Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь неферментативных процессов гликирования и дезаиидирования белков

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь неферментативных процессов гликирования и дезаиидирования белков"

госкомитет российской федерации по высшей школе

Ростовский Ордена Трудового Красного Знамени государственный университет

^_ОД-:-

и ^:

Специализированный совет "..-■•• К 063.52.09.

На правах рукописи УДК 577.1 + 547.96

Назарова Ирина Николаевна Взаимосвязь неферыептативных процессов гликирования и дезвиидирования белков

03.00.04. (биологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов на Дону 1993

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Ростовского Ордена Трудового Красного Знамени государственного университета, отделе физико-химической биологии НИИ Биологии РГУ.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук,профессор

А.И. Лукаш (г. Ростов-на-Дону), кандидат биологических наук, доцент Н.В. Пушкина (г. Ростов-на-Дону).

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Действительный член РАН,

доктор биологических наук, профессор Э.З. Эмирбеков (г. Махачкала). Ведущий научный сотрудник НИИАП МЗРФ, доктор биологических наук Т.Н. Погорелова (г. Ростов-на-Дону).

'ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ кафедра биохимии Ростовского Ордена Дружбы Народов Медицинского института

Защита диссертации состоится1;__1993г. в 10

часов на заседании специализированного совета К 063.52.09. по биологическим наукам в Ростовском государственном университете (34471I, Ростов на Дону, ул. Большая Садовая, 105, РГУ, биолого-почвенный факультет). "

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РГУ(344006, г. Ростов на Дону, ул. Пушкинская, 148)

Автореферат разослан "_ _1993г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук Кп/ В.Н. Кирой

* I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Важную роль в процессах созревания, функционирования . и деградации. белков, играют неферментативные постсинтетичеокие изменения. Немаловажное значение в посттрансляционных изменениях структуры белковой молекулы, наряду с другими модификациями, охватыавюцими широкий набор химических прев-ращенний, имеет дезамидирование аспарагина и глутамина(Лукаш, Пушкина, 1976; Пушкина, 1979; Пушкина, 1988).

Процесс спонтанного дезамидирования рассматривается как одна из возможных причин инактивации белков In vivo и In vitro(Wright, 1991). В работах ряда авторов получены убедительные доказательства участия неферментативного дезамидирования в процессах старения на молекулярном уровне(Lowenson, Clark, 1991) Гидролиз амидов, протекающий вследствие значительной лабильности амидных групп белковосвязанного аспарагина и глутамина, рассматривают как "молекулярные часы", определяющие продолжительность функционирования белковой молекулы(Robinson, 1991).

Скорость дезамидирования амидов при фибиологических условиях определяется как положением их в аминокислотной последовательности, так и в пространственной организации белковой молекулы-(Wrlglvt, 1991). Несмотря на генетическую запрограммированность, скорость неферментативного гидролиза амидов зависит от факторов окружающей среды(температуры, рН, ионной силы среды, наличия ряда метаболитов). Среди естественных метаболитов, влияющих на на этот процесс, особое место занимает глюкоза. В нашей лаборатории было показано ускорение дезамидирования сывороточного альбумина при высоких концентрациях глюкозы(Цибульский, 1985).

Уровень глюкозj в крови и в других тканях увеличивается при старении организма(старение сопровождается нарушением толерант-

ности к глюкозе), так и при заболевании сахарным диабетом.

Установлено, что при высоких концентрациях глюкозы в средЗ белки подвергаются гликированию(гликирование-неферментативное гликозшшрование, термин введен в 1988г.) in vivo и In vitro (Данилова, Фоменко, 1991). Одним из предполагаемых механизмов присоединения глюкозы к белку, является реакция взаимодействия альдегидной группы"глюкозы и амидной группы аспарагина.

Накопление модифицированных белков в тканях приводит к преждевременному старению организма и развитию различных патологий при сахарном диабете(Cha et al., 1991; Domlniczak, 1991; Gilcre-aae, 1990).

Высказано предположение, что глюкоза является "медиатором" старения(Ceraml,1985; Фролькис, Мурадян, 1992). В то же время ряд биологических объектов существуют при весьма высоких и изменяющихся концентрациях глюкозы(дрожжи). Исследование степени гликирования и вмидированности их белков в зависимости от концентрации глюкозы в.среде представляло в связи'с изложенным выше особый интерес.

Мы предположили,' что ковалентное связывание глюкозы с белком может быть общим механизмом изменения скорости их дезамиди-рования. Обе эти модификации влекут за собой нарушение системы водородных и электростатических взаимодействий в молекулах, вследствие чего может измениться нативная конформация,устойчивость к действию протеоли отческих ферментов и биологическая активность 6oma(Glllery et al., 1991, Gracy et al.,1990).

Актуальным является изучение влияния неферментативных модификаций гликирования и дезамидирования на изменение структурно-функциональной организации белковой молекулы, которое приводит к нарушению активности белка. Важным является вопрос о возможной

регуляторной роли данных модификаций в метаболических процессах, идущих с их ростом.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы .явилось установление взаимосвязи неферментативных процессов гликирования и дезамидирования и их влияния на устойчивость к протеолизу и функциональную активность белков.

Объектом изучения были: дрожки Saccharamyces paradoxus, и индивидуальные белки, инсулин и алкогольдегидрогеназа.

ПРИ ЭТОМ НЕОБХОДИМО БЫЛО РЕШИТЬ СЛЕДУЮЩИЕ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЕ ЗАДАЧИ:

I. Определить амидированность и степень гликозилирпвания белков "молодах" и "старых" клеток дрожжей, выращенных при различном содержании глюкозы в среде.

2. Определить атакуемость общего белка дрожжей.измененного в результате гликирования и дезамидирования.

3. Исследовать амидированность и гликирование инсулина in vitro при его инкубации в растворах глюкозы различной концентрации.

4. Определить гипоглйкемическую активность модифицированного инсулина и изменение его атакуемости проназой.

5.Исследовать амидированность и гликирование алкогольде-гидрогеназы при ее инкубации в растворах глюкозы различной концег нтрации.

6. Определить изменение биологической активности алкоголь-дег-идрогеназы и изменение ее атакуемости проназой. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Впервые установлена, амидированность и степень гликирования общего белка "молода.." и "старых" клеток популяции дрожжей Sac-charomyces paradoxus, выращенных при различном содержании глюкозы в среде.

Показано, что степень шинирования инсулина увеличивается пропорционально содержанию глюкозы в среде и зависит от времени инкубации. Увеличение гликирования белков сопровождается снижением степени амидированности. Установлена корреляционная зависимость между изучаемыми процессами. Обнаружена связь между степенью гликирования и амидированности инсулина и изменением . его биологической активности.

Установлена степень гликирования и амидированность алко-гольдегидрогеназы при инкубации фермента в растворах глюкозы и влияние данных процессов на ферментативную активность и устойчивость к протеолизу.

Изменения свойств и функций белков, сопряженных с гликирова нием и дезамидированием, могут играть определенную роль в развитии осложнений сахарного диабета и в процессе старения организма Меаду двуый атими процессами существует взаимосвязь.

Полученные в работе данные представляют существенный интерес для понимания механизма устранения модифицированных белков и развития патологических процессов,'связанных с изменением концентрации глюкозы.

Неферментативные процессы дезамидирования и гликирования, вероятно, используются биологическими системами как механизмы, определяющие длительность функционирования белков и, возможно, •играют роль в изменениии метаболических процессов в дрожжевых клетках в зависимости от изменений концентрации глюкозы в окружающей среде.

.' . Полученные в работе результаты позволяют рекомендовать, после дополнительных исследований, использование, комплексных препаратов инсулина и ингибиторов протеиназ при тяжелых формах сахарного диабета.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались на научной конференции РТУ, биолого-почвенного факультета(Ростов на Дону,-1991г.); научной конференции "Ускоренное старение, связь с возрастной патологией" (Киев,1992г.); на Ростовском отделении биохимического общества Российской Федерации (1993г). ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. По Tevje диссертации. опубликовано 3 работы, 2 находятся в печати.

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания постановки эксперимента и методов исследования, резльтатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа содержит 12 таблицi • 12 рисунков. Список литературы включает 189 наименований. ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Для изучения степени гликирования и амидироввнности использовали общий белок, выделенный из клеток дрожжей Saccharomyces paradoxus. Дрожжи вы- • ращивали при физиологическом оптимуме_содержания глюкозы в среде (2%), концентрацей глюкозы менее физиологической{!%), й при повышенном ее содержании Ъ% и 10%.

Биомассу' разделяли на две фракции "старых" и "молодых" кле-ток(1£оиз S, Nelson А, 1984). Выделяли.обЩий белок(Lgoua S, Nel- . son А, 1984). В препарате определяли уровень глакированных белков (Parker et al., 1981). Исследовали общую амидироввнйость белков и содержание легко- и трудногидролизуемых фракций амидов (Лукаш, Пушкина, 1976). Концентрацию свободного аммиака после гидролиза амидов в белках определяли флюорометрическим методом (Sugowara, Ovama, 1981).

Для изучения устойчивости белков "молодых" и ''старых" клеток дрожжей к действию протеолитических ферментов исследовали их атакуемость бактериальной проназой (Sigma), соотношение фер-

мант:субстрат - 1:200, рН 7,4. Об интенсивности протеолиза судили по приросту количества ТХУ-растворимых Фолин-положительных продуктов(Lowry, 1951).

В опытах In vitro использовали коммерческие препараты инсулина (Novo-Nordiska-S - Дания), и алкогольдегидрогеназу из печени лошади(Reanal, Будапешт, Венгрия).

Инкубацию инсулина в растворах глюкозы I, 5, 10 и 20% при 37°проводили 2, 4, -24 часа, алкогольдегидрогеназы - 24 часа при концентрации глюкозы 2 и 10% . Контролем служили белки, инкуби-ванные в физиологическом растворе.

После инкубации белки очицалй от несвязавшейся глюкозы и других примесей и использовали для определения степени гликиро-вания и амидированности.

Определяли устойчивость модифицированных белков к действш проназы, как описано выше.

Для исследования изменения функциональной активности бел-тсов, модифицированный инсулин вводили крысам и через 2 часа опр< деляли содержание глюкозы в крови(ортотолуидиновым методом) (Кушманова, Ивченко, 1983). ' .

Активность алкогольдегидрогеназы определяли го способносп восстанавливать MD+(Dalzall Н, 1957).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для изучения общих закономерностей взаимосвязи дезамидиров ния и гликирования мы использовали общий белок, выделенный из клеток дрожжей Saccharomycea paradoxus. Мы предположили, что установление такой взаимосвязи первоначально на суммарном препарате белков даст возможность полагать ее достаточно универсальной.

Дрожжи Saccaromyces paradoxus, выращивали в течение суток на минимальной среде YNB при I, 2, 5, 10%-ом содержании глюкозы в среде. Степень гликирования выделенных из них суммарных белков, соответствующая физиологическому 2%-ому содержанию глюкозы в среде, составила в среднем 68,2мкм. фруктозы на 1г. белка в популяции "молодых" клеток. В белках "старых" клеток дрожжей она была незначительно, но достоверно внше(р<0|01) и составила 71,2 мкм. фруктозы на 1г. белка.

Уменьшение содержания глюкозы' в среде до 1% не повлияло на содержание гликированных белков в популяции "старых" клеток, но степень гликирования белков "молодых" клеток была достоверно ниже контрольной на 13%.

Таким образом, при физиологических и более низких концентрациях глюкозы в среде белки "молодых" и "старых" клеток дрожжей гликируются в разной степени. "Старение" сопровождается увеличением степени гликирования.

Увеличение содержания глюкозы в среде до 5 и 10% привело к усилению гликирования как в "молодых" так и в "старых" клетках Количество модифицированных белков в "молодых" клетках возросло на 25 и 38% соответственно и превысило уровень^ гликирования белков "старых" клеток дрожжей, выращенных при физиологическом .оптимуме содержания глюкозы в среде (2%). В "старых" клетках, выращенных на 5 и IOiS-ой глюкозе степень гликирования белков возросла на 45 и 52% по сравнению с контролем соответственно(рис.I)

Возникшие в результате гликирования изменения химической , структуры полипептидной цепи могут играть немалов&жнук роль в дестабилизации высокоупорядоченной конформации белковой молекулы и, по-видимому, приводят к возникновению других нвферментзтивных модификаций.

мкм. ICXT фруктозы на 1г. белка. 80

60"

40"

' 20"

1 I I W~

содержание гюкозы в среде (%) РисЛ. Динамика гликирования белков дрожжей* выращенных при 1,2 5,10%-ом содержании глюкозы; I)"молодые'' 2)"старые" клетки.

В лите^туре имеются сведения, что аспарагин и аспарагино-вая кислота чуствительны к изменениям окружения, аспарагин наиболее подвержен другой неферментативной модификации - дезамиди рованию(Ра$е1-1 et al, 1990).

Скорость неферментативного 'дезамидирования аспарагина зави сит как от положения его в аминокислотной последовательности, так и от структурной организации белка(Wright, 1990) и ряда внешних факторов, в том числе от присутствия в среде различных соединений(Tuler-Crosa et al., 1991).

Амидированность белков "молодых" клеток дрожжей, выращенны: на 2%-ой глюкозе(контроль), составила в среднем 563 мкм.азота ■амидных групп на 1г. белка(САГ). Распределение аспарагина и глу тамина в белках было практически поровну: 268,7 и 301,6 мкм. аз> та амидных групп на 1г. белка, соответственно ЛАГ и ТАГ. Пр "старении" количество амидов в белках снижалось на 17%(САГ); I; И 16%(ЛАГ и ТАГ). По данным литературы при старени в белках хру сталика глаза было отмечено снижение амидированности в средне; на 23Ж(р~кристаллины)(Кричевская, Лукаш, Пушкина, 1981).

Увеличение степени глиютрования бежов сопровождалось сни-женем их амидированности. Количество суммарных амидных груш белков "молодых" клеток, выращенных на 10%-ой глюкозе уменьшилось по сравнению с контро.-лм на 3056. Снижение амидированности происходило за счет обеих фракций.

Белки "старых" клеток дезамидировались в большей степени, причем следует подчеркнуть, что снижение амидированности происходило в основном за счет фракции ЛАГ, представленной аспараги-ном. Количество ЛАГ белков "старых" клеток, выращенных на 10%-ой глюкозе уменьшилось на 2Ь% по сравнению с контролем, что подтверждается данными литературы о преимущественном дезамидирова-нии аспарагина, эти дзнные косвенно свидетельствуют о нефермен-тативности процесса(Пушкина, 1988). Коэффициент корреляции между степенью гликирования белков и количеством ЛАГ белков "старых" клеток, выращенных на 10%-ой глюкозе равен 0,69.

Снижение содержания глюкозы в среде не изменило степени амидированности белков "молодых" клеток, но' привело к увеличению ащдированности белков "старой" популяции дрожжей до уровня "молодых" контрольных клеток и составило в среднем 560,7мкм. амид-ного азота на 1г. бежа.

Суммируя вышеизложенное, можно -сказать, что в низких концентрациях глюкоза действует как стабилизатор, в высоких являет^ ся токсичной.

Одной из возможных причин увеличения скорости неферментативного дезамидирования бежов при повышенном содержании глюкозы может быть взаимодействие гидроксильных групп свободной глюкозы и амидной группы аспарагина, что облегчает протониз.ацию амида при гидролизе и способствует трансформации амидной группы в карбоксильную.

Изменение структурной организации белковой молекулы, в результате модификаций, способствует увеличению "атакуемости белков протеолитическими ферментами.

С увеличением степени.гликирования белков дрожжей и снижением их амидированности атакуемость белков дрожжей бактериальной проназой увеличилась в 2 раза по сравнению с контролем как в "молодых", так и в "старых" клетках. При этом необходимо отметить, что белки "старых" клеток подвергаются действию проназы интенсивнее, чем в "молодых" и в контроле и в опыте(10%-я глюкоза).

Т.о. проведенные исследования показали, что увеличение концентрации глюкозы в окружающей среде, приводит к возрастанию сте пени гликирования; и при этом также наблюдается снижение амидиро ванности белков дрожжей. Мы полагаем, что оба процесса могут быт взаимосвязаны. Реакция гликирования осуществляется без участия ферментов, регулируется в организме редуцирующими сахарами ациклической формы и зависит от времени контакта сахара с белком. (Kato,1990). Предполагается, что процесс неферментативного гликирования цроисходит в результат© взаимодействия альдегидной группы глюкозы и гидроксильных груш серина или треонина, е-ами-ногруппы лизина,, амидных груш аспарагина • или глутамина с образованием нестабильного основания Шиффа, которое в результате перегруппировки Амадори превращается в стабильный кетоамин (Cerami et al., 1979; Monnlr et al., 1981). Предполагаемым сайтом гликозилирования является п гледовательность Asn-Gly-Sei (Bank et al., 1991).

Недостатком опытов in vivo на дрожжах может быть влияние различий биосинтеза белка и протеолиза на средах с различной концентрацией глюкозы.

Общность закономерностей гликирования и дэзамидирования се-лков дрожжей с животными объектами,о чем можно судить по данным литературы(Цыбульский, 1985), позволили далее детальнее исследовать протекание данных модификаций на индивидуальных белках, in vitro, в условиях, исключающих эффекты биосинтеза и протеолиза.

Были избраны белки, обладающие функциональной активностью: инсулин - гормональной, алкогольдегидрогеназа - ферментативной.

Инсулин - гормон, осуществляющий регуляцию уровня глюкозы в тканях. По литературным данным ивзестно, что в условиях гипергликемии присходит неферментативное гликирозание НЬ, альбумина, белков хрусталика, иммуноглобулина и др. Интересным является вопрос о возможности гликирования белка, участвующего в метаболизме глюкозы.

В процессе инкубации инсулина в р-рах глюкозы I, 5, 10 и 20% происсходит его гликирование, при 3icM степень- модификации белка пропорционально возрастает с увеличением концентрации глюкозы. В 1%-ом р-ре глюкозы содержание гликированных белков возросло за 24 часа инкубации на 78%. В 5%-ом р-ре глюкозы количество модифицированных белков увеличилось вдвое. Более интенсивно, процесс гликирования протёкал в 10 и ЗО^-ных р-рах глюкозы, где количество модифицированных белков возросло, в 6-7 раз (рис.2)-

Результаты наших исследований подтверждаются некоторыми даннными литературы.Белки, при контакте с невосстанавливающей формой глюкозы, подвергаются неферментативному гликированшо (Галенок, Боднар, 1989).

Уровень гликированных белков коррелирует со степенью гипэр-гликемии при сахарном диабете. Авторами отмечается повышение количества модифицированных белков при заболевании;в 2-4 раза по сравнению с нормой(Викторова, Городецкий, 1390).

Высказано предположение, что гликирование, наряду с другими факторами, в частности, последовательностью аминокислот в цепи, может влиять на скорость дезамидирования(Тиггепс, Steven, 1987).

При инкубации инсулина в 1%-ом р-ре глюкозы практически не произошло снижения амидированности белка.

Начиная с 5%-ой глцжозы наблюдается достоверное снижение амидированности. С дальнейшим увеличением концентрации глюкозы в сред' скорость неферментативного дезамидирования повышается: содержание азота амидных групп белка после инкубации в 20%-ой глюкозе в течение суток уменьшается на 20%. .

Таким образом, по нашим данным скорость дезамидирования инсулина изменяется в зависимости от содержания глюкозы в среде и времени инкубации. Возможно,' что длительное нахождение белка в условиях'гипергликемии (при диабете) приведет-к ускорению проце-

сса дезамидирования.

Между двумя изученными процессами(дезамидирование-гликиро-вание) установлена корреляционная зависимость. Коэффициент корреляции между уровнем :ликированных белков и количеством ЛАГ варьировал от 0,56 до 0,95 в зависимости от времени инкубации и содержания глюкозы в среде.

Следует отметить, что более интенсивно снижалось количество ЛАГ(аспарагина). Дезамидирование ТАГ(глутамина) происходит после денатурации белковой молекулы.(Пушкина, I97S).

Нефрментативное дезамидирование бежа под влиянием гликиро-вания приводит к изменению структурно-функциональной оргагчзации белковой молекулы, следствием чего может быть увеличение атакуе-мости белка и снижение его активности.

Высказано предположение, что гликирование инсулина ln vivo может снизить его гипогликемическую активность(Галенок, Боднар, 1989).

При введении модифицированного препарата крысам,оказалось,-что активность гормона снижена по сравнению с исходным нативным препаратом на 17 и 31% после его инкубации в I и 5%ных растворах глюкозы в течение суток, и на 58 и 72% после инкубации в 10 и 20%-ных растворах глюкозы(рис. 3).

Патогенез сахарного диабета характеризуется разнообразными. нарушениями метаболизма, ео многом сходными с нарушениями при старении организма. Эти нарушения проявляются в обеспеченности организма инсулином, часто из-за снижения его активности. Возможно, изменение конформации молекулы в результате дезамидирования .приводит к нарушению взаимодействия гормона со своим рецептором на поверхности клеток-мишеней(Burke et al., 1980). Есе эти изменения влекут за собой развитие стойкой гипергликемга и в даль-

нейшем развитию патологических процессов.

мМоль глюкозы на 1л.

2

Рис. 3. Содержание глюкозы в крови крыс без введения инсулина (I); после введения нативного инсулина(2); после введен инкубированного в I, 5, 10 и 20%-ных р-рах глюкозы(3, 4, б, 6)

Неферментативное дезамидирование и связанная с ним аспар гин-зависимая автофрагментация белков является причиной измен ния структурных и физико-химических свойств, белков и изменен их атакуемости бактериальной проназой.

Результаты наших исследований показали, что при использо нии I и-5%-ого р-ра глюкозы в процессе инкубации инсулина атак емость белка увеличилась на 21 и 22% по сравнению с контролем.

Увеличение концентрации глюкозы в среде сопровождалось ре ким усилением атакуемости белка проназой. В 10%-ом р-ре глюко оно увеличилось йа 82%, в 20%-ом на 125%.

Полученные данные позволяют предположить, что сопряженные процессы гликирования, дезамидирования и протеолитической дест рукции приводят в конечном итоге к снижению активности как эндогенно инсулина, так и препаратов гормона при терапии тяжелых форм сахарного диабета. Есть основание предложить использовать

в таких случаях комплексный препарат инсулина с ингибиторами протеиназ для пролонгирования его действия. Однако это требует дополнительных исследований.

Таким образом, неферментативные процессы гликирование и дезамидирование вызывают существенные изменения свойств белкоЕых молекул, и приводят в конечном итоге к ускорению "старения" белков.

Показано, что дезамидироване и гликирование являются одними из важнейших способов модификации специфической активности белков. Установлено изменение свойств альбумина, иммуноглобулина НЬ, интерлейкина, многих гормонов при гликировании и дезамидиро-зании(Ш11 ег а1., 1990; СПсгеаэе е1; а1., 1990; Тсетого ег а1.' 1990; Jaciшan ег а1., 1990; Г1огг1зоп еХ а1., 1990; БоНюГег ег а1., 1991).

Показано изменение свойств некоторых ферментов, например, триозофосфатизомеразы, РНК-азы, в процессе дезамидиров8Ния(Сгасу е1; а! .,1990; Цыбульский, 1985).

Проведенные нами исследования по амидированности и гликирова-нию алкогольдегидрогеназы показали, что в исходном, нативном препарате алкогольдегидрогеназы, контрольный уровень гликирова-ния составил в среднем ЗОДмкм. фруктозы на 1г.. бета. После инкубации в 2 и 10%-ных р-рах глюкозы произошло повышение стопет гликирования в 1,5 и 2,2 раза(рис.4).

Следует отметить, чт?о процесс гликирования алкогольдегидрогеназы протекал менее интенсивно, чем в случае инсулина. Количе-чество гликированных форм этого белка возросло на 109% по сравнению с контролем при 24-х часовой -инкубации в 10%-ой глюкозе, а инсулина в аналогичных условиях на 260$.

Амидированность алкогольдегидрогеназы уменьшилась по сраь-

нению с контролем на 28% после инкубации бежа в 10%-ой глюкоз в течение суток(рис.5),амидированность инсулина после инкубаци в 10%-ой глюкозе на 15%, в 20%-ой на 24%. Суммируя вышеизложен ное, можно сказать, что процесс дезамидирования в обоих белка протекал практически аналогично, однако в гликировании белков н блюдались различия. Видимо это связано с особенностями структур алкогольдегидрогеназы, с локализацией на поверхности мо лекулы лизина, аспарагина и др.аминокислот, подвергающихся гликировани

концентрация глюкозы {%)

Рис.4. Зависимость степени гликирЬвания белков от процентного содержания глюкозы в среде; инкубация инсулина 0, 2, 4, 24 час* (1-4); 5)алкогольдегидрогеназы; 6,7) "молодые" и "старые" клетки дрожжей,.соответственно.

Активность алкогольдегидрогеназы после 24-х часовой инкубЕ ции препарата в 10%-ой глюкозе снизилась на 18% по сравнению контролем. По-видимому, данное снижение является результатом ос их процессов: как дезамидирования, так и гликирования. •

На изменение атакуемости алкогольдегидрогеназы также, по-1

димому, влияют оба процесса и гликирование и дезамидирование т.к. динамика их сходна. Атакуемость алкоголъдегидрогеназы бактериальной проназой возросла в 1,8 раза по сравнению с контролем.

Полученные в результате нашей работы данные свидетельствуют о том, что между изученными процессами существует взаимосвязь. Повышение содержания глюкозы в среде сопровождалось увеличением степени гликирования инсулина и алкоголъдегидрогеназы(in vivo), и общего белка дрожжей(in vivo), параллельно наблюдалось снижение амидированности данных белков.

I00&

мкм.

азота 900

амид-

ных 800

груш. 700

600

500

400

300

200

100

10 12. 14 16 18 20 содержание глюкозы в среде(%)

Рис. б. Суммарная амидированность белков при инкубации в р-рах

глюкозы, в течение суток; I)алкогольдегидрогеназы; 2,3) "молодые" и "старые" клетки дрожжей; 4) инсулин.

Неферментативное гликирование и дезамидирование, вероятно, являются причиной модификации белков при сахарном диабете и могут сыграть определенную роль в развитии осложнений, характерных для диабета и нормряьного физиологического старения организма. Спонтанно стареющие формы могут либо быть токсичными, либо выте-

снять нормальные белки. Накопление измененных белков приводит к развитию патологических явлений при сахарном диабете или же возможно, приводит к ускоренному старению организма,популяцг клеток и др. систем.

Таким образом,можно заметить, что два неферментативных прс цесса различного характера(гликирование и дезамидироваше) моГ} быть взаимосвязаны и использоваться в биологических системах кг механизм, определяющий длительность функционирования белковых i лекул.

ВЫВОДЫ.

1. Степень гликирования белков "молодых" клеток дрожжей п] выращивании в среде с содержанием глюкозы I, б, 10 и 2( "составляв?57,2; 71,2; 89,5; 98,5 мкм. фруктозы на 1г. белка, с<

ответственно. Содержание амидов в белках в тех же условиях бы. 551,6; 563,3; -471,6; 420,6 мкм". азота амидных групп на 1г. бел!

2. Степень гликирования белков "старых" клеток дрожжей пр< вьгаГает ее величину у "молодых" клеток, и была выше в аналогична условиях на 16%; 8%; 10%; 5,8%, соответственно. Содержание ами, в белках "старых" клеток дрожжей в 1%-ой глюкозе было 560,7 мга азота амидных груш на 1г. белка, в 2, 5, 10%-ной глюко;

снлжрется на.14,7%; 2,3%; 6,9% по сравнению с "молодыми" клвтк.

3. Атакуемость белков бактериальной проназой увеличиваете на •104% при повышении содержания глюкозы в среде в "молоды: клетках и на 75% в "старых" клетках. При "старениин на 47% 2%-ой глюкозе, и на 26% в 10%-ой глюкозе.

4. Изменение уровня гликирования инсулина при инкубации растворах глюкозы I, 5, 10 и 20% наиболее проявляется'при 24 часовой инкубации и превысило контрольный уровень(5,6 ми

фруктозы на 1г. белка) на 77%; 125%; 267%; 731%, соответственно. Амидированность белка в 1%-ой глюкозе практически не изменилась по сравнению с контрольной (946,9 мкм. азота АГ. на 1г. белка), и составила 915,9 мкм. азота АГ. на 1г, белка, в 5, 10 и 20%-ной глюкозе уменьшилась на 15%; 20%; 24%.

5. Атакуемость белка бактериальной проназой увеличивается при повышении степени гликирования и снижении амидированности.

6. Гипогликемическая активность инсулина снизилась на 17%; 31%; 58%; 72% при инкубации белка в течение 24-х часов в I, 5, 10 и 20%-ой глюкозе.

7. Степень гликирования алкогольдегидрогеназы в процессе инкубирования в растворах глюкозы 2 и 10% была 46,5 и 65,3 мкм. фруктозы на 1г. бежа, соответственно, в контроле 30,1 мкм. фруктозы на 1г. бежа. Амидированность бежа в аналогичных условиях была 502; 426 мкм азота АГ. на 1г.' бежа, в контроле 596 мкм. азота АГ. на 1г. бежа.

8. Атакуемость модифицированного бежа бактериальной прочязой увеличивается на 55% по сравнению с контролем.

9. Удельная активность ажогольдегидрогеназы при инкубации в 2 и. 10%-тх растворвх глюкозы снижается на 14% и 18% по сравнению с контролем.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:"

1. Пушкина Н.В., Шепотиновская И.В. Назарова И.Н.,- Лукаш А.И. Роль неферментативного гликозилирования в ускорении процессов старения бежов. В сб.: Ускоренное старение, связь с возрастной патологией. Тезисы дкладов научной конференции. Киев, 1992г.

2. Пушкина Н.В., Шепотиновская И.В., Климова • И.А., Назарова ■ И.Н., Лукаш А.И. Гипогликемическая активность инсулина при его

неферментативном гликировании и деаамидированш. Проблемы от рения и долголетия. -Киев, 1992, N4, -0.466-474 3. Назарова И.Н., Климова И.А., Пушкина Н.В., Лукаш л. И. Пос трансляционные модификации белков "молодых" и "старых" клеток дрожжей Sacctiaromyces paradoxus. -Статья депонирована в ВИНИ 23 июля 1993 года, N 2I0I-B93. Деп.Пс. Две работы находятся в печати.