Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональный отклик мембранных структур клеток животных на воздействие антропогенных факторов окружающей среды

ВАК РФ 03.00.29, Охрана живой природы

Автореферат диссертации по теме "Функциональный отклик мембранных структур клеток животных на воздействие антропогенных факторов окружающей среды"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

- л - Биологический факультет

На правах рукописи

УДК 502: 628: 3:577

Котелевцев Сергей Васильевич

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ОТКЛИК МЕМБРАННЫХ

СТРУКТУР КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ.

03. 00. 29 - Охрана живой природы. 03. 00. 02 - Биофизика

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1997

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Николай Дмитриевич Озсршок

Доктор биологических наук Олег Федорович Филенко

Доктор биологических наук, Евгеаий Иванович Асташкин,

Ведущая организация: Институт Озероведения РАН

Защита состоится мая 1997 г. в 15 часов 30 минут

на заседании диссертационного совета Д. 053. 05. 91 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119899, Москва, Воробьевы горы, Московский государственный университет, Биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Диссертация в виде научного доклада разослана апреля

1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Л. И. Степанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Развитие промышленности и сельского хозяйства, а так же военная деятельность государств, несмотря на систему мер по охране окружающей среды, приводят ко все возрастающему поступлению в экосистемы ксенобиотиков и радионуклидов. При мониторинге экосистем индивидуальный анализ химических компонентов в окружающей среде и особенно в тканях животных и растений необходим, однако не всегда возможен, так как, во-первых, часто не известен даже класс химических соединений, которые нужно контролировать, а во-вторых, действующие концентрации некоторых ксенобиотиков столь малы, что для химико-аналитического контроля не всегда эффективны даже специальные высоко чувствительные и дорогостоящие методы анализа (например, масспектрометрии) (Хмельницкий, Бродский, 1990). Кроме того, многие биологически активные вещества не стабильны и после взаимодействия с биологической мишенью в короткие сроки распадаются.

Эти обстоятельства объясняют возрастающий в настоящее время интерес к изучению отклика экосистем на антропогенные воздействия. При этом необходимо проводить исследования на различных уровнях организации живых систем (Захаров, 1993).

Анализ отклика на молекулярном и мембранном уровнях дает возможность регистрировать генетические и биохимические изменения в клетках, которые могут привести к далеко идущим последствиям для данного вида организмов задолго до того, как наступят необратимые изменения, вызванные антропогенными факторами.

При проведении исследований антропогенных воздействий на клетку одной из наиболее удачных систем являются мембранные структуры тканей животных и человека, так как именно они являются мишенью для большинства токсикантов и ионизирующей радиации. Кроме того, в этих системах (и прежде всего в эндоплазматическом ретикулуме печени) происходит не только накопление ксенобиотиков, но и их детоксикация и метаболическая активация. Процессы взаимодействия ряда ксенобиотиков с биологическими мембранами приводят к индукции активности специфических мембранно-связанных ферментов. Эта индукция сохраняется длительное время (у некоторых холоднокровных животных на протяжении месяцев) и

дает возможность судить о контакте организма с ксенобиотиком даже после того, как химическое соединение полностью выведено из организма или распалось.

Таким образом, исследование отклика экосистем на биохимическом уровне, на уровне клеточных мембран приобретает все большее значение для решения проблем охраны окружающей среды и рационального природопользования. Развитие молекулярной биологии и биотехнологии делает доступным использование этих методических подходов для создания тест-систем, которые все шире внедряются в мировой практике для биомониторинга.

Цель исследования

Цель работы - выяснение закономерностей функциональной модификации клеточных мембран эритроцитов и эпдоплазматического ретикулума клеток печени холоднокровных и теплокровных животных под воздействием ксенобиотиков и радионуклидов, а также определение эффективных путей контроля состояния экосистем на основе структурно-функционального отклика этих мембранных структур

Научная новизна.

Впервые проведен анализ изоформ цитохрома Р-450 в печени рыб озера Байкал (в том числе эндемичных) в норме и после индукции различными ксенобиотиками. Изучен фосфолипидный и жирнокислотный состав мембран эндоплазматического ретикулума байкальских рыб в норме и после индукции монооксигеназ полициклическими углеводородами (ПАУ), полихлорированными бифенилами (ПХБ) и сточными водами Байкальского целлюлозно-бумажного комбината (БЦБК).

Впервые продемонстрировано участие циклазной системы в регуляции ионного гомеостаза в эритроцитах рыб при стрессе и при антропогенном загрязнении водоемов ПАУ, ПХБ и тяжелыми металлами, исследованы молекулярные механизмы регуляции ионного гомеостаза в этих условиях. Разработаны тест-системы на основе анализа регуляции транспорта ионов в эритроцитах пресноводных рыб.

Впервые показана возможность использования тест-систем на основе мембранных фракций плаценты, осуществляющих детоксикацию ксенобиотиков, и тест - систем на основе анализа активности ионных переносчиков клеток крови для выделения

групп риска среди населения, подвергавшегося действию неблагоприятных факторов окружающей среды.

Практическая значимость работы.

На основе полученных результатов были предложены тест-системы для биохимического мониторинга и мониторинга генотоксичности пресноводных и морских водоемов, загрязненных мутагенными и канцерогенными соединениями, радионуклидами. С помощью этих тестов более 10 лет проводили биохимический мониторинг и мониторинг генотоксичности экосистем южного Байкала, осуществляли контроль генотоксичности сточных вод, производственных потоков и эффективности работы очистных сооружений Байкальского целлюлозно-бумажного комбината. Проведено исследование пруда-охладителя Чернобыльской АЭС и районов Киевского водохранилища, подвергавшихся загрязнению радионуклидами.

Выявлены группы риска среди населения Алтайского края, подвергавшегося действию испытаний ядерного оружия в период 1949-1965 гг.

Апробация работы.

Диссертация апробирована на совместном заседании лаборатории физико-химии биомембран и кафедры гидробиологии Биологического факультета Московского государственного университета.

Основные материалы и положения работы обсуждены на 25 Всесоюзных и Международных съездах и симпозиумах, в том числе:

Международном симпозиуме "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека", (Москва, 1985 г.); Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды", Новосибирск 1987; У Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул, (Ялта, 1989); Международном симпозиуме "Ферментативные системы метаболизма чужеродных соединений, (Варна, Болгария, 1989); 2-симпозиум по экологической биохимии рыб (Ростов Великий, 1990), 7 международной конференции "Биохимия и биофизика цитохрома Р-450, Структура и функция, биотехнология и экологические аспекты, (Москва 1991); 7 Международном симпозиуме по биоиндикации и охране окружающей среды (Куопио, Финляндия, 1992); На школе семинаре НАТО "Молекулярные аспекты ферментативного окисления ксенобиотиков: Их значение в

токсикологии окружающей среды, канцерогенезе и здоровье населения" (Кушодаси, Турция, 1993); 77 Конференции Канадского химического общества, посвященной проблемам охраны окружающей среды (Виннипег, Канада 1994); на научных семинарах университетов г. Куопио (Финляндия, 1995) и г. Плимута (Англия, 1996) Публикации.

По теме диссертации опубликованы: две главы в книгах, учебно- методическое пособие, 70 статей, 25 тезисов докладов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Сбор материала проводили в ходе экспедиционных работ на озере Байкал, Рыбинском водохранилище, пруду-охладителе Чернобыльской АЭС, Киевском водохранилище, в Алтайском крае, во внутренних водоемах Финляндии, на острове Хурноя (северная Норвегия).

В качестве объекта исследования использовали морских рыб: треска (Cadus morhua morhua) и мойва (Mallotus villosus.) пресноводных рыб озера Байкал: омуль (Coregonus autumnalis migratorius), хариус (Thymallus articus baikalensis), ленок (Brachymystax lenok), сиг (Coregonus lavaretus baicalensis), окунь [Perca fluviatüis), плотва (Rutilus rutilus lacustris) и эндемичных бычков - желтокрылка (Cottocomephorus greminskii) и подкаменка (Batrachocottus baicalensis).

На Рыбинском водохранилище в работе использовали лещей (Abramis brama). В пруду-охладителе Чернобыльской АЭС и Киевском водохранилище измерения проводили на следующих видах рыб: карп (Cyprinus carpió), густера (Blicca bjoerkna), лещь (Abramis brama), белый толстолобик (Hypophthálmichthys molitrix), синец (Abramis ballerus), голавль (Leuciscus cephalus), американский канальный сом (Ictalwrus punetatus ), серебряный карась (Carassius auratus gibelio), линь (Tinca tinca). В качестве условного контроля использовали карпов и толстолобиков из пруда Шатурской теплоэлектростанции. Рыбу, как правило, отлавливали неводом и доставляли в лабораторию в проточных аквариумах.

В лабораторных экспериментах в Москве использовали карпов и радужную форель (Salmo gairdneri), которых получали с Московской живорыбной базы. Лабораторным экспериментам предшествовала двухнедельная адаптация рыб в аквариумах с

ежедневной сменой половины объема воды. Инъекцию ксенобиотиков проводили в оливковом масле (не более 0. 5 мл, от 20 до 80 мг на кг веса).

В экспериментах на острове Хурноя отлавливали моевок (Rissa tridactyla), проводили инъекции ксенобиотиков (40 мг на кг веса в оливковом масле), метили птиц и отпускали на гнезда. Через 48 часов птиц отлавливли вторично для получения крови и тканей.

Плаценту, пуповинную кровь и кровь от 101 роженицы получали непосредственно в момент родов в родильным домах города Барнаула и населенных пунктов различных районов Алтайского края. Кроме этого была проанализирована кровь 157 человек, проживающих в различных районах Алтайского края, в том числе и при семейных обследованиях (три поколения).

Кровь забирали в раствор гепарина и хранили на льду до проведения измерений (не более суток). Печень и ткани плаценты перфузировали охлажденным фосфатным буфером в присутствии 0,15% KCl, антиоксидантов и ингибиторов протеаз. Если выделение мембранных фракций не происходило немедленно, то препараты доставляли в лабораторию на сухом льду или в жидком азоте для определения концентраций изоформ цитохрома Р-450, монооксигеназных активностей и активностей ферментов конъюгации, характера перекисного окисления липидов.

Липиды из мембранных фракций выделяли по методу Фолча, определение содержания фософолипидов проводили с помощью тонкослойной хроматогорафии и жидкостной хроматографии высокого давления. Жирнокислотный состав определяли с помощью газо-жидкостной хроматографии и масспектрометрии.

Измерение активности ионтранспортирующих систем в эритроцитах крови проводили с помощью ингибиторного анализа, используя 86Rb+ (в качестве радиоактивного аналога К+) и 23Na+ (Орлов и др., 1989 ).

Исследование мембранно-связанных ферментов микросомной фракции печени рыб озера Байкал выявило их высокую лабильность. В связи с этим стандартная процедура выделения мембранных фракций была изменена за счет включения в среду выделения антиоксидантов, ингибиторов протеаз, комплексонов металлов и фракции очищенного сывороточного альбумина для связывания свободных жирных кислот. При этом в среду хранения микросомной фракции добавляли 20% глицерина и по 10"4 М ЭДТА и ионола.

Выделение микросомной фракции и определение содержания в ней изоформ цитохрома Р-450 и его активностей проводили или сразу после отлова рыбы (на базе Байкальского института экологической токсикологии), или после фиксации печени в жидком азоте с последующей транспортировкой и хранением их на сухом льду.

Получение микросомных фракций из печени рыб проводили с помощью дифференциального центрифугирования по ранее описанному методу (Котелевцев и др., 1986). Определение в микросомах монооксигеназных активностей О-деалкилирования 7- этоксирезоруфина (EROD), О-деалкилирования 7-этоксикумарина (ECOD) и гидроксилирование бенз(а)пирена (АНН) проводили с помощью флуоресцентного анализа. Концентрацию цитохрома Р-450 в мембранных фракциях определяли по методу Омура и Сато и по методу Иохансона, содержание изоформ цитохрома Р-450 определяли методом иммуноблотинга.

Контроль чистоты мембранных фракций препаратов микросом и состояние мембранных структур форменных элементов крови осуществляли с помощью электронной микроскопии.

С целью исследования накопления канцерогенных и мутагенных ксенобиотиков в почве, донных отложениях, в воде и в тканях растений и животных образцы фиксировали в ацетоне (воду экстрагировали гексаном).

Ксенобиотики из печени и мышц рыб выделяли путем многократной экстракции смесью органических растворителей (ацетон:гексан = 1:1). Ацетон, в котором фиксировали ткани, и суммарные экстракты органических растворителей объединяли вместе. Ксенобиотики отделяли от экстрагируемой смеси на роторном испарителе, обезвоживали на лиофильной сушке и разводили в диметилсульфоксиде (ДМСО) пропорционально сухому весу образца из расчета 1 мл ДМСО на 100 мг сухого веса ткани. В таком виде образцы исследовали на генотоксичность в тесте Эймса. Анализ мутагенных свойств каждого образца осуществляли в стандартном тесте Эймса сальмонелла/микросомы в модификации Фонштейна (Ames et al., 1974; Фонштейн и др., 1977). Опыт проводили на двух тестерных штаммах сальмонеллы ТА 98 (учитывающий генные мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода) и ТА 100 (учитывающий мутации типа замены оснований) и в условиях действия (+МА) без (-МА) индуцированной Соволом или метилхолантреном системы метаболической активации

ксенобиотиков из печени взрослых крыс самцов (система цитохрома Р-450, Б9 фракция). В присутствии Б9 фракции (+МА) на используемых штаммах определяли активность непрямых мутагенов (промутагенов).

Дозиметрия тканей рыб проводилась на базе НПО "Зиверт" (генеральный директор И.Н. Рябов) в с.с. Ораное и Страхолесье сотрудниками Чернобыльской экспедиции РАН.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью метода Стъюдента по программе Statgraf. Количество измерений (п) в каждом эксперименте приведено в графитах и таблицах.

Результаты и обсуждение

Биохимический мониторинг пресноводных экосистем на основе цитохрома Р-450

Анализ отклика первой фазы системы детоксикации (монооксигеназная система окисления, состоящая из электронтранспортной цепи, основным компонентом которой является цитохром Р-450) проводили на рыбах озера Байкал и Рыбинского водохранилища.

Обнаружено, что уровень содержания цитохрома Р-450 и монооксигеназных акивностей в микросомной фракции рыб озера Байкал зависит от вида и пола рыб, периода их отлова (измерения проводили в июне, августе сентябре, октябре) и существенно не связан с местом их обитания (отлов производили в центральной и южной части Байкала). Наибольшие концентрации цитохрома Р-450 зарегистрированы в печени омуля и хариуса, наименьшие - в микросомах печени бычков -эндемиков Байкала (Таблица 1). Исследования уровня монооксигеназных активностей в течение длительного периода времени не выявили достоверных отличий в уровне ЕСОБ и ЕТЮВ в микросомах печени рыб, отловленных в центральной части Байкала и в непосредственной близости от сброса сточных вод БДБК (в каждом опыте использовали не менее 7 самцов или самок в возрасте 3 лет) (Рис. 1). В микросомной фракции всех видов исследованных рыб оз. Байкал возможна индукция монооксигеназных активностей (МОА) инъекцией метилхолантрена (МС), Арохлора, Совола или р-нафтофлавона. Индукция происходит и при затравке рыб сточными водами БЦБК, но достоверные отличия наблюдаются лишь после месячной инкубации рыб в очищенных стоках с концентрацией, превышающей 20 % (Рис. 1).

Ни в одном из случаев не была зарегистрирована индукция активностей других компонентов детоксицирующей системы -НАДФ(Н)цитохром Р-450 редуктазы и цитохрома в5

В работах Дж. Стегемана (Stegeman, 1993, 1995 ) была показана возможность ингибирования индукции EROD и ECOD активностей в печени рыб за счет токсичности содержащихся в экосистемах компонентов. Однако в этих случаях удавалось обнаружить присутствие индуцированной формы цитохрома Р-450IAI с помощью иммуноблотинга.

В норме в печени байкальских рыб не регистрируется эта изоформа цитохрома Р-450; введение соответствующих индукторов или содержание рыб в разбавленных стоках (20%) на протяжении месяца приводит к синтезу этого фермента de novo.

Таким образом, проведенные работы не выявили существенного влияния сточных вод БЦБК на индукцию изоформ цитохрома Р-450 или его монооксигеназных активностей. Однако, учитывая возможность индукции цитохрома P-450IAI и его активностей сточными водами, считаем целесообразным проводить мониторинг в месте их выброса. Для проведения такого вида мониторинга наиболее целесообразно использовать немигрирующих и обитающих как в местах сброса сточных вод, так и во всех прибрежных водах Байкала бычка подкаменку и бычка желтокрылку.

В отличие от результатов, полученных на Байкале, в исследованиях сточных вод целлюлозно-бумажного комбината на озере Саимаа (центральная Финляндия), проведенных совместно с профессором университета г, Куорио P. Lindstrôm-Seppa, была выявлена индукция монооксигеназ. При этом наблюдали увеличение содержания общего пула цитохрома Р-450, появление изоформы P-45QIAI и индукцию монооксигеназных активностей как в 20-и дневном эксперименте при затравке радужной форели сточными водами в разведении более 10%, так и в опытах in vivo. В последнем случае форель (по 10 особей в возрасте 1 года) помещали в садки в непосредственной близости от выброса сточных вод и на расстоянии 500, 1000, 5000 и 10000 м. Достоверное увеличение активности EROD (р< 0,05) было зарегистрировано на расстоянии до 5 км. (Lindstrâm-Seppa, 1990). При этом в экстрактах из тканей рыб были обнаружены в тесте Эймса мутагенные соединения.

Таблица 1. Содержание цитохромов Р-450 и в5 в микросомной фракции печени рыб озера Байкал (самцы в возрасте 3 лет)

Вид рыбы Цит. Р-450 (контроль.) Цит. Р-450 + (МС-20 мг кг"1) Цит. Р-450 + (МС-80 мг кг"1) Цит. в5

(нмоль - мг"1 белка микроеом)

Омуль п=15 0.37 ± 0.07 0.77 ± 0.11 0.58 ± 0.09 0-42 ± 0.05

Хариус п=15 0.32 ± 0.07 0.67 ± 0.09 0.51 ± 0.07 0.40 ± 0.06

Сиг п=12 0.28 ± 0.06 0.51 ± 0.09 0.40 ± 0.08 0.35 ± 0.07

Ленок п=15 0.24 ±0.05 0.48 ± 0.06 0.32 ± 0.06 0.34 ± 0.04

Окупь п= 13 0.19 ± 0.07 0.42 ± 0.08 0.37 ± 0.07 0.31 ± 0.06

Плотва п=14 0.18 ± 0.05 0.41 ± 0.06 0.39 ± 0.05 0.29 ± 0.007

Бычок желтокрылка п=21 0-12 ± 0.03 0.29 ± 0.05 0.19 ± 0.05 0.21 ± 0.05

Бычок подкамепка п=21 0.11 ± 0.02 0.32 ± 0.05 0.18 ± 0.05 0.22 ± 0.04

Рис.1. Активность ЕССЮ в печени бычков (1), хариусов (2) и омулей(3, 4), отловленных в районе выпуска сточных вод БЦБК (3), острова Ольхон (4) в августе 1983-1993 гг.. I, II - Затравка рыб сточными водами БЦБК в разведении 1:20 и 1:5 соответственно. МС - инъекция метилхолантрена. (I, II, МС р<0. 001)

Время отлова (год) п > 7 для каждого измерения 1, 2, 3, I, И, МС р < 0.05 3, 4 р >0.01

Тест-системы на основе индукции изоформ цитохрома Р-450 в микросомной фракции печени рыб можно успешно использовать не только для анализа сточных вод предприятий целлюлозно-бумажной промышленности.

Мы проводили анализ индукции монооксигеназных активностей в микросомах лещей (самцы в возрасте 3 лет) из Рыбинского водохранилища, отловленных в его различных районах. Было показано, что уровень индукции монооксигеназ существенно зависит от места вылова рыбы и соответветствует содержанию в воде и донных отложениях ксенобиотиков (в первую очередь полихлорированных бифенилов). При этом максимальный уровень цитохрома Р4501А1 в микросомах печени лещей был зарегистрирован в наиболее загрязненных районах, что, однако, не соответствует максимальному уровню ЕССЮ (Рис. 2). Эти результаты полностью согласуются с исследованиями, проведенными Дж. Стегеманом на печени морских рыб

(31с^стап, 1993, 1995). Кроме этого было обнаружено, что характер индукции монооксигеназных активностей зависит от времени вылова рыб (весной уровень активности достоверно ниже, чем осенью). Полученные результаты позволяют проводить биохимический мониторинг Рыбинского водохранилища и свидетельствуют о существенном влиянии выбросов Череповецкого металлургического комбината и сточных вод города Череповец на этот водоем.

Таким образом на примере мембранных систем эндоплазматического ретикулума рыб хорошо видно, что в качестве отклика на загрязнение водоемов происходит индукция активности монооксигеназ за счет синтеза изоформ цитохрома Р-450. В настоящее время биохимический мониторинг морских и пресноводных экосистем на основе индукции монооксигеназных активностей проводится во многих странах (США, Канада, Япония, страны ЕС)

Индукция монооксигеназных активностей печени может происходить не только у рыб, но и в мембранах эндоплазматического ретикулума других животных. Особый интерес в этом смысле представляют рыбоядные птицы, которые занимают конечные звенья пищевой цепи морских биоценозов.

Рис. 2 Содержание цитохрома Р-4501А1 и этоксикумарин-диэтилазная активность в микросомах печени лещей из загрязненных (Торово, Любец) и условно контрольных районов (Мякса, Брейтово) Рыбинского водохранилища (Каждой точке не мене 10 рыб, самцы трехлетки ) * р <0.05 , * * р<0.001

40

Р4501А1 (нмоль/мг белка )

ГНОП (нмоль/мг белка/мин)

8

30

20

10

о

6

4

о

2

Торово Любец Мякса Брейтово

Станции аР-4501Л1 ВИЕКОО

Помимо ферментов моноокситеназной системы в детоксикации ксенобиотиков в тканях птиц существенное участие принимают и, так называемые, ферменты И-ой фазы детоксикации, осуществляющие реакции конъюгации. В общем виде, электрофильные интермедиаты, продуцируемые в ходе монооксигеназных реакций, являются субстратами глутатион S-трансферазы (GST) и в ходе реакций конъюгации с глутатионом превращаются в безвредные продукты. GST также способна необратимо (ковалентно) связывать различные ксенобиотики, являясь, таким образом, белком-нейтрализатором или транспортным белком. GST печени птиц, по-видимому, играет ключевую роль в защите тканей от электрофилов и других соединений, повреждающих клетку. К сожалению данных об активности этого фермента в тканях рыбоядных птиц очень немного.

Таким образом, исследование активности GST в тканях птиц, особенно в сочетании с изучением других ферментов детоксикации (монооксигеназная система, эпоксидгидролаза и др.), является необходимым шагом в понимании природы различных патологий, вызываемых ксенобиотиками в их тканях.

Среди других ферментов детоксикации в печени важную роль играет УДФ-глюкуронозилтрансфераза (UDP), осуществляющая конъюгацию ксенобиотиков с УДФ-глюкуроновой кислотой. Важность этого фермента подчеркивается и тем, что он принимает участие в метаболизме таких эндогенных соединений как билирубин, тироксин, тетрагидрокортизол, стероидные гормоны.

Были проведены исследования этих ферментов и активностей изоформ цитохрома Р-450 в печени моевок {Rissa tridactila ) на птичьем базаре острова Хурноя (северная Норвегия). Измерения проводили как в норме, так и после инъекции птицам ксенобиотиков МС и ДДТ (см. раздел "Материалы и методы"). Параллельно в тесте Эймса исследовали содержание в тканях этих птиц и в некоторых других компонентах экосистемы острова Хурноя мутагенных и канцерогенных соединений. Тест позволяет не только регистрировать мутагенные соединения, но определять характер их метаболической активации в мембранных системах цитохрома Р-450.

Результаты исследования мутагенности экстрактов образцов, отобранных на острове Хурноя в северной Норвегии, представлены на Рис. 3.

Рис. 3. Доля проб, отобранных на побережье острова Хурноя, проявивших мутагенный эффект в тесте Эймса (% контроля)

1 -

Водоросли (Lamina-ria saccharina, Fucus vesiculosus ), n=29, 2. Моллюски (Mytilus edulis, Littorina lit-torea ), n= 31 Рыба (Мышцы) мойва (Mallotus villosus ) и треска (Gadus morhua rnorhua), (n=17) 4. Мышцы моевок

(n=ll) Мышцы птенцов моевок (n=10) Яйца моевок (п=17)

6

5

6

В пробах воды не обнаружено мутагенного эффекта ни на одном из тестерных штаммов. В водорослях также практически не накапливаются генотоксические соединения. Только несколько проб, отобранных возле причала, проявили слабый прямой мутагенный эффект типа сдвига рамки считывания, который полностью устраняется системой метаболической активации, используемой в тесте (Рис. 3). Экстракты тканей бокоплавов, напротив, проявили непрямой мутагенный эффект типа замены оснований, но также лишь в одном из вариантов опыта (данные не приводятся).

Моллюски являются сильными аккумуляторами генотоксических соединений, что определяется особенностями их образа жизни и метаболизма. Однако наше исследование не выявило значительного накопления мутагенных ксенобиотиков в моллюсках. Несколько проб гастропод обнаружили прямой мутагенный эффект на штамме сальмонеллы ТА 98.

Таким образом, можно сделать выводы, что в начальных звеньях исследуемой пищевой цепи не происходит существенного накопления генотоксических соединений, регистрируемых в тесте

Эймса. Можно предположить, что ксенобиотики накапливаются в исследуемых организмах в количестве, не достаточном для регистрации в используемой тест-системе, однако при передаче по пищевым цепям происходит их концентрирование.

Действительно, у мойвы в мышцах аккумулируются прямые мутагены (штамм ТА 98, -МА), однако система метаболической активации полностью устраняет проявляемый мутагенный эффект.

В мышцах трески и мойвы (рыба была взята из гнезд в момент кормления птенцов) была обнаружена слабая прямая и промутагенная активность типа сдвига рамки считывания (штамм ТА 98: -МА, +МА); в печени - мутагенные соединения обоих типов, причем в одной из проб мутагенное действие проявлялось только после метаболической активации.

В контрольной группе взрослых птиц (экстракты тканей мышц) обнаружен прямой мутагенный эффект типа сдвига рамки считывания (ТА 98, - МА). В шести из этих случаев метаболическая активация снижала или даже устраняла обнаруженный эффект, однако 4 пробы проявили и промутагенный эффект того же типа (ТА 98, + МА). На штамме сальмонеллы ТА 100 было зарегистрировано больше промутагенных соединений (+МА), проявлявших мутагенный эффект только после взаимодействия с системой метаболической активации, и только один экстракт обладал слабым прямым мутагенным действием ( -МА).

Мышцы птенцов накапливают существенно меньшие количества генотоксических соединений (Рис. 3).

Яйца моевок сравнимы по степени аккумуляции ксенобиотиков с мышцами птенцов.

Таким образом, из анализа представленных данных можно заключить, что аккумуляция ксенобиотиков, проявляющих мутагенный эффект в тесте Эймса происходит по пищевым цепям. В экстрактах тканей животных и растений, представляющих нижние звенья пищевой цепи, в данном исследовании не удалось выявить значимого накопления мутагенных ксенобиотиков. Если в воде они вовсе не были зарегистрированы, то в некоторых экстрактах водорослей, моллюсков, бокоплавов, полихет и мойвы наблюдается уже слабое накопление мутагенов. В исследованных экстрактах мышц трески и мойвы аккумуляция генотоксических соединений происходит уже в значительной части проб.

В мышцах моевок, питающихся рыбой и занимающих высший трофический уровень, происходит уже заметное накопление мутагенных ксенобиотиков (в 10 из 11 исследованных проб обнаружены мутагены того или иного типа).

В мышцах птенцов, аккумуляция мутагенов незначительна. По-видимому, генотоксические соединения поступают с пищей в довольно низких концентрациях и для их накопления в мышцах необходим более длительный период времени (Рис- 3). Естественно, следует рассматривать возможность накопления птицами мутагенных соединений не только непосредственно на птичьем базаре, но и в местах, где они питались до перелета к месту гнездовья.

С целью исследования характера детоксикации мутагенных соединений птицам вводили индуктор монооксигеиазной системы -МС. Инъекция МС вызвала небольшое снижение количества мутагенов в экстрактах тканей мышц, проявляющих промутагенную активность на обоих штаммах. Относительное количество выявленных прямых мутагенов практически не изменилось. По-видимому, это связано с тем, что введение индуктора вызывает активацию системы цитохрома Р-450 и усиленную трансформацию ксенобиотиков в печени моевок

В целом можно отметить, что введение индукторов монооксигеназ не оказывает заметных изменений в накоплении генотоксических ксенобиотиков мышцами моевок на протяжении 2 суток, но приводит к существенному увеличению активности ферментов детоксикации.

Аккумуляция мутагенных соединений в тканях рыб и животных связана с активностью системы их детоксикации и метаболической активации. Микросомная система печени рыб менее активна по сравнению с моевками. Уровень содержания цитохрома Р-450 в микросомах печени трески и мойвы был примерно одинаков и изменялся от 0. 17 до 0. 22 нмоль/мг белка микросом, в то время как в печени моевок концентрация цитохрома Р -450 выше почти в двое.

Содержание цитохром Р-450 и уровень монооксигеназных активностей в микросомной фракции исследованных птиц незначителен, однако МС вызывает существенную индукцию монооксигеназ (Таблица 2).

Таблица 2. Содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени моевок в норме и после индукции 3-метилхолантреном (+ МС): 40 мг на кг веса, одноразовая иньекция, анализ через 48 часов.

Самцы Самцы +МС Самки Птенц ы

Цит. Р-450 (нмояь X мг"1 белка микросом) 0.26 ± 0.11 0.55 ± 0.13 0.36 ± 0.09 0.14 ± 0.8

В норме в микросомной фракции печени моевок активность монооксигеназ незначительна, особенно низок уровень монооксигеназ и монооксигеназной активности во фракции печени птенцов. Однако, учитывая хорошую индукцию монооксигеназ, возможно использовать этих птиц для проведения мониторинга морских экосистем. Мы планируем продолжение этих исследований.

Таблица 3. Активность 7- этоксикумариндиэтилазы (ECOD) и 7-этоксирезоруфин-О-диэтилазы (EROD), UDP-глюкуронилтранс-феразы (UDP - GS) и глюкуронил -S-трансферазы (GST) в печени микросом моевок.

Лкивыосгь Самцы Самк Птенцы Самцы + ксенобиотик

ферментов

(нмоль /мг ДДТ ддт+м МС

белка мин.) с

ECOD 0.18+ 0.16± 0.09+ 0.25+ 1.79± 1.95+

0.22 0.021 0.024 0.027 0.196 0.209

EROD 0.28+ 0.24+ 0.17± 0.31± 1.8+ 2.71+

0.023 0.035 0.019 0.037 0.187 0.192

UDP-GS 52.8+ 51.2+ 32.1± 47.2± 142+ 165+

8.1 9.2 8.3 11.1 13.7 21.1

GST 287± 288± 192+ 272± 355+ 372±

17.1 20.1 19.9 20.9 33.5 35.7

В микросомной фракции птиц ферменты конъюгации также достаточно активны, хотя менее эффективно индуцируются МС .

В эксперименте птицам вводили не только МС но и ДДТ (2 мг/кг веса). В этой концентрации ДДТ не приводил к гибели птиц и не вызывал индукции монооксигеназ, однако при совместном

введении ДДТ и МС снижался уровень индукции монооксигеназ, вызванный, по-видимому, его токсическим действием. Кроме этого, инъекция ДДТ приводила к интенсификации неферментативного перекисного окисления липидов в микросомах печени моевок.

Таким образом в печени моевок достаточно активно функционируют как ферменты системы цитохрома Р-450, так и ферменты второй фазы детоксикации (Таблица 3). По-видимому, уровень накопления ксенобиотиков в печени моевок может зависеть от активности этих ферментов.

Активность ферментов детоксикации и способность этих ферментов к индукции возрастает по мере эволюционной продвинутости вида. Так, например, у водорослей ферменты, участвующие в окислении ксенобиотиков (пероксидаза, система цитохром Р-450), обладают низкой активностью. В тканях моллюсков и полихет детоксикация осуществляется в основном ферментами второй фазы. В тканях рыб как ферменты системы цитохрома Р-450, так и ферменты конъюгации уже достаточно активны и хорошо индуцируются.

Рыбоядные птицы, представляющие конечное звено пищевой цепи прибрежных экосистем, имеют полный набор ферментов детоксикации и метаболической активации и, несмотря на это, именно в их тканях происходит максимальное накопление мутагенных и канцерогенных соединений.

В тесте Эймса с системой метаболической активации из печени крыс, индуцированных Соволом, часть этих соединений детоксицируется. Это свидетельствует о том, что, несмотря на высокий уровень индукции, монооксигеназные системы птиц в норме не могут осуществить метаболизм всех поступающих в их ткани ксенобиотиков.

Зарегистрированное нами накопление мутагенных соединений в тканях моевок говорит об опасном уровне присутствия мутагенных и канцерогенных ксенобиотиков в их тканях и о возможной опасности для экосистемы дальнейшего загрязнения прибрежных вод мутагенными и канцерогенными соединениями.

Липиды мембран зндоплазматического ретикулума рыб и птиц в норме и под воздействием полициклических углеводородов и лолихлорированных бифенилов

Изоформы цитохрома Р-450 способны к индукции в микросомной мембране и их функции существенно зависят от липидного окружения. Липиды холоднокровных животных весьма лабильны, их фосфолштидный состав меняется как в зависимости от воздействия природных факторов внешней среды (сезонности, температуры), так и от присутствия в водных экосистемах ксенобиотиков (Сидоров, 1983). С этих позиций были проведены исследования изменений фосфолипидного и жирнокислотного состава в микросомной фракции печени рыб в норме и после инъекции индукторов монооксигеназ. Параллельно изучали модификацию активности фоефолипазы А2 и характер перекисного окисления липидов.

Фосфолипидный и жирнокислотный состав микросом печени зависит от вида рыб. Инъекция байкальским рыбам индукторов монооксигеназ - МС, Р-нафтофлавона, Арахлора 1254 или Совола приводит, наряду с регистрируемым с помощью электронной микроскопии ростом объема мембран зндоплазматического ретикулума, к увеличению количества мембранных липидов на единицу белка микросом (у теплокровных животных этот процесс носит противоположный характер). При этом МС и р-нафтофлавон, как наиболее сильные индукторы, вызывают максимальное увеличение количества мембранных липидов.

Интересно, что в микросомах печени бычка желтокрылки и бычка подкаменки по сравнению с микросомами других байкальских рыб (сиг, омуль, хариус) и карпа как в контроле, так и после индукции значительно повышен уровень суммарных фосфолипидов, отнесенных к мг белка микросом печени.

Исследование изменеий фософолипидного состава микросом после инъекции индукторов обнаружило другую особенность мембранных липидов микросом у бычка-желтокрылки. Индукция монооксигеназ снижает содержание

полифосфоинозитидов (ФИ) в микросомах печени бычка желтокрылки в отличие от других рыб (хариус, омуль, щука, окунь, ленок), у которых, наоборот, относительное количество ФИ увеличивается на 15-25%. В липидном составе микросом печени карпа после инъекции индукторов монооксигеназ так же, как и в микросомах бычка-желтокрылки уменьшается доля

полифосфоинозитидов на 29 - 30 % по сравнению с уровнем ФИ в микросомной фракции печени контрольных рыб.

Индукция монооксигеназ как полихлорированными бифенилами, так и полициклическими углеводородами приводит к модификации фосфолипидного состава микросом печени рыб. Происходит увеличение содержания фосфатидилхолина, фосфатидил-этаноламина, сфингомиелина при одновременном уменьшении доли нейтральных липидов - холестерина, глицеридов (НЛ), однако эти изменения незначительны. (Рис. 4).

Рис.4 Фосфолипидный состав микросом печени байкальских рыб в норме и после индукции монооксигеназ метилхолантреном (МС) и Арахлором.

РН - фосфатидилхолин, РНЕ - фосфатидилэтаноламин, N1.-нейтральные липиды, ЬРЬ -лизофосфолипиды, Р8 фосфатидилсерин

Хариус

ТКутаИш агсЫсш Ъагса1еп&18

КОНТРОЛЬ МС АРАХЛОР 1254

■ 1_Р1_ ОРБ ЕЯРН ВРЕД ЕШЫ!.

Рис. 4 (Продолжение)

Омуль

Согедопив аъйотпаИэ тгдгаЬопиз

ГЕА 20.36

КОНТРОЛЬ РН 32.94

мс

34.24

РБ 5.39 ХРЬ 0.29 19 05

АРАХЛОР 1254

22.54

34.58

1ЧЬ 40.84

39.22

37.12

Быяок желтокрылка

СоиосотерКогиз дгеттвку

КОНТРОЛЬ

мс

АРОХЛОР 1254

ГЕА 15.76

РН 24.5

7.57

№ 55.32

28.66

20.38

48.11

■ 1-Р1_ ПРв ЕЯРН ИРЕА 53141.

Рис. 4 (Продолжение)

КОНТРОЛЬ

Карп

Cyprinus carpió

мс

АРОХЛОР 1254

РП 50.51

РЕА 26.46

17.49

-10.35 1-0.45

24.32

19.62

В смесях метилированных жирных кислот микросомных липидов было зарегистрировано более 30 жирных кислот с числом атомов углерода от 12 до 24. Липиды эндоплазматического ретикулума рыб отличаются большим разнообразием полиеновых жирных кислот, составляющим более 40% от их суммы. При этом более 80% из них падает на долю 18:2ш6, 18:ЗюЗ, 20:4со6, 20:5соЗ, 22:5®3 и 22:6юЗ. Среди моноеновых кислот наиболее часто встречаются жирные кислоты 16:1ю7, и 18:1ш9, количество которых существенно не зависит от вида рыбы и составляет около 20%.

Для липидов микросом печени бычка желтокрылки характерно более высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот (около 60%), в то же время доля насыщенных жирных кислот составляет всего 19%.

В процессе индукции монооксигеназ как полихлорированными бифенилами, так и полициклическими углеводородами происходит изменение содержания отдельных классов жирных кислот, которое варьирует в зависимости от вида рыб. Однако, за исключением бычка желтокрылки, для всех исследованных видов характерно достоверное возрастание доли моноеновых жирных кислот при суммарном снижении количества полиненасыщенных жирных кислот на 15-30% (р<0.001)

(Рис.5) Жирнокислотный состав микросом печени карпа и бычка желтокрылки в норме и после индукции монооксигеназ. (Самцы в возрасте 3 лет, в каждой группе по 7 рыб, * р < 0.001)

% контроля

Кара Карп+МС Бычок Бычок+МС

Ненасыщенные Мопоевовые Полиеновые

100 116 100 101

100 141 100

58

□Карп ■Карп+МС ШБычок ■Бычок+МС

Жирные кислоты

У бычка желтокрылки при введении индукторов наблюдается снижение примерно на 40% моноеновых жирных кислот по сравнению с контролем за счет падения доли пальмитиновой и олеиновой кислоты (Рис. 5).

Изменения жирнокислотного и фосфолипидного состава микросом печени рыб при введении индукторов монооксигеназ может быть связано, во-первых, с модификацией перекисного окисления липидов, во-вторых, с активацией эндогенных фосфолипаз, а в-третьих, с нарушением синтеза фосфолипидов.

Было проведено исследование степени доступности мембранных фосфолипидов для фосфолипазы А^ и уровня перекисного окисления липидов (МДА) в микросомной фракции печени рыб. Обнаружено, что активность ферментативного перекисного окисления в мембранах печени рыб значительно ниже, чем в мембранных структурах печени теплокровных животных, несмотря на то, что в фосфолипидах рыб содержится значительно больше ненасыщенных жирных кислот. Таким образом низкий уровень липопереокисления в микросомной фракции рыб связан не с субстратной специфичностью, а со слабой генерацией активных форм кислорода НАДФ(Н).

зависимыми цепями переноса электронов в микросомах печени рыб.

Исследования показали, что индукция монооксигеназ в печени хариуса сохраняется на протяжении длительного периода времени и сопровождается снижением уровня диеновых конъюгатов, шифовых оснований и малонового диальдегида (МДА) (Рис. 6). При этом МС вызывает наибольшее снижение содержания липоперекисей в момент максимальной индукции монооксигеназ.

Рис. 6. Бенз(а)пиренгидроксилазная активность (АНН) и содержание малонового диальдегида (МБА) в микросомах печени

В отличии от микросомной фракции печени крыс (Каган, Котелевцев и др., 1974), мы не наблюдали существенного роста уровня липопереокисления в момент "разборки" мембран эндоплазматического ретикулума печени после индукции монооксигеназ. Тем не менее полученные результаты позволяют предположить, что липопереокисление может участвовать в регуляции монооксигеназных активностей в печени рыб и в обновлении мембранных фософолипидов. С другой стороны, судя по тому, что в момент индукции происходит снижение количества продуктов окисления липидов можно предположить, что липопереокисление не играет существенной роли в модификации фосфолипидного состава при индукции монооксигеназ.

Активация фосфолипаз, по мнению ряда авторов, является одним из основных факторов модификации липидного состава при адаптации рыб к условиям окружающей среды. Мы исследовали доступность микросомных липидов карпа к действию фосфолипазы А2 (0.175 е.а. мг1 белка микросом) в норме и после индукции монооксигеназ МС. Параллельно исследовали инактивация монооксигеназных актвностей лизофосфолипидами. Индукция in vitro экзогенной фосфолипазой А2 гидролиза фософолипидов в микросомах рыб существенно отличается от этого процесса в мембранах эндоплазматического ретикулума крыс как в норме, так и при индукции монооксигеназ МС. Было обнаружено, что гидролиз фософолипидов в микросомах карпа происходит значительно более интенсивно, чем в микросомах контрольных крыс (Таблица 4). Это может объясняться присутствием значительно большего количества полиненасыщенных жирных кислот в составе фософолипидов эндоплазматического ретикулума печени рыб.

Таблица 4. Гидролиз фосфолипидов микросом печени карпа и крысы фосфолипазой А2 в норме и после индукции монооксигеназ 3-метилхолантреном._

Вид животного Содержание фосфолипидов (мг мг1 белка) Продукты гидролиза фосфолипидов (мкг мг-1 белка) Глубина гидролиза (%)

Свободные yivxV ЛФЛ

Карп 0.66 ± 0.07 46.51 ± 2.05 84.04 ± 3.53 12.7 *

Карп + МС 0.71 ± 0.06 58.56 ± 0.88 107.08 ± 0.59 15.0 *

Крыса 0.46 + 0.03 13.04 ± 1.50 22.62 ± 2.30 5.0 **

Крыса + МС 0.42 + 0.02 62.52 ± 1.50 105.55 ± 0.90 25.0 **

* р<0.05, **р<0.001

Несмотря на то, что, как было показано выше, фосфолипидный и жирнокислотный состав микросом печени рыб модифицируется введением МС, этот процесс практически не влияет на глубину гидролиза.

Таким образом, присутствие ксенобиотиков в тканях рыб не только приводит и индукции монооксигеназ, но и стабилизирует мембранную систему эндоплазматического ретикулума, что, по-видимому, является одним из факторов биохимической адаптации холоднокровных организмов к воздействию факторов окружающей среды.

Отклик мембран эритроцитов пресноводных рыб на воздействие ксенобиотиков и радионуклидов.

Мембраны форменных элементов крови являются одной из основных мишеней для гидрофобных ксенобиотиков и радионуклидов. Механизмы трансмембранного переноса одновалентных ионов лучше всего исследованы у теплокровных животных, где кроме Ыа+,К+-насоса (Иа+,К+АТФ-аза, осуществляющая активный транпорт) идентифицирован набор переносчиков, обеспечивающих облегченную диффузию ионов натрия, калия и анионов. Показана возможность модификации ионного гомеостаза при ряде патологических состояний в крови теплокровных животных (Ог1оу, 1994).

Мы исследовали активность ионтранспортирующих систем в эритроцитах пресноводных рыб и механизмы гормональной регуляции этих процессов в условиях стресса и под воздействием ксенобиотиков и радионуклидов.

Ыа+,К+-насос эритроцитов леща и карпа неодинаково реагирует на стрессирующие воздействия. У леща его скорость достоверно постоянна в любых условиях (Таблица 5), тогда как у карпа после травмирующего вылова она в 6 раз выше, чем после адаптации (р<0,01) (Рис. 7).

Разница в реакции Ма+,К+-насоса на острый стресс у леща и карпа вызвана, по нашему мнению, различиями в механизмах регуляции этого переносчика, разной структурной устойчивостью мембран эритроцитов, а также особенностями нейрогуморальной регуляции ионного транспорта в эритроцитах этих видов рыб при стрессирующем воздействии.

Известно, что при стрессе у рыб даже в самые ранние сроки происходят нарушения нормального баланса электролитов между плазмой и клетками крови (Магеаипс! е! а1., 1977; Запруднова, 1989). Поэтому при искусственной инкубации эритроцитов, взятых у стрессированных рыб, могут регистрироваться более высокие скорости работы Ма+,К+~насоса по сравнению с контролем. Однако сомнительно, что даже очень существенные нарушения проницаемости мембраны при сохранении жизнедеятельности клетки могут привести к увеличению активности переносчика в 6 раз.

Карп значительно менее чувствителен к вылову и транспортировке, что подтверждается значительно меньшим его отходом при этих операциях. Возможно, что на протяжении многовекового искусственного разведения карп выработал

Таблица 5. Транспорт ионов (ммоль/л клеток ч.) и его гормональная регуляция в эритроцитах леща в условиях общего адаптационного синдрома (М± ш).

Система транспорта. ингибитор иасос, 0,2 мМ, уабаин Котрапспорт, 0,5мМ, фуросемид Неиигиб. вход 8еКЪ

Группы рыб «Без норадреналина 2> +10"6 мМ норадрспалшга !)Без норадреналина 2) +10-6 мМ норадревалипа !)Без норадреналина 2) +10-6 мМ порадревалин а

Контроль (вентеря) 1'4,33 ± 0,6 2)14,74 ± 1,2** 0,13 ± 0,03 0,201 ± 0,02

Контроль (невод) 1,85 ± 0,2 4,06 ± 0,8 0,22 ± 0,05 0,43 ± 0,2 0,204 ± 0,03

Щадящий лов;15 суток выдержки 1,73 ± 0,6 1,46 ± 0,9 0,88 ± 0,4* 1,45 ± 0,2** 0,72 ± 0,02* 1,24 ± 0,2*

Щадящий лов; 20суток выдержки 2,93 ± 1,5 3,13 ± 1,6 0,46 ± 0,3 0,80 ± 0,5 0,48 ± 0,2 1,42 ± 0,6*

Щадящий лов, 25 суток выдержки 1,38 ± 1,0 2,25 ± 1,3 0,61 ± 0,3* 1,17 ± 0,6* 0,64 ± 0,3* 1,87 ± 0,4**

Травмирующий лов; 15 суток выдержки 2,00 ± 0,4 1,98 ± 0,2 0,69 ± 0,3* 1,29 ± 0,4* 1,31 ± 0,2** 2,18 ± 0,2**

* — р<0,05; ** — р<0,01.

генетически-закрепленные механизмы адаптации к резким изменениям условий среды, в число которых, вероятно, и входит увеличение активности Ш+,К+-насоса при стрессе.

Относительный вклад Ыа+,К+-насоса в общий вход 86ЙЬ в эритроциты леща снижается прямо пропорционально степени стрессирующего воздействия на рыбу. Если в контрольных группах его доля колеблется в пределах 89-92 %, то после выдерживания в садках - уже 52-76 %, а после 15-дневного

выдерживания рыбы, травмированной в трале, - вообще только 50% (Таблица 5).

Рис. 7. Активность ионтранспортирующих систем (ммоль/л ч) в норме и при р-адренергической активации (норадреналин 10~6 М, форосколин 10~4 М) в эритроцитах карпа при остром стрессе вылова и 2-х недельной адаптации.

I. Ыа+,К+-насос. 2. №+,К+насос + норадреналин (ИА). 3. Ка+,К+насос + форсколин. 4. Котранспорт. 5 Котранспорт + МА; 6. Пассивный транспорт 7. Пассивный транспорт + NA _ * - р< 0.05 , * *- р £ 0.01_

Снижение относительного вклада Ыа+,К+-насоса в общий вход 86ИЬ происходит по причине значительного увеличения Ш+,К+,2С1-- и К+,С1"-котранспорта в клетку, а также за счет увеличения активности неидентифицированных систем облегченной диффузии калия. Так, у рыб, выдержанных в садках, котранспорт в 3-4 раза выше, чем "в норме" (р<0,05) (р<0,01). Неингибируемая уабаином и фуросемидом компонента входа 88НЬ в эритроциты у лещей, пойманных щадящим орудием лова и выдержанных 15-25 дней в садках, возрастает в 2-4 раза по сравнению с контролем (р<0,05), а у рыб, травмированных

тралом, после 15-дневной экспозиции - в 6-10 раз (р<0,01) (Таблица 5).

Уровень Na+,K+,2CI~- и К+,С1"-котранспорта в клетку у адаптированных карпов в 1,5-2,0 раза ниже, чем при остром стрессе (р<0,05). При добавлении в среду инкубации норадреналина скорость работы этих систем в обоих группах рыб достоверно не различается. Активность неингибируемых фуросемидом систем облегченной диффузии калия также в 2,0 раза ниже в группе адаптированных рыб (р<0,01). Эта картина наблюдается и в присутствии норадреналина (р<0,05) (Рис. 7).

Гормональная регуляция Na+.K+-Hacoca.

Нам удалось продемонстрировать, что в отличие от теплокровных животных в ядерных эритроцитах рыб Na+,K+-насос увеличивает свою активность при действии агонистов ß-рецепторов, в том числе норадреналина. Так осуществляется гормональная регуляция ионного гомеостаза в клетках крови рыб. В эритроцитах леща и карпа "в норме" при добавлении в среду инкубации норадреналина скорость работы Na+,K+-Hacoca возрастает в 1,5-3 раза (Рис. 7). Однако в эритроцитах леща, содержащихся после вылова в искуственных условиях, в первые 2-2,5 недели теряется способность Na+,K+-Hacoca отвечать на активацию норадреналином in vitro. То-же самое происходит при остром стрессе у карпа (Рис. 7). В эритроцитах лещей гормональный контроль над переносчиком начинает восстанавливаться к концу третьей недели выдерживания и достигает нормальных значений на 25 сутки: активация Na+,K+-насоса составляет уже 62%. Способность Ыа+,К+-насоса эритроцитов карпа отвечать на добавление норадреналина наблюдается уже через две недели адаптации (активность увеличивается в 1,86 раз). Данный процесс восстановления утраченной при остром стрессе функции характеризует, по-видимому, стадию резистентности по Селье.

Факт утраты способности эритроцитов рыб реагировать на гормональные стимулы после острых стрессирующих воздействий ранее описан некоторыми исследователями (Hyde et. al, 1987; Jensen, 1987; Milligan &Wood, 1987), Однако механизмы таких нарушений до сих пор в деталях не изучались.

Полученные к настоящему времени данные позволяют утверждать, что гормональная регуляция систем ионного транспорта в эритроцитах рыб осуществляется через

аденилатциклазную систему при участии р-рецепторов, Од-белков, аденилатциклазы и протеинкиназ, вторичным мессенджером является сАМР.

Нами было установлено, что Ыа+,К+-насос эритроцитов леща и карпа увеличивает свою активность в 1,5-3 раза как при действии агониста Р-рецепторов норадреналина, так и при добавлении в среду инкубации рецептор-независимого активатора аденилатциклазы форсколина. Этот факт помог экспериментально выяснить, связана ли потеря гормонального контроля над Иа+,К+-насосом у стрессированных рыб с модификацией Р-рецепторов или 05-белков, либо она предположительно вызвана снижением активности аденилатциклазы, протеинкиназ или снижением базального уровня сАМР в клетках. На модификацию сродства р-рецепторов или С5-белков могли прямо указать данные о возрастании активности 1<1а+,К+-наеоса при добавлении в среду инкубации форсколина в эритроцитах рыб, утративших гормональный контроль над этим переносчиком. Однако полученные результаты свидетельствуют о том, что потеря гормонального контроля над системой активного транспорта ионов в эритроцитах рыб при стрессе вызвана не подавлением функциональной способности Р-рецепторов или 05-белков, а изменениями в каких-то других элементах аденилатциклазной системы.

Гормональная регуляция систем облегченной диффузии калия.

Как было показано выше, при инкубации эритроцитов, взятых у рыб после острого стресса, регистрируются достоверно более высокие скорости переноса калия через системы облегченной диффузии (уабаин-неингибируемая компонента входа 8бШ>). Однако при добавлении в среду инкубации норадреналина активация этих систем у стрессированных рыб ниже, чем у контрольных.

Так, в эритроцитах леща, Ка+,К+-насос которых не отзывается на добавление норадреналина, активация систем облегченной диффузии калия составляет в среднем 55-84 % по сравнению с 72-142 % У рыб, не потерявших гормонального контроля над Ыа+,К+-насосом.

У карпа при остром стрессе активация котранспорта норадреналином снижается в 1,7 раза, тогда как после адаптации она увеличивается в 1,2 раза (Рис. 7).

Эти данные свидетельствуют о том, что в эритроцитах рыб острый стресс приводит не только к подавлению гормональной регуляции Na+,K+-Hacoca, но и снижает активацию систем облегченной диффузии калия. Не столь значительный характер нарушений в этом случае связан, по-видимому, с тем, что, в отличие от Na+,K+-Hacoca, активация систем облегченной диффузии носит вторичный характер (Bourne & Cossins 1984; Nikinmaa & Huestris 1984).

Таким образом, мы обнаружили значительные изменения ионного транспорта и его гормональной регуляции в эритроцитах рыб в условиях общего адаптационного синдрома.

Ыа+,К+-насос - основная система, поддерживающая фадиент натрия и калия между внутри- и внеклеточной средой. При стрессе происходит увеличение "пассивной" проницаемости мембраны и, как следствие, нарушение баланса натрия и калия между плазмой крови и эритроцитами (Mazeaund et. al, 1977). В эритроцитах леща активность Na+,K+-Hacoca при этом существенно не изменяется. Это, по всей видимости, вызвано потерей гормонального контроля над переносчиком при остром стрессе. В таких условиях адаптивное восстановление ионного гомеостаза клеток затруднено. У лещей, выловленных щадящими орудиями лова, со временем гормональная регуляция Na+,K+-насоса восстанавливается и рыбы адаптируются к искусственным условиям содержания. То же происходит в течение двух недель и у карпов. В отличие от них группа лещей, травмированных тралом, на 20-25 сутки экспозиции полностью погибла. Естественно, что при долговременном "выключении" гормонального контроля над одним из основных механизмов, компенсирующих нарушение ионного гомеостаза клеток, каким является Na+,K+-nacoc, происходит гибель всего организма.

Влияние радионуклидов на ионный гомеостаз эритроцитов пресноводных рыб.

Активность Na+,K+-Hacoca в эритроцитах карпа, инъецированных 1МБк/кг радиоактивного 45Са достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,01). Однако активация переносчика норадреналином в эритроцитах этих рыб подавлена,

она составляет 16 % по сравнению с 94 % в контрольной группе (Рис. 8).

Наиболее вероятной причиной повышенной активности Ыа+,К+-насоса в группе инъецированных радионуклидом рыб, по-видимому, является увеличение пассивной проницаемости мембраны при облучении.

Экспериментально доказано, что нарушение целостности и барьерных свойств мембран эритроцитов теплокровных животных приводит к изменению активности транспортных АТФ-аз, в частности №+,К+-АТФ-азы (Бурлакова и др., 1981; Дворецкий и др., 1987; Древаль, 1992). При инкубации эритроцитов облученных рыб зарегистрированы повышенные по сравнению с контролем значения скорости работы Ыа+,К+-АТФ-азы (Рис. 8). Однако после инъекции 45Са проницаемость для калия мембран эритроцитов карпов опытной

и контрольной групп (фуросемид-неингибируемая компонента выхода 86КЬ) была одинаковой.

Вход Ии 86

II

Инъекции

Рис. 8: Средние значения активности ионтранспортирующих систем (достоверные отклонения обсуждаются в тексте) и его гормональной регуляции норадреналином (10~6 М) в эритроцитах карпов, инъецированных радиоактивным 45Са (1 Мбк/кг) и Соволом-54 (50 мг/кг). Экспозиция 15 суток. 1. Ма+,К+-насос; 2. Ыа+,К+,2С1-- и К+,С1"-котранспорт; 3. Неингибируемый вход абШх__

Более значительные нарушения барьерных свойств мембран эритроцитов наступают в результате достаточно длительной экспозиции в условиях облучения. Так, пассивная проницаемость мембраны для натрия (амилорид-, фуросемид-неингибируемая компонента входа 22Na) в эритроцитах карпов из пруда-охладителя Чернобыльской АЭС в 2-4 раза выше, чем у карпов из пруда-охладителя Шатурской ТЭЦ (см. ниже). Эта картина наблюдается как в присутствии норадреналина в среде инкубации, так и без него.

Карпы, инъецированные 45Са, находились в условиях опыта в течение 15 суток. Несмотря на то, что активность 45Са в организме инъецированных рыб (1 Мбк/кг) в среднем на порядок выше суммарной активности всех радионуклидов на единицу массы в тканях карпов из пруда-охладителя Чернобыльской АЭС в 1986-87 гг. (KuJikov and Ryabov, 1992), пасивная проницаемость мембран их эритроцитов сохранялась в норме (Рис. 8).

Исходя из вышеизложенного можно предположить, что наблюдаемое увеличение активности Na+,K+-nacoca у карпов, инъецированных 45Са, вызвано не возрастанием проницаемости мембраны. Данный эффект, по-нашему мнению, может относиться к числу адаптивных реакций на действие стрессирующего фактора, каким и является облучение.

Регуляция Na+.K+-Hacoca норадреналином в эритроцитах после инъекции карпам радионуклидов .

В эритроцитах карпа в нормальных условиях активность Na+,K+-Hacoca при добавлении в среду инкубации норадреналина существенно возрастает. Так реализуется один из механизмов гормонального контроля за работой этого переносчика. У карпов, инъецированных 1 МБк/кг радиоактивного кальция-45, при добавлении в среду инкубации норадреналина скорость работы Na+,K+-Hacoca в среднем возрастает в 1,2 раза, тогда как у контрольных рыб - почти в 2 раза (различия достоверны) (Рис. 8).

Наблюдаемое снижение активации Na+,K+-nacoca норадреналином у облученных рыб может быть вызвано нарушениями в цепи передачи сигнала через трансмембранные системы. В литературе встречаются данные о высокой радиочувствительности функциональных белков

аденилатциклазной системы. Так, выявлены многочисленные

факты о снижении активности аденилатциклазы, протеинкиназ и базального уровня сАМР при действии различных доз ионизирующих лучей в клетках различных тканей позвоночных и клеточных культурах (Кудряшов и Пархоменко, 1984; Хамидов и др.; 1986, Бездробный и Божок, 1992; Лозинская и др., 1992).

Системы облегченной диффузии калия.

Активация Na+,K+,2C1~- и ингибируемой фуросемидом части К+,С1~-когранспорта норадреналином в эритроцитах инъецированных радионуклидом карпов достоверно не отличается от этого процесса у контрольных рыб (Рис. 8).

Активность неингибируемых фуросемидом систем облегченной диффузии калия как в присутствии, так и без норадреналина в обоих группах рыб достоверно не различается (Рис. 8).

Приведенные данные не позволяют утверждать, что инъекции радионуклида в течение 15-суточной экспозиции приводят к изменениям работы систем облегченной диффузии калия в эритроцитах карпа.

Таким образом, наиболее значительными из выявленных нами нарушений функционирования систем ионного транспорта эритроцитов карпа при внутреннем облучении является модификация работы Na+,K+-nacoca и подавление его активации норадреналином. Системы облегченной диффузии эритроцитов рыб, по-видимому, менее чувствительны к облучению.

Влияние Совола-54 на транспорт ионов и его гормональную регуляцию в мембранах эритроцитов рыб.

Лещу вводили дозы Совола 50, 100 и 150 мг/кг и регистрировали состояние исследуемых систем через 5 и 10 дней экспозиции. Карпа инъецировали в дозе, вызывающей полумаксимальную активацию монооксигеназной системы печени (50 мг/кг). Примененные в опытах концентрации ксенобиотика близки к тем, которые были обнаружены в тканях леща Шекснинского плеса Рыбинского водохранилища близ Череповца, они достигали значений от 2 до 25 мг/кг (Козловская и др., 1990).

Na+,K+-nacoc.

Проведенные исследования не выявили реакции Na+Д4"-насоса эритроцитов леща на введение ПХБ. Это справедливо как

для всех вводимых доз ксенобиотика, так и для разных сроков экспозиции.

В противоположность лещу, введение 50 мг/кг ПХБ карпу после 15-дневной экспозиции вызывает достоверное возрастание скорости работы Ыа+,К+-насоса (р<0,01) (Рис. 8). Такой же эффект наблюдали в эритроцитах карпа, инъецированного 100 мг/кг Совола-54: после недельной экспозиции активность №+,К+-насоса возрастала практически в 2 раза.

Таким образом, существуют межвидовые различия реакции Ка+,К+-насоса леща и карпа на действие ПХБ. Объясняется это, по нашему мнению, тем, что оба вида обладают особенностями реакции на стрессирунмцие воздействия (каким является присутствие в организме ксенобиотика), а также особенностями состава и строения мембран эритроцитов.

Рис. 9: Средние значения активности ионтранспортирующих систем в норме и при [5-адренергической активации (А- без норадреналина, Б-норадреналин Ю-6 М и В-форсколин 10~4 М) в эритроцитах леща, инъецированного Соволом-54. Экспозиция 5 суток;

1. Ка+,К+-насос; 2. Ыа+,К+,2С1-- и К+,С1"-котранспорт; 3. Неингибируемый вход 86Шэ; п — число рыб в группе. Достоверость различий см. в тексте

В эритроцитах леща при введении Совола-54 не происходит угнетения системы гормональной регуляции ^+,К+-насоса (Рис. 9). У инъецированных этим ксенобиотиком карпов наблюдается лишь незначительное подавление активации переносчика норадреналином: активность возрастает в 1,57 раза по сравнению с 1,94 у контрольных карпов (Рис. 8).

Вышеперечисленные факты указывают на то, что ПХБ в используемых нами дозах вызывает лишь незначительные нарушения передачи сигнала через Р-адренергическуго систему на №+,К+-АТФ-азу.

Системы облегченной диффузии калия.

Уровни Na+,K+,2Cl~- и К+,С1~-котранспорта в эритроцитах леща и карпа, инъецированных Соволом-54, от контрольных значений достоверно не отличаются.

Однако при добавлении в среду инкубации норадреналина активность этих ионтранспортирующих систем увеличивается значительно сильнее в группах опытных рыб. При 10-дневной экспозиции лещей, получивших Совол в дозах 50 и 100 мг/кг, активация составляет соответственно 83 и 118 % по сравнению с 48 % в контрольной группе. При 5-дневном выдерживании рыб, которым вводили 150 мг/кг, активность котранспорта возрастает в 2,03 раза по сравнению с 1,54 у рыб "в норме" (Рис. 8), при 10-дневном — в 2,34 раза (в контроле — в 1,5 раза) (Рис. Э). У карпов, инъецированных 50 мг/кг (экспозиция 10 суток), активация котранспорта норадреналином в опытной группе составляет 42 % по сравнению 14 % у контрольных рыб.

Активность неингибируемых фуросемидом систем транспорта калия у рыб, инъецированных ПХБ, достоверных отклонений от нормы не имеет.

В присутствии норадреналина в среде инкубации активность неингибируемых фуросемидом систем облегченной диффузии калия у рыб, которым вводили ПХБ, всегда выше, чем в контрольной группе.

Как видно из представленных данных, системы облегченной диффузии калия как ингибируемые, так и неингибируемые фуросемидом, одинаково реагируют на действие ПХБ. Без норадреналина в среде инкубации их активность равна контрольной. Однако при его добавлении скорость переноса 86Rb через эти системы выше в группе опытных рыб. Известно, что катехоламины вызывают набухание эритроцитов и последующее возрастание скорости котранспорта и других систем облегченной диффузии (Bourne and Cossins, 1984; Nikinmaa and Huestis, 1984). Введение рыбам Совола-54 по-видимому, приводит к таким изменениям в эритроцитах, результатом которых является способность клеток больше увеличивать свой объем при добавлении н ор а д р ен а л и н а.

Пассивная проницаемость мембраны.

Пассивная диффузия калия через мембрану эритроцитов карпа (фуросемид-неингибируемый выход 86Ш} при введении 100 мг/кг Совола-54 снижается в 2 раза. Подобные изменения наблюдаются и в клетках рыб, инъецированных смесью ПХБ и радионуклида.

Были получены данные о значительном возрастании содержания натрия в эритроцитах карпов, инъецированных 50 мг/кг Совола-54. При этом в среде присутствовали ингибиторы активного транспорта натрия и систем облегченной диффузии, то есть возрастание содержания иона в клетке было связано только с его пассивной диффузией.

Наблюдаемые различия в характере изменений пассивной проницаемости мембраны для натрия и калия при введении карпам ПХБ могут быть вызваны разным методическим подходом в измерении проницаемости. Не исключается также версия, что пассивная диффузия калия и натрия через мембрану эритроцитов идет по разным механизмам, что подтверждается данными, полученными для эритроцитов человека (Орлов и др., 1993).

Совместное действие Совола-54 и 45Са на ионный транспорт эритроцитов рыб.

Одной из опытных групп карпов вводили и Совол-54, и радиоактивный 45Са в базовых концентрациях. Данные представлены на Рис. 8.

Активность ЭДа+,К+-насоса в эритроцитах этих рыб достоверно выше, чем у контрольных (р<0,01), однако не отличается от таковой в группах, инъецированных ПХБ и 45Са в чистом виде (Рис. 8). При добавлении в среду инкубации норадреналина скорость работы переносчика возрастает в 1,57 раза (в группе рыб с Соволом-54- в 1,58 раза, с 45Са- в 1,16 раза), тогда как у рыб "в норме"- в 1,94 раза.

Значения котранспорта эритроцитов карпов, инъецированных смесью ПХБ и радионуклида, практически сходны со значениями, полученными для рыб других экспериментальных групп.

Скорость входа 86ЙЬ через уабаин-, фуросемид-неингибируемые ионтранспортирующие системы в эритроцитах карпов, инъецированных смесью ПХБ и 45Са, достоверно не отличается от скорости, измеренной в клетках других

экспериментальных групп. Добавление в среду инкубации норадреналина также не приводит к регистрации достоверных отличий.

Пассивная диффузия калия из эритроцитов (фуросемид-пеингибируемый выход 86НЬ) в группе карпов, которым были введены оба исследуемых вещества, равна таковой у рыб с ПХБ и в 1,8-1,9 раза ниже, чем у контрольных рыб и у рыб, которым вводили только радионуклид.

Введение в эксперимент группы рыб, инъецированной и Соволом-54, и радиоактивным 45Са, позволяет установить, какие изменения систем ионного транспорта под воздействием этих веществ носят специфический, а какие- общий характер. Например, во всех опытных группах рыб наблюдается повышенная активация Ыа+,К+,2С1"- и К+,С1'-котранспорта норадреналином. В группе рыб, которым вводили оба вещества, она составляет 72 %, только 45Са — 59 только Совол — 42 % (в контрольной группе — 14%).

Этот факт позволяет предположить, что действие Совол-54 и 45Са на этот ионный переносчик происходит по идентичным механизмам. Оба вещества приводят к более сильному по сравнению с нормой набуханию эритроцитов при добавлении в среду инкубации норадреналина. Введение обоих веществ, естественно, увеличивает силу воздействия и мы регистрируем более ярко выраженный патологический эффект.

Оба исследуемых загрязнителя приводят к снижению способности Ка+,К '-насоса эритроцитов карпа отвечать на активацию норадреналином. В группе рыб, инъецированных Соволом-54, активация переносчика составляет 58 %; в группе, которой вводили 45Са — 16 %; у рыб, которым ввели оба вещества — 57 % ("в норме" — 94%) (Рис. 8). Таким образом, по возрастанию степени подавления гормональной регуляции Ка ',Кь-насоса экспериментальные группы располагаются следующим образом: контрольная — карпы, инъецированные Соволом-54 и инъецированные обоими веществами — рыбы, которым вводили только 45Са.

Эти данные позволяют предположить, что механизмы патологического действия ПХБ и радионуклида на аденилатциклазную систему эритроцитов карпа различны. В противном случае введение и ПХБ и радионуклида вызывало бы более значительные изменения, чем чистые вещества. Однако этого не наблюдается. Более того, присутствие в организме карпа Совола-54 снижает действие радиоактивного 45Са на систему

гормональной регуляции Ыа+,К+-насоса. Это также свидетельствует о том, что механизмы нарушения нормальной работы аденилатциклазной системы эритроцитов рыб ПХБ и радионуклидом различны.

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что такие вещества как ПХБ и 45Са обладают как специфическими, так и общими механизмами воздействия на системы ионного транспорта и трансмембранной сигнализации эритроцитов карпа.

Ионный транспорт и его гормональная регуляция в эритроцитах леща. обитающего в различных районах Рыбинского водохранилища.

В организме леща, обитающего в загрязненной стоками г. Череповца зоне Рыбинского водохранилища содержится значительное количество тяжелых металлов, нефтепродуктов, полиароматических углеводородов и полихлорированных бифенилов (Ершов, 1990; Козловская и др., 1990; Гапеева, 1993). Концентрации веществ, относящихся к двум последним группам, достигают значений, способных вызывать злокачественные новообразования в тканях рыб (Ктае а1., 1990). Тяжелые металлы и нефтепродукты содержатся в количествах, в 10-15 раз, превышающих ПДК (Гапеева, 1993). В отличие от этого, в тканях рыб контрольной группы концентрации загрязнителей не превышают предельно-допустимых значений (Козловская и Самбурский, 1992). Эти различия связаны с разной продолжительностью пребывания рыб обоих групп в загрязненных стоками водах. У лещей из устья р. Шексны она значительно меньше, чем у рыб, места нагула которых приурочены к Шекснинскому плесу Рыбинского водохранилища (Поддубный и Малинин, 1988).

Активность Ыа+,К+-насоса в эритроцитах рыб, обитающих в воде, загрязненной сточными водами, более чем в два раза выше по сравнению с контрольными (Рис. 10).

Скорость котранспорта, интабируемого фуросемидом и его активация норадреналином в обеих группах леща равны. В то время как, активность систем облегченной диффузии калия, неингибируемых фуросемидом, значительно выше в эритроцитах рыб из загрязненных районов (р<0,05). Кроме того, при добавлении в среду инкубации эритроцитов норадреналина эти системы гораздо лучше активируются у лещей из загрязненной

зоны: в 1,8 раза по сравнению с 1,35 в контрольной группе (Рис.10).__

Вход Ru 86 (шМ/л клеток в час)

Na, К насос Котранспорт Пассивный транспорт

Рис. 10. Транспорт ионов в эритроцитах леща, отловленного в чистых (1,2) и загрязненных районах (3,4) Рыбинского водохранилища.

2,4 присутствие норадреналина в среде инкубации * р < 0.05

Известно, что в ряде случаев при выдерживании рыб в сточных вод происходит увеличение объема эритроцитов (van Vuren, 1986; Williams and Eddy, 1988). В условиях патологического увеличения объема эритроцитов вероятно предположить повышенную активность систем облегченной диффузии калия, включая как фуросемид-зависимые, так и неингибируемые этим препаратом. Однако наблюдается модификация лишь одной из них. Возможно, такой эффект обусловлен специфичным действием какого-либо из компонентов сточных вод на одну из данных систем транспорта. Окончательный ответ на этот вопрос можно будет дать после более детального изучения систем облегченной диффузии эритроцитов рыб, их полной идентификации и установления особенностей функционирования.

Ионный гомеостаз в клетках крови рыб пруда-охладителя ЧАЭС и Киевского водохранилища

Na+,K+-Hacoc в эритроцитах толстолобиков, отловленных в пруду-охладителе ЧАЭС, функционирует достаточно

эффективно и вполне сравнимо с активностью этой транспортной системы в эритроцитах контрольных рыб. Однако как видно из таблицы 5, наблюдается значительная вариабильность функционирования уабаин ингибируемой компоненты в эритроцитах рыб, подвергающихся действию радионуклидов по сравнению с контрольными рыбами. Это может быть объяснено как действием радиации, так и рядом других факторов в том числе и условиями содержания рыб в пруду-охладителе ЧАЭС. Значительно больший интерес представляет тот факт, что Ка+,К+-насос существенно хуже стимулируется норадреналином в эритроцитах облученных толстолобиков по сравнению с контрольными рыбами (Таблица 6).

Как было показано ранее, эта стимуляция осуществляется через локализованную в мембранах эритроцитов рыб циклазную систему и, по-видимому, снижение уровня активации Ыа+,К+-насоса в эритроцитах облученных рыб может быть связано с нарушением радиацией структурно-функциональных свойств мембранных структур (см. стр. 16). С другой стороны, нарушения мембранных структур клетки, вызываемые длительным облучением, как правило, неспецифичны, что позволяет предположить возможность модификации ответа на гормональные стимулы и в других клетках облученных рыб. Следствием этих нарушений может быть изменение гормонального статуса и ряда жизнено важных функций, в первую очередь, размножения.

Ка+,К+,2С1'-котранспорт в эритроцитах этих рыб идет с незначительной скоростью. В ряде случаев вообще не удавалось зарегистрировать этот тип транспорта в эритроцитах толстолобиков. Этот процесс также стимулируется норадреналином. С нашей точки зрения ^+,К+-2С1_-котранспорт менее удобен в качестве теста для анализа действия радионуклидов на эритроциты пресноводных рыб. Зарегистрированные нарушения в механизме регуляции Ыа,К-насоса, с одной стороны, дают возможность сделать заключение о разрушающем действии исследуемых радионуклидов на мембраны эритроцитов, а с другой стороны, - предложить измерение уровня стимуляции уабаин-ингибируемой компоненты норадреналином в качестве тест-системы для анализа действия длительного радиационного облучения на пресноводных рыб (карпы и толстолобики).

Таблица 6. Транспорт одновалентных ионов в эритроцитах крови толстолобиков из пруда-охладителя ЧАЭС (I) и пруда Шатурской электростанции (II)

| № обр азц а Норадрен алии N3+, К+-насос Ыа+,К+,2С1"-котранснорт Пассивный транспорт

ммоль на литр клеток в час

I 2.47 ± 0.3 0.09 ± 0.003 0.80 + 0.3

I 10'6 М 2.60 + 0.5 0.40 ± 0.030 1.01 ± 0.4

II 2.60 ± 0.7 0.04 ± 0.005 0.47 ± 0.01

II 10'6 М 5.81 ± 0.4 0.53 ± 0.010 0.51 ± 0.02

Ш/К-С1 котранспорт в эритроцитах толстолобиков из пруда-охладителя ЧАЭС работает активней, чем в эритроцитах контрольных рыб, однако, с низкой интенсивностью и, как правило, не превышает 0,1 ммоль на литр клеток в час. (Таблица 6).

Существенно модифицирован пассивный транспорт, что по-видимому связано с нарушением структуры плазматической мембраны эритроцитов этих рыб. Изменение структуры плазматических мембран мембран митохондрий и ядер форменных элементов крови толстолобиков из пруда охладителя ЧАЭС нам удалось подтвердить и электронно-микроскопическим контролем.

Таким образом, в мембранных структурах форменных элементах крови рыб из пруда-охладителя ЧАЭС так же, как и в мембранах эндоплазматического ретикулума печени этих рыб (см. ниже), обнаружены мембранные патологии. Несмотря на это стадо толстолобиков в пруду успешно растет, от него получено несколько поколений потомства, обнаруженные биохимические изменения позволяют выявить нарушения связанные как с

накоплением в их тканях радионуклидов, так и с действием на этих рыб ксенобиотиков. Совместное действие радионуклидов и мутагенных ксенобиотиков на мембранные структуры тканей рыб Рыбинского водохранилища в дальнейшем будет обсуждается подробнее.

Таким образом, исследование активности систем ионного транспорта эритроцитов рыб показало их высокую чувствительность к таким загрязнителям водной среды как кадмий, полихлорированные бифенилы, радионуклиды и сточные воды, содержащие нефтепродукты, ПХБ, ПАУ и тяжелые металлы. Эти вещества вызывают как специфические, так и неспецифические изменения систем ионного транспорта и их гормональной регуляции. Последние проявляются в результате действия на эритроциты in vivo, но не in vitro и носят сходный характер с изменениями, происходящими у рыб при стрессе вылова.

Модификация работы систем ионного транспорта и трансмембранной сигнализации эритроцитов рыб имеет несомненно, приспособительное значение. Как известно, реакция тревоги по Селье в числе целого комплекса вызывает возрастание концентрации в крови рыб катехоламинов и кортикостероидов (Nikano and Tomlinson, 1967; Mazeaud and Mazeaud, 1981) и снижение pH плазмы за счет увеличения продукции лактата в мышцах и утечки протонов из клеток (Holeton et. Al., 1983; Nikinmaa and Huestis, 1984). За этим следуют вторичные реакции, включающие интенсификацию процессов перекисного окисления липидов мембраны, возрастание на ее поверхности действующих Р-адренорецепторов (Reid and Perry, 1991), активацию Na+/H+- и С1"/НС03--обмена и последующий осмотический приток воды, вызывающий набухание эритроцитов и, как результат, возрастание скорости работы систем облегченной диффузии (Nikinmaa and Huestis, 1984; Borgeze et. al., 1986). Физиологическое значение последней реакции заключается в регуляторном уменьшении клеточного объема (Nikinmaa, 1992). Помимо этого происходит утечка из эритроцитов калия и нарушение баланса электролитов между клетками и плазмой крови (Mazeaud et. al., 1977; Railo et. al., 1985).

Вышеперечисленные изменения в условиях стресса являются общими для всех изученных до настоящего времени видов рыб.

Межвидовые различия проявляются в реакции некоторых ионтранспортирующих систем, и в частности Na+,K+-Hacoca.

У некоторых видов рыб, например, у леща, его активность при стрессе практически не изменяется, тогда как у карпа в условиях реакции тревоги по Селье она многократно возрастает..

Восстановлению клеточного гомеостаза с помощью Ыа+,К+-насоса мешает подавление гормональной регуляции этого переносчика. Это прбйеходит в эритроцитах всех рассматриваемых в настоящем исследовании видов рыб при воздействии как вылова, так и загрязнителей водной среды. Как показали эксперименты, на стадии резистентности общего адаптационного синдрома эта утраченная функция возвращается в норму. Установлено, что к угнетению передачи сигнала через циклазкую систему не причастен "выход из строя" Р-рецепторов и С,-белков. По-видимому, тут играет роль снижение активности аденилатциклазы и базалыюго уровня сАМР. Многочисленные литературные источники свидетельствуют о высокой стресс-чувствительности этих компонентов циклазной системы.

Все зарегистрированные нами изменения систем ионного транспорта при стрессе являются компенсаторными: возрастание активности Ыа+,К+-насоса служит восстановлению снизившегося градиента натрия и калия между клеткой и внеклеточной средой; увеличение скорости Ка+,К+,2С1~-, К+,С1~-котранспорта и других систем облегченной диффузии позволяет снизить объем эритроцитов до нормального уровня. Виды рыб, у которых эти механизмы выражены сильнее, легче восстанавливаются после стрессирующих воздействий, ярким примером может служить карп.

Многокомпонентное загрязнение . водоемов в современных условиях определяет сложность реакции на него систем транспорта ионов и трансмембранной сигнализации эритроцитов рыб. Хроническое действие поллютантов (в большинстве водоемов их концентрации превышают ПДК) если не вызывает необратимых нарушений этих систем, то в совокупности с естественными стресс-факторами (нерест, зимовка, изменения гидрологических характеристик среды) могут обусловить синергический эффект, способный вызвать повышенную естественную смертность рыб.

Активность монооксигеназной системы (ЕНОР) в микросомной Фракции рыб пруда-охладителя АЭС и Киевского водохранилища.

Активность монооксигеназной системы микросомной фракции печени белых толстолобиков семилетнего возраста из пруда-охладителя ЧАЭС существенно снижена в сравнении с рыбами из пруда Шатурской ТЭЦ, выбранных в качестве контрольных.

Измерения были начаты в мае-июне 1991 и продолжались в мае-июне 1992 и 1993 годов. На протяжении этого периода наблюдали дальнейшее подавление активности монооксигеназной системы печени несмотря на снижение содержания радионуклидов в тканях исследуемых рыб. Вероятно, что частичное снижение монооксигеназных активностей может быть связано с условиями содержания рыб, однако полученные результаты позволяют предположить, что хроническое облучение значительными дозами, как и в случае теплокровных животных (работы были выполнены под руководством профессора Ю.Б. Кудряшова), приводит к инактивации монооксигеназной системы толстолобиков. (Рис. 11.)

Рис. 11. Монооксигеназная активность (ЕНОВ) микросомной фракции печени белого толстолобика (возраст 7-9 лет) из прудов-охладителей ЧАЭС (1, 2) и Шатурской ТЭС (3-4) и содержание в мышцах 137Сб (5).

е КНОР(гшоль1/мг бедк./мин) Се-137 кВк/к#

25 20 15 10 5 0

р<0.05

В параллельных исследованиях монооксигеназных активностей печени молодых (не старше трех лет) рыб различных видов не выявлено корреляционной зависимости между содержанием 137С$ в мышцах и скоростью Е11СШ в микросомной фракции печени (Рис. 12). По всей вероятности, у рыб второго и следующих поколений, получивших меньшие дозы облучения, активность монооксигеназ не подвергается ощутимым изменениям. Проведенные исследования позволяют сделать заключение о том, что монооксигеназная система печени семилетних толстолобиков из садков пруда-охладителя ЧАЭС значительно ослаблена. Снижение монооксигеназных активностей, по-видимому, наблюдается на протяжении всего периода жизни рыб и, несмотря на уменьшающуюся концентрацию 137Сз в их тканях, не восстанавливается (Рис. 11).

Исследование монооксигеназных активностей в тканях рыб в возрасте 3 лет, отловленных в пруду-охладителе ЧАЭС и в Киевском водохранилище, не выявило существенной модификации системы цитохрома Р-450 у всех исследованных видов. Скорость микросомного окисления 7-этоксирезоруфина в значительной степени зависела от вида рыб, но не от концентрации 137С.ч в мышцах (Рис. 12). Различия в 3-4 градуса в температурных режимах пруда-охладителя ЧАЭС и Киевского водохранилища не должны отражаться на результатах исследований, поскольку ранее нами было показано, что в таком градиенте температур монооксигеназная активность печени разных видов рыб существенно не изменяется. Следовательно, сравнение монооксигеназных активностей у рыб пруда-охладителя ЧАЭС и Киевского водохранилища вполне правомерны. Из полученных результатов видно, что несмотря на значительное различие в содержании 137Сз в мышцах этих рыб, монооксигеназные активности вполне сравнимы. Это позволяет сделать вывод о том, что у рыб второго и третьего поколений, родившихся от производителей, находившихся во время аварии в пруду-охладителе ЧАЭС, и у рыб Киевского водохранилища, обитающих вблизи села Страхолесье, скорость ЕНСШ не модифицирована.

Исследование генотоксичности экстрактов из печени и мышц рыб в тесте Эймса сальмонелла/микросомы показало, что на территории, пострадавшей от аварии на ЧАЭС, кроме радиационного, имеются и другие факторы, способные проявлять тератогенное и мутагенное действие. К ним относятся техногенные загрязнители химической природы. Анализ

генотоксичности экстрактов тканей рыб проводили не только с целью определения присутствия в тканях гидрофобных органических соединений, способных вызывать генные мутации, й, следовательно, влиять на появление уродств при развитии потомства толстолобиков, но и для выяснения возможности совместного действия накапливающихся в тканях органических мутагенных соединений и радионуклидов на состояние монооксигеназной системы рыб, осуществляющей детоксикацию и метаболическую активацию ксенобиотиков.

Из девяти обследованных видов рыб в печени восьми и мышцах девяти видов рыб, обитающих в пруду-охладителе ЧАЭС, регистрируются на обоих тестерных штаммах как прямые, так и промутагенные соединения. Частота обнаружения мутагенных эффектов в этом водоеме достаточно высока по сравнению с Киевским водохранилищем. В тканях этих же видов рыб из Киевского водохранилища удалось обнаружить прямые мутагены только в экстрактах печени карпа и в мышцах карпа и леща, а промутагенные соединения - в печени и мышцах леща. Печень и мышцы карпов и толстолобиков из пруда-охладителя Шатурской ТЭС также накапливают мутагенные и промутагенные соединения обоих типов (штаммы ТА 98, ТА 100). Полученные результаты позволяют сделать вывод о том что, в таких техногенных водоемах, как пруды-охладители АЭС и ТЭС, мутагены накапливаются у разных видов рыб в значительных количествах. Многие из них представлены прямыми мутагенными соединениями, которые в большинстве случаев после метаболизма в условиях детоксикации in vitro (+МА) теряют или снижают свою генотоксичность. Промутагенные соединения обнаружены только в экстрактах печени густеры (пруд-охладитель ЧАЭС) и печени лещей (Киевское водохранилище, с.Страхолесье). В мышцах рыб по сравнению с печенью наиболее часто регистрируемые прямые мутагенные соединения (-МА) обычно в меньшей степени подвержены метаболическим превращениям и их генотоксичность не снижается в результате метаболической активации. По-видимому это связано с тем, что мышцы рыб являются "вторичным депо" мутагенов, которые сначала накапливаются в печени, а затем в ходе метаболизма попадают в мышцы, где их концентрация через определенное время достигает значимого уровня. Одной из причин накопления значительных количеств мутагенных соединений в тканях рыб пруда-охладителя ЧАЭС является

возможное ослабление системы детоксикации печени хроническим радиационным облучением.

Рис. 12. Монооксигеназная активность (ЕГЮБ) микросомной фракции печени и содержание шСэ в мышцах рыб (возраст 3 года) из пруда-охладителя ЧАЭС -1 и Киевского водохранилища (с. Страхолесье) -2

Карп Густера Лещь

Белый толстолобик Синец Голавль Ам.канальпый сомик Серебряный карась Линь

екои.

сз-ш .

6 4

евоо

2 0 0 2 0* 0.6 0-8 1 1.2 1.4 16

Сз-137 .

Это предположение подтверждается тем, что в условиях теста Эймса после метаболизма в присутствии крысиной Б9 фракции большинство прямых мутагенов экстракта мышц утрачивает или ослабляет свою мутагенную активность. Кумулятивный эффект мутагенных ксенобиотиков и радиационного облучения в этом водоеме может приводить к снижению плодовитости рыб и появлению уродств при развитии потомства.

Накопление в тканях рыб генотокических соединений, так же как и других ксенобиотиков (включая тяжелые металлы), может определять и нарушения в ионном транспорте эритроцитов этих рыб (результаты приведены в предыдущей главе). Однако проведенные в аквариумах эксперименты (см. предыдущий раздел) позволяют предположить, что нарушения в ионном транспорте связаны, скорее всего, именно с действием радиационного облучения.

Существенной модификации мембранных систем крови и печени рыб, отловленных в Киевском водохранилище вблизи села Страхолесье, не выявлено.

Мембранные структуры клеток крови и тканей плаценты жителей районов Алтайского края, подвергавшихся действию испытаний ядерного оружия.

В настоящее время можно считать доказанным, что неблагополучная медицинская обстановка в ряде районов Алтайского края связана с воздействием на население наземных испытаний ядерного оружия, происходившими в период с 1949 по 1965 гг.. (Щойхет и др., 1993).

Это явилось основой для проведения комплексных исследований изменений мембранных структур клеток крови, а также мембран эндоплазматического ретикулума плаценты жительниц некоторых районов Алтайского края.

При этом рассматривается возможность модификации мембранных структур не только у людей, непосредственно подвергшихся действию ядерных испытаний, но и у их потомков. Другим важным моментом мы считаем возможность совместного действия на генетический аппарат мутагенных ксенобиотиков и радионуклидов. Ввиду того, что большинство мутагенных и канцерогенных соединений обладают гидрофобными свойствами, они способны накапливаться в биологических мембранах, изменять их физико-химические свойства и активность мембранно-связанных ферментов.

Как отмечалось выше, мембраны форменных элементов крови являются одной из основных мишеней, поражающихся малыми дозами ионизирующей радиации. Активация молекулярного кислорода, образование его активных форм и непосредственное воздействие на мембранные липиды, сопровождающееся липопереокислением, приводит как к нарушению пассивной проницаемости мембранных структур, так и к непосредственной модификации мембранно-связанных ферментов,

осуществляющих транспорт ионов и регулирующих ионный гомеостаз в эритроците - одну из основных функций, обеспечивающую нормальную работу клетки. Существует возможность наследования ряда мембранных дефектов эритроцитов, определяющих не только наследственные заболевания (например, серповидноклеточная анемия, талассемия), но и функциональные нарушения, предрасположенность к ним (например, гипертония). Нарушение мембранных структур форменных элементов крови возможно и под воздействием химических веществ, попадающих в организм животных и человека.

Мы проводили исследование модификации основных параметров, определяющих ионный гомеостаз эритроцитов: Ка+,К+-АТФаза, Ма+,Н+-обмен, котранспорт, пассивная проницаемость. В некоторых случаях исследовали также проницаемость мембран для ионов Са2+

Был проведен анализ одновременно в крови рожениц и в пуповинной крови новорожденных.

Кроме этого изучали монооксигеназные и конъюгационпые активности ферментов плаценты рожениц некоторых районов Алтайского края.

Были обследованы жители, проживающие в различных районах Алтайского края и, естественно, подвергающиеся в различной степени влиянию неблагоприятных факторов окружающей среды. При обсуждении результатов в первую очередь были выделены два фактора: воздействие ионизирующей радиации в прошлом и возможность возрастающего токсического действия ксенобиотиков в настоящее время.

Анализировали характер липопереокисления в крови и плаценте новорожденных и рожениц, исследовали активности как изоформ цитохрома Р-450 параллельно с его содержанием в тканях плаценты рожениц ряда районов Алтайского края, так и активности ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков,

осуществляющих их конъюгацию с глутатионом и глюкуроновой кислотой.

Параллельно в тесте Эймса исследовали содержание в тканях плаценты мутагенных и канцерогенных соединений.

Тест позволил не только зарегистрировать мутагенные соединения, но определить характер их метаболической активации в мембранных системах цитохрома Р-450.

В эритроцитах венозной крови рожениц исследуемых районов Алтайского края было обнаружено снижение активности системы К+,С1~-котранспорта, контролирующей объем клеток и увеличение пассивной проницаемости мембран для Ыа+. Эти же отличия, а также увеличение пассивной проницаемости для Ыа+ и активности На+,К+-насоса выявлены в эритроцитах пуповинной крови новорожденных с конъюгационной желтухой. Было сделано предположение, что это является следствием прямого воздействия некоторых неблагоприятных экологических факторов на родителей детей, страдающих желтухой (радионуклидных загрязнений, возникших в результате испытаний ядерного оружия, токсичных ксенобиотиков), либо некоторых вторичных генетически закрепленных изменений.

С целью проверки выдвинутого предположения сопоставили состояние ионного гомеостаза рожениц из подвергшихся влиянию ядерных испытаний районов Алтайского края и относительно благополучных районов. Одним из основных проявлений нарушения функций биологических мембран является перекисное окисление липидов. Этот процесс, как уже отмечалось выше, сопровождает большинство патологических состояний, связанных с модификацией биологических мембран.

Представляло интерес проведение посемейного обследования жителей Алтайского края, подвергавшихся действию испытаний ядерного оружия. Кроме этого, в качестве контроля мы использовали кровь жителей Московской области.

Во всех случаях контроль можно считать условным, так как на жителей различных районов России действуют различные факторы окружающей среды. Московская область один из наиболее загрязненных ксенобиотиками районов России, однако в этих районах никогда не наблюдалось значительного радиоактивного загрязнения (Обнинский район, выбранный в качестве контрольного был на особом учете, контроль радиоактивного загрязнения в этом районе проводился регулярно).

При посемейном обследовании в 1993 -1994 гг. была проанализирована кровь членов семей следующих населенных пунктов Алтайского края: Топольное (реконструированная доза облучения -243 сЗв, 21 семья, 53 человека), Зеленая Дубрава (доза облучения 18 сЗв, 14 семей, 36 человек) и Шарчино (контрольный район, 8 семей, 24 человека). Кроме того, в качестве контроля в г. Обнинске была обследована группа из 42 человек в возрасте от 19 до 54 лет. Всего 1994 г. было обследовано 113 жителей в Алтайском крае. В 1992, 1993 г. были обследованы 75 рожениц и их новорожденных из города Барнаула, Тальменсхюго района (район с повышенной частотой регистрации желтухи новорожденных), а также рожениц и новорожденных из некоторых других районов Алтайского края. Таким образом, представлен анализ мембранных показателей, а также анализ характера ПОЛ по результатам обследования более чем 200 жителей из пострадавших районов Алтайского края с расчетными реконструированными дозами облучения в первом поколении 18 сЗв (47чел.), 26 сЗв (10 чел.), 65 сЗв (40 чел.), 97 сЗв (9 чел.) и 243 сЗв ( 53 чел.).

Алтайский край - район с развитым промышленным и сельскохозяйственным производством, являющимся источником химического загрязнения. Одной из причин неблагоприятной медицинской обстановки в Алтайском крае может быть воздействие радионуклидов на генетический аппарат родителей, а также действие на наследственный материал химических мутагенов в ходе роста и развития детей.

Исследование функциональной активности мембранно-связанных систем клеток крови у рожениц из различных районов Алтайского края.

В эритроцитах венозной крови рожениц Тальменского района Алтайского края, новорожденные дети которых страдают конъюгационной желтухой, снижена активность системы К+,С1~-котранспорта, контролирующая объем клеток, и увеличена пассивная проницаемость мембран для Ыа+. Эти же отличия, а также увеличение пассивной проницаемости для №а+ и активности Ыа 4,К '-насоса выявлены в эритроцитах пуповинной крови новорожденных с конъюгационной желтухой. Было выдвинуто предположение, что этот факт может быть следствием

прямого воздействия некоторых неблагоприятных экологических факторов (химического загрязнения или действия радиации в период с 1949 по 1965 гг., возникшего в результате испытаний ядерного оружия). С целью проверки выдвинутого предположения мы сопоставили состояние ионного гомеостаза у рожениц из подвергшихся влиянию ядерных испытаний районов Алтайского края и относительно благополучных районов.

Все обследованные роженицы и новорожденные были разбиты на четыре группы. В первую группу были выделены роженицы, которые (как и их родители) проживали на территориях Алтайского края, наиболее пострадавших от испытаний ядерного оружия, где общая эффективная доза облучения составляла более 100 сЗв. В отдельную, вторую группу, были объединены матери, проживающие в Тальменском районе. Этот район, хотя и не существенно пострадал от ядерных испытаний, выделяется среди других регионов Алтайского края неблагоприятной медицинской обстановкой и рядом других медико-гигиенических факторов. К третьей группе отнесены роженицы, которые проживали на территориях, частично подвергавшихся воздействию ядерных испытаний (расчетная доза менее 20 сЗв), и четвертая группа была составлена из жительниц населенных пунктов, входящих в районы Алтайского края, наименее подвергшихся воздействию испытаний ядерного оружия.

Таким образом, в первую группу вошли роженицы, матери которых и они сами проживали в г. Рубцовске в период с 1949 по 1965г. и получили общую дозу более 100 сЗв. Во вторую группу выделены, как уже отмечалось выше, роженицы из Тальменского района. Третья группа - роженицы из районов, в которых доза общего облучения была около 10 сЗв.

В качестве контрольных были выбраны роженицы проживавшие в районах, не затронутых следом ядерных испытаний (IV группа рожениц, районы: Алейский, Завьяловский, Павловский, Панкрушихинский, Ребрихинский, Романовский, Шелаболихинский . Данные суммированы в Таблице 7. Из приведенных данных видно, что в эритроцитах венозной крови рожениц из неблагополучных районов средние значения проницаемости для Ма+ и К+ увеличены, в то время как активность К+,С1+-котранспорта, индуцированного набуханием эритроцитов, снижена.

Таблица 7. Пассивная проницаемость и К+,С1+-котранспорт в эритроцитах крови рожениц Алтайского края.

| Группы по районам Пассивная проницаемость для К+ для К+,С1+- котранспорт

нмоль/литр клеток в час

I 1.53 ± 0.14 0.80 ± 0.02 0.40 ± 0.01

II 1.87 ± 0.014 0.14 ± 0.04 0.48 ± 0.07

III 1.31 ± 0.07 0.61 ± 0.06 0.57 ± 0.07

1 IV 1.25 ± 0.14 0.1 ± 0.015 0.65 ± 0.07

Состав групп см. в тексте

Транспорт ионов Са24" в эритроцитах доноров различных поколений в Алтайском крае.

Средние величины показателя скорости входа Са2+ в эритроциты практически не различаются у мужчин и женщин 1-го поколения в с.Шарчино (условный контроль) и с.Зеленая Дубрава (18 сЗв) (обследование проходило в 1994 г.). В то же время у жителей 1-го поколения с.Топольное (243 сЗв) отмечается отчетливое снижение скорости входа Са2+ в эритроциты. Напротив, показатель пассивной проницаемости мембраны гипертонически сжатых эритроцитов существенно выше у жителей из районов, подвергавшихся испытанию ядерного оружия на полигоне г.Семипалатинска. Аналогичная закономерность изменения этих двух показателей проницаемости мембраны отмечались при сравнительном обследовании в 1993 г. жителей из населенных пунктов Тополыюе, Зеленая Дубрава, Саратовка и Подсосново (контроль). В тоже время, скорость входа Са2+ в эритроциты, преинкубированные в гипотоническои среде, характеризовалась слабыми различиями у жителей 1-го поколения в Топольном, Зеленой Дубраве и Шарчино (Рис. 13).

2.5 2 1.5 1

0.5 0

Рис. 13. Средние величины скорости входа Са2+ в эритроциты жителей различных районов Алтайского края в изотонических и гипертонических средах.

Вход Са мкмоль/(мин х л клеток)

□243 сЗв □18 сЗв ЕЭКонтроль

- р < 0.05

Среда инкубации

В результате проведенных исследований модификации мембран эритроцитов у жителей районов, подвергавшихся радиационному воздействию можно сделать следующие выводы:

I. В эритроцитах жителей с реставрированной дозой облучения 18-243 сЗв модифицирована система транспорта одновалентных ионов и увеличена пассивная проницаемость мембраны гипертонически сжатых эритроцитов, что говорит о наличии скрытого мембранного дефекта.

II. В эритроцитах доноров с реставрированной дозой облучения родителей 243 сЗв снижена скорость входа Са2+ в эритроциты, что позволяют говорить о наличии отдаленных биологических последствий у облученного населения Алтайского края, выражающихся в модификации проницаемости клеточных мембран.

III. Изменения проницаемости мембран, выявленные в первом поколении жителей районов, подвергавшихся действию ядерных испытаний, также наблюдаются и во втором поколении.

IV Обнаружены отклонения в системе кроветворения у жителей районов Алтайского края, подвергавшихся действию испытаний ядерного оружия, что выражается:

1)в увеличении показателя осмотической реакции тромбоцитов;

2) снижении величины оптической плотности тромбоцитарно-лимфоцитарной суспензии, выделяемой из периферической крови.

V. Скорость аскарбат-зависимого липопереокисления достоверно увеличена в группе жителей районов, подвергавшихся действию ядерных испытаний (дозы 18 и 243 сЗв), степень увеличения скорости соответствует увеличению уровня реставрированной дозы для района. Однако, достоверных отличий между первым и вторым поколением во всех исследованных районах не обнаружено.

Исследование_мембранных_ферментов_детоксикации

ксенобиотиков в плаценте рожениц Алтайского края.

Система цитохрома Р-450 и система ферментов конъюгации, входящие в мембранные комплексы, лабильны и подвергаются модификации рядом факторов, в том числе и перекисным окислением мембранных липидов. Нарушение функционирования микросомных монооксигеназ (как было показано выше на микросомной фракции рыб) может быть вызвано и радиационным облучением, и действием радионуклидов. Кроме этого, активность систем мембранно-связанных ферментов находится под многоступенчатым генетическим контролем специальных генных семейств и, по-видимому, может быть модифицирована в результате мутаций, в том числе и вызываемых действием радиации.

Помимо ферментов монооксигеназпой системы в детоксикации ксенобиотиков принимают участие и, так называемые, ферменты И-ой фазы детоксикации, осуществляющие реакции конъюгации. В общем виде, электрофильные интермедиаты, продуцируемые в ходе монооксигеназных реакций, являются субстратами глутатион Э-трансферазы (Гт) и в ходе реакций конъюгации с глутатионом превращаются в безвредные продукты. Гт также способна необратимо (ковалентно) связывать различные ксенобиотики, являясь, таким образом, белком-нейтрализатором или транспортным белком. Гт плаценты играет ключевую роль в защите плода от электрофилов и других соединений,

повреждающих клетку:, антибиотиков, разнообразных гидрофобных лекарств, продуктов химического синтеза и пр. Гт плаценты, в отличие от Гт печени, является слабо индуцибельным белком, т.е. ее активность слабо изменяется под действием ксенобиотиков и, в частности, сигаретного дыма курящих матерей. Известно, что Гт также способна осуществлять транспорт билирубина в плаценте, причем активность плацентарной Гт ингибируется билирубином.

Таким образом, исследование активности Гт плаценты человека, особенно в сочетании с изучением других ферментов детоксикации плаценты (монооксигеназная система, опоксидгидролаза и др.), является необходимым шагом в понимании природы различных патологий новорожденных, в том числе и желтухи. (Pasanen & Pelkonen , 1989, 1990).

Среди других ферментов детоксикации в плаценте важную роль играет УДФ-глюкуронозилтрансфераза (УДФ-ГТ), осуществляющая конъюгацию ксенобиотиков с УДФ-глюкуроновой кислотой ( Temply & Burchell, 1990). Важность этого фермента подчеркивается и тем, что он принимает участие в метаболизме эндогенных соединений: билирубина, тироксина, тетрагидрокортизола, стероидных гормонов.

Мы провели исследования характера липопереокисления в крови и плаценте новорожденных и рожениц, исследовали активности как изоформ цитохрома Р-450 и его содержания в тканях плаценты рожениц ряда районов Алтайского края, так и активности ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков, осуществляющих их конъюгацию с глутатионом и глюкуроновой кислотой. Параллельно в тесте Эймса исследовали содержание в тканях плаценты мутагенных и канцерогенных соединений. Тест позволяет не только регистрировать мутагенные соединения, но определять характер их метаболической активации в мембранных системах цитохрома Р-450.

Для измерения монооксигеназных активностей в мембранах эндоплазматического ретикулума печени использовали два субстрата 7-этоксикумарин и 7-этоксирезоруфин. Эти монооксигеназные активности отражают метаболизм в мембранных структурах печени чужеродных соединений. При этом надо учитывать, что в то время как большинство чужеродных для организма химических веществ-ксенобиотиков в результате метаболизма в монооксигеназной системе претерпевают первую фазу детоксикации, ряд веществ, наоборот, проходит метаболическую активацию и приобретает в результате

монооксигеназпого окисления канцерогенные и мутагенные свойства.

Наиболее высокие значения этой монооксигеназной активности были зарегистрированы у женщин, куривших в период беременности. Полученные результаты были представлены в виде групп, в которые объединены матери, проживающие на территориях, подвергшихся влиянию-ядерных испытаний (женщины, курившие во время беременности, из рассмотрения исключены). Кроме этого группы были объединены с учетом поражения новорожденных желтухой невыясненной этиологии, при этом в качестве контрольных взяты дети, родители которых не проживали на территориях, существенно подвергшихся влиянию ядерных испытаний и все здоровые дети. В плацентах первой группы (роженицы из районов в наибольшей степени подвергшихся воздействию испытаний ядерного оружия) регистрируется достоверное снижение моноокигеназных активностей. Снижение монооксигеназных активностей регистрируется и в плацентах матерей проживавших на менее пораженных территориях и у рожениц из Тальменского района. (Рис. 14)

Достоверных различий активностей монооксигеназ между группами детей с физиологической и гемолитической желтухой неясной этиологии выявить не удалось. Не обнаружено достоверной корреляции и между уровнем монооксигеназных активностей и заболеваниями центральной нервной системы новорожденных (Рис. 15)

Исследования УДФ-глюкуронозилтрансферазы и глутатион-Б-трансферазы выявили те же тенденции, что позволяет говорить о развитии мембранной патологии, затрагивающей все мембранно-связанные ферменты плаценты (Таблица 8).

Естественно, что регистрируемые у новорожденных патологии могут быть связаны с нарушением микросомной системы не только плаценты, но и печени, а также некоторых других органов и тканей, в том числе и лимфоцитарной.

На сегодняшний день в литературе нет убедительных доказательств того, что индукция или нарушение монооксигеназных активностей в ткани печени матери адекватно будет отражена в характере активностей соответствующих изоформ цитохрома Р-450 микросомных мембран плаценты. В плаценте, по-видимому, отсутствует фенобарбитальная изоформа цитохрома Р-450.

Таблица 8. Активность ксенобиотков в плаценте

ферментов биотрансформации

Группы по районам Активность ферментов плаценты нмоль/мг белка /мин.

УДФ-ГТ гт- цитозоль ГТ-микросом 4.2 ± 2.0

I- Условный контр. 0.55 ± 0.26 156 ± 52

II- доза < 35 сЗв 0.83 ± 0.26 р <0.05 132 ± 32 и.д. 2.8 ±1.1 р<0.05

III- доза > 100 сЗв 0.38 ± 0.18 р<0.1 (р<0.05) 120 ± 31 р<0.05 4.5 ± 1.3 н.д. (р<0.05)

В таблице 8 указан уровень достоверности от первой группы; ад. - нет достоверных отличий. В скобках уровень достоверности отличий между второй и третьей группами._

Рис.14. ЕССШ-активность в микросомах плаценты рожениц различных районов Алтайского края: 1 - условный контроль (п=23), 2 - только здоровые новорожденные из условнокон-трольных районов (п-17), 3 - Тальменский район (< 35 сЗв), (п=40) 4 - Рубцовский район (>100 сЗв), (п=21). 2 - 3, 4 р<0.01, 3 - 4 р <0.05

ЕССЮ пмоль/мг белка/мин.

2»

15----

11

На данном этапе исследование индукции изоформ цитохрома Р-450 в печени не проводили, С другой стороны, по-видимому, ряд токсикантов может не увеличивать, а ингибировать монооксигеназные активности в тканях плаценты за счет нарушения мембранных структур и инициации перекисного окисления липидов. Впрочем, достаточно логичным кажется и предположение, что низкие, по каким-либо причинам, активности ферментов детоксикации в плаценте сопровождаются накоплением в этих плацентах мутагенных и канцерогенных соединений.

Рис. 15. ЕССШ-активность в микросомах плаценты рожениц Алтайского края. Группы составлены по диагнозам заболеваний новорожденных после первого месяца жизни: 1 - норма,(п=17)

2 - физиологическая желтуха, (п=28), 3 - гемолитическая желтуха, (п=25) 4 - заболевания ЦНС (п=21). Различия между группами не достоверны.

ЕССШ лмоль/мг белка/мип.

1 2 Э 4

■1 В32_

По полученным на сегодняшний день результатам в исследуемых тканях, за редким исключением, не удалось выявить сколько-нибудь существенной индукции монооксигеназ. Это позволяет сделать предварительный вывод об отсутствии в организме рожениц индуцирующего действия ксенобиотиков типа полихлорированных бифенилов и полициклических углеводородов. Однако, вариабельность значений

монооксигеназных активностей и содержания цитохрома Р-450 в тканях рожениц довольно велика. Это согласуется с литературными данными и, по мнению Pasanen и Pelkonen (Fasanen & Pelkonen, 1989, 1990), определяется не только воздействием окружающей среды, но и генетическими факторами. Действительно, целый ряд исследований показал, что монооксигеназные активности существенно индуцируются в плаценте курящих матерей. Возникает ли эта индукция исключительно как ответ на внешние условия (например, курение), или генетические факторы играют определенную роль в регуляции активности монооксигеназ в настоящий момент недостаточно ясно.

Изучение генетически контролируемой индукции монооксигеназной активности в плаценте человека затруднено, но косвенные исследования по индукции дибензантраценом в лимфоцитах пуповинной крови и лимфоцитах матери показали, что наблюдается статистически значимая корреляция (г = 0.75, р<0.01) между плацентарной монооксигеназной активностью и индуцибельностью лимфоцитов пуповинной крови, но таковая отсутствует у лимфоцитов матери (Pelkonen et al, 1981).

Действие факторов радиации на модификацию монооксигеназных и конъюгационных активностей в плацентах матерей, которые родились значительно позднее 1962 года и непосредственно не подвергались радиоактивному облучению, может быть объяснено только в связи с нарушением генетического аппарата их родителей, проживавших на загрязненных радионуклидами территориях. Такая гипотеза выдвигается в настоящее время, и кажется довольно убедительной, однако она нуждается в экспериментальной проверке.

Исследование экстрактов плаценты рожениц Алтайского края в тесте Эймса.

Мы предприняли попытку применить методы гидрофобной экстракции ксенобиотиков, обладающих мутагенным эффектом в тесте Эймса, при исследовании тканей плаценты рожениц, дети которых страдали различными патологиями. Такая постановка исследований нам представлялась оправданной в связи с тем, что одной из возможных причин возникновения патологии является попадание в организм ксенобиотиков, которые, как правило,

обладают мутагенным и канцерогенным действием, выявляемым в тесте Эймса.

С другой стороны, даже если в основе возникновения исследуемых патологии лежит не действие химических агентов, попавших в организм, а других факторов, наличие в плаценте ксенобиотиков может привести к сочетанному действию этих факторов и мутагенных соединений. Проявление последствий этого воздействия может иметь пролонгированное действие и не выявляться в первый период развития ребенка.

В части образцов удалось выявить наличие мутагенных и промутагенных соединений. Однако надо иметь ввиду, что отрицательный результат может быть обусловлен по крайней мере тремя причинами. Во-первых, возможно, что в тканях исследуемых образцов, вообще отсутствует какое-либо значительное количество ксенобиотиков; во-вторых, присутствующие в тканях химические соединения, являющиеся причиной развития данного патологического процесса, не вызывают генных мутаций и, следовательно, не регистрируются в тесте Эймса, и, в третьих, предложенный метод экстракции ксенобиотиков недостаточно эффективен для получения из такого количества ткани действующих концентраций мутагенных соединений.

Одной из причин попадания мутагенных соединений в организм матерей является курение, в результате' которого в тканях плаценты происходит образование различных метаболитов бенз(а)пирена: эпоксиды, хиноны, фенолы и диолы. Низкая активность монооксигеназ плаценты может быть связана с дефектами родов, и, как теперь представляется вполне вероятным, с воздействием факторов окружающей среды. Хотя систематическое распределение ДНК повреждающих продуцируемых метаболитов могло бы теоретически приводить к образованию аддуктов с ДНК в таких тканях, как плацента.

Предшествующие исследования убедительно показывают, что сама по себе монооксигеназная система плаценты способна образовывать конечные канцерогенные и мутагенные продукты с потенциальным риском для функций плаценты и для благополучия плода. Имеющийся в нашем распоряжении экспериментальный материал не позволяет сделать достоверные выводы о накоплении в плаценте мутагенных соединений вследствие курения. В одном случае высокое содержание прямых мутагенов в плаценте роженицы может быть следствием ее профессиональной деятельности, связанной с хлорорганикой.

В группе матерей, проживающих на территориях, подвергшихся воздействию ядерных испытаний на Семипалатинском полигоне, в экстрактах плаценты чаще регистрируются мутагенные соединения. Это может быть объяснено тем, что при нарушении системы цитохрома Р-450 и снижении уровня активности ферментов конъюгации соответственно происходит и уменьшение скорости метаболизма мутагенных соединений. В результате этого, по-видимому, наблюдается увеличение концентрации прямых мутагенных соединений в плацентах женщин, проживающих на неблагополучных территориях. После метаболизма в микросомной системе генотоксичность исчезает, что подтверждает наше предположение о снижении активности ферментов детоксикации в плаценте и, возможно, в печени матерей, проживающих на неблагополучных территориях.

В заключении следует отметить, что использованные в этой работе методические подходы, основанные на измерении мембранной проницаемости эритроцитов, исследования перекисного окисления, ферментов детоксикации в микросмах плаценты и регистрация в этих тканей мутагенных соединений могут быть применены для диагностики скрытых мембранных патологий. Предложенные экспресс методы (при наличии необходимого оборудования) позволяют производить эпидемиологические обследования состояния здоровья населения в районах подвергавшихся радиактивному загрязнению.

При проведения мер по реабилитации населения районов Алтайского края подвергавшихся действию ядерных испытаний необходимо учитывать, что регистрируемые патологические состояния мембранных систем по-видимому могут быть в значительной мере нормализованы за счет введения в рацион продуктов, богаты витаминами группы Е, каротиноидами, и некоторыми другими соединениями, обладающими антиоксидантными свойствами и стимулирующими системы защиты организма от активных форм кислорода.

Рекомендуется проведение мероприятий по психологической реабилитации населения с целью снятия стрессорных факторов, являющихся одной из причин возникновения мембранных патологий, связанных с интенсификацией перекисного окисления липидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мембранные структуры клеток теплокровных и холоднокровных животных являются не только мишенью для ксенобиотиков и радионуклидов, но и эффективно реагируют на их воздействие изменением функциональной активности. При этом откликом на попадание в клетку целого ряда химических соединений , является индукция систем, осуществляющих метаболизм этих веществ. У холоднокровных животных (в первую очередь рыб) повышенный уровень моноокисгеназных активностей после воздействия ксенобиотиков сохраняется длительный период времени (в течение месяца и более), что позволяет эффективно использовать измерение этих активностей или анализ синтеза de novo в мембранах эндоплазматического ретикулума изоформ цитохрома . Р-450 в эколого-токсикологическом анализе как морских, так и пресноводных водоемов.

Более чем десятилетние исследования монооксигеназной системы печени байкальских рыб позволили нам заложить фундамент для проведения биохимического мониторинга различных регионов озера Байкала на основе изучения индукции монооксигеназ в печени рыб. Другим важным подходом является анализ характера увеличения активности детоксицирующих ферментов печени рыб в ходе затравок для исследования различных сточных вод и производственных потоков, что позволяет оценивать эффективность работы очистных сооружений.

Увеличение активности монооксигеназ в печени птиц и млекопитающих при попадании в клетку ксенобиотиков происходит в гораздо более сжатые сроки, индуцированные изоформы цитохрома Р-450 достаточно быстро разбираются (по-видимому за счет активации фосфолипаз и перекисного окисления липидов). Тем не менее, повышенный уровень активности ферментов системы цитохрома Р-450, как и ферментов второй фазы детоксикации в печени птиц может служить сигналом загрязнения мест их обитания опасными химическими соединениями. Рыбоядные птицы - вершина пищевой пирамиды и их использование в качестве тест-объектов (особенно на птичьих базарах) весьма перспективно.

Существует несколько тест-систем для прижизненного анализа активности монооксигеназ в печени человека (например анализ метаболитов амидопирина в слюне или моче и т. п. (см. например Арчаков, 1991). Известно много исследований индукции изоформ цитохрома Р-450 в плаценте женщин на разных стадиях беременности. • Было продемонстрировано повышение активности монооксигеназ при курении, под действием некоторых лекарств (Ре1копеп). Мы впервые предприняли попытку анализа действия факторов окружающей среды на уровень активности монооксигеназ в плаценте. Благодаря участию в государственной программе по ликвидации последствий ядерных испытаний на Семиполатинском полигоне (научный руководитель программы Я. Н. Шойхет), в течение четырех лет удалось проанализировать значительный материал. Впервые была показана не только возможность индукции монооксигеназ в плаценте женщин, работающих на вредных производствах (хлорорганика), но и исследованы мембранные нарушения в плаценте и форменных элементах крови, приводящие к патологиям новорожденных (различные желтухи). Такой подход может быть весьма эффективен, особенно не территориях, зараженных диоксинами - наиболее сильными и специфическими индукторами цитохрома Р-450.

Монооксигеназная система эндоплазматического ретикулума печени - электрон-транспортная цепь, для функционирования которой достаточно важно липидное окружение. С другой стороны известно, что липиды рыб легко модифицируются под воздействием факторов окружающей среды. Несмотря на громадное количество работ по анализу как жирных кислот, так и фосфолипидов в тканях рыб исследований фосфолипидного и жирнокислотного состава в микросомах печени не проводилось. Мы проанализировали изменения мембранных фосфолипидов байкальских рыб под воздействием индукторов монооксигеназ. Выяснилось, что несмотря на однонаправленный характер индукции цитохрома Р-450, фосфолипидный и жирнокислотный состав микросом меняется по разному у различных видов Байкальских рыб. Изменения фосфолипидного состава вызывалось и сточными водами Байкальского ЦБК. Изучение характера изменений фософолипидов и жирных кислот, а также перекисного окисления мембранных липидов

эндоплазматического ретикулума печени рыб позволяет выяснить физико-химические и биохимические механизмы действия ксенобиотиков.

Мембранные системы транспорта ионов также эффективно откликаются на попадание в организм ПАУ, ПХБ, тяжелых металлов. Оказалась, что эта система гораздо более чувствительна к действию радиации, чем комплекс ферментов, осуществляющих детоксикацию ксенобиотиков. В тканях человека они модифицируются даже малыми дозами радиационного облучения.

Система транспорта ионов в ядерных эритроцитах рыб гормонально-зависимая. Нам впервые удалось

продемонстрировать, что именно гормональная регуляции ионных переносчиков претерпевает наиболее существенные изменения под действием стресса, ПАУ, ПХБ, тяжелых металлов и радионуклидов. Эта система гораздо более лабильна, чем система детоксикации и может служить эффективным инструментом при исследовании влияния на рыб целого ряда антропогенных факторов.

На основе проведенных работ и анализа полученного материала предлагается концепция эколого-токсикологического анализа на основе биологических мембран.

Разработанные методы регистрации отклика мембранных структур клеток эндоплазматического ретикулума и эритроцитов могут быть использованы для холоднокровных животных, для теплокровных животных, человека.

Эколого-токсикологический анализ, исследование отклика экосистем на биохимическом уровне, на уровне клеточных мембран дает возможность решения проблем охраны живой природы. Использование для эколого-токсикологического анализа тест-систем на основе мембранных структур позволяет выявить группы риска как среди животных, обитающих на пораженных территориях, так и среди людей, подвергавшихся воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Анализ отклика мембранных структур на антропогенные факторы окружающей среды позволяет выяснять механизмы действия этих факторов и проводить прогноз развития патологических состяний.

ВЫВОДЫ

1. Определены уровни содержания цитохрома Р-450 и монооксигеназных активностей в микросомах печени различных видов рыб озера Байкал. Бычок подкаменка и бычок желтокрылка предложены в качестве тест-объекта для проведения биохимического мониторинга озера на основе отклика сиситемы цитохрома Р-450

2. Монооксигепазные системы эффективно индуцируются в печени всех исследованных видов рыб озера Байкал как ПАУ и ПХБ, так и при затравке сточными водами БЦБК в разведении 1: 5 и более высокими концентрациями. Однако на протяжении 10 лет исследований не удалось обнаружить изменений ЕСОО и ЕКОО в печени рыб, обитающих как в непосредственной близости от сброса сточпых вод, так и в центральной части озера Байкал.

3. В микросомах печени лещей Рыбинского водохранилища, отловленных в районе г. Череповца, происходит индукция изоформы цитохрома Р-4501А1 и монооксигеназных активностей, этот процесс не наблюдается в относительно чистых районах водохранилища.

4. Индукция монооксигеназных активностей в тканях рыб ПАУ и ПХБ сопровождается изменением фосфолипидного и жирнокислотного состава микросом печени. Эти изменения: а) носят видоспецифический характер; б) не связаны с активацией перекисного окисления липидов; в) не связаны с доступностью мембранных фосфолипидов фосфолипазе А2 .

5. В микросомах печени толстолобиков, находившихся в пРУДУ-охлаД11теле ЧАЭС во время аварии, в результате хронического облучения снижается активность ЕИОО и ЕСОО, что способствует накоплению ксенобиотиков в их тканях. В микросомах различных видов рыб, родившихся в пруду-охладителе через 4 года после аварии, уровень монооксигеназ соответствует норме.

6. Активность ферментов детоксикации ксенобиотиков в ткапях рыбоядных птиц (моевки) значительно выше, чем в печени рыб, которыми они питаются. Несмотря па это мутагеппыс и канцерогенные соединения эффективней накапливаются в ткапях птиц.

Мопооксигепазы моевок иптепсивно индуцируются ксенобиотиками и могут служить тест-системой для анализа загрязнения прибрежных морских экосистем.

7. Ахстивность ионтранспортирующих систем эритроцитов рыб, регулируется 3-агопистами и отвечает на появление в окруясающей среде ПАУ, ПХБ, тяжелых металлов и радионуклидов. Отклик иоптранспортиругощей системы посит как специфичный, так и неснецифичпый характер и его характер зависит от вида рыб.

8. Загрязпепие Рыбинского водохранилища сточными водами г.Череповца приводит к возрастанию в эритроцитах леща скорости работы неингибируемых фуросемидом систем облегченной диффузии калия и к увеличению их активации норадрепалипом. При этом уровни Ма+,К+,2С1~- котранспорта пе изменяются.

9. Анализ мембранной проницаемости эритроцитов, исследование кинетики аскорбат-зависимого перекисного окисления в эритроцитах, анализ ферментов детоксикации в микросомах плаценты и регистрация в пих мутагенных соединений могут быть применены для диагностики скрытых патологических отклонений в мембранных системах и позволяют проводить выявление групп риска среди населения, проживающего в подвергавшихся загрязнению райопах:

а) В венозной крови матерей, проживающих на территориях, подвергавшихся воздействию ядерных испытаний на Семипалатинском полигоне, и в пу повинной крови их новорожденных модифицированы системы транспорта одновалентных ионов.

б). Скорость аскорбат-зависимого липопереокисления достоверно увеличена в эритроцитах группы жителей районов, подвергавшихся действию ядерных испытаний, степень увеличения скорости соответствует повышению уровня

реставрированной дозы для района. Однако достоверных отличий между первым и вторым поколением во всех обследованных районах не обнаружено.

в) Монооксигеназное окисление ксенобиотиков в плацентах матерей, проживающих на территориях, подвергавшихся действию ядерных испытаний, подавлено, что, по-видимому, служит причиной накопления мутагенных соединений в их тканях.

10. Функциональный отклик мембран эндоплазматического ретикулума печени и системы транспорта ионов в эритроцитах клеток животных и человека на воздействие ксенобиотиков и радионуклидов может быть использован как для выяснения механизмов действия антропогенных факторов па клетку, так и для эколого-токсикологического анализа модифицированных экосистем, выделения групп риска, а также прогноза развития патологических состояний па территориях, загрязненных ксенобиотиками и радионуклидами.

Ряд исследоаний выполнялся при финансовой поддержке гранта РФФИ "Регуляция функциональной активности нейтрофилов, макрофагов и ядерных эритроцитов при изменении клеточного объема в норме и под воздействием факторов окружающей среды (ксенобиотики и радионуклиды)" № 96-0450232, грантом European Science Foundation - Toxicology and Environmental Toxicology (Fellowship "Biotransformation and accumulation mutagenic xenobiotics in fish tissues in modified ecological systems"), грантом INTAS "Antropogenic impact on Lake Baikal" Ref. № 94-0531) and NATO Environment (Linkage Grant).

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Котелевцев С.В., Каган В.Е., Данилов B.C., Козлов ЮЛХ, Тарусов Б.Н.. Перекисное окисление липидов при метаболизме иминоксильных радикалов в микросомах. \ В кн.: Биоантиокислители и регуляция окислительных процессов в клетке. Изд. МГУ. М., 1972. с.47-48.

2. Kotelevtsev S.V., Kagan V.E., Arkhipenko Yu.P. Kozlov Yu.P. Interrelation of membrane phospholipid peroxidation and electron transport in microsomes studied with the aid of nitroxide radical.\ Studia biophysica. 1974,v. 47, n. 2. p.133 -140.

3. Козлов Ю.П., Каган B.E., Бейм A.M., Добрина C.K., Котелевцев С.В. Тест-системы для биомониторнга на основе мебранно-связанных ферментных

комплексов. I. Исследование оксидаз со смешанной функцией в микросомах печени рыб - эндемиков озера БайкалД Биологические науки, №1, 1983, стр. 20-24.

4. Козлов Ю.П., Каган В.Е., Будина Н.Б., Ритов В.Б., Глазер В.М., Савов В.М., Степанова Л.И., Котелевцев C.B., Новиков КН.. Разработка эколого-токсикологической оценки промвыбросов предприятий целлюлозно-бумажной промышленности Восточно-Сибрского региона методами физико-химической биологии. \ В сб.: "Биологи МГУ - рыбному хозяйству", 1984, стр 87-92.

5. Котелевцев C.B., Степанова JIM., Глазер В.М., Ритов В.Б., Козлов Ю.П., Бейм A.M.. Применение методов физико-химической биологии для эколого-токсикологической оценки промвыбросов предприятий целлюлозно-бумажной промышленноетиД В сб.: "Проблемы охраны природы", 1984, стр. 86 -87.

6. Глазер В.М., Степанова ЛИ., Абилев С.К., Котелевцев C.B., Каган В.Е. Бейм A.M., Козлов Ю.П.. Тест-система для индикации сточных и природных вод на базе монооксигеназ печени рыб, осуществляющих метаболическую активацию ксенобиотиковД В сб.: "Методы биоиндикации и биотестирования природных вод", Ростов-на-Дону, 1985, стр. 97-102.

7. Котелевцев С. В., Кравцова Т. Н., Агеенко А.И., Кравцов Г.М., Козлов Ю. П.\ Трансмембранный потенциал лимфоцитов. Изменения при злокачественном росте. Иммунология, 4, 1985, стр. 13-16

8. Kozlov Yu-P., Kotelevtsev S.V., Novikov K.N., Panomareva L.V., Yesakova T.D.. Inductiov of monooxygenase activity in hepatic microsomes and immunocompetent cells of mice and rats by protein-aminoanthracene conjugates.\ In book: "Cytochrome P-450 and protection of human environment", 12-18 august, 1985, Moscow, p. 109-110

9. Котелевцев C.B., Стволинский С.Л., Бейм A.M., Эколого-токсикологический анализ на основе биологических мембран.\ М. МГУ, 1986, стр. 103

10. Котелевцев C.B., Степанова Л.И., Козлов Ю.П.. Эколого-токсикологический контроль за состоянием окружающей среды методами физико-химической биологии. \"Биологические науки", 1986, N 1, стр. 19-30

11. Котелевцев C.B., Степанова Л.И., Комаров П.Г., Новиков К.Н., Глазер В.М., Бейм A.M., Козлов Ю.П. Тест-система для биомониторинга мембранно-связанных ферментов. V. Индукция монооксигеназ со смешанной функцией в микросомах печени байкальских рыб.\ Биологические науки, 1986, № 9, стр. 27-32

12. Котелевцев C.B., Степанова Л.И., Новиков К.Н. Биотестирование канцерогенов с помощью монооксигеназных реакций печени рыбД В сб.:

"Канцерогены и экосистемы", Киев, 1986, стр. 8-9

13. Котелевцев С.В., Степанова Л.И., Глазер В.М., Буевич Г.В., Бейм А.М. Монооксигенааные пути метаболизма полициклических ксенобиотиков в тканях рыб.\ В сб.: "Цитохром Р-450 и охрана окружающей Среды", Новосибирск, 1987, с. 61.

14. Котелевцев С.В., Степанова Л.И., Буевич Г.В., Бейм A.M., Козлов Ю.П., Пономарева JI.B. Индукция с помощью полициклических ароматических углеводородов активности монооксигеназ в тканях рыб. \"Экспериментальная онкология", 1987, т.9, п. 5, стр. 29-32.

15. Котелевцев С.В., Глазер В.М., Бейм А.М., Козлов Ю.П., Пономарева Л.В., Новиков К.Н. Метаболизм канцерогенных соединений в тканях пресноводных рыб. \В кн.: "Применение научных разработок ученых-биологов в рыбном хозяйстве", 1987, стр.18-19.

16. Глазер В.М., Степанова Л.И., Абилев С.К., Котелевцев С.В., Каган В.Е., Бейм А.М., Козлов Ю.П.. Тест-система для биоиндикации сточных и природных вод на базе монооксигеназ печени рыб. \В сб.: "Методы биоиндикации и биотестирования природных вод", Ленинград, 1987, 1, стр.12-18

17. Poznyakov S., Panteleev A., Kotelevtsev S., Alekseyeva N., Botcharov B. Retinoic acid euhaces the effects of the vitamin A status in wistar rats. In Book Dioxin 88. The 8-th Int. Sump, on Chlorinated Dioxins and related compounds. Umea, Sweden, 1988 Tox P08.

18. Kotelevtsev S.V., Viner H.I., Ponomareva L.V., Novikov K.N., Kozlov Yu.P. An immunochemical analysis of citochrome P-450 isoforms induced by 3-methylcholanthrene, b-naphtoflavone and Arochlor 1254 in the liver of freshwater fish. \Symp. "Drug methabolizing enzime systems", Bulgaria, Varna, Oct 1989, p.18.

19. Котелевцев C.B., Пономарева Л.В., Полуэктов В.Ф., Винер Р.И., Шевцов В.К.. Хроматомасс-спектрофотометрическое исследование жирнокислотного состава микросом печени карпов в норме и после инъекции Совола и 3-метилхолантрена. \Тез. конф. молодых ученых: "Применение масс-спектрометрии в биологии и медицине", Харьков, 1989, с. 71

20. Орлов С.Н., Скрябин Г.А., Котелевцев С.В., Козлов Ю.П.. Транспорт одновалентных ионов в эритроцитах карпа: Механизм и регуляция. \Биологические мембраны, 1989, 6, 12, стр. 1261-1267.

21. Котелевцев С.В. Эколого-токсикологический анализ природных и сточных вод с помощью исследования индукции цитохрома Р-450 в тканях рыб. \В сб.: "V Всесоюзная конференция Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989, с. 54

22. Котелевцев С. В., Степанова Л.И., Пономарева Л.В. Бейм A.M., Козлов Ю.П.. Метаболическая активация ксенобиотиков монооксигеназами тканей гидробионтов в морских и пресноводных экосистемах. \В сб.: "V Всесоюзная конференция Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989, с.319

23. Ponomareva L.V., Isuev Н.Р., Kotelevtsev S.V. Beim A.M. Novikov K.N.. Citochrome P-450 isoforms induced by hidrophobic xenobiotic in adult fish tissues and during embriogenesis. \Symp. "Drug methabolizing enzime systems", Bulgaria, Varna, Oct. 9-13, 1989, p. 75.

24. Степанова Л.И., Котелевцев C.B., Глазер В.М., Буевич Г.В., Бейм A.M.. Исследование в тесте Эймса накопления мутагенных соединений в тканях гидробионтов и позвоночных после действия сточных вод. \"Рыбохозяйствештя токсикология", тез. докл. I Всес. конф., Часть П, Рига 1989, с. 133-134.

25. Бейм А.М., Глазер В.М., Котелевцев C.B. Изучение мутагенных эффектов шлам-лигнина. \В сб.: "Проблемы экологической химии и токсикологии в охране природы". Тез. докл. к конференции, Вайкальск, 1990, с.34-35.

26. Бейм A.M., Клюев H.A., Котелевцев C.B.. Идентификация хлорированных углеводородов в сточных водах сульфатно-целлюлозного производства. \В кн.: "Проблемы экологической химии и токсикологии в охране природы". Тез. докл. к конференции, Байкальск, 1990, с. 43-45.

27. Болдырев A.A., Котелевцев C.B., Руиц М.Е. JL, Валкарсуд С.А., Алварес A.A.. \Введение в биомембранологию. МГУ, Москва, 1990, с. 221.

28. Глазер В. М., Котелевцев C.B., Степанова Л.И., Абилев С.К, Буевич Г.В., Бейм A.M. Оценка на мутагенность в тесте Эймса сточных вод и производственных потоков Байкальского целлюлозно-бумажного комбината.. "Биологические науки", 1990, N 1, с.101-109.

29. Котелевцев C.B., Пономарева Л.В., Новиков К.Н., Винер Р.И., Козлов Ю.П., Хаценко О.Г., Митрофанов Д.В. Иммунохимический анализ индукции цитохрома Р-450 в печени пресноводных рыб 3-метилхолантреном, ß-нафтофлавоном и Арохлором 1254. \ Биологические науки, 1990, 5, 23-29.

30. Котелевцев C.B., Каренгин C.B., Степанова Л.И., Малютин О.В., Глазер В.М. Исследование экстрактов тканей гидробионтов Каспийского моря, Черного моря и озера Байкал в тесте Эймса. \"Образование канцерогенных N-нитросоединений в экосистемах", Тез. докл. 2 Всесоюзн. симп., Киев, 1990, с.69.

31. Скрябин Г.А., Петруняка В.В., Орлов С.Н., Котелевцев C.B., Козлов Ю.П. Особенности активности аденозхдатрифосфатаз в эритроцитах карпа, обработанных сапонином. \ Биохимия. 1990, 55, 8, 1503-1506.

32. Степанова Л.И., Каренгин С.В., Котелевцев С.В., Глазер В.М. Генотоксичность экстрактов шдробионтов различных районов Каспийского и Черного морей. \В кн.: Эколого-генетический мониторинг состояния окружающей среды. Мат. секции генетические аспекты проблемы "Человек и биосфера"(5-8 сентября) Караганда, 1990, с. 114.

33. Орлов С.Н., Скрябин Г.А., Котелевцев С.В., Козлов Ю.П. Рецептор и объем-зависимая регуляция Na-K-Hacoca и ионных переносчиков в эритроцитах рыб. \Биологические науки, 1990, №. 6, с. 27-37.

34. Ruiz М.Е. L., Valcarcel С.А., Alvarez Р.Р., Boldirev A.A., Kotelevtsev S.V. -Introduction al estudio de las biomembranas. -\ Impreso en GENIC, Habana, 1990, p. 142, (in Spanish)

35. Глазер B.M., Котелевцев C.B., Степанова Л.И., Бейм А.М., Буевич Г.В., Листова Н.К., Генетический мо1ШТоринг сточных вод. \В кн. Мониторинг и оценка состояния Байкала и Прибайкалья. Ред. Ю.А. Израэль и Ю.А. Анохин, Ленинград, Гидрометиоиздат, 1991 г., с. 169-175.

36. Исуев А.Р., Пономарева Л.В., Коссова Г.В., Котелевцев С.В., Бейм A.M. Мембранные липиды и монооксигеназы в период эмбриогенеза вьюна в норме и после инъекции рыбам З-метилхолантрена и Совола 54. \Биологические науки, 1991, N 1, с. 32-38.

37. Котелевцев С.В., Скрябин Г.А., Ребров В.Г., Рязкский Г.Г., Орлов С.Н. Влияние З-метилхолантрена и Совола на транспорт одновалентных катионов в эритроцитах карпа.\ Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии, 1991, 27, 3, с. 295-299.

38. Kotelevtsev S.V., Hanninen О. Biotechnology in analysis water ecosystems: hydrobionts tissue isoforms of cytochrome P-450. -\ In: "Cytochrome P-450: Biochemistry and Biophysics", 1991, Proceed, of the 7-th Intern. Conference. Eds. A.I. Archakov, G.V. Bachmanova, Held in Moscow, Russia, July 28 aug.-2 sept.1991, p. 475-480.

39. Ponomoreva L., Kotelevtsev S., Pospholipid and fatty acid composition of lipids in liver microsoms of freshwater fish. Effect of induction of monooxygenase with polycyclic aromatic hydrocarbons and polychlorinated biphenils. \In: "Cytochrome P-450: Biochemistry and Biophysics", 1991, Proceed, of the 7-th Intern. Conference. Eds. A. I. Archakov, G. V. Bachmanova, Held in Moscow, Russia, July 28 aug.-2 sept.1991, p. 607-610.

40. Скрябин Г.А., Котелевцев C.B., Орлов C.H. Объем-зависимая регуляция Na и К транспорта в эритроцитах рыб. \Доклады МОИП, серия "Общая биология", 1991 с. 41.

11. Beim A., Hanninen О., Kotelevtsev. S.V., Glaser V.M The Biomonitoring of Cellulose Mill Waste Water in Lake Baikal:\ 7th International Bioindicators Symposium and Workshop on Environmental Health, Kuopio , Finland, September 28 - October 3, 1992, P 6, p. 60.

12. Khafagi O.L, Kotelevtsev. S.V., Stepanova L.I., Ryabov I.N. Monooxygenase system of freshwater fish under basin pollution by xenobiotics and radionuclides. -\ In: 7th International Bioindicators Symposium and Workshop on Environmental Health, Kuopio , Finland, September 28 - October 3, 1992, P 33, p. 82.

13. Kotelevtsev. S.V., Novikov K.N., Obrraztsov V.V., Stepanova L..L, Ponomareva L.V. Monooxygenase and and conjugating actvities in placentae of mathers of new-born Suffering from hemolitic Jaundicesln: \7th International Bioindicators Symposium and Workshop on Environmental Health, Kuopio , Finland, September 28 - October 3, 1992, P 37, p. 46.

14. Орлов C.H., Ко-тслевцсв C.B., Скрябин Г.А. Новиков К.Н., Степанова Л.И., Образцов В.В., Брусованик В.И. Мембраны форменных элементов крови и ферменты детоксикации ксенобиотиков. Ядерные испытания, окружающая среда и здоровье населения Алтайского края. Мат. научных исследований, 1993, т.7, с. 7-40.

15. Kotelevtsev S.V., Stepanova L.I., Glaser V.M., Biomonitoring of Genotoxisity in Coastal Water. \In book Biomonitoring of Coastal Waters and Estuaries. Kramer, K.J.M. ed., CRC Press Inc.,1993 p. 227-245.

16. Котелевцев C.B., Степанова Л.И. Биотестирование канцерогенных и мутагенных компонентов в водных экосистемах. \Журнал Российского химического общества, 1994, N 1, с. 87-93.

17. Kotelevtsev S.V., Grosheva E.I., Beim A.M., Rybov I.N. Accumulation of metals in fresh water ecosystems and ecotoxicological analysis of their action on base of the biological membrane of the water animals cells. \In book "77th CSC Conference". Winnipeg, Manitoba. 1994, p. 102

48. Kotelevtsev S.V., Stepanova L.I. Helth environment of Altai territory and monooxygenase and conjugating actvities in placentae of new-born. \In book "Molecular aspects of oxidative drug metabolizing enzymes: Their significance in environmental toxilogy, chemical carcinogenesis and healh." NATO ASI Series. Series H: Cell Biology, Vol. 90. E. Arinc et all ed. Sprinfr-Verlag Berlin Heidelberg 1995 p. 567 - 589.

19. Kotelevtsev S.V., Stepanova L.I. Biochemical and genotoxical monitoring of ecosystems with special reference to Lake Baikal and Northern Black Sea. \In book "Molecular aspects of oxidative drug metabolizing enzymes: Their significance in environmental toxilogy, chemical carcinogenesis and healh."

NATO ASI Series. Series Н: Cell Biology, Vol. 90. E. Arine et all ed. Sprinfr-Verlag Berlin Heidelberg 1995 p. 624-666.

50. Kotelevtsev S.V., Obraztsov V.V., Novikov K.N., Stepanova L.I., Brusovanik V.I., Schoychet J.N., Hanninen O. Placental monooxygenase and conjugating activities of Altay newborns suffering from hemolytic jaundice. \In book: "Bioindicators of enviromental health." Ed. M. Munovar et al. SPB Academic Publishing bv/Amsterdam. 1995. p. 251 - 263

51. Нагдалиев Ф.Ф., Котелевцев C.B., Козловская В.И., Герман А.В. Влияние ксенобиотиков на транспорт ионов и его адренергическую активацию в мембранах эритроцитов леща Abramis brama (L.) и карпа Cyprinus carpio (L.) (сем. Cyprinidae). \Вопросы ихтиологии.- 1995.- №.3, с. 394 - 401.

52. Нагдалиев Ф.Ф., Котелевцев С.В., Козловская В.И., Герман А.В., Орлов С.Н. Исследование транспорта ионов и его гормональной регуляции в эритроцитах леща Abramis brama (L.), инъецированного смесью отечественных полихлорироанных бифенилов. \Бюллетень экспериментальном биологии и медицины.- 1995.- 122., №10, с.14-18.

53. Нагдалиев Ф.Ф., Котелевцев С.В. Влияние ксенобиотиков на транспорт ионов и его гормональную регуляцию в мембранах эритроцитов рыб.\ Тез. докл. Междунар. конф. "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды", 12-16 сентября 1995г., г.Томск, 1995.- Т.2.- с. 263.

54. Нагдалиев Ф.Ф., Котелевцев С.В. Транспорт ионов и его гормональная регуляция в эритроцитах рыб при стрессе. \Вопросы ихтиологии.- 1995.-№.6 с. 22-27

55. Шевченко А.С., Кобялко В.О., Шевченко Т.С., Брусовник В.И., Котелевцев С.В. Оценка мембранных характеристик клеток крови у жителей районов Алтайкого края, подвергшихся воздействию ядерных испытаний. \Вестник научной программы "Семипалатинский полигон - Алтай". 1995, №2, стр. 72 - 80.

56. Котелевцев С.В., Нагдалиев Ф.Ф., Скрябин Г.А. Влияние радионуклидов на транспорт ионов и его гормональную регуляцию в мембранах эритроцитов рыб. \Вопросы ихтиологии,- 1996,- №1, с. .21-34.

57.

Lindstrom-Seppa P., Huuskonen S., Kotelevtsev S., Mikkelson P., Rasanen Т., Stepanova L. \Evaluation of pollutant contamination in Lake Baikal: Chemical composition, toxicity and mutagenicity of waste waters from Baikalsk pulp and paper mill. In book 9 th International Symposium on Pollutant Responses in Marine Organisms (PRIMO 9) Buggers, Norway, 1997, p. 27

С. В. Котелевцев

Список сокращений

БЦВК - Байкальский целлюлозно- анн -

бумажный комбинат.

сбт-

дмсо - диметилсульфоксид

ессш -

ддт - дихлордифенилтрихлор-

метилметан

жк - евсю -

жирные кислоты

ма - метаболическая активация ьрь -

мда - малоновый диальдегид мс -

моа - монооксигелазная ш, -

активность

пау- мабр(н)

полициклические

углеводороды

пол - перекисное окисление рн -

липидов

рне -

ПХБ - полихлорированные

бифенилы

РБ -ТОР

бенз(а)пирен гидроксилаза

глутатион Б-трансфераза

7- этоксгасумарин-О-деэтилаза

7- этоксирезоруфин- О-деэтилаза

лизофосфолипиды

метилхолантрен,

нейтральные липмды,

-никотинамидаденин-динуклеотидфосфат постановленный

фосфатидилхолин,

фосфатидилэтаноламин,

фосфатидилсерин

УДФ-глюкуронозилтранс-фераза

сАМР - циклоаденозиямонофосфат

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ................ 3

Актуальность проблемы................................. 3

Цель исследования...................................... 4

Научная новизна....................................... 4

Практическая значимость работы........................ 5

Апробация работы....................................... 5

Публикации............................................ 6

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ............................. 6

Материалы и методы.................................... 6

Результаты и обсуждение................................ 9

Биохимический мониторинг пресноводных экосистем на основе цитохрома Р-450 .................................. 9

Липиды мембран эндоплазматического ретикулума рыб и птиц в норме и под воздействием полициклических углеводородов и полихлорированных бифенилов............ 20

Отклик мембран эритроцитов пресноводных рыб на воздействие ксенобиотиков и радионуклидов................ 27

Гормональная регуляция Ма+,К+-насоса.................. 30

Влияние радионуклидов на ионный гомеостаз эритроцитов пресноводных рыб........................................ 30

Влияние радионуклидов на ионный гомеостаз эритроцитов пресноводных рыб....................................... 32

Регуляция Ма+,К+-насоса норадреналином в эритроцитах после инъекции карпам радионуклидов.................... 34

Системы облегенной диффузии калия .................... 35

Влияние Совола-54 на транспорт ионов и его гормональную регуляцию в мембранах эритроцитов рыб................... 35

Совместное действие Совола-54 и 45Са на ионный транспорт

эритроцитов рыб....................................... 38

Ионный транспорт и его гормональная регуляция в эритроцитах леща, обитающего в различных районах Рыбинского водохранилища............................... 40

Ионный гомеостаз в клетках крови рыб пруда-охладителя ЧАЭС и Киевского водохранилища ........................ 41

Активность монооксигеназной системы (ЕКОБ) в микросомной фракции рыб пруда-охладителя АЭС и Киевского водохранилища...........................................46

Мембранные структуры клеток крови и тканей плаценты жителей районов Алтайского края, подвергавшихся действию испытаний ядерного оружия.............................. 50

Исследование функциональной активности мембранно-связанных систем клеток крови у рожениц из различных районов Алтайского края................................. 53

Транспорт ионов Са2+ в эритроцитах доноров различных поколений в Алтайском крае.............................. 55

Исследование мембранных ферментов детоксикации ксенобиотиков в плаценте рожениц Алтайского края......... 57

Исследование экстрактов плаценты рожениц Алтайского края в тесте Эймса........................................... 62

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................65

ВЫВОДЫ ........................................................................................68

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ................70

Список сокращений........................................................................77