Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Неферментативное гликозилирование коллагена in vitro и возможные пути его регуляции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Неферментативное гликозилирование коллагена in vitro и возможные пути его регуляции"

На правах рукописи

ТИМОФЕЕВА Мария Владимировна

НЕФЕРМЕНТАТИВНОЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ КОЛЛАГЕНА IN VITRO И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ЕГО РЕГУЛЯЦИИ

03.00.04-Биохимия 03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском и учебно-методическом Центре биомедицинских технологий Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений РАСХН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Ведущая организация:

ГУ НИИ биомедицинской химии им.

Ребров Леонид Борисович Бержицкая Валерия Владимировна

Хасигов Петр Заурбекович Панасенко Олег Михайлович

¡.Н.Ореховича РАМН.

Защита состоится « » 2004 года В 'О.РО часов на заседании

диссертационного совета Д 208.057.01 при ГУ НИИ физико-химической медицины МЗ РФ по адресу: 119992, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ физико-химической медицины МЗ РФ.

Автореферат разослан «¿3» О^МЩРЗаША года.

Ученый секретарь диссертационного совета'?

доктор биологических наук Мурина М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Взаимодействие белков и, в частности, коллагена органов и тканей с углеводами, т.е. неферментативное гликозилирование, происходит при старении организма человека и лежит в основе патогенеза наиболее серьезных осложнений сахарного диабета (почечная недостаточность, катаракта, тромбозы, атеросклероз и др.) [Mormier V.M., 1990; Wells-Knecht M.C. е.а., 1995; Bailey A.J.,

Процесс неферментативного гликозилирования коллагена, пусковым механизмом которого служит связывание глюкозы или других восстанавливающих Сахаров с боковыми аминогруппами этого белка, в конечном итоге приводит к изменению его молекулярной структуры и физико-химических свойств. Происходит нарушение конформации тройной спирали молекул коллагена, изменение распределения поверхностных зарядов, а также через каскад реакций окисления, дегидратации и различных химических превращений образование новых флуоресцирующих продуктов, (имеющих специфические спектральные характеристики) и дополнительных, внутри- и межмолекулярных поперечных связей [Reiser K.M., 1991, Tarsio J.F. е.а., 1985]. Все это вызывает функциональные нарушения соединительной ткани разных органов: ригидность стенок артерий, дисфункцию почечных капилляров, жесткость и гиперплазию дермы кожи, уменьшение эластичности и проницаемости базальных мембран и развитие других патологий [Vlassara H. е.а., 1994; Sing R. е.а., 2001].

В настоящее время проблема неферментативного гликозилирования коллагена in vivo и in vitro практически не разрабатывается в России и активно изучается в основном зарубежными биохимиками и практическими врачами. Однако многие принципиальные вопросы и конкретные биохимические механизмы изменения структуры этого белка остаются не до конца выясненными.

Так, в литературе основное внимание уделяется идентификации конкретных химических соединений, образующихся в результате гликозилирования белка [Tessier F. е.а., 1999; Biemel K.M. е.а., 2002], однако остаются не совсем понятными скорость и место образования этих продуктов, а также их вклад в патологическую модификацию структуры коллагена. Остается практически не изученным вопрос о роли телопептидов в изменении структурной стабильности гликозилированного коллагена. В литературе имеется мало данных по изучению кинетики реакций неферментативного гликозилирования чистых препаратов коллагена in vitro. Достаточно спорными остаются представления о роли окислительных процессов с участием активных форм кислорода, ионов хелатных металлов и образующихся активных ди-карбонилов [Baynes J.W. е.а., 1999; Mossine V.V. е.а., 1999; Jakus V., 2000]. Кроме того, большинство исследований процесса неферментативного гликозилирования кол-

2001].

лагена в тканях in vitro проводится

показатели

структурной мойификаЦйй [Юл&ён^сЬ^сг'веЫю кшкйг <кАУк(-/ся мало изученными. И, наконец, в должной мере не исследованы факторы и механизмы регуляции реакций неферментативного гликозилирования коллагена .на мрлекулярном и тканевом уровне in vitro, позволяющие лучше понять повреждение кодпагеновых структур in vivo и представить пути возможного предупреждения и коррекции этих нарушений применительно к проблемам старения, диабета и других патологий.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось комплексное изучение изменений $ структуре коллагена на молекулярном и тканевом уровнях в процессе неферментативного гликозилирования in vitro по ряду биохимических и. биофизических показателей и исследование действия различных соединений, регулирующих этот процесс.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Изучить характер изменений биохимических и спектральных показателей коллагена (на коммерческом препарате белка) в процессе длительной инкубации с

. глюкозой, сроком до 1 года.

2. Исследовать скорость и место образования дополнительных поперечных связей и новых флуоресцирующих соединений в коллагеновых молекулах в процессе гликозилирования in vitro, используя обработку белка протеолитическими ферментами с разной' специфичностью действия.

3. Оценить роль телопептидов в изменении структурной стабильности коллагена при гликозилированйи in vitro.

4. Выяснить общие закономерности и различия в кинетике образования ранних и конечных Продуктов гликозилирования коллагена под действием высокой концентрации глюкозы (1,5М) и при концентрации в 20 раз ниже (0,07М).

5. Изучить динамику изменения фракционного состава коллагена дермы кожи человека и образования дополнительных поперечных сшивок в структуре нерастворимого коллагена при неферментативном гликозилированйи in vitro.

6. Исследовать влияние соединений, ингибирующих разные факторы или реакции гликозилирования белка (гуанидин хлорид, каталаза, диэтилентриаминопента-уксусная кислота, ацетилсалициловая кислота), на биохимические и спектро-флуориметрические характеристики коллагена при неферментативном гликози-лированйи in vitro.

Научная новизна. В работе впервые проведено сравнительное комплексное биохимическое и биофизическое изучение модификаций в структуре коллагена при неферментативном гликозилирования in vitro на двух уровнях организации белка -молекулярном и тканевом.

Впервые изучена динамика изменений биохимических и спектральных характеристик коллагена в процессе длительной (до 1 года) инкубации с глюкозой.

Доказана ведущая роль концевых неспирализованных участков (телопептидов) молекулы коллагена в образовании дополнительных поперечных сшивок и повышении структурной стабильности белка на ранних сроках гликозилирования in vitro.

Получены новые данные об особенностях структурной модификации коллагена дермы кожи при гликозилировании in vitro. Впервые при этом показано изменение фракционного состава коллагена, формирование новых более стабильных связей-сшивок и флуорофор-содержащих соединений в нерастворимой фракции коллагена, скорость и место их образования, а также структурные особенности этих конечных продуктов гликозилирования белка.

Впервые одновременно исследовано влияние нескольких различных химических соединений и их комбинаций, ингибирующих разные реакции образования продуктов гликозилирования коллагена, на изученные биохимические и спектро-флуориметрические показатели коллагена при неферментативном гликозилировании in vitro. При этом выявлены ключевые и лимитирующие этапы и факторы, способные играть важную роль в регуляции процесса гликозилирования коллагена in vitro и in vivo.

Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют современные биохимические представления о процессе неферментативного гликози-лирования коллагена и механизмах его возможной регуляции с общебиологической точки зрения.

Представленные экспериментальные данные позволяют понять биохимические особенности модификации коллагена и коллагенсодержащих структур при старении и развитии различных патологий, как на молекулярном, так и на тканевом уровне.

Одним важнейших научно-практических аспектов диссертации является выяснение ключевых факторов и этапов, участвующих в регуляции реакций процесса неферментативного гликозилирования, что крайне актуально для разработки новых медикаментозных средств, снижающих количество и качество осложнений при диабете, а в перспективе - и предотвращающих старение организма.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Основные результаты работы были представлены на научно-практической конференции НИЦ БМТ ВИЛАР "Биомедицинские технологии", г. Москва, 2002 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах, содержит 46 рисунков и 10 таблиц, состоит из введения, обзора литературы (2 главы), материалов и методов, результатов собственных исследований (3 главы), обсуждения и выводов. Список литературы включает 190 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали препарат коллагена ("Serva") и дерму кожи человека.

Образцы коллагена инкубировали при 35°С в течение разных сроков (от 5 сут. до 12 мес.) с 1,5М или 0,07М глюкозой в 0,2М фосфатном буфере с добавлением антисептиков. Аналогично инкубировали образцы дермы с 0,7М глюкозой. Отдельно инкубировали коллаген с 1,5М глюкозой в присутствии гуанидин хлорида (0,ЗМ); или каталазы (3000 ед.актУмл); или DETAPAC (0,1М); или каталазы и гуа-нидина вместе, в указанных концентрациях; или АСК (0,3 и 0,1М). Коллаген с 0,07М глюкозой инкубировали с АСК (15мМ) [Hunt J.V. е.а., 1988; Monnier V.M., 1990, WolffS.P. е.а., 1991; Malik N.S. е.а., 1994; Elgawish А. е.а., 1996].

Контролем служили образцы коллагена или дермы, инкубированные в аналогичных условиях, без глюкозы.

Удаление телопептидов из молекул коллагена перед гликозилированием образцов проводили по методике [Zimmermann B.K. е.а., 1973].

Содержание в коллагене ранних продуктов гликозилирования оценивали по реакции с ТБК, специфической для кетоаминосвязанных гексоз (D443) [Schnider S.L. е.а., 1980].

Содержание карбонильных групп в белке определяли по реакции с ДНФГ [Cao G. е.а., 1995].

Степень устойчивости коллагена к протеолитическому действию коллагеназы, пепсина и проназы определяли по количеству оксипролина, перешедшего в раствор (%), при соотношении ферментхубстрат 1:2, t=+37°C [Stegemann H. е.а., 1967].

Продукты гидролиза коллагена исследовали флуоресцентным методом (на спектрофлуориметре "Shimadzu - RF 540") и методом гель-хроматографии (на колонке с "Toyopearl HW-55F") [Bellmunt J.M. е.а., 1995].

Коллаген дермы фракционировали, используя последовательное экстрагирование растворами lMNaCl и 0,5МСНзСООН. Определяли количество оксипро-лина, перешедшего в раствор [Schnider S.L. е.а., 1981].

Нерастворимую фракцию коллагена дермы последовательно гидролизовали пепсином, коллагеназой и IN NaOH. В гидролизатах определяли содержание окси-пролина, распределение продуктов гидролиза по молекулярной массе методом гель-хроматографии и измеряли интенсивность флуоресценции при ех370/ет440 и ех335/ет400.

Данные обрабатывали, используя распределение Стьюдента для малых выборок [Лакин Г.Ф., 1980].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Модификация структуры коллагена в процессе гликозилирования in vitro

Принятая схема неферментативного гликозилирования коллагена кратко представлена на рис.1 [Monnier V.M., 1990].

В нашем исследовании изучение модификаций в структуре коллагена в процессе его гликозилирования in vitro проводилось на основе биохимической и биофизической (спектрофлуориметрической) характеристики ранних, промежуточных и конечных продуктов гликозилирования.

Рис. 1. Схема неферментативного гликозилирования коллагена (по реакции Майяра).

1.1. Кинетики образования основныхпродуктов гликозилирования коллагена

Первоначально в работе исследовали динамику и характер изменений в структуре коллагена по ряду показателей в процессе длительной (до 12 месяцев) инкубации коммерческого препарата этого белка с 1,5М глюкозой.

На рис. 2 представлены кинетики накопления в коллагене ранних продуктов гликозилирования (оцениваемых по ТБК-реакции, А), продуктов гликоокисления белка (определяемых по количеству карбонильных групп в белке, Б) и динамика образования новых флуорофоров (регистрируемая по интенсивности флуоресценции кислотных гидролизатов коллагена при ех335/ет400 и ех370/ет440, характерных для разных групп конечных продуктов гликозилирования, В).

Видно, что в течение первых 5-ти суток инкубации с глюкозой в коллагене быстро увеличивалось содержание ТБК-активных продуктов (в 2 раза по сравнению с контролем), однако в это же время уже увеличивался и уровень карбонильных групп в белке (в 2-2,5 раза), и незначительно возрастала интенсивность флуоресценции (только при 440 нм) кислотных гидролизатов коллагена (в 1,3-1,5 раза). Затем в течение 1-5 месяцев гликозилирования коллагена in vitro продолжалось накопление ТБК-продуктов, карбонилов, увеличивалась интенсивность флуоресценции в двух измеряемых диапазонах спектра. К 5 месяцам эксперимента количество ТБК-активных продуктов повышалось по сравнению с контролем в 3-4 раза и дальше уже не возрастало. Образование карбонилов постепенно замедлялось, но не прекращалось вплоть до 12 месяцев, превышая уровень в контроле в 15-20 раз. Кинетика образования флуоресцирующих продуктов различалась в зависимости от диапазона спектра измерения: интенсивность флуоресценции при ех335/ет400 продолжала четко увеличиваться к 12 месяцам, а при ех370/ет440 - практически не изменялась после 5 месяцев.

Полученные данные свидетельствуют о том, что уже в течение нескольких суток взаимодействия in vitro коллагена с глюкозой образуются не только ранние продукты гликозилирования (Шиффовы основания, продукты Амадори), но происходят и другие изменения в структуре белка: его окисление, и, возможно, даже незначительное образование соединений, флуоресцирующих около 440 нм. В течение 1-2 месяцев интенсивно продолжается гликоокисление белка и появление разных флуо-рофоров. Наиболее длительные процессы, продолжающиеся свыше 5-ти месяцев, -это окисление коллагена и образование продуктов, флуоресцирующих только в коротковолновом диапазоне, около 400 нм.

Вероятно, неферментативное гликозилирование коллагена может интенсивно продолжаться в течение длительного времени, что крайне важно для понимания модификации структуры коллагена - этого наиболее долгоживущего белка организма.

В следующей серии экспериментов, используя протеазы с разной специфичностью действия (коллагеназу, пепсин и проназу), мы исследовали изменение структурной стабильности коллагена в процессе гликозилирования in vitro. Из представленных на рис. 3 данных видно, что в процессе инкубации с глюкозой наиболее быстро и резко происходило повышение устойчивости коллагена к действию пепсина. За 1-ый месяц гликозилирования in vitro величина гидролиза белка уменьшалась с 70% до 4%. Резистентность к действию коллагеназы наиболее резко изменялась только ко 2-му месяцу эксперимента: величина протеолиза снижалась с 90% до 20%. Однако к действию проназы коллаген не только не приобретал дополнительную устойчивость в процессе инкубации с глюкозой, но на относительно поздних сроках гликозилирования (свыше 2-х месяцев) величина гидролиза отмечалась повышенной.

0 2 4 6 8 10 12 Время инкубации, мес.

Известно, что коллагеназа разрушает только область тройной спирали молекул коллагена. Пепсин и проназа гидролизуют белок с концевых неспирализованных участков, т.е. в области телопептидов, однако проназа обладает значительно более широкой субстратной специфичностью [Слуцкий Л.И., 1969]. Можно предположить, что в процессе неферментативного гликозилирования коллагена образование поперечных сшивок гораздо быстрее происходит в области телопептидов (что доказывает резкое возрастание устойчивости к пепсину), чем в спирализованной части молекулы (оценка устойчивости к действию коллагеназы).

Действие проназы, возможно, связано с ббльшей доступностью этого фермента к местам специфического действия в гликозилированном коллагене. Это может быть вызвано, например, изменением конформации молекул за счет образования конечных продуктов реакции Майяра.

Рис. 3. Величина гидролиза коллагена под действием коллагеназы (—■ —), пепсина (—О—) и проназы (— -¿г- • ) в зависимости от продолжительности его инкубации с 13М глюкозой.

е 0

1.2. Характеристика гликозилированного коллагена, ' не содержащего телопептиды

В литературе нет четкого вывода о том, какие участки коллагеновой молекулы играют ббльшую роль при образовании разных типов связей в процессе гликозили-рования. Для оценки вклада области телопептидов, мы предварительно удаляли их из молекул, а затем инкубировали полученный коллаген, не содержащий эти концевые участки, с глюкозой. Сравнительные данные по определению устойчивости коллагена, содержащего и не содержащего телопептиды, к действию разных протеаз в процессе гликозилирования in vitro, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Величина гидролиза коллагеназой и пепсином коллагена, содержащего и не содержащего телопептиды, через 1 месяц инкубации без глюкозы (контроль) и с 1,5М глюкозой

Оксипролин, перешедший в раствор (%)

Фермент: ПЕПСИН КОЛЛАГЕНАЗА

Коллаген: Содержит телопептиды Удалены телопептиды Содержит телопептиды Удалены телопептиды

Контроль 73 ±3 77 ± 3 99+1 92 ±5

1 месяц инкубации с глюкозой 4 ± 1 13 ±1 90 ±5 40 ±8

Получено четкое различие между коллагеном, имеющим нативную структуру молекулы, т.е. содержащим концевые неспирализованные участки (телопептиды), и коллагеном без телопептидов, по их чувствительности к действию протеолитиче-ских ферментов после гликозилирования in vitro. Так, после инкубации с глюкозой в течение 1 месяца коллаген, содержащий телопептиды, приобретал в 3-4 раза более высокую устойчивость к действию пепсина, чем коллаген без этих концевых участков (величина гидролиза, соответственно, 4% и 13%), а в случае действия коллаге-назы, наоборот, гидролизовался примерно в 2 раза сильнее.

Исходя из полученных данных и специфичности действия использованных в описанных опытах ферментов, можно предположить, что коллаген, сохраняющий нативную структуру молекул, приобретает высокую степень устойчивости на ранних сроках гликозилирования (1 месяц) за счет образования связей именно в области телопептидов.

1.3. Гликозилирование коллагена in vitro при низкой концентрации глюкозы

Для выяснения общих закономерностей и различий гликозилирования коллагена in vitro в зависимости от действующей концентрации глюкозы в работе исследовали особенности модификации коллагена при инкубации с глюкозой, использованной в другой, меньшей в 20 раз концентрации - 0,07М.

Сравнительные данные по устойчивости гликозилированного в указанных условиях коллагена к действию протеолитических ферментов свидетельствуют о том,

-8-

что его устойчивость к коллагеназе в процессе обработки 0,07М глюкозой увеличивалась примерно так же, как и под действием 1,5М глюкозы. Однако величина гидролиза коллагена пепсином через 1 месяц инкубации с 0,07М глюкозой была в 8 раз выше (33%), чем при действии 1,5М глюкозы (4%), хотя последующее длительное гликозилирование, в течение 5 месяцев, приводило к одинаково высокой степени устойчивости гликозилированного белка (величина протеолиза составляла всего 3%).

Характеристика образования в коллагене отдельных продуктов гликозилирова-ния (Рис. 4) также свидетельствовала о выраженных различиях в динамике этого процесса под действием разных концентраций глюкозы.

Так, уровень ТБК-активных продуктов (Рис. 4, А) за 1 месяц инкубации с 0,07М глюкозы не изменялся по сравнению с контролем, тогда как в присутствии!,5 М глюкозы - возрастал в 3 раза. Через 5 месяцев гликозилирования при низкой концентрации глюкозы количество ТБК-продуктов увеличивалось всего в 1,5-2 раза, а при действии 1,5М - в 5-6 раз.

Количество образующихся в белке карбонильных групп (Рис. 4, Б) также резко снижалось на ранних сроках гликозилирования при низких концентрациях глюкозы: через 1 месяц инкубации коллагена с 0,07М глюкозой их прирост (по сравнению с контролем) был в 7 раз меньше, чем в присутствии 1,5М глюкозы, тогда как через 5 месяцев гликозилирования - всего в 1,5 раза меньше.

Что касается биофизических показателей, то значения флуоресценции продуктов кислотного гидролиза коллагена (Таблица 2) практически не различались в зависимости от действующей концентрации глюкозы, причем и через 1 месяц, и через 5 месяцев инкубации. Возможно, образование флуорофоров происходит почти с максимальной скоростью в присутствии уже 0,07М глюкозы, и дальнейшее повышение концентрации углевода практически не приводит к увеличению их образования.

Таблица 2.

Интенсивность флуоресценции при ех370/еш440 и ех335/ет400 продуктов кислотного гидролиза и протеолиза коллагеназой, пепсином и проназой коллагена, инкубированного в течение 1 и 5 месяцев с глюкозой в концентрациях 1,5М и 0,07М

Срок инкубации с глюкозой Интенсивность флуоресценции, усл.ед.

ех370/ет440 ex33S/em400

0,07 М глюкозы м глюкозы 0,07 М глюкозы М глюкозы

Кислотный гидролиз

1 месяц 15 + 2,8 17 + 3,0 32 ±3,1 41 ± 4,6

5 месяцев 32 ±2,5 37 ±1,2 86 ±3,3 95 ±4,3

Протеолиз коллагеназой

1 месяц 16 ± 0,8 16 ±1,3 33 ± 1,5 32 ±3,5

5 месяцев 32 ±1,9* 61 ±6,2 69 ± 3,1* 98 ± 7,9

Протеолиз пепсином

1 месяц 9 ± 0,7* 15 ±0,8 22 ± 2,7 29 ±2,9

5 месяцев 25 ± 2,3* 75 ±11,3 62 ±5,6* 164 ±31,3

Протеолиз проназой

1 месяц 21 ±2,2 16±3,1 33 ±1,0* 40 ± 1,8

5 месяцев 19 ±2,5* 38 ±3,2 75 ±4,8* 103 ± 12,7

Все значения интенсивности флуоресценции нормированы на 0,1 мг коллагена.

Значения флуоресценции в контрольных образцах приняты за "0".

*- р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем при действии 1,5 М глюкозы

Однако интенсивность флуоресценции продуктов ферментативного гидролиза коллагена (табл. 2), инкубированного с 0,07М глюкозы в течение 5 месяцев, была гораздо ниже, чем в присутствии 1,5 М глюкозы (при ех370/ет440 в 2-3 раза, а при ех335/ет400 в 1,5-2 раза). Эти данные свидетельствуют о том, что под действием глюкозы в более низкой (0,07М) концентрации, возможно, происходит более равномерное распределение образующихся флуоресцирующих продуктов гликозилирова-ния в различных участках молекулы коллагена, гидролизуемых разными по специфичности действия протеолитическими ферментами.

Таким образом, в целом при снижении действующей концентрации глюкозы в 20 раз,' резко замедлялись одни процессы и почти не изменялись другие. По-видимому, именно на ранних сроках гликозилирования in vitro (1 месяц) резко снижалась скорость образования поперечных связей в концевых участках молекулы коллагена, при этом не происходило накопление ранних продуктов гликозилирования и также резко замедлялось окисление самого белка. Вместе с тем, характер образования связей в спирализованной части молекул коллагена и общее количество образующихся флуоресцирующих соединений практически не изменялись.

2. Изменения биохимических и спектральных характеристик коллагена дермы кожи человека при гликозилировании in vitro

Изучение процесса гликозилирования коллагена in vitro было продолжено в опытах с использованием в качестве биоматериала дермы кожи человека, где этот белок в весовом отношении составляет около 80% [Мазуров В.И., 1974]. Основной целью этих экспериментов было оценить особенности гликозилирования коллагена на другом уровне его структурной организации - в составе фибрилл и волокон соединительной ткани кожи человека.

2.1. Структурная модификация коллагена дермы, гликозилированной in vitro

В процессе инкубации дермы с глюкозой (0,7М) в течение 1 и 5 месяцев также увеличивалась устойчивость коллагена к действию протеаз (Рис. 5), однако характер и динамика изменений резко отличались от предыдущих результатов, полученных на коммерческом препарате коллагена.

Рис. 5. Величина гидролиза коллагена дермы под действием коллагеназы и пепсина в контроле □ н после инкубации с глюкозой в течение 1 0, 5 В и 12 В месяцев.

Величина гидролиза коллагена дермы коллагеназой уменьшалась с 96% до 83% в течение 1-го месяца гликозилирования, однако через 5 и 12 месяцев снижалась всего до 76% и 71%, соответственно, тогда как в экспериментах на препарате коллагена на этих поздних сроках обработки глюкозой (и 0,07М, и 1,5М) белок становился очень устойчивым к действию коллагеназы. Степень протеолиза пепсином в it-чение 1-го месяца уменьшалась с 69% всего до 43% (в отличие от предыдущих экспериментов) и только через 5 и 12 месяцев гликозилирования in vitro этот показатель снижался до 4%.

Особенности изменения интенсивности флуоресценции при гликозилировании дермы отличались от данных, полученных на препарате коллагена, незначительно. Представленные на рис. 6 спектры возбуждения флуоресценции свидетельствуют о том, что, как и в случае препарата белка, в течение 1-го месяца гликозилирования дермы в 2-3 раза увеличивалась интенсивность флуоресценции при возбуждении в диапазоне длин волн 300-400 нм, с четким появлением двух пиков: 335 нм и 370 нм. В течение 5-ти месяцев наиболее интенсивно (еще в 2-3 раза) возрастала флуоресценция при возбуждении с максимумом 335 нм.

Рис.6. Типичные спектры возбуждения флуоресценции (em450) щелочных гидролизатов

коллагена дермы (А) и препарата коллагена (Б) в контроле (........), и при гликознлировании

In vitro в течение 1 (-) и 5 (-) месяцев.

Таким образом, показанные особенности изменения структурной стабильности коллагена дермы при гликозилировании in vitro, по-видимому, обусловлены существованием изначальной специфической фибриллярной организации коллагена в ткани, реагирующей в меньшей степени, чем чистый белок, на модифицирующее действие глюкозы. Однако закономерности образования флуоресцирующих продуктов свидетельствуют о том, что в коллагеновых структурах дермы может происходить достаточно интенсивный процесс гликозилирования.

По-видимому, именно образование новых связей специфически зависит от тканевого уровня организации коллагена. Вероятно, что коллаген, входящий в состав фибрилл и волокон соединительной ткани дермы и стабилизированный уже существующими ковалентными сшивками (с участием тех же аминокислотных остатков лизина, оксилизина и аргинина, которые могут вступать в реакции неферментативного гликозилирования), может содержать меньше возможных мест для образования дополнительных связей в спирализованных областях молекул.

Можно также предположить, что закономерности образования флуорфоров в процессе гликозилирования коллагена обусловлены уже молекулярным уровнем его организации, в отличие от характера формирования связей, который зависит от более высокого, надмолекулярного уровня структуры коллагена.

2.2. Фракционный состав и характеристика нерастворимой фракции коллагена дермы, гликозилированной in vitro

В работе исследовали динамику изменения фракционного состава коллагена дермы в процессе гликозилирования in vitro (таблица 3). В контрольных образцах, т.е. при инкубации дермы в отсутствие глюкозы, относительное содержание ней-трально-солерастворимой (НСРК) и кислоторастворимой (КРК) фракций коллагена в течение 12 месяцев несколько уменьшалось, примерно в 1,5-2 раза.

Таблица 3.

Содержание фракций коллагена в дерме нативной (контроль) и гликознлированной in vitro в течение 1-12 месяцев

Количество оксипролииа во фракциях, %

Срок инкубации НСРК КРК НК

Контроль (инкубация без глюкозы) Омес 5,27 ±0,22 0,79 ±0,11 93,94 ±0,32

12мес 3,88 ± 0,25 0,40 ±0,09 95,72 ±0,17

Гликозили- роваиие (инкубация с глюкозой) Омес 5,27 ±0,22 0,79 ±0,11 93,94 ±0,32

1 мес 1,34 ±0,12 0,48 ±0,09 98,18 ±0,31

2 мес 1,47 ±0,23 0,37 ±0,11 98,16 ±0,24

5 мес 1,59 ±0,27 0,51 ±0,11 97,09 ±0,42

12 мес 0,90 ±0,16 0,39 ±0,07 98,70 ±0,20

В гликозилированных образцах дермы (инкубация с 0,7 М глюкозой) уже через 1 месяц содержание НСРК резко снижалось, в 4 раза, в дальнейшем изменяясь незначительно, но к 12 месяцам эксперимента уменьшалось уже в 6 раз. Однако содержание КРК снижалось в течение 12 месяцев гликозилирования точно так же, как и в контроле - в 1,5-2 раза. Относительное содержание нерастворимого коллагена (НК) соответственно увеличивалось, в ббльшей степени при гликозилировании, чем в контрольных образцах.

Известно, что экстрагируемые нейтрально-солевыми буферами молекулы НСРК практически не содержат поперечных ковалентных связей. Молекулы КРК в основном стабилизированы внутримолекулярными связями, а НК, составляющий основу фибриллярных структур, имеет развитую сеть внутри- и межмолекулярных сшивок [Никитин В.Н. и др, 1977]. Полученные данные по характеристике фракционного состава коллагена дермы, инкубированной с глюкозой, свидетельствуют о том, что в процессе гликозилирования дермы in vitro происходит резкая и значительная модификация основной массы молекул НСРК с переходом их в нерастворимое состояние, по-видимому, за счет быстрого образования внутри-, и особенно, межмолекулярных связей.

В отдельной серии экспериментов изучали образование дополнительной сети ковалентных поперечных связей в фибриллярных структурах дермы в процессе гли-козилирования in vitro. Для этого последовательно обрабатывали фракцию НК двумя разными по специфичности ферментами - сначала пепсином, а затем коллагена-зой. Как видно их рис. 7, контрольные образцы НК практически полностью гидро-лизовались пепсином, тогда как через 1 месяц, и особенно через 5 месяцев гликози-лирования дермы in vitro повышалась доля НК, устойчивая к действию пепсина (5% и 66%, соответственно), но полностью растворяемая коллагеназой. Через 12 месяцев гликозилирования около 7% НК становилось устойчивым уже не только к пепсину, но и к коллагеназе, и разрушалось только при жесткой денатурации щелочью. Интересно, что при этом величина гидролиза НК пепсином не изменялась (34%).

Исходя из результатов указанных экспериментов, можно предположить, что в течение 5 месяцев происходит постепенное образование сшивок, устойчивых к действию пепсина, т.е. в основном в области телопептидов, а к 12 месяцам наиболее устойчивые ковалентные связи, стабильные к действию обеих протеаз, образуются именно в спирализованной области коллагеновой молекулы.

Все полученные при последовательной обработке ферментами и щелочью гид-ролизаты НК оценивали также и по интенсивности их флуоресценции.

Таблица 4.

Интенсивность флуоресценции при ех370/ет440 и ех335/еш400 гидролизатов НК, полученных при последовательном действии пепсина, коллагеназы и щелочи.

глнкозилн- ^ч^ММИШ Обработка ^^ Контроль 1 месяц 5 месяцев 12 месяцев

Флуоресценция при ех370/ет440 (усл.ед.)

Пепсин 4± 1 17 ± 2 49 ±2 72 ±5

Комагешаа — 6±2 44 ±4 60 ±3

тон — — — 78 ±5

Флуоресценция при ех335/еш400 (усл.ед.)

Пепсин 7±2 25 ±3 79 ± 5 80 ±4

Коллагеназа — 15 + 3 72 ±6 86 ±4

тон — — — 156 ± 10

Все значения интенсивности флуоресценции нормированы на 0,1 мг коллагена

Полученные данные (Табл. 4) по увеличению показателей флуоресценции всех гидролизатов НК в зависимости от продолжительности инкубации дермы с глюкозой свидетельствуют о том, что в структуре НК дермы происходит интенсивное образование новых флуорофоров, четко зависимое от времени гликозилирования.

Интересно отметить, что в щелочном гидролизате НК, устойчивого к действию коллагеназы и получаемого только через 12 месяцев гликозилирования, интенсивность флуоресценции при ех335/ет400 была в 2 раза выше, чем в гидролизатах пепсином и коллагеназой.

Можно предположить, что при длительном гликозилировании в спирализован-ной области молекул НК образуются такие конечные продукты гликозилирования (например, пентозидин), которые одновременно придают коллагену высокую степень структурной стабильности и интенсивно флуоресцируют именно при ех335/ет400.

Для более детальной характеристики модификации коллагена фибриллярных структур дермы в процессе гликозилирования, все полученные гидролизаты НК исследовали методом гель-хроматографии на колонке с 'Тоуореай Н^55Р". Изучали распределение продуктов гидролиза по молекулярной массе (М.м.), определяя содержание оксипролина во фракциях, а соответствующее распределение хромофоров в этих фракциях - по интенсивности флуоресценции при ех335/ет400.

3 <2 А Выше "300 50 5 1кДа 4 444 3 г Выше 300 50 5 1кДа Б 4 444 /Г 3 В Выше " 300 50 5 ВДа 4 4 41

s к о !■ О 2 / 2 1

0 ' Inj 0 * O^HctjfTRpwfiT) i) ы. i j ^ 0

10 15 20 25 30 35 10 15 20 25 30 35 10 15 20 25 30 35

Фракции, мл Фракции, мл Фракции, мл

Рис. 8. Распределение по молекулярной массе методом гель-хроматографии продуктов по- ,4 следовательно™ гидролиза (А - пепсином, Б - коллагеназой, В - щелочью) НК дермы контрольной (•■■♦—) и гликозилнрованной in vitro в течение 1 (—О —), 5 (—й—) н 12 (—) месяцев.

Обнаружено (Рис. 8), что продукты протеолиза НК пепсином (А) и коллагеназой (Б) при увеличении срока гликозилирования характеризовались смещением в сторону высоких значений их М.м., что также свидетельствует об образовании в коллагене дополнительных внутри- и межмолекулярных связей. Фракция НК, пщ-ролизуемая только щелочью (В) и появляющаяся только через 12 месяцев гликозилирования, также содержала большое количество высокомолекулярных продуктов, т.е., по-видимому, модифицированный на этой стадии гликозилирования НК харак-

теризовался хорошо развитой сетью поперечных сшивок, делающей структуру коллагена устойчивой к гидролитическому действию протеаз и щелочи.

Интенсивность флуоресценции в изученных фракциях продуктов протеолиза (Рис. 9) также увеличивалась в процессе гликозилирования. При этом флуоресценция продуктов гидролиза коллагеназой (Б) через 12 месяцев была максимальной во фракции с М.м. около 5 кДа, а выход по количеству оксипролина - в более низкомолекулярной фракции, около 1 кДа (аналогичное смещение отмечалось уже и через 5 месяцев).

Однако при гидролизе щелочью (В) наиболее интенсивной флуоресценцией характеризовались низкомолекулярные фракции (<1 кДа), тогда как содержание оксипролина было выше в более высокомолекулярном материале (>1 кДа).

Эти результаты подтверждают нашу точку зрения, что при длительном глико-зилировании in vitro в коллагеновых структурах дермы кожи образуются множественные продукты, различающиеся и по их способности формировать дополнительные поперечные сшивки, и по их флуоресцентной характеристике.

Основное изменение коллагеновых структур дермы при гликозилировании in vitro заключается в переходе отдельных молекул коллагена в нерастворимое состояние за счет формирования межмолекулярных связей, что может серьезно нарушать нормальный процесс фибриллогенеза in vivo, а также в значительном повышении структурной стабильности самих фибриллярных структур, что снижает эластичность и упругость дермы и в организме может приводить к замедлению обновления коллагеновых фибрилл и волокон, т.е. к "старению" кожи.

3.. Влияние ингибиторов реакций гликозилирования на показатели структурной модификации коллагена in vitro

Известно, что процесс модификации коллагена под действием глюкозы неразрывно связан с влиянием многих факторов: свободно радикальных и нерадикальных форм кислорода, активных дикарбонилов (продуктов аутоокисления углеводов и промежуточных продуктов гликозилирования), ионов металлов переменной валентности (Fe3+n Cu2+) (см. рис. 1) [Elgawish А. е.а., 1996; Mossine VV е.а., 1999; Bailey A.J., 2001].

Все эти факторы играют важную роль в процессе гликозилирования коллагена, однако не совсем ясно, на каком этапе их вклад является определяющим, и какое участие они принимают в наиболее серьезных изменениях структуры белка. Мало изученным остается также вопрос, важный в практическом отношении, о возможности регуляции модификации коллагена на каждом из стадий гликозилирования.

3.1. Особенности гликозилирования коллагена in vitro в присутствии соединений, ингибирующих действие ионов металлов, Н2О2, активных дикарбонилов Дня исследования этих вопросов в работе был изучен характер модификации коллагена при гликозилировании т vitro под влиянием известных ингибиторов этого процесса: DETAPAC как хелатора ионов металлов; каталазы, фермента, разрушающего Н2О2; гуанидин хлорида в качестве "ловушки" дикарбонилов (к которым относятся промежуточные высоко реакционно-способные продукты гликозилирования:' глиоксаль, метилглиоксаль, глюкозоны и дезоксиглюкозоны).

В опытах использовался препарат коллагена, модификацию которого в процессе инкубации с 1,5М глюкозой в присутствии ингибиторов оценивали по целому ряду показателей: количество ТБК-активных продуктов и карбонильных групп в белке, интенсивность флуоресценции, величина гидролиза коллагена под действием проте- > олитических ферментов.

Влияние всех использованных ингибиторов, действующих по отдельности, (Рис. 10, А) на показатель образования и накопления в коллагене ранних продуктов гликозилирования (ТБК-активных продуктов) было незначительным. Однако при совместном действии каталазы и гуанидина резко повышалось содержание указанных соединений на ранних сроках гликозилирования: за 5 суток инкубации с глюкозой количество ТБК-продуктов возрастало в 3 раза больше, чем в коллагене, гликозили-рованном без ингибиторов.

В то же самое время отмечался совершенно иной характер образования карбонильных групп в коллагене под действием ингибиторов (Рис. 10, Б). На ранних сроках гликозилирования (в течение 1-го месяца) значительно снижалось количество образующихся карбонильных групп в белке при гликозилировании in vitro в присутствии всех ингибиторов, действующих по отдельности (на 40-50%), а совместное ингибирующее влияние каталазы и гуанидина было еще более выраженным (на

65%). Однако в течение последующего гликозилирования (1-5 месяцев) отмечалось четкое статистически достоверное ингибирующее действие только одного соединения - гуанидина, а также совместно гуанидина с каталазой.

Рис. 10. Содержание ТБК-активных продуктов (Л) и карбонильных групп (Б) в коллагене в зависимости от срока его инкубации с 1,5М глюкозой без ингибиторов ( ♦ ) и в присутствии каталазы (—0- ■), гуанидина (— Лг -), ОЕТАРАС (—О *), или при совместном действии катал азы и гуанидина (--•--)

Во всех контрольных образцах, инкубированных без глюкозы как в присутствии ингибиторов, так и без них, количество ТБК-активных продуктов и карбонилов практически не различалось (-о-).

Полученные экспериментальные данные указывают на то, что наиболее быстрые изменения в белке: образование ранних продуктов гликозилирования, их распад и окисление самого коллагена, в разной степени зависят от действия исследуемых нами факторов (Н2О2 и, возможно, ОН*, образующихся дикарбонилов, ионов металлов). Так, первоначальное взаимодействие коллагена с глюкозой практически не зависит от их влияния, однако уже последующий распад ранних продуктов, возможно, усиливается при совместном действии активных форм кислорода и промежуточных дикарбонилов, а окисление самого коллагена может происходить с активным участием всех указанных факторов. Однако на поздних сроках гликозилирования (5 месяцев) роль ионов металлов и активных форм кислорода явно снижается. Образование реакционно-способных промежуточных продуктов гликозилирования (ингиби-руемых гуанидином) может, таким образом, явиться лимитирующим звеном, способным длительно реагировать на воздействие различных химических соединений или лекарственных препаратов и участвовать в регуляции неферментативного гли-козилирования коллагена.

Образование флуоресцирующих продуктов гликозилирования коллагена (Рис. 11) также снижалось под влиянием всех использованных ингибиторов, однако характер их ингибирующего действия четко различался.

Так, интенсивность флуоресценции при ех370/ет440 кислотных гидролизатов коллагена через 1 месяц гликозилирования in vitro в присутствии хелатора ионов металлов DETAPAC снижалась на 90% (Рис. 11, А). Каталаза и гуанидин, взятые по отдельности, практически не оказывали ингибирующего влияния, а при совместном действии интенсивность флуоресценции снижалась на 65%. В течение 5 месяцев гликозилирования достоверное ингибирующее действие оказывал только DETAPAC, однако степень его действия резко уменьшалась (всего 35%).

Значения флуоресценции при ех335/ет400 (Рис. 11, Б) через 1 месяц гликози-лирования коллагена in vitro также наиболее сильно уменьшались под действием DETAPAC (на 85%), однако и каталаза, и гуанидин по этому показателю тоже оказывали заметное ингибирующее действие (на 35-40%), а при их совместном применении ингибирующий эффект составлял уже 70%. Через 5 месяцев действие DETAPAC уже было менее выражено (40%), а ингибирование каталазой практически не изменялось, т.е. оставалось на уровне 30-35%. Гуанидин в этих условиях не оказывал статистически достоверного влияния по показателям флуоресценции.

Согласно полученным данным, можно предположить, что и это звено неферментативного гликозилирования, связанное с участием ионов металлов (Fe3+n Cu2+), также может быть "мишенью" для действия ингибиторов - регуляторов процесса модификации коллагена. В частности, можно констатировать наиболее выраженное ингибирующее действие хелатора ионов металлов на реакции образования всех флуоресцирующих продуктов гликозилирования.

Интересно отметить, что в присутствии разных ингибиторов в значительной мере изменялся и характер образования связей при гликозилировании коллагена.

Представленные в таблице 5 данные свидетельствуют о том, что по устойчивости коллагена к действию коллагеназы наиболее выраженное ингибирующее действие оказывал гуанидин. Величина гидролиза белка не изменялась по сравнению с контролем через 1 месяц гликозилирования, и снижалась всего на 20% через 5 месяцев (в коллагене, гликозилированном без ингибиторов, за 5 месяцев этот показатель снижался почти на 90%), т.е. гуанидин резко блокировал образование поперечных связей в молекуле коллагена при гликозилировании in vitro, и именно в спирализо-ванной области молекул этого белка.

Таблица 5.

Величина гидролиза коллагена, под действием коллагеназы и пепсина, после его инкубации в течение 1 и 5 месяцев с 1,5М глюкозой без ингибиторов и в присутствии DETAPAC, каталазы, гуанидин хлорида, или каталазы и гуанидина вместе

Фермент Срок инкубации с глюкозой Оксипролин, перешедший в раствор, %

Без ингибиторов DETAPAC каталаза гуанидин Каталаза + гуанидин

Коллагеназа Контроль 99+1 98 ± 1 98 ±2 99 ±1 98 ±2

1 мес 90 ±3 99 ± 1 87 ±4 98 ±2 97 + 3

5 мес 12±2 70 ±2 10 ± 2 10±3 78 ± 12* 37 ±4*

Пепсин Контроль 73 ±2 71 ±3 71 ±4 72 ±2

1 мес 4 ± 1 68 ±8' 17± 3* 38 ±5* 70 ±8*

5 мес 3 ± 1 3 ± 1 3±1 3±1 3+1

- различия достоверны со статистическим уровнем значимости рл0,05 межпу показателями коллагена, гликозилированного без ингибиторов и в их присутствии

По устойчивости коллагена к действию пепсина все используемые соединения оказывали ингибирующее действие только на ранних сроках гликозилирования (в течение 1-го месяца). При этом наиболее выраженным было влияние хелатора ионов металлов DETAPAC и совместное действие каталазы с гуанидином, тогда как гуанидин и каталаза по отдельности действовали в этом отношении гораздо слабее.

На основании полученных данных можно полагать, что в концевых и спирали-зованных участках молекул происходит формирование разных типов молекулярных сшибок, различающихся и по скорости, и по механизму их образования.

Таким образом, полученные результаты по устойчивости коллагена к действию ферментов и данные флуоресцентного анализа четко различаются и по избирательности действия ингибиторов, и по динамике изменений в их присутствии. Это свидетельствует о многочисленных различиях в реакциях образования поперечных связей и флуоресцирующих соединений, особенно четко отмечаемое по ингибирующе-му действию гуанидина, почти полностью предотвращающему образование сшивок' в спирализованной области коллагеновых молекул, и практически не влияющему на появление новых флуоресцирующих продуктов в структуре коллагена в процессе гликозилирования ш vitro.

3.2. Действие ацетилсалициловой кислоты на показатели структурной модификации коллагена при гликозилировании in vitro

В литературе считается, что действие АСК, также ингибирующей процесс неферментативного гликозилирования белков, в основном связано с блокированием боковых аминогрупп белка за счет их ацетилирования. Рассматривается также возможность фармакологического применения АСК в качестве средства, снижающего риск возникновения осложнений сахарного диабета [Malik N.S. е.а., 1994; Caballero F. е.а., 2000].

В наших исследованиях оценивалось ингибирующее действие АСК на процесс гликозилирования коллагена in vitro по всем вышеперечисленным биохимическим и спектральным показателям.

Первоначально нами было показано, что при взаимодействии 1,5М глюкозы с коллагеном, вызывающем уже в течение 5-ти суток инкубации повышение в 2 раза содержания в белке ТБК-продуктов, совершенно не происходило их накопления в присутствии АСК (0,1 и 0,ЗМ). Это сразу позволило предположить резкое снижение образования ранних продуктов гликозилирования в коллагене in vitro в присутствии АСК.

В следующей серии экспериментов мы инкубировали коллаген в течение 1 месяца с 0,07М глюкозы в присутствии 15мМ АСК и исследовали другие показатели: образование карбонильных групп в белке, изменение интенсивности флуоресценции и устойчивости коллагена к действию протеаз (Табл. 6).

Таблица 6.

Содержание карбонильных групп в белке, интенсивность кислотных гидролизатов (ех335/еш400 и ех370/еш440), величина гидролиза коллагеназой и пепсином коллагена, инкубированного в течение 1 месяца с 0,07М глюкозой без ингибиторов и в присутствии 15мМ АСК

Образцы, инкубированные в течение 1 месяца Без ингибиторов АСК(15мМ)

Карбонильные группы, нмоль на 1 мг коллагена

Контроль (инкубация без глюкозы) 2,5 ± 0,3 2,2 ±0,2

Гликозилирование (инкубация с глюкозой) 4,4 ± 0,2 3,5 ±0,3

Интенсивность флуоресценции, усл.ед.

ех370/ет44в ех335/ет400 ех37в/ет440 ех335/ет400

Ко [про ль (инкубация без глюкозы) 12 ±1,1 13 ±0,9 11 ±13 14 ±1,1

Гликозилирование (инкубация с глюкозой) 29 ±2,8 45 ±3,1 13 ±2,1 23 ±1,8

Величина гидролиза, %

Коллагенвза Пепсин Коллагенвза Пепсин

Контроль (инкубация без глюкозы) 99 ± 1 73 ±3 98 ±2 79 ±4

Гликозилирование (инкубация с глюкозой) 76 ±6 33 ±6 87 ±4 75 ±1

Полученные данные свидетельствуют о выраженном снижении всех реакций неферментативного гликозилирования коллагена под влиянием АСК: окисления белка; образования продуктов гликозилирования, флуоресцирующих в двух разных диапазонах спектра (ех335/ет400 и ех370/ет440); формирования сшивок, повышающих устойчивость коллагена к действию коллагеназы и пепсина.

На основании всех экспериментов по ингибирующему действию АСК на реакции неферментативного гликозилирования коллагена, а также в соответствии с литературными данными, можно предположить, что ацетилирование боковых аминогрупп белка в первую очередь блокирует взаимодействие коллагена с глюкозой, резко снижая все последующие реакции гликозилирования.

Таким образом, в целом все проведенные нами исследования не только подтверждают многофакторность процесса гликозилирования, сложный процесс цепных и разветвленных реакций, но и подчеркивают тонкие механизмы его регуляции. При блокировании одного из факторов или этапов может резко изменяться "классический" ход всех реакций, а может, наоборот, почти полностью компенсироваться за счет других процессов. Поэтому для наиболее полного и эффективного предотвращения повреждения коллагена по пути неферментативного гликозилирования, по-видимому, необходимо ингибировать этот процесс на самых ранних стадиях.

ВЫВОДЫ

1. Показаны выраженные изменения в структуре коллагена в процессе неферментативного гликозилирования in vitro. На ранних сроках инкубации с 1,5 М глюкозой (5 суток - 2 месяца) в коллагене идет накопление продуктов всех стадий гли-козилирования, с преобладанием образования поперечных сшивок. При длительном гликозилировании (5-12 месяцев) отмечалось только интенсивное глико-окисление коллагена и выраженное образование соединений, флуоресцирующих в коротковолновой области (около 400 нм).

2. Высокая степень устойчивости коллагена на ранних сроках гликозилирования in vitro обусловлена быстрым образованием поперечных связей в области телопеп-тидов (за 1 месяц) и более медленным (в течение 2-го месяца) - в спирализован-ной части молекул этого белка.

3. Характер и степень структурных изменений коллагена при гликозилировании in vitro в значительной степени зависят от концентрации глюкозы. При снижении в 20 раз действующей в опытах концентрации глюкозы резко замедлялись: накопление в коллагене ранних продуктов гликозирования, окисление белка, образование поперечных связей в области телопептидов. Однако при этом скорость образования сшивок в спирализованной части коллагена и общее количество образующихся флуорофоров практически не изменялись.

4. Структурная Модификация коллагена дермы кожи, гликозилированной in vitro, no сравнению с препаратрм этого белка лмела ряд существенных особенностей: основное, различие заключалось в уменьшении скорости образования и количества .додолнительных поперечных связей, особенно в спирализованной части коллаге-новых молекул; интенсивное образование новых флуоресцирующих соединений, четко связанное с, продолжительностью гликозилирования, в целом, по-видимому, не зависело от надмолекулярного уровня организации коллагйна.

5. В процессе неферментативного гликозилирования дермы in vitro обнаружено также существенное изменение фракционного состава коллагена, по-видимому, за счет быстрого образявания внутри, а особенно, межмолекулярных связей: резко снижалось содержание нейтрально-солерастворимой фракции, практически не изменялась доля кислоторастворимой фракции, а количество нерастворимого коллагена (НК) - увеличивалось. В НК дермы на поздних сроках гликозилирования in vitro (5 -12 месяцев) в спирализованной части молекул 'образуются дополнительные сшивки, которые, по-видимому, одновременно являются флуоресцирующими структурами.

6. Выявлено разнонаправленное действие известных ингибиторов процесса гликозилирования коллагена (гуанидин-хлорид, DETAPAC, фермент каталаза, ацетилсалициловая кислота) на характер модификации коллагена в процессе его глико-зилирования in vitro, характеризуемой по степени и скорости образования ТБК-активных продуктов, карбонилов, флуорофор-содержащих соединений и по чувствительности к гидролитическому действию специфических и неспецифических протеаз.

7. На основании полученных экспериментальных данных по влиянию ингибиторов на гликозилирование коллагена in vitro показаны лимитирующие этапы и факторы, играющие важную роль в механизмах регуляции процесса гликозилирования коллагена in vitro: образование ранних продуктов взаимодействия белка с глюкозой, активных дикарбонил-содержащих соединений, присутствие ионов металлов. Возможно, эти звенья процесса гликозилирования.могут быть "мишенями" фармакологического воздействия in vivo при лечении осложнений сахарного диабета и различных патологий при старении.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Тимофеева М.В., Бержицкая В.В., Реброва ГА., Василевский В.К., Со Сан Хо, Р маков ЮА, Быков ВА, Ребров Л.Б. Старение коллагена: модификация его с руктуры в процессе гликозилировании in vitro. IIТез. докл. на VIII Российском нац ональном конгрессе "Человек и лекарство", М., 2001, стр.494.

2 Тимофеева М.В., Бержицкая В.В., Со Сан Хо, Реброва ГА, Василевский В.К., Б IKOB BA, Ребров Л.Б. Биохимические свойства коллагена при старении кожи in vi го. II Тез. докл. на VI Международной научно-практической конференции "По-ж шой больной. Качество жизни", Клиническая геронтология, 2001, т.7, №8, стр.82.

3. Бержицкая В.В., Тимофеева М.В., Реброва ГА, Василевский В.К., Со Сан Хо, Р( бров Л.Б., Быков ВА Изучение модификации структуры коллагена при неферм нтативном гликозилировании in vitro. II Бюллетень экспериментальной биологии и .медицины, 2002, т. 133, №5, стр.514-518.

4. Тимофеева М.В., Реброва ГА, Бержицкая В.В., Василевский В.К., Со Сан Хо, П лкратова Г.В., Ромаков Ю.А., Ребров Л.Б. Модификация структуры коллагена в Пр оцессе старения in vitro. IIБиомедицинские технологиии, 2002, вып. 19, стр.48-55.

5. Тимофеева М.В., Бержицкая В.В., Реброва Г.А., Со Сан Хо, Быков В.А., Василев-CFли В.К., Ребров Л.Б. Изменения фракционного состава и сети поперечных сшивок кс тлагена кожи при гликозилировании in vitro. II Биомедицинские технологии и ра-Д1 оэлектроника, 2003, №6, стр.44-50.

6. Реброва ГА, Бержицкая В.В., Василевский В.К., Тимофеева М.В., Со Сан Хо № которые факторы старения коллагена in vivo и in vitro. II Биомедицинская химия, 2ОЗ.Т.49, №2, стр. 128-137.

7. Реброва Г.А., Бержицкая В.В., Василевский В.К., Тимофеева М.В., Василевский

8. <., Ребров Л.Б., Со Сан Хо, Быков В.А., Панкратова Г.В. Старение коллагена при гл псозилировании in vitro: модификация структуры и возможные пути регуляции. Ю иническая геронтология, 2004, т. 10, № 1, стр.20-26.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

ДХТАРАС - диэтилентриаминопентауксусная кислота

ex em - длины волн возбуждения и испускания флуоресценции

А( 'К - ацетилсалициловая кислота

Д} ФГ-динитрофенилгидразин

ЮК - кислоторастворимая фракция

НК - нерастворимая фракция коллагена

Н( РК - нейтрально-солерастворимая фракция

Т!К - 2-тиобарбитуровая кислота

«§20б9|

20.10.2004г. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. г.Москва, ул. Красина, 2 Типография ООО "Химия и бизнес"

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Тимофеева, Мария Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава 1. Неферментативное гликозилирование коллагена в органах и тканях

1.1. Коллаген - основной белок соединительной ткани.

1.2. Неферментативное гликозилирование коллагена.

1.3. Факторы, сопровождающие неферментативное гликозилирование белка in vitro и in vivo.

Глава 2. Клиническое значение изучения неферментативного гликозилирования коллагена в организме

2.1. Клинико-биохимическая характеристика гликозилированного коллагена органов и тканей при сахарном диабете и в старческом возрасте.

2.2. Ингибиторы реакций гликозилирования белков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1. Модификация структуры коллагена в процессе неферментативного гликозилирования in vitro

1.1. Кинетики образования основных продуктов гликозилирования коллагена.

1.2. Изменение структурной стабильности коллагена при гликозили-ровании in vitro.

1.3. Гликозилирование коллагена in vitro при низкой концентрации глюкозы.

Глава 2. Изменения биохимических и спектральных характеристик коллагена дермы кожи человека при гликозилировании in vitro

2.1. Структурная модификация коллагена дермы, гликозилированной in vitro.

2.2. Фракционный состав и характеристика нерастворимой фракции коллагена дермы, гликозилированной in vitro.

2.3. Особенности гликозилирования коллагена обезжиренной дермы кожи человека.

Глава 3. Влияние ингибиторов реакций гликозилирования на показатели структурной модификации и свойства коллагена 3.1. Особенности гликозилирования коллагена in vitro в присутствии соединений, ингибирующих действие ионов металлов, активных форм кислорода и дикарбонил-содержащих соединений.

3.2. Действие ацетилсалициловой кислоты на характеристики коллагена при гликозилировании in vitro.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Неферментативное гликозилирование коллагена in vitro и возможные пути его регуляции"

Взаимодействие белков и, в частности, коллагена органов и тканей с углеводами, т.е. неферментативное гликозилирование, происходит при старении организма человека и лежит в основе патогенеза наиболее серьезных осложнений сахарного диабета (почечная недостаточность, катаракта, тромбозы, атеросклероз и др.) [50,69,137,169].

Процесс неферментативного гликозилирования коллагена, пусковым механизмом которого служит связывание глюкозы или других восстанавливающих Сахаров с боковыми аминогруппами этого белка, в конечном итоге приводит к изменению его молекулярной структуры и физико-химических свойств. Происходит нарушение конформации тройной спирали молекул коллагена, изменение распределения поверхностных зарядов, образование новых соединений в структуре белка и дополнительных внутри- и межмолекулярных поперечных связей. Все это вызывает функциональные нарушения соединительной ткани разных органов: ригидность стенок артерий, дисфункцию почечных капилляров, жесткость и гиперплазию дермы кожи, уменьшение эластичности и проницаемости базальных мембран и развитие других патологий [19,22,26,51,71,81,130,149,166].

В настоящее время проблема неферментативного гликозилирования коллагена in vivo и in vitro практически не разрабатывается в России и активно изучается в основном зарубежными биохимиками и практическими врачами. Однако многие принципиальные вопросы и конкретные биохимические механизмы изменения структуры этого белка остаются не до конца выясненными.

Так, в литературе основное внимание уделяется идентификации конкретных химических соединений, образующихся в результате гликозилирования белка [84,127,146,147,168], однако остаются не совсем понятными скорость и место образования этих продуктов, а также их вклад в патологическую модификацию структуры коллагена. Остается практически не изученным вопрос о роли телопептидов в изменении структурной стабильности гликозилированного коллагена. В литературе имеется мало данных по изучению кинетики реакций неферментативного гликозилирования чистых препаратов коллагена in vitro, особенно в течение длительного времени. Достаточно спорными остаются представления о роли окислительных процессов с участием активных форм кислорода, ионов хелатных металлов и образующихся активных дикарбонилов. Кроме того, большинство исследований процесса неферментативного гликозилирования коллагена в тканях in vitro проводятся на образцах сухожилий, тогда как показатели структурной модификации коллагена собственно кожи остаются мало изученными. И, наконец, в должной мере не исследованы факторы и механизмы регуляции реакций неферментативного гликозилирования коллагена на молекулярном и тканевом уровне in vitro, позволяющие лучше понять повреждение коллагеновых структур in vivo и представить пути возможного предупреждения и коррекции этих нарушений применительно к проблемам старения, диабета и других патологий.

Целью нашей работы являлось комплексное изучение изменений в структуре коллагена на молекулярном и тканевом уровнях в процессе неферментативного гликозилирования in vitro по ряду биохимических и биофизических показателей и исследование действия различных соединений, регулирующих этот процесс.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Изучить характер изменений биохимических и спектральных показателей коллагена (на коммерческом препарате белка) в процессе длительной инкубации с глюкозой, сроком до 1 года.

2. Исследовать скорость и место образования дополнительных поперечных связей и новых флуоресцирующих соединений в коллагеновых молекулах в процессе гликозилирования in vitro, используя обработку белка протео-литическими ферментами с разной специфичностью действия.

3. Оценить роль телопептидов в изменении структурной стабильности коллагена при гликозилировании in vitro.

4. Выяснить общие закономерности и различия в кинетике образования ранних и конечных продуктов гликозилирования коллагена под действием высокой концентрации глюкозы (1,5 М) и при концентрации в 20 раз ниже (0,070 М).

5. Изучить динамику изменения фракционного состава коллагена дермы кожи человека и образования дополнительных поперечных сшивок в структуре нерастворимого коллагена при неферментативном гликозилировании in vitro.

6. Исследовать влияние соединений, ингибирующих разные факторы или реакции гликозилирования белка (гуанидин хлорид, каталаза и диэтилен-триаминопентауксусная кислота, ацетилсалициловая кислота), на биохимические и спектрофлуориметрические характеристики коллагена при неферментативном гликозилировании in vitro.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тимофеева, Мария Владимировна

выводы

1. Показаны выраженные изменения в структуре коллагена в процессе неферментативного гликозилирования in vitro. На ранних сроках инкубации с 1,5 М глюкозой (5 суток - 2 месяца) в коллагене идет накопление продуктов всех стадий гликозилирования, с преобладанием образования поперечных сшивок. При длительном гликозилировании (5-12 месяцев) отмечалось только интенсивное гликоокисление коллагена и выраженное образование соединений, флуоресцирующих в коротковолновой области (около 400 нм).

2. Высокая степень устойчивости коллагена на ранних сроках гликозилирования in vitro обусловлена быстрым образованием поперечных связей в области телопептидов (за 1 месяц) и более медленным (в течение 2-го месяца) - в спирализованной части молекул этого белка.

3. Характер и степень структурных изменений коллагена при гликозилировании in vitro в значительной степени зависят от концентрации глюкозы. При снижении в 20 раз действующей в опытах концентрации глюкозы резко замедлялись: накопление в коллагене ранних продуктов гликозирования, окисление белка, образование поперечных связей в области телопептидов. Однако при этом скорость образования сшивок в спирализованной части коллагена и общее количество образующихся флуорофоров практически не изменялись.

4. Структурная модификация коллагена дермы кожи, гликозилированной in vitro, по сравнению с препаратом этого белка имела ряд существенных особенностей: основное различие заключалось в уменьшении скорости образования и количества дополнительных поперечных связей, особенно в спирализованной части коллагеновых молекул; интенсивное образование новых флуоресцирующих соединений, четко связанное с продолжительностью гликозилирования, в целом, по-видимому, не зависело от надмолекулярного уровня организации коллагена.

5. В процессе неферментативного гликозилирования дермы in vitro обнаружено также существенное изменение фракционного состава коллагена, по-видимому, за счет быстрого образования внутри, а особенно, межмолекулярных связей: резко снижалось содержание нейтрально-солерастворимой фракции, практически не изменялась доля кислоторастворимой фракции, а количество нерастворимого коллагена (НК) - увеличивалось. В НК дермы на поздних сроках гликозилирования in vitro (5-12 месяцев) в спирализован-ной части молекул образуются дополнительные сшивки, которые, по-видимому, одновременно являются флуоресцирующими структурами.

6. Выявлено разнонаправленное действие известных ингибиторов процесса гликозилирования коллагена (гуанидин-хлорид, DETAPAC, фермент катала-за, ацетилсалициловая кислота) на характер модификации коллагена в процессе его гликозилирования in vitro, характеризуемой по степени и скорости образования ТБК-активных продуктов, карбонилов, флуорофор-содержащих соединений и по чувствительности к гидролитическому действию специфических и неспецифических протеаз.

7. На основании полученных экспериментальных данных по влиянию ингибиторов на гликозилирование коллагена in vitro показаны лимитирующие этапы и факторы, играющие важную роль в механизмах регуляции процесса гликозилирования коллагена in vitro: образование ранних продуктов взаимодействия белка с глюкозой, активных дикарбонил-содержащих соединений, присутствие ионов металлов. Возможно, эти звенья процесса гликозилирования могут быть "мишенями" фармакологического воздействия in vivo при лечении осложнений сахарного диабета и различных патологий при старении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Тимофеева, Мария Владимировна, Москва

1. Алейникова T.JI., Авдеева JI.B., Андрианова J1.E. и др. Биохимия: учебник для ВУЗ-ов под редакцией Е.С.Северина. Изд-во ГЭОТАР-МЕД, Москва, 2003.

2. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Патогенез ангиопатий при сахарном диабете.// Сахарный диабет, 1999, №1, стр.24-28.

3. Берштейн И.Я., Каминский IO.JI. Спектрофотометрический анализ в органической химии.// Из-во "Химия", Ленинград, 1986.

4. Владимиров Ю.А., Рощупкин Д.И., Потапенко А.Я., Деев А.И. Биофизика.// Из-во "Медицина", Москва, 1983.

5. Лакин Г;Ф. Биометрия.// Из-во "Высшая школа", Москва, 1980, стр. 96-110.

6. Лебедев Д.А. Коллагеновые структуры одна из информационных систем организма.// Успехи современной биологии, 1973, том 88, вып.1, стр.36-49

7. Мазуров В.И. Биохимия коллагеновых волокон.// Из-во "Медицина", Москва, 1974.

8. Никитин В.Н., Перский Е.Э., Утевская Л.А. Возрастная и эволюционная биохимия коллагеновых структур. -Из-во:"Наукова Думка", Киев. 1977.

9. Реброва Г.А., Василевский В.К., Ромаков Ю.А., Быков В.А., Ребров Л.Б. Изменение коллагена при старении in vitro.// Клиническая геронтология, 2001, том 3-4, стр. 35-40.

10. Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани.// Из-во "Медицина", Ленинградское отделение, 1969.

11. Страейр Л. Биохимия в 3-томах под редакцией С.Е.Северина.// Изд-во "Мир", Москва, 1984.

12. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии в трех томах под редакцией акад. Ю.А. Овчинникова. Изд-во "Мир", Москва, 1981.

13. Ahmed M.U., Frey В.Е., Degenhardt Т., Thorpe S.R., Baynes J.W. N-(Carboxyethyl)lysine, a product of the chemical modification of proteins with methylglyoxal, increases with age in human lens proteins.// J. Biochem., 1987, Vol.324, pp.565-570.

14. Ahmed M.U., Thorpe S.R., Baynes J.W. Identification of N-carboxymethyllysine as a degradation product of fructoselysine in glycated proteins.//J. Biol. Chem., 1986, Vol.261, pp.4889-4894.

15. Aitman P., Alaupovic P., Samuelsson O. Lipoprotein abnormalities as a risk factor for progressive nondiabetic renal disease.// Kidney Int, 1999, Vol.56, pp.1417.

16. Andreassen T.T., Oxiund H., Danielsen C.C. The influence of nonenzymatic glycosylation and formation of fluorescent reaction products on the mechanical properties of rat tail tendon.// Connect Tissue Res, 1988, Vol.17, pp. 1-9.

17. Andreassen T.T., Seyer-Hansen K, Bailey A.J. Changes in thermal isometric tension, reducible crosslinks, and mechanical properties of rat tail tendon induced by experimental diabetes.// Biochim Biophys Acta, 1981, Vol.677, pp.313-322.

18. Arumugham R., Bose S.M. Effect of indomethacin and naproxen on collagen cross-linking.//Communicated to Biochem. Pharmacol., 1980, Vol.54, pp. 159166.

19. Bailey A.J. Molecular mechanisms of ageing in connective tissues. Review.// Mechanisms of Ageing and Development, 2001, Vol.122, pp.735-755.

20. Bailey A.J., Peach C.M., Foweler L.J. The biochemistry of intemolecular crosslinks in collagen. In: Balazs E.A., Ed. The Chemistry and Molecular Biology of the Intercellular Matrix.//New York: Academic Press, 1970, pp.3 85-404.

21. Bailey, AJ. Chemistry of collagen cross-links. Glucose-mediated covalent cross-linking of type IV collagen in lens capsules.// J. Biochem. 1993, Vol.296, pp.489-496.

22. Bateman J.F., Lamande S.R., Ramshaw J.A.M. Collagen superfamily.// In: Comper W.D., ed. Extracellular matrix Amsterdam: Harwood, 1996, Vol.2, pp.22-67.

23. Baynes J.W. Reactive oxygen in the aetiology and complications of diabetes, in Drugs, Diet and Disease (Vol.2): Mechanistic Approaches to Diabetes, ed. Ioan-nides C.// London. Pergamon Press, 1996, pp.203-240.

24. Baynes J.W. The role of AGEs in aging: causation or correlation.// Exp. Gerontology, 2001, Vol.36, pp. 1527-1537.

25. Baynes J.W., Thorpe S.R. Glycation and advanced glycation reactions, in Diabetes in the New Millennium, edited by Turtle J.R., Kaneko T., Osato S.// Sydney. International Diabetes Federation, 2000, pp.337-350.

26. Baynes J.W., Thorpe S.R. Glycoxidation and lipoxidation in athero-genesis.// Free Radio Biol Mod, 2000, Vol.28, pp.1708-1716.

27. Baynes J.W., Thorpe S.R. Role of oxidative stress in diabetic complications: a new perspective on an old paradigm.// Diabetes, 1999, Vol.48, pp. 1-9.

28. Beisswenger P.J., Moore L.L., Curphey T.J. Relationship between glycemic control and collagen-linked advanced glycosylation end products in type I diabetes.// Diabetes Care, 1993, Vol.16, pp.689-694.

29. Bellmunt J.M., Portero M., Pampiona R., Cosso L., Odetti P., Prat J. Evidence forthe maillard reaction in rat lung collagen and its relationship with solubility and age.// Biochim. Biophys. Acta., 1995, Vol.1272, pp.53-60.

30. Bensusan H.B. A novel hypothesis for the mechanism of cross-linking in collagen.// In: Harkness R.D., Partridge S.M., Tristiam G.R., Eds. Structure and function of connective and skeletal tissue. London: Butterworths, 1965, pp.42-46.

31. Biemel K.M., Friedl D.A., Lederer M.O. Identification and quantification of major maillard cross-links in human serum albumin and lens protein.// The Journal Of Biological Chemistry, 2002, Vol.277, № 28, pp.24907-24915.

32. Biemel K.M., Reihl O., Conrad J., Lederer M.O. Formation pathways for lysine-arginine cross-links derived from hexoses and pentoses by maillard processes.// The Journal Of Biological Chemistry, 2001, Vol.276, № 26, pp.23405-23412.

33. Booth A.A., Khalifan R.G., Hudson B.G. Thiamine pyrophosphate and pyridox-amine inhibit the formation of antigenic advanced glycation end-products: Comparison with aminoguanidine.// Biochem Biophys Res Commun, 1996, Vol.220, pp.113-119.

34. Booth A.A., Khalifan R.G., Todd P., Hudson B.G. In vitro kinetic studies of formation of antigenic advanced glycation end products (ACrEs): Novel inhibition of post-Amadori glycation pathways.// J Biol Chem, 1997, Vol.272, pp.5430-5437.

35. Boskey A.L., Wright T.M., Blank, R.D. Collagen and bone strength.// J Bone Miner Res, 1999, Vol.14, pp.330-335.

36. Bradley J.L.,King R.H.M.,Muddle J.R., Thomas P.K. The extracellular matrix of peripheral nerve in diabetic polyneuropathy.// Acta Neuropathol (Berl), 2000, Vol.99, pp.539-546.

37. Brennan M. Changes in solubility, nonenzymatic glycation, and fluorescence of collagen in tail tendons from diabetic rats.// J Biol Chem, 1989, Vol.264, pp.20947-20952.

38. Brennan M. Changes in the cross-linking of collagen from rat tail tendons due to diabetes.//J. Biol. Chem., 1989, Vol.264, pp.20953-60.

39. Bron A.J., Vrensen G.F., Koretz J. The ageing lens.// Ophthalmologica, 2000, Vol.214, pp.86-104.

40. Brown J.C., Timpl R. The collagen superfamily.// Int Arch Allergy Immunol, 1995, Vol.107, pp.484-90.

41. Brownlee M. Advanced protein glycosylation in diabetes and aging.// Annu. ReV. Med., 1995, Vol.46, pp.223-234.

42. Brownlee M., Vlassara H., Kooney T., Ulrich P., Cerami A. Aminoguanidine prevents diabetes-induced arterial wall protein crosslinking.// Science, 1986, Vol.232, pp.1629-1632.

43. Bucala R. Lipid and lipoprotein modification by AGE's: role in atherosclerosis.// Exp. Physiol., 1997, Vol.82, pp.327-337.

44. Bunn H.F., Higgins P.J. Reaction of monosaccharides with proteins: possible evolutionary significance. //Science, 1981, Vol.213, pp.222-224.

45. Caballero F., Gerez E., Batlle A., Vazquez E. Preventive aspirin treatment of streptozotocin induced diabetes: blockage of oxidative status and reversion of heme enzymes inhibition.// Chem.-Biol. Interact., 2000, Vol.126, pp.215-225.

46. Cai J., Hurst H. E. Identification and quantification of N-(carboxymethyl)valine adducts in hemoglobin by gas chromatography/mass spectrometry.// J. Mass Spectrom, 1999, Vol.34, pp.537-543.

47. Cao G., Cutler R.G. Protein oxidation and aging.//Arch. Biochem. Biophys.,1995, Vol.320, pp.106-114.

48. Cerami A., Stevens V.J., Monnier V.M. Role of nonenzymatic glycosylation in the development of the sequelae of diabetes.// Metabolism, 1979, Vol.28, pp.431-437.

49. Cerami A., Vlassara H., Brownlee M. Role of advanced glycosylation products in complications of diabetes.//Diabetes Care, 1988, Vol.11, pp.73-79.

50. Ceriello A. Hyperglycemia: the bridge between non-enzymatic glycation and oxidative stress in the pathogenesis of diabetic complications.// Diabetes Nutr. Metab., 1999, Vol.12, pp.42-46.

51. Chellan P., Nagaraj R. Protein cross-linking by the Maillard reaction: dicar-bonyl-derived imidazolium cross-links in aging and diabetes.// Arch. Biochem. Biophys. 1999, Vol.368, pp.98-104.

52. Cloos P.A.C., Christgau S. Non-enzymatic covalent modification ofproteins. Mechanisms, physiological consequences and clinical application.// Matrix Biol, 2002, Vol.21, pp.39-52.

53. Cloos P.A.C., Fledelius C. Collagen fragments in urine derived from bone resorption are highly racemized and isomerized. A biological clock ofprotein ageing with clinical potential.// Biochem J, 2000, Vol.345, pp.473-480.

54. Cohen M.P., Wu V.Y. Age-related changes in nonenzymatic glycosylation of human basement membranes.// Exp Gerontol., 1983, Vol.18, pp.461-469.

55. Colaco, C.A. The Glycation Hypothesis of Atherosclerosis.// Chapman & Hall, New York, 1997.

56. Corbett, J.A., et al. Aminoguanidine as a novel inhibitor of nitric oxide formation prevents diabetic vascular dysfunction.// Diabetes, 1992, Vol.41, pp.552556.

57. Courderot-Masuyer C., Dalloz F., Maupoil V., Rochette L. Antioxidant properties of aminoguanidine.// Fundam. Clin. Pharmacol., 1999, Vol.13, pp.535-540.

58. Degenhardt T.P., Thorpe S.R., Baynes J.W. Chemical modification of proteins by methylglyoxal.//Cell Mol. Biol., 1998, Vol.44, pp.1139-1145.

59. Deyl Z., Miksik I., Zicha J. Multicomponent analysis by off-line combination of synchronous fluorescence spectroscopy and capillary electrophoresis of collagen glycation adducts. //J. Chromatogr., 1999, Vol.836, pp.161-171.

60. Dyer D.G., Dunn J.A., Thorpe S.R. Accumulation of Maillard reaction products in skin collagen in diabetes and aging.// J Clin Invest, 1993, Vol.91, pp.24632469.

61. Elgawish A., Glomb M., Friedlander M., Monnier V.M. Involvement of hydrogen peroxide in collagen cross-linking by high glucose in vitro and in vivo.// The Journal of Biological Chemistry, 1996, Vol.271, № 22, pp. 12964-12971.

62. Farrukh A.S., Sharkey E., Creighton D. Maillard reactions in lens proteins: me-thylglyoxal-mediated modifications in the rat lens.// Exp Eye Res, 2000, Vol.70, pp.369-80.

63. Fu M.X., Requena J.R., Jenkins A.J., Lyons T.J., Baynes J.W., Thorpe S.R. The advanced glycatin end-product, N-(carboxymethyl)lysine, is a product of both lipid peroxidation and glycoxidation reaction.// J. Biol. Chem., 1996, Vol.271, pp.9982-9986.

64. Fujimaki M., Namiki M., Kato H., Amino-carbonyl reactions in food and biological systems.// Dev. Food Sci. Tokiyo: Kodansha-Elsevier, 1986, Vol.13, pp.1-584.

65. Garlick R.L., Bunn H.F., Spiro R.T. Nonenzymatic glycation of basement membranes from human glomeruli and bovine sources: Effect of diabetes and age.// Diabetes, 1988, Vol.37, pp.1144-1150.

66. Gillery P., Monboisse J.C., Maquaert F.X., Borel J.P.: Glycation of proteins as a source of superoxide.// Diabete Metab., 1998, Vol.14, № 1, pp.25-30.

67. Glomb M.A., Monnier V.M. Mechanism of protein modification by glyoxal and glycolaldehyde, reactive intermediates of the Maillard reaction.// J. Biol. Chem.,1995, Vol.270, pp.10017-10026.

68. Haitoglou, C.S. Altered cellular reactions between endothelial cells and non-enzymatically glucosylated laminin/type IV collagen.// J. Biol. Chem., 1992, Vol.267, pp. 12404-12407.

69. Hammes H.P., Alt A., Niwa T. Differential accumulation of advanced glycation end products in the course of diabetic retinopathy.// Diabetologia, 1999, Vol.42, pp.728-36.

70. Handa J.T., Verzijl N.,Matsunaga H. Increase in the advanced glycation end product pentosidine in Bruch's membrane with age.// Invest Ophthalmol Vis Sci, 1999, Vol.40, pp.775-9.

71. Hanson D.A., Eyre D.R. Molecular site speciccity of pyrridinoline and pyrrole cross-links in type I collagen of human bone.// J. Biol. Chem., 1996, Vol.271, pp.26508-26516.

72. Hata F., Igaki N., Nakamichi T., Masuda S., Nishimoto S., Oimomi M., Baba S., Kata H. Suppressive effect of a-ketoaldehyde dehydrogenase on the advancedprocess of the Maillard reaction.// Diab. Res. Clin. Pract., 1988, Vol.5, pp.54135418.

73. Hirsh, J., et al. X-ray structure of 3-amino 5-substituted triazines produced by the reaction of 3-deoxyglucose with aminoguanidine.// J. Cabohydr. Res., 1992, Vol.11, pp.891-901.

74. Hyung-Soon Yim, Sa-Ouk Kang, Yung-Chil Hah, P.Boon Chock, Moon B.Yim //Free radicals generated during the glycation reaction of amino acids by me-thylglyoxal. The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol.270, № 47, pp.28228-28233.

75. Igaki N., Sakai M., Hata F., Oimomi M., Kato H. Effects of 3-deoxyglucosone on the Maillard reaction.// Clinical Chemistry, 1990, Vol.36, pp.631-634.

76. Iijima K., Murata M., Takahara H., Irie S., Fujimot D. Identification of N-carboxymethylarginine as a novel acid-labile advanced glycation end product in collagen.// J. Biochem., 2000, Vol.347, pp.23-27.

77. Ikeda K., Higashi T., Sano H. N-(carboxymethyl)lysine protein adduct is a major immunological epitope in proteins modified with advanced glycation end products of the Maillard reaction.// Biochemistry, 1996, Vol.35, pp.8075-8083.

78. Jakus V. The role of free radicals, oxidative stress and antioxidant systems in diabetic vascular disease.//Bratisl LekListy, 2000, Vol.101, № 10, pp.541-551.

79. Januszewski A.S., Alderson N.L., Metz T.O., Thorpe S.R., Baynes J.W. Role of lipids in chemical modification of proteins and development of complications in diabetes.//Biochemical Society Transactions, 2003, Vol.31, № 6, pp.1413-1416.

80. Joles J.A., Kunter U., Janssen U., et al. Early mechanisms of renal injury in hy-percholesterolemic or hypertriglyceridemic rats.// J Am Soc Nephrol, 2000, Vol.1, pp.669-683.

81. Kadler K. Extracellular matrix 1: fibril-forming collagens.// Protein Profile, 1995, Vol.2, pp.491-619.

82. Kaji Y., Usui T., Oshika T. Advanced glycation end products in diabetic corneas.// Invest Ophthalmol Vis Sci, 2000, Vol.41, pp.362-8.

83. Keane W.F. The role of lipids in renal disease: future challenges.// Kidney Int, 2000, Vol.57, pp.27-31.

84. Kent M.J.C., Light N.O., Bailey A.J. Evidence for glucose-mediated covalent cross-linking of collagen after glycosylation in vitro.// Biochem J, 1985, Vol.225, pp.745-752.

85. Khalifan R.G., Baynes J.W., Hudson B.G. Amadorins: novel post-amadori inhibitors of advanced glycation reactions.// Biochem Biophys Res Commun, 1999, Vol.257, pp.251-258.

86. Kivirikko K.I. Collagens and their abnormalities in a wide spectrum of diseases.// Ann Med, 1993, Vol.25, pp.113-26.

87. Kohn R.R., Schnider S.L. Glucosylation of human collagen.// Diabetes, 1982, Vol.31, pp.47-51.

88. Kusche J., Menningen R., Leisten L., Amoei B. Elevation of the large bowel histamine concentration by aminoguanidine-induced diamine oxidase inhibition.// Agent Actions, 1987, Vol.20, pp.274-276.

89. Kuznetsova N., Leikin S. Does the Triple Helical Domain of Type I Collagen Encode Molecular Recognition and Fiber Assembly while Telopeptides Serve as Catalytic Domains?//J Biol Chem, 1999, Vol.274, № 51, pp.36083-36088.

90. La Bella F.S., Paul G. Structure of collagen from human tendon as influenced by age and sex.// J Gerontol., 1965, Vol.20,-pp.54-59.

91. Lapolla A., Fedele D., Traldi P. The role of mass spectrometry in the study of nonenzymatic protein glycation in diabetes.// Mass Spectrom. ReV., 2000, Vol.19, pp.279-304.

92. Lee K.-W., Simpson G., Ortwerth B. A systematic approach to evaluate the modifcation of lens proteins by glycationinduced crosslinking.// Biochim. Bio-phys. Acta, 1999, Vol. 1453, pp. 141 -151.

93. LePape A., Guitton J.D., Gutman N., Legrand Y., Fauvel F., Muh J.P. Nonenzymatic glycosylalion of collagen in diabetes: Incidence on increased normal platelet aggregation.// Haemostasis, 1983, Vol.13, pp.36-41.

94. Lyons T.J., Kennedy L. Effect of in vitro non-enzymatic glycosylation of human skin collagen on susceptibility to collangenase digestion.// Eur J Clin Invest, 1985, Vol.15, pp.128-131.

95. Maillard L.C. Action des acides amines sur les sucres: formation des melanoidines par voie methodique.// C. R. Acad. Sci. (Paris), 1912, Vol.154, pp.66-68.

96. Malik N.S., Meek K.M. The inhibition of sugar-induced structural alteration in collagen by aspirin and other compounds.// Biochem. Biophys. Res. Comm, 1994, Vol.199, № 2, pp.683-686.

97. Meng J., Sakata N., Imanaga Y., Tachikawa Y., Chihara J., Takebayashi S. Evidence for a link between glycoxidation and lipoperoxidation in patients with chronic renal failure.// Clin. Nephrol., 1999, Vol.51, pp.280-289.

98. Misur I, Turk Z. Substituted guanidine compounds as inhibitors of nonenzymatic glycation in vitro.// Croatica Chemica Acta, 2001, Vol.74, № 2, pp.455465.

99. Monnier V.M. Nonenzymatic glycosylation, the Maillard reaction and the aging process.//J Gerontology, 1990, Vol.45, № 4, pp.105-111.

100. Monnier V.M. Toward a Maillard reaction theory of aging. In Baynes J.W., Monnier V.M., Eds. The Maillard reaction in aging, diabetes and nutrition.// Prog. Clin. Biol. Res. New York: Alan R. Liss, 1989, Vol.304, pp. 1-22.

101. Monnier V.M., Cerami A. Nonenzymatic browning in vivo: possible process for aging of long-lived proteins.// Science, 1981, Vol.211, pp.491 -493.

102. Monnier V.M., Kohn R.R., Cerami A. Accelerated age-related browning of human collagen in diabetes mellitus.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, Vol.81, pp.583-587.

103. Monnier V.M., Stevens V.J., Cerami A. The browning reaction of proteins with glucose.// Arch Biochem, 1979, Vol.24, pp. 157-78.

104. Monnier V.M., Vishwanat V., Frank K.E., Elmets C.A., Dauchot P., Kohn R.R. Relation between complications of Typel diabetes mellitus and collagen-linked fluorescence.// N. Engl. J. Med., 1986, Vol.314, pp.403-408. .

105. Mossine V.V., Linetsky M., Glinsky G.V., Ortwerth B.J., Feather M.S. Superoxide free radical generation by Amadori compounds: the role of acyclic forms and metal ions.// Chem. Res. Toxicol, 1999, Vol.12, pp.230-236.

106. Mullarkey C.J., Edelstein D., Brownlee M. Free Radical Generation by Early Glycation Products: a Mechanism for Accelerated Atherogenesis in Diabetes.// BBRS, 1990, Vol.173, pp.932-939.

107. Muntner P., Coresh J., Smith J.C., et al. Plasma lipids and risk of developing renal dysfunction: The Atherosclerosis Risk in Communities Study.// Kidney Int,2000, Vol.58, pp.293-301.

108. Myllyharju J., Kivirikko K.J. Collagen and collagen-related diseases.// Ann Med2001, Vol.33, pp.7-21.

109. Nacamura S., Makita Z, Ishikawa S.et al: Progression of nephropathy in spontaneous diabetic rats is prevented by OPB-9195, a novel inhibitor of advanced glycation.//Diabetes, 1997, Vol.46, pp.895-899

110. Nakamura K. Acid stable fluorescent AGEs: Vesperlysines A, B and C are formed as crosslinked products in the Maillard reaction between lysine and proteins with glucose.// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, Vol.2322, pp.227-230.

111. Naranjo G.B., Malec L.S., Vigo M.S. Reducing sugar effect on available lysine loss of casein by moderate heat treatment.// Food Chem., 1998, Vol.62, pp.309313.

112. Odetti P.R., Borgoglio A., De Pascale A., Rolandi R. Prevention of diabetes-increased aging effect on rat collagen-linked fluorescence by aminoguanidine and rutin.// Diabetes, 1990, Vol.39, pp.796-801.

113. Onorato J.M., Jenkins A.J., Thorpe S.R., Baynes J.W. Pyridoxamine, an inhibitor of advanced glycation reactions, also inhibits advanced lipoxidation reactions.// J. Biol Chem, 2000, Vol.275, pp.21177-21184.

114. Overend W.G., Peacoke A.R., Smith J.B. Reactions as position carbohydrates: Part I: The polarographic reduction of carbohydrates.// J. Chem. Soc., 1961, pp.3487-3492.

115. Oya T., Hattori N., Mizuno Y. Methylglyoxal modification of protein: chemical and immunochemical characterization of methylglyoxal-arginine adducts.// J. Biol. Chem., 1999, Vol.274, pp. 18492-18502.

116. Packer L. The role of anti-oxidative treatment in diabetes mellitus.// Diabetolo-gia, 1993, Vol.36, pp.1212-1213.

117. Paul R-.G, Avery N.C., Slatter D.A., Sims T.J., Bailey A.J. Isolation and characterization of advanced glycation end products derived from the in vitro reaction of ribose and collagen.// J. Biochem., 1998, Vol.330, pp.1241-1248.

118. Paul R.G., Bailey A.J. The effect of advanced glycation end-product formation upon cell-matrix interactions.// Int J Biochem Cell Biol, 1999, Vol.31, pp.653660.

119. Pecoraro R.O., Graf R.J., Halter J.B., Beiter H., Porte D. Comparison of a col-orimetric assay for glycosylated hemoglobin with ion-exchange chromatography.//Diabetes, 1979, Vol.28, pp.1120-1125.

120. Perejda A.J., Zaragoza E.J., Briksen E., Ultto J. Nonenzymatic glucosylation of lysyl and hydroxylysyl residues in type I and type II collagens.// Collagen Rel Res, 1984, Vol.4, pp.427-439.

121. Pongor S., Ulrich P.C., Benesath F.A., Cerami A. Aging of proteins: isolation and identification of a fluorescent chromophore from the reaction of polypeptides with glucose.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, Vol.81, pp.2684-2688.

122. Prabhakaram M., Mossine V.V. Characterization of a blue £uorophore isolated from in vitro reaction of N-K-acetyllysine and 3-deoxyglucosone.// Prep. Biochem. Biotechnol, 1998, Vol.28, pp.319-338.

123. Raj D.S., Choudhury D., Welbourne T.C., Levi M. Advanced glycation end products: a nephrologist's perspective.// Am J. Kidney Dis., 2000, Vol.35, pp.365-380.

124. Reddy S., Bichler J., Wells-Knecht K.J., Thorpe S.R., Baynes J.W. N-(carboxymethyl)lysine is a dominant advanced glycation end product (AGE) antigen in tissue proteins.//Biochemistry, 1995, Vol.34, pp. 10872-10878.

125. Reiser K.M. Nonenzymatic glycation of collagen in aging and diabetes.// Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1991, Vol.196, № 1, pp. 17-29.

126. Robins S.P., Bailey A.J. Age-related changes in collagen: The identification of reducible lysine carbohydrate condensation products.// Biochem Biophys Res Commun, 1972, Vol.48, pp.76-84.

127. Sakai M., Oimomi M, Kasuga M. Experimental studies on the role of fructose in the development of diabetic complications.// Kobe J. Med. Sci., 2002, Vol.48, № 5, pp.125-136.

128. Saxena P., Saxena A.K., Cui X.L. Transition metal-catalyzed oxidation of ascorbate in human cataract extracts: possible role of advanced glycation end products.// Invest Ophthalmol Vis Sci, 2000, Vol.41, pp. 1473-81.

129. Schleicher E., Wieland O.H. Kinetic analysis of glycation as a tool for assessing the half-life of proteins.// Biochim Biophys Acta, 1986, Vol.884, pp. 199-205.

130. Schleicher E.D., Wagner E., Nerlich A.G. Increased accumulation of the gly-cooxidation product N-(carboxymethyl)lysine in human tissues in diabetes and aging.// J. Clin. Invest., 1997, Vol.99, № 3, pp.457-468.

131. Schmidt A. M., Yan S. D., Stern D. The dark side of glucose.//Nat. Med., 1995, Vol.1, pp.1002-1004.

132. Schnider S.L., Kohn R.R. Effects of age and diabetes mellitus on the solubility and nonenzymatic glucosylation of human skin collagen.// J Clin Invest, 1981, Vol.67, pp.1630-1635.

133. Schnider S.L., Kohn R.R. Glucosylation of human collagen in aging and diabetes mellitus.// J Clin Invest, 1980, Vol.66, pp.1179-1181.

134. Shamsi F., Partal A., Sady C., Glomb M., Nagaraj R. Immunological evidence for methylglyoxal-derived modifications in vivo.// J. Biol. Chem., 1998, Vol.273, pp.6928-6936.

135. Shin D.B., Hayase F., Kato H. Polymerization of proteins caused by reaction with sugars and the formation of 3-deoxyglucosone under physiological conditions.// Agric. Biol. Chem., 1988, Vol.52, pp. 1451-1458.

136. Shoda H., Miyata S., Liu B-F., Yamada H., Ohara T., Suzuki K., Oimomi M., Kasuga M. Ingibitory effects of tenilsetam on the Maillard reaction.// Endocrinology, 1997, Vol.138, № 5, pp.18886-1892.

137. Singh R., Barben A., Mori T., Beilin L. Advanced glycation end-products: a review.// Diabetologia, 2001, Vol.44, pp. 129-146.

138. Slatter D.A., Murray M., Bailey A.J. Formation of a dihydropyridine derivative as a potential cross-link from malondialdehyde in physiological systems. FEBS Letts, 1998, Vol.421, pp.180-184.

139. Slatter, D.A., Bolton C.N., Bailey A.J. The importance of lipid-derived malondialdehyde in diabetes mellitus.// Diabetologia, 2000, Vol.43, pp.550557.

140. Slatter, D.A.,Paul R.G., Murray M., Bailey A.J. Reactions of lipid derived malondialdehyde with collagen.// J. Biol. Chem.3 1999, Vol.274, pp.1966119669.

141. Soulis T., Sastra S., Thallas V. A novel inhibitor of advanced glycation end-product formation inhibits mesenteric vascular hypertrophy in experimental diabetes.// Diabetologia, 1999, Vol.42, pp.472-479.

142. Spoerl E., Huhle M., Seiler T. Induction of cross-links in corneal tissue.// Exp. Eye Res., 1998, Vol.66, pp.97-103.

143. Stegemann H., Stalder K. Determination of hydroxyproline.// Clin. Chim. Acta, 1967, Vol.18, pp.267-273.

144. Stevens V.J., Rouzer C.A., Monnier V.M., Cerami A. Diabetes cataract formation: potential role of glycosylation of lens crystallins.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, Vol.75, pp.2918-2922

145. Stitt A.W. Advanced glycation: an important pathological event in diabetic and age related ocular disease.// J. Ophthalmol., 2001, Vol.85, pp.746-753.

146. Sullivan R. Contributions to senescence: non-enzymatic glycosylation of proteins.// Arch. Physiol. Biochem., 1996, Vol.104, No 7, pp.797-806.

147. Szwergoid B.S., Kappler F., Brown T.R. Identification of fructose 3-fhoshhate in the lens of diabetic rats.// Science, 1990, Vol.247, pp.451-454.

148. Tagami U.,-Akashi S., Mizukoshi T., Suzuki E., Hirayama K. Structural-studies of the Maillard reaction products of a protein using ion trap mass spectrometry.// J. Mass Spectrom., 2000, Vol.35, pp.131-138.

149. Takahashi, M. Isolation, purification and characterisation of Amadoriase isoenzymes (Fructosyl amine-oxygen oxidoreductase EC 1.5.3.) from Aspergillus sp.//J. Biol. Chem., 1997, Vol.272, pp.3437-3443.

150. Takeuchi M., Makita Z., Yanagisawa K., KamedaY., Koike T. Detection of noncarboxymethyllysine and carboxymethyllysine advanced glycation end products (AGE) in serum of diabetic patients.// Mol. Med., 1999, Vol.5, pp.393405.

151. Tanzer M.L., Fairweather R., Gallop P.M. Collagen crosslinks: isolation of reduced N-hexosylhydroxylysine from borohydride-reduced calf skin insolube collagen.//Arch Biochem Biophys, 1972, Vol.151, pp. 137-141.

152. Tanizawa H., Sazuka Y., Takino Y. Identification of lipoperoxidation product.// Chem. Pharm. Bull, 1981, Vol.29, № 10, pp.2910-2914.

153. Thornalley P.J., Langborg A., Minhas H.S. Formation of glyoxal, methylglyoxal and 3-deoxyglucosone in the glycation of proteins by glucose.// J. Biochem, 1999, Vol.344, pp.109-16.

154. Thorpe S.R., Baynes J.W. Role of the Maillard reaction in diabetes mellitus and diseases of aging.// Drugs Aging, 1996, Vol.9, pp.69-77.

155. Thorpe S.R., Lyons T.J., Baynes J.W. Glycation and glycoxidation in diabetic vascular disease, in Oxidative Stress and Vascular Disease, edited by Keaney J.F.// Kluwer Academic Publishers, 2000, pp.259-283.

156. Tian S.-F., Toda S., Higashino H., Matsumura S. Glycation decreases the stability of the triple-helical stands of fibrous collagen against proteolytic degradationby pepsin in a specific temperature range.//J.Biochem., 1996, Vol.120, pp.115362.

157. Ulrich P., Cerami A. Protein glycation, diabetes and aging.// Recent Prog. Horm. Res., 1998, Vol.56, pp. 1-21.

158. Vashishth D., Gibson G.J., Khoury J.I., Schaffler M.B., Kimura J., Fyhrie D.P. Influence of nonenzymatic glycation on biomechanical properties of cortical bone.// Bone, 2001, Vol.28, pp.195-201.

159. Vishwanath V:,'Frank K.E., Elmets C.A., Dauchot P.J.,Monnier V.M. Glyca- • tion of skin collagen in type I diabetes mellitus.// Diabetes, 1986, Vol.35, pp.916-921.

160. Vlassara H. Recent progress in advanced glycation end products and diabetic complications.// Diabetes, 1997, Vol.46, № 2, pp. 19-25.

161. Vlassara H., Bucala R., Striker L. Pathogenic effects of AGEs: biochemical, biologic, and clinical implications for diabetes and aging.// Lab. Invest., 1994, Vol.70, pp.138-151.

162. Vlassara, H., et al. Advanced glycosylation end-products induce sclerosis and albuminuria in normal rats.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, Vol.91, pp.11704-11708.

163. Wada T., Miyata T. Kurokawa K. Implication of carbonyl stress in long term uraemic complications.//Nephrol. Daial. Transplant., 1999, Vol.14, pp.79-81.

164. Wang X., Shen X., Li X., Agrawal C. M. Age-related changes in the collagen network and toughness of bone.// Bone, 2002, Vol.31, № 1, pp. 1-7.

165. Wells-Knecht K.J., Brinkmann E., Wells-Knecht M.C. New biomarkers of Maillard reaction damage to proteins.// Nephrol. Dial. Transplant., 1996, Vol.11, № 5, pp.41-47.

166. Wells-Knecht M.C., Thorpe S.R., Baynes J.W. Pathways of formation of gly-coxidation products during glycation of collagen.// Biochemistry, 1995, Vol.34, №36, pp.15134-15141.

167. Wolff S.P., Dean R.T. Glucose autoxidation and protein modification.// J. Biochem., 1987, Vol.245, pp.243-250.

168. Wolff S.P., Jiang Z.Y., Hunt J.V. Protein glycation and oxidative stress in diabetes mellitus and ageing.// Free Radical Biology & Medicine, 1991, Vol.10, pp.339-352.

169. Wolffenbuttel, B.H., et al. Breakers of advanced glycation end-products restore large artery properties in experimental diabetes.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, pp.4630.

170. Yamagishi S., Fujimori H., Yonekura H. Advanced glycation endproducts accelerate calcification in microvascular pericytes.// Biochem. Biophys. Res. Comm, 1999, Vol.258, pp.353-7.

171. Yeboah F.K., Alii I., Yaylayan V.A. Reactivities of D-glucose and D-fructose during glycation of bovine serum albumin.// J. Agric. Food Chem., 1999, Vol.47, pp.3164-3172.

172. Zimmerman B.K. Timplat R. Intermolecular cross-links of collagen.// Eur.J.Biochem., 1973, Vol.35, pp.216-221.

173. Zioupos P., Currey J.D., Hamer A.J. The role of collagen in the declining mechanical properties of aging human cortical bone.// J. Biomed. Mater. Res, 1999, Vol.45, pp.108-116.