Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение воздействия электрического поля, химических и биологических факторов на свойства клеток и их способность к образованию гибридов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение воздействия электрического поля, химических и биологических факторов на свойства клеток и их способность к образованию гибридов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМЕНИ В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

РГ6 од

О ЛИ г Ъ;- На правах рукописи

УДК 577.2' 3 + 577.2.04

ФЕДОРОВА

Людмила Ивановна

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОЛЯ, ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА СВОЙСТВА КЛЕТОК И ИХ СПОСОБНОСТЬ К ОБРАЗОВАНИЮ ГИБРИДОВ

03.00.03 — Молекулярная биология 03.00.25—Клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта Российской Академии Наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор А. В. Зеленин, доктор биологических наук И. А. Прудовский.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. А. Кущ, доктор биологических наук, профессор О. Л. Поляновский.

Ведущая организация — Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова, РАН.

Защита состоится « IX » , . 1994 г.

в « ^» часов на заседании специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии РАН.

Автореферат разослан « Л . » . 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

А. М. Крицын

- а -

ОБИАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Широкое развитие работ по клеточной инженерии явилось стимулом к разработке подходов, повышавших эффективность гибридизации клеток. Среди подходов, которые в течение последней четверти века буквально революцинизировали клеточную биологии, фактически создав генетику соматических клеток, следует выделить метод слияния клеток и метод введения чужеродной ДНК в клетки. Существуют три основных метода слияния клеток: с помощью инактивированного вируса Сендая, полиэтиленгликоля и электрообработки. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. В отношении каждого из нид имеются данные о его механизме. Однако, остается иного неясных вопросов относительно механизмов слияния. Изучение вопроса о механизмах слияния может иметь важное значение для выбора метода слияния, предпочтительного для решения тех или иных задач. Особенный интерес представляет метод электрослияния, который все более широко используется в биотехнологии.

Цель и задачи работи. Цель настоящей работи: исследовать воздействие электрического поля на клетки, попытаться разработать универсальный метод слияния и выяснить механизм воздействия поверхностных гликопротеинов вируса Сендая и ПЭГ на способность к образованию клеточных гибридов. Непосредственными задачами работы являлись:

1) выяснить влияние электрообработки (ЭО) на клетки

2) оптимизировать условия электрообработки

3) оценить эффект воздействия ЭО на дроаски

41 попытаться разработать универсальный метод электрослияния ОС)

5). проверить предположение о двухэтапности процесса слияния

6) Выяснить возможность получения с помощью ПЭГ гетерокарионов далеко отстоящих эволюционно друг от друга организмов: дрожкевих и животных клеток.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено комплексное исследование действия импульсной электрической обработки на жизнеспособность клеток. Подобраны состав среды и условия ЭО, при которых гибель клеток

незначительна и патологические изменения носят временная характер. Разработан ряд новых методов ЭС. позволяющих с высокой эффективностью сливать разнообразные клетки. Получены новые данные, указывающие на двухэтапность процесса слияния клеток. Показана возможность использования очищенных лиофилиэированных белков вируса Сендая для слияния клеток. При этом возможно длительное хранение лиофилиэированных белков без потери их сливающей активности. Впервые была получена экспериментальная модель долгоживушго гетерокариояа, в которой генетический дефект животной клетки компенсируется дрожжевым геномом.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на: конференциях "Генетика соматических клеток в культуре" (1986, Звенигород); "Новые направления биотехнологии" (1986, Пушино); IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (1987, Черноголовка); XI Jena Symposion or Biophysical Chemistry (1986, Jena), Всесоюзных совещаниях пс биоэлектрохимии (1986, Ленинград; 1987,Каунас); Всесоюзно* совещании "Биология клетки в культуре" (1967, Ленинград).

Структура и обьеи диссертации. Диссертация состоит и: введения, обзора литературы, описания материалов и методо! исследования, результатов и их обсуждения, выводов и спискг цитируемой литературы из 171 наименования, из них 14S иностранных источника. Работа содержит ¿Ш страниц, включая 2< рисунков и 13 таблиц.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ Получено авторское свидетельство за N 1514777 от 22.07,1988 Список публикация приведен в конце автореферата.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЯ. АО - акридиновый оранжевый ГАТ- гипоксантин, аминоптерин, тимидин Е - напряженность импульса ИЖ - индекс жизнеспособности ИС - индекс слияния ПЭГ- полиэтиленгликоль ФДА- флюоресцеиндиацетат

ФСБ- фосфатно-солевоя буфер ФГА- фитогемагглстинин ЭО - электрообработка ЭС - электрослияние

МАТЕРИАЛЫ а МЕТОДЫ

Культура клеток.

В работе были использованы мышиные фибробластоподобные клетки линии 1-929, эпителиальные клетки мыши М1Н ЗТЗ; мутантные клетки фибробластов китайского хомячка СИ линии 431 итами ГГФРТ- , полученные из лаборатории генетики соматических клеток Института молекулярной генетики РАН; фибробласты киталского хомячка линии 431; клетки миеломы человека линия КБО, Х-653, перитоиеалъние макрофаги иыии, спленоциты мыши; протопласты клеток дро?гкей Епботусез швтшП, Тоги1а иНИв; дрожжевые клетки ЗассМгопусед сегеу1н1ае, полученное в Институте микробиологии РАН; Э&ссЪагоиусеБ сегеу1в1ае расы ЬК, полученные ¡¡а Московском дрожжевом комбинате. Основным обьектом в большинстве экспериментов являлись 1-клетки.

Электрическая обработка.

Клетки снимали с культуральных флаконов смесью растворов Версена (0,02*) и трипсина (0,23X1 и суспендировали в ростовой среде с сывороткой. Затем при двукратной отыывке клетки переводили в среду, в которой проводили электрообработку (далее будем именовать ее средой электрообработки). В качестве базовой среди . электрообработки использовали фосфатно-солевои буфер (ФСБ) РМ 16 ("Зеп/а",ФРГ1 следующего состава, мМ: №0.-140, КС1.-3, На2НР04-3,6, МаН2Р04-1,Г.

Состав других сред, в которых проводили электрообработку, приведен в табл.1.

Слияние клеток в суспензии.

Ячейка объемом 0,25 мл имела плоскопаралельные электроды из нержавеющей стали с зазором между ними 1,5 или 2 мм. Плотность клеток в суспензии, помещаемой в ячейку, составляла

- б -

(2-5)'10ь мл"1. Аппаратура для электрообработки, а также конструкция' ячеек описана Эршлером и Сухаревым Оршлер и др., 1991, Sukharev et al., 1987 1.

Слияние клеток на электропроводящих подложках.

Суть метода заключается в следующем. Клетки высаживают на проводящую подложку (диализный целлофан, покрытый сывороточными белками) и. культивируют до образования клеточного монослоя. Затем добавляют суспензию других клеток и культивируют еще 1-3 ч для установления контактов между клетками верхнего и нижнего слоя. Подложку с клетками переносят в ячейку со средой ЭО и обрабатывают электрическим импульсом, перпендикулярным плоскости подложки.

Слияние клеток при центрифугировании.

Для слияния в процессе центрифугирования использовали модифицированную настольную центрифугу (High-speed centrifuge М 310, "Mechanlka Precyzyjna",ПНР) с регулируемой скоростью вращения. Вместо обычных пробирок в ротор центрифуги помешали специальные ячейки, состоящие из тефлонового корпуса и двух электродов из нержавеющей стали .на резьбовом соединении. Диаметр полости, в которой формировали клеточный осадок, обычно составлял 3 мы. Один электрод образует дно ячейки, а другой выполняет также роль пробки, обеспечивающей стерильность ячейки после заполнения ее клеточной суспензией в боксе. Межэлектродный зазор обычно составлял 3 мм. С электрической цепью электроды соединены через скользящие контакты, закрепленные на валу ротора и крышке центрифуги.

Скорость вращения центрифуги контролировали с помощью строботахометра. Максимальная скорость соответствовала центростремительному ускорению G - lOOOg. Импульсную электрообработку клеток проводили с помощью специально сконструированного генератора высоковольтных импульсов, состоящего из маломощного источника высокого напряжения, накопительного конденсатора и коммутирующих импульсных тиристоров. Генератор имеет выходное сопротивление 4 Ом и дает одиночные почти прямоугольные импульсы амплитудой до 1 кВ и длительностью 15- 1Ь0 мке.

Слияние клеток при помощи поверхностных гликопротеиноь ■вируса Сендая.

Поверхностные гликопротеины вируса Сендая iбелки F и NH) мы получали от к.х.н. В.П. Копьева, Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина РЛН. В экспериментах использовали L-клетки.

Агглютинация клеток. Агглютинацию клеток фитогемагглютинином (ФГА) (Difco, ФРГ)" проводили согласно методике [Мерсер и Босерга, 1985 1.

Определение уровня синтеза суммарного белка. Через три часа после ЭО клетки растворяли в 0,5 мл буфера с додецилсульфатом натрия, проводили электрофорез полученного экстракта в полиакриламидноы геле. Гель окрашивали красителем Кумасси G ("Pharmacia" Швеция), высушивали и получали авторадиограмму, которую сканировали на денситометре LKB UltroScan XL (Швеция) Синтез ЛНК в клетках исследовали методом импульсной метки (Hi - тимидином с последующей авторадиографиея. Проявленные и высушенные препараты окрашивали красителем Гимза и производили подсчет меченых и немеченых ядер и определяли индекс меченых клеток (т.е. отношение меченых клеток к общему числу клеток в процентах).

Пролнферашвная активность клеток. Пролиферативную активность клеток после электрообработки оценивали подсчетом как общего числа клеток в популяции, так и их митотического индекса.

Результаты исследовании.

Действие импульсной электрооОраСоткм на клетки.

Нами были выбраны диапазон длительностей импульса 5-100 мкс и напряженностел электрического поля 2-5 кВ/см, как наиболее типичные для элэктрического слияния (Zimmerman, 1962; Zimmerman, 1986).

Гибель клеток после электрообработки.

Зависимость изменения индекса »«неспособности в результате электрообработки изучали на клетках L-929, NIH ЗТЗ, клетках миеломы N20 и Х-653. ЭлектрообраСотку клеток проводили в суспензии и в монослое. Использовали импульсы длительностью: 15 мкс, 30 мкс, 50 мкс, 100 мкс; с амплитудами: 2 кВ/см, 3

кВ/см, 4 кВ/см, 5 кВ/см, 7 кВ/см. ЭО 1.-клеток одним импульсом 3 кВ/см, 100 мкс приводит к 100$ гибели клето;с почти сразу после ЭО, что выражается в прокрашивании всех клеток трчпановьш синий (0.05Х). При обработке 14 кВ/см, 5() мкс] происходит полная гибель клеток миеломы НЭ0, Х-653; 100* гибель лимфоцитов наступает в результате обработки их импульсом 13 кВ/см, 50 мкс).

При ЭО меньшей интенсивности гибель клеток непосредственно в ходе электрообработки незначительна, а происходит через некоторое время после нее (табл.1).

Таблица 1. Оценка жизнеспособности клеток на ранних сроках после ЭО.

Клетки < ЭО 5 Доля метрзых клеток,%

^ Е,кВ/см^ ' мкс < 10 мин < ! 30 мин £ 60 мин

ИБО* 4 ■20 82-11 47-18 35-10

N30* 3 20 71+9 25-14

ЗТЗ 3 30 - 15-6 21-5

ЗТЗ 5 30 - 20-7 28-7

1-929. 2 30 - 8-3 15-5

1-929 4 30 — 12-4 16^6 .

« - Окрашивание смесью ФДА * ЭБ, исследование на проточном цигофлуориметре. Остальное - окрашивание трипановым синим, подсчет под микроскопом. Усреднение по трем опытам, в каждом оценивали не менее 300 клеток._

Для исследования влияния на клетки и. оптимизации условий электрослияния в последующих экспериментах мы использовали импульсы длительностью от 15 мкс до 50 икс, напряженностью от 600 в/см до 5 кВ/см.

Зависимость индекса жизнеспособности от параметров ЭО.

Электрообработка клеток импульсом напряженностью 1 кВ/см, длительностью 5-100 мкс не приводит к заметной гибели клеток При напряженности электрического поля (Е) больше 1 кВ/см доля

жизнеспособности IИЖ) убывает как при увеличении г при фиксированной Е, так и при росте Е при фиксированном г.

Влияние состава среды на жизнеспособность клеток после ЭО.

Присутствие Са2+ и в физиологических концентрациях

приводит к значительноя гибели Ь-клеток. Клетки ыиеломы N30 и спленоциты чуствительны к изменению содержания Са2+ лишь при интенсивной ЭО. Замещение №01 на эквивалентное количество КС1 в среде обработки положительно сказывается на жизнеспособности клеток ЗТЗ, 1-929 (табл.2).

Таблица 2. Хизнеспособность ¡.-клеток после ЭО в средах различного состава

Состав среды * < ИЖ,*

Ростовая среда (1,5 мМ Са2+,1мМ Мг2* 45-6

ФСБ * 1 ,5 мМ Са2+ 50-5

ФСБ + 1 мМ Мя2"1" 54 1 5

ФСБ 70-5

ФСБ + 130 мМ КС111:9) 85-3

ФСБ + 40 мг/мл бычий сыворот.альбумин 82-3

Диализованная сыворотка 64-4

ФСБ + 0,3 М сахароза (1:1) 92 1 2 Диализованная сыворогка + 0,3 М сахароза!1:1 ) 95-3

0,3 М сахароза 43-10

ЭО: (4 кВ/см; 30 икс ).

* - среду заменяли на ростовую через 30 мин инкубации при 37°С. «» - тест на исключение трипанового синего через 3 часа после ЭО

Жизнеспособность клеток увеличивается при введении в среду обработки сахарозы или диализованноя сыворотки. Однако, при ЭО в растворе, содержащем только сахарозу, живых клеток остается даже меньше, чем при обработке в ФСБ без добавок (табл.2).

Важным является то, что жизнеспособность клеток зависит не только от состава, в которой проводится ЭО, но и от состава среды, в которой клетки инкубируют после ЭО. Такая чуствитель-ность клеток сохраняется в течение некоторого времени. Перене-

о +

сение ¡--клеток в среду, содержащую Са" , через 1-2 мин после ЭО приводит к значительной гибели клеток. ИЖ достигает максимума при 10-15 минутной инкубации в ФСБ без и , а при

дальнейшей инкубации снижается. При этом более предпочтительна инкубация при 37°С .

Изменения в клетках после электрообрр.бспки Комплекс экспериментов по выяснению слияния электрических импульсов на пролиферативную активность клеток, уровень синтеза ДНК, а также на скорость вхождения в Э-период из покоящегося состояния проведен нами на клетках ЗТЗ. поскольку именно эти клетки, что существенно для последнего эксперимента, способны входить в состояние покоя при низкой концентрации сыворотки. Одним из последствий ЭО, кроме гибели части клеток, является замедление роста выживших клеток в первые два ч».са после ЭО. ЭО клеток N50 импульсом 12 кВ/сы, 30 мке 1 практически не влияет на скорость роста клеток, тогда как при более . сильной 30 происходит почти полное подавление размножения клеток в первые сутки после ЭО. То же справедливо и для ¡.-клеток. Подсчитанный паралельно митотическии индекс клеток ЗТЗ (табл.З) к 24-му часу-после электрообработки в опытах был ниже, чей е контроле, '¡о к 40-му часу он приблизился к контролю в обоих опытах.

Таблица 3. Милютическия индекс (X) в культуре клеток СТЗ, подс-

читанный в различные сроки после электрообработки в ФСБ

Параметры импульса ^ Время после ЭО, Ч

\ 24 1 4а

3 кВ/си, 20 икс 3,5 2.0

5 кВ/см, 20 икс 2,6 2,1

Контроль 6,8 2,5

ЭО средней интенсивности приводит к угнетению синтеза ДНК.

В опытах с клетками НЭО и мышиными спленоцитами ЭО напря.тен-ностыо 3-4 кВ/си, длительностью 10-30 мкс вызывало угнетение синтеза ДНК (табл.4. ), которое сохранялось и до 24 ч.

Таблица 4. Доля синтезирующих МЯК клеток после электрической

обработки (X).

Клетки I , NS0 I Спленоцигы

Е, кВ/си $ Время после ЭО, < ч i г, мкс | 5 1 24 < : 5 24

3 10 34.0 39,0 1 ,9 0,7

3 30 23,0 12,0 0,5 0,1

4 30 - 1,5 - -

0 (контроль) 53,5 50,5 3.1 2,3

В ряде случаев это угнетение носит временный характер (до

5 часов). Синтез ДНК в клетках ЗТЗ, обработанных 3 кВ/см, 20

а

мкс, как показало импульсное мечение [ HI-тимидином, неналолго подавляется: через 6-0 часов синтез ДНК в опыте постанавливается практически до контрольного уровня.

В последующих экспериментах было изучено влияние электрической обработки на синтез клетками белка. Денситометрия показала, что, несмотря на некоторое изменение относительных интенсивностей 12 основных полос полиакриламидного геля, общее содержание меченого белка в контроле и во асех экспериментах различалось не более чем на 15*.

ЭлектрооОработка не оказывает заметного влияния и на скорость вхождения стимулированных сывороткой клеток в 5-период. В различные сроки после стимуляции сывороткой в обработанных импульсом (ЗкВ/си,20 мкс 1 и интактных клетках мезду контролем и опитом но обнаружено достоверных различия по доли меченых [3Н 1-тимидином клеток. Время этого вхождения в норме (у клеток, не подвергавшихся ЭО) составляет 10-12 часов.

Морфологическое »лучение фиксированных и окрашенных клеточных ' препаратов показывает, что после ЭО средней

интенсивности (2-4 kB/cm, 50 мкс) наблюдается вакуолизация цитоплазмы, появление зернистости, прикрепляющиеся клетки слабее распластываются. При прижизненной окрас;;е АО заметно укрупнение лизосом.

Влияние электрической обработки на рост дрожжевых клеток.

Эта часть работы была выполнена на дрожжевых клетках Saccharomyces cerevlslae, любезно предоставленных нам к.б.н. H.A. Помощниковой (Институт микробиологии РАН) и Saccharomyces cerevlslae расы LK (Moctf. дрожж. завод). В опытах использовали дрожжевую культуру, подрощеккую в течение 24 ч на качалке при 28-3^ С а также культуру, не прошедшую такой предварительной обработки. Методика и аппаратура для электрообработки, а также конструкция ячеек описана ранее [Эршлер и др., 1991; Sukharev et al., 1087). Параметры 30: напряженность поля 0,5-7 kB/см, длительность импульса 15-300 мкс.

Таблица 5. Накопление биомассы дрожжей через 24 ч после электрического воздействия, в * к контролю.

Среда $ Среда культивирования

обработки 5с с* ¡ре да Ридер ; 1(евх&роза; $ среда Ридер2< $ S* 1 %с ахар. *Сл > с ре да Ридер < * 1 /|к>к о эа J ► среда на . ОС ИОВ с > мелассы

Среда Ридер +1% сахарозы 200 230 _ _

Среда Ридер

+1* сах.+Са2+ 160 190 - -

Автоклавиров. водопров.вода 150 200 160 225*

Среда Ридер *1Х глюкозы - - 200 -

"Клетки расы LK

Проведенные эксперименты показали, что, начиная с 1-2 ч после воздействия импульсного электрического поля, количество клеток ЗассУйгошусеБ сегеу1Б1ае в культуре заметно

увеличивается по сравнению с контролем. Через 6 ч культивирования число клеток после электрообработки почти на 40*, а содержание белка даже на 80* превышает контрольные значения. При этом погибщих клеток не наблюдалось. В течение суток после электрообработки скорость роста клеток выше контрольной только в первые 10 ч. При этом через 24 ч общее число клеток после ЭО примерно в 1,5 раза превышает контрольные значения. Абсолютное значение прироста и его скорость существенно зависят от условия культивирования (температура, состав и обьем питательной среды). При оптимальных условиях культивирования (среда на основе свекловичной мелассы, температура

о Т -1

около 25 С и исходная концентрация клеток около 10 мл ) прирост обработанных клеток может в 3,5-4 раза превышать данную величину для контроля. Изменения внешнего вида клеток не наблюдалось.

Оптимальный диапазон параметров стимулирующего импульса для Saccheromyces cerevislae расы LK составлял: 3-4 кВ/см, 3050 мкс,. хотя для каждой расы клеток существуют свои значения напряженности поля и длительности импульса, даюшхе наилучшие результаты.

УсосерЕеистиование методов электрослмяння.

Слияние агглютинированных клеток.

Для агглютинации кгггток мы использовали фитогеыагглютинин (Dlfco). Процедура агглютинации описана в разд.2.7.

Слияние в суспензии.

Эксперименты проводили на L-клетках, фибробластах китайского хомячка линии 431, клетках миеломы Х-653, лимфоцитах.

Слняние L-клеток с ФГА: ИС - 51 -6 *: ИЖ - 70*. Без ФГА : ИС - 27 ; 3 8; ИЖ - 80 - 9S.

Слияние клеток китайского хомячка линии 431 с ФГА: ИС - 35 - 10S, И - 50*. Без ФГА ИС - 20 -3Z, ИД - 60*.

Слияние клеток Х-653 и лимфоцитов мыши. Данные по образованию поликарионоз Х-653, лимфоцитов, а также гетерокарионсв - Х-653 ♦ лимфоциты представлены в табл.6.

- н -

Таблица б. Электрослияние агглютинированных ФГА клепюк.

Клетки $ ИС ? ИЖ

Х-63 + Х-63 52 -11 43 - 15

Сплен.* сплен. 15 -,7 10-3

• Х-63 + сплен. 17-3 60-12

Слияние клеток на проводящей подложке. Слияние Ь-клеток. Результаты представлены в табл.7, в. Таблица 7. Электрослияние Ь-клеток на проводясь л подложке.

№ п/п ¿Клетки на «подложке Ферхния < 5 слоя < |<300тыс. < ^.-клеток) < Центрифуг. ¡200е х 5мин 5 Инкубация 1 37 С х 120мин *

1, Монослоя 100* конфлюента - - - зо- 3

2. Монослоя 70* конфлюента - - - 17- 0

3. — „ — + + - 19- 9

4. - „ - + + 53- 12

5. - ,. - + - + 48- 6

Индекс слияния подсчитывали через 24 часа после электрообработки. Обработку проводили в диализованноя сыворотке 1 импульсом 13 кВ/см, 35 икс).

Из таблицы 7 ясно, что повышению интенсивности слияния способствуют: 1 ) наличие верхнего слоя клеток; 2) инкубация препаратов при 37°С для установления контакта клеток верхнего слоя с клетками, растущими на подложке.

Слияние клеток китайского хомячка (431). Результат: ИС -50*, ИЖ - 60«.

Слияние клеток ЗТЗ. Результат: через 16 часов после Э0

индекс слияния составил - 13 - 4Х; ИЖ - 75Х. В контроле без ЭО - многоядерных клеток около 2 X.

Слияние ¡.-клеток с лиифоиитаии иыт. Было обнаружено слияние 1-клеток между собой и спленоцитов между собой. Кроме того, на 100 Ь-клеток обнаруживалось 2-5 гетерокарионов I * спленоцит.

Слияние клеток СН 431 со спленоцитами мыши. Гетерокарионы составляли 1-4 % от общего количества клеток 431.

Таблица в. Электрослияние 1-клеток на проводящей подложке

ЭО Е,кВ/см г,мкс < > Среда ЭО | Среда инкубации | ис.х | <- иж,х

3 30 ФСБ ФСБ 63-16 10-5

3 10 ФСБ ФСБ 61-12 87-6

2 10 ФСБ ФСБ 62-10 95-3

3 30 Д.сыв. Д.сыв. 57-9 77-7

3 30 Д.СЫВ.+ Д.сыв.* 0.3 М

0.3 М саха- сахароза +

роза (1:1) 53-9 98-1

3 30 - » - ФСБ 52-11 94-3

3 30 - •• - 0,3 М сахароза 10+2 53-11

3 30 0,3 М сах. 0,3 М сахароза 9-5 95-3

ИС подсчитывали через 5 ч после ЭО. ИЖ определяли через 5 ч после ЭО, с помощь» теста на исключение трипанового синего. Подложки с клетками переносили в среду инкубации через 1 мин после ЭО.

Слияние клеток, предварительно осажденных центрифугированием. В этом варианте слияния клетки приводили в контакт при помоши центрифугирования, после которого полученный осадок подвергали электрообработке. В экспериментах использовали клетки: Х-653. 1-929, ШН ЗТЗ, СН 431.

Были обнаружены гомокарионы клеток миеломы и гетерокарионы миелома + лимфоцит (5Х от числа клеток Х-653, ИЖ клеток Х-653

составлял 60%, ИХ лимфоцитов много меньше.

В то же время не удалось добиться заметного слияния з осадке клеток: L-929; ЗТЗ; СН 431, даже варьируя интенсивность 30 в диапазоне Е- 2-5 кВ/см, r= J0-50 мкс и состав среды (различные соотношения ФСБ и сахарозы). Поэтому мы пошли по пути дальнейшего развития подхода, в котором клетки приводят в контакт центрифугированием и разработали болго униг.орсальный метод ЭС.

Слияние клеток в процессе центрифугирования.

Описание метода.

1>(етодика экспериментов проста: суспензию клеток, отмытых от сыворотки и переведенных в среду электрообработки, вводили в ячейки соответствующего типа, закрывали верхним электродом, помешали в центрифужные стаканы, подключай:;, контакт к верхнему электроду и закрывали центрифугу крышкой со встроенными щетками. Центрифугирование осуществляли 15 мин, После чего, не останавливая центрифугу, производили ЭО клеток и центрифугировали их затем еще 2 мин. Палее ячейки осторожно извлекали из ротора, помещали в тёрмостат и инкубировали 15-30 мин при 37°С. После инкубации клетки ресусиондировали в ростовой среде и рассаживали для культивирования в пеницилиновые флаконы на покровные стекла (по 2 х 1С? клеток на флакон). Через 12-24 часа препараты фиксировали 70%-ныы этанолом, окрашивали красителем Гиыэа ("Merck",ФРГ) и определяли индекс слияния, просчитывая не менее 300 ядер. Данный метод применялся нами для самых разных типов клеток: L-929, ЗТЗ, NS0, Х-653, NSO+спленоциты, L-929+спленоциты. Различные варианты слияния клеток обобщены в табл.9. Из таблицы видно, что эффективность слияния клеток при центрифугировании зависит от параметров электрической обработки.

Таблица 3. Зависимость Эффективности слияния от параметров ЭО

№ п/п { Клетки 5 Среда

Осаждение

ЭО

:лияния ^ а/г ^,мин| к! £ мкс

< ИС,% < ИЖ,*

1. 1-929 ФСБ'0,3 М сах.,4:1 450 10 3,0 0 20 52-7 45-12

2. ЗТЗ ФСБ+0,3 М сах., 1:1 1000 5 3,0 20 65-9 51-14

3. N50 Среда ЙРМ1 800 4 3,0 10 31-5 44-10

4. Х-653 Среда ИРМ1 380 7 3,0 13 29-6 57-15

5. N30 + спленоц. Д.сыз.+0,ЗМ сах., 1:1 450 10 2,0 20 7-4 68-7

6. 1-929

(на подлпяхе) ^спленоц. ФСБ "350 5 3,0 15 5-3 49-8

Примечание: ЭО проводили за 1 мин до остановки центрифуги.

Однако, высокая интенсивность ЭО (например (2,5 кВ, 30 икс.)) ещз не является достаточным условием слияния клеток. Дополнительным условием слияния клеток является достижение плотного контакта между ними.

Слияние клеток с покояыо поверхностных глмкопротеинов вируса Сендап.

В экспериментах использовали вирус Сендай (в качестве контроля); фракцию (1 ) - Р-белок; фракцию (2) - Ш-белок; смесь Фракций Р и НИ в соотношениях 1:1 и 1:2; смесь белков Р и НЫ. Фракции (1) и (2) получены из солюбилизировэ.кных поверхностных белков вируса Сендая с последующей молекулярно-ситовоп хроматографией на биогеле А-1,5 п. Анализ фракций методом электрофореза показал, что Фракция (1) содержит в основном белок Р, фракция (2) - белок НЛ. Фракции концентрировали до обьема 2-3 мл и смешивали в различных соотношениях. Смесь белков получали солюбилиэацией вируса в 1* октилглюкозиде и

удалением детергента диализом.

Слияние вирусом Сендай.

Слияуие вирусом Сендай проводили в монослое и в суспензии. При слиянии вирусом Сендай индекс слияния ¡.-клеток равнялся 2025* (табл.10).

Слияние гликопротеинами вируса Сенлая.

Показано, что каждая фракция в отдельности обладает низкой сливающей активностью (табл.10). Смесь фракций (1 и 2) в соотношении 1:1 и 2:1 проявляет достаточно высокую сливающую активность - 14-18*.

Таблица 10. Сливающая активность белков F и HN в различных

соотношениях.

» Содержание* < к Нгйрамияи- Ъ Уде ль мля i

Материал < ► Селка,мкг/нл< > да.jtiAB дк* S нейрамини' S Индекс

► тивиостъ, S данная акт. S слияния

\ е д. ак т/ мл S е д . ах т/ м л \

Вирусная суспензия 1 ,0 38,9 38,9 25,6

Фракция 1 0,08 2,8 35,3 3,3

Фракция 2 0,08 7,6 95.8 3,1

Фракции 1+2 11:1) 0,08 5,6 65,4 14,0

Фракции 1+2 (2:1 ) 0,08 5,0 58,8 16,5

Смесь белков

И и НН 0,17 6.1 35,9 10,5

Результаты изучения влияния обшей концентрации белков на

сливающую активность приведены в табл.11. Показано, что

оптимальной концентрацией белков F и HN в соотношении 1:1 и 2:1

для проявления максимальной сливающей активности является 80100 мкг/мл.

Таблица 11. Влияние концентрации белков Р и НН и предварительной обработки клеток ФГА на сливающую активность.

Материал

Вирусная сусп,

Фракции 1+2 (2:1)

Фракции 1+2 12:1 )+ФГА

Смесь Р и НИ

$ НеОрлииии- < Удгл&ная Содерж&ни? £ дазпая ак- ч нгаракииц- £ Индекс белка, мг/нл \ тияиостъ ч д&эпая £ слияния

£ гд. акт/мл ъ тииноетъ, > (2) ч г д. ак т/ мл

0,5 0,45

0,45+0,025 0,035 0,070 0,100 0,150

3,9 6,7

6,7 2,3 5,6 8,1 12,3

4,9 15,0 '

80,0 80,5 81 ,0 32,0

5,6

14,9 10,3 17,3 16,3 17,8

Из таблицы видно, что индекс слияния фракцией белков агглютинированных ФГА клеток в 2,5 раза выше, чем не агглютинированных . Определение индекса слияния показало, что слияние клеток происходит только после добавления обеих фракций белков.

Для выяснения роли белка НМ, как агглютинирующего фактора, мы провели эксперименты, в которых использовали препараты белков с низкой нейраминидазнои активностью. Клетки предварительно обрабатывали фитогемагглютинином. Было обнаружено, что ИС в опытах без агглютинации с ФГА равен 5,6 %, а в опытах с агглютинацией клеток ФГА индекс слияния равен 14,9 % (табл.11 ).

Также было показано, что при хранении лиофильно высушенные белки вируса Сендая не теряют своей сливающей активности и могут быть использованы в работе (табл. 12).

Таблица 12. Стабильность препарата сиеси белков И и НИ вируса Сендай при хранении.

Срок хранения, нес

Индекс слияния

1

1 .5 6 10

18.3

14.4 17,0

10,2

10,0

Применение ПЭГ для слияния дрохяевнх клеток и клеток хивотних.

Долгоживушие гетерокарионы животных и дрожжевых клеток.

В работе были использованы протопласты клеток дрохгк-вых организмов Ерйопусез тадпиБН, Тоги1а иЫИв, а такжэ ъышиные фибробласты (И и мутантные фибробласты китайского хомячка (штамм ГГФРТ-), получерные из лаборатории генетики соматических клеток Института молекулярной генетики РАН. Слияние клеток осуществляли с помошыо ПЭГ.

Слияние [.-клеток с протопластами дрожжей.

В результате слияния клеток ыышиих фибробластов (I! и протопластов дрожжевых организиов Еп<1овусе5 тазлигИ, Тоги1а иШИв и последующей инкубации в ростовой среде (1,5-2 ч) были получены жизнеспособные гетерокарионы. Их количество в препаратах составляло 40-501 от общего количества фибробластов в поле зрения микроскопа. Многие из гетерокарионов содержали несколько ядер дрожжевых клеток. Не отмечалось резкой границы между цитоплазмой Ь-клеток и цитоплаэыоя дрожжевых клеток. В процессе инкубации гетерокарионов в питательной среде до 24 ч наблюдалось некоторое перемещение дрожжевых ядер в цитоплазме Ь-клеток в направлении к ядру. Более длительное наблюдение за гетерокарионами было затруднено ввиду интенсивного разиножения неслившихся клеток.

Слияние фибробластов китайского хомячка ГГФРТ с протопластами дрожжевых клеток.

Для получения долгоживущих гибридов животных и дрожжевых клеток и выяснения их возможного взаимодействия были проведены эксперименты по слиянию протопластов дрожжевого организма Епйотусев таепизИ с мутантныыи фибробластаыи китайского хомячка линии 431 (ГГФРТ-) и селекции гибридов на среде ГАТ.

Полученные нами гетерокарионы дрожжевых клеток и фибробластов китайского хомячка (ГГФРТ-) на среде ГАТ сохраняли свою жизнеспособность по крайней мере до 24-26 суток инкубации.

С целью получения клонов гибридных клеток проводили культивирование полученных гетерокарионов ь селективной среде на панелях (24- и 96-ячеечных). К сожалению, клонировать гибридные клетки не удалось.

Отсутствие способности к пролиферации и клонообраэованию полученных гетерокарионов свидетельствует о том, что между '^¿следуемыми клетками не были образованы истинные гибриды (синкарионы) ^

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Временная зависимость индекса жизнеспособности клеток (1-929; ЗТЗ; N60; Х-653) после электрической обработки в ФСБ одиночными импульсами различной амплитуды (табл.1) отражает кинетику развития индуцированных электрическим полем изменений в клетках, приводящих к беспрепятственному поступлению трипанового синего в цитоплазму. Существенно, что вход красителя обусловлен не собственно электрическим пробоем плазматической мембраны, а вторичными процессами, ведущими к более значительному нарушению целостности мембраны, т.е. последующей деструкцией поврежденных полем клеток.Способность клеток интенсивно прокрашиваться трипановым синим появляется не в ходе электрического пробоя и не сразу после него, а лишь спустя определенное время, необходимое, по-видимому, для протекания вторичных дептрукционных процессов (2ч).

Вместе с тем величины ИЖ, снятые через 5 и 24 ч после

электрообработки, различаются незначительно. Это дает возможность утверждать, что время инкубации для корректногс подсчета доли выживших после такой процедуры Клеток составляет 3-5 ч. Значения ИЖ через 24 ч показывают, что импульсы продолжительностью 30-50 мкс и амплитудой до 2 кВ/см слабо влияют и; жизнеспособность клеток. Импульсы той же длительнрст! амплитудой более 5 кВ/см необратимо повреждают значительну! долю (50-80*) клеток. Увеличение длительности импульса, как i увеличение амплитуды, понижает число жизнеспособных клеток Обработка клеток в средах, содержащих миллимолярньи концентрации ионов кальция и магния: DMEM (1,5 м.Ч Са ) и ФСБ i добавлением 1 мМ Са2+или 1ыМ приводит к гибел:

значительной части (40-50*) клеток. Как видно из табл.2, пр

обработке клеток в бескальциевом ФСБ жизнеспособность клето

„ 2 +

заметно выше, чем при использовании Са - содержащих растворов

Электрические воздействия вызывают морфологичеЩр

изменения в исследованных нами клетках. При электрообработке 2 +

Са -содержащей среде, а также при сильной обработке (4-кВ/см, 30-50 мкс) в ФСБ в клетках происходят долговременны изменения, обнаруживаемые в световом микроскопе. В цитоплазм появляются вакуоли различного размера, которые, иаиооле вероятно, являются разбухшими цистернами эндоплаэматическог ретикулума. В клетках также происходит увеличение размере лизосом, которые в отличие от равномерного распределения г цитоплазме в норме группируются вблизи ядра. Введение в cpei сахарозы в концентрации 150 мМ (ФСБ + 300 мМ сахароза, 1:1), .также бычьего сывороточного альбумина (40 мг/мл в ФСБ) замет1 повышает ИЖ и улучшает состояние клеток после электрообработм Синтез ДНК и белка. Рассматривая результаты опытов, нож! сделать заключение о том. что непосредственно пос. электрообработки, даже летальной для половины клеток (5 кВ/см не наблюдается значительного изменения скорости синте: основных белков. Денситометрия показала, что общее содержан! меченого белка в контроле и во всех экспериментах различает' не более чем на 15%. Исходя из наших данных о синтезе ДНК клетках после электробработки можно утверждать, что, ко электрическая обработка ^ожет значительно замедлить размножен клеток 2ТЗ в культуре, тотального нарушающего пролмферац

юздеяствия на все клетки в исследованном диапазоне она не позывает, и через некоторое время, зависящее от параметров филоженного импульса, популяция восстанавливает нормальный гровень пролиферативной активности. Электрическая обработка не называет заметного влияния и на скорость вхождения покоящихся ;л еток в S-период.

Совокупность представленных данных не содержит указания на :уществование. каких-либо других первичных эффектов деяствия ¡лектрического поля на клетки, кроме нарушения барьерной функ-' ми мембраны. Необратимое повреждение мембраны обусловлено по-гвлением до.^гоживущих, стабильных, вероятнее всего, достаточно ]ирок)!х (d>l,5 нм) пор IKinoslta and Tsong, 1977; Schwistsr and ieuticke, 19Ô5; Serpersu et al., 1965; Telssle, Rois, 19931, a )ор:,шрсвание такой поры (или нескольких пор) в отдельно взятой ¡летке происходит статистически с вероятность», возрастающей фи повышении. напряжния на мембране и длительности его 1еяствия.

Кальций,- входящий в цитоплазму через поврежденную полем ¡ембрану, способствует массовой гибели исследованных клеток, (то согласуется с представлениями, изложенными в обзорах Färber, 1962; Trump et al., 19811.

Отдельная серия экспериментов была посвящена изучению влития ЭО на жизнеспособность и рост дрожжевых клеток. Результаты 1Кспериыентоз показали, что рост дрожжей Sacctiaromyces cerevl-;1ае можно стимулировать в импульсных электрических полях 1селедованного диапазона напряженноетей'более эффективно, чем в юстоянных и переменных полях невысокоя напряженности, (птинальные результаты достигаются в диапазоне 3-4 kB/см при 1лит9лыюсти импульса около 50 икс и требуемых условиях :ультивирования. Простота методики и возможного техно-югического оборудования совместно с высокой эффективностью .анкого типа электрообработки может иметь большое практическое 1начение.

Разработаны способы электростимулируемого слияния клеток ри центрифугировании и на проводящей подложке. Полученные нами еэультаты указывают на перспективность центробежного метода лектрослияния для гибридизации по краянея мере клеток мзотных. По сравнению с другими методами электрослияния данный

метод имеет ряд преимуществ. Для приведения клеток в плотный контакт центрифугированием не требуется какой-либо специальной подготовки клеток, например обработки протеолитическими ферментами (Zimmerman, 1982; Ohno-Shosaku and Okada, 1985), агглютинаторами [Ruker et al., 1987), полиэтиленгликолем и др.. В зависимости от конструкции ячеек в одном опыте можно сливать от нескольких десятков тысяч до нескольких десятков миллионов клеток. Сам процесс электрослияния может проводиться в среде, близкой к физиологической, обеспечивающей жизнеспособность клеток после импульсной электрообработки. Полученный индекс слияния (30-40%) свидетельствует о высокой эффективности предложенного метода. Широкая вариация параметров обработки (интенсивность центрифугирования, амплитуда и длительность импульсов) дает основание надеятся, что метод может быть применен для слияния самых различных типов клеток.

Электрослияние на проводящей подложке позволяет получать большое количество дигибридов, т.к. электрическое поле накладывается перпендикулярно подложке с клетками и поэтому клетки нижнего слоя сливаются в основном с клетками верхнего слоя.

В представляемой работе часть экспериментов была посвящена изучению закономерностям слияния клеток с помощью гликопротеинов вируса Сендай. Результаты проведенных нами исследований дают четкое представление о двухэтапности слияния клеток и о роли специфических вирусных белков в этом процессе. Употребление очищенных белков в качестве сливающих агентов позволяет исключить ряд недостатков, свойственных широко распространенному методу слияния с помощью инактивированного вируса, особенно в случае клеток, которые не сливаются при использовании других способов [Зеленин и др., 1982 1. Прежде всего достигается значительно большая стабильность препарата, т.е. сохранение достаточно высокой сливающей активности прч хранении, возможны стандартизация условий слияния и исключение нежелательного влияния вирусного генома. Полученный препарат очищенных поверхностных гликопротеинов вируса Сендай может быть широко использован для слияния и гибридизации клеток. В ходе работы по изучению особенностей слияния животных и дрожжевых клеток эпервые были получены долгоживущие гетерокарионы.

Сохранение длительной жизнеспособности полученных гетерокарионов животных и дрожжевых клеток обусловлено функционированием дрожжевого генома, находящегося в составе гетерокариона. Полученная нами экспериментальная модель гетерокариона: животные + дрожкевые клетки - является перспективной и представляет интерес для изучения путей обмена, взаимодействия и взаимовлияния геномов различных таксономических групп, далеко отстоящих друг от друга.

ВЫВОДЫ

1. Под влиянием электрообработки Г2-4 кВ/см; 10-30 мкс ) в культурах клеток животных развивается ряд обратимых цитоплаз-матических изменений (вакуолизация цитоплазмы, укрупнение лизосом, угнетение синтеза ДНК).

2. Изменения, возникающие в клетках в ходе электрообравотки, зависят от состава среды, в которой проводят электрообработку. Подобрана среда для электрообработки клеток, позволяющая свести к минимуму токсическое воздействие электрического импульса.

3. Наибольшее значение для выживания клетки в процессе

9+ 1*

электрообработки имеет концентрация ионов Са и Щ во внешней среде.

4. Обработка дрожжей ЗасеМготусеэ сегеу15 1ае в импульсных электрических полях [3-4 кВ/см, 15 икс 1 приводит к стимуляции их роста.

5. Разработаны два новых метода электрослияния:

а. на электропроводящей подложке,(получение гетерокарионов)

б. в ходе центрифугирования (повышение индекса слияния, упрощение процедуры слияния).

0. В опытах с использованием фракций поверхностных глико-протеинов вируса Сендай подтверждено предположение о двухэтап-ности процесса слияния клеток.

7. В экспериментах с использованием в качестве агглютина-тора ФГА показано, что плотный контакт клеток является необходимой стадией слияния.

0. Очищенный лиофилизированный препарат белков вируса Сен-дая может быть использован для слияния и гибридизации клеток.

-2 6-

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Барбул А.И., Егоров Е.Е., Бандрина И.Н., Федорова Л.И., Сухарев С.И., Зеленин A.B. Влияние импульсного электрического поля на жизнеспособность мышиных фибробластоподобных клеток. //Биол. мембр., 1939, т. 6, с.197-211.

2. Абидор И.Г., Барбул А.И., Желев Д., Сухарев С.И., Бандрина И.Н., Федорова Л.И..Пастушенко В.Ф., Кузьмин П.И., Зеленин A.B. Эл^ктростимулируемое слияние клеток при центрифугировании и электрические свойства клеточных осадков. //Биол. мембр., 1969, т.6, с.1296-1312.

3. Копьев В.П., Жигис Л.С., Слепушкин В.А., Решетов П.Д., Федорова Л.И.. Бородина В.М., Зеленин A.B. Поверхностные

о

гликопротеины вируса Сендаи и их использование для слияния клеток. //Биол. мембр., 1966, т.5, с.1201-1286.

4. Бородина В.М., Кирьянова Е.А., Федорова Л.И., Зеленин A.B. Долгоживушие гетерокарионы животных и дрожжевых клеток. //ДАН, 1985, т.282, 'с.986-990.

5. Sukharev S.I., Bandrlna I.N., Barbul A.I., Fedorova L.I., Abldor I.G.. Zelenln A.V. Electrofuslon of fibroblasts on the porous membrane // Biochlm. Blophys. Acta, 1990, v;1034, P.125-131.

6. Бородина B.M., Федорова Л.И., Эршлер И., Абидор И.Р., Зеленин A.B. Стимуляция роста дрожжей Saccharoroyces cerevislae в импульсных электриче:ких полях. //Биол. мембр., 1992, т.9, с.970-976.

7. Бородина В.М., Федорова Л.И., Абидор И.Г.Способ получения биомассы дрожжей Saccharomyces cerevislae// Авторское свидетельство N 1514777, 22.07.1988.

8. Бандрина И.Н., Сухарев С.И., Федорова Л.И., Барбул А.И., Абидор И.Г., Зеленин A.B. Слияние и выживаемость клеток в электрическом поле. //СБ.тезисов. Конференция "Генетика соматических клеток в культуре". Звенигород, 1906, с.92.