Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перекисное окисление липидов и состояние мебран эритроцитов и микросом при многократном длительном действии факторов гипербарической гелиокислородной среды

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Перекисное окисление липидов и состояние мебран эритроцитов и микросом при многократном длительном действии факторов гипербарической гелиокислородной среды"

Министерство науки, высшей школы и технической политики Российской Федерации РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ Специализированный совет К 063.Б2.09 то биологическим наукам

На правах рукописи

САПОЖНИКОВ Валерий Маркович

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИВДДОВ И СОСТОЯНИЕ МШБРАН ЭРИТРОЦИТОВ И МИКРОСОМ ПРИ МНОГОКРАТНОМ ДЛИТЕЛЬНОМ ДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ ГИПЕРБАРИЧЕСКОИ ГЕЛИОШЛОРОДНОИ СРЕДЫ

(03.00.04 - Биологическая химия)

Автореферат дасоертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Роотов-на-Дону 1992

Работа Шполнена в НШ Биологии Ростовского госуниверситета

руководители: доктор биологических наук, профессор А.А.Кричевская (г. Ростов-на-Дону), кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Н.П.Милютина (г. Ростов-на-Дону) 5*ишальны9 оппоненты: член-корр. АШ И доктор биологических наук, прсфесес'р ЭЛ. Эгарбеков

/г. Махачкала, ДГУ/ доктор медицинских наук, профессор Л.Г.Медведев /Сшкт-Цетер-

I

бург, Воешю-Медишшска!* Академия

ни. С.М.Карова. Ведущая организация: Физиологический 1ШИ им. А.А.Ухтомского, Санкт-Петербург

Защита состоится faÁ' ^LpAlJl 1992 г. па заседании специализированного совета К 063.62.09 в Ростовском государственном университета, 344006, г,.Ростов-на-Дону, ул. Энгельса .105 ауд. 304, 10.00

С диссертацией йожно ознакомиться в библиотеке РТУ Автореферат разослан " JUAJI_1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

(Кирой В.Н.)

о'

1 ' , общая характеристика работы.

с.-зд-гция ■

-------Актуальность проблемы: В настоящее время в практике подводных работ все шире применяется техника насыщенных (сатурацион-ных) погрукений в искусственных газовых средах, содержащих в качестве компонентов инертные газы. Применение таких смесей позволяет акввнввтом длительное время находиться на глубине под давлениями до 6,7 МПа (Беннетт, 1988). Компонентом подобных газовых смесей часто является гелий. Смесь гелия с килородсм, применяемая для дыхания в ходе длителышх глубоководных погружений, носит назвонив гелиокса.

Однако длительное пребывание акванавтов на глубше в обитаемых гипербарических комплексах в гелиокислородной среде под давлением связано с опасностью неблагоприятного действия комплекса стрессорных факторов, (Зальцман и др., 1979), вызываниях в организме обратимые и необратимые изменения. Еозмогшо, эти сдвиги лежат в основе этиопатогекеза профессиональных заболеваний водолазов.

Необходимость изучения уровня ПОЛ и структурных свойств мембран эритроцитов и микроссм при гипербарии объясняется важнейшей ролью процессов ПОЛ в развитии стресс-реакции (Меэрсон, 1984; Барабой, 1989) и регуляции структурного состояния биомембран (Владимиров, 1987). Эта информация позволит судить об особенностях адаптаптационно-приспособительнчх реакций при действии многократной гипербарии. Кроме того, для понимания влияния гипербарической газовой среды на организм существенным является изучение активности микросомальной -монооксигеназной системы, выполняющей детоксикационную и пластическую функцию в клетке.

Полагают, что вахнайшей точкой приложения ""гипербарической газовой среды являются биологические .мембраны, через которые реализуется микросдоуктурный эффект .компрессионного и анестетического действия' индифферентных газов (Беннетт, 1988; МШег, 1981). В то же время, согласно концепции Е.М. Крепса (1981), биологический мембраны являются главной мишенью адаптации организма. Значит, исследование механизмов действия факторов гипербарической среды на организм должно быть, прежде всего, направлено на выявление изменений в свойствах субклеточных и клеточки* мембран.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось выяснение роли процессов ПОЛ и изменений структурно-функционального состояния мембран эритроцитов и микросом различных тканей мышей в ответной реакции на многократное длительное действие гипербарической ге-лиокислородной среда (3,6 МПа, е суток; 1,9,5-кратное действие) и в период последействия (через 2 месяца йосле гипербарии).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследование интенсивности ПОЛ в плазме крови, мембранах эритроцитов и микросом мозга, легких, печени и почек.

2. Определение активности антиоксид антшх ферментов - СОД и каталазы в эритроцитах.

3. Определение стабильности мембран эритроцитов по уровню суммарной пчроксидазной активности и активности СОД в плазме крови.

4. Изучение структурных свойств "(лембран эритроцитов и микросом различных тканей: определение относительноЛ микровязкости липидаого бислоя, зон белок- лшшдных контактов и степени погружения белков в липидный бислой.

Б. Определение гидроксшшрувдей активности микросомной мо-нооксигеназы - цитохрома Р-450 - с двумя субстратами (анилином и амидопирином) в мозгу, легких, печени и почках.

Научная новизна. В данной работе впервые была исследована динамика структурно-функционального состояния эритроцитарных и микросомальных мембран при многократном действии гипербарической дыхательной смеси. Было выявлено изменение активности цитохрома Р-450 - ключевого звена монооксигеназной системы (МОС)' микросом в гипербаричвскях условиях. На основании полученных нами результатов и анализа дйннйх литературы была предпринята попытка обобщить имеющиеся.материалы и рассмотреть возможные механизмы воздействия гипербарического гелиокса на эритроцитарные и микросо-мальные мембраны.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные в результате работы данные предсталяют интерес с точки зрения поиска механизмов воздействия на клеточнные и субклеточные мембраны гипербарической гелийсодержащей дыхательной смеси. Заслуживает внимания интерпретация изменений, наблюдаемых в мембранах эритроцитов и микросом в течение пятикратного дли-

- б -

тельного гипербарического воздействия как одного из проявлений развития приспособительных реакций к действию гипербарии на тканевом и организменном уровне. В работе высказывается предположение о возможном влиянии изменений в мембранах микросом мозга под действием гипербарии на развитие нервного синдрома высоких давлений (НСВД).

Практическая значимость данной работы определяется возможностью на основе полученной информации корректировать с помощью мембранопротекторов антиоксидаитной природы состояние липидной фазы мембранных структур клеток, от которой зависит их функциональная активность . Кроме того, информация о состоянии еритро-цитарных и микросомальных мембран в последействии позволит в дальнейшем подбирать оптимальные разимы раборы водолазов- глубоководников..

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 6-й Ростовской научно-практической школе-семинаре (Ростов-на-Дону, 1990), Всесоюзном симопзиумэ "Механизмы зимней спячки" (Махачкала, 1990), конференциях молодых ученых Ростовского университета (Ростов-на-Дону, 1989, 1992) и на заседании Ростовского отделения Всероссийского биохимического общеотва (Ростов-на-Дону, 1992).

Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 8 работ, 2 находятся в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация выполнена на 165 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав," выводов и списка литературы, -включающего.204 отечественных и-зарубежных источника. Работа иллюстрирована 21 рисунком, 26 таблицами и I фотографией.

Материалы и методу исследования

■ Материалом .служили самцы бели беспородных мышей массой 23-35 г, содержавшиеся'в условиях вивария.

Постановка эксперимента осуществлялась с помошью гипербари-чзской установки, снабженной' системами жизнеобеспечения и контроля за животными. Животные находились в барокамере в гелиокис-лородной среде под давлением 3,6 МПа, при ьормоксии, оптимальной температуре и влажности (условия для нормальной жизнедеятельн.-сти организма мышей при данном давлении). Животных делили на две группы (I и II). Первую группу (опыт) подвергали воздействию гипербарического гелиокса, а вторую (камерный контроль) помещали в

такую же установку, заполненную воздухом при нормобарии (нормальном давлении) на такой же срок (6 сут). Контрольных животных (контроль) содержали в условиях вивария. Равные по длительности гипербарические воздействия (по 6 сут) повторяли 5 раз с перерывами между ними (по Б сут), в течение которых животные находились в вгаарии. После завершения I, III и V/ гипербарических воздействий часть мышей декапитировали. Одновременно забивали контрольных животных. Мышей, оставшихся после пяти гипербарических воздействий, содержали в виварии еще в течение 2 мес. для исследования отдаленных последствий многократного действия гиперба-ркческого гелиокса.

После забоя у животных собирали кровь и извлекали мозг, легкие, печень и почки. Ткани гомогенизировали, выделяли микро-сомальную фчакцгао (Карузина, Арчаков, 1977). Кровь центрифугировали, плазму отделяли от эритроцитов. В плазме крови и эритроцитах определяли активность СОД (Fried,1975) и каталазы (Luck, 1963) . Центрифугированием выделяли мембраны эри.роцитов (Кол-чинская и др., 1976) и микросом (Карузина, Арчаков, 1977), из них экстрагировали лшшда (Bligh, Dyer, 1959). В хлороформных липидных экстрактах определяли уровень продуктов ПОЛ - ДК -диеновых коныогатов (Владимиров, Арчаков, 1972) и ПЮ - шиф$овых оснований (Bidlack, Tappel, 1973). Содержание ДК и 11Ю рассчитывали в отношении к содержанию-общих липидов (Колб, Камышников, 1982).

Методом флуоресцентных зондов на , спектрофлуориметре "Hitachi 650-60" определяли относительную микровязкость эритро-цитарных и микросомальных мембран, микровязкость зон белок-липидного контакта и погруженность белков в липидный бислой (Добрецов, Владимиров, 1980). Микровязкость липидного бислоя мембран оценивалй йо коэффициенту эксимеризации пирена Fg/FH(334), равного отношению интенсивности флуоресценции его эксимеров и мономеров при длине волны возбуждающего света ^воза* 334 Микровязкость зон белок-липидногз контакта оценивали по коэффициенту F5/TM(286) при Лб03б=286 нм. Параметры FS/V334) и Fg/TM (286) находятся в обратной зависимости от величины микровязкости, так как в вязкой среде эксимеризация пирена снижается. Степень погружения белкового компонента в липидный матрикс мембран определяли по тушению флуоресценции белков пиреном (AF). происходящему вследствие безызлучательного переноса энергии с триптофанилон- мембранных белков на пирен при

\0O3(J=286 нм.Для определения двух первых показателей пробы выравнивали по содержанию фосфолипидов (Кушманова, Ивченко, 1983), последнего - по содержанию белка (Shacterle, Pollack, 1973).

В микросомах определяли деметилазную (Nash, 1953) и гидрок-силазную (Орехович, 1977) активность цитохрома P-46Q. Данные обрабатывались ■ статистически с применением критерия Стьюдента (Владимирский, 1983). Резко выделяющиеся локазатели отбрасывались с помощью критерия Шовене (Кокункн, 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕШЕ Состояние лелоран эритроцитов и плазлн крови при лногократ-нол действии ГБГ. После однократного действия ГБГ в флйзме и МЭ резко возрастает содержание ДК и ШО. В частности, в МЭ уровень 1Ю повышается на 450%. Одновременно с этим в ¿эритроцитах наблюдается снижение активности СОД на 44Ж. Очевидно, снижение активности СОД - ключевого фермента антиоксидантной защиты (АОЗ) -обусловливает интенсификацию ПОЛ в ЫЭ.

Нескомпенсированное усиление процессов пероксидяции, по-видимому, указывает на истощение адаптационных возможностей организма и переход начальной адаптивной стресс-реакции в патологическую. Причин усиления ПОЛ при действии ГБГ может быть несколько: повышенная продукция и выброс в кровь отрессорных гормонов - катехоламинов и глхжокортикоидов (Зальцман и др., 1979; Manalaysay et al., 1983), являющихся активным!, стимуляторами ПОЛ. (Меерсон, 1984); гипоксемия, развивающаяся в гиперЗариче-ских условиях и связанная с диффузионными и респираторными нарушениями ЧГуляр, 1988); инактивация СОД в эритроцитах и т.д.

Следствием усиления ПОЛ в МЭ после однократного действия ГБГ является рост относительной микровязкости на 27% и высокое содержание холестерина в МЭ. Известно, .-.что,.увеличение микровязкости эритроцитаршх мембран изменяет их вязкоэластические свойства, т.е., способность к обратимой деформации, что сопровождается нарастанием ригидности клетки. Это приводит к усилению вну-трикапиллярного гемолиза.

■ Одновременно в плазме наблюдается рост активности СОД и СПЛ. Однако СОД в норме к.".зет исключительно внутризритроцктарйуа локализацию, а основной вклад в СПА плазмы вносит внеэритроци ■ тарный гемоглобин (Дудкин, 1983). Следовательно, возрастаниэ в плазме активности СОД и СПА говорит о нарушении стабильности вритроцитврных мембран и выходе СОД в плазму.

100*

Плазма

' ДК 141

44

17

24

Ш0

45

13 5

13 5

Рэ/?м(334) Еэ/Рм(28б)

100«

67

90

11

13 3

ш

п

-1134

450 □

шо

1 з

з

П 12

64

АР

1 з Холестерин

97 □

13 5

27'

,24

16

1 з 18

Плазма 1

и

23

45

Мембраны эритроцитов

СОД

Катал аз а

64

37

13 3

3 5

щт

16 17

Плазма

СОД

267 □

СПА

93

МЭ

44

1, з,-з - сеансы ГЕГ ДК - диеновые конъюгаты ШО - шиффовы основания МЭ - мембраны эритроцитов СОД - супероксиддисмутаза СПА - суммарная шроксидазная активность » - достоверные различия относительно контроля

Р_/£м(334) - коэффициент ьксиморизацш

пярена при \=334 тл Р„/Т„(331) - коэффициент эксимеризации

пирена при Я.=334 нм АР - тушение флуоресценции белка пиреном

I

оэ

Рис. I. Интенсивность ПОЛ, активность антиокислительных ферментов в кройи и структурные свойства мембран эритроцитов мышей при многократном действии 3,6 ЫПа гипербарического ' Гелиокса. (в * к контролю).

«

После 3-кратного действия ГБГ в эритроцитах -наблюдаьтся возрастание активности СОД до контрольного уровня. Параллельно росту активности СОД снижается интенсивность ПОЯ в МЭ, Относительная микровязкость лшидаого Сислоя после III гипербарического воздействия остается повшгенвоа. Одновременно наблюдвэтся снижение г.жкровязкости зон Селок-лишдного контакта на 67% и погруженности белков в липидный бислой на 455.

После 5-кратного воздействия ГБГ активность СОД в эритроцитах превышает контроль на 54%, а уровень ДК и ШО в МЭ п плазма крови достигает контрольного уровня. Параметры структурного состояния МЭ нормализуются, однако микровязкость вон белок-липидного контакта на 90% ниже контроля.

Таким образом, ингибирование СОД в эритроцитах вызывает усиление ПОЛ и свидетельствует о недостаточности антиоксидантной защиты при однократном действии ГБГ. После 3- кратцрго действия ГБГ происходит нормализация активности СОД, а к концу пятого воздействия на 53% возрастает активность СОД, что сопровождается выраженным снижением интенсивности ПОЛ. При ртом на протяжении многократного действия ГБГ активность каталазы изменяется незначительно. Положительная динамика активности СОД по. мэрэ увеличения количества гипербарических воздействий говорит о стимуляции антиоксидантной системы и развитии компенсаторно- приспособительных реакций.

В период последействия (через 2 месяца порлэ. окончаиля ги-пэбарического эксперимента) вновь наблюдается интенсификация ПОЛ в плазме крови. Уровень ДК на 64% превышает контроль, в то врэмя как содержание ШО остается в пределах норы. Активность СОД возрастает на 150%'при тенде{щии к снижению активности каталазы. Это монет создать значительный дисбаланс р работе оопряиенных Ентйоксидантных ферментов и способствовать накоплению Hgpg. .Последняя, взаимодействуя с ионвми железа,,через посредотво двух-стадийной реакции Габера-Вейса поровдвет гндронсяльиые радикалы, которые активируют ПОЛ.

Итак, однократное действие ГБГ обусловливает интенсификация ПОЛ в МЭ, которая внвнвапт изменение структурного состойшя эритрсэцитарпых мембран. Однако посла У гипербарического воздействия (отмечается стабилизация всех испледоввшшх паршлзтров структурно- функционального состояния МЭ за исключением микро-вязкостц зон белок-лшшдного контакта, которая остается сншзен-

ной. У мышей,.находившихся в барокамере при нормобарии, изменения уровня продуктов ПОЛ в плазме и МЭ и изменения структурных параметров МЭ имеют ту ке направленность, что и у животных, подвергнутых многократному длительному действию ГБГ, но они значительно менее выражены и нормализуются, как правило, после трехкратного длительного пребывания в замкнуто^-объеме.

Состояние лелбран ликросол лишей при Лногокрашол действии ГБГ и 6 последейстоии. Наиболее значительное усиление процессов ПОЛ в микросомах наблюдается прл однократном действии ГБГ. Уровень ДК в микросомах мозга, легких, печени и почек превышает контроль соответственно на 131%; 66%; 142% и-264%, а уровень НЮ - на 80%; 152%; 159% и 107%. После III гипербарического воздействия наблюдается заметное снижение инициации ПОЛ, выраженное в падении уровня ДК по сравнению с I воздействием ГБГ. К окончанию V гипербарического воздействия уровень ДК в мембранах микросом мозга, легких и печени достигает контрольного уровня, оставаясь повышенным лишь в микросомах почек на 54%. Уровень ШО в микросомах всех тканей после V воздействия ГБГ остается выше контроля. Спустя 2 месяца после V сеанса ГБГ наблюдается вторичный всплеск инициации ПОЛ в мембранах микросом легких, печени и почек.

Вместе с тем, важнейшей особенностью динамики ПОЛ при многократном действии ГБГ является прогрессивное снижение интенсивности ПОЛ в мембранах микросом по мере увеличения количества гипербарических воздействий. Можно предположить, что постепенное снижение скорости процессов свободнорадикального окисления (СРО) липидов при многократном действии ГБГ свидетельствует о повышении резистентности организма к стрессорным факторам гипербарии и активации компенсаторных процессоз. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными, которые показывают, что при многократном участии акванавтов в насыщенных погружениях наблюдается постепенное угасание сгресс-реакции, устраняется чрезмерный катаболический эффект стресса <и сопутствувдио ему повреждения (Гуляр, 1988; Гуляр, Ильин, 1990).

После однократного действия ГБГ возрастает относительная микровязкость мембран микросом легких, печени и почек. Это согласуется с данными об интенсификации ПОЛ после однократного действия ГБГ в микросомальных мембранах втих тканей. В ходе последующих 'гипербарических воздействий относительная микровязкость микросомальных мембран достигает контрольного уровня.

Мозг

дк шо

80,

87

'72

40

48

1'3 ' 22

да

Ю

о_

1 ЗИП

Печень

ШО

159

142

62

34

1 з

35

44

бб

1 з в п

осп Легкие ДК 268 211 ШО

104

56

¿9

* * *

152 192

58

1 3 В П 1 3 В П

264

Почки

ДК 198

ШО

70

54

107

78

72 Ь-,64

1 з в п

1 з в п

Рис.- 2. Содервапкз продуктов ПОЛ в мембрсяах микросом тканей мышей при (шогократном Действии 3,6 ШЗа пшербарическоГо голиокса (в % к контролю). 1,э.в, - сеансы ГБГ: п-последействие; * - достоверные различия относительно контроля; ДК - диеновые' конъюгати; ШО - шиффовн осйованйя.

» * в *

п

;ХОО*

МОЗГ

Ре/Гм(334) ?э/?и (286)1; Рэ/Ум(334)

27 1 *

33

17

*

3 5

19

1002

ЛР

1 3 ^ П |—1С» о 11

Ь 12 3

звО"

13

Холестерин 12

3 Б П .

19

24

16

Печень Рд/Ру(334) Рд^Я(286)

96

12

13 8

□ гь

1 3 й п

34 Л?2з Холестерин 14'

11

3 3 .п * ■

Т"Т

25

3 Б П

31

25

И 47

Легкие

476Д *У*М<236)

17

и

30

ЛР

13 3 40

1 3 Б П

32

до Холестерин 26

а

1 3 в п

3131

01

РуТй(334)

1 3 3 п

Подо 53

РГ

Р-ё/Рй(286)

з в

40 1 3 5 П

29

Холестерин

■Щ]

2123*-'

27

1 3

3 п

43

Рио. 3. Структурное состояние мембран микросом мышей при много-. 1фатном длительном действии 3,6 МПа гипербарического гелиокса (в % к контролю)..

1,3,3, - сеансы ГБГ; п-последействие; » - достоверные различия относительно контроля; Р§/Ря(334) и Рд/Рм(286)- коэффициент эк-симеризации пирена при А.=334 нм и Х=286 нм; ДР - тушение флуоресценции белка шреном.

Через 2 месяца последействия относительная микровязкость не от', личается от контроля в микросомальных мембранах легких, печени и почек, в микросомах мозга она на 33% ниже контроля. Другой веяный показатель структурного состояния микросомальных- мембран -мнкровязкость зой белок-липидного контакта - после,III 'гипербарического воздействия снижается в мембранах микросом мовга, легких, печени и почек соответственно, на 18%, 47%, 96% и 63%. После 5-кратного действия ГБГ этот параметр остается сниженным в мембранах микросом легких и печени. Через 2 месяца последействия в микросомах всех тканей микровязкость зон белок-липидного контакта нормализуется.

Активность цитохрома Р-450 в ходе многократного действия ГБГ претерпевает значительные изменения. Деметилазная активность цитохрома Р-450 (ДМА) при однократном действии ГБГ снижается в микросомах мозга, легких, печени и почек соответственно, на 46%, 65%, 28% и 55%. Парагидроксилазная активность (ПГА) в микросомах мозга, печени и почек возрастает соответственно на 69%. 64^ и. 459%. Эт^ направленность изменений ДМА в целом сохраняется и при последущих воздействиях ГБГ, однако ПГА в микросомах мозга и печени опускается ниже контроля. В микросомах печени ПГА ниже контроля и в последействии.

Цитохром Р-450 связан о гидрофобной частью мембраны (Кару-зина, Арчаков, 1988), кроме того, его активность зависит от микровязкости участков липидного бислоя, примыкаюадх к молекуле фермента (Адрианов, Уваров, 1988). Интенсификация ПОЛ вызывает изменение гидрофобного микроокружения цитохрома Р-450 и микровязкости микросомальных мембран. Возможным следствием этого . является изменение активности цитохрома Р-4Е1. Имещиося в литературе данные указывают на важную роль белок-липидных взаимодействий в функционировании системы цитохрома Р-450 (Арчвков, 1975; Бурлакова и др., 1982). Кроме того, снижение микровязкости зон белок-липидных контактов мембран микросом вследствие активации ПОЛ, по-видимому, повышает доступность гемовой группы для экзогенных субстратов и стимулирует скорость гидроксилирования.

Нами показано, что в микросомах лроявляется двунаправленная реакция отдельных изоформ цитохрома Р-450 на многократное действие ГБГ. Деметилазная активность цитохрома Р-450 снижается после однократного действия ГБГ в микросомах всех исследованных, тканей, а после третьего и пятого сеансов ГБГ ингибирование

100%

100*

Легкие ДМА ПГА

50

13В а

* * *

66

'67

69

ДМА

13В

28 и

55

26

38

* *

И

31 495

з в

Почки

ПГА

4о 73

1 зп

Рко. 4, Активность цитохрома Р-450 при многократном длительном действии 3,6 МПа гипэрбарического геЛиокса (в % г контролю). 1,э,в, -свиной ГВГ; п - последействие; * - достоверные различия относительно контроля; ДМА - деметилазная активность, Г1ГА -: па-рагидроксилазная активность.

Н-деметижрования амидопирина сохраняется только в микросомах легких и печени. Напротив, анилингидроксилвзнай активность цито-хрома Р-4Б0 значительно повшаается при многократном действии ГБГ. Наибольшая «серость гидроксилирования анилина отмечена в микросомах мозга и печени после третьего сеанса ГБГ, а в микросомах почек после первого сеанса. Негативной стороной • резкого' повышения анилингидроксилазной активности цитохрома Р-450 в микросомах при многократном действии ГБГ может быть образование двух типов метаболитов - активных форм кислорода (АФК; и конъкъ гированных диенов (Арчаков, 1983).

По-видимому, одной из причин разнонаправленного действия ГБГ на активность цитохрома Р-450 являются особенности взаимодействия изоформ фермента с субстратами I (амидопирин) и II (анилин) типа. Мокно'предположить, что при многократном действии ГБГ возросшая интенсивность ПОЛ нарушает взаимодействие .цитохрома Р-450 с субстратом I типа, что приводит к депрессии' демети-лазной активности. Взаимодействие цитохрома Р-450 с субстратами II типа кокет стимулироваться этим действием и приводить к повышению гидроксилазной активности. Известно, что гемовая группа цитохрома Р-450 расположена на границе раздела фаз е микросо-мальных мембранах (Райхман и др., 1973).

Таким образом, однократное действие ГБГ обусловливает выраженную интенсификацию процессов ПОЛ в микросомальных мембранах, которая, в свою очередь, вызывает изменения структ>рно- функционального состояния микросомальных мембран, выражающееся, прежде всего, в возрастании микровязкости липидаого бислоя мембран и разнонаправленном изменении активности цитохрома Р-450 по отношению к субстратам I и II типа.

Можно заключить,' что первоначально однократное действие ГБГ на мышей реализуется как стресс-реакция чрезмерной силы с переходом в патологическую, неспецифическим пусковым механизмом которой является интенсификация ПОЛ и недостаточность антиокси-дантной защиты. Присутствие в газовой смеси гелия вносит определенную специфику в микроструктурный эффект гипербарш на мембраны. Гелий, хорошо растворим в воде, но. слабо растворим в липи-дах. Усиление ПОЛ в мембранах способствует появлениъ гидрофильных кластеров, повышая проникновение молекул воды в мембраны. В липидной фазе мембран атомы гелия окружаются молекулами мембранной вода, образуя водно-гелиевые гидраты кластерного-типа. Про-

никновение молекул вода в толщу мембран разупорядочивает их. структуру и приводит к "водной коррозии" мембран, что является важнейшим следствием усиления ПОЛ в мембранах (Владиклров, 1987). В условиях дейстьия ГБГ, по-видимому, можно предположить возникновение "водно-гелиевой коррозии" микросомальных и эритро-цитарных мембран. Следствием этого является снижение микровязко-оти белок-лшшдшх контактов в мембранах и разобщение гидрокси-лазных реакций микросомального окисления.

Главная причина превращения адаптационной реакции в патологическую - низкий исходный уровень стресс-лимитируюцей антиокси-дантной системы мышей, характерный для данного биологического вида. Последующее многократное действие ГБГ стимулирует компенсаторные защитные механизмы и способствует формированию адаптивных изменений. К последним относятся повышение антиоксидантного статуса, приводящее к снижению интенсивности свободшрадикально-го окисления липидов, тенденция к нормализации микроструктура плазматических и субклеточных мембран, умеренная активация гид-рокси пазноП активности цитохрома Р—150.

Поскольку мембраны являются осноьной точкой приложения для действия факторов гипербарии, целесообразно применение антиокси-дантов мембранопротекторного действия для ослабле1Шя повреддаю-дего вффекта стресса и сшшения порога адаптации.

ВЫВОДЫ '

1. Однократноэ действие гипербарического гелиокса под давлением 3,6 МПа приводит к резкому росту уровня продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов и плазме крови. Активное^ СОД значительно снижается. Трех».и пятикратное воздействие ГБГ сопровождается сниженном накопления продуктов ПОЛ как в плазме крови, так и в мембранах эритроцитов, проходящее на фоне резкого роста активности СОД. Однако' через 2 месяца после пятого гипербарического воздействия при высоком (на 1БОЖ выше контроля) уровне активности СОД наблюдается рост содержания продуктов ПОЛ в плазме крови. Активность каталазы в плазме и эритроцитах ео все сроки воздействия ГБГ остается неизменной.

2. Многократное действие ГБГ приводит "к изменению параметров структурного состояния МЭ. Уже после первого сеанса ГБГ наблюдается рост относительной микровязкости лшшдаого бислоя мембран и погруженности белка в липидный матрикс, а,также снижение микровязкости зон белок-липидаого контакта. Однако после . пятикрат-

ного действия ГБГ наблюдается нормализация структурных параметров.

3. В микросомах мозга, легких, печени и почек мышей однократное действие ГБГ вызывает резкий рост уровня продуктов ПОЛ. К. концу пятого гипербарического воздействия наблюдается снижение уровня ДК в микросомах всех тканей, кроме почек. Уровень ШО после пятикратного действия ГБГ остается повышенным в мембранах микросом всех исследованных тканей. В период последействия няблюдяется вторичный рост интенсивности ПОЛ в микросомах мозга, легких п печьни.

4. Структурные параметры мембран микросом всех исследованных тканей мышей претерпевают выраженные разнонаправленные изменения в ходе пятикратного действия ГБГ. Так в мембранах микросом легких, печени и почек наблюдается рост относительной микрсзязкости после однократного гипербаричьского воздействия, в то время, как в микросомах мозга этот параметр снижается после первого и третьего сеансов ГБГ. Микровязкость зон белок-липпдногс контакта снижается в мембранах микросом легких, печени и почек, остаьаясь в легких и печени ниже контроля и после пятого сеанса ГБГ. Уровень холестерина отличается от контроля в мембранах микросом легких, печени и почек.

5. В ходе пятикратного действия ГБГ как деметилазная, так и гидроксилазная активность цитохрома Р-450 подвергаются. значительным изменениям. В мембранах микросом всех тканей снижение деметил'азной активности цитохрома Р-450 сопровождается ростом парагидроксилазной активности. К"концу пятого, воздействия ГБГ большая часть изменений сохраняется.

6. Важной составляющей гипербарического воздействия является нахождение животных в ограниченном объеме барокамеры, о чем свидетельствуют данные камерного контроля: возрастает уровень продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов и микросом мышей после пребывания животных в барокамере, заполненной атмосферным воздухом при нормальном давлении.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Некоторые характеристики индивидуальной чувствительности й эффективности ГБО (К.Б. Шэрстввв.А.А. Кричевская, Е.Е. Николаева, г.Г. Жданов, Н.П. Милютина, И.Я. Шерстнева, Е.В. Минкина, Е.В. Лыкова) // Гипербарическая оксигенация, IV симп.- М.,

^1989.- С. 157-168.

г. Влияние унитиолв на ПОЛ и актиоксидантныо форманты эритроцитов при гипербароксигенации в условиях сердечно-сосудистой патолэгии.(К.Б. Шерстнев, Г.Г. Жданов, Е.Е. Николаева, Н.П. Милютина, И.Я. Шерстнева, Новикова Е.И.). / Биоантиоксидант, 3 Всес. конф. М., 1989.- С. 125-126.

3. Оценка химического' состава крови и структурно-функционального состояния мембран эритроцитов и микросомальной фракции мозга, легких, печеы и почек мышей при многократном действии гипербарии (A.A. Ананян, Н.П. Мшцотина, Б.И. Новикова, К.Б. Шеротнев). // Отчет по НИР ИЭФБ им. И.М. Сеченова АН СССР ГОперекающио исследования иа животных по многократному пребыва-

.нию под давлением".- Л., 1989.- С. 60, 103, 130, 185, 200, 239.

4. Отдаленные последствия многократной гипербарии (A.A. . Ананян, Н.П. Милютина, Е.И. Новикова, К.Б. Шеротнев)..// Отчет по НИР ИЭФБ им. И.М. Сеченова АН СССР "Опережаюдие иссладоэания на животных по многократному пребыванию под давление)*Л., 1989.- 0. 296.

Б. Влияние гипорбарии на активность ПОЛ и структуру мембран ^рит^цитов и микросом мышей (Е.И. Новикова, Б.С. Дашевский) // Тез. 6-й Ростовской обл. научно-практ. школы-семинара.-Ростов-на-Дону, 1990.- 2.- С. 32.

6. Влияние гщкжсии ца структурно-функциональные —двойства эритроцитов (Н.П, ;МЙлютина, В.А. Херувимова, A.A. Ананян, Е.И. Новикова). // Тез.'докл. Всесоюз. симп. "Механизмы зимней спячки".- Махачкала, 1990. - С. 80-81.

7. Структурно-химическое состояние мембран эритроцитов и микросом клетоюмозга, дэгких, печени, почек, сердца и семенников морских свинок при гипербарии (A.A. Ананян, А.И. Лукаш, Н.П. Милютина, Е.И. Новикова). // Отчет по НИР ИЭФБ им. И.М. Сеченова АН СССР "Оценка состояния основных функциойальных систем организма теплокровных живо'ишх в условиях длительного пребывания под давлением". Л., 1990.- С. 89, 98, 104, 206, 289.

8. "Соотояние мембран цркросом мозга и эритроцитов шшей при действии гишрбарического гелиожса" (Н.П. Милютина, Е.И. Новикова) // Известия СКНЦ ВШ. Естеств. науки.- 1992.- JH.- С..Т42-146

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СОКРАЩЕН^ АФК - активные формы кислорода ГБГ - гипербарический гелйокО МЭ - глембраны эритроцитов ДК - диэновыэ контЬюгаты ШО - ВПффОВЫ основания СРО - свободнорадикальное окисление ПОЛ - пэрекисное окисление липидов СОД - супероксдддисмутаза СПА - суммарная перокслдазная активность МОС - ионооксигеназная система