Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрослияние клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электрослияние клеток"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ВАРБУЛ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ

УДК 577.352.26

ЭЛЕКТРОСЛИЯНИЕ КЛЕТОК 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Институте электрохимии км. А. Н. Фрумкина АН СССР

Научный руководитель:

доктор химических наук И. Г. Абидор

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Г. Н.Берестовский кандидат биологических наук А. А. Булычев

Ведущая организация: Шститут теоретической и экспериментальной биофизики АН СССР , г. Пущино. -

Защита состоится " ^^ Т99Т года в /£/часов

на заседании специализированного Совета К-053.05.68 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском Государственном Университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва>В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета М1У.

Автореферат разослан " ^п ^^-1991 года.

Ученый секретарь специализированного Оэвета доктор биологических наук, доцент

В. А. Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Слияние клеток является одним из. наиболее важных инструментов клеточной биологик, биотехнологии и клеточной инженерии. Процедура слияния - ключевой этап получения гибридом, других соматических гибридов клеток растения и животных, микроорганизмов и грибов.

Традиционно слияние клеток индуцируют полиэтиленгликолем, либо вирусом Сендай. В 1979 г. было найдено, что клетки могут сливаться при коротком, но достаточно мо!цном электрическом воздействии. В основе злектрослияния ОС) лежит приведение мембран клеток в плотный контакт и их электрическая обработка (90) импульсом высокой интенсивности (напряженность шля 1*10 кВ/см, длительность 5*150 мкс). Успешные опыты по ЭС различных растительных и животных клеток обусловили интерес к этому способу слияния. Был выдвинут ряд предположения о механизме ЭС. Тем не менее, в данной области имеются и нерешенные проблемы. Здесь следует прежде всего отметить сложность существующих методов ЭС, их недостаточную эффективность для некоторых объектов. Данные о воздействии различных факторов на процесс ЭС отрывочны и часто противоречивы. К>мплексного исследования последствий 30 для клеток не проводилось, поэтому процедура ЭС во многих случаях оказывается губительной для клеток.

Цель и па да исследований. Целью работы являлась разработка новых эффективных подходов к ЭС и систематическое исследова-

■

-гое электрослияния клеток.

В связи с этим решались следукхцие задачи:

I. Изучение действия сильных электрических полей на клетки т определение условий, при которых повреждение клеток при ЭС иг.'-

ниыально.

2. Разработка методов ЭС, эффективных для широкого круга клеток.

3. Детальное изучение влияния различных факторов на процесс ЭС.

4. Выяснение возможного механизма ЭС клеток.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование действия импульсной электрической обработки на жизнедеятельность клеток, выяснена ключевая роль обратимого электрического пробоя плазматических мембран в электроповреждении клеток. Подобраны состав среды и условия ЭО, при которых гибель клеток незначительна и патологические изменения носят временный характер. Разработан ряд новых методов ЭС, позволяющих с высокой эффективностью сливать разнообразные клетки, с помощью этих методов получены гетерокарионы, имеющие научную и практическую ценность. Детально изучены электрические свойства клеточных осадков и ЭС при центрифугировании, зарегистрирован и исследован обратимый электрический пробой мембран клеток осадка"и показана его прямая связь с ЭС клеток. Предложен механизм ЭС, предполагающий, что в ходе электрического импульса в контактирующих клеточных мембранах образуются коаксильные поры, хромки которых замыкаются под действием сил, возникающих при прохождении тока сквозь поры.

Практическая ценность. Методы алектрослиякия клеток на проводящих подложках; при центрифугировании; пневмоэлектрический, позволяющие с высокой эффективностью осуществлять слияние как распластывающихся, так и суспензионных клеток, отличаются простотой и надежностью, дают возможность осуществлять различные ва-

рианты слияния клеток. Метод ЭС при центрифугировании уже успешно применяется в Институте молекулярной биологии АН СССР и в Институте вирусологии АМН СССР.

Рекомендации по защите клеток при 30 могут бьггь полезны при электрослиянии и алектротрансфекции клеток, а также при изучении действия различных повреждающих факторов (детергенты, температура, радиация и др.) на клетки.

Практическое исследование и теоретическая модель процесса ЗС углубляя» представления о функциональном строении биологических мембран и о слиянии клеток in vivo и in vitro.

Методы изучения электрических параметров клеточных осадков позволяют оценивать вязко-упругие свойства клеток и изучать обратимый электрический пробой клеточных мембран. Эти методы могут найти применение в диагностических целях.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Всесоюзных совещаниях по биоалектрохимии (Суздаль, 1985; Ленинград, 1986; Каунас, 1987), IX Йенском меидународном симпозиуме ( Erfurt, GDH, 1986), IX Всесоюзном симпозиуме ."Структура и функции, клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1987), 1У Международном Фрумкинском симпозиуме (Суздаль, 1988).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ. Описок основных публикаций приведен в конце автореферата.

Огруктура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав, заклвчения,' выводов и двух приложений (101 страница машинописного текста), 60 рисунков, II таблиц, списка литературы (189 работ).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клетки. В работе использовали клеточные линии из коллекции лаборатории функциональной морфологии хромосом Института Молекулярной Биологии АН СССР - фибробластоподобные: мышиные L-929, К1КЗТЗ, СЗН 10 Т 1/2 кл.8; китайского хомячка СН кл.431; плаз-коциты мшей РЗ -íiso-Ag 4.1 и Х-63; эпителиоподобные: трахеи коровы Тв-АГ-9 (ГГ5Т) и почки эмбриона свиньи СПЭВ - 13Д5 -ТК" (получены от к.б.н. Й.М.Тугизова, Институт Вирусологии АМН СССР) Перитонеальные макрофаги мши, мышиные спленоциты (линейные мыши Baïb/c), диплоидные фибробласты мышиного эмбриона - ДФМ, 1-ый' 3-ий пассажи (беспородные мши), эритроциты куринного эмбриона выделяли из животных перед экспериментами по общепринятым методикам. Клетки 1.929, СЗН ЮТ 1/2 кл.8, СН 431, Х-бЗ культивировали на среде Игла с 10^ сыворотки новорожденных телят. Клетки KiH 3Î3, TR-AF9, ДФМ, СПЭВ выращивали на средеD MEM с 10£ сыворотки новорожденных телят. Культивировали клетки при 37°С в стеклянных матрасах, со стекла снимали обработкой смесью растворов трипсина (.0,23%) и Берсена (1:1). Клетки îfèo культивировали на среде H PMI - 1640 с эмбриональной телячьей сыворотки. Перевиваемые клеточные линии проверяли на отсутствие микоплазмы по определению красителем Хекста 33358.

Реактивы. Псименяли реактивы марок "хч", "цда", "analytical grade Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (ФСБ) -н а^1Р04 -0,1 мМ; HaCI - 135 мМ; КН^04 - 14,5 мМ; KCl - 2,8 мМ; pH -7,4-готовшш на деионизованной дистиллированной воде из сухой смеси PM-I6 (8erva ).

i Методы. 30 клеток проводили в тефлоновых ячейках различной формы, с плоскопараллельными электродами из нержавеющей стали.

Квазипрямоугольные электрические импульсы длительностью 10+150 икс амплитудой до 1000 В подводили к ячейке от самодельного генератора высоковольтных импульсов (ГШ), состоящего из накопительного конденсатора, коммутирующих тиристоров и схемы управления тиристорами (выходное, сопротивление ГЕИ 4 Ои). Параметры импульса контролировали с помощью запоминающего осциллографа (38-13.

Индекс слияния (ИС) подсчитывали по Веласкесу как отношение числа ядер, включенных в поликарионы, к общему количеству ядер. Агализировали не менее 500 клеток. Индекс жизнеспособности (ИЖ) определяли по различным тестам как долю живых клеток (в %).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Импульсная электрическая обработка суспензии клеток. Исследовали действие на клетки электрических импульсов амплитудой 2+5 кЗ/см длительностью 104-150 мкс, наиболее типичных для ЭС. Было установлено, что при ЭО в среде, содержащей 0,5 мг/мл нейтрального красного, или при добавлении красителя в среду не позднее I мин после ЭО, диффузно прокрашивается цитоплазма клеток и слегка окрашиваются ядра (в цитоплазме контрольных, не подвергшихся ЭО клеток, краситель локализован в гранулах). Наблюдается также окрашивание ядер клеток этидием при добавлении этого красителя (25 мкг/мл) к клеточной суспензии не позднее 30 мин после ЭО (люминисцентная микроскопия). При наблюдении в фазовом контрасте клеток спустя 10-30 мин после их ЭО видно снижение показателя преломления цитоплазмы..

Т&ким образом, импульсная ЭО клеток <2+5 кВ/см; 10+150 мкс>* приводит к увеличению проницаемости плазматической мембраны кле-

*примечание: здесь и далее первая цифра в угловых скобках равна амплитуде электрического импульса, вторая -его длительности.

ток для некоторых красителей и воды. Оэстояние повьшенной проницаемости плазыаледаы сохраняется до 30 мин после 30.

Жизнеспособность клеток после Э0. Обработка клеток мощными электрическими импульсами приводит к гибели значительной их части. Для количественного изучения гибели клеток после 30 необходимо было I) выбрать достоверные методы и критерии оценки жизнеспособности; 2) найти оптимальные сроки определения жизнеспособности.

В результате проведенных исследований выяснилось, что на коротких сроках после 30 наиболее надежные результаты дает метод исключения трипанового синего 'концентрация красителя в среде 0,05^): живые клетки не окрашиваются, мертвые хорошо прокрашены. Более одного часа спустя 30 различные методы определения жизнеспособности дают сходные достоверные результаты. Характерное время гибели клеток после умеренной 30 различных клеток в наших экспериментах составляло 1-2 ч, вопреки распространенному мнению о непосредственной гибели клеток в ходе 30.

и следовало ожидать, жизнеспособноЬть клеток уменьшается с ростом амплитуды и длительности импульса, хотя чувствительность клеток разного типа к 30 различна. Из исследованных нами клеток бвд составлен ряд по устойчивости к 30 и оказалось, что эта устойчивость прямо' связана с размером клеток: наиболее сильно повреждаются мелкие клетки - г-яеноциты, а крупные клетки СЗН ЮТ 1/2 кл. 8 наименее чувствительны к .30.

Очень важной представляется обнаруженная нами зависимость повреждения клеток от состава среДы, в которой проводится 30 и инкубация клеток после нее. Так, на клетки Ь 929, Я1Н ЗТЗ, СПЭВ сильное повреждающее действие оказывают ионы и Мб2+» особен-] но если эти ионы присутствуют в среде при 30 или добавлены сра-

б

зу после нее. На клетки миеломы и спленоциты токсическое действие Са2+ и оказывают лишь при интенсивной ЭО. Введение в среду ЭО и инкубации сахарозы, сывороточного альбумина, частичная заменаВ а+ на сахарозу или К* заметно защищает клетки от электроповреждения.

Расчет разности потенциалов на клеточных мембранах по формуле и = | Ег (Е - напряженность электрического поля; г -радиус клетки) показывает, что даже при ЭО суспензии спленоцитов (г = 3,5 мкм), не говоря уже о более крупных клетках, на участках мембран на их полюсах создается и >1 В, при Е > 2 кВ/см, что, согласно имеющимся представлениям, приводит к образованию в мембранах проводящих пор, размеры и число которых связаны с длительностью и амплитудой воздействия. Действительно, нами показано увеличение проницаемости плазмалемм при ЭО для воды и некоторых красителей. Кроме того, повшенная чувствительность клеток после ЭО к составу внетней среды свидетельствует о росте проницаемости клеточной мембраны также для одно- и двухвалентных ионов.

Характерное время "залечивания" мембран после электрического пробоя, оцениваемое нами по восстановлению их барьерных свойств, составляет 5 мин для нейтрального красного; 5-10 мин для Са2+; 30 мин для этидия; 30-40 дан для воды. Сравнение вре-!кен залечивания мембран и гибели клеток после ЭО показывает,что, вопреки распространенному мнению о смерти меток вследствие необратимого повреждения их мембран, основная масса клеток погибает уже после восстановления плазмалеммы. Следовательно, глинкой причиной гибели клеток в результате ЭО, на наш взгляд, является значительное нарушение клеточного гомеостаза, в первую очередь, ионного баланса между клеткой и средой. При обратимом электрическом пробое в клетку из внеаней среды поступают Са2+,

Ка+, вода, а цитоплазма теряет К1". Если клетка не справляется с нарушением гомеостаза, то через несколько часов она погибает. Вследствие отличий в размерах, особенностей индивидуальной чувствительности, эффективности работы ионных насосов, разные типы клеток обладает различной устойчивостью к ЭО.

Уменьшение перепада концентраций ионов между вне- и внутриклеточной средой на время обратимого пробоя плаэмалеммы путем исключения из состава среды ЭО и инкубации Са , снижение

концентрации К а+ и увеличение содержания К* заметно защищает клетки при ЭО. Введение в среду сахарозы, белков сыворотки, молекулы которых не проникают через поры в мембране при электрическом пробое, уравновешивает осмотическое давление внутриклеточных белков и препятствует поступлению в клетки воды, затрудняет диффузию ионов сквозь поры, что способствует выживанию клеток.

Временное нарушение гомеостаза клеток не проходит бесследно для их жизнедеятельности. Даже в выживших после ЭО клетках наблюдается ряд патологических изменений: повшенная зернистость и вакуолизация цитоплазмы; снижение способности клеток к распластыванию (окрашивание по Пшза фиксированных препаратов); укрупнение лизосом (прижизненное окрашивание акридиновым оранжевый); снижение активности внутриклеточных эстераз (оценивали по распаду диацетата флуоресцеина); деконденсация хроматина (электронная микроскопия тонких срезов, связывание %-актиномицина Д); замедление синтеза ДНК и РНК (импульсное ыеченив %-тимидином и уридином). После ЭО замедляется рост клеток, снижается митотичрс-кий индекс. Перечисленные изменения связаны, по-видимому, как с повреждением клеточных структур, так и с ответной реакцией клеток на воздействие, так называемш "стресс-ответом". Отметим,что после ЭО вшившие клетки возвращаются к норме только через 24-48

часов.

Результаты, полученные в данной части работы, имели важное значение для оптимизации электрослияния.

Злектрослияние клеток.. Изучая ЭС, мы пришли к заключению, что эффективность методов- ЭС во многом определяется как качеством контакта между клетками, так и интенсивностью электрообработки. Однако следует иметь в виду, что сильная ЭО угнетает жизнедеятельность клеток. Ниже описаны три разработанных нами метода ЭС, в которых особое внимание уделяется достижению плотного контакта между клетками в сочетании с возможно более мягкой электрической обработкой.

Метод ЭС на проводящих подложках основан на способности некоторых типов клеток образовывать плотные межклеточные контакты большой площади в физиологических условиях. Суть метода заключается в следующем. Клетки высаживают на проводящую подложку (диализный целлофан, который для лучшего прикрепления клеток покрывают слоем сывороточных белков) и культивируют до образования клеточного монослоя 70-80& конфлюентности. Затем добавляют суспензию других клеток и культивируют еще 1-3 часа для установления контактов между клетками верхнего и нижнего слоя. В ячейке, заполненной соответствующей средой, подобранной для обеспечения максимальной жизнеспособности клеток, подложку с клетками обрабатывают электрическим импульсом, перпендикулярным плоскости подложки. Клетки инкубируют в тех же ячейках 30 мин при 37°С, после чего подложки переносят в ростовую среду для дальнейшего культивирования. Слияние клеток можно наблюдать через 2-3 часа прямо на подложках, так как последние прозрачны. Основные результаты по слиянию клеток разных типов сведены в табл. I. Следует

подчеркнуть высокую эффективность ЭС на проводящих подложках: ИС L-клеток, к примеру, превдаает 6Q?, Поскольку в данном методе электрическое поле направлено перпендикулярно подложке, клетки нижнего слоя сливаются в основном с верхними клетками, т.е. вероятность образования гегерокарионов вше, чем гомо- полика-рионов. Если же оба клеточных слоя сформированы из клеток одного типа, то при ЭС образуются поликарионы с разным, в зависимости от плотности посадки клеток, количеством ядер. ТЬк, в ряде опытов мы получали видимые невооруженным глазом гигантские клетки СЗН 10 TI/2 кл.8 диаметром до 1,5 мм с более-чем 150-ю ядрами. Тем не менее, анализ данных из табл. I показывает, что не все клетки устанавливают между собой контакты, достаточные для слияния (особенно суспензионные). Для таких клеток мы разработали методы, в которых образование плотных контактов обеспечивается механическим способом.

В пневмоэлектрическом методе слияния плотный контакт между клетками достигается сжатием их между двумя проводящими подложками. Подложки помещают в ячейку специальной конструкции между электродами из нержавеющей стали. При отсасывании жидкости из пространства между подложками последние сжимают клетки. Ниже описаны три варианта реализации этого метода ЭС.

Слияние в-суспензии. 30 мкл густой суспензии (Ю^ клеток/мл) помещают на мембранный фильтр и накрывают подложкой из диализного целлофана. Ячейку заполняют, смесью ФСБ + 0,3 М сахароза (1:1) и, руководствуясь показаниями манометра, сжимают клетки давлением Pj = 0,07 атм в течение 5 мин, после чего выдерживают 3 мин под давлением и обрабатывают импульсом <2 кВ/си; 100 мкс> . Через I мин давление.сбрасывают и инкубируют ячейку с клетками

Таблица!

Электрослияние на проводящих подложках

Клетки нижнего слоя_

Клетки верхнего слоя_

Среда ЭО

Параметры 30 ИС, % Ш %

ампл., к В/с м длит., МКС

2 10 62 95

2 30 58 56

3 30 50 60

2 70 15 52

3 12 5 68

3 ' 15 I 65

3 15 4 62

4 30 36 50

3 25 47 90

3 20 13 75

L -929 L -929 ФСБ

Т8-АГ-9 ÎR-AT-9 ФСБ+0, ЗМ еах., 1:1 CH-43I CH-43I —и—

L -929 макрофаги —"—

L -929 спленоциты —"— L -929 Х-бЗ --"--

CH-43I спленоциты —"—

ШЭВ ШЭВ --"--

СЗН I0TI/2 СЗН 10П/2 ФСБ+0, ЗМ сах., 2:1 ЗТЗ ЗТЗ ФСБ+0, ЗМ сах., 1:2

Электрослияние при центрифугировании

Таблица 2

Клетки Среда Осажкение ЭО ИС, % 1

а, ед.Я 1, мин Г, МКС

L -929 ФСБ+0, ЗМ сах. ,4:1 450 10 '900 20 52 45

ЗТЗ * ФСБ+0, ЗМ сах., I: I 1000 5 900 20 .65 51

ДФМ ФСБ+0,ЗМ сах.,2:3 1000 5 900 24 32 70

ЮР Игла 1500 10 900 30 16 -

MSO HPMÎ 800 4 900 10 31 44

Х-63 RPMI 380 7 900 13 29 57

MSD-»спленоциты Д.сыв.+0^3М сах., 450 10 600 20 7 68

L ~929-к;пленоц. ФСБ 850 5 900 15 5 49

ЗТЗ + ЮР ФСБ+0,ЗМ сах., 1:1 1000 5 900 20 5 64

ДФМ + ЮР ФСБ+0,ЗМ сах.,2:3 1000 5 900 24 0 70

Примечание: 30 проводили за I мин до остановки центрифуги

30 мин при З^С, затем клетки рассаживают для дальнейшего культивирования в ростовой среде. На рис. I приведены результаты слияния Ь -клеток при разных давлениях р£> а на рис. 2 - результаты . слияния ь -клеток со спленоцитами. Из этих данных видно, что чем сильнее сжаты клетки, тем ->ие эффективность слияния. Однако слишком большие давления в сочетании с электрообработкой приводят к повреждению клеток. Удаересно, что при Р^ = О ИС минимален. Это говорит о том, что образовавшиеся под давлением плотные контакты между клетками нарушаются*в течение нескольких минут.

Слияние типа монослой + суспензия. На диализном целлофане формируют клеточный монослой согласно описанной выше процедуре. На мембранный фильтр наносят 30 мкл густой суспензии клеток и накрывают подложкой с монослоем. Слияние осуществляют, как в предыдущем случае. После ЭС растущих в монослое клеток с куриными эритроцитами до 4% клеток монослоя содержали ядра эритроцита. Наилучшие результаты были получены при Р^ = 0,007 атм.

Слияние типа монослой + монослой. После.формирования клеточных монослоев на целлофановых подложках их сжимают в ячейке и подвергают ЭО. Через 12 часов культивации подложки разделяют и исследуют. В случае Ь - клеток ИС достигает 6С& при давлений ?2 = 0,007 атм," импульс.<3 кВ/см; 30 мкс> .

Пневмоалектрический метод слияния отличается высокой эффективностью, технически прост, пригоден для самых разных типов клеток. Важно отметить, что в этом методе плотность межклеточных контактов легко регулируется внешним давлением, что позволяет сливать клетки, тяжело поддающиеся слиянию другими методами.

В методе электрослияния при центрифугировании клетки приводят в контакт осаждением в конических ячейках, причем плотность осад-

I |1 I . . « П

21 Р2-Ю}т. и

Рис Л ПнеЕмоэлектрослияние Ь-клеток

Рис.2 Пневмоэлектрослияние Ь -929-гепленоциты

Зависимость индекса слияния от давления Р£ в момент ЭО.

т а/а

Рис.3 Электрослияние 1>-шток при центрифугировании, квисимость ИС от центростр.

шт. импульса - 30 икс. гнктир: сопротивление ячей-I с клетками.

¿,/М ин

Рис.4 ■ Электрослияние Ь-клеток в осадке, сформированном при 8004 10 мин. Зависимость ИС от интервала, между остановкой центрифуги и ЭО (600 В, 30 мксТ • Пунктир: сопротивление ячейки с клеточным осадком.

ка регулируется скоростью вращения ротора. Предварительные эксперименты показали, что чем больше интервал между осаждением клеток и ЭО осадка, тем меньше индекс слияния, поэтому ЭО целесообразно проводить непосредственно в ходе центрифугирования. Для этого используют модифицированную центрифуг.у с бакетным ротором. Клетки осаждают в отверстие диаметром 3 мм в дне специальной тефлоновой ячейки на электрод из нержавеющей стали, другой электрод вмонтирован в кршку ячейки. Для предохранения клеток от прямого контакта с нижним электродом, его закрывают мембранным фильтром. Электроды через скользящие контакты соединяют с внешней электрической цепью. Эффективность слияния всех без исключения опробованных нами типов клеток животного происхождения данным методом достаточно высока, некоторые примеры слияния приведены в табл. 2. В то же время, предложенная система позволяет осуществлять целый ряд электрических измерений при образовании клеточного осадка, при обработке клеток электрическим импульсом и после него. Из рис. 3 видно, что осаждение клеток при ускорении а = 1+50в приводит к увеличению сопротивления ячейки. Сопротивление сформированного таким образом осадка из I млн ь-клеток, что соответствует примерно десяти клеточным слоям, сос-j тавляет около 150 Cto. Дальнейшее увеличение а сопровождается уп-| лотнением осадка и, соответственно, ростом его сопротивления Нос. Характерное время изменения BQC при установлении нового зш чения а составляет 1-2 мин. При а = 80Cfe HQC возрастает почти на порядок. Следовательно, по Вос мы можем оценивать плотность клеточного осадка. В последующих экспериментах нами была установлена прямая зависимость между степенью уплотнения клеток в осадке и эффективностью их алектрослиякия (рис. 3). В осадке, сформированном при 1+50 в клетки практически не сливаются даже

при интенсивной 30. По мере увеличения плотности осадка с ростом а возрастает и ИС. Правда, при слишком больших ускорениях ИС снижается, что, очевидно, связано с повреждением клеток при одновременном действии механического давления и электрического поля. Интересно, что после остановки центрифуги вос уменьшается, соответственно, снижается и эффективность слияния клеток (рис.4). Следует заметить, что, хотя после остановки центрифуги аос не возвращается полностью к начальному уровню, ЭО через 10 мин после остановки уже не вызывает слияния клеток в осадке.

Значительный интерес представляют данные по измерении* электрического сопротивления осадка в ходе электрообработки. На рис. 5 приведены мгновенные вольтамперные зависимости ячейки с клетками (кривая I) и без них (кривая 2). При небольших амплитудах импульса значения Я00, измеренные таким способом, совпадают с полученными ранее. Однако с ростом амплитуды измеряемоенос уменьшается. Для осадка, толщина которого соответствует 10 слоям клеток, отклонение вольтамперной характеристики от линейности начинается с 17 В; для осадка вдвое большей толщины - с 32 В. При значительных амплитудах импульса (более 300 В) проводимость ячейки с клеточным осадком приближается к проводимости ячейки без клеток. Приведенные данные однозначно говорят о том, что при Э0 импульсом с амплитудой, превыпакхцей пороговую, имеет место электрический пробой клеточных мембран в осадке. ЕЬли плотный клеточный осадок упрощенно рассматривать как систему послойно расположенных клеточных мембран; то и нв каждой мембране можно оценить, разделив приложенное к осадку напряжение на удвоенное число клеточных слоев. Определенные таким способом значения и, с которых начинается электрический пробой мембранЬ -клеток*составляют 0,6-0,7 В, что близко к литературным значениям для животных

клеток.

На рис. 5 показана зависимость ИСь-клеток при центрифугировании от амплитуды сливающего импульса. Существенно, что слияние клеток в осадке происходит при напряжениях почти на порядок больших, чем необходимы для пробоя мембран. Ъким образом, нами впервые показано, что ЭС клеток происходит лишь в условиях когда заведомо имеет место электрический пробой их мембран. Кроме того, удалось продемонстрировать, что в этих условиях пробой мембран является обратимым. Для этого к ячейке подключали генератор прямоугольных импульсов, который срабатывал с регулируемой задержкой после ГВИ. Оказалось» что проводимость клеток оса; ка после мощного импульса с ГВИ в ответ на тестирующие импульсы амплитудой Ю В, остается повыленной в течение некоторого времени. Кинетика спада проводимости быстрой составляющей - около Тис Ска увеличивается с ростом длительности пробивающего импульса и, в меньшей степени, его амплитуды. Медленная составляющая имеет характерное время около I мин. Уменьшение проводимости осадка от ражает как процесс восстановления мембран, так и процесс уплотнения клеточного осадка после электрического пробоя клеточных мембран, поскольку Кос уже минуту спустя пробивающего импульса становится даже большим, чем до него. Время полного залечивания мембран клеток, которое оценивали по совпадению токовых осциллограмм осадка в ответ на околопороговый импульс (20 В) до и поел« пробивающего импульса, определено нами в 5-15 мин в зависимости от интенсивности ЭО. Как видим, полученное значение хорошо согласуется с оцененным нами ранее временем восстановления барьерных свойств мембран Ъ-клеток для Са^+ после электрического проб<

Механизм электрослияния клеток. Анализ экспериментальных и

Т6

Рис.5 Злектрослияние Ь - клеток при центрифугировании. Зависимость ИС от амплитуды импульса (3). Вольт-амперные характеристики ячейки с клетками (I) и без них (2)

• Рис.б Кэаксиальные поры в мембранах соседних клеток. Силовые линии электрического поля и давление на мембраны в окрестности пор.

литературных данных свидетельствует о том, что ЭС также, как вирус- и полиэтиленгликоль-индуцируемое слияние, происходит по 4 ключевым стадиям: I) приведение клеток в контакт; 2) индукция слияния под действием сливающего агента - обработка электрическим импульсом; 3) набухание клеток; 4) стабилизация слившихся клеток.

Действие различных факторов на ЭС мы изучали с учетом этих стадий, что позволило более четко уяснить как механизм их действия, так и механизм электрослияния в целом. Учитывая специфику работы, мы ограничивались подробным рассмотрением первых трех стадий, то есть процессов, происходящих, в основном, на мембранном уровне.

Приведенные вьизе результаты опытов по ЭС клеток показывают, что не всякий контакт между клеточными мембранами достаточен для слияния клеток под действием электрических импульсов. Наиболее важными, на наш взгляд, характеристиками контакта между клетками, являются его геометрические параметры - толщина мембранного зазора и площадь контакта. Именно эти величины и определяют эффективность ЭС. 1&ким же способом обеспечивается контакт - за счет биологических взаимодействий между клетками или их механическим сближением - при ЭС особой роли не играет. Величины сил, возникающих при центрифугировании или пиевмоэлектрослиякии, как показывают проведенные в работе оценки, недостаточны для преодоления электростатического отталкивания методу мембранами, поэто- 1 му при сближении йлеток в месте контакта устанавливается равновесное для данной ионной силы расстояние между мембранами (порядка Дебаевской длины), а дальнейшее сжатие клеток приводит к их деформации и, соответственно, увеличению площади межклеточного контакта. Как показали наши опыты по измерению при центрифу-

гировании, изменению формы клеток препятствуют элементы цитоске-лета - периферические микрофиламенты и микротрубочки, а обработка разрушающими цитоскелет цитохалазином Б и колцемидом значительно облегчает сжатие клеток. ЬЬжно убедиться, что рост площади контакта при увеличении сдавливающей клетки силы или при обработке, например, цитохалазином, благоприятствует электрослиянию. Аналогичным образом, уменьшение равновесного расстояния между мембранами в средах с высокой ионной силой в наших опытах также способствовало ЭС. Предварительная обработка проназой,(удаляет с клеточной поверхности белки и полисахариды ивызывает, по-видимому, уменьшение межмембранного зазора вследствие снижения заряда мембран и устранения стерических препятствий для их сближения) равно как и агглютинация клеток растительными'лектинами, стабили-зирущими контакты большой площади, увеличивают ИС. В то же вре-

Г} П

мя, белки сыворотки, Са , 1% + на стадии контакта не оказывают влияния на ЭС.

Толчком к слиянию приведенных на первой стадии ЭС в плотный контакт мембран клеток служит электрический импульс. Для объяснения событий, происходящих на второй стадии слияния клеток нами предлагается следующий механизм. Под действием внешнего электрического поля на клеточных мембранах возникает разность потенциалов, приводящая к их электрическому пробою, причем вероятность образования пор в контактных мембранах пропорциональна площади контакта и напряженности поля, наиболее вероятен пробой участков мембран, перпендикулярных направлению поля. После электрического пробоя одной иэ контактных мембран, напряжение на другой мембране напротив поры практически удваивается и именно в этом месте наиболее вероятен пробой второй мембраны. Т&ким образом, при ЭО клеток в контактных мембранах образуются коаксиальные поры, сквозь

которые проходит электрический ток (рис.6). Поскольку ток лишь в незначительной степени проникает в зазор между мембранами, электрическое поле в окрестности пор распределено таким образом, что возникает давление, сближающее мембраны. Плотность сил О, действующих на мембрану по нормали к ее плоскости, равна разности максвелловских натяжений по обе сторны мембраны. Решение уравнения Лапласа для системы коаксиальных пор с соответствующими граничными условиями дает распределение потенциала на обеих поверхностях мембраны и соответствующее выражение для р. Полную силу Р, действующую на мембрану, можно найти путем численного интегрирования этого выражения на ЭВМ. При и = I В Р составляет 2x10"*%, что соответствует давлению на кромки пор р а* 50 атм. Доведенный в работе анализ препятствующих сближению мембран сил электростатического и гидратационного отталкивания, а также сил сопротивления мембран изгибу показывает, что силы эти одного порядка или меньше Р.

Замыканием кромок пор с образованием мембранной трубки, ограничивающей цитоплазматическую перемычку между клетками и завершается вторая стадия слияния.

На следующей стадии происходит рост перемычки и полное перемешивание цитоплазм клеток. Каковы движущие силы этого процесса? Нами было установлено, что основную роль играет натяжение мембран, в то время как цитоскелет на этом этапе слияния заметного участия не принимает. Натяжение мембран может создаваться при распластывании клеток или осмотически, причем гипотонический шок при ОС распластывающихся клеток ускоряет их слияние, а не распластывающихся - не только ускоряет, но увеличивает и эффективное! слияния. Существенно, что подавление клеточного метаболизма предотвращает слияние клеток. Из этого следует, что рост перемычки

обусловлен активными внутриклеточными процессами и данный этап слияния требует поддержания оптимальных для жизнедеятельности клеток условий.

/Ьльнейшая судьба слившихся клеток с общей мембраной и смешанной цитоплазмой зависит уже от тонких биологических взаимодействий между ядрами и органеллами исходных клеток.

ВЫВОДЫ

1. Детально изучено действие импульсной электрической обработки на животные клетки разных типов и показано, что электрическая обработка приводит к ряду патологических нарушений: вакуолизации цитоплазмы, укрупнению лизосом, деконденсации хроматина, угнетению синтезов ДНК и РНК, замедлению клеточного роста и даже гибели части клеток спустя 1-2 часа после электрообработки.

2. Установлено, что в ходе импульсной электрической обработки и до 30 минут после нее клетки обладают повышенной чувствительностью к составу внешней среды и характеризуются высокой проницаемостью гшазмалеммы для одно- и двухвалентных катионов, воды и некоторых красителей.

3. Обоснован механизм электроповреждения клеток, в соответствии с которым основной причиной патологических нарушений и гибели клеток является изменение содержания ионов и воды в клетках при обратимом электрическом.пробое плазмалеммы. Составлена среда на основе фосфатно-солевого буфера, из которого исключены Оа и и введены сахароза и сывороточные белки и показано, что при обработке клеток в такой среде патологи- ' ческие изменения носят временный характер, а гибель клеток незначительна.

4. Разработаны три новых метода электрослияния клеток

(на проводящих подложках; при центрифугировании; пневмоэлек-трический), позволяющие с высокой эффективностью осуществляв слияние как распластывающихся, так и суспензионных клеток.

5. С помощью новых методов электрослияния получен ряд гетерокарионов из различных типов животных клеток, гибридом-ные клоны с высоким титром продуцируемых антител.

6. При исследовании слияния клеток методом центрифугирования обнаружено, что уплотнение клеточного осадка сопровс дается увеличением его электрического сопротивления. После уменьшения сжимающей силы сопротивление осадка и, соответственно, степень уплотнения клеток в осадке, уменьшаются за счет упругости цитоскелета.

7. Зарегистрирован и исследован обратимый электрический пробой мембран клеток в осадке. Установлено, что пробой мем-ран Ь-клеток происходит при напряжении на мембранах более О, (>-0,7 В. Предложена модель описания свойств клеточного оса ка, согласно которой быстрая стадия релаксации проводимости осадка с характерным временем порядка миллисекунд связана с восстановлением клеточных мембран после электрического пробо а медленная, с характерным временем I минута - с уплотнением клеточного осадка. Время полного восстановления электрически свойств мембран клеток после пробоя определено в 5-15 минут.

8. Показано, что слияние клеток всегда сопровождается электриоеским-пробоем их мембран, при этом напряжение на мем бранах для слияния I.-клеток должно превызать 3 В.

9. Проведен анализ действия многих факторов (сжимающая сила, лектины, протеолитические ферменты, ионная сила, ингибиторы цитоскелета, параметры электрообработки,

белки сыворотки, осмос, ингибиторы метаболизма) на конкрет-

е стадии процесса слияния и предложен новый механизм электро-ияния, согласно которому в приведенных в плотный контакт кле-чных мембранах под действием электрического поля образуются аксиальные поры. Последующее сближение и замыкание кромок пор зывает мощная сила, возникающая при прохождении тока сквозь ры. Слияние клеток при этом обеспечивается ростом образовав-Йся перемычки за счет мембранного натяжения.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Сухарев С.И., Бандрина И.Н., Барбул А.И., Абидор И.Г.,. игенин A.B. Способ получения соматических гибридных клеток шотных// Авторское свидетельство N1324292.- 15.03.1987.

2. Abidor I.G., Barbul A.I., Bandrina I.N., Pedorova I.A., loharev S.I., Borodina V.M., Zelenin A.V. Aotion of the .eotrio field pulses upon living oells// XIth Jena Simposium i Biophysioal ChemiBtry:AbatraotB.- Erfurt, 1986.-p.36.

3. Барбул А.И., Егоров E.E., Бандрина И.Н., Федорова Л.И., 'харев С.И., Зеленин A.B. Влияние импульсного электрического >ля на жизнеспособность мышиных фибробластоподобных клеток// юл. мембраны.- 1989,- т. 6.- C.I97-2II.

4. Sukharev S.I., Bandrina I.N», Barbul A.I., Abidor I.G., [lenin A.V. Eleotrofuaion of fibroblaet-like oells//Studia ophys.- 1987.- Vol. 119.- P.45-40.

5. Sukharev S.i., Bandrina I.N., Barbul A.I., Pedorova L.I., idor I.O., Zelenin A.V. Eleotrofuaion of fibroblasts on the roua membrane//Bioohim. Biophys. Aota.- 1990.- Vol. 1034.125-131.

6. Кузьмин П.И., Пастушенко В.Ф., Абидор И.Г., Сухарев С.И., Барбул А.И., Чизмаджев Ю.А. Теоретический анализ механизма электрослияния клэток//Биол. мембраны.- 1988.- Т. 5.- С. 600-612.

7. Барбул А.И., Бандрина И.Н., Абидор И.Г., Сухарев С.И., Егоров Е.Е., Зеленин А.В. Импульсная электрическая обработка -универсальный способ слияния клеток//Цитология.- 1987.- Т. 29.-С. 1073.

8. Абидор И.Г., Барбул А.И., Желев Д., Сухарев С.И., Бандрина И.Н., Федорова Л.И., Пастушенко В.Ф., Кузьмин П.И., Зеленин Ф.В. Электростимулируемоэ слияние клеток при центрифугировании и электрические свойства клеточных осадков//Биол. мембраны.- 1989.- Т. 6.- С. I296-I3I2.

9. Frudovsky I.A., Kapnio Е.М., Pedorov Yu.V., Barbul A.I., Zelenin A.V. Differential regulation of DNA synthesis in heterokaryons between ohioken erythrocytes and. culture oells with various proliferative potentials//Eur. J. Cell Biol.-1990.-V. 51 .-P. 347-352.