Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка микрохирургической технологии искусственного оплодотворения млекопитающих

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка микрохирургической технологии искусственного оплодотворения млекопитающих"

ггз од

)

> . . I

На правах рукописи

ГАЛАТ ВАСИЛИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА МИКРОХИРУРГИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ИСКУССТВЕННОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.23. биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино- 1997

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук,

член корреспондент РАСХН, М.И. Прокофьев

доктор биологических наук,

член корреспондент РАН, JI.M. Чайлахян

Официальные опоненты:

доктор биологических наук, H.H. Ротг

/S, /7,

кандидат биологических наук, A.C. Криво^рчеике^ Ведущее учреждение: Институт биологии развития РАН

Защита состоится « ^^» „ 1998 г. На

- -«с--

заседании Диссертационного Совета ^Д 020. 17. 01 при Всероссийском научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных. Адрес института г. Боровск-3, Калужская обл, ВНИИФБиП с-х. животных.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « 199^'г.

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат сельскохозяйственных наук

Г.В. Дворянчикова

ВВЕДЕНИЕ

Нарушения оплодотворяющей способности спермы являются существенным ограничением для использования искусственного оплодотворения как в животноводстве, так и в работах по репродукции человека.

В некоторых из обследованных групп населения до 87% случаев бесплодия обусловлено мужским фактором. Вероятность повреждения спермы увеличивается при ее криоконсервации. Для многих видов адекватные режимы криоконсервации спермы еще не разработаны. В криобанках хранятся образцы спермы, полученные от погибших диких животных, изначально имеющие разную степень деградации.

Необходимость использования спермы с нарушенной оплодотворяющей способностью привела к развитию методов вспомогательной репродукции, которые позволяют добиваться оплодотворения in vitro поврежденными спермиями.

Метод подоболочечного осеменения (ПОО - subzonal insemination, -SUZI), введения спермиев под блестящую оболочку яйцеклетки, достаточно успешно используется в тех случаях, когда спермин сохраняют хотя бы ограниченную подвижность (Kaplan at all, 1995). При необходимости использовать для оплодотворения неподвижные спермии применяют метод внутриаитоплазматической инъекции спермия (ВЦИС -intracytoplazmic sperm injection, - ICSI). Если ядра таких спермиев сохранны, то оплодотворение с использованием ВЦИС может быть успешным, тогда как никакими другими способами добиться этого не удается (Никитин, 1996).

В то же время, прежде всего из-за технической сложности операции и низкой выживаемости яйцеклеток некоторых видов, ВЦИС применяется ограниченно. Кроме того, показано, что после этой манипуляции, несмотря на формирование зиготы, часть эмбрионов не проходит необходимого числа делений дробления на доимплантационной стадии развития или совсем не делится (Hewitson et all, 1996). Гибель значительной части эмбрионов или нарушение их развития после различных микрохирургических операций вообще является основным фактором, лимитирующим развитие и применение методов эмбриотехнологии. В значительной Степени это обусловлено тем, что механизмы гибели клеток на начальных стадиях эмбриогенеза не изучены, а, следовательно, и не ■ разработано адекватных способов ее снижения. При применении ВЦИС повреждение зигот в результате использования для инъекции клеток микропипеток с большим диаметром (5-9мкм) становится практически неизбежным (Plachot, 1996). По всей видимости, можно уменьшить степень повреждения зиготы, если использовать неинвазивный способ введения спермия.

Еще одна проблема, возникающая при использовании ВЦИС, состоит в том, что у некоторых видов, в том числе у мышей, вероятность

образования мужского пронуклеуса после инъекции спермия в цитоплазму яйцеклетки очень низка (Keefer, 1989). Обнаруженный факт формирования пронуклеусов из ядер спермиев, инъецированных в цитоплазму яйцеклетки другого вида (Naish et al, 1987) открывает дополнительные возможности для получения зигот.

Мы предположили, что эффективность микрохирургического оплодотворения может быть увеличена за счет развития инструментальной базы, снижения гибели эмбрионов после микрохирургических операций в результате выяснения механизмов гибели клеток на начальных стадиях эмбриогенеза, и, главным образом, при замене радикальной операции введения инъекционной микропипетки в цитоплазму оплодотворяемой яйцеклетки неинвазивной процедурой (без нарушения целостности плазматической мембраны) - электрослиянием с кариопластом, содержащим пронуклеус.

Мы решили проверить возможность осуществления выработанной нами схемы, предполагающей формирование пронуклеусов в гетерологичных яйцеклетках (для которых ВЦИС эффективен) и дальнейшую их трансплантацию в виде кариопласта в яйцеклетку мыши (использована в качестве модельного объекта) с целью ее оплодотворения.

Цель исследования

Цель настоящей работы заключалась:

а) в создании эффективной микрохирургической технологии искусственного оплодотворения яйцеклеток таких видов животных, у которых вероятность повреждения яйцеклеток при ВЦИС велика;

б) в изучении возможности реализации апоптоза в ранних эмбрионах.

Основные задачи исследования.

1. Разработать специальные приспособления и методические приемы для повышения эффективности микрохирургических операций по инъекции спермиев и пересадке ядер.

2. Подобрать виды лабораторных животных, яйцеклетки которых могут быть использованы в качестве "промежуточного хозяина" для формирования пронуклеусов из спермиев мыши, для чего провести оплодотворение яйцеклеток других видов спермиями мыши.

3. Изучить возможность эффективного электрослияния гетерологичных кариопластов с яйцеклетками и зиготами мыши.

4. Провести трансплантацию мужских пронуклеусов мыши, сформированных в гетерологической яйцеклетке, в активированную яйцеклетку или зиготу с удаленным мужским пронуклеусом мыши.

5. Исследовать возможность гибели яйцеклеток и эмбрионов мышей начальных стадий развития по механизму апоптоза.

Научная новизна.

Разработан метод искусственного микрохирургического неинвазивного оплодотворения (МОН) путем электрослияния яйцеклетки с кариопластом, содержащим мужской пронуклеус, позволяющая избежать разрушения плазматической мембраны яйцеклетки.

Показано, что гибель тотипотентных бластомеров эмбрионов начальных стадий развития может проходить по механизму апоптоза.

Обнаружено, что мужские пронуклеусы, образовавшиеся в чужеродной цитоплазме, обеспечивают доимплантационное развитие эмбрионов.

Продемонстрирована возможность электрослияния клеточных мембран разных видов животных при гетерологической трансплантации ядер.

Показано, что ограниченное привнесение гетерологичной цитоплазмы из зиготы крысы в зиготу мыши не оказывает заметного воздействия на ее дальнейшее развитие.

Практическая значимость работы.

Разработана технология - микрохирургического неинвазивного оплодотворения яйцеклеток мышей, позволяющая реализовать генетическую информацию спермиев, имеющих повреждения и функциональные нарушения. Технология позволяет оплодотворять яйцеклетки таких видов животных, у которых вероятность образования пронуклеусов при ВЦИС низка, а повреждаемость яйцеклеток высока. Технология может быть адаптирована применительно к другим видам млекопитающих и наряду с ВЦИС использована для воспроизведения мутантных линий животных, страдающих нарушениями сперматогенеза, для для межвидовой гибридизации, для преодоления мужского бесплодия.

Разработан прибор для изготовления микропипеток специальной формы, обеспечивающей высокую эффективность микрохирургических операций трансплантации и микроинъекции ядер.

Разработаны технические приспособления и методические приемы, позволяющие оптимизировать проведение операций по пересадке ядер и микроинъекции спермиев: вибрационная микронасадка для прокалывания мембраны; микропульсатор предотвращающий адгезию спермия к стеклу за счет вибрации спермия внутри микропипетки при пульсациях давления инъекционного раствора; усовершенствована сама микропипетка за счет изменения формы и помещения внутрь ее микропоршня из инертного вещества.

Апробация работы.

Результаты работы были , представлены на Евроазиатском биотехнологическом симпозиуме (Анкара, 1995), Международном экологическом конгрессе (Воронеж, 1996), Совещании по консервации

генетических ресурсов (Пущино, 1996), Симпозиуме по сохранению биоразнообразия (Лондон, 1997), Международной конференции по биотехнологии и разведению животных (Киев, 1997).

Структура работы.

Диссертация состоит из трех глав, изложена на 117 стр., содержит 8 таблиц, 16 фотографий и 5 рисунков. Список литературы включает 187 наименований.

Публикации по теме диссертации.

По теме диссертации опубликовано 16 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использовали гибридных мышей СВА х C57BL/6, аутбредных NMRI, крыс "Вистар" которых получали из питомника "Светлые горы", а также хомячков золотистых и кроликов новозеландских.

Яйцеклетки мышей, крыс, хомяков и кроликов получали после гормональной стимуляции овуляции или спаривания самок с вазэктомированными самцами (Hogan, 1987; Monk, 1990). Все манипуляции с эмбрионами in vitro осуществляли в среде среде Виттена (Witten, 1981) с добавлением органического буфера Heppes. Культивировали эмбрионы в эксикаторе в стеклянных колечках, приклеенных ко дну чашек Петри в объеме среды 200 мкл. при 37°С в термостате. Активацию яйцеклеток производили 8% этанолом, критерием активации служило выделение второго направительного тельца и образование пронуклеуса (Дыбан, 1985). Трансплантацию эмбрионов мышей осуществляли в ампулу яйцевода и рог матки псевдобеременных самок (Barton, 1990). Сперму мышей выделяли из эпидидимусов и капацитировали (Rogers, 1981).

Оплодотворяли яйцеклетки микроинъекцией в ооплазму (ВЦИС) обездвиженных спермиев (Thadani, 1980). Для повреждения хвостов спермиев использовали прием активного встряхивания на wortex. Яйцеклетки крысы оплодотворяли также капацитированной спермой мышей: in vitro с удаленной при помощи 0.1% проназы блестящей оболочкой (Hanada and Chang, 1972); микроинъекцией спермиев под блестящую оболочку (ПОО) (Keefer, 1990). Состояние ядерных структур анализировали при помощи световой и люминисцентной микроскопии с использованием красителя Hoescht 33342 (Мельникова, Бочарова, 1983).

Выделение и трансплантацию пронуклеусов из яйцеклеток крысы в активированные яйцеклетки и энуклеированные (с удаленным мужским пронуклеусом) зиготы мыши выполняли по методу МакГрафа с учетом предложенных Свиридовой модификаций (McGrath, Solter, 1983; Свиридова, 1987). Слияние мембран реконструируемого эмбриона производили при помощи электрических импульсов (Zimmermann, 1982). Использовали камеру с параллельными электродами и систему подвижных торцевых электродов (Чайлахян, 1986).

Микрохирургические операции производили с использованием комплекта манипуляторов КМ-2, микрокузницы, а также разработанных нами пуллера, прибора для электрослияния и описанных (в главе результаты) приспособлений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработанные приборы, устройства и методические приемы для эффективной микрохирургии.

1.1 Прибор, обеспечивающий производство микропипеток с усовергиенствованной формой кончика (пуллер).

Согласно Кларку и Джонсону (Clarke, Johnson, 1988), форма инъекционной пипетки является наиболее важным фактором, определяющим успех ВЦИС. Наилучшие результаты достигаются при малой конусности рабочей части микропипетки. Нами разработан прибор, обеспечивающий производство двухступенчатых микропипеток с практически цилиндрической формой ступеней. Данная форма пипеток имеет несколько преимуществ: цилиндрическая форма позволяет вводить пипетку вглубь яйцеклетки без увеличения разрыва мембраны в месте пробоя; резко снижается обтекание объекта жидкостью во время его продвижения внутри микропипетки; вытеснение равных объемов раствора при сериальной инъекции можно контролировать по перемещению мениска в пределах отрезков одинаковой длины.

1.2. Устройство для прокалывания мембраны в виде микронасадки из пьезокристалла, вызывающее вибрации кончика микроинструмента;

Предложено устройство на основе свойства пьезокристалла резонансно вибрировать при подаче тока соответствующей частоты. Маленький пьезокристалл прикрепляли микрозажимом к рабочей микропипетке. Колебания резонансной частоты 200 кГц. подавали на пьезокристалл генератором частот ГС-33. Микровыключатель закрепляли на приводе пневмоманипулятора. Кратковременная подача сигнала в момент подведения микропипетки к мембране приводила к ее проколу без каких-либо затруднений.

1.3. Устройство, создающее микропульсации давления внутри микропипетки и предотвращающее адгезию спермия к стеклу.

При микроинъекции спермиев возникает постоянная проблема, связанная с прилипанием головок спермиев к стеклу внутри инъеционной пипетки. Для преодоления этого затруднения предложено устройство, вызывающее микропульсации жидкости внутри инъекционной системы. Устройство присоединяют к гибкому шлангу инъекционной системы. С его помощью осуществляют периодические сдавливания шланга с регулируемой частотой и интенсивностью. Параметры работы устройства подобраны таким образом, что микропульсации давления внутри инъекционной системы вынуждают спермий вибрировать и постоянно находиться во взвешенном состоянии.

1.4. Оптимизация наполнителей микропипеток (микропоршни).

Для проталкивания головки спермия внутри инъекционной пипетки в качестве наполнителя обычно используется ртуть (Keefer, 1989). Нами предложено использовать более удобные и нетоксичные наполнители: перфторан или микроцитопласты. Для отбора микроцитопластов в камеру помещается яйцеклетка, обработанная цитохалазином В.

Описанные устройства и методические приемы были использованы при проведении ВЦИС мышиных яйцеклеток, что позволило достичь 17% их выживаемости. Из выживших яйцеклеток у 45% образовались мужские пронуклеусы (таб.1). Для мыши это высокие показатели, поскольку мышиные яйцеклетки крайне уязвимы к введению пипетки для трансплантации непосредственно в цитоплазму. Однако, если отнести количество оплодотворившихся яйцеклеток к исходному их количеству, то мы получим 5.2%, что сравнимо с данными Рон-Еля - 4.7% (Ron-EI, 1995). Понятно, что для решения практических задач такая эффективность является низкой и, по-видимому, не может быть существенно улучшена дальнейшим совершенствованием микрохирургической аппаратуры и инструментов.

Поэтому мы решили оценить способность цитоплазмы гетерологичных, устойчивых к ВЦИС яйцеклеток к формированию пронуклеусов из спермиев мышей. Мы предположили, что такие пронуклеусы могут быть выделены и трансплантированы в виде кариопласта без фактического нарушения целостности мембран по методике МакГрафа и Солтера успешно реализованной при трансплантации гомологичных кариопластов (McGrath and Solter, 1983). Были произведены опыты для подбора видов лабораторных животных, яйцеклетки которых могут быть использованы в качестве "промежуточного хозяина" для формирования пронуклеусов из спермиев мыши.

2.1. Исследование жизнеспособности и активации яйцеклеток крысы, мыши, хомяка, кролика при проведении ВЦИС.

Проведено ВЦИС яйцеклеток мыши, кролика, крысы и хомяка спермиями мыши. Определяли их устойчивость, активацию, состояние мышиного спермия в цитоплазме. Критерием активации служило выделению второго направительного тельца и образование пронуклеусов.

Сообщения по вопросу устойчивости яйцеклеток к ВЦИС не всегда совпадают, поскольку используемые методы и навык экспериментаторов существенно влияют на исход операции. Различия приводимых данных по выживаемости ооцитов находятся в следующих пределах: мышь - 0-10 %, крыса - 20-25 %, кролик - 30-55 %, человек - 50-90 %, хомяк - 70 - 95 %. Сравнение полученных нами данных по уровню выживаемости яйцеклеток исследованных видов после ВЦИС (таб. 1) с литературными

показывает, что в нашем исследовании достигнут наилучший результат в особенности для кроликов и, в мышей (КееГег, 1990; Яоп-Е1,1995).

ТАБЛИЦА 1.

Выживаемость яйцеклеток разных видов после ВЦИС, их способность к активации и формированию пронуклеуса из спермия мыши._

Состояние яйцеклетки % состояние яд ра спермия %

вид-донор яйцеклеток выжило активировано деконденсация пронуклеусы

кролик 60 (12/20) 41 (5/12) 25 (3/12)

хомяк 78 (18/23) 77 (14/18) 21 (3/14) 78(11/14)

крыса 27 (21/78) 85 (18/21) 27(5/21) 73 (13/18)

мышь 17 (16/90) 56 (9/16) 55 (5/9) 45 (4/9)

Различия выживаемости яйцеклеток между кроликом хомячком недостоверно (р < 0.2), а между крысой и мышью - достоверно (р< 0.05).

Яйцеклетки исследованных видов в ходе манипуляций ВЦИС активируются с различной эффективностью. Крысиные яйцеклетки активировались лучше других (85%). Их активация (33%) происходила также после инъекции среды для культивирования и даже при выделении таб. 2. Вероятность активации яйцеклеток кроликов и мышей при ВЦИС ограничена, поэтому можно рекомендовать применение дополнительного активирующего стимула для яйцеклеток данных видов непосредственно перед микроинъекцией.

Деконденсация спермиев зарегистрирована в яйцеклетках всех исследованых видов, она не зависит от активации яйцеклеток. Обследование некоторых прооперированных яйцеклеток без пронуклеусов показало, что спермий может быть адгезирован с наружной стороной мембраны. Видимо, в таких случаях микропипетка не проникла в цитоплазму и инъекция была произведена во впячивание, "карман" плазматической мембраны. Очевидно, что контакт мембран гамет не обязательно приводит к их слиянию.

Формирование мужских пронуклеусов мыши, крысы и хомяка отмечено только в активированных яйцеклетках.

Несмотря на то, что выживаемость яйцеклеток крысы после ВЦИС существенно ниже чем у хомяка (27% и 78%, р<0.05), формирование пронуклеусов в выживших яйцеклетках у них происходит с одинаковой эффективностью (73% и 78%, р < 0.6). Таким образом, вероятность преобразования головки спермия в мужской лронуклеус при гетерологичном ВЦИС определяется как видовым сочетанием гамет, так и активацией яйцеклетки.

Способ подготовки спермы также существенно влияет на активацию яйцеклеток. Мы проводили ВЦИС головками спермы с преднамеренно удаленными хвостами, чтобы изучить возможность оплодотворения неподвижными спермиями. Прием встряхивания (\\от1ехт§) применен вместо распространенного метода отделения

хвостов - ультразвуковой обработки, поскольку известно, что предварительное озвучивание ухудшает результативность ВЦИС (Iritani, Hosoi, 1989; Goto, 1993).

Наши данные совпадают с выводами экспериментаторов, обнаруживших возможность гетероспецифического взаимодействия спермиев и яйцеклеток (Thadany, 1980; Naish, 1987).

Наиболее подходящим кандидатом в качестве промежуточного хозяина ("инкубатора пронуклеусов") является яйцеклетка золотистого хомячка. Она обладает важными свойствами: высокой устойчивостью к микроиньекции (78±8% выживают), способностью трансформировать спермин мышей, а также других видов в пронуклеусы. Однако, визуализация пронуклеусов при обычной микроскопии затруднена, большая жесткость мембраны и вязкость цитоплазмы также затрудняет операцию. Более доступным и удобным для исследования объектом является яйцеклетка крысы. Она обнаруживает достаточную устойчивость к микроиньекции спермия (27%) и способна преобразовывать спермий мыши в пронуклеус (активировались 85% яйцеклеток переживших операцию, сформировали нормальные пронуклеусы - 73%). Поэтому для разработки предложенной МОН технологии модельной парой яйцеклеток выбраны мышиная (отличающаяся крайней неустойчивостью к прямой микроиньекции) для оплодотворения и крысиная в качестве "инкубатора мужских пронуклеусов" (рис. 1).

Таким образом, проведение гетерологичной ВЦИС неподвижными спермиями возможно. Выживаемость яйцеклеток, их активация и способность к образованию пронуклеусов из гетерологичных спермиев различается у исследованных видов. При осуществлении гетерологичного оплодотворения путем ВЦИС возникает необходимость подбора оптимальных сочетаний видов

2.2. Сравнительная оценка оплодотворения яйцеклеток крысы мышиными спермиями.

. Для проверки возможности электрослияния гетерологичного кариопласта с яйцеклеткой, определения влияния вносимой при этом чужеродной цитоплазмы не имеет значения состояние спермы, использованной для оплодотворения. Поэтому были исследованы другие, более технически простые по сравнению с ВЦИС возможности получения пронуклеусов из спермиев мыши в крысиных зиготах.

Оплодотворение яйцеклеток крысы путем инъекции спермиев мыши под блестящую оболочку.

Проводили инъекцию под оболочку единичных подвижных спермиев (1-3) и инъекцию суспензии спермиев. Попытка оплодотворения мышиных яйцеклеток микроинъекцией единичного спермия под блестящую оболочку в наших опытах не увенчалась успехом. При ПОО супензии спермиев оплодотворилось 88 % яйцеклеток. Полиспермия

(имели более 2-х пронуклеусов) была зарегистрирована у 24 % полученных зигот (таб.2).

Оплодотворение in vitro крысиных яйцеклеток с удаленной блестящей оболочкой, спермиями мыши.

Ооциты освобождали от блестящей оболочки раствором проназы, добавляли суспензию спермы и инкубировали в течении двух часов. Формирование пронуклеусов наблюдали через 6-8 часов инкубирования. В наших условиях оплодотворялось 77 % ооцитов, из которых у 24 % наблюдалось более двух пронуклеусов (таб. 2).

ТАБЛИЦА 2

Эффективность вспомогательного оплодотворения яйцеклеток крысы спермиями мыши.

Состояние яйцеклеток через 12 ч. культивирования.

Условия эксперимента неоплодотворенные, неактивнрованные, разрушившиеся (%) 1-2 пронуклеуса 2-е направительное тельце (%) более 2-х пронуклеусов (%)

внутрицнтоплаз-матическая инъекция спермия мыши 77 (60/78) 17 (13/78) 0(0/78)

введение единичных спермиев поя блестящую оболочку 100(14/14) 0(0/14) 0 (0/14)

инъекция суспензии спермиев под блестящую оболочку 12 (3/25) 64 (16/25) 24 (6/25)

оплодотворение in vitro без блестящей оболочки 22(10/45) 53(24/45) 24(11/45)

Инъекция суспензии спермиев под блестящую оболочку ооцитов является более эффективной чем ВЦИС, поскольку она производится без повреждения клеточной мембраны и для неё используются подвижные спермии. Как было отмечено введение под блестящую оболочку 1-3 спермиев не привело к оплодотворению. Это обстоятельство указывает, что в популяции мышиных спермиев, подвергнутых капацитации, далеко не все имеют необходимый для слияния с мембраной статус.

Крысиные ооциты, лишённые блестящей оболочки, оплодотворяются мышиными спермиями (Hanada and Chang, 1972). В нашем исследовании оплодотворилось 78% ооцитов от общего их числа. К недостаткам оплодотворения in vitro и ВЦИС при гомологичном оплодотворении относят повышенную частоту полиспермного оплодотворения. Для данной задачи это обстоятельство является преимуществом, поскольку позволяет каждый из удаляемых пронуклеусов использовать для дальнейшей трансплантации.

МИКРОХИРУРГИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ НЕИНВАЗИВНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ (МОН)

Схема микрохирургического оплодотворения мышиной яйцеклетки неподвижным спермием с использованием гетерологичной яйцеклетки крысы в качестве временного «хозяина»-«инкубатора пронуклеуса»

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МИКРОХИРУРГИЧЕСКИХ ОПЕРАЦИЙ ПРИ ОСУЩЕСТВЛЕНИИ МОП

ИНЪЕКЦИЯ СПЕРМИЯ МЫШИ В ЯЙЦЕКЛЕТКУ КРЫСЫ

ВВЕДЕНИЕ ПРО НУКЛЕУСА В ЯЙЦЕКЛЕТКУ МЫШИ

п

V

АКТИВАЦИЯ ЯЙЦЕКЛЕТКИ, ОБРАЗОВАНИЕ ПРОНУКЛЕУСОВ

ЭЛЕКТРОСЛИЯНИЕ

пт

VI

ИЗЪЯТИЕ МУЖСКОГО ПРОКУКЛЕУСА

РАЗВИТИЕ МЫШИНОГО ЭМБРИОНА

Рис. 2

В наших опытах эффективность ПОО и оплодотворения in vitro оказалась сравнимой (различия недостоверны, р<0.4) и гораздо более высокой чем ВЦИС, при помощи которого показана принципиальная возможность использования неподвижных спермиев. Поэтому для отработки процедуры трансплантации пронуклеусов и определения потенции реконструированных зигот к развитию использовали наиболее простую процедуру оплодотворения - in vitro.

2.3. Электрослияние гомологичных и гетерологичных кариопластов.

При отработке режимов электрослияния исследовали следующие сочетания клеток и их элементов: бластомеры мышиных эмбрионов 2-х клеточной стадии, мышиные кариопласты с мышиными зиготами, крысиные цитопласты с мышиными зиготами и крысиные кариопласты с активированными мышиными яйцеклетками.

Оптимальной для слияния оказалась длительность импульса 40 микросекунд. Эффективность слияния увеличивалась при подаче двух импульсов с интервалом 3 секунды. Что касается амплитуды сливающего импульса (напряженности поля), то для разных объектов ее эффективные значения варьировали. Для слияния бластомеров 2-х клеточных эмбрионов нами подобрана напряженность поля 200 V/см (эффективность слияния 81% (9/11)), для сочетанйя крысино-мышиных элементов клеток -250 V/см, для мышиных - 350 V/см. Необходимо отметить, что слияние наблюдается при амплитудах импульса близких к вызывающим разрушение бластомеров или (чаще) кариопластов. Крысиные кариопласты оказались более чувствительными к амплитуде импульса по сравнению с мышиными. Это приводило к необходимости при электрослиянии крысино-мышиных сочетаний использовать стимулы предельные для выживаемости крысиных кариопластов, еще не вызывающие эффективного микропробоя мембраны реципиентной мышиной клетки. При этом возникала необходимость в повторных электростимуляциях. Уменьшение напряженности поля при электрослиянии крысино-мышиных сочетаний уменьшало выход слившихся клеток (р<0.01) до 33 % (18/58) против 75 % (12/16) для мышиных кариопластов при однократном воздействии импульса. Слияние происходило обычно за 5-20 мин. Различие по чувствительности к амплитуде сливающего импульса у реконструированных мышиных зигот и бластомеров 2-х клеточных эмбрионов (р<0.7) может быть обусловлено формой объектов, мембранными характеристиками, предварительной обработкой зигот цитохалазином В. Различие между крысиными и мышиными кариопластами по всей видимости заложены в свойствах их плазматических мембран.

ТАБЛИЦА 3

(приводится сокращенно, отражены результаты для оптимальных режимов). Результаты электрослияния в камере с параллельными электродами.________

Объект Кол-во импульсов Длина импульса (мкс) Амплитуда импульса (V) Результат (п=) + 0 -

двух клеточные эмбрионы 2 40 20 9 1 1

мышиные кариопласт-иитопласт 2 40 35 12 3 1

гетерологичные кариопласт-цитопласт 2-4 40 25 18 28 12

количество клеток: "+" - слившиеся, "О" - без изменений,

"-" разрушившиеся.

Таким образом, электрослияние мембран зигот разных видов -мыши и крысы возможно несмотря на разную чувствительность мембран зигот данных видов к интенсивности сливающего импульса и разные оптимальные для слияния значения амплитуды. Процедура электрослияния не является ограничением для реконструкции гетерологичной мышиной зиготы, что позволяет перейти к изучению дальнейших этапов технологии, и в первую очередь, последствий для развития мышиной зиготы при введении части гетерологичной цитоплазмы.

2.4. Влияние гетерологичной цитоплазмы на развитие реконструированной зиготы мыши.

При пересадке пронуклеусов с использованием электрослияния вместе с пронуклеусом в составе кариопласта переносится минимальный объем цитоплазмы. Для выяснения вопроса, влияет ли на дальнейшее развитие зиготы присутствие цитоплазмы гетерологичного вида, цитопласты крыс были слиты с зиготами мышей. Размеры цитопластов соответсвовали пронуклеусу (диаметр 10 мкм.) и кариопласту (30 мкм.). Из одной зиготы, лишенной блестящей оболочки, получали несколько цитопластов. В качестве контроля культивировали мышиную зиготу, подвергавшуюся воздействию 4-х электрических импульсов в режиме электрослияния. Результаты культивирования приведены в таблице 4.

ТАБЛИЦА 4

Развитие эмбрионов мыши после введения электрослиянием в зиготу мыши крысиного цитопласта Культивирование в течение 96 часов (%)■_

Диаметр цитопласта зигота 2-х 4-х морула бласто-циста

15 (3/20) 20 (4/20) 65 (13/20)

25-30 мкм 5 (1/19) 47 (9/19) 32(6/19)- 16 (3/19) -

10-15 мкм 13 (4/31) 19 (6/31) 6(2/31) 16(5/31) 46(14/31)

При введении большого цитопласта (диаметром 25-30 микрон) мышиный эмбрион, как правило, развивался до 2-4х клеточной стадии, после чего наблюдалась экструзия одного из блгстомеров или деление с образованием бластомеров разного размера. Введение меньшего количества гетерологичной цитоплазмы крысы не препятствовало развитию эмбрионов до стадии бластоцисты. Однако, 56 % эмбрионов остановилось на промежуточных стадиях развития. Остановка развития отмечена также и у 25% контрольных эмбрионов. Остановившиеся эмбрионы не имели внешних признаков нарушений и сохраняли жизнеспособность (мембраны непроницаемы для трипанового синего) в течении многих часов. Введение дополнительной цитоплазмы уменьшает ядерно-цитоплазменное соотношение . По некоторым данным, изменение этого соотношения может влиять на скорость дробления, время образования бластоцели, количество успешно развивающихся эмбрионов (Евсиков, 1992; гакЪаЛсЬепко, 1997).

Таким образом отмечено некоторое угнетающее (на 19%, р<0.2) влияние гетерологичной цитоплазмы на развитие мышиного эмбриона вызывающее задержку, остановку и патологию развития. Неблагоприятное влияние увеличивалось пропорционально объему вводимой гетерологичной цитоплазмы. Следовательно, количество цитоплазмы в составе кариопласта при выделении пронуклеуса должно быть минимальным. Часть модифицированных эмбрионов после электрослияния была трансплантирована псевдобеременным самкам. В результате трансплантации одинадцати эмбрионов двум самкам родилось четыре мышонка. Этот результат показывает, что последствия введения гетерологичной цитоплазмы не являются критичными также и в период постимплантационного развития эмбриона.

Сам по себе метод трансплантации гетерологичной цитоплазмы может служить инструментом для изучения феномена ооплазматической сегрегации, вопросов цитоплазматической регуляции экспрессии генов, передачи дополнительных свойств, кодируемых внеядерной наследственностью.

2.5. Эффективность развития реконструированных зародышей мыши после трансплантации мужского пронуклеуса в активированную яйцеклетку и в энуклеированную (удален мужской пронуклеус) зиготу.

Способность мышиного пронуклеуса, сформированного в зиготе крысы, поддерживать нормальное развитие мышиного эмбриона, оценивали по результатам культивирования реконструированных зародышей. Использовали два типа реципиентов кариопластов. Мужской пронуклеус трансплантировали в активированные мышиные яйцеклетки или в энуклеированные зиготы.

Пронуклеусы в зиготах крысы можно наблюдать через 6-8 часов после оплодотворения. Мужские пронуклеусы выделяли и кариопласты сливали с активированными яйцеклетками или энуклеированными зиготами мыши, обработанными цитохалазином В. Если оплодотворение было полиспермным, то отбирали для пересадок два-три наиболее развитых пронуклеуса.

Культивирование реконструированных эмбрионов показало, что пронуклеусы, сформированные из спермиев мыши в зиготах крысы, способны поддерживать развитие эмбриона до стадии бластоцисты. Тот факт, что пронуклеус, образовавшийся в зиготе крысы, обеспечивает развитие реконструированной зиготы мыши, предполагает существование аналогичного механизма трансформации спермия в пронуклеус у исследованных видов. Развивается до стадии бластоцисты больше эмбрионов, реконструированных из энуклеированных зигот чем из активированных яйцеклеток(48±7% и 30±6% соответственно, р<0.1, таб. 5). Более высокая эффективность операции при использовании энуклеированных зигот по видимому связана с более адекватным соотношением фаз клеточного цикла донора и реципиента, значение чего подчеркивалось неоднократно (Ри1ка, 1996). В исследованиях по трансплантации ядер показано, что использование яйцеклеток в качестве реципиентов ядер вместо энуклеированных зигот, позволяет улучшить развитие реконструированных эмбрионов (\VHmut е1 а1, 1997). По видимому репрограммнрование ядер продвинутых эмбриональных стадий лучше осуществляется в яйцеклетках, а при трансплантации пронуклеусов большее значение имеет наличие синхронности клеточных циклов донора-реципиента.

ТАБЛИЦА 5

Развитие реконструированных мышиных зигот in vitro, культивирование в течении 96 часов (%)■ ______

клетка-реципиент кол-во зигот некроз зигота 2 кл. 4 кл. мо-рула бласто-циста

зиготы контроль 30 13 17 70

активированные яйцеклетки 44 16 И 16 9 18 30

энуклеированные зиготы (удален мужской пронуклеус) 46 6 9 19 7 11 48

Таким образом, при "оплодотворении" мышиной яйцеклетки путем ее предварительной активации и слияния с мужским пронуклеусом удается достигнуть развития до стадии бластоцисты у 30 % реконструированных зигот. В то же время, при оплодотворении мышиных яйцеклеток методом ВЦИС, развитие пронуклеусов наблюдалось только у 5 % (4/90) из них. Более высокая эффективность развития до стадии

бластоцисты после замены пронуклеусов (48%) позволяет надеяться на дальней

шую оптимизацию методов при более тщательной синхронизации клеточных циклов кариопласта и цитоплазмы реципиента, но другим направлением возможной оптимизации методов является выяснение причин остановки развития жизнеспособных реконструированных эмбрионов и поиск путей их преодоления.

Результаты экспериментов подтверждают возможность осуществления предложенной нами схемы искусственного оплодотворения как методом электрослияния активированной яйцеклетки с кариопластом, содержащим пронуклеус, так и заменой существующего пронуклеуса, что позволяет представить предварительную схему в качестве технологии (микрохирургического оплодотворения неинвазивного, МОН) для практического осуществления. МОН позволяет реализовать генетическую информацию спермиев с повреждениями и функциональными нарушениями и может быть адаптирована применительно к другим видам млекопитающих.

3. Исследование доимплантациояной гибели эмбрионов.

В наших опытах после микрохирургических операций на разных стадиях развития останавливается до 50% эмбрионов таб. 4, 5. и мы провели подробное исследование состояния таких эмбрионов

Считается, что в тотипотентных бластомерах ранних эмбрионов реализация программируемой клеточной гибели принципиально невозможна, а гибель таких клеток может наступать только в результате грубых нарушений целостности клеточной мембраны по механизму некроза (Rosenberger, 1995). Предметом исследования были эмбрионы, не прошедшие соответствующего числа делений дробления или не дробившиеся вообще. Мы предположили, что прекратившие развитие эмбрионы гибнут по апоптозному пути. Изучали состояние клеточных мембран, клеточных ядер и ДНК на стадиях 2-х, 4-х, 8-ми клеток и морулы на предмет наличия признаков апоптоза. Полученные нами данные указывают на возможность гибели тотипотентных эмбриональных клеток по типу апоптоза.

Во-первых, на поверхности бластомеров остановившихся в развитии эмбрионов обнаруживались прозрачные пузырьки или их цепочки, отрывавшиеся впоследствии от клеток Такая трансформация поверхности и распадание клеток (blebing), типична для апоптоза (Hinchliffe, 1981).

Во-вторых, наблюдали ряд характерных изменений ядер, являющихся важнейшим морфологическим признаком апоптоза (Мосин и др., 1997; Vaux, Strasser, 1996). Нам удалось выделить следующие стадии трансформации ядер: конденсация хроматина в виде образования нескольких грубых глыбок (1), образование так называемых

"хроматиновых бус" (2), уплотнение конденсированных участков с образованием одной или нескольких компактных сфер (кариорексис), а затем эксцентричное смещение хроматина (3), фрагментация ядер (4), сильное сжатие ядер с образованием плотных пикноморфных ядер (5), сближение ядерных фрагментов с наружной мембраной и экзоцитоз части клетки (6) вместе с фрагментом ядра (апоптозные тельца).

В-третьих, характерная для апоптоза фрагментация самой ДНК обнаружена нами при проведении электрофореза отдельных бластомеров из прекративших развиваться 4-х и 8-ми клеточных эмбрионов (Haza et al, 1996).

У остановившихся в развитии на стадии 2-х, 4-х и 8-ми клеток эмбрионов признаки нарушения проницаемости наружной мембраны появлялись через - 70-96, 36-48 и 30 часов соответственно, что на 20-30 часов позже, чем описанные выше морфологические изменения ядер. Такая динамика патологических изменений бластомеров позволяет определить тип гибели эмбриональных клеток как апоптоз. Именно при апоптозе, в отличие от некроза, ядерная фрагментация предшествует нарушению проницаемости клеточной мембраны (Sen, 1992).

Фрагментация ядер на изученных нами стадиях имеет различный характер. Мы не зарегистрировали четкой фрагментации на двухклеточной стадии. В редких случаях наблюдался "разброс" хроматина. На четырехклеточной стадии мы регистрировали фрагментацию в виде 3-4х крупных .субъединиц в 30% случаев. В 95% проанализированных нами бластомеров восьмиклеточной стадии наблюдалась множественная фрагментация с разбросанным ядерным материалом по всей цитоплазме.

Нас интересовал вопрос, связан ли запуск и развитие апоптоза с активностью специфических генов. Культивирование эмбрионов в среде с актиномицином D (1-4 10"6) показало, что блокада синтеза РНК не только не препятствует апоптозу, но, напротив, делает его неотвратимым. Все культивировавшиеся в среде с актиномицином D 2-х клеточные (20), 4-х клеточные (30) или 8-ми клеточные эмбрионы (20) прекращали дробиться и имели ядра с признаками апоптоза. Очевидно, программа осуществляется а счет предсуществующих белков, полученных эмбрионом от яйцеклетки.

Составлена "диагностическая карта" развития патологии ядра во времени на основании определения сроков наступления соответствующих стадий (табл. 6).

Длительность переживания прекративших дробление эмбрионов зависит от стадии, на которой произошел блок развития (табл. 7). Мы определяли период от остановки развития до начала прокрашивания бластомеров трипановым синим. Скорость развития апоптоза увеличивается по ходу эмбриогенеза. Дольше всего, до 96 часов, (в среднем 70) не погибают 2-х клеточные зародыши, 4 -х - до 48, 8-ми - до

33. Более быстрая гибель 4-х и 8-ми клеточных зародышей не связана с активацией синтетических процессов, что подтверждается опытами с актиномицином О. Продолжительность и морфологические характеристики гибели бластомеров морул сравнимы с таковыми для бластомеров восьмиклеточных зародышей.

ТАБЛИЦА 6

Длительность блока развития 2-х клеточных эмбрионов . до регистрации соответствующих стадий нарушения морфологии ядер.

Стадии трансформации ядер 1 2 3 4 5 6

количество исследованных эмбрионов 8 26 34 34 28 19

Время развития процесса, час. 12± 2.7 16.3± 3.1 27.3+ 2.3 30.6± 1.5 45.5± 1.2 67.5± 4.6

Таблица 7 Время от остановки развития эмбриона до разрушения мембраны бластомеров

Стадия развития эмбриона 2-х клеточный 4-х клеточный 8-ми клеточный

Количество бластомеров 20 19 20

Время развития процесса, час. 69.8±4.6 47.7+1.2 33.4±1.4

Различие по продолжительности переживания для бластомеров 2-х, 4-х и 8-ми-клеточной стадии развития статистически достоверно, р<0.05.

Развитие апоптоза в бластомерах эмбриона происходит, как правило, не синхронно. Мы регистрировали разные стадии трансформации ядер бластомеров в одном эмбрионе. Не одновременно происходит и гибель бластомеров в эмбрионе. Асинхронность возрастает на более продвинутых стадиях развития. Возможно, что скорость апоптоза зависит не только от стадии развития эмбриона, но и от фаз клеточного цикла бластомеров, в момент остановки развития. Наш вывод согласуется с данными Секириной (Секирина, 1997) показавшей, что время переживания двухклеточного эмбриона в культуре зависит от фазы клеточного цикла, на которой развитие было заторможено. Известно, что бластомеры в пределах эмбриона могут находиться на разных фазах клеточного цикла (Дыбан, 1988). Полученные нами данные согласуются с гипотезой о возможном участии в программе реализации апоптоза факторов регуляции клеточного цикла (King, 1995).

По-видимому уже на ранних, стадиях в эмбрионе происходит транскрипция факторов роста и рецепторов к ним, поскольку подавление транскрипции актиномицином D обуславливает развитие апоптоза.

Известно, что на доимплантацнонных стадиях развития погибает существенно больше эмбрионов млекопитающих, чем после имплантации в матку (Столина, Соломко, 1996).

Апоптоз очевидно играет ключевую роль в доимплантационном отборе жизнеспособных эмбрионов. Развитие эмбриона прерывается наиболее безопасным способом для организма матери.

Как многостадийный процесс апоптоз имеет много точек и способов регуляции (Новожилова, 1996). Подавление апоптоза при манипуляциях с эмбрионами позволит существенно уменьшить гибель зародышей на начальных этапах эмбриогенеза.

ВЫВОДЫ

•Разработана технология микрохирургического неинвазивного оплодотворения (МОН) путем электрослияния яйцеклетки с гетерологичным кариопластом, содержащим мужской пронуклеус. Она позволяет избежать нарушения целостности плазматической мембраны яйцеклетки. Технология позволяет реализовать генетическую информацию спермиев, имеющих повреждения и функциональные нарушения, в т.ч. достигать эффективного оплодотворения животных, у которых при ВЦИС повреждаемость яйцеклеток высока.

•Показано, что имеет место апоптозная гибель тотипотентных бластомеров эмбрионов начальных стадий развития.

•Обнаружено, что мужские пронуклеусы, образовавшиеся в чужеродной цитоплазме, обеспечивают доимплантационное развитие эмбрионов своего вида.

•Продемонстрирована возможность электрослияния мембран эмбрионов разных видов животных при гетерологической трансплантации ядер.

•Показано, что возможно развитие мышиного зародыша после ограниченного привнесения в зиготу гетерологичной цитоплазмы из зиготы крысы.

•Разработан прибор для изготовления микропипеток специальной формы, обеспечивающей высокую эффективность микрохирургических операций по трансплантации и микроинъекции.

•Разработаны технические приспособления и методические приемы, позволяющие оптимизировать проведение операций по пересадке ядер, микроинъекции спермиев: вибрационная микронасадка для прокалывания мембраны; микропульсатор предотвращающий адгезию спермия к стеклу за счет вибрации спермия внутри микропипетки при пульсациях давления инъекционного раствора; усовершенствована сама микропипетка за счет изменения формы и помещения внутрь ее микропоршня из инертного вещества.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.Галаг, В.В.Мадисон, Л.В.Мадисон Пересадка половинок эмбрионов скота//3оотехния 1991. N 4, С 57-58.

2.В.В.Галат, Л.М.Межевикина, Л.М,Чайлахян Микрохирургические подходы к разделению эмбрионов млекопитающих на ранних стадиях развития/ЛДитология 1994. Т.36. N 6, С 519.

3.Zacharchenko V.A., Galat V.V. Obeline gene as a reporter in living mammalian cells/./Intemational Conference, Borovsk, Russia 1995. P. 17.

4.Межевикина Л.М., Попов В.И., Галат B.B., Чайлахян Л.М//Изменение ультраструктуры яйцеклеток морского, ежа при действии диметилсульфоксида. Докл. РАН. 1995, Т. 344, N 3. С. 417-420.

5.Mezhevikina L.M., Galat V.V.,Sacharova N.Yu., Zhdanov R.I.,Fedchenko V.I. Embryo freezing as a way of prolonged concervation of animals//International Ecologycal Congress. Voronezh, Russia. 1996. P. 125.

ô.Galat V.V., Mezhevikina L.M., Zoubin M.N., Zhdanov R.I., Problems of resuscitation of animals fr jm their genomes concerved//International Ecologycal Congress. Voronezh, Russia. 1996. P. 105.

7.Богданенко E.B., Свиридов Ю.В., Галат B.B. Сравнительный анализ и поиск новых методов искуственного оплодотворения мышей//Материалы конференции. Пущино. 1996. С. 17.

8.Галат В.В., Межевикина Л.М., Храмов Р.Н., Чайлахян Л.М. Воздействие ряда физико-химических факторов на ранние зародыши морского ежа//Материалы рабочего совещания. Консервация генетических ресурсов. Пущино. 1996. С. 120.

9.Галат В.В., Зубин М.Н., Чайлахян Л.М. Реконструкция эмбрионов в проблематике восстановления и поддержания разнообразия/Материалы рабочего совещания. Консервация генетических ресурсов. Пущино. 1996. С. 63.

Ю.Галат В.В., Шишова Н.В., Мосягин И.А. Микрохирургическая технология оплодотворения нефертильными спермиями. Городская конференция молодых ученных. Пущино. 1997. С. 98.

11 .Галат В.В., Бочарова Л.С., Белецкий И.П., Чайлахян Л.М. Апоптоз как форма гибели тотипотентных клеток ранних зародышей мышей//Докл. РАН, 1997, Т. 356, N 5. С. 690-692.

12.Галат В.В., Прокофьев М.И., Межевикина Л.М. Технология неинвазивного микрохирургического оплодотворения//Материалы международной конференции по биотехнологии и разведению животных, ДНК -технологии. Киев. Аграрная наука. 1997. С. 17-18.

13.Галат В.В. Методы микроинъекции спермиев как инструмент вспомагательной репродукции и изучения биологии оплодотворения//Онтогенез. В печати.

И.Галат В.В., Зубин М.Н., Межевикина Л.М., Лепихов К.А., Храмов Р.Н., Чайлахян Л.М. Сравнительное изучение влияния волн миллиметрового диапазона на развитие эмбрионов мышей и морских ежей//Биофизика. В печати.

15.Galat V.V., Mezhevikina L.M., Chailachhyan L.M.'A.Ahmet. Realization of genetic information by microsergensy methods. Caradeniz Jornal of Medical Science. In press.

16.Galat V.V., Prokophjev M.I. Intracytoplasmic sperm microinjection for realization genetic information of cryopreserved sperm//Cryoletters. In press.