interact. 2008. V. 173. P. 215 - 223; Спасов A.A., Петров В.И., Чепляева Н.И., Ленская К.В. и соавт. Фундаментальные основы поиска лекарственных средств для терапии сахарного диабета 2-го типа // Вестник РАМН. 2013. № 2. С. 43 - 49). Показано, что производные 1,3,4-ТД способны в водных растворах трансформироваться в тиольные производные, которые, согласно нашей гипотезе, могут связывать глюкозу и карбонильные интермедиаты НГБ, а также обладать антиоксидантными свойствами. Однако, противодиабетическая активность производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов ранее не изучалась. Вышеизложенное определило цель и задачи данной работы.

Целью настоящей работы является оценка способности производных серосодержащих гетероциклов проявлять антиоксидантную активность, блокировать НГБ и корригировать метаболические нарушения при экспериментальном СД.

Задачи:

1. Провести скрининг способности блокировать реакцию неферментативного гликозилирования бычьего сывороточного альбумина (БСА) глюкозой in vitro в рядах производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов.

2. Исследовать антиоксидантную активность производных 1,3,4-ТД на модели ингибирования окисления аскорбиновой кислоты (АК) кислородом воздуха.

3. Оценить соотношение липо- и гидрофильных свойств производных 1,3,4-ТД с антиоксидантной и противогликозилирующей активностью в системе «н-октанол — вода».

4. Изучить влияние производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов на биохимические показатели крови и внутренних органов крыс при аллоксановом СД.

5. Выяснить взаимосвязь между структурой, липофильностью, антиоксидантными, противогликозилирующими свойствами производных 1,3,4-ТД и их способностью корригировать метаболические нарушения при экспериментальном СД.

6. Провести кинетический анализ реакции НГБ и ее ингибирования восстановленным глутатионом (G-SH) на примере генноинженерного инсулина человека.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты РФФИ № 12-04-31852_мол_а и РФФИ-«Урал» № 10-04-96097) и «Программы развития УрФУ на 2010 - 2020 гг.».

Научная новизна. Впервые показано, что производные 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов способны ингибировать накопление продуктов НГБ при инкубации БСА с глюкозой. Установлено, что наилучшими противогликозилирующими свойствами обладают производные 5-фенил-1,3,4-ТД, имеющие кислородсодержащий гетерил- или алкиламиновый заместитель в положении 2.

Произведена оценка липофильности потенциальных ингибиторов реакции НГБ -производных 1,3,4-ТД в системе «н-октанол - вода». Установлено, что коэффициент распределения 1 для активных ингибиторов НГБ составлял 2,90 - 3,19, а для менее активных ингибиторов 3,14 - 4,02.

Впервые показана способность производных 1,3,4-ТД ингибировать окисление аскорбиновой кислоты кислородом воздуха. Наибольшую активность проявляют соединения Н-32, ТД-79, L-92, L-17.L-34.

Впервые на модели аллоксанового СД у крыс обнаружена противодиабетическая активность производных 1,3,4-ТД (L-17, L-14, Н-32, L-31, L-91) и 2-гуанидин-4-пиридинтиазола (2-Г-4-ПТ). Исследованные производные 1,3,4-ТД обладают способностью корригировать гипергликемшо, накопление продуктов НГБ в крови и внутренних органах, а также обладают антиоксидантной активностью. 2-Г-4ПТ снижает накопление продуктов НГБ и СРО липидов в крови и внутренних органах, не влияя на уровень гликемии.

Предложена и экспериментально подтверждена кинетическая модель процесса неферментативного гликозилирования генноинженерного человеческого инсулина in vitro. Найдены константы скоростей прямой и обратной элементарных реакций в стадии 2, отношение констант скоростей прямой и обратной элементарных реакций в стадии 1, а также термодинамические константы равновесия обеих стадий.

Установлено, что в диапазоне физиологических концентраций природный тиол G-SH обладает дозозависимой способностью ингибировать гликозилирование инсулина глюкозой in vitro, проведен кинетический анализ процесса.

На защиту выносятся следующие положения:

Производные 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов способны блокировать реакцию НГБ. Наилучшими противогликозилирующими свойствами обладают производные 5-фенил-1,3,4-ТД, с кислородсодержащим гетерил- или алкиламиновым заместителем в положении 2, и имеющие коэффициент распределения lg/C,«. в системе «н-октанол - вода» в пределах 2,90 - 3,19.

Производные 1,3,4-ТД способны ингибировать окисление аскорбиновой кислоты кислородом воздуха. Наибольшую активность проявляют производные 1,3,4-ТД, имеющие морфолиновый заместитель в положении 2 и тиофен, фенил или и-фторфенил в положении 5.

Антиоксидшггные и противогликозилирующие свойства производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов позволяют частично корригировать метаболические нарушения при развитии аллоксанового СД у крыс.

В результате кинетического исследования реакции неферментативиого гликозилирования генноинженерного инсулина человека (ГИЧ) и её ингибирования G-SH, предложена математическая модель этой реакции, проверено её соответствие результатам эксперимента in vitro, рассчитаны константы скоростей и константы равновесия стадий образования ФА в отсутствии и в присутствии G-SH.

Практическая значимость. В ходе скрининга были найдены вещества, способные снижать накопление первичного продукта реакции НГБ фруктозамина (ФА), ингибировать окисление АК кислородом воздуха. Выявлены некоторые аспекты зависимости «структура-активность», что позволит вести целенаправленный поиск и синтез веществ с противогликозилирующей и антиоксидантной активностью. Применение веществ, сочетающих свойства антиоксиданта и блокатора НГБ, представляется перспективным подходом к фармакологической коррекции СД в эксперименте.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 3 - в журналах, входящих в перечень ВАК. Подана 1 заявка на изобретение, № 2014151103 (приоритет от 16.12.2014 г.). Результаты работы доложены (с опубликованием тезисов) на международных и Российских конференциях: Российской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009); Ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010); XX Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2010); I Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в

физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010); Ежегодной конференции «Фармация общественное здоровье» (Екатеринбург, 2011); Всероссийской научно-практическо конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохим и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научи исследований» (Омск, 2011); II Международной научно-практической конференции «Высоки технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт Петербург, 2011); IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с Молодёжной научно школой по органической химии (Уфа, 2013); I научно-практической конференции аспирантов студентов России «Химия в федеральных университетах» (Екатеринбург, 2013); Российско научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопрось медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики» (Казань, 2013); Уральско научном форуме «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014); I Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Саратов, 2014); Российско научном форуме на Урале «Актуальные вопросы фундаментальной медицины» (Екатеринбург 2014).

Личный вклад автора. Автор принимал участие в планировании диссертационног исследования, проводил литературный поиск, непосредственно осуществлял эксперименты i vitro, проводил биохимические исследования крови и органов экспериментальных животных, проводил расчёты и экспериментальную проверку кинетической модели реакции гликозилирования. Материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 160 страницах. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа содержит 25 таблиц и 39 рисунков. Список литературы включает 225 источников, в том числе 141 работу на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В литературном обзоре рассмотрены биохимические механизмы развития нарушений обмена веществ при СД, существующие подходы к их фармакологической коррекции, химия и биологическая активность природных и синтетических серосодержащих гетероциклических соединений классов 1,3,4-ТД и замещённых тиазолов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании были использованы производные 1,3,4-ТД и 2,4-замещённые производные тиазола, синтезированные на кафедре органической химии Химико-технологического института УрФУ (к.х.н. Сидорова Л.П., к.х.н. Перова Н.М., к.х.н. Цейтлер Т.А., к.х.н. Новикова А.П.) под руководством академика РАН О.Н. Чупахина. В качестве веществ сравнения использовали восстановленный и окисленный глутатион, аминогуанидин (Sigma, США) и метформин («Глюкофаж», Nycomed, Германия).

Способность исследуемых соединений блокировать протекание реакции НГБ оценивали по накоплению начального продукта НГБ ФА при инкубации БСА с глюкозой в присутствии производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов. В модельный водный раствор, содержавший БСА в концентрации 5 г/л и глюкозу в концентрации 20 ммоль/л, в качестве ингибиторов реакции НГБ были добавлены указанные выше вещества в концентрации 20 ммоль/л. Система инкубировалась при температуре 4°С, в качестве консерванта в раствор добавлялся .и-крезол в концентрации 2,5 мг/мл. Через 1, 2, 4, 8 недель отбирали пробы для определения концентрации начального продукта гликозилирования ФА (Викторова Л.Н., Городецкий В.К.

Колориметрический метод определения неферментативно гликозилированного альбумина и гемоглобина // Лаб. дело. 1990. № 5. С. 15 - 18).

Антиоксидантную активность производных 1,3,4-ТД оценивали по влиянию на скорость окисления АК кислородом воздуха. Для этого растворяли в воде 1,3,4-ТД и АК в соотношениях 1:1 и 1:2 соответственно и инкубировали при температуре 37 °С и интенсивном перемешивании в течение 6 час. Каждый час отбирались пробы и устанавливалась концентрация АК в растворах титриметрическим методом с 2,6-дихлорфенолиндофенолом (Девис М., Остин Дж., Патридж Д. Витамин С. Химия и биохимия // М.: Мир, 1999. 176 е.). На основании полученных данных были построены графики снижения концентрации АК в присутствии каждого исследуемого вещества. Скорости снижения конце[праций вычислялись по формуле V = AC/At, где АС - изменение концентрации АК, At - время инкубации.

Для оценки соотношения гидро- и липофильных свойств производных 1,3,4-ТД определяли коэффициент распределения веществ в системе «н-октанол/вода» методом медленного перемешивания (ГОСТ 32291-2013). Коэффициент распределения веществ в системе «н-октанол/вода» (Kow) представляет собой соотношение равновесных концентраций вещества, растворенного в двухфазной системе, состоящей из двух практически несмешивающихся растворителей. Результат приводили в виде десятичного логарифма (lgAT„w) (Rutkowska Е., Pajak К., Józwiak К. et al. Lipophilicity - methods of determination and its role in medicinal chemistry // Acta Pol. Pharm. 2013. V. 70, №1. P. 3 - 18).

Эксперимент по оценке влияния серосодержащих гетероциклических соединений на биохимические показатели крови и внутренних органов при экспериментальном СД проведен на базе Института иммунологии и физиологии УрО РАН (д.б.н. Данилова И.Г., к.б.н. Гетте И.Ф., м.н.с. Булавинцева Т.С, директор - академик РАН В.А. Черешнев). Аллоксановый СД моделировали на 50 белых беспородных крысах-самцах массой около 200-250 г. Животные содержались в условиях лабораторного вивария, где поддерживалась постоянная температура в пределах 22 - 25°С и естественная смена дня и ночи. Все животные имели свободный доступ к пище и воде. Ежедневно проводилась очистка клеток, дезинфекция - один раз в неделю. Все манипуляции с животными осуществлялись с соблюдением этических принципов и в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях.

СД моделировали путем трехкратного внутрибрюшинного введения аллоксана в суммарной дозе 300 мг/кг массы животного. Одновременно с индукцией СД вводили соединения L-17, L-14, Н-32, L-31, L-91 и 2-гуанидин-4-пиридинтиазол, гидробромид, в дозе 40 мг/г массы животного внутримышечно с периодичностью 3 раза в неделю в течение 4 недель. Вещества предварительно растворяли в инъекционной воде. В качестве вещества сравнения использовали ЛК («Октолипен», Россия) в аналогичных дозах.

По окончании эксперимента в крови животных определяли концентрации глюкозы (глюкозооксидазиым методом) и общего белка (биуретовым методом) (Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. // Минск: Беларусь, 2000. Т.1 495 е., Т.2 463 е.). Для характеристики активности процесса НГБ у животных определяли концентрацию ФА в плазме крови и гомогенатах печени и почки (Викторова Л.Н., Городецкий В.К. Колориметрический метод определения неферментативно гликозилированного альбумина и гемоглобина // Лаб. дело. 1990. № 5. С. 15 - 18) и HbAic крови методом колоночной хроматографии наборами «Диабет-тест» (ООО «Фосфосорб», Россия). Активность СРО липидов оценивали по концентрации МДА плазмы (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии; под ред. В. Н. Ореховича. М., 1977. С. 66 - 68) и активности каталазы цельной крови (Бах А.Н., Зубкова С.А. К вопросу о каталазе // Сборник избранных трудов. Ленинград. 1937. С. 241-245).

Кинетический анализ реакции неферментативного гликозилирования ГИЧ и его ингибирования G-SH проведён совместно с доцентом кафедры физической и коллоидной химии ХТИ УрФУ, К.Х.Н. Н.К. Булатовым.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Раздел 3.1. Противогликозилирующая и антиоксидантнан активность производных 1,3,4-ТД Раздел 3.1.1. Исследование способности производных 1,3,4-ТД блокировать реакцию неферментативного гликозилироваиия БСА глюкозой in vitro

Возможность применения природных и синтетических тиолов для коррекции НГБ in vivo ограничивает их низкая биодоступность и быстрая инактивация при окислении до дисульфидов. В связи с этим очевидны перспективы исследования противогликозилирующей активности синтетических веществ, способных трансформироваться в тиольные производные в клетках. Такого рода трансформация характерна для производиых 1,3,4-ТД, что может объяснять их широкий спектр биологической активности.

ХК

куу

HS R1

Среди 41 соединения, подвергнутого скринингу, нами было отобрано 12 наиболее активных веществ, подавлявших накопление ФА на 20 - 70% против контроля (рис. 1).

100 эо . so

70 60 50 40 30 20 10 0

1-17 LT-17 Н-10 LT-4 LT-1 L-20 Н-80

Н-32 ТД-79 1-34

1 неделя а 2 недели и 4 недели ■ 8 недель

Рис. 1. Накопление ФА при инкубации БСА с глюкозой в присутствии производных 1,3,4-ТД, % к уровню контрольного опыта соответствующей недели эксперимента. Вещество сравнения - в-ЗН.

Действие данных веществ проявлялось на всём протяжении эксперимента, в отличие от й-вН, утратившего активность к 8 неделям. Вещества, проявляющие максимальную противогликозилирующую активность, отличаются от малоактивных соединений по характеру заместителей в положениях 2 и 5 тиадиазинового цикла (табл. 1).

Производные 1,3,4-тиадиазина, эффективно подавляющие накопление ФА

Обозначение соединения Заместитель Обозначение соединения Заместитель

R, R; R, R2

L-17 Ч/О (X H-80 X) г\

LT-17 -NH—(CHjb-OH a LT-10 a

H-10 Oo "XX Н-32 X)

LT-4 -Й-О °xx ТД-79 "О Û.

LT-1 -N-O H ^ n L-34 ^N-^r-CH, V сн, a

L-20 Oo HOÇ^ L-14 ГЛ —NH—(CHJ,— N^0 (X

Среди активных ингибиторов типично сочетание фенила в положении 5, а в положении 2 - морфолина, либо иного кислородсодержащего алкиламинового фрагмента. Среди веществ с наименьшей противогликозилирующей активностью преобладают вещества, содержащие дихлортиофеновые заместители в положении 5, независимо от природы заместителя в положении 2.

Механизм противогликозилирующего действия соединений класса 1,3,4-ТД возможно связан с их способностью трансформироваться в SH-замещенные пиразолы, как это наблюдается при нагревании некоторых 1,3,4-ТД в кислых и щелочных средах, или присоединять глюкозу к фрагменту тиадиазинового кольца после его раскрытия (рис. 3). Можно предположить, что наличие в алкиламиновом фрагменте в положении 2 атома кислорода снижает электронодонорные свойства азота, участвующего в р-гс сопряжении с тиадиазиновым циклом, тем самым способствует раскрытию цикла с разрывом связи сера-углерод.

Раздел 3.1.2. Исследование антиоксндантных свойств производных 1,3,4-ТД на модели окисления аскорбиновой кислоты кислородом воздуха

АК проявляет антиоксидантные свойства синергично с другими природными антиоксидантами. Известно, что аскорбат восстанавливает феноксидный радикал витамина Е, окисляясь при этом до дегидроаскорбата, а тиоловые соединения восстанавливают последний до АК. Содержание аскорбата в крови больных СД снижено и отрицательно коррелирует с уровнем HbAic (Kositsawat J., Freeman V.L. Vitamin С and A]c relationship in the National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) 2003-2006 // J. Am. Coll. Nutr. 2011. V. 30, № 6. P. 477-483).

12 3 4 5 6 Пер„од7ч

■®=АК -®-смесь1:1» —А—смесь 2:1 * Ь-17 : АК*

Рис. 2. Оценка влияния соединения Ь-17 на кинетику окисления АК кислородом воздуха.

Для оценки антиоксидантных свойств производных 1,3,4-ТД оценивали их способность ингибировать окисление АК кислородом воздуха. На примере вещества Ь-17, (рис. 2), видно, что концентрация АК в исследуемых растворах с течением времени уменьшается, но окисление АК кислородом воздуха в контроле идет быстрее, чем в присутствии вещества Ь-17. Скорость убыли АК без ингибитора составила 15,0 мкг/л-час, в присутствии эквимолярного количества Ь-17 она снижалась до 11,5мкг/л час, а при 2-кратном избытке Ь-17 - до 8,5 мкг/л час. В проведенном эксперименте показано, что вещество Ь-17 обладает дозозависимой способностью предотвращать окисление АК.

Эксперимент был проведён ещё с семью представителями класса 1,3,4-ТД, ЛК и глутатионом в окисленной и восстановленной формах. По полученным данным вычислены скорости снижения концентраций АК в исследованных растворах (табл. 2).

Таблица 2

Скорость окисления АК кислородом воздуха в присутствии серосодержащих соединений

В-во 1:1 1:2

V, мг/л-час %К V, мг/л час %К

ОБН 9,78±0,49 50±2,5 2,44±0,12 57±2,8

16,56±0,83 72±3,6 14,67±0,73 72±3,6

ЛК 29,33±1,47 86±4,3 29,33±1,46 86±4,3

ТД-79 6,98±0,35 17±0,8 10,48±0,52 30±1,5

Ь-92 18,33±0,92 78±3,9 10,86±0,54 44±2,2

Н-32 16,10±0,81 62±3,1 7,33±0,37 28±1,4

Ь-31 25,88±1,29 75±3,7 32,59±1,63 100±5

1,-34 39,01±1,95 100±5 23,33±1,16 56±2,8

Ь-17 28,62±1,43 72±3,6 21,46*1,07 53±2,6

ЬТ-1 33,17±1,66 130±6,5 36,67±1,83 123±6,1

Ь-14 73,33±3,67 650±32,5 71,90±3,59 625±31,2

*% К - процент к уровню контрольного опыта

По приведённым в таблице данным можно сделать выводы о том, что наибольшей антиоксидантной активностью обладает вещество ТД-79, несколько слабее препятствуют

окислению АК 0-311, соединения Н-32, Ь-92, и Ь-17. Вещества Ь-34 и 1,-31, а также окисленный глутатион в двух исследованных концентрациях оказали неоднозначное влияние на кинетику окисления АК, а вещества ЬТ-1 и Ь-14 и вовсе ускоряли его.

Возможный механизм данного эффекта 1,3,4-ТД мы связываем с действием продуктов его трансформации, содержащих тиольную группу. Эти соединения восстанавливают дегидроаскорбиновую кислоту до АК, сами при этом окисляясь до дисульфидов (рис. 3).

R1V"» „ /1 "Ч и к, R. н RVV»

2-re Л- # # У-1-

н+он р/ Su «/^-^Л, H-j-OH

R R

Рис. 3. Связывание карбонильных соединений и восстановление дегидроаскорбииовой кислоты в присутствии производных 1,3,4-ТД.

Анализ взаимосвязи «структура-активность» в ряду производных 1,3,4-ТД, изменяющих кинетику окисления АК кислородом воздуха, показывает зависимость данной активности от наличия и природы заместителей в положении 2 и 5 тиадиазинового цикла. Так, среди производных 1,3,4-ТД, содержащих фенильный фрагмент в положении 5, наибольшей антиоксидантной активностью обладают соединения L-17 и L-34, содержащие в положении 2 морфолин и диметилморфолин, соответственно. С другой стороны, среди морфолинозамещённых производных 1,3,4-ТД наивысшими антиоксидантными свойствами обладают производные тиофена в положении 5. Наивысшей антиоксидантной активностью среди исследованных синтетических соединений обладал 2-морфолино-5-тиенил-1,3,4-ТД (ТД-79).

Раздел 3.1.3. Исследование соотношения липо- и гидрофильных свойств производных 1,3,4-ТД с антиоксидантной и противогликозилирующей активностью в системе «н-октанол — вода»

Взаимодействие между биологически активными веществами и клеточными и субклеточными структурами происходит в водной среде или в неводных слоях мембран, которые образованы гидрофобными фрагментами липидов. Показано, что возрастание липофильности соотносится со снижением водорастворимости, повышением скорости проникновения через кожу, увеличением степени связывания с белками плазмы, материальной кумуляцией, что в значительной мере определяет биологическую активность соединений (Lu Y., Kim S., Park К. et al. In vitro-in vivo correlation: perspectives on model development // Int. J. Pharm. 2011. V. 418, №1. P. 142 - 148; ГОСТ 32291-2013).

Методом медленного перемешивания были определены коэффициенты lgÄ"m,. 10 производных 1,3,4-ТД, отличавшихся по противогликозилирующей активности (табл. 3).

Значения коэффициентов распределения в системе «н-октанол - вода» __ производных 1,3,4-тиадиазина___

Вещ-во LT-17 LT-4 L-17 ТД-79 H-94 L-34 Н-32 L-103 L-92 L-14

Igtf« 2,90 3,01 3,03 3,06 3,14 3,17 3,19 3,38 3,41 4,02

При анализе значений lgif,,,, исследованных 1,3,4-ТД были обнаружены закономерные отличия в липофильности соединений, отличающихся природой заместителей в положении 2 и 5. Например, соединение 2-Г-5-Ф имеет наименее объемный заместитель в положении 2 из всех изученных соединений и обладает наименьшей липофильностью. Соединение L-17, отличающееся от 2-Г-5-Ф меньшей полярностью заместителя в положении 2, имеет более высокое значение коэффициента lgÄ",™.. Соединение L-34, имеющее 2 дополнительных метил-радикала в структуре морфолинового фрагмента по сравнению с L-17, обладает и большей липофильностью. Наконец, соединение L-14, имеющее наиболее алифатический и наименее полярный заместитель в положении 2, закономерно обнаружило самое высокое значение

Распределение производных 1,3,4-ТД с различной антиоксидантной активностью по соотношению липо- и гидрофильных свойств не продемонстрировало зависимости между способностью ингибировать окисление АК кислородом воздуха и lg/C™. Значения lgA'ovf у производных 1,3,4-ТД с наивысшей антиоксидантной активностью не отличались от таковых у слабых антиоксидантов.

При сопоставлении липофильности и противогликозилирующей активности 1,3,4-ТД были выявлены следующие факты. Коэффициент распределения lgК0* для более активных ингибиторов НГБ составлял 2,90 - 3,19 (в среднем 3,04), а для менее активных ингибиторов 3,14 - 4,02 (в среднем 3,42). Таким образом, можно сделать заключение, что оптимальным для проявления противогликозилирующей активности производных 1,3,4-ТД является значение

2,90-3,19.

Раздел 3.2. Исследование способности блокировать реакцию неферментативного гликозилнрования БСА глюкозой in vitro в рядах 2,4-замещенных тиазолов

В лечении сахарного диабета и его осложнений применяются синтетические производные тиазола (тиамин) и гуанидина (метформин) (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений. Руководство для врачей // М.: Медицина, 2005. 512 е.; Аметов A.C. Сахарный диабет 2 типа. Проблемы и решения // М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. 704 е.). Аминогуанидин является эталонным соединением при экспериментальной оценке способности веществ ингибировать НГБ. Однако гуанидинзамещенные производные тиазола не подвергались ранее исследованию на противодиабетическую активность, что и обусловило постановку задачи данного раздела работы.

Для исследования были выбраны вещества - производные тиазола, содержащие гуанидиновую, аминогруппу или морфолин в положении 2, а также арил или гетерил в положении 4 (табл. 4).

Структура исследуемых 2,4-замещенных производных тиазола

Обозначение соединения Заместитель Обозначение соединения Заместитель

R1 R2 R1 R2

2-гуанидин-4- фенилтиазол (2-Г-4-ФТ) .NH -к NH, a L-90 ГЛ (Г

2-гуанидин-4-и- аминофенилтиазол (2-Г-4-АФТ) .NH -¡rf NH, jy Н-63 — N\ /° a

2-гуанидин-4-а-пиридинтиазол (2-Г-4-о-ПТ) „NH -N-f H NH, a Н-107 —NHj

2-гуанидин-4-у-пиридинтиазол (2-Г-4-У-ПТ) ,NH h"nh, Н-108 —nh2 ■tx

2-гуанидин-4-(5- урацил)тиазол (2-Г-4-УТ) .NH -B-f NH, °A о Н-109 —NHj OM*

Строение этих веществ, в частности наличие гуанидиновой группы, делает их вероятными ингибиторами реакции НГБ за счет конкуренции с белком в реакции с глюкозой и карбонильными промежуточными продуктами. Кроме того, в эксперименте были использованы аминогуанидин (АМГ) и метформин (МФ), активность которых в качестве блокаторов реакции НГБ была доказана ранее (Ozyazgan S., Unlucerci Y., Bekpinar S., Akkan A.G. Impaired relaxation in aorta from streptozotocin-diabetic rats: effect of aminoguanidine (AMNG) treatment // Int. J. Exp. Diabetes Res. 2000. V. 1, №2. P. 145 - 153; Chang K.C., Hsu K.L., Chou T.F. et al. Aminoguanidine prevents age-related deterioration in left ventricular-arterial coupling in Fisher 344 rats // Br. J. Pharmacol. 2004. V. 142, № 7. P. 1099 - 1104; Ланкин B.3., Коновалова Г.Г., Тихазе A.K., Недосугова Л.В. Влияние природных дикарбонилов на активность антиоксидантных ферментов in vitro и in vivo П Биомед. хим. 2012. Т. 58, вып. 6. С. 727 - 736). Способность замещённых 2,4-тиазолов ингибировать реакцию НГБ исследовалась аналогично эксперименту с 1,3,4-ТД.

Из полученных данных (рис. 4) можно сделать вывод, что накопление ФА в модельной системе БСА с глюкозой в присутствии гуанидиновых производных тиазола снижается, по сравнению с контролем, более всего - в присутствии 2-гуанидин-4-фенилтиазола. В случае л-аминофенильного производного концентрация ФА превышала контрольную в 3,5 - 4 раза во всех сроках эксперимента. Мы связываем это со способностью данного соединения образовывать дополнительные количества ФА по аминогруппе аминофенильного фрагмента.

& 500 1

< I

I неделя Ь 2 недели 4 недели ■ 8 недель

Рис. 4. Накопление ФЛ при инкубации БСА с глюкозой в присутствии 2,4-замещенных производных тиазола, % к уровню контрольного опыта соответствующей недели эксперимента.

Вещества сравнения — аминогуанидин (АМГ) и метформин (МФ).

Значительную способность ингибировать накопление ФА в поздних сроках эксперимента демонстрировали производные тиазола, содержащие в положении-2 аминогруппу или морфолин, а в положении-4 фенил или замещенный фенил. Наивысшей активностью среди них обладал 2-морфолино-4-фенилтиазол (соединение Н-63). Таким образом, 4-арилтиазолы, содержащие в положении-2 гуанидиновую группу или морфолин, представляют собой перспективную в отношении поиска ингибиторов НГБ группу синтетических серосодержащих гетероциклических соединений.

Раздел 3.3. Биохимические показатели крови и органов крыс при развитии аллоксанового СД на фоне введения серосодержащих гетероциклических соединений

В разработке новых лекарственных средств для лечения СД широко применяется моделирование данной патологии в эксперименте на животных. Ведущую роль в формировании диабетического поражения сосудов и нервов играет вызванная длительной гипергликемией активация НГБ и СРО липидов, белков, нуклеиновых кислот. Известно, что природный тиол глутатион корригирует состояние эндокринной функции (3-клеток поджелудочной железы при экспериментальном СД. В эксперименте и клинике получены многочисленные свидетельства успешной коррекции свободнорадикальных процессов и НГБ, усиления действия инсулина при СД введением ЛК. Учитывая ранее выявленную способность ряда гетероциклических соединений класса 1,3,4-ТД и 2-гуанидинтиазола ингибировать реакцию НГБ в модельной системе, представляет интерес оценить способность данных соединений влиять на биохимические показатели периферической крови при экспериментальном СД.

Биохимические показатели крови и органов крыс при развитии аллоксанового сахарного диабета на фоне введения

серосодержащих гетероциклических соединений, М± ш

Показатель Контроль («=Ю) Исследованное вещество

ЛК (п=7) Ь-31 (п=5) Ь-91 (п=5) Ь-17 (п=7) Н-32 (п=5) И4 (п=5) 2-Г-4-ПТ (п=6)

Кровь

Глюкоза, ммоль/л 34,6±3,4 14,8±1,7* 10,3±0,9* 13,7±1,9* 23,7±2,2* 25,2±5,2* 29,3±3,0* 33,4±2,5

НЬАк, % 9,1 ±0,8 5,1±0,9* 6,9±0,3* 5,3±0,3* 6,5±0,7* 5,7±1,7* 7,5±0,7* 9,2±0,7

Фруктозамин, мкмоль/г белка 4,7±0,5 3,1 ±0,4* 3,8±0,5 3,6±0,2* 3,2±0,9 3,8±0,8 5,3±0,6 3,2±0,5*

Каталаза, нкатал/г НЬ 15б±11 1094±95* 1025±87* 1222±70* 143±8 79±9* 165±10 138±22

МДА, нмоль/л 441±19 370±50 365±45 303 ±43* 106 ±27* 370±22 620±68 191±28*

Органы

Фруктозамин, почка, мкмоль/г бепка 45,2±3,8 16,3±1,3* 37,7±1,5 16,3±0,3* 15,6±2,2 23,9±2,0* 20,7±2,1* 17,3±0,9*

Фруктозамин, печень, мкмоль/г белка 20,9±8,0 3,7±0,3* 5,1 ±0,9* 9,3±0,8* 8,6±1,6* 9,4±1,3* 9,5±2,5* 8,3±1,2*

* - статистически значимые различия с контрольным опытом, р < 0,05

Согласно данным таблицы 5, введение аллоксана приводило к стойкой и выраженной гипергликемии, накоплению гликозилированных белков в крови и органах животных. Гипергликемия и активация НГБ могли служить триггером оксидативного стресса, накопления МДА и снижения активности каталазы крови. Введение JIK существенно ослабляло, хотя и не отменяло полностью, биохимические нарушения при формирующемся аллоксановом СД. Гипергликемия и связанные с ней концентрации гликозилированных белков крови при введении ЛК были на 35-55% ниже, чем в контрольной группе. Содержание ФА в гомогенатах почек и печени при введении ЛК было в 2,8 и 5,6 раз, соответственно, ниже, чем в контроле. Антиоксидантный эффект ЛК в нашем исследовании проявился в увеличении активности каталазы, однако, содержание МДА в крови не претерпело статистически значимых изменений.

Исследованные синтетические серосодержащие гетероциклические соединения также обладали способностью частично корректировать метаболические нарушения при развитии аллоксанового СД. Однако в действии производных 1,3,4-ТД и 2-Г-4-ПТ имелись принципиальные различия. Производные 1,3,4-ТД L-17, L-91, Н-32, L-14 вызывали снижение гипергликемии и концентрации HbAic в крови, а также ФА в почках и печени животных, подобно ЛК. Соединение L-31 отличалось от других 1,3,4-ТД тем, что не снижало накопления ФА в почках. Ключевым моментом корригирующего действия производных 1,3,4-ТД был антигипергликемический эффект.

Выраженность антигипергликемического эффекта производных 1,3,4-ТД в эксперименте in vivo убывала в ряду L-31 > L-91 > L-17 > Н-32 > L-14. Анализируя взаимосвязь между активностью производных 1,3,4-ТД в эксперименте in vivo и in vitro, следует отметить, что соединения Н-32, L-31 и L-17, активно ингибировавшие окисление АК кислородом воздуха, проявили большую корригирующую активность in vivo, чем соединение L-14, ускорявшее окисление АК в опыте in vitro и увеличивавшее накопление МДА в крови животных.

Введение 2-Г-4-ПТ не уменьшало выраженности гипергликемии и накопления HbAic, но статистически значимо снижало уровень МДА и ФА почек и печени. Таким образом, не обладая антигипергликемическим эффектом, 2-Г-4-ПТ проявлял свойства антиоксиданта и блокатора НГБ.

Способность ЛК и производных 1,3,4-ТД ослаблять метаболические нарушения при развивающемся аллоксановом СД мы связываем, прежде всего, с защитой Р-клеток островков Лангерганса от индуцированного аллоксаном оксидативного стресса, приводящего к гибели панкреатических эндокриноцитов.

В качестве биохимического механизма такого влияния может рассматриваться способность ЛК и производных 1,3,4-ТД трансформироваться в тиольные производные, увеличивающие мощность антиоксидантной защиты Р-клеток. 2-Г-4-ПТ, не обладая способностью пополнять фонд внутриклеточных тиолов, очевидно лишено прямого действия на Р-клетки. Защитное действие данного соединения при развивающемся аллоксановом СД может быть объяснено с учетом данных об антиоксидантной активности замещенных тиазолов и способности гуанидиновых производных тиазола ингибировать НГБ путем реакции с глюкозой и карбонильными интермедиатами НГБ.

Таким образом, в проведенном исследовании впервые показана способность синтетических серосодержащих гетероциклических соединений ряда 1,3,4-ТД и 2-Г-4-ПТ корригировать метаболические нарушения при развитии аллоксанового СД у крыс. Метаболическое действие представителей двух классов серосодержащих гетероциклов отличалось: для производных 1,3,4-ТД был характерен антигипергликемический, антиоксидантный и противогликозилирующий эффекты, 2-Г-4-ПТ обладал только двумя последними механизмами действия. Эффективность производных 1,3,4-ТД в лечении экспериментального СД обнаруживала параллели с их антиоксидантной активностью in vitro.

Раздел 3.4. Кинетический анализ реакции неферментативного гликозилпрования генноинженерного инсулина человека

НГБ представляет собой сложный многостадийный процесс, который условно можно разделить на три этапа. Начальный этап реакции НГБ включает 2 последовательные стадии (рис. 5).

\гВ М

инсулин (сокр. I)

основание Шиффа (сокр. IG)

:HjOH

1-леэокси-1-(М-аминоацил}-фруктоза (фрухтозамин, сокр. IF)

Рис. 5. Начальный этап реакции НГБ

Первая стадия - образование основания Шиффа, которое на второй стадии перегруппировывается в более стабильный продукт Амадори. В случае взаимодействия белка с глюкозой продукт Амадори имеет строение 1-дезокси-1-(Лг-аминоацил)фруктозы, (фруктозамин, ФА). В литературе имеются различные точки зрения в отношении обратимости 2-й стадии. Кинетический анализ в данной работе проведен в соответствии с гипотезой о том, что вторая стадия обратима.

Второй этап - превращение ФА в промежуточные продукты гликозилирования, карбонильные соединения: глиоксаль, метилглиоксаль и другие (рис. 6). Образовавшиеся карбонильные соединения более реакционноспособны в реакции с белком, чем исходный моносахарид.

НАЧАЛЬНЫЕ ПРОДУКТЫ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ (КПГ)

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ (ППГ)

КОНЕЧНЫЕ ПРОДУКТЫ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ (КПП

CH-N-1 белок

н—j—он

но—}—н

н-

он

CHjOH

-он -он

CHjOH Основание Шиффа

СЬЦ-NH—I белок j =0

сн,он

Продукт Амадори (фруктозамин)

Н О Глиоксаль

н3с о

Метилглиоксаль

СН-0 =0 CHj

он

-он

CHjOH

З-Деэоксиглюкозон и другие глюкоэоны

Н Н

,сн1

- ГуЧ—

СИ,

'ноХЪ

ч^ь

Рис. 6. Схема образования некоторых продуктов НГБ. Apr и лиз — остатки аргинина и лизина в

составе белка.

Заключительный этап реакции - образование конечных продуктов гликозилирования за счет взаимодействия карбонильных соединений с молекулой белка (рис. 6). Образование конечных продуктов гликозилирования необратимо изменяет нативную структуру белков. Наиболее существенный вклад в этот процесс вносят внутри- и межмолекулярные сшивки между аминогруппами белков.

Знание кинетических закономерностей гликозилирования инсулина позволит предложить механизм взаимодействия глюкозы с белком, что послужит основой выработки научного подхода к поиску и синтезу ингибиторов НГБ. Экспериментальное исследование кинетики неферментативного гликозилирования инсулина проводилось в модельных растворах, в состав которых входили ГИЧ и глюкоза в разных концентрациях. Растворы инкубировали в течение 8 недель, периодически отбирали пробы для определения концентрации фруктозамина.

Полученные данные по изменению концентрации с[Р в рабочих растворах с течением времени Г представлены на рис. 7.

0.8

0,1 ¡/Х/^----

о.о

012345678

нея.

Рис. 7. Кинетические кривые %(0П (п = 1, 2, 3, 4) при Сн2о.о = 55400 моль/м3, С, 0 = 0,872 моль/м3 и разных с0 „, моль/м3: 1 - 6,25; 2 - 12,50; 3 - 25,00; 4 - 50,00. Температура Т = 277 К.

Далее была проведена линеаризация кинетических кривых для последующей математической обработки (рис. 8), и выведена серия уравнений, характеризующих рассматриваемый этап реакции.

<, нед.

Рис. 8. Линейные образы кинетических кривых %(')„ (п = 1, 2, 3, 4) в координатах I и 1п( рав/{ рав—с1г)) при следующем выборе С,ь-ри моль/м3: I - 0,253; 2 - 0,290; 3 - 0,434; 4 - 0,637.

Путем обработки экспериментальных кривых %(0 с помощью кинетических уравнений процесса неферментативного гликозилирования ГИЧ in vitro найдены константы скоростей прямой и обратной элементарных реакций в стадии 2 (к^ = 0,044715 1/час; ^о6р= 0,002158 1/час), отношение констант скоростей прямой и обратной элементарных реакций в стадии 1 = 134.2), а также

термодинамические константы равновесия обеих стадий (К{= 134,2; = 21,0). Определены равновесные концентрации всех инсулинсодержащих компонентов -участников процесса.

Данный процесс на начальном этапе его развития отчетливо проявляется в виде совокупности двух стадий, имеющих двусторонний характер, первая из которых представляет собой взаимодействие инсулина (I) с глюкозой (G) и ведет к образованию промежуточного соединения - основания Шиффа (IG), а вторая - к образованию фруктозамина (IF):

l.I + G = IG + H20,

2. IG = IF,

причем течение процесса происходит в квазиравновесном режиме по первой стадии.

Далее модельная система была усложнена добавлением третьего компонента реакции - G-SH, с целью выяснения его способности ингибировать реакцию НГБ. Аналогично предыдущему эксперименту, была проведена математическая обработка результатов эксперимента.

По результатам было установлено, что добавки G-SH не изменяют двухстадийный механизм данного процесса, протекающего в квазиравновесном режиме по стадии 1, но они существенно снижают его темп и степень продвижения за счёт связывания инсулина посредством глутатиона в химическое соединение типа IaY по маршрутной реакции р=3:

3. aI + Y = I„Y,

где a - модуль стехиометрического коэффициента инсулина.

Показано, что в присутствии G-SH течение процесса гликозилирования инсулина на его начальном этапе происходит в квазиравновесном режиме не только по стадии 1, но и по маршрутной реакции 3, поэтому его ход во времени t по прежнему подчиняется интегральному кинетическому уравнению стадии 2, выраженному в логарифмической форме: ln(c1Fpa,/(cIFpH-clf)) = a/, где параметры %рав и а зависят от начальной концентрации глутатиона cY 0. Это означает, что G-SH способен дозозависимо снижать накопление ФА в модельной системе.

На основе расчётов по константе равновесия стадии 3 Щ(Г,[с4])было установлено, что значение модуля стехиометрического коэффициента инсулина a = 4. На практике это означает, что в модельной системе одна молекула глутатиона взаимодействует с четырьмя молекулами инсулина. Этот результат является довольно неожиданным из-за большого значения а=4, поэтому он нуждается в дополнительном обсуждении с точки зрения механизма взаимодействия инсулина с G-SH. Вероятно, G-SH за счет имеющихся в его составе полярных функциональных групп способен нековалентно взаимодействовать с инсулином, за счет чего изменяется конформация белка. Также известно, что в растворе инсулин образует агрегаты - тетра и гексамеры. Диссоциация данных комплексов на мономеры может увеличивать доступность аминогрупп для гликозилирования, поэтому замедление диссоциации в присутствии глутатиона способно ингибировать процесс.

Таким образом, в проведенном исследовании предложена и экспериментально подтверждена кинетическая модель процесса неферментативного гликозилирования генноинженерного человеческого инсулина in vitro. Установлено, что в диапазоне физиологических концентраций природный тиол G-SH обладает дозозависимой способностью ингибировать гликозилирование инсулина глюкозой in vitro, проведен кинетический анализ процесса.

Выводы:

1. Показано, что производные 1,3,4-тиадиазина и 2,4-замещенных тиазолов способны ингибировать накопление продуктов НГБ при инкубации бычьего сывороточного альбумина с глюкозой. Наилучшими противогликозилирующими свойствами обладают производные 5-фенил-1,3,4-тиадиазина, имеющие кислородсодержащий гетерил- или алкиламиновый заместитель в положении 2.

2. При оценке липофильности потенциальных ингибиторов реакции НГБ -производных 1,3,4-тиадиазина в системе «н-октанол - вода» установлено, что коэффициент распределения lg/¡fow для активных ингибиторов НГБ составлял 2,90 - 3,19, а для менее активных ингибиторов 3,14 - 4,02.

3. Производные 1,3,4-тиадиазина обладают способностью ингибировать окисление аскорбиновой кислоты кислородом воздуха. Наибольшую активность проявляют проявляют соединения Н-32, ТД-79, L-92, L-17, L-34.

4. Производные 1,3,4-тиадиазина (L-17, L-14, Н-32, L-31, L-91) и 2-гуанидинтиазола корригируют метаболические нарушения при аллоксановом СД у крыс. Исследованные производные 1,3,4-тиадиазина снижают гипергликемию, накопление продуктов НГБ в крови и внутренних органах, а также обладают антиоксидантной активностью. 2-1уапидин-4-пиридинтиазол проявляет антиоксидантную и противогликозилирующую активность, не влияя на выраженность гипергликемии.

5. Серосодержащие гетероциклические соединения, производные 1,3,4-тиадиазина и 2,4-замещенных тиазолов, являются перспективными для дальнейшего исследования противодиабетической активности и ее биохимических механизмов в эксперименте на животных.

6. Отбор производных 1,3,4-тиадиазина для экспериментальной оценки противодиабетического действия in vivo может проводиться на основании результатов предварительного тестирования in vitro на противогликозилирующую активность (ингибирование накопления фруктозамина при инкубации бычьего сывороточного альбумина с глюкозой), антиоксидантные свойства (ингибирование окисления аскорбиновой кислоты кислородом воздуха) и соотношение липо- и гидрофильных свойств (в системе «н-октанол - вода»).

7. Предложена и экспериментально подтверждена кинетическая модель процесса неферментативного гликозилирования генноинженерного человеческого инсулина in vitro и его ингибирования G-SH, вычислен ряд констант данной реакции.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

Статьи, опубликованные в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК

1. Саватеева, Е.А. Кинетический анализ реакции неферментативного гликозилирования in vitro генноинженерного инсулина человека / Е.А. Саватеева, В.В. Емельянов, Н.К. Булатов, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Бутлеровские сообщения. - 2012. - Т.30, №6. - С.94 - 102.

2. Емельянов, В.В. Перспективы поиска новых противодиабетических средств среди серосодержащих гетероциклических соединений / В.В. Емельянов, Е.А. Саватеева.

Л.В. Мусальникова, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, А.П. Новикова, Т.С. Булавинцева, И.Ф. Гетте, И.Г. Данилова, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Аллергология и иммунология. - 2013. - Т. 14., № 2. - С. 141 - 142.

3. Булатов, Н.К. Кинетический анализ ингибирования глутатионом процесса неферментативного гликозилирования in vitro генноинженерного инсулина человека / Н.К. Булатов, Е.А. Саватеева. В.В. Емельянов, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Бутлеровские сообщения. - 2014. - Т. 38, № 5. - С. 103-111.

Другие публикации

1. Емельянов, В.В. Перспективы создания средств фармакологической блокады реакции неферментативного гликозилирования белка / В.В. Емельянов, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, Я.А. Булгакова, Е.А. Саватеева. В.А. Черешнев // «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» Российская конференция, посвященная 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица, приуроченная к 65-летию Челябинской государственной медицинской академии, 5 - 8 октября 2009 г.: сборник материалов конференции. Челябинск: ЧелГМА, 2009. -С. 91-92.

2. Емельянов, В.В. Влияние глутатиона на неферментативное гликозилирование инсулина in vitro / В.В. Емельянов, Е.А. Саватеева. Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Материалы ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье», 25 февраля 2010 г. Сборник статей. - Екатеринбург: УГМА,2010.-С. 27-30.

3. Булгакова, Я.А. Тиолы и производные гуанидина как потенциальные блокаторы реакции неферментативного гликозилирования белков / Я.А. Булгакова, Е.А. Саватеева // Тезисы докладов XIX Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии», посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького. Екатеринбург, 2024 апреля. Екатеринбург: Издательство УрГУ, 2010. - С. 480-481

4. Саватеева. Е.А. Изменение собственной флюоресценции белков при неферментативном гликозилировании in vitro / Е.А. Саватеева. В.В. Емельянов, Я.А. Булгакова, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Материалы международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». Сборник статей. Санкт-Петербург, 23-26 ноября 2010 г. - СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2010.-С. 308-309.

5. Емельянов, В.В. Неферментативное гликозилирование белков крови и оксидативный стресс при аллоксановом сахарном диабете на фоне введения иммуномодуляторов / В.В. Емельянов, Е.А. Саватеева. Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, И.Г. Данилова, И.Ф. Гетте, В.А. Черешнев // Материалы ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье». Сборник статей. Екатеринбург, 19 мая 2011 г. - Екатеринбург: УГМА, 2011. - С. 383 - 385.

6. Емельянов, В.В. Гетероциклические соединения класса 1,3,4-тиадиазина -потенциальные блокаторы неферментативного гликозилирования белков / В.В. Емельянов, Е.А. Саватеева. A.B. Мусальникова, Е.А. Леонтьева, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В.А. Черешнев // Материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине. Сборник статей. Омск, 20-21 сентября 2011 г. - Омск: ОмГМА, 2011. - С. 89 - 92.

7- Саватеева. Е.А. Ингибирование глутатионом неферментативного гликозилирования генноинженерного инсулина человека / Е.А. Саватеева. В.В.

Емельянов, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Материалы международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». Сборник статей. Санкт-Петербург, 25-29 октября 2011 г. - СПб.: Изд-во Политехи. Ун-та, 2011.-С. 281 -282.

8. Саватеева. Е.А. Серосодержащие гетероциклические соединения - блокаторы неферментативного гликозилирования белков / Е.А. Саватеева. В.В. Емельянов, A.B. Мусальникова, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Тезисы докладов IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с Молодёжной научной школой по органической химии, Уфа-Абзаково, 4-8 июня 2013 г. - Уфа: Изд-во БашГУ, 2013. - С. 101.

9. Саватеева. Е.А. Серосодержащие гетероциклические соединения с потенциальной противодиабетической активностью / Е.А. Саватеева. В.В. Емельянов, A.B. Мусальникова, Л.П. Сидорова, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Материалы конференции «Химия в федеральных университетах». Сборник статей. Екатеринбург: УрФУ, 2013. - С. 142 - 144.

Ю.Емельянов, В.В. Влияние серосодержащих антиоксидантов на развитие экспериментального сахарного диабета / В.В. Емельянов, Е.А. Саватеева. A.B. Мусальникова, Л.П. Сидорова, А.П. Новикова, Т.С. Булавинцева, И.Ф. Гетте, И.Г. Данилова, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Сборник научных статей Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики», посвященной памяти академика АН РТ профессора Д.М. Зубаирова. Казань, 23-26 сентября 2013 г. -КканыИздагельс1во«Отечялво»,2013.-С62 - 68.

11. Емельянов, В.В. 1,3,4-Тиадиазины в экспериментальной терапии сахарного диабета / В.В. Емельянов, Е.А. Саватеева. Л.П. Сидорова, И.Ф. Гетте, Т.С. Булавинцева, И.Г. Данилова, H.H. Мочульская, О.Н. Чупахин, В.А. Черешнев // Уральский научный форум «Современные проблемы органической химии». Сборник тезисов. Екатеринбург, 8-12 июня 2014 г. - Екатеринбург: УрФУ, 2014. - С. 46.

12. Емельянов, В.В. Синтетические блокаторы неферментативного гликозилирования белков для экспериментальной терапии сахарного диабета / В.В. Емельянов, Е.А. Саватеева. Л.П. Сидорова, Т.С. Булавинцева, И.Ф. Гетте, И.Г. Данилова, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Фундаментальная гликобиология: материалы конференции. II Всероссийская конференция. Саратов, 7-11 июля 2014. - Саратов: ООО «Ракурс», 2014. - С. 30.

13. Саватеева. Е.А. Серосодержащие гетероциклические соединения с потенциальной противодиабетической активностью / Е.А. Саватеева. В.В. Емельянов, A.B. Мусальникова, Л.П. Сидорова, Н.Е. Максимова, H.H. Мочульская, В.А. Черешнев // Chimica Techno Acta. - 2014. - V.l, №3. - С. 83 - 86.

Используемые сокращения

1,3,4-ТД- 1,3,4-тиадиазин

2-Г-4-ПТ - 2-гуанидин-4-пиридинтиазол

G-SH - глутатион восстановленный

G-SS-G - глутатион окисленный

HbAic - гликозилированный гемоглобин

RAGE - рецептор конечных продуктов гликозилирования

АК - аскорбиновая кислота

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГИЧ - генноинженерный инсулин человека

КПГ - конечные продукты гликозилирования

JIK - липоевая кислота