Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт ионов в эритроцитах пресноводных рыб в норме и под воздействием загрязнителей

ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Транспорт ионов в эритроцитах пресноводных рыб в норме и под воздействием загрязнителей"

р Г Б ОД

9 '5 ]Ь!л6„

<•'• МОСКОВСКИМ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Нагдалиев Фархад Фарманович

Транспорт ионов в эритроцитах пресноводных рыб в норме и под воздействием загрязнителей

03 . 00 . 10 - ихтиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

_____ кандидата_биологических_наук__

Москва-1995

Работа выполнена на Биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководители: доктор биологических наук, профессор

Е. А. Криксунов кандидат биологических наук С. В. Котелевцев

Официальные оппоненты: доктор биологческих наук Н. Д. Озернюк

доктор биологических наук О. Р. Колье

Ведущее учреждение: Институт озероведения Российской

Академии наук, г. Санкт-Петербург

Защита диссерации состоится "_"_ 1996 г. в_ч.

на заседании специализированного Ученого Совета Д.053.0. _при Биолоическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, ауд._.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Отзыв в двух экемплярах просим направлять по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, специализированный Ученый Совет Д.053.05.71, ученому секретарю.

Автореферат разослан "_"_ 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А. Г. Дмитриева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время природная среда испытывает все усиливающееся антропогенное воздействие. В водных системах концентрируются значительные количества загрязнителей различной природы, среди которых особой опасностью выделяются канцерогенные и мутагенные вещества, тяжелые металлы и радионуклиды. Они способны аккумулироваться в тканях рыб, находиться там длительное время и изменять ход важнейших процессов жизнедеятельности организма.

За последние десятилетия накопился обширный экспериментальный материал о реакции рыб на стресс-факторы. Растущий уровень антропогенного воздействия на природные популяции рыб делает необходимым разрешение вопроса об адаптивных возможностях их организма, степени его резистентности и чувствительности. Поэтому особую ценность могут представлять данные изучения наиболее чувствительных, быстро реагирующих и легко модифицирующихся систем организма. В число последних входят клеточные мембраны системы, осуществляющие транспорт ионов и участвующие в передаче сигнала от мембранных рецепторов е клетку. Однако до сих пор характер и степень их реакции на изменения условий окружающей среды исследовался лишь фрагментарно.

С другой стороны, при мониторинге водных экосистем индивидуальный анализ химических компонентов в окружающей среде и особенно в тканях животных и растений необходим, однако не всегда возможен, так как, во-первых, часто не известен даже класс химических соединений, которые нужно контролировать, а во-вторых, действующие концентрации некоторых ксенобиотиков столь малы, что для химико-аналитического контроля не всегда достаточно далее специальных высокочувствительных и дорогостоящих методов анализа (например масспектрометрии) (Хмельницкий P.A. и Бродский Е.С., 1990) Кроме этого, ряд биологически активных веществ (например радонуклпды) не стабилен и после взаимодействия с биологической мишенью в короткие сроки распадается.

Эти условия объясняют возрастающий в настоящее время интерес к изучению отклика экосистем на антропогенные воздействия. При этом необходимо проводить исследования на различных уровнях организации живых систем. Анализ изменений на молекулярном и мембранном уровне дает возможность регистрировать биохимические нарушения в клетках, которые

могут привести к далеко идущим последствиям для данного вида организмов задолго до того, как наступят необратимые изменения в численности, биологической продуктивности, ареале распространения вида и т. п.

При проведении биохимического мониторинга, позволяющего выявить антропогенные воздействия на клетку, одной из наиболее удачных систем являются мембранные структуры тканей животных, так как именно они являются мишенью для большинства токсикантов и ионизирующей радиации.

Поэтому, с нашей точки зрения, анализ транспорта ионов в эритроцитах рыб имеет существенное значение для понимания механизмов повреждения важнейших систем мембран холоднокровных животных в условиях антропогенного изменения среды их обитания. Кроме того на базе этих исследований могут быть разработаны высокочувствительные тест-системы для биохимического мониторинга водных экосистем.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основная цель работы заключалась в исследовании модификации транспорта ионов и его гормональной регуляции в эритроцитах пресноводных рыб под воздействием некоторых антропогенных факторов.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ активности различных ионтранспортирующих систем эритроцитов рыб в норме, в условиях неспецифического стресс-синдрома и под воздействием загрязнителей водной среды, таких как полихлорированные бифенилы (ПХБ), тяжелые металлы (кадмий), радионуклиды, а также загрязнители Рыбинского водохранилища в районе г.Череповца.

2. Исследовать регуляцию систем ионного транспорта эритроцитов рыб Р-адренергическими препаратами.

3. Установить, какие из исследуемых систем являются наиболее чувствительными к стресс-факторам различной природы, выявить специфические и неспецифические эффекты.

4. Оценить возможные механизмы модификации ионного транспорта и его гормональной регуляции при антропогенном изменении условий окружающей среды.

5. Выявить межвидовые различия реакции данных систем на внешние воздействия у исследованных видов рыб.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В настоящей работе представлены первые данные о действии полихлорированных бифенилов и радионуклидов на системы транспорта ионов в эритроцитах рыб.

Впервые проведен анализ ионтранспортирующих систем и их гормональной регуляции в эритроцитах леща Abramis brama L.

Впервые установлено, что потеря гормонального контроля над системой активного транспорта ионов в эритроцитах рыб при стрессе не связана с нарушением функции ß-рецепторов или С5-белков.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. В результате проведенных работ предложены тест-системы на основе использования анализа активности систем ионного транспорта эритроцитов для биотестирования состояния организма рыб, оценке его адаптивного потенциала и прогнозировании реакции на изменяющиеся условия внешней среды. Тест может быть применен для решения задач охраны окружающей среды и биомониторинга.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы окружающей среды" (Томск, 1995), семинарах лаборатории физико-химии биомембран Биологического факультета МГУ (1993, 1994), на заседании кафедры ихтиологии Биологического факультета МГУ (1993, 1994, 1995).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.

Работа изложена на _ стр. Содержит _ рисунков и _ таблиц. Список

литературы включает источника, из которых опубликовано в

отечественных и - в зарубежных изданиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Леща Abramis brama L. промысловых возрастов отлавливали на Рыбинском водохранилище донным тралом и щадящими орудиями лова (невод, вентеря). Затем рыбу помещали в садки и выдерживали до взятия крови разные сроки. В контрольную группу вошли рыбы, кровь у которых забирали после вылова щадящими орудиями лова немедленно.

Карпа Cyprinus carpió L. завозили с Московской живорыбной базы, отгрузка рыб сопровождалась выдерживанием на воздухе и механическим

травмированием. Кровь забирали у рыб сразу после отгрузки и через 2 недели адаптации в аквариумах.

Карпа двухлетнего возраста отлавливали из садков водоема-охладителя Чернобыльской АЭС. В качестве контрольной группы использовали карпов из пруда-охладителя Шатурской ГРЭС.

Карпам-трехлеткам, содержащимся в 300-литровых аквариумах, вводили смесь отечественных полихлорированных бифенилов совол-54 в дозе 50 мг./кг. и 45Са в дозе ХМБк/кг (объем вводимой смеси для всех рыб не превышал 1мл.). 45Са растворяли в стерильном фосфатном буфере рН 7.4. (среда А), совол-54 - в оливковом масле. Контрольным карпам вводили фосфатный буфер без радионуклида и чистое масло, кровь отбирали через 15 дней после инъецирования.

Леща, содержащегося в садках, внутрибрюшинно инъецировали соволом-54 в дозах 50, 100 и 150 мг/кг. Контрольным рыбам вводили чистое масло. Кровь отбирали через 5 и 10 дней после инъецирования.

Леща отлавливали в прилегающей к г.Череповцу загрязненной различными поллютантами зоне Рыбинского водохранилища. В качестве контрольной группы использовали леща из устья реки Шексны.

Радужную форель Salmo gairdneri Rich., завезенную с Зеленоградской живорыбной базы, после предварительной адаптации выдерживали в воде с CdS04 в течение двух суток.

Кровь у рыб забирали из сердца с помощью шприца, смоченного раствором гепарина в среде А (1000 ед/мл). Среда А содержала: 145 мМ NaCl, 5 мМ фосфатный буфер (рН 7.4 при 20-50° С). Затем кровь центрифугировали (900 g) и осажденные эритроциты отмывали от плазмы и клеток белой крови 4 раза в среде А.

В экспериментах in vitro эритроциты инкубировали в среде, содержащей совол-54 (0,02 мг/мл). Время инкубации- 1ч. Затем клетки отмывали и подвергали собственно ингибиторному анализу.

Отмытые в фосфатном буфере рН 7.4 эритроциты карпов и форелей инкубировали 2 ч. с CdS04 при концентрации 0,2 мМ. Затем клетки отмывали и подвергали собственно инкубации с 86Rb.

Хранение крови, прединкубацию, инкубацию, определение радиоактивности и расчет скорости входа и выхода 86Rb и 22Na проводили по способу, описанному Орловым (Орлов и др., 1989).

Об активности Na+,K+-Hacoca судили по величине уабаин-ингибируемой компоненты входа s6Rb; - о Na^K^Cl"- и ингибируемой фуросемидом доли К'.СГ-котранспорта - по величине фуросемид-ингибируемой компоненты входа ;liRb; - о пассивной диффузии калия из эритроцитов- по величине фуросемид-неингибируемой компоненты выхода StlRb; - о пассивной диффузии натрия в эритроциты- по величине амилорид-, фуросемид-неингибируемой компоненты входа --Na; - о пассивной проницаемости мембраны- по величине уабаин-, фуросемид-неингибируемой компоненты входа BeRb (Орлов и др., 1989).

Результаты подвергали статистической обработке с использованием критерия достоверности Стьюдента по программе Statgraf.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ИЗМЕНЕНИЯ РАБОТЫ ИОНТРАНСПОРТИРУЮЩИХ СИСТЕМ ЭРИТРОЦИТОВ РЫБ В УСЛОВИЯХ ОБЩЕГО АДАПТАЦИОННОГО СИНДРОМА.

Na+,K+-Hacoc эритроцитов леща и карпа неодинаково реагирует на

стрессирующие воздействия вылоЕа и искусственного содержания. У леща его скорость достоверно постоянна в любых условиях (табл. 1), тогда как у карпа после травмирующего вылова она в 6 раз выше, чем после адаптации (р<(),01) (табл. 2) Разница в реакции Na+,K+'Hacoca на острый стресс у леща и карпа вызвана, по нашему мнению, различиями в механизмах регуляции этого переносчика, разной структурной устойчивостью мембраны эритроцитов, а также особенностями нейрогуморальной реакции этих видов рыб на стрессирующие воздействия.

Относительный вклад Na^,K+-Hacoca в общий вход ll6Rb в эритроциты леша в контрольных группах колеблется в пределах 89-92 "/с, после выдерживания в садках он составляет уже 52-76 %, а после 15-дневного выдерживания рыбы, травмированной в трале- вообще только 50% (табл. 1). Снижение относительного вклада Na^.K'-nacoca в общий вход i!"Rb происходит, по-видимому, из-за возрастания Na",K~,'2Cl*- и КЛ,СГ-котрацспирта в клетку, а также за счет увеличения пассивной проницаемости мембраны. Так, у рыб, выдержанных в садках 15-25 дней, котранспорт в 3-4 раза выше, чем в контрольной группе (р<0,05) (р<0,01). Пассивная проницаемость мембраны эритроцитов лещей, пойманных щадящим орудием лова и выдержанных 15-25 дней в садках, возрастает в 2-4 раза по сравнению с контролем (р<0,05), а у

рыб, травмированных тралом, после 15-дневной экспозиции - в 6-10 раз (р<0,01) (табл. 1).

Таблица 1

Транспорт ионов (ммоль/л ч) и его гормональная регуляция в эритроцитах леща в

условиях общего адаптационного синдрома (М± т).

Ионтранспорт. система, ингибитор Na'*',K+-Hacoc, 0,2 мМ уабаин Котранспорт, 0,5 мМ фуросемид Пассивная проницаемость мембраны

Группы рыб Без +10"" мМ нор-на нор-н Без +10"6 мМ нор-на нор-н Без +10-6 мМ нор-на нор-н

Контроль (вентеря) 4,33 ± 0,6 14,74 ± 1,2" 0,13 ± 0,03 0,44 ±0,1 0,201 ± 0,02 0.34 ± 0,1

Контроль (невод) 1,85 ± 0,2 4,06 ± 0,8 0,22 ± 0,05 0,43 ± 0,2 0,251 ± 0,01 0,45 ± 0,1

Щадящий лов, 15 сут. выдерж. 1,73 ± 0,6 1,46 ± 0,9 0,88 ± 0,4' 1,45 ± 0,2" 0,72 ± 0,02* 1,24 ± 0,2*

Щадящий лов, 20 сут выдерж. 2,93 ±1,5 3,13 ±1,6 0,46 ± 0,3 0,80 ± 0,5 0,48 ± 0,2 1,42 ± 0,6*

Щадящий лов, 25 сут, выдерж. 1,38 ± 1,0 2,25 ± 1,3 0,61 ± 0,3* 1,17 ± 0,6* 0,64 ± 0,3* 1,87 ± 0,4"

Травмир. лов, 15 сут. вьщерж. 2,00 ± 0,4 1,98 ± 0,2 0,69 ± 0,3* 1,29 ± 0,4* 1,31 ± 0,2" 2,18 + 0,2"

Прим.: * — р<0,05; ** — р<0,01.

Уровень На+,К+,2С1"- и К+,С1"-котранспорта в клетку у карпов, выдержанных в аквариумах 2 недели, в 1,5-2,0 раза ниже, чем при остром стрессе (р<0,05). Пассивная проницаемость мембраны также в 2,0 раза ниже в этой группе рыб (р<0,01). (табл. 2).

Таблица 2

Активность ионтранспортирующих систем (ммоль/л ч) в норме и при (3-адренергической активации в эритроцитах карпа после стресса вылова и 2-хнедельной

адаптации (М± ш).

Ионтранспортирующая система, ингибитор Добавление в среду инкубации Скорость входа Адаптация 2 нед. ""КЬ, ммоль./ л/ч Стресс вылова, выдерж. на воздух«

Ыа+, К+- насос, 0,2 мМ уабаин норадреналин (Ю-6 М); форсколин (Ю-4 М) 4,754 i 0,52" 8,842 i 0,68** 9,128 i 1,13*» 29,929 ± 0,85** 32,271 ± 1,3** 28,399 ± 1,02"

Котранспорт, 0,5 мМ фуросемид норадреналин 10"6 М 0,881 i 0,05* 1,019 ± 0,16 1,142 ± 0,23 0,662 * 0,32

Пассивная проницаемость мембраны норадреналин 10"6 М 1,880 i 0,49" 2,061 i 0,13* 3.728 * 0,12" 4,537 ± 0,36*

Прим.: * - р < 0,05 " - р < 0,01

Как видно из представленных данных, уровни транспорта ионов через системы облегченной диффузии, ингибируемые фуросемидом, Есегда выше в клетках, взятых у рыб после острого стресса и на стадии истощения по Селье.

Анализ ряда литературных данных (Mazeaud М. and Mazeaud F., 1981: Railo et. al, 1985) позволяет предположить, что при стрессе, вызванном выловом, эритроциты лещей и карпов неспособны в искусственной среде инкубации полностью восстановить свой нормальный объем. Поэтому у этих рыб мы и наблюдаем более высокие уровни котранспорта и других систем облегченной диффузии.

В эритроцитах леща и карпа контрольных групп при добавлении в среду инкубации норадреналина скорость работы Na+,K+-Hacoca возрастает в 1,5-3 раза (табл. 1, 2). Однако у лещей, содержащихся после вылова в искусственных условиях, в первые 2-2,5 недели теряется способность Na+,K+-Hacoca отвечать на активацию норадреналином in vitro (рис. 1). То-же самое происходит при остром стрессе у карпов (табл. 2). У лещей гормональный контроль над переносчиком начинает восстанавливаться к концу третьей недели жизни в садках и достигает нормальных значений на 25 сутки (рис. 1). У карпов способность Ка+,К+-насоса отвечать на добавление норадреналина наблюдается уже через две недели адаптации (табл. 2).

120 г 100 80

Активация

% 60

40 20 о

Л мин. IS сут. 'J0 г у,. ■ '1Г, >\1

Рис.1: Активация .\та*.К+-насоса эритроцитов леша (r,<) (М ± т) 1(Г6 М норадреналином в разные сроки после вылова щадящими орудиями лова;

Всех лещей, независимо от сезона Еылова и степени стрессирующего воздействия, разделили на две группы: в первую вошли рыбы, в эритроцитах которых Na+,K+-Hacoc не потерял способности к активации норадреналином, во-вторую — с потерей такой способности. Как видно из представленных на

рис. 2 данных, независимо от сезона вылова, в эритроцитах леща при подавлении активации На+,К+-насоса норадреналином этот переносчик не активируется так-же и рецептор-независимым активатором аденилатциклазы форсколином. И наоборот, если На+,К+-насос сохранил способность к активации норадреналином, он так-же активируется и форсколином.

Рис. 2: Влияние норадреналина (10~6 М) и форсколика (10"4 М) на активность Na+,K+-насоса эритроцитов леща (М ± т);

А- группа рыб, в эритроцитах которых Na+,K+-Haeoc не отвечает на активацию норадреналином; В — группа рыб, в эритроцитах которых Na+,K+-Hacoc активируется норадреналином (I — ноябрь, II — июнь, III — октябрь); I — без добавок в среду инкубации; 2 — в присутствие норадреналина; 3 — в присутствие форсколина.

Такая-же картина наблюдается у карпа: после острого стресса вылова и отгрузки Na+,K+-Hacoc не активируется ни норадреналином, ни форсколином, после 2-хнедельной адаптации восстанавливается утраченное стимулирующее действие на переносчик и норадреналина, и форсколина (табл 2).

Таблица 3

Влияние норадреналина и форсколина на активность систем облегченной диффузии в эритроцитах леща (ммоль/л-ч)(М ± т).

Добавка в среду инкубации А 11.11.93 20.06.94 В 11.11.93 20.06.94 15.10.93

норадр-н (10 ь М) 2,06 ±0,3 1,13 ±0,5 3,18 ± 0,5 2,08 ±0,6 2,271± 0,5 0,88 ±0,4 1,25 ± 0,5 3,888± 0,4 2,06 ± 1,2 3,04 ± 0,8

форсколин (Ю-4 М) 2,65 ± 0,5 2,00 ± 0,6 2,326± 0,3 2,00 ± 1,3 2,78 ± 0,8

Прим.: А^ группа лещей, в эритроцитах которых Ка^Д^насос не отвечает на активацию норадреналином; В- группа лещей, в эритроцитах которых Ш+,К+-насос активируется норадреналином;

Эти результаты свидетельствуют, что и у леща, и у карпа потеря гормонального контроля над системой активного транспорта ионов в эритроцитах при стрессе вызвана не подавлением функциональной способности (5-рецепторов или С5-белков, а патологией других элементов аденилатциклазноп системы.

В эритроцитах леща, Ка+,К+-насос которых не отзывается на добавление норадреналина, активация систем облегченной диффузии калия составляет в среднем 55-84 % по сравнению с 72-142 % у рыб, не потерявших гормонального контроля над Ха+,К+-насосом (табл. 3). У карпа при остром стрессе активация котранспорта норадреналином снижается в 1,72 раза, тогда как после адаптации она увеличивается в 1,16 раза (табл. 2). Эти данные свидетельствуют о том, что в эритроцитах рыб острый стресс приводит не только к подавлению гормональной регуляции Na+,K+-Hacoca, но и снижает активацию систем облегченной диффузии. Не столь значительный характер нарушений в этом случае объясняется, по-видимому, тем, что, в отличие от Na+,K+-Hacoca, активация систем облегченной диффузии носит вторичный характер (Bourne and Cossins, 1984; Nikinmaa and Huestris, 1984).

ВЛИЯНИЕ РАДИОНУКЛИДОВ НА ТРАНСПОРТ ИОНОВ И ЕГО ГОРМОНАЛЬНУЮ РЕГУЛЯЦИЮ В ЭРИТРОЦИТАХ КАРПА.

Активность Кта+,К+-насоса у карпов, инъецированных 1МБк/кг эадиоактивного 4эСа достоверно выше, чем в контрольной группе (р<(),01) (рис. 3). Многими исследователями показано, что колебания активности транспортных :\ТФ-аз могут быть вызваны нарушением целостности и барьерных свойств лембраны (Бурлакова и др., 1981; Дворецкий и др., 1937; Древаль, 1992).

Однако, по нашим данным, наблюдаемое повышение активности Na+,K+-mcoca не связано прямо с увеличением пассивной проницаемости мембраны рис. 4).

В отличие от искусственной модели, пассивная проницаемость мембраны 1ля натрия эритроцитов карпов из пруда-охладителя Чернобыльской АЭС в 2-4 >аза выше, чем у карпов из пруда-охладителя Шатурской ГРЭС (рис. 5) И эти [е смотря на то, что активность кальция-45 в организме инъецированных в [абораторных условиях карпов - 1 МБк./кг,- в среднем на порядок выше уммарной активности всех радионуклидов на единицу массы в тканях карпов в пруда-охладителя Чернобыльской АЭС в 1986-87 гг. (Koulikov and Ryabov,

1992). Однако карпы, инъецированные 4оСа, находились в условиях облучения в течение более короткого времени - 15 суток. По-видимому, нарушение барьерных свойств мембраны может произойти только при более длительной экспозиции.

Контроль Кальций-45, 1МБк/кг

Совол, 50 мг/кг Совол + кальций-45

Рис. 3: Транспорт ионов и его гормональная регуляция (10~6 М норадреналином) (М ± т) в эритроцитах карпов, инъецированных радиоактивным 45Са (1 МБк/кг) и соволом-54 (50 мг/кг). Экспозиция 15 суток.

1. Ш+,К+-насос; 2. Ыа+,К+,2СГ- и К+,СГ-котранспорт; 3. Пассивная проницаемость мембраны. А — без норадреналина в среде инкубации; Б — в присутствие норадреналина.

Поэтому можно утверждать, что увеличение активности Ыа+,К+-насоса у карпов, инъецированных 45Са, вызвано не возрастанием проницаемости мембраны. Данный эффект, по-нашему мнению, может относиться к числу неспецифических реакций организма на действие стрессирующего фактора, каким является облучение.

В эритроцитах карпа в нормальных условиях активность Ка+,К+-насоса при добавлении в среду инкубации норадреналина возрастает в 1,5-2,5 раза. У карпов, инъецированных 1 МБк/кг радиоактивного кальция-45, при добавлении в среду инкубации норадреналина скорость работы №+,К+-насоса возрастает в 1,16 раза, тогда как у контрольных рыб- в 1,94 раза (рис. 3).

15 40 :15

:и)

Выход ИЬ, 25

% в ч. 20 ]а 10 5 0

Рис. 4: Пассивная диффузия калия из эритроцитов карпа (ас от содержания) (М ± т). инъецированного соволом-54 (50 мг/кг) и радиоактивным ^Са (1 МБк/кг). 1 — контроль; 2 — Совол-54; 3 — кальцин-45; 4 — смесь веществ.

Наблюдаемое снижение активации Ка+,К+-насоса норадреналином у облученных рыб может быть вызвано нарушениями в цепи передачи сигнала через трансмембранные системы сигнализации. Многими исследователями на разных экспериментальных моделях были выявлены факты колебания активности аденилатциклазы, протеинкиназ и базального уровня ц.АМФ при облучении (Кудряшов и Пархоменко, 1984, Хамидов и др., 1986, Бездробный и Божок, 1992; Лозинская и др., 1992).

Вход Ка, мМ/л ч

Рис. о: Пассивная диффузия натрия в эритроциты карпов из Чернобыльской АЭС и Шатурской ГРЭС (М ± т).

1 — без норадреналина в среде инкубации; 2 — в присутствие норадреналина.

Активация Ха",К+,2С1"- и ингпбируемой фуросемлдом части К+,С1~-котранспорта норадреналином в эритроцитах инъецированных радионуклидом карпов выше, чем у контрольных рыб: при добавлении гормона ина возрастает в 1,59 раз, тогда как в контрольной группе - только в 1,14 раза. Однако недостоверность различий по Стьюденту не позволяет заключить, что инъекции радионуклида в течение 15-суточной экспозиции приводят к изменениям работы систем облегченной диффузии в эритроцитах карпа.

а

ВЛИЯНИЕ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ НА ТРАНСПОРТ ИОНОВ И ЕГО ГОРМОНАЛЬНУЮ РЕГУЛЯЦИЮ В ЭРИТРОЦИТАХ РЫБ.

Проведенные исследования не выявили реакции На+,К+-насоса эритроцитов леща на введение смеси отечественных ПХБ совола-54. Это справедливо для всех вводимых доз ксенобиотика (50, 100 и 150 мг.кг) и разных сроков экспозиции (рис. 6, 7, 8,).

В отличие от этого, введение 50 мг/кг ПХБ карпу после 15-дневной экспозиции вызывает возрастание скорости работы Ка+,К+-насоса (р<0,01) (рис. 3). Налицо межвидовые различия реакции Ыа+,К+-насоса леща и карпа на действие ПХБ. По-видимому, это объясняется внутривидовыми особенностями реакции на стрессирующие воздействия (каким является присутствие в организме ксенобиотика), а также особенностями состава и строения мембран эритроцитов.

Контроль Совол, 50 мг/кг

Вход Rb ММ/л ч

Совол, 100 мг/кг

Рис. 6: Активность ионтранспортирующих систем в норме и при р-адренергической активации (норадреналин 10"6 М, форсколин К)"4 М) (М ± ш) в эритроцитах леща, инъецированного соволом-54. Экспозиция 10 суток;

1. Na+,K+-Hacoc; 2. Na+,K+,2C1'- и К+,СГ-котранспорт; 3. Пассивная проницаемость; А — без добавок в среду инкубации; Б — в присутствии норадреналина; В — в присутствие форсколина.

Под воздействием совола-54 in vitro активность переносчика в эритроцитах карпа снижается (табл. 4). По-видимому, используемая при этом

доза ксенобиотика (0,2 мг/мл) приводит к изменениям структуры мембранного матрикса, что и сказывается на функционировании Ха+,К4"-АТФ-азы

Контроль Сонол-54, 1511 мг/кг

Рис. 7: Активность ионтранспортирующих систем в норме и при Р-адренергической активации (норадреналин 10~6 М, форсколин Ю-4 М) (М ± т) в эритроцитах леща, инъецированного соволом-54. Экспозиция 5 суток;

1. Ка~,К+-насос, 2. Ма+,К+,2СГ- и К+,СГ-котранспорт; 3. Пассивная проницаемость мембраны. А — без добавок в среду инкубации; Б — в присутствие норадреналина; В — в присутствие форсколина.

Контроль Совол-54, 1511 мг/кг

Рис. 8: Активность ионтранспортирующих систем в норме и прп Р-адренергическоп актпвашш (норадреналин 1(Г() М. форсколин ИГ4 М) (М ± т) в эритроцитах леща, инъецированного соволом-54. Экспозиция 10 суток;

В эритроцитах леща при введении совола-54 не происходит угнетения системы гормональной регуляции Ка+.К*-насоса (рис. 7, о). У инъецированных этим ксенобиотиком карпов наблюдается лишь незначительное подавление активации переносчика норадреналином (рис. 3). Ранее в нашей лаборатории было установлено, что после инъецирования карпа соволом-54 в дозе 100 мг./кг. и недельной экспозиции также происходит незначительное подавление активации №+,К+-насоса норадреналином и форсколином (Котелевцев и др., 1991).

Вышеперечисленные факты указывают на то, что ПХБ в данных концентрациях не вызывают нарушений передачи от Р-рецепторов на Na+,K+-АТФ-азу.

Уровни Na+,K+,2C1~- и К+,С]--котранспорта в эритроцитах леща и карпа, инъецированных соволом-54, от контрольных значений достоверно не отличаются (рис. 3, 6, 7, 8). Такая-же картина наблюдается при инкубации эритроцитов карпа с соволом-54 in vitro (табл. 4). Однако при добавлении в среду инкубации норадреналина активность этих ионтранспортирующих систем возрастает значительно сильнее в группах опытных рыб (рис. 3, 6, 7, 8, табл. 4).

Данный эффект не связан с прямым действием ксенобиотика на мембрану клетки, так как не проявляется in vitro, а, по всей видимости, является следствием развития стресс-реакции в организме рыбы. Известно, что введение в организм ПХБ среди прочих эффектов вызывает возрастание содержания в крови катехоламинов, что приводит к набуханию эритроцитов и дополнительной активации котранспорта и других систем облегченной диффузии. Повышенная активация норадреналином систем транспорта характерна также и для эритроцитов, взятых у рыб после стресса вылова.

Значения пассивной проницаемости мембраны эритроцитов рыб, инъецированных ПХБ, достоверных отклонений от нормы не имеет (рис. 3, 6, 7, 8). В отличие от этого, in vitro совол-54 приводит к снижению пассивной проницаемости мембраны (р<0,01) (табл. 4).

Таблица 4

Активность ионтранспортирующих систем в норме и при р-адренергической активации (М ± ш) в эритроцитах карпа, инкубированных в среде с соволом-54.

Экспозиция 1 час;

Ионтранспортируюшая система, ингибитор Добавление в среду инкубации Скорость входа 86 Rb, ммоль./ л/ч Контроль Совол-54, 0,02 мг/ мл

Na+, К+- насос, 0,2 мМ уабаин норадреналин 10"6 М форсколин 10"4 М 34,088 ± 0,85* 27,841 ± 4,05 30,619 ± 1,34 2.4,476 ± 3,18 29,577 ± 2,00 29,711 i 1,72

Котранспорт, 0,5 мМ фуросемид норадреналин 10"6 М 0,988 ±0,67 1,038 ± 0,23 0,745 ± 0,32 0,944 ± 0,55

Пассивная проницаемость мембраны норадреналин 10"6 М 3.762 ± 0,39 2,750 ± 0,12" 4,457 ± 0,54 3,780 * 0,36

Прим.: * - р < 0,05; **- р < 0,01.

Пассивная диффузия калия из эритроцитов карпа при введении 100 мг/кг совола-54 снижается в 2 раза. Подобные изменения наблюдаются и в клетках рыб, инъецированных смесью ПХБ и радионуклида (рис. 4).

Как видно из представленных данных, совол не влияет на пассивный вход калия в клетки, основу которого составляют К+-каналы и неидентифицированные системы облегченной диффузии и снижает выход калия из клеток, основу которого определяет простая диффузия катиона По-видимому, гидрофобный ксенобиотик, встраиваясь в структуру мембранного матрлкса, увеличивает ее барьерные свойства, не влияя при этом на транспорт ионов, проходящий при участии молекул белков.

СОВМЕСТНОЕ ДЕЙСТВИЕ СОВОЛА-54 И 45Са.

Одной из опытных групп карпов вводили и совол-54 (50 мг/кг), и радиоактивный 45Са (1 МБк/кг). Повышенная активация норадреналином котранспорта, характерная для всех опытных рыб, проявляется в данной группе сильнее: активация составляет 72 % по сравнению с 59 при введении чистого 4;1Са %, 42 % при введении совола-54 и 14 '/с в контрольной группе. Усиление эффекта при введении обоих веществ указывает на общие механизмы действия на мембрану.

Оба исследуемых поллютанта приводят к снижению способности ТСа+,К^-насоса эритроцитов карпа отвечать на активацию норадреналином. В группе рыб, инъецированных соволом-54, активация переносчика составляет 58 сд,; в группе, которой вводили 4;>Са — 16 у рыб, которым ввели оба вещества — 57 %, в контрольной группе — 94 % (рис. 3). Эти данные позволяют предположить, что механизмы действия ПХБ и радионуклида на аденилатциклазную систему эритроцитов карпа неодинаковы. В противном случае введение и ПХБ, и радионуклида вызывало бы более значительные изменения, чем чистые вещества. Однако этого не наблюдается. Более того, присутствие в организме карпа совола-54 снижает действие радиоактивного 4лСа на мембрану эритроцитов.

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что такие вещества как ПХБ и 4^Са обладают как специфическими, так и общими механизмами воздействия на системы ионного транспорта и трансмембранной сигнализации эритроцитов карпа.

ИЗМЕНЕНИЯ ТРАНСПОРТА ИОНОВ И ЕГО ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ В ЭРИТРОЦИТАХ РЫБ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ КАДМИЯ.

Na+,K+-Hacoc эритроцитов форели отвечает увеличением активности на действие кадмия как in vivo, так и in vitro. У рыб, выдержанных в воде с тяжелым металлом (концентация - 0,5 мг/л), скорость работы Na+,K+-Hacoca эритроцитов в 1,9 раз выше, чем в контрольной группе (р<0,05) (табл. 5). Активность Na+,K+-Hacoca в клетках, подвергнутых действию кадмия in vitro (содержание в среде инкубации - 0,2 мМ), в 4,3 раза (!) выше, чем в норме (р<0,01) (рис. 9). В последнем случае эффект выражен значительно сильнее. Это обусловлено, по-видимому, более высокой концентрацией тяжелого металла в среде инкубации клеток- 0,2 мМ (что аналогично 50 мг/л) по сравнению с его содержанием в крови рыб, выдержанных в воде с концентрацией кадмия 0,5 мг/л.

Таблица 5.

Транспорт ионов (ммоль/л ч) и его гормональная регуляция в эритроцитах форелей,

выдержанных в растворе кадмия (Cd2+) концентрацией 0,5 мг/л в течение 48 часов

Ионтранспортир. Добавка в среду Контроль Опыт

система, ингибитор инкубации

Na+,K+-Hacoc, - 1,025± 0,2 1,926± 0,3'

0,25 мМ уабаин норадр-н, 5,976± 0,4 9,200± 0,6"

(Ю-6 М)

Уабаин- - 0,991± 0,1 0,650± 0,1

неингибируемый вход норадр-н 1,414± 0,3 2,082± 0,3

86КЬ (10"6 М)

Прим.: * - р < 0,05; **- р < 0,01.

В эритроцитах карпа, подвергнутых инкубации с Cd2+ in vitro, возрастания активности Na+,K+-Hacoca не происходит (рис. 10). Этот факт позволяет предположить, что изменения, вызванные тяжелым металлом в эритроцитах форели, определяются ее видовыми особенностями и отличиями механизмов регуляции Na+,K+-Hacoca от таковых у карпа.

Во всех проведенных экспериментах с кадмием в эритроцитах рыб наблюдается подавление гормональной регуляции Na+,K+-Hacoca. Так, в клетках форели, инкубированных с кадмием, переносчик норадреналином практически не активируется, тогда как в контрольных клетках при добавлении катехоламина его производительность возрастает в 5,7 раза (рис. 9). Аналогичный эффект характерен для карпа (рис. 10) и для форели in vivo

(табл. о). Присутствие достоверных отклонений от нормы при действии кадмия как in vivo, так и in vitro доказывает, что этот токсикант способен оказывать "двойной" патологический эффект: вызывая стресс-синдром в организме и действуя на клетку как токсический агент.

Коптролъ

Рис. 9: Активность ионтранспортирующих систем в норме и при активации норадреналином (10"в М) (М ± т) в эритроцитах форели, инкубированных в растворе кадмия. 1. №+,К+-насос; 2. Системы облегченной диффузии; А — без норадреналина в среде инкубации; Б — в присутствие норадреналина.

Рис. 10: Активность ионтранспортирующих систем в норме и при активации норадреналином (10"6 M) (M + m) в эритроцитах карпа, инкубированных в растворе кадмия. 1. Na+,K+-Hacoc; 2. Системы облегченной диффузии; А — без норадреналина в среде инкубации; Б — в присутствие норадреналина.

При действии на эритроциты рыб in vitra кадмий не вызывает значительных изменений активности систем облегченной диффузии и их гормональной регуляции (рис. 9, 1Ü). В отличие от этого, in vivo у форели наблюдается снижение в 1,5 раза скорости работы этих систем. При этом значительно возрастает уровень их активации норадреналином (табл. 5).

Зарегистрированное снижение производительности систем облегченной диффузии калия и возрастание их активации норадреналином в эритроцитах рыб опытной группы нельзя объяснить прямым действием кадмия на эритроциты, так как in vitro при гораздо более высокой дозе ксенобиотика эффекта не наблюдается (рис. 9, 10). По нашему мнению, эти изменения являются следствием стресс-реакции при помещении рыбы в воду с ксенобиотиком. В этих условиях увеличится объем эритроцитов и будут происходить флуктуации активности систем ионного транспорта, отвечающих за его восстановление (Nikinrnaa and Huestis, 1984; Орлов и др., 1991).

Форель Карп

Рис. 11: Пассивная диффузия калия из эритроцитов форели и карпа (М ± ш), инкубированных в средах с кадмием концентрацией 0,2 мМ. Экспозиция 2 ч. 1 — без норадреналина в среде инкубации; 2 — в присутствие норадреналина.

Рис. 12: Пассивная диффузия калия из эритроцитов форели (М ± т), выдержанной в растворе кадмия концентрацией 0,5 мг/л.

Пассивная проницаемость мембраны для калия достоверно возрастает только при инкубации с Cd:+ эритроцитов карпа (рис. 11). В эритроцитах форели, как in vitro, так и in vivo, такого эффекта не наблюдается (рис. 11, 12). Наблюдаемые межвидовые различия в реакции данных путей транспорта на кадмий можно связать не только с разной устойчивостью мембраны к тяжелому

металлу, но и с различной организацией у этих видов мембранных систем облегченной диффузии, неингибируемых фуросемлдом.

Судя по нашим данным, количество последних в эритроцитах форели невелико. В противном случае они отозвались бы более значительным увеличением активности на добавление в среду инкубации норадреналина. Именно такой эффект наблюдается у карпа в контрольной группе клеток: скорость выхода а"КЬ возрастает в 3,3 раза, (рис. 11), что говорит о существенном участии систем облегченной диффузии в фуросемид-неингибируемом выходе "6Rb из эритроцитов этого вида.

Исходя из этого можно предположить, что в используемых нами дозах и экспозициях кадмий не изменяет пассивную диффузию ионов через мембрану эритроцитов рыб. Эффект, произведенный тяжелым металлом в клетках карпа, следует отнести прежде всего к нарушению нормальной работы системы, осуществляющей К+,С1"-котранспорт из клетки.

ВЛИЯНИЕ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ РЫБИНСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА НА ТРАНСПОРТ ИОНОВ И ЕГО ГОРМОНАЛЬНУЮ РЕГУЛЯЦИЮ В ЭРИТРОЦИТАХ

ЛЕЩА

В тканях леща, обитающего в загрязненной стоками г. Череповец зоне Рыбинского водохранилища содержится значительное количество тяжелых металлов, нефтепродуктов, полиароматических углеводородов и полихлорированных бифенилов (Ершов, 1990; Козловская и др., 1990; Гапеева, 1993). Концентрации веществ, относящихся к двум последним группам, достигают значений, способных вызывать злокачественные новообразования в тканях рыб (Kinae ct. al, 1990). Тяжелые металлы и нефтепродукты содержатся в количествах, в 10-15 раз превышающих ПДК (Гапеева, 1Ü93). В отличие от этого, в тканях рыб из р. Шексна (контрольная группа) концентрации загрязнителей не превышают предельно-допустимых значений (Козловская и Самбурский, 1992). Разное качественное состояние обоих групп леща связано с разной продолжительностью их пребывания в загрязненных стоками водах. У лещей из устья р. Шексны она значительно меньше, чем у рыб, места нагула которых приурочены к Шекснинскому плесу Рыбинского вдхр. (Поддубный и Ма линии, 1988).

Активность Ка+,К+-насоса в эритроцитах рыб, обитающих в воде, загрязненной сточными водами, достоверно не отличается от контрольной, (рис. 13).

Контроль Загрязнение

Рис. 13: Активность ионтранспортирующих систем в норме и при активации норадреналином (10"6 М) (М ± ш) в эритроцитах леща Рыбинского вдхр. из условно-чистого и загрязненного районах;

1. Ка+,К+-насос; 2. Ка+,К+,2СГ- и К+,С1"-котранспорт; 3. Пассивная проницаемость мембраны. А — без норадреналина в среде инкубации; Б — в присутствие норадреналина.

Скорость котранспорта, ингибируемого фуросемидом и его активация норадреналином в обоих группах рыб равны.

Пассивная проницаемость мембраны, основу которой составляют неидентифицированные системы облегченной диффузии и К+-каналы, в эритроцитах рыб, обитающих в загрязненной среде, значительно выше, чем у рыб из устья Шексны (р<0,05) (рис. 13).

Сопоставление данных, полученных на полигоне Рыбинского водохранилища и в экспериментальных моделях, позволяет заключить, что в токсической зоне на рыб действует стресс-фактор, который способен модифицировать системы ионного транспорта в эритроцитах. Из изученных нами ксенобиотиков ни один не является основным модифицирующим агентом в районе г. Череповец, хотя, по-видимому, достаточно высоко содержание в среде полихлорированных бифенилов (что подтверждается литературными данными, Козловская и Самбурский, 1992). На это указывает сходный характер изменений систем облегченной диффузии и пассивной проницаемости у рыб из природного водоема и экспериментальной модели. В отличие от ПХБ, специфических эффектов кадмия и радионуклидов на транспорт ионов у рыб из загрязненных участков водоема мы не зарегистрировали.

ВЫВОДЫ:

1. Стресс вылова и искусственного содержания вызывает в эритроцитах исследованных видов рыб возрастание скорости работы систем облегченной диффузии и подавление их регуляции норадреналином. Активность Na+,K+-насоса эритроцитов леща при этом не изменяется, у карпа-же она многократно возрастает. В клетках рыб обоих видов после вылова происходит подавление регуляции 1\та+,К"г-насоса норадреналином, со временем утраченная функция восстанавливается.

2. Присутствие в тканях рыб полихлорированных бифенилов приводит к снижению пассивной диффузии калия из эритроцитов, возрастанию активации систем облегченной диффузии норадреналином и незначительному подавлению гормональной регуляции Na+,K+-Hacoca.

3. Длительное воздействие радионуклидов в пруду-охладителе Чернобыльской АЭС на карпов служит причиной значительного увеличения пассивной проницаемости мембраны эритроцитов для натрия. В лабораторных условиях получены результаты, свидетельствующие , что наибольшей чувствительностью к внутреннему облучению в эритроцитах рыб обладает (3-адренергическая аденилатциклазная система.

4. Кадмий (Cd2^) вызывает в эритроцитах рыб снижение скорости работы систем облегченной диффузии и возрастание их активации норадреналином. Пассивная проницаемость мембраны не изменяется. Как in vitro, так и in vivo кадмий приводит к многократному увеличению активности Na+,K+-Hacoca и подавлению гормональной регуляции этого переносчика.

5. Загрязнение Рыбинского водохранилища служит причиной увеличения пассивной проницаемости эритроцитов леща. При этом уровни Na^.K^.2C]"- и ингибируемой фуросемидом части К+,С!"-котранспорта в клетку не изменяются.

6. На основе исследования ионного гомеостаза и его гормональной регуляции в эритроцитах рыб могут быть предложены тест-системы для анализа последствий загрязнения водоемов ксенобиотиками и радионуклидами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нагдалиев Ф.Ф., Котелевцев C.B., Козловская В.И., Герман A.B. Влияние ксенобиотиков на транспорт ионов и его адренергическую активацию в мембранах эритроцитов леща Abramis brama (L.) и карпа Cyprinus carpió (L.) (сем. Cyprinidae) // Вопросы ихтиологии.- 1995,- N.3.- С.394 - 401.

2. Нагдалиев Ф.Ф., Котелевцев C.B., Козловская В.И., Герман A.B., Орлов С.Н. Исследование транспорта ионов и его гормональной регуляции в эритроцитах леща Abramis brama (L.), инъецированного смесью отечественных полихлорированных бифенилов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины- 1995,- Т.122.- N.10 - С.14-18.

3. Нагдалиев Ф.Ф., Котелевцев C.B. Влияние ксенобиотииков на транспорт ионов и его гормональную регуляцию в мембранах эритроцитов рыб. // Тез. докл. Междунар. конф. "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды", 12-16 сентября 1995г., г.Томск, 1995.- Т.2.- С.263.

4. Нагдалиев Ф.Ф., Котелевцев C.B. Транспорт ионов и его гормональная регуляция в эритроцитах рыб при стрессе // Вопросы ихтиологии.- 1996.- N.1 (в печати).

5. Котелевцев C.B., Нагдалиев Ф.Ф., Скрябин Г.А. Влияие радионуклидов на транспорт ионов и его гормональную регуляцию в мембранах эритроцитов рыб // Вопросы ихтиологии- 1996,- N.1 (в печати).