Влияние неферментативного дезамидирования на некоторые биохимические и физико-химические свойства препарата лактоглобулина

Бибов, Михаил Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние неферментативного дезамидирования на некоторые биохимические и физико-химические свойства препарата лактоглобулина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние неферментативного дезамидирования на некоторые биохимические и физико-химические свойства препарата лактоглобулина"

На правах рукописи .

Бибов Михаил Юрьевич

ВЛИЯНИЕ НЕФЕРМЕНТАТИВНОГО ДЕЗАМИДИРОВАНИЯ НА НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА ЛАКТОГЛОБУЛИНА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 2004

Диссертация выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Ростовского государственного университета, а также в Ростовском научно-исследовательском институте микробиологии и паразитологии.

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Лукаш АИ.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Погорелова Т.Н.

доктор биологических наук, профессор Волжина Н.Г.

Ведущая организация: Кубанская государственная медицинская академия

Защита диссертации состоится 200^г. в «^»"часов на заседании

диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в Ростовском госуд^рю^венном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, 6, ул. Большая Садовая, 105,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Ростовского государственного университета (344006, г. Росгов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из основных причин возникновения острых кишечных заболеваний у детей раннего возраста служат условнопатогенные микроорганизмы, что обусловлено физиологической незрелостью и относительно низкой степенью развития систем неспецифической иммунной защиты организма (Тур А.Ф., 1967) В исследованиях последних лет показана возможность использования препаратов лактоглобулинов и лактосывороток из молока и молозива коров для защиты от инфекции и формирования нормального микробиоценоза в кишечнике новорожденных (Соболева СВ. и соавт., 1991). Препараты лактоглобулинов представляют собой комплексные белковые системы, содержащие как факторы иммуноспецифической защиты (IgA, IgG, IgM) так и факторы неспецифической противомикробной резистентности, центральное место среди которых занимает лактопероксидазная система (ЛПО). Однако многие из перечисленных белковых компонентов, обуславливающих протекторные свойства лактоглобулина, весьма уязвимы к действию внешних факторов и легко теряют свою активность в ходе получения препарата (Пушкина Н.В. и соавт., 1986). Получение нелиофилизированной формы препарата лактоглобулина представляет непосредственный интерес в плане сохранения в нем активности систем неспецифической противомикробной резистентности. Применение технологии мембранной фильтрации позволяет избежать использования спирта для фракционирования белков при получении лактоглобулина, а, следовательно, и лиофилизации, являющейся мощным повреждающим фактором для белков лактосыворотки. Исследование биохимических свойств, специфической и неспецифической активности, а также стабильности нелиофилизированных препаратов лактоглобулина, полученных таким способом, необходимо для оптимизации технологического процесса их получения, что и определило направление наших исследований.

неферментативного дезамидирования и, связаннг 1 РРС^нМДШКШфАМЗДЯфимая

БИБЛИОТЕКА I

автофрагментация задействованы в процессах старения и деградации белковых молекул (Олехнович Л П и соавт., 1985; Blotgrett J К., 1985; VooiterC Е М, 1988; WrightH.T., 1991). Изменение степени амидированности влечет за собой определенные локальные нарушения структурных и физико-химических характеристик белков, и является причиной возникновения новых модифицированных белков с «дефектными» биологическими функциями (Robmson N Е., 2002) Следствием этих изменений является снижение специфической • и неспецифической биологической активности белковых молекул

Мы полагали, что спонтанное дезамидирование в водных растворах препарата лактоглобулина, полученного с помощью мембранных технологий, может быть важнейшей причиной их «старения» при хранении Это, а также попытки модифицировать скорость этих процессов определили цель и задачи исследования

Цель работы: Целью настоящей работы явилось установление роли неферментативного дезамидирования в изменениях некоторых биохимических и физико-химических свойств белков препарата лактоглобулина, полученного методом мембранных технологий, в зависимости от условий хранения Задачи исследования, • 1. Изучение лактопероксидазной, активности, антиоксидантных свойств, а также титров антител, специфических против Salmonella В и Salmonella D, препаратов лактоглобулина в процессе его хранения при различных значениях температуры

(4°±1°С и 35°±1°С) и pH (7,0 и 5,5).

2. Изучение динамики протекания процессов неферментативного дезамидирования белков препарата лактоглобулина в процессе его хранения при различных значениях температуры

3. Изучение интенсивности деструкции белков препарата лактоглобулина в процессе его хранения при различных значениях температуры (4°±1°С и 35°±1°С) и pH (7,0 и 5,5)

4 Изучение структурно-конформационных преобразований в белках препарата лактоглобулина методом регистрации их собственной флуоресценции в процессе его хранения при различных значениях температуры 5,5)

и структурно-конформационных преобразований белков препарата лактоглобулииа в ходе его хранения при 40±1°С И 35°±1°С. Научная новизна результатов. В работе впервые установлено состояние систем специфической и неспецифической противомикробной защиты в нелиофилюированных препаратах лактоглобулина направленного действия против сальмонелл, полученных с применением мембранных технологий. Выявлено влияние температуры и рН инкубационной среды на активность ЛПО, антиоксидантные свойства и уровень титров антител специфических против Salmonella В и Salmonella D в препаратах лактоглобулина при их хранении. Впервые установлены тесные корреляционные связи и роль процессов неферментативного дезамидирования, деструкции и структурно-конформационных изменений в инактивации препаратов лактоглобулина при их хранении. Показано снижение интенсивности дезамидирования и деструкции белков препарата лактоглобулина при инкубации в слабокислой среде по сравнению с нейтральной. Установлено влияние глюкозы, фруктозы и сорбитола, на скорость процессов дезамидирования и деструкции, а также изменения биологической активности белков препарата лактоглобулина в ходе их «модельного» старения при хранении. Впервые установлено ускорение дезамидирования трудногидролизуемых амидных групп (ТАГ) перечисленными углеводами. Основные положения выносимые на защиту:

1. В ходе хранения прИ'40±1°С И 35°ileC в препарате лактоглобулина происходит снижение его биологической активности вследствие дезамидирования, фрагментации и конформационных изменений молекул белков, входящих в его состав.

2. Скорость дезамидирования, деструкции и снижения специфической и неспецифической биологической активности в ходе инкубации при

в течение 28 суток ниже для препаратов, инкубировавшихся при рН 5,5 по сравнению с нейтральной средой.

3. Скорость дезамидирования белков препарата лактоглобулина тесно коррелирует с интенсивностью деструкции полипептидных цепей.

4. Инкубация препарата лактоглобулина при слабокислых рН позволяет увеличить продолжительность функционирования в нем ЛПО, а также факторов, обусловливающих его антиоксидантное действие.

5. Введение в среду инкубации глюкозы, фруктозы и сорбитола оказывает неодинаковое влияние на скорость дезамидирования легкогидролизуемых амидных групп (ЛАГ) и ТАГ, а также на активность ЛПО, антиоксидантные свойства и уровень специфической активности изучаемого препарата.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты имеют существенное значение для понимания молекулярной природы процессов происходящих при старении белков. Важным в теоретическом плане является установление взаимосвязи между интенсивностью дезамидирования и функционированием систем специфической и неспецифической противомикробной резистентности препаратов лактоглобулина. Это может свидетельствовать о роли неферментативного дезамидирования в качестве одного из механизмов регуляции протекторных свойств белков лактосыворотки.

Практическую ценность представляют данные о снижении интенсивности дезамидирования и деструкции белков препарата лактоглобулина при инкубации в слабокислой среде (5,5) по сравнению с нейтральной (7,0). Особое значение имеют данные о более продолжительном функционировании Л ПО, а также систем, отвечающих за антиоксидантные свойства препарата лактоглобулина в условиях его хранении при слабокислых значениях рН.

Учитывая универсальность процессов дезамидирования, такие величины рН могут быть рекомендованы для хранения растворов других белковых препаратов, применяющихся в медицинской практике.

Представляются существенными с практической точки зрения данные о влиянии глюкозы, фруктозы и сорбитола на биологические свойства и показатели нативности белков препарата лактоглобулина, что может оказаться полезным при выборе пищевых добавок и консервантов в практике производства иммунобиологических препаратов на основе молока и молозива с целью сохранения в них тех или иных видов биологической активности, а также обеспечения вкусовых качеств данных препаратов, предназначенных в основном для перорального применения пациентами раннего детского возраста.

Результаты, полученные при выполнении работы, используются при получении экспериментально-производственных серий нелиофилизированного препарата лактоглобулина в Ростовском НИИ Микробиологии и Паразитологии, а также при чтении лекций по специальному курсу «Биохимия белка» в Ростовском государственном университете.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на ежегодных научно-практических конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов Ростовского государственного университета «Неделя науки» (Ростов-на-Дону, 2000 -2004), 54-й Итоговой научной конференции студентов, молодых ученых и специалистов Ростовского Государственного Медицинского Университета (Ростов-на-Дону, 2000), 3-й научной сессии Ростовского Государственного Медицинского Университета (Ростов-на-

Дону, 2000), конференции молодых ученых Северного Кавказа по физиологии и валеологии (Ростов-на-Дону, 2000), ежегодной межвузовской международной конференции молодых ученых специалистов и студентов «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2003; 2004), научно-практической конференции «Проблемы общей биологии» (Ростов-на-Дону, 2003), Всеобщей польской, конференции по проблемам медицины (Белосток, Польша, 2003), ежегодной Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003; 2004), международном междисциплинарном симпозиуме «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии -интегративная медицина» (Хургада, Египет, 2004), международном междисциплинарном симпозиуме «Интегративная медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004), а также 6-м международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, Украина, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ в отечественной и зарубежной печати, получена 1 приоритетная справка

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста, включая 35 таблиц и 17 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 63 отечественных и 139 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовались препараты лактоглобулина против Salmonella В и Salmonella D, полученные в лаборатории медицинской биотехнологии и иммунохимии Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии (РНИИ МП МЗ РФ) методом мембранной ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Препараты инкубировали, соблюдая условия стерильности в течение 28-ми суток при температуре В специальных сериях препарата создавали

10% концентрацию глюкозы, фруктозы и сорбитола. Белковый состав препарата лактоглобулина исследовали методом электрофореза в 7,5% и 15% полиакриламидном геле (ПААГ) (Laemmli U.K., 1970). Определение содержания белка в препаратах лактоглобулина осуществляли методами Лоури и Варбурга-Кристиана (Камышников В С, 2002). Активность ЛПО в препаратах лактоглобулина определяли ортотолуидиновым методом, описанным в работе Альперовича ДВ. и Кесельман ЭВ. (1990) Антиоксидантную активность препарата лактоглобулина определяли по интенсивности тушения им Ре2+-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) желточных липопротеинов

(Владимиров Ю.А. 1992) с использованием хемилюминометра ХЛ-003 (Россия). Специфическую активность препарата лактоглобулина оценивали по 'интенсивности реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарными О-диагностикумами к вакцинным штаммам Salminella BHD, приготовленными в лаборатории биологического и технологического контроля РНИИ МП (Минеева Л.Д., 1980). Для определения амидированности в препаратах лактоглобулина белки подвергали осаждению 6%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и обрабатывали органическими растворителями для освобождения от небелковых примесей. Амидные группы в белках определяли по количеству аммиака, выделившегося при их гидролизе в 1 н. серной кислоте при 100°С. Определяли суммарную амидированность (САГ), а также содержание легкогидролизуемых (ЛАГ) и трудногидролизуемых (ТАГ) амидных групп, освобождавших аммиак, соответственно, за 15 мин и 3 ч гидролиза (Гершенович З.С. и Кричевская А.А. 1960). Количество аммиака определяли флуорометрическим методом Sugawara и Оуата (1981) с использованием спектрофлуориметра Флуорат-02 (Россия). Для оценки интенсивности деструкции белков препарата лактоглобулина в ходе их инкубации при различных температурных режимах нами был использован скрининговый метод определения уровня молекул средней массы (МСМ) в модификации А. Бабеля и соавт., (1974). Результаты выражали как отношение экстинций исследуемого раствора при 280 и 254 нм. Конформационные изменения белков лактоглобулина оценивали, по интенсивности и характеру спектра их собственной флуоресценции при длинах волн возбуждения 275,280 и 285 нм (Vekshin N.L. 1999).

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически методом вариационной статистики с помощью программы Stalistica 6.0 Statsoft, (США). Для установления вида и силы статистической зависимости между различными показателями вычисляли коэффициент корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение специфической и неспецифической биологической активности препаратов лактоглобулина в процессе его хранения в различных условиях

В результате проведенных исследований установлено, что в процессе инкубации препарата лактоглобулина при наблюдалось постепенное

снижение их ЛПО активности.

Активность ЛПО в препаратах лактоглобулина, инкубировавшихся при рН 7,0 и 5,5 сразу после получения («нулевое» время) составляла Ед/мг белка

соответственно.

Уже через 7 суток инкубации при 4°±!0С И 35°±1СС было отмечено снижение активности ЛПО на 55% и 96%, соответственно После 14-ти и 28-ми суток инкубации при 4°±10С это снижение составляло 77% и 88%, соответственно Высокотемпературная инкубация в течение 14-ти суток приводила к полной потере ЛПО активности (Рис 1)

Недельная инкубация препарата лактоглобулина при 4°±1вС, рН 5,5 не оказывала достоверного влияния на активность ЛПО, в то время как при ЗЗ'^^С значение соответствующего показателя снижалось на 24% Инкубация данного препарата при в течение 14-ти и 28-ми суток приводила к падению активности ЛПО на 11% и 21% соответственно При высокотемпературной инкубации в течение 28-ми суток препарат полностью терял каталитическую активность (Рис 1)

Введение 10%-ной добавки глюкозы и сорбитола в среду инкубации белков препарата лактоглобулина приводило к падению активности ЛПО в 1,5 раза по сравнению с «чистым» препаратом, инкубировавшимся при рН 5,5, а добавка фруктозы практически полностью подавляла способность препарата к осуществлению пероксидазной реакции За 28 суток инкубации препаратов лактоглобулина при в присутствии 10%

глюкозы и сорбитола они полностью лишались каталитических свойств (Рис 1)

Препараты лактоглобулина с рН 7,0 и 5,5 обладали выраженной антиоксидантной активностью в модельной системе свободнорадикального перекисного окисления липопротеинов яичного желтка, индуцированного ионами Алтиоксидантные

свойства лактоглобулина были сильнее выражены в слабокислой среде по сравнению с нейтральной

' В ходе 28-ми суточной инкубации препаратов лактоглобулина в нейтральной и слабокислой среде при 4°±1°С И 35в^1°С наблюдалось снижение их антиокислительной активности (Рис. 2) Как видно из данных представленных на рисунке, препараты лактоглобулина, подвергавшиеся инкубации в нейтральной среде теряли антиоксидантные свойства быстрее тех, что инкубировались при рН 5,5. После 7 и 14-ти суток низкотемпературной инкубации в нейтральной среде препарат лактоглобулина подавлял светосумму ХЛ на 22,4% и 7%. К 28-и суткам инкубации исследуемый препарат полностью терял способность к антиоксидантному действию. В аналогичных условиях препарат, инкубировавшийся при рН 5,5 снижал светосумму ХЛ на 32,6%, 22,1, и 17,6% после 7,14, и 28-ми суточной инкубации соответственно (Рис. 2).

Введение в среду инкубации добавок глюкозы, фруктозы и сорбитола усиливало антиоксидантные свойства препарата. В присутствии углеводных добавок снижение антиокислительной активности препарата лактоглобулина происходило значительно медленнее, чем в «чистых» препаратах, инкубировавшихся в слабокислой и нейтральной среде (Рис. 2)

В отличие от систем неспецифической противомикробной резистентности, факторы иммунной защиты, входящие в состав препарата лактоглобулина проявляли большую стабильность при инкубации. В препарате лактоглобулина, инкубировавшемся в

нейтральной среде к 28-ми суткам низкотемпературной инкубации выявлялось снижение титров антител против Salmonella В на 33%. После четырех недель инкубации такого препарата при 350±10С отмечалось снижение титров антител против Salmonella В и Salmonella D на 64% и 50% (Табл. 1).

В случае препарата, инкубировавшегося при рН 5,5,28-ми суточная инкубация при 4°±10С не оказывала заметного влияния на показатели титров специфических антител против соответствующих штаммов сальмонелл.

Табл. I Титры антител, специфических против Salmonella В и Salmonella D в препаратах лактоглобулина после 28-ми суток инкубации при различных значениях температуры и

. Рн„. Специфическая активность (мкг/Юмкл)

•• Штамм 4°±1°С 35°±1°С

0 буток 28 суток 0 суток 28 суток

7,0 Salmonella В 28,08±2,1 18,72±2,1 28,08±2,1 10,14±1,2

Р <0,03 <0,001

Salmonella D 18,72±2,1 16,38±1,8 18,72±2,1 9,36±1,04

Р >0,05 <0,003

5,5 Salmonella В 29,64±1,6 28,08±2,1 29,64±1,6 17,16*1,6

Р >0,05 <0,001

Salmonella D 28,08*2,1 26,52±2,4 28,0&±2,1 10,92±1,3

Р >0,05 <0,001

Достоверное снижение иммунологической активности препарата в отношении штаммов Salmonella D и Salmonella В происходило лишь по прошествии 14-ти и 28-ми суток инкубации при соответственно.

Уровень титров специфических антител против Salmonella В и Salmonella D в присутствии добавок глюкозы, фруктозы и сорбитола достоверно не изменялся, что свидетельствует о том, что идущие в ходе инкубации' препарата процессы неферментативного гликирования не отражаются на способности гипервариабельных доменов иммуноглобулинов связывать соответствующие антигенные детерминанты (Табл. 2).

Снижение специфической и неспецифической активности препаратов лактоглобулина в ходе их хранения в различных условиях поставило, с одной стороны, вопрос о выяснении причин нестабильности биологически активных факторов в нелиофилизированном препарате лактоглобулина, а с другой стороны, указало на

необходимость оптимизации технологического процесса получения жидкой формы лактоглобулинов, с целью сохранения в них как специфических иммунопротекторных факторов, так и активности компонентов, обеспечивающих неспецифическую противомикробную защиту.

Табл. 2 Титры антител, специфических против Salmonella В и Salmonella D в препаратах лактоглобулина, подвергавшихся инкубации в присутствии углеводов при 4°±10С И

35°±1°С в течение 28-ми суток, п = 10

Исследуемые углеводы 10% Специфическая активность (мкг/10мкл)

Штамм 4°±1°С 35°i ГС

0 суток 28 суток 0 суток 28 суток

Глюкоза Salmonella В 28,08±1,56 28,08±1,56 28,08±1,5б 21,84±2,55

Р >0,05 >0,05

Salmonella D 26,52±2,08 26,52±2,08 26,52±2,08 18,72±2,9

Р >0,05 >0,05

Фруктоза Salmonella В. 28,08±1,56 28,08±1,56 28,08±1,56 21,06±2,86

Р >0,05 >0,05

Salmonella D 26,52±2,08 24,96±2,55 26,52±2,08 17,16±2,55

Р >0,05 >0,05

Сорбитол Salmonella В 26,52±2,08 26,52±2,08 26,52±2,08 21,84±2,55

Р >0,05 >0,05

Salmonella D 24,96±2,58 24,96±2,58 24,96±2,58 17,94±2,34

Р >0,05 >0,05

Мощным фактором, обусловливающим нестабильность белковых препаратов, являются неферментативные посттрансляционные модификации, центральное место среди которых занимает дезамидирование остатков Асн и Глн. Поэтому следующим этапом наших исследований стало изучение нативности белков препарата лактоглобулина в ходе его хранения в различных условиях.

Исследование динамики процессов неферментативного дезамидирования, деструкции и конформационных преобразований в белках препарата лактоглобулина при инкубации На РИС. 3 представлены диаграммы, демонстрирующие динамику изменения содержания САГ, ЛАГ и ТАГ в препаратах лактоглобулина с рН 7,0 и 5,5 на различных этапах их инкубации при

Сразу после получения («нулевое» время) общее содержание амидных групп в белках, препаратов лактоглобулина, предназначенных для инкубации в нейтральной и слабокислой среде составляло 733,5±2,8 И 679,7±5,3 мкМ амидного азота на г. белка, соответственно.

Количество ЛАГ в препаратах лактоглобулина, инкубировавшихся при рН 7,0 в «нулевое» время составило 276±3,06 мкМ амидного азота на г белка или 37,6% от суммы амидов, в то время как на долю ТАГ приходилось 457,5±4,65 мкМ амидного азота на г белка.

В препарате лактоглобулина, инкубировавшемся при рН 5,5 содержание ЛАГ и ТАГ составляло мкМ амидного азота на г белка, соответственно.

Препарат лактоглобулина, инкубировавшийся при рН 7,0, подвергался дезамидированию с гораздо большей скоростью по сравнению с препаратом, инкубировавшимся при рН 5,5. За 28 суток инкубации при 4°±10С И 35°±1°С уровень САГ в препарате, инкубировавшемся при нейтральном рН снизился на 33%, и 53%, соответственно. Низкотемпературная инкубация препарата лактоглобулина при рН 5,5 в течение 28-ми суток не отражалась на общем уровне амидированности входящих в его состав белков, в то время как при высокотемпературной инкубации величина данного показателя за такой же промежуток времени снижалась на 29%.

К 28-ми суткам низко- и высокотемпературной инкубации препарата лактоглобулина в нейтральной среде содержание амидных групп фракции ЛАГ снижалось на 52% и 71%, соответственно При рН 5,5 содержание ЛАГ за это же время понизилось на 9,5% и 30%, соответственно Амидные группы фракции ТАГ подвергались дезамидированию гораздо медленнее За четыре недели инкубации при 4°±1°С уровень ТАГ в препаратах лактоглобулина, Инкубировавшихся при нейтральном рН снизился на 21%, а в препарате, инкубировавшемся при рН 5,5 статистически достоверных изменений в содержании ТАГ выявлено но было Высокотемпературная инкубация в тех же условиях приводила к потере амидов фракции ТАГ на 42% и 28,5%

При введении в среду инкубации препарата добавок глюкозы, фруктозы и сорбитола отмечалось'замедление дезамидирования во фракции ЛАГ, представленной преимущественно остатками Асн, и, напротив, ускорение дезамидирования во фракции ТАГ, представленной преимущественно остатками Глн (Пушкина Н В, 1988) (Рис 4)

Снижение интенсивности потери амидных групп фракции ЛАГ в белках лактосыворотки в присутствии глюкозы, фруктозы и сорбитола может быть, предположительно, объяснено способностью углеводов к изменению структуры ассоциатов молекул воды, входящих в состав ближайшего окружения остатков Асн, и стабилизации гидрофобных взаимодействий в белковых молекулах (Gekko 1981, Пушкина НВ исоавт.,1986)

123 133 Л 2 3 123 123 123

-7 суток О -14 суток и -2* сунне

4*±1'С

35*»1*С

I - различая, достоверные во егаошсшпо ж кокгролю (р«0,б5) 1-САГ;2-ЛАГ5 З-ТАГ; С1с - Е1ЮХОМ10И, Ггс - фрукте» ЮН; БгЬ - сорблвд ЮН;

Рис. < Имиицш» гадср» «ила «мяянмт «ддп » др«ар;тп листагдобутдм* » год ж* яихубдция 4*±1*<? ■ ЗУ±1*С ■ ■рвсуштустот (» Н в* иппш К контр»» - ( суток анкуСашв)

Параллельно со снижением содержания амидных групп в препаратах лактоглобулина отмечалось постепенное увеличение содержания продуктов деструкции белковых молекул (Табл 3). Коэффициент корреляции между содержанием САГ и молекул средней массы (МСМ) в белках препарата лактоглобулина, инкубировавшихся в нейтральной и слабокислой среде при 35°±1°С составлял соответственно -0,85 и -0,97 (р<0,001). Столь же высокий уровень корреляции наблюдался и в отношении дезамидирования во фракции ЛАГ, что согласуется с данными Олехновича Л.П. и соавт. (1985) наблюдавших неферментативное дезамидирование и аспарагинзависимую автофрагментацию других белков.

Полученные в нашей работе данные указывают на то, что интенсивность фрагментации белковых молекул в препарате лактоглобулина, инкубировавшемся в слабокислой среде была значительно ниже той, которая наблюдалась в препарате с рН 7,0.

Табл. 3 Изменение содержания молекул средней массы в препаратах лактоглобулина в ходе их инкубации при различных условиях (% по отношению к 0 - суток инкубации)

Препарат Сроки и режим инкубации

4°±1°С 35°±ГС

7 суток 14 суток 28 суток 7 суток 14 суток 28 суток

Лактоглобулин с рН 7,0 57* 139» 168» 177» 300» 433» •

Лактоглобулин с рН 5,5 10,4» 32,6» 89» 45,4» 94,1» 139»

Лактоглобулин + Глюкоза 10% 0,65 2,52 13,5 34,2» 56,8» 166,7»

Лактоглобулин + Фруктоза 10% 2,4 10,4» 18,5» 62,2» 117,3» 313»

Лактоглобулин + Сорбитол 10% - - 0,33 39* 60,5» 167,2»

* - изменения достоверные по отношению к 0 суток инкубации (р<0,05)

За 28 суток инкубации препарата лактоглобулина при 4°±1<>С И 35°±10С, рН 7,0 содержание в нем МСМ возросло на 168% и 433% соответственно, тогда как в препарате, инкубировавшемся при рН 5,5 этот показатель превышал контрольное значение на 89% и 139% соответственно (Табл. 3)

Введение в среду инкубации добавок глюкозы, фруктозы и сорбитола приводило к снижению интенсивности фрагментации белковых молекул в условиях низкотемпературной инкубации. За 28 суток инкубации препаратов лактоглобулина при в присутствии глюкозы и сорбитола содержание в них МСМ достоверно не изменялось, а при инкубации препарата лактоглобулина в присутствии фруктозы при 4°±10С в течение 28-ми суток уровень МСМ возрастал на 18,5%.

Данные о различной интенсивности прироста содержания МСМ в препаратах лактоглобулина в ходе их «модельного» старения подтверждались также данными электрофоретического исследования, выявившими постепенное увеличение гетерогенности фракционного состава исследуемых препаратов с появлением дополнительных низкомолекулярных фракций на фоне снижения содержания белков а- и Р-глобулиновых фракций, что также свидетельствует о фрагментации белковых молекул в ходе инкубации.

Снижение интенсивности деструкции белков в присутствии углеводов в сочетании с эффектом последних на интенсивность дезамидирования во фракции ЛАГ может, по нашему мнению, рассматриваться как косвенное подтверждение того, что в процессах деструкции белков препарата лактоглобулина в ходе их «модельного» старения задействованы механизмы, имеющие аспарагинзависимый характер. В то же время мы не исключаем участия следовых количеств протеолитических ферментов в наблюдаемой нами фрагментации полипептидных цепей. Усиление атаки полипептидных цепей протеазами на фоне дезамидирования ранее отмечалось рядом исследователей (Пушкина Н.В., 1988; ЛукашА.И., 1994).

Изменение содержания продуктов деструкции белка в препарате лактоглобулина коррелировало и с изменением его ЛПО и антиоксидантной активностей. Коэффициенты корреляции между соответствующими показателями в препаратах, инкубировавшихся в нейтральной и слабокислой среде составляли -0,90 (р<0,001) и 0,80 (р<0,001). Введение в среду инкубации глюкозы и сорбитола снижало уровень корреляции между данными показателями, указывая на разобщение процессов деструкции белка и изменений биологической активности препарата.

В ходе инкубации препаратов лактоглобулина отмечалось наличие конформациоиных преобразований входящих в их состав белков.

В «нулевое» время показатели интенсивности собственной флуоресценции белков препаратов лактоглобулина, предназначенных для инкубации в нейтральной и слабокислой среде составляли 410,64±5,0 И 5484,4±33,5 усл. ед, что, по-видимому,

связано с тем, что в нейтральной среде большая часть остатков триптофана в составе белков лактоглобулина изначально экспонировано на поверхности белковых глобул.

Инкубация препаратов при 4°±10С, рН 7,0 И 5,5 в течение 28-ми суток приводила к снижению интенсивности их собственной флуоресценции на 18,5% и 33%, а при 35°±1°С -на 33% и 48%

Глубина наблюдавшихся конформационных изменений коррелировала с интенсивностью дезамидирования белков соответствующих препаратов Коэффициент корреляции между изменением интенсивности собственной флуоресценции белков, возбуждаемой при 285 нм и уровня амидированности белков препарата лактоглобулина в ходе 28-ми суточной инкубации при 35°±1°С, рН 7,0 и 5,5 составлял 0,82 (р<0,001) и 0,86 (р<0,001)

Введение углеводных добавок несколько снижало глубину конформационных преобразований, происходивших в молекулах белков препарата лактоглобулина в ходе инкубации, что, по-видимому, также сыграло некоторую роль в снижении интенсивности деструкции полипептидных цепей За 28 суток инкубации препаратов лактоглобулина в присутствии глюкозы и сорбитола при интенсивность собственной флуоресценции

белков при длине волны возбуждения 285 нм понижалась на 22% и 17%. Аналогичные изменения при высокотемпературной инкубации составляли 36,6% и 26% (Рис. 5).

Введение фруктозы в среду инкубации не оказывало значительного эффекта на характер конформационных преобразований в белках препарата. Это согласуется с наиболее ярко выраженным, по сравнению с другими углеводами, ингибирующим эффектом фруктозы на активность ЛПО.

Возможный механизм стабилизирующего влияния углеводов на антиокислительную активность лактоглобулина может реализовываться за счет их подавляющего действия на процесс деструкции белковых молекул. Замедление деструкции белков препарата в присутствии углеводов может оказывать стабилизирующий эффект на способность металлсвязывающих белков, таких как лактоферрин и лактоферрицин, к иммобилизации ионов Fe2+ и Си2+ и, тем самым способствовать .сохранению антирадикальной активности лактоглобулина Кроме того, повышению антиоксидантной активности препарата может способствовать и увеличение интенсивности суммарного дезамидирования, наблюдаемого в присутствии углеводов, что обусловлено увеличением плотности распределения карбоксильных групп на поверхности белковой глобулы, способных к связыванию ионов FeJ+ и Cui+.

Таким образом, оптимальными условиями для хранения нелиофилизированных препаратов лактоглобулина являлись содержание при температуре При

таких условиях инкубации белки препарата лактоглобулина проявляли наименьшую скорость дезамидирования и максимальную ЛПО активность.

Введение в среду инкубации добавок глюкозы и сорбитола позволяет еще более снизить скорость дезамидирования во фракции ЛАГ, значительно замедлить интенсивность деструкции белковых молекул и стабилизировать антиоксидантную и специфическую активность препарата. Негативной стороной воздействия добавок сорбитола и глюкозы является их ингнбирующее действие на активность ЛПО.

ВЫВОДЫ

1. В процессе инкубации нелиофилизированных препаратов лактоглобулина при

происходит спонтанное дезамидирование и деструкция белковых молекул, что сопровождается их структурно-конформационными перестройками.

2. Процессы дезамидирования и деструкции белков обусловливают снижение активности ЛПО, антиоксидантного действия, а также титров антител, специфических против Salmonella В И Salmonella D, препаратов лактоглобулина при их инкубации.

Наиболее тесная корреляция с коэффициентами 0,73 - 0,99 выявлена между показателями амидированности (САГ, ЛАГ, ТАГ) и уровнями МСМ, флуоресценции и активности ЛПО при инкубации лактоглобулина при рН 7,0, а также между показателями амидированности и уровнем ЛПО, МСМ и флуоресценции при инкубации лактоглобулина при рН 5,5 и температуре

35в±ГС.

Введение глюкозы, фруктозы и сорбитола в концентрации 10 % в среду инкубации лактоглобулина понижало интенсивность деструкции белковых молекул в условиях низкотемпературной инкубации, а также приводило к усилению интенсивности дезамидирования входящих в его состав белков преимущественно за счет фракции ТАГ, снижению интенсивности дезамидирования во фракции ЛАГ и к уменьшению активности ЛПО. Введение глюкозы, фруктозы и сорбитола в среду инкубации лактоглобулина позволяет стабилизировать его антиоксидантную активность, а также уровень титров антител, специфических против Salmonella В и Salmonella D. Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

Олемпиева Е.В., Бибов М.Ю., Павлова Т.В. Исследование белкового состава и иммунных свойств препарата лактоглобулина // 54-я Итоговая научная конференция студентов, молодых ученых и специалистов (Ростов-на-Дону, апрель, 2000). Тез. докл. - Ростов-на-Дону: Изд. РГМУ, 2000. - с. 99. (Процент участия - 90%; Объем - 0,005 ал.)

Бибов М.Ю., Павлова Т.В. Сравнение белкового состава и иммунных свойств препарата лактоглобулина // Конференция молодых ученых северного Кавказа по физиологии и валеологии (Ростов-на-Дону, октябрь, 2000) Тез докл. -Ростов-на-Дону: Изд. полигр. комплекс «Биос» РГУ, 2000. - с. 20 - 22. (Процент участия - 75%; Объем - 0,03 ал.)

Летуновский А.В., Бибов М Ю, Павлова Т.В., Сравнение белкового состава и иммунных свойств препаратов лактоглобулина // Ш-я научная сессия Ростовского государственного медицинского университета Тез. докл. - Ростов-

на-Дону: Изд. РГМУ, 2000. - с. 96 - 97. (Процент участия - 75%; Объем - 0,042 ал.)

4. Бибов М Ю., Вачаев Б.Ф./ Синичкин А.А. Исследование биохимических свойств препарата лактоглобулина под воздействием температурного стресса // Вторая межвузовская международная конференция молодых ученых, специалистов и студентов (Ростов-на-Дону, март, 2003). Тез. докл. - Ростов-на-Дону: Изд. РГМУ, 2003. - с. 28 - 29. (Процент участия - 85%; Объем - 0,03 а.л.)

5. Бибов МЮ, Сорокина И А., Синичкин А.А. Изучение степени амидированности белков препаратов иммунных лактосывороток при старении // Научно-практическая конференция «Проблемы общей биологии» (Ростов-на-Дону, октябрь, 2003). Тез докл. - Ростов-на-Дону: Изд. РГПУ, 2003. - с. 9- 10. (Процент участия - 75%; Объем - 0,03 ал.)

6. Бибов М Ю. Синичкин А.А. Исследование спонтанной флуоресценции и активности лактопероксидазы препаратов лактоглобулина // 7-я Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, апрель, 2003). Тез. докл. -Пущино: ГП Серпуховская типография, 2003. - с. 90 - 91. (Процент участия -85%; 0бъем-0,014 ал.)

7. Bibov M.Y., Vachaev B.F., Yagovkin Е.А., Sorokina I.A., Sinichkin A.A., Ryzhkov PA., Zaburdenko M.A. The influence of nonenzymatic deamidation on spontaneous fluorescence and lactoperoxidase activity of lactoglobulin preparates // The Conference of Medical Students (Bialystok, Poland, may, 2003), Book of abstracts. -Bialystok: Bialystok Medical University Press, 2003. - pp. 17 - 18. (Процент участия - 70%; Объем - 0,031 ал.)

8. Бибов М.Ю. Влияние процессов неферментативного дезамидирования на характер спонтанной флуоресценции и активность лактопероксидазы в препаратах лактоглобулина // Труды аспирантов и соискателей ростовского государственного университета - Ростов-на-Дону: Изд. РГУ, 2003. т. 12, с. 104 - 105. (Процскг участия - 100%; Объем - 0,04 а.л.)

9. Бибов МЮ., Вачаев Б.Ф. Исследование лактопероксидазной активности в препаратах лактоглобулина до и после лиофилизации // Третья межвузовская международная конференция молодых ученых, специалистов и студентов (Ростов-на-Дону, март, 2004). Тез. докл. - Ростов-на-Дону: Изд. РГМУ, 2004 -с. 26 - 27. (Процент участия - 75%; Объем - 0,02 ал.)

10 Bibov M.Y., Vachaev B.F., Sorokina I.A., Lukash A.I., Evtushenko O.A., Yagovkin

E.A. Deamidation rate of lactoglobulin preparation ander different pH and

temperature values // Progress in biotechnology and neurobiology - integrative medicine (Egypt, Hurgada, February, 2004). - Book of abstracts., pp. 38 - 40. (Процент участия - 70%; Объем - 0,083 ал.)

11. Бибов М.Ю., Вачаев Б.Ф., Сорокина И.А., Лукаш АИ., Синичкин АА, Яговкин

Э.А. Влияние ненферментативног посттрансляционного дезамидирования на активность белков препарата иммунной лактосыворотки. // Изв. ВУЗ-ов Сев. Кав. регион. Естественные науки. №1,2004, с. 56 - 59. (Процент участия - 75%; 0бъем-0,17 а. л.)

12. Бибов М.Ю., Сорокина И.А., Лукаш А.И. Влияние содержания амидных групп в

белках препарата лактоглобулина на изменение его антиоксидантных свойств // Деп. в ВИНИТИ 30.03.04, № 521-В-2004. (Процент участия - 80%; Объем - 0,54 ал.)

13. Bibov M.Y., Sorokina LA., Lukash A.I. Deamidation and Biological Activity of Lactoglobulin Preparation During its "Model" Ageing // The Biological Mechanisms of Ageing (Kharkov, Ukraine, May, 2004). Book of Abstracts. - Kharkov, 2004, pp. 58. (Процент участия - 80%; Объем - 0,028 ал.)

14. Бибов М.Ю., Вачаев Б.Ф., Сорокина И.А., Лукаш А.И., Синичкин АА, Яговкин

Э.А. Влияние некоторых углеводов и полиолов на активность. лактопероксидазы в* препарате лактоглобулина // 8-ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Май, 2004). Тез. докл. -Пущино: ГП Серпуховская типография, 2004, с. 250. (Процент участия - 65%; Объем - 0,019 ал.)

15. Bibov M.Y., Vachaev B.F., Sorokina LA., Lukash A.I., Yagovkin E.A., Sinichkin A.A., Evtushenko O.A Investigation of Some Biochemical Properties of Non-Lyophilized Lactoglobulin Preparation Obtained by Means of Membrane Filtration During its "Model" Ageing // Progress in Fundamental and Applied Sciences for Human Health (Sudak, Crimae, Ukraine, June, 2004). Book of Abstracts. - Sudak, 2004, pp. 43. (Процент участия - 70%; Объем - 0,042 ал.)

16. Вачаев Б.Ф., Шепелев А.П., Яговкин Э.А., Соболева СВ., Чупрынина Р.П., Бибов М.Ю. Способ получения иммунного лактоглобулина Приоритетная справка № 2004120007 от 02.07.2004.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ЛАГ - легкогидролизуемые амидные группы

2. ЛПО - лактопероксидаза

3. МСМ - молекулы средней массы

4. ПААГ - полакриламвдный гель

5. ПТМ - посттрансляционные модификации

6. РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

7. САГ - суммарные амидные группы

8. ТАГ - трудногидролизуемые амидные группы

9. ТХУ - трихлоруксусная кислота

10. ХЛ - хемилюминесценция

Издательство ООО «ЦВВР». Лицензия JIP J6 65-36 от 0S.08.99 г. Подл, в печать 29.07.04 г. За*. № 512. Тир. 150 экз. Печ. лист. 1,0. Услпечл. 1,0. Типография: Издятепьско-полиграфический комплекс « Биос» РГУ. 344091, г. Ростов-ва-Дону, ул. Зорге, 28/2, кора 5 «В», тел. 929-516,659-532. Лицензия на полиграфическую деятельность № 65-125 от 09.02.98 г.

04" 1 "75

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бибов, Михаил Юрьевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Бактерицидные факторы белковой и пептидной природы молока и молозива.

2.1.1 Иммунные факторы молока и молозива.

2.1.2 Факторы неспецифической противомикробной резистентности молока и молозива.

2.1.2.1 Лактоферрин.

2.1.2.2 Лактопероксидаза.

2.1.2.3 Клеточные и гуморальные факторы, обусловливающие антисептические свойства молока и молозива.

2.2 Роль амидных групп в структурно-функциональных свойствах белков.

2.2.1 Механизмы отщепления амидных групп аспарагина и глутамина в молекулах белков.

2.2.2 Роль процессов дезамидирования в изменении конформационной организации белковых молекул.

2.2.3 Дезамидирование и аспарагинзависимая автофрагментация белковых молекул.

2.2.4 Физиологическое значение процессов неферментативного дезамидирования и автофрагментации.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1 Материалы исследования и постановка эксперимента.

3.2 Методы исследования.

3.2.1 Определение содержания белка в препаратах лактоглобулина.

3.2.2 Изучение специфической и неспецифической биологической активности препаратов лактоглобулина.

3.2.2.1 Определение активности лактопероксидазы в препаратах лактоглобулина.

3.2.2.2 Определение антиоксидантной активности препарата лактоглобулина.

3.2.2.3 Определение титров специфических антител в препарате лактоглобулина.

3.2.3 Исследование интенсивности дезамидирования и деструкции препаратов лактоглобулина.

3.2.3.1 Определение содержания фракций амидных групп в белках препаратов лактоглобулина.

3.2.3.2 Определение уровня молекул средней массы в препаратах лактоглобулина.

3.2.3.3 Исследование собственной флуоресценции белков препарата лактоглобулина.

3.2.3.4 Электрофорез препаратов лактоглобулина.

3.2.4 Статистическая обработка результатов.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1 Изучение специфической и неспецифической биологической активности препаратов лактоглобулина в процессе хранения.

4.1.1 Исследование лактопероксидазной активности препаратов лактоглобулина при хранении.

4.1.2 Изучение антиоксидантных свойств препаратов лактоглобулина при хранении.

4.1.3 Исследование содержания титров специфических антител против сальмонелл в препаратах лактоглобулина при хранении.

4.2 Изучение характера протекания процессов неферментативного дезамидирования, деструкции и конформационных преобразований в белках препарата лактоглобулина при его хранении.

4.2.1 Исследование неферментативного дезамидирования белков препарата лактоглобулина при его хранении.

4.2.2 Исследование процессов деструкции и изменения электрофоретической гетерогенности белков препарата лактоглобулина при его хранении.

4.2.3 Исследование собственной флуоресценции препаратов лактоглобулина на различных этапах их хранения.

4.3 Исследование специфической и неспецифической активности препаратов лактоглобулина на различных этапах их хранения в присутствии углеводов и полиолов.

4.3.1 Исследование активности лактопероксидазы в препарате лактоглобулина на различных этапах его хранения в присутствии 10% глюкозы, фруктозы и сорбитола.

4.3.2 Исследование антиоксидантной активности препаратов лактоглобулина на различных этапах их хранения в присутствии 10% глюкозы, фруктозы и сорбитола.

4.3.3 Исследование специфической активности препаратов лактоглобулина на различных этапах их хранения в присутствии 10% глюкозы, фруктозы и сорбитола.

4.4 Изучение характера протекания процессов неферментативного дезамидирования, деструкции и конформационных преобразований в белках препарата лактоглобулина при его хранении в присутствии углеводов.

4.4.1 Динамика дезамидирования, конформационных перестроек и деструкции белков препарата лактоглобулина при хранении в присутствии 10% глюкозы.

4.4.2 Динамика дезамидирования, конформационных перестроек и деструкции белков препарата лактоглобулина при хранении в присутствии 10% фруктозы.

4.4.3 Динамика дезамидирования, конформационных перестроек и деструкции белков препарата лактоглобулина при хранении в присутствии 10% сорбитола.

5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6 ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние неферментативного дезамидирования на некоторые биохимические и физико-химические свойства препарата лактоглобулина"

Актуальность проблемы. Одной из основных причин возникновения острых кишечных заболеваний у детей раннего возраста служат условнопатогенные микроорганизмы, что обусловлено физиологической незрелостью и относительно низкой степенью развития систем неспецифической иммунной защиты организма (Тур А.Ф., 1967). В исследованиях последних лет показана возможность использования препаратов лактоглобулинов и лактосывороток из молока и молозива коров для защиты от инфекции и формирования нормального микробиоценоза в кишечнике новорожденных (Соболева С.В. и соавт., 1991). Препараты лактоглобулинов представляют собой комплексные белковые системы, содержащие как факторы иммуноспецифической защиты (IgA, IgG, IgM), так и факторы неспецифической противомикробной резистентности, центральное место среди которых занимает лактопероксидазная система (ЛПО). Однако многие из перечисленных белковых компонентов, обусловливающих протекторные свойства лактоглобулина, весьма уязвимы к действию внешних факторов и легко теряют свою активность в ходе получения препарата (Пушкина Н.В. и соавт., 1986). Получение нелиофилизированной формы препарата лактоглобулина представляет непосредственный интерес в плане сохранения в нем активности систем неспецифической противомикробной резистентности. Применение технологии мембранной фильтрации позволяет избежать использования спирта для фракционирования белков при получении лактоглобулина, а, следовательно, и лиофилизации, являющейся мощным повреждающим фактором для белков лактосыворотки. Исследование биохимических свойств, специфической и неспецифической активности, а также стабильности нелиофилизированных препаратов лактоглобулина, полученных таким способом, необходимо для оптимизации технологического процесса их получения, что и определило направление наших исследований.

Одной из основных причин нестабильности и снижения биологической активности белковых препаратов в ходе их получения и последующего хранения являются спонтанные ковалентные посттрансляционные модификации (ПТМ), принимающие непосредственной участие в процессах старения белковых молекул. Центральное место среди таких ПТМ занимает реакция неферментативного посттрансляционного дезамидирования остатков аспарагина (Асн) и глутамина (Глн) (Wright Н.Т., 1991; Reissner K.J., 2003). Предполагают, что встроенные в полипептидную цепь остатки Асн и Глн действуют как «молекулярные часы», определяющие продолжительность функционирования белковой молекулы (Robinson А.В., 2001). Процессы неферментативного дезамидирования и связанная с ним аспарагинзависимая автофрагментация задействованы в процессах старения и деградации белковых молекул (Олехнович Л.П. и соавт., 1985; Blotgrett J.K., 1985; Voorter С.Е.М., 1988; Wright Н.Т., 1991). Изменение степени амидированности влечет за собой определенные локальные нарушения структурных и физико-химических характеристик белков, и является причиной возникновения новых модифицированных белков с «дефектными» биологическими функциями (Robinson N.E., 2002). Следствием этих изменений является снижение специфической и неспецифической биологической активности белковых молекул.

Мы полагали, что спонтанное дезамидирование в водных растворах препарата лактоглобулина, полученного с помощью мембранных технологий, может быть важнейшей причиной их «старения» при хранении. Это, а также попытки модифицировать скорость этих процессов определили цель и задачи исследования

Задачи исследования.

1. Изучение лактопероксидазной активности, антиоксидантных свойств, а также титров антител, специфических против Salmonella В и Salmonella D, препаратов лактоглобулина в процессе его хранения при различных значениях температуры (4°±1°С и 35°±1°С) и рН (7,0 и 5,5).

3. Изучение интенсивности деструкции белков препарата лактоглобулина в процессе его хранения при различных значениях температуры (4°±1°С и 35°±1°С) и рН (7,0 и 5,5).

4. Изучение структурно-конформационных преобразований в белках препарата лактоглобулина методом регистрации их собственной флуоресценции в процессе его хранения при различных значениях температуры (4°±1°С и 35°±1°С) и рН (7,0 и 5,5).

5. Исследование влияния глюкозы, фруктозы и сорбитола на ЛПО активность, антиоксидантные свойства, титры антител, специфические против Salmonella В и Salmonella D, а также показатели неферментативного дезамидирования, деструкции и структурно-конформационных преобразований белков препарата лактоглобулина в ходе его хранения при 4°±1°С и 35°=Ы°С.

Научная новизна результатов. В работе впервые установлено состояние систем специфической и неспецифической противомикробной защиты в нелиофилизированных препаратах лактоглобулина направленного действия против сальмонелл, полученных с применением мембранных технологий. Выявлено влияние температуры и рН инкубационной среды на активность ЛПО, антиоксидантные свойства и уровень титров антител специфических против Salmonella В и Salmonella D в препаратах лактоглобулина при их хранении. Впервые установлены тесные корреляционные связи и роль процессов неферментативного дезамидирования, деструкции и структурно-конформационных изменений в инактивации препаратов лактоглобулина при их хранении. Показано снижение интенсивности дезамидирования и деструкции белков препарата лактоглобулина при инкубации в слабокислой среде по сравнению с нейтральной. Установлено влияние глюкозы, фруктозы и сорбитола, на скорость процессов дезамидирования и деструкции, а также изменения биологической активности белков препарата лактоглобулина в ходе их «модельного» старения при хранении. Впервые установлено ускорение дезамидирования трудногидролизуемых амидных групп (ТАГ) перечисленными углеводами. Основные положения выносимые на защиту:

1. В ходе хранения при 4°±1°С и 35°±1°С в препарате лактоглобулина происходит снижение его биологической активности вследствие дезамидирования, фрагментации и конформационных изменений молекул белков, входящих в его состав.

2. Скорость дезамидирования, деструкции и снижения специфической и неспецифической биологической активности в ходе инкубации при 4°±1°С и 35°±1°С в течение 28 суток ниже для препаратов, инкубировавшихся при рН 5,5 по сравнению с нейтральной средой.

Практическую ценность представляют данные о снижении интенсивности дезамидирования и деструкции белков препарата лактоглобулина при инкубации в слабокислой среде (5,5) по сравнению с нейтральной (7,0). Особое значение имеют данные о более продолжительном функционировании ЛПО, а также систем, отвечающих за антиокислительные свойства препарата лактоглобулина в условиях его хранении при слабокислых значениях рН.

Представляются существенными с практической точки зрения данные о влиянии глюкозы, фруктозы и сорбитола на биологические свойства и показатели нативности белков препарата лактоглобулина, что может оказаться полезным при выборе пищевых добавок и консервантов в практике производства иммунобиологических препаратов на основе молока и молозива с целью сохранения в них тех или иных видов биологической активности, а также обеспечения вкусовых качеств данных препаратов, предназначенных в основной для перорального применения пациентами раннего детского возраста.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бибов, Михаил Юрьевич

6. ВЫВОДЫ

В процессе инкубации нелиофилизиро ванных препаратов лактоглобулина при 4°±1°С и 35°±1°С происходит спонтанное дезамидирование и деструкция белковых молекул, что сопровождается их структурно-конформационными перестройками.

Процессы дезамидирования и деструкции белков обусловливают снижение активности ЛПО, антиоксидантного действия, а также титров антител, специфических против Salmonella В и Salmonella D, препаратов лактоглобулина при их инкубации. Наиболее тесная корреляция с коэффициентами 0,73 — 0,99 выявлена между показателями амидированности (САГ, ЛАГ, ТАГ) и уровнями МСМ, флуоресценции и активности ЛПО при инкубации лактоглобулина при рН 7,0, а также между показателями амидированности и уровнем ЛПО, МСМ и флуоресценции при инкубации лактоглобулина при рН 5,5 и температуре 35°±1°С.

Инкубация белков препарата лактоглобулина в слабокислой среде (рН 5,5) по сравнению с нейтральной (рН 7,0) позволяет значительно снизить интенсивность их дезамидирования и деструкции, а также увеличить продолжительность сохранения в нем лактопероксидазной и антиоксидантной активностей. Введение глюкозы, фруктозы и сорбитола в концентрации 10 % в среду инкубации лактоглобулина понижало интенсивность деструкции белковых молекул в условиях низкотемпературной инкубации, а также приводило к усилению интенсивности дезамидирования входящих в его состав белков преимущественно за счет фракции ТАГ, снижению интенсивности дезамидирования во фракции ЛАГ и к уменьшению активности ЛПО.

Введение глюкозы, фруктозы и сорбитола в среду инкубации лактоглобулина позволяет стабилизировать его антиоксидантную активность, а также уровень титров антител, специфических против Salmonella В и Salmonella D.

152

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бибов, Михаил Юрьевич, Ростов-на-Дону

1. Аграненко В.А. Консервирование крови. - В кн.: Справочник по переливанию крови и кровезаменителей / Под ред. Гаврилова O.K. М.: Медицина, 1982, с. 42.

2. Адигамов Л.Ф. Новые данные о биологически активных факторах молока, их свойствах и специфичности // Вопр. пит. — 1986. № 4. С. 3 - 7.

3. Алексеева Н.Ю., Аристова В.П., Патратий А.П. и др. Состав и свойства молока как сырья для молочной промышленности / Под ред. Костина Я.И. М.: Агопромиздат, 1986, с. 139.

4. Альперович Д.В. Взаимосвязь дезамидирования, деструкции и иммунологической активности препаратов иммуноглобулинов: Дис. . канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1986. с. 10-31.

5. Альперович Д.В., Кесельман Э.В. Новый способ определения активности лактопероксидазы: Тез. докл. Всесоюз. конф. «Методы получения, анализа и применения ферментов». Юрмала Рига, 1990, с. 114.

6. Белизи С., Назарова И.Н., Прокофьев В. Н., Сорокина И.А., Пушкина Н.В., Лукаш А.И. Изменение антиоксидантных свойств лактоферрина из женского молока в при дезамидировании // Биохимия. 2001. т. 66, № 5. - С. 576 - 580.

7. Бобров В.М., Шишкин Ш.А. Молекулы средней массы -показатель интоксикации при гнойно-воспалительных заболеваниях ЛОР-органов // Вестник оториноларингологии. 1999. № 1. - С. 33-34.

8. Вельтищев Ю.Е., Харькова Р.М. Биологически активные факторы грудного молока / /Вопр. охраны материнства и детства. 1991. №6. -С. 48-53.

9. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах.

10. Биофизика (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., 1991. -т. 29.-с. 252.

11. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., Азимбаев Т.К., Оценка антиоксидантной и антирадикальной активностей веществ и биологических объектов с помощью железо-индуцированной хемилюминесценции // Биофизика. 1992. т. 37. вып. 6. - С. 1041 -1047.

12. Волков А.В. Получение противошигеллезного лактоглобулина, оценка его антибактериальной и антитоксической активности.: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 2000. с. 21.

13. Гершенович З.С., Кричевская А.А. Амидные и карбоксильные группы белков мозга при кислородной интоксикации // Биохимия. -1960. т. 25, вып. 2, С. 310 - 317.

14. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. М.: Птцев. промышленность. 1980. - с. 272.

15. Грачев И.И., Попов С.М., Скопичев В.Г. Цитофизиология секреции молока. Л.: Наука. 1976. с. 199.

16. Денисова И.И. Оценка активности, количественного содержания и антимикробного действия неспецифического фактора иммунитета -лактопероксидазы: Автореф. дис. канд. биол. наук. Л., 1989. с. 18.

17. Есипова Н.Г., Туманян В.Г. О факторах, определяющих формирование третичной структуры глобулы белка // Молекулярная биология. 1972. т.6, - С. 840 - 850.

18. Ииргенсонс Б. Природные органические макромолекулы. — М.: Мир, 1965, с. 254.

19. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь, 2002. с. 346 - 347.

20. Канышкова Т.Г., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Биологические функции молока человека и его компонентов // Усп. совр. биол., 2002, т. 122, №3,-С. 259-271.

21. Кесельман Э.В. Свободнорадикальный механизм взаимодействия ксантиноксидазы и лактопероксидазы в антимикробной системе молока: Дисс.канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1993 — с. 13 19.

22. Кит ЮЛ., Семёнов Д.В., Невинский Г.А (1995) Мол. Биол. т. 29, № 1 - С. 893 — 905.

23. Кокряков В.Н., Алешина Г.М., Слепенков С.В., Яковлева М.Ф., Пигаревский В.Е. О степени структурной гомологии лактоферринов молока и нейтрофильных гранулоцитов // Биохимия. 1988, т. 53, № И.-С. 1837.

24. Кретович В Л. Биохимия растений. М.: Высшая школа, 1980. -с. 445.

25. Кричевская А.А., Лукаш А.И., Пушкина Н.В. Биохимические основы старения белков. Тез. докл. IV-й Всесоюз. съезд геронтологов и гериатров, Кишинев. Киев, 1982, с. 200.

26. Кричевская А.А., Лукаш А.И., Пушкина Н.В., Шерстнев К.Б., Менджерицкий A.M., Вовченко И.Б. Вопросы биохимии мозга 1979. №13.-С. 127.

27. Кричевская А.А., Лукаш А.И., Пушкина Н.В., Шепотиновская И.В., Шерстнев К.Б. Постгрансляционное дезамидирование белков хрусталика глаза при старении животного // Биологические наук. -1984. №7.-С. 23-28.

28. Кричевская А.А., Лукаш А.И., Пушкина Н.В., Херувимова В.А. Амидированность белков мозга позвоночных и возможные причины разной прочности амидной связи // Журн. эволюц. биохимии и физиологии 1973, т. 9, № 2 - С. 206 - 208.

29. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1973. - с. 170.

30. Липкинд Г.М., Попов Е.М. // Молекуляр. Биология 1971, т.5, N5.-С. 667.

31. Лукаш А.И. Пушкина Н.В., Цыбульский И. Е. Аутоантигенные свойства дезам идированного сывороточного альбумина // Иммунология. 1974. № 11. - С. 513.

32. Лукаш А.И., Пушкина Н.В., Климова И.А., Назарова И.Н. Роль посттрансляционных модификаций белков в регуляции скорости старения клеток дрожжей Saccaromyces paradoxus // Биополимеры и клетка. 1994. т. 10, №1 - С. 53 - 57.

33. Минеева Л.Д. Иммунологическая характеристика и устойчивость к протеолитическим ферментам препарата колипротейного лактоглобулина: Дис. канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1980. — с. 5 — 8.

34. Олехнович Л.П., Пушкина Н.В., Жданов А.Ю., Лукаш А.И., Кричевская Л.А., Ал ахов Ю.Б. Аспарагинзависимая селективнаяавтофрагментация белка на примере рибонуклеазы // Доклады АН СССР. 1985, т. 281, № 1. - С. 217 - 220.

35. Отт В.Д., Маруппсо Т.Л. Иммунобиологическая роль женского молозива и молока // Педиатрия. 1985, № 10. - С.72 - 75.

36. Пол У., Сильверстайн А., Купер М., и др. Иммунология: В 3-х т. Т. 1. Монография / Под. ред. У. Пола. М.: Мир, 1987. 476 с.

37. Пушкина Н.В. Амидированность белков при старении организма // Укр. биохим. журн. 1979, т.51, №6. - С.280.

38. Пушкина Н.В. Неферментативное дезамидирование и автофрагментация лизоцима и альбумина в условиях, моделирующих физиологические // Укр. биохим. журн. 1988, т.60, №4. - С.9 - 14.

39. Пушкина Н.В., Климова И.А., Назарова И.Н., Москвичев Д.В., Лукаш А.И. Изменение степени амидированности белков семян гороха на этапе их набухания и прорастания // Онтогенез 1999, т. 30, № 4. -С. 267-273.

40. Пушкина Н.В., Лукаш А.И. Легко- и трудногидролизуемые амидные группы в белках // Изв. Северо-Кавказ. науч. Центра высшей школы. Естеств. Науки. 1976, № 2. - С.95 - 97.

41. Пушкина Н.В., Цыбульский И.Е, Лукаш А.И. Влияние некоторых химических соединений и условий хранения на скорость неферментативного дезамидирования белковых препаратов // Прикладная биохимия и микробиология 1986, т. 22, вып. 2. - С. 198 -203.

42. Пушкина Н.В., Цыбульский И.Е, Лукаш А.И. Амидированность белков крови в условиях гипергликемии при экспериментальном сахарном диабете // Вопр. мед. химии., 1987, № 4, С. 52 55.

43. Сагакянц А.Б. Динамика цистеина, цистина и белка в зоне сывороточного альбумина крыс при антиканцерогенном воздействии переменным магнитным полем: Тез. докл. молодых ученых Северного Кавказа по физиологии и валеологии. Ростов-на-Дону, 2000 - с. 90.

44. Сагакянц А.Б. Свободные радикалы и стуктурно-функциональное состоляние молекул сывороточного альбумина: Труды аспирантов и соискателей Ростовского Государственного Университета. Отв. ред. А.Т. Ушак. Ростов-н/Д.: Изд. Рост, ун-та,2003-т. 9-с. 86.

45. Семёнов Д.В., Канышкова Т.Г., Акимжанов А.М., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Взаимодействие лакгоферрина молока человека с АТР // Биохимия. 1998. т. 63, вып. 8. - С. 1107 - 1115.

46. Семёнов Д.В., Канышкова Т.Г., Кит Ю.Я., Хлиманков Д.Ю., Акимжанов А.М., Горбунов Д.А., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса G молока человека гидролизуют нуклеотиды• // Биохимия. 1998. т. 63., вып. 8. - С. 1097 - 1106.

47. Синичкин А.А. Сывороточный альбумин как биополиантиоксидант: Тез. докл. конф. «Биоантиоксидант» Тюмень, 2000-с. 18.

48. Соболева С.В. Лактоглобулины направленного действия (микробиологические аспекты разработки и клинического применения препаратов: Автореф. дис. . доктора мед. наук. Ростов-на-Дону, 1991.-с. 38.

49. Соболева С.В., Златник Е.Ю., Шаманова Г.П., Никонова Н.К., Детские молочные продукты обогащенные иммуноглобулинами. — М.: Агро НИИТЭИММП, 1991.-с. 20.

50. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. — М.: Высшая школа, 1996, с. 253 254.

51. Троицкий Г.В. Постсинтетическая модификация белков // Укр. Биохим. Журн. 1985. т.57, №3. - С.81 - 98.

52. Тур А.Ф. Физиология и патология новорожденных детей. — Л.: Медицина, 1967. с. 71 - 72.

53. Уманская Н.Я. Влияние дезамидирования и гликирования на активность некоторых белков с антиоксидантными свойствами: Дис. . канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1995. с. 106.

54. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. М.: Мир, 1980. - 421 -с. 423.

55. Хаггис Д., Михи Д., Мюир А., Роберте К., Уонер Б. Введение в молекулярную биологию М.: Мир, 1967. - с. 158.

56. Цыбульский И.Е. Изменение свойств и функций некоторых белков при дезамидировании: Дис. . канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1985.-е. 192.

57. Шепотиновская И.В. Дезамидирование белков в процессе старения: Дисс. . канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1982.-е. 207.

58. Шепотиновская И.В., Цыбульский И.Е., Пушкина Н.В. Влияние денатурации на скорость неферментативного дезамидирования сывороточного альбумина. // Деп. ВИНИТИ № 7640 83 от 03.12.83.

59. Ahern T.J., Klibanov A.M., The mechanism of irreversible enzyme interaction at 100°C // Science. 1985. - Vol. 228. - P. 1280.

60. Antila P., Paakkarl I., Jarvinen A., Mattila M.J., Laukkanen M., Pihlanto-Leppala A., Mantsala P., Hellman J. Opioid peptides derived fromm in vitro proteolysis of bovine whey proteins // Int. Dairy J. 1991 - Vol. 1. 1. P. 215-229.

61. Blotgrett J.K., Loudon G.M., and Collins K.D. Specific cleavage of peptides containing an aspartic acid (0-Hydroxamic acid) residue // J. Amer. Chem Soc. 1985. - Vol. 107. - P. 4305.

62. Bond J.S., Barrett A.J. Degradation of fructose-1,6 bisphosphaldolase by cathepsin-B, a further example of peptidyldipeptidase activity of this proteinase // Biochem. J. 1980. - Vol. 17. - P. 189.

63. Bos C., Gaudichon C., Tome D. Nutritional and Physiological Criteria in the Assessment Of Milk Protein Quality for Humans // Journal of the American College of Nutrition. 2000. - Vol. 19, № 90002. - P. 191 - 205.

64. Brambell F.W. The transmission of passive immunity from mother to young / Eds., Neuberger A., Tatum E.L. North Holland /. Amsterdam and London. 1970,432 p.

65. Brock J.H., Pifieiro A., Lampreave F. The effect of trypsin and chymotrypsin on the antibacterial activity of complement, antibodies, lactofeirin and transferrin in bovine colostrums //Ann. Rech.Vet. 1978. -Vol. 9, №2. - P. 287-294.

66. Caillard I., Tome D. Different routes for the transport of a-lactalbumin in rabbit ileum // J. Nutr. Biochem. 1992. - Vol. 3. - P. 653658.

67. Caillard I., Tome D. Modulation of B-lactoglobulin transport in rabbit ileum //Am. J. Physiol. 1994. - Vol. 266. - P. 1053-1059.

68. Carlsson В., Hanson L. Immunologic Effects of Breast-Feeding on the • Infant. In Handbook of Mucosal Immunology / Eds., Ogra P.L., Lamm M.E.,

69. McGree J.R., Mestecky J., Strober W., Bienestock J. / San-Diego: Academic Press, 1994, 653 p.

70. Carlstorm A.B. Physical and compositional investigations of the subfractions of lactoperoxidase // Acta Chem. Scand. 1969. - Vol. 23. - P. 185-202.

71. Chabance B, Marteau P, Rambaud JC, Migliore-Samour D, Boynard M, Perrotin P, Guillet R, Jolles P, Fiat AM: Casein peptide release and passage to the blood in humans during digestion of milk and yogurt // Biochimie. 1998. Vol. 80. - P. 155-165.

72. Chang K.J., Killian A, Hazum E, Cuatrecas P: Morphiceptin (NH4-Tyr-Pro-Phe-Pro-CONH2): a potent specific agonist for morphine (p) receptor // Science. 1991. - Vol. 212. - P. 75-77.

73. Chothia C. Principles that determine the structure of proteins // Ann. Rev. Biochem. 1984. - Vol. 53. - P. 562.

74. Dice J.F., Goldberg A.L. Analysis of relationship between degradative rates and molecular weights of proteins // Arch. Biochem. Biophys. 1975. -Vol. 170.-P. 213.

75. Dice J.F., Goldberg A.L. Relationship between in vivo degradative rates and isoelectric points of proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1975.-Vol. 72.-P. 3893.

76. Dreyfus J.C., Kahn A., Schapira F., Molecular mechanisms of alterations of some enzymes in aging // Adelman R.C., and Roth G.S. Altered Proteins and Aging. Eds., CRC Press. Boca Raton. FL, 1983, P. 113.

77. Englund J., Glezen W.P., Piedra P.A. // Vaccine. 1988. - Vol. 16. -P. 1456.

78. Fey H.R., Burtler R., Marti F. // Vox Sang. 1973. - Vol. 25. - P. 245.

79. Flatmark, Т., Sletten, K. // J. Biol. Chem. 1968. Vol. 243. - P. 1623 - 1629.

80. Freimuth U., Krause W. Zur Alkalibehandlung von Protein. 6 Mitt. Desamidienmg und hydrolitische spaltung. Nahrung, 1981, Bd. 25, H.4, S.397 - 404.

81. Gafhi A., Noy N. Age related affects in enzyme catalysts // Mol. Cell. Biochem. 1984. - Vol. 59. - P. 113.

82. Ganjan LS, Thornton WH, Marshall RT, Mc Donald RS: Antiproliferative effects of yogurt fractions obtained by membrane dialysis on cultured mammalian intestinal cells // J. Daily Sci. 1997. - Vol 80. - P. 2325 -2329.

83. Gardner MLG: Gastrointestinal absorption of intact proteins // Ann. Rev. Nutr. 1988. - Vol. 8. - P. 329 - 350.

84. Geiger, Т., Clarice, S. Deamidation, Isomerisation, and Racemization at asparaginyl Aspartyl Residues in Peptides //J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262.-P. 785-794.

85. Goldman E.M., Goldblum R.M. Human milk: immunologic-nutritional relationships //Ann. NY Acad. Sci. 1990. - Vol.587. - P.236 - 245.

86. Gonnella P., Harmatz P., Walker W.A. Prolactin is transported across theepithelium of the jejunum and ileum of the sukling rat // J. Cell Physiol -1989 Vol. 140.-P. 138-149.

87. Gregory R.L., Filler S.J. // Infect. Immun., 1987 - Vol. 55. - P. 2409.

88. Hansen M., Sandstrom В., Lonnerdal B. The effect of casein phosphopeptides on zinc and calcium absorption from phytate infants diets assessed in rats pups and Caco-2 cells // Pediatr. Res. 1996. - Vol. 40. - P. 547-552.

89. Hanson L.A. // Annal. Allerg. Asth. Immunol., 1998. - Vol. 81. - P. 523.

90. Hicks C.L. Korycka Dahl M., Richardson T. Superoxide dismutase in bovine milk // J. Diary Sci. - 1975 - Vol. 58. - P. 796.

91. Hill R.D. Superoxide dismutase activity in bovine milk // Aostralian J. of Diary Tech., 1975 - N 30 - P. 26.

92. Hirachberg C.B., Snider M.D., Topography of glycosylation in the rough endoplasmic reticulum and Golgi apparatus // Ann. Rev. Biochem., -1987.-Vol. 56.-P. 63.

93. Jencks W.P., Catalysis in Chemistry and Enzymology. New York, McGrow-Hill, 1969 - p. 523.

94. Kamau D.N., Doores S., Pruitt K.M. Enhanced thermal destruction of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus by the lactoperoxidase system // Applied and Environmental Microbiology 1990. - Vol. 56. - N 9.-P. 2711-2716.

95. Kanyshkova, T.G., Semenov, D.V., Khlimankov D.Yu., Buneva V.N., and Nevinsky, G.A. // FEBS Lett., 1997. - Vol. 416. - P. 23 - 27.

96. Kay M.M.B., Goodman S.R., Sorensen K., Whitfild C.F., Nong P., Zaki L., Rudloff V. Senescent cell antigen is immunobiologically related to 3 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - Vol. 80. - P. 1631,1983.

97. Kim L. H., Robert S. Y. Improved recovery of insulin-like growth factors (IGFs) from bovine colostrums using alkaline diafiltration // Biotechnol. and Appl. Biochem., 2002. - Vol. 32. - P.l61 - 166.

98. Kit, Y.Y., Kim, A.A., and Sidorov, V.N. // Biomed. Sci., 1991. -Vol. 2.-P. 201 -205.

99. Kit, Y.Y., Semenov, D.V., and Nevinsky, G.A. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. - Vol. 39. - P. 521 - 527.

100. Korhonen H. A new method for preserving raw milk: lactoperoxidase antibacterial system // Animal World. 1980. - Vol. 35. - P. 24 - 29.

101. Kossiakoff A.A., Tertiary structure is a principal determinant to protein deamidation // Science 1988. - Vol. 240. P. 191.

102. Kramps J. A., de Jong W.W., Wollensak J., Hoenders H.J. The polypeptide chain of a-crystallin from old human eye lenses // Biochim. Biophys. Acta. 1978. - Vol. 533. - P. 487.

103. Laemmli U.K. // Nature. 1970. - Vol. 227. - N 5259. - P. 680-685.

104. Langbakk В., Flatmark Т. Lactoperoxidase from human colostrums // Biochem. J., -1989. Vol. 259. - N 3. - P. 627 - 631. * 119. Larson B.L., Heary H.L.Jr.,Devery J.E. // J. Dairy Sci. - 1980. - Vol.63.-p. 665.

105. Lowiy O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. // J. Biol. Chem., 1951. -Vol. 193.-P. 265.

106. Mahe S., Benamouzig R., Gaudichon C., Huneau J.F., De Cruz I., Tome D. Nitrogen movements in the upper jejunum lumen in humans fed low amounts of caseins or в-lactoglobulin // Gastroenterol. Clin. Biol. -1995.-Vol. 19.-P. 20-26.

107. Mahe S., Marteau Ph., Huneau J.F., Thuillier F., Tome D. Intestinal nitrogen and electrolyte movement following fermented milk ingestion in humans // Br. J. Nutr. 1994. - Vol. 71. - P. 169-180.

108. Mahe S., Messing В., Thuillier F., Tome D. Digestion of bovine milk t proteins in patients with a high jejunostomy // Am. J. Clin. Nutr. 1991.1. Vol. 54.-P. 534-538.

109. Man E.H., Sandhouse M.E., Burg J., Fisher J.H. Accumulation of D-aspartic acid with aging in human brain // Science. 1983. - Vol. 220. - N 4604.-P. 1407-1408.

110. M&nsson-Rahametulla В., Rahametulla F., Baldone D., Pruitt K.M., Hjerpe A. Purification and characterization of human salivary peroxidase //•> Biochemistry. 1988. - Vol. 27. - P. 233 - 239.

111. Marcon-Genty D., Tome D., Kheroua O., Dumontier A.M. Heyman M., Desjeux J.F. Transport of B-lactoglobulin across rabbit ileum in vitro // Am. J. Physiol. 1989. - Vol. 256. - P. 943 - 948.

112. Matar С., Amiot J., Savoie L., Goulet J. The effect of milk fermentation by Lactobacillus helveticus on the release of peptides during inm vitro digestion // J. Dairy Sci. 1996. - Vol. 79. - P. 971-979.

113. Matar C., Goulet J. B-casomorphins 4 from milk fermented by a mutant of Lactobacillus helveticus // Int. Dairy J. 1996. - Vol. 6. - P. 383397.

114. Matar C., Nadathur S.S., Bakalinski Т., Goulet J. Antimutagenic effects of milk fermented by lactobacillus helveticus L89 and a protease-deficient derivative // J. Dairy Sci. 1997. - Vol. 80. - P. 1965-1970.

115. Mazanec M.B., Nedrud J.G., Kaetzel C.S., Lamm M.E. // Immunol. Today. 1993. - Vol. 14. - P. 430.

116. Mc Clelland D.B.L. Antibodies in milk // J. Reprod. and Fert. 1982. - Vol. 65. - N 2. - P. 537 - 543.

117. McFaul S.J., Stuyt E.L., Evarse J. Observations on the catalyticactivity of lactoperoxidase using a nontinuous assay // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1985. - Vol. 179. - N 3. - P. 331 - 337.

118. McKerrow, J. H., Robinson, A. B. Deamidation of asparaginyl residues as a hazard in experimental protein and peptide procedures // Anal. Biochem. 1971. - Vol. 42. - N 2. - P. 565 - 568.

119. Meisel H. Biochemical properties of regulatory peptides derived from milk proteins // Biopoly. 1997. - Vol. 43. - P. 119-128.

120. Meisel H. Chemical characterization and opioid activity of an exorphin isolated from in vivo digest of casein // FEBS Lett. 1986. — Vol. 196.-P. 223-227.

121. Mestecky J., McGhee J.R. // Adv. Immunol. 1987. - Vol. 40. - P. 153.• 138. Mestecky J., Russel M.W. // Vet. Quarterly. 1998. - Vol. 20. - P.83.

122. Midlefort С., Mehler A.H. Deamidation in vivo of an asparagines residue of rabbit muscle aldolase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972.1. Vol. 69.-P. 1816.

123. Midlefort C., Mehler A.H.Chymotrypsin catalyzed modification of rabbit muscle aldolase // J. Biol. Chem. 1972. - Vol. 247. - P. 3618.

124. Miranda R., Saravia N.G., Ackerman R., Murphy N., Berman S., McMurray D.N. // Am. J. Clin. Nutr. 1983. - Vol. 37. - P. 632.

125. Momany F.A., Aguanno J.J., Larabee A.R. Correlation of degradative rates of proteins with a parameter calculated from amino acid composition and subunit size // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - Vol. 73. - P. 3093.

126. Nakai N., Wada K., Kolashi K., Hase J., Limited proteolysis of rabbit muscle aldolase by cathepsin-Bl // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1978. -Vol. 83.-P. 881.

127. Nakamura Y., Yamamoto N., Sakai К., Takano T. Antihypertensiveeffect of sour milk and peptides isolated from it that are inhibitors to angiotensin I converting enzyme // J. Dairy Sci. 1995. - Vol. 78. - P. 1253-1257.

128. Nichol A.W., Angel L.A., Moon Т., Clezy P.S. Lactoperoxidase haem, an iron-porphyrin thiol // Biochem. J. 1987. - Vol. 247. - N 1. - P. 147-150.

129. Odajima T. Oxidative destruction of the microbial aflatoxin by the myeloperoxidase-chloride system // Arch. Oral. Biol. 1981. - Vol. 26. - P. 339-340.

130. Ogra P.L., Dayton D.H. (Eds.) //Immunology of Breast Milk, New York, Raven Press, 1979. p. 284.

131. Peres JM, Bouhallab S, Bureau F, Maubois JL, Arhan P, Bougie D: Absorption digestive du fer lie au caeinophosphopeptide 1-25 de la 6-caseine // Le Lait. 1997. - Vol. 77. P. 433-440.

132. Pruitt K.M., Kamau D.N. The lactoperoxidase system of bovine and human milk. In Oxidative enzymes in foods / Ed. by Robinson D.S. and

133. Eskin N.A.M. // Elsevier Science Publishers LTD. 1991. - N 4. - P. 133 -174.

134. Pruitt K.M., Tenovuo J.O. The lactoperoxidase system: chemistry and biological significance. In Immunology Series, New York and Basel: Marsel Dekker Inc. -1985. Vol. 27. - P. 123 - 141.

135. Reissner KJ., Aswad D.W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals? // Cellular and Molecular Life Sciences. 2003. - Vol. 60. - P. 1281 - 1295.

136. Reiter B. Review of nonspecific antimicrobial factors in colostrums // Ann. Rech. Vet. 1978. - Vol. 9. - N 2. - P. 205 - 224.

137. Robinson A.B. Evolution and the distribution of glutaminyl and asparaginyl residues in proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. — Vol. 71.-N3.-P. 885-888.

138. Robinson A.B. Molecular clocks, molecular profiles and optimum diets: three approaches to the problem of aging // Mech. Ageing. Dev. -1979.-Vol. 9.-P. 225.

139. Robinson A.B. Molecular Clocks. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001, V. 98, N3, p.944 949.

140. Robinson A.B., McKerrow J.H., Caiy P. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1970. - Vol. 66. - N3. - P.753.

141. Robinson A.B., McKerrow J.H., Legaz M., Sequence dependant deamidation rates for model peptides of cytochrome с // Int. J. Pept. Protein Res.-1974.-Vol. 6.-P. 31.

142. Robinson N. E., Robinson A. B. Deamidation of human proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2001. Vol 98. -P. 12409-12413.

143. Robinson, А. В., Robinson, L. R. Distribution of glutamine and asparagine residues and their near neighbors in peptides and proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88. - P. 8880-8884.

144. Robinson, N. E. Protein Deamidation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2002. Vol. 99. - P. 5283-5288.

145. Rogers S.W., Rechsteiner M., Degradation of structurally characterized proteins injected into Hela cells. Tests of hypothesis // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263. P. 19850.

146. Roos N., Mahe S., Benamouzig R., Sick H., Rautureau J., Tome D. 15N.-labeled immunoglobulins from bovine colostrum are partially resistant to digestion in human intestine // J. Nutr. 1995. - Vol. 125. P. 1238-1244.

147. Rothstein M. Changes in enzymatic proteins during aging, In Molecular basis of Aging, Roy A.K. and Chateijee В., Eds., Academic Press, New York, 1984. p. 209.

148. Rothstein M. Detection of altered proteins, In Altered Proteins and Aging, Adelman R.C., and Roth G.S. Eds., CRC Press. Boca Raton. FL, 1983.- p. 1.

149. Rothstein M. Molecular Biology of Aging. Wood-head, A.D., Biakett A.D., and Hoelaender A. Eds., Plenum Press, New York, 1984. p. 193.

150. Sanchez L., Calvo M., Brock J.H. Biological role of lactoferrin // Arch. Dis. Childhood. 1992. - Vol. 67. - P. 657-661.

151. Scanff P., Yvon M., Thirouin S., Pelissier J.P. Characterization and kinetics of gastric emptying of peptides derived from milk proteins in the preruminant calf// J. Dairy Res. 1992. - Vol. 59. - P. 437-447.

152. Sievers G. Structure of milk lactoperoxidase. A study using circular dichroism and difference absorption spectroscopy // BBA. 1980. - Vol. 624.-Nl.-P. 249-259.

153. Sievers G. Structure of milk lactoperoxidase. Evidence for a single peptide chain // FEBS Letters. 1981. - Vol. 127. - N 2. - P. 253 - 256.

154. Stadtman E.R. Protein modification in aging // J. Gerontol. 1988. -Vol. 43.-P. 112.

155. Stephenson R.C., Clarke S. Succinimide Formation from Aspartyl and Asparaginyl Peptides as a Model for the Spontaneous Degradation of Proteins // Journ. of Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. - N 11. - P. 6164 -6170.

156. Sugawara K., Oyama F. J. // Biochem. 1981. - Vol. 5. - P. 771-774.

157. Sun, A., Yuksel, K. U., & Gracy, R. W.// Arch. Biochem. Biophys. -1995. Vol. 322. - P. 361-368.

158. Takemoto L., Boyle D. Deamidation of a-A Crystallin from nuclei of Cataractous and Normal Human Lenses. Molecular Vision, 1999, 5:2, pp. 312-317.

159. Tani F., Lio K., Chiba H., Yoshikawa M. Isolation and characterization of opioid antagonist peptides derived from human lactoferrin // Agric. Biol. Chem. 1990. - Vol. 54. - P. 1803-1810, 1990.

160. Tollefsboi Т.О., Gracy R.W. Premature aging diseases cellular and molecular changes // Bioscience. - 1983. - Vol. 33. P. 634.

161. Tollefsboi Т.О., Zaun R.M., Gracy R.W. Increased lability of triosophosphate isomerase in progeria and Werner's syndrome fibroblasts // Mech. Aging Develop. 1982. - Vol. 20. - P 93.

162. Tollefsboi Т.О., Garcy R.W. Premature aging diseases: cellular and molecular changes // Bioscience. 1983. - Vol. 33. - N 10. - P. 634 - 639.

163. Tomazic S., Klibanov A.M., Why is one bacillus a-amilase more resistant against irreversible thermoinactivation than another? // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263. - P. 3092.

164. Tome D., Dumontier A.M., Hautefeuille M., Desjeux J.F. Opiate activity and transepithelial passage of intact B-casomorphins in rabbit ileum // Am. J. Physiol. 1987. - Vol. 253. - P. 737 - 744.

165. Umbach M, Teschemacher H, Praetorius K, Hirschhauser R, Bostedt H: Demonstration of a B-casomorphin immunoreactive material in the plasma of newborn calves after milk intake // Regulatory Peptides. 1985. -Vol. 12. P. 223-230.

166. VassSo R.S., Carneiro-Sampaio M.M.S. Phagocytic activity of human colostrum macrophages // Braz. J. Med. Biol. Res. 1989. - Vol. 22. N 4. -P. 457-464.

167. Vekshin N.L. Photonics of biopolymers. Moscow. Moscow State University Press. 1999. p. 63 - 71

168. Venkatesh Y.P., Vithayathil P.J. Influence of deamidation(s) in the 67 74 region of ribonuclease on its refolding // Int. J. Pept. Protein Res. -1985.-Vol. 25.-P. 27.

169. Voorter C.E.M., de Haard-Hoekman W.A., van den Oetelaar P.J.M., Bloemendal H., and de Jong W.W., Spontaneous peptide bond cleavage in aging a-crystallin through a succinimide intermediate // J. Biol. Chem. -1988.-Vol. 263.-P. 19020.

170. Westall F.C., Relaesed myelin basic protein immunogenic factor // Immunochemistry. - 1974. - Vol. 11. - P. 513.

171. Whitworth N.S., Grosvenor C.E. Transfer of milk prolactin to the plasma of neonatal rats by intestinal absorption // J. Endocrinol. 1978. -Vol. 79.-P. 191-199.

172. Williams M.R., Halliday R. The role of colostrum antibodies and significance of antigenic in young lambs // Ann. Rech. Vet. 1978. - Vol. 9. -N 2.-P. 327-333.

173. Wilson C.B., Lewis D.B., Penix L.A., // The physiologic immunodeficiency of Immaturity: In Immunologic Disorders of Infants and Children / Ed., Stiehm. Philadelphia: Sounders, 1996. p. 253.

174. Winer, B. J., Brown, D. R., Michels, К. M. Statistical principals in experimental design. (3rd ed.). New York, McGraw-Hill, 1991. p. 148.

175. Wright H.T. Nonenzymatic Deamidation of Asparaginyle and Glutaminyl Residues in Proteins // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1991. - Vol. 26. - P. 1 - 52.

176. Wright H.T. Sequence and structure determinants of the nonenzymatic deamidation of asparagines and glutamine residues in proteins // Protein Engineering. 1991. - Vol.4. - N3. - P. 283 - 294.

177. Wright H.T., Robinson A.B., Cryptic amidase active sites catalyze deamidation in proteins. In From Cyclotrons to Cytochromes. Kaplan N.O., Robinson A.B., Eds., Academic Press. New York, 1982. p. 727.

178. Yamamoto N. Antihypertensive peptides derived from food proteins // Biopolymers. 1997. - Vol. 43. - P. 129-134.

179. Yuan P. M., Talent J. M., Gracy R.W. Molecular basis for the accumulation of acidic isozymes of triosophosphate isomerase on aging // Mech. Ageing Dev.- 1981.-Vol. 17.-P. 151.

180. Yuan P.M., Talent J.M., Gracy R.W. Molecular basis for the accumulation of acidic isozymes of triosophosphate isomerase on aging // Mech. Ageing and Develop. 1981. - Vol. 17. - N 2. - P.151 - 162.

181. Yuh K.-C.M., Gafiii A. Reversal of age-related effects in rat muscle phosphoglycerate kinase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - Vol. 84. -P. 7458.

182. Yvon M., Pelissier J.P. Characterization and kinetics of evacuation of peptides resulting from casein hydrolysis in the stomach of the calf // J. Agric. Food Chem. 1987. - Vol. 35. P. 148-156.

183. Zaman S., Carlsson В., Morikawa A., Jeansson S., Narayanan I., Thiringer K., Jalil F., Hanson L.A. // Arch. Dis. Child. 1993. Vol. 68. - P. 198.

Информация о работе

Бибов, Михаил Юрьевич
кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние неферментативного дезамидирования на некоторые биохимические и физико-химические свойства препарата лактоглобулина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Влияние неферментативного дезамидирования на некоторые биохимические и физико-химические свойства препарата лактоглобулина - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы