Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оплодотворящая способность спермы быков in vitro

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Оплодотворящая способность спермы быков in vitro"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

■ '-:---

р Г Б ' " На правах рукописи

- 5 УД" УДК 636.2.034.577.21

БАБУШКИНА Ирина Аверкиевна

ОПЛОДОТВОРЯЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ СПЕРМЫ БЫКОВ IN VITRO

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

Работа выполнена в лаборатории культионрооання эмбрионов Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных, Санкт-Петербург.

Научные руководители — доктор сельскохозяйственных наук, профессор Б. П. Завертяев, доктор биологических наук Б. Е. Свиридов.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор Б. И. Протасов, кандидат биологических наук А. Д. Комиссаренко.

Ведущая организация — Санкт-Петербургская Государственная Академия ветеринарной медицины.

Защита состоится ^ЛАО-Л/ 1995 г ц /3 часов на

заседании Специализированного совета Д 020.07.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, Санкт-Петербург, Московское шоссе, д. 55-А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан <Р-^ »^©¿-^¿и^Х 1995 г

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных

наук, профессор Ж. Г. Логинов

1. сбг.ая /;а?акте?/:с7>хл работы

1 Л. Актуальности tcyh. Биология раззиткя :«екопитзкш;их имоет вэ-кксэ энгчанло з хетотнсводстзе, что позволяет решать ряд лрахткчгсюэс зэдзч, в гераую очередь в воспроизводстве и со>-.$Х!£21 ее-^кохозяйствеяикх ытбстных. В настоящее время методы :с;'»с:сонсорва1^с: сперхатозоидоз и эмбрионов, искусственное осеменение и трансплантация эмбрионов широко используются для rer.OTK'iGCXOrO улуЧ^еЖЯ город и повышения плодовитости жпьотлкх. В рэзз7.7ъ;х странах искусственное осеменение и трансплантат^ з.убрионэз стал;: Знотехнологической базой селекционных програж; в хэлочком скотоводстве.

Усгэеко развивается важный раздел генетики - генетика размножения, изучгк^ий особенности нормирования гамет, оплодотворения и ранних стадий развития эмбрионов.

Б конце 50-х годов были разработаны условия культивирования ооцитов, оплодотворения и раннего развития эмбрионов. Это позволило приступить к детальному изучению взаимодействия сперматозоидов с ооцитами млекопитающих.

Методы созревания, оплодотворения и развития in vitro эмбрионов сельскохозяйственных животных открыли широкие возможности для детального изучения процессов раннего развития, а также практического использования раннее недоступного пула ооцкгов. Из яичников убитых животных были выделены яйцеклетки, после оплодотворения которых получены эмбрионы овец, коров, свиней. Очевидно, в будущем эта технология будет использована как дешевый источник эмбрионов для получения клонированных и трансгенных животных.

При культивировании эмбрионов in vitro детально изучают ' клеточные циклы в течение раннего развития, синтез ДНК, РНК и белка, так как развитие in vitro позволяет проводить различные манипуляции с эмбрионами (Эрнст'и др., 1992).'

В биотехнологии • оплодотворения ооцитов имеется ряд нерешенных задач. Одна из них - капацитация сперматозоидов и оценка оплодотворяющей способности спермы быков в условиях in vitro, разработка методов оценки сперматозоидов при капацитации и оплодотворении ооцитов коров in vitro в настоящее время чрезвычайно актуальна.

Проблема капацитации сперматозоидов и ошюдотворонио ооцитов коров in vitro посвящено большое количество работ. При этом получены противоречивые результаты. Зто и определило необходимость проведения настоящей работы.

1.2. Цель и задачи последовакмя. Целью исследования являлось изучение особенностей оплодотворяющей способности спермы быков

in vitro.

В соответствшш с поставленной келью решались следущие задачи : . •

- изучить 'влияние разных концентраций гепарина на изменчивость характера даижения сперматозоидов, их агрегации и • приобретение способности к оплодотворению ;

- сравнить характер изменении криоконсервированных и натиз-ных сшрматозоидов быков при индуцировании капацитации in vitro, определить характер даижения, ■ агрегации сперматозоидов разных быков в процессе капацитации ;

- установить значение вращения ооцит-кумулюсного комплекса при капацитации сперматозоидов ;

- исследовать влияние спермы разных быков на изменчивость оплодотворения яйцеклеток и дробления зигот ;

- провести гетеросйермное осеменений ооцитов in vitro ;

- дать цитоморзюлогическую оценку оплодотворенных m vitro яйцеклеток и ранних эмбрионов. ;

1.3.Научная новизна. Впервые изучена динамика изменения . характера движения сшрматозоидов быков и их агрегация при ' капацитации с использованием гепарина. Установлена изменчивость параметров капацитации при использовании спермы разных быков. Выявлена высокая вариабельность параметров оплодотворения ооцитов и дробления зигот, вызванная использованием спермы разных . быков. Установлена корреляция между оплодотворяющей способностью спермы . быков и ранними стадиями дробления эмбрионов. Дана цитоморфологическая характеристика оплодотворенным in vitro яйцеклеткам и эмбрионам.

1.4.Практическая значимость работы, разработанные 'способы оценки капацитации и оплодотворяющей способности спермы быков могут быть использованы в лабораториях, разрабатывающих проблему оплодотворения in vitro ооцитов млекопитающих. Результаты могут, 'быть также использованы при чтении курсов генетики, биотехноло-

2 ' •

гии и разведения сельскохозяйственных животных.

1.5.Апробация работы. Материалы диссертации демонстрировались или докладывались: на Международном симпозиуме по молекулярной генетике и биотехнологии в оценка и изменении геномов сельскохозяйственных животных (Санкт-Петербург, 1994), на i-й Международной научной конференции молодых учёных и специалистов (Киев, 1994), на яи Региональной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов (Оренбург, 1994), на отчётных сессиях аспирантов ВНИИГРЖ (1992-1993 гг.).

1.6.Публикации. . По теме диссертации опубликовано четыре работы.

1.7.Объем и структура диссертации. Диссертация состоит, из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исслёдований, обсуждения, выводов и предложений, списка использованной литературы, включающэго 180 источников, в том числе 123 иностранных. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков, 14 таблиц.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом для исследований явились ооциты, выделенные из антральных Фолликулов (2-6 мм) яичников убитых на мясокомбинате коров.

Яичники, отобранные для исследований, промывали в Физиологическом растворе (0,8555 Nací ) с антибиотиками (стрептомицин - 50 мкг/мл, пенициллин - 100 ЕДти).

Ооциты извлекали из яичников путем надреза Фолликулов диаметром 2-6 т.

Выделанные'ооциты промывали средой ТСМ-199 на растворе Эрла с добавлением Ъ% Фетальноя сыворотки крови крупного рогатого скота и гентомицина (40 мкг^мл)..

Морфологическую оценку ооцитов осуществляли под микроскопом МБС-9. Для культивирования отбирали только ' ооциты с гомогенной цитоплазмой и окруженные не менее 4-5 слоями кумулюсных клеток.

Культивирование ооцитов осуществляли в покрытых минеральным маслом каплях (200 та) среда ICM-189 на раствора Хзнкса (eibco) с добавлением пирувата Na (2мМ), лактата Ca (2,92 мМ), бикарбоната Na (33,9 мМ), Нерез (4,43 ММ), ФСГ (10 МКГ/МЛ, Schering), эстрадиола - 17 а (1 мкг/мл, sigma), гентомицина (40 мкг>-мл) и 20%

' • " 3

астральной сыворотки (Berg and Brem, 1989). В КЭЖДУЮ КЭПЛЮ помещали 15-20 оовдтов. Культивировали при температуре ■ - 39°С, 100Ж влажности, в присутствии Ъ% С02 в воздухе, в течение 24 часов.

Для исследований процесса капащтгации и оплодотворения яйцеклеток использовали нативную и криоконсервированную сперму- быков ПО "Ленинградское".

Капацигацию сперматозоидов осуществляли по методу Parrish (Parrish et al. . 1988) В Среде TALP И В МОДИФИЦИрОВаННОЙ СреДЭ В WW ' (Biggers et ai.. 1971) с добавлением гепарина (10-200 ЕД^МЛ,

Ser va ) .

Оценку характера движения сперматозоидов при капащтгации проводили согласно методике Tateno, míkamo (1987). Сперматозоиды после оттаивания двигаются прямолинейно-поступательно. В процессе капащтгации сперматозоиды приобретают "гиперактивнов" движение, характеризуемся усилением скорости движения .(íanagimachi , 1981)." Затем "гиперакггивное" движение сменяется поступательным замедленным, Б конце процесса капациггации два и более сперматозоида агрегируют головками.

Оплодотворение яйцеклеток осуществляли в каплях (200 мкл) среда модифицированной Тиродэ (Bavister. 1977), под минеральным маслом. В каждую каплю помещали по 50 мкл спермы (концентрация сперматозоидов 1-1,5 х 106 на мл) и 5-10 яйцеклеток.

Инкубацию яйцеклеток со ,сперматозоидами проводили ' при • температуре 39°0, в присутствии Ь% С02в воздухе, 100% влажности, в течение 5-48 часов (в зависимости от задач эксперимента).

Исследования по прикреплению сперматозоидов к блестящая оболочке яйцеклетки, проникновению сперматозоида в перивителлино-вое пространство, наличию второго полярного тельца проводили .под микроскопом. МБИ-15 (увеличение 10 х 10).

Культивирование ранних эмбрионов . до стадии морулы осуществляли на монослое клеток кумулюса. Эмбрионы переносили в среду созревания, где ранее ^культивировались ооциты, на образовавшийся в результате инкубации в течение .48 часов монослоа клеток кумулюса. Часть эмбрионов культивировали в каплях (200 мкл) среды МПМ с добавлением 20% астральной сыворотки и гентомивдна (40 мкг'мл). Газовая среда : 556 С02, 535 0, и 9035 n,j при 10056 влажности- Температура культивирования - 39 0, . ' ' ■ 4

Для исследования стадий развития эмбрионов готовили тотальные препараты, окрашивали по Романовскому (Азур-Эозином) и ацото-орсеином.

Статистическую обработку полученных данных проводим с использованием общепринятых биометрических методов (Лакин, 1980).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ хсащцовАклк 3.1. Характер движения сперматозоидов быков при воздействии гепарина

В оплодотворении in vitro ооцитоз крупного рогатого скота при • использовании спермы разных быков отмечается высокая степень вариабельности оплодотворяющей способности спермы (Brackets et al. . 1883; Sirard et al. . 1985; Parrish et. al. . 1988. 1988). He исключено, что это обусловлено особенностями в изменении физико-химических свойств мембранных структур сперматозоидов в процессе капацигации. При капацитации происходят как структурные, так и Функциональные изменения, способствующие проникновению сперматозоидов в ооциг. Функциональным показателем процесса капацитации является изменение в характере движения сперматозоидов.

Для оценки параметров характера движения сперматозоидов нами использовались критерии : прямолинейно-поступательное движение, "гагорактивное", поступательное замедленное и колебательное.

В табл. 1 представлены данные по изменение характера движения сперматозоидов быков в процессе капацитации при использовании различных концентраций гепарина.

Видаю, что нативные сперматозоиды в среде капацигации без гепарина -совершают прямолинейно-поступательное движение в течение 240 минут. При этом "гиперактивного" и поступательного замедленного движений не отмечается.

При добавлении в среду капацигации ; гепарина в концентрации 10 ЕД^-мл нативные сперматозоиды совершают в течение 90 минут прямолинейно-поступательное движение, затем переходят к "гкгаракгивному", которое продолжается в' течение 180 минут. Постепенно "гиперактиэное" движение сперматозоидов прекращается и Наблюдается поступательное . замедленное. При увеличении концентрации гепарина до 200 ВД-чм время . прямолинейно-поступательного движения нативных сперматозоидов сокращается в 5 раз; время "гиперактивного" движения составляет всего 55 минут, в то

■". ' 5

Таблица 1

Характеристика двигекия сперматозоидов при воздействии гепарина

(x+Sx)

Характер Время явигения сперкатозондов при концентрации гепаркйа, кин

Квинения 0 ЕД/кл 10 ЕД/кл 50 ЕД/ил 100 ЕД/нл 200 ЕД/кл

не кс не вс не кс не кс не кс

Пршолинейно-посдаательное

"Гиперактивное"

Достдпатеяьное-эакедяенвое

240+10 30+10'

- 90+5

— 60±5

90+10 30±2 180+20 60±5 60+10 60+10

60+10 30+5 95+15 40+10 70+10 30+15

50+10 15+5 60±10 30+10 90+15 120+10

45+10 10+5 55+5 30+5 120+15 150±15

Прижечаяие. Не- натявнне спериатозоидн, кс- кряоконсервнрованные сперматозоида

вро:„л как поступательного замедленного - 120 хкнут.

Исследования криокснсэрвировзянкх сперматозоидов показа.-/, что хгрэктер их дарения в среде кгп&цотзцки без гепарикэ аналогичен двкгавиэ взтивных сперматозоидов з среде, содержащей 10 ЕД^мл гепарина.

Увеличение в средэ . капацитации гепарина до 200 ЕД^кл способствует сокрацзижо времени прямолшеяно-поступ-этельного движения криококсерзкрованных спермэтозовдов в 9 .раз, а "гиперактивного" -.Зраза. Продолжительность поступательного замедленного движения при этом увеличивается в 2,5 раза.

Такта образом, . при воздействии гепарина на криококсервированную и ньтпзну» сперму отмечается сокращение Бремени перехода прямолинейно-поступательного движения к "гкпер-актявному" и продолжительности как нативяых, так и, в особенности, кркоконсервированных сперматозоидов. Вероятно, что процессы охлаждения при замораживании спермы и оттаивания способствуют эФФекту капацитации криоконсервированных сперматозоидов.

Особый научный интерес вызывает характер движения

сперматозоидов индивидуальных быков при капацитации.

Исследования характера движения сперматозоидов быков при воздействии гепарина в концентрации 10 ЕДтил показали, что через 30 минут инкубации 32% сперматозоидов быка Дельфина имели "гиперэктивное" движение, а у 20% отмечалось поступательное замедленное .и колебательное. С увеличением времени инкубации число сперматозоидов с прямолинейно-поступательным и "гиперактивным" движениями уменьшается и увеличивается с поступательным замедленным, колебательным. В то йе время сперматозоиды быков Ходкого и Пастора значительно быстрее переходят от прямолинейно-поступательного движения к "гиперактивному" и поступательному замедленному. Следует отметить, что период "гиперактизного" движения сперматозоидов этих быков значительно меньше, чем у быка ДельФина.

Таким образом, выявлены существенные' изменения характера движения сперматозоидов разных быков при капацитации с применением гепарина (10 ЕДтлл). '

Известно, что при взаимодействии "гиперактивно" движущихся сперматозоидов с ооцитамй наблюдается вращение ооцит-кумулюсного комплекса. Мы в экспериментах попытались определить время начала

7

вращэния ооцит-кумулюсного комплекса. При исследовании криоконсервированной спермы разных быков выявлена вариабельность во времени начала вращательного движения ооцит-кумулюсного комплекса. Так, время необходимое для начала вращения ооцит-кумулюсного комплекса _в зависимости от спермы быка колебалось от 35 i 5 мин до 60 - 6 мин. При инкубации криоконсёрвированной спермы разных быков с ооцит-кумулюсными комплексами в среда, содержащей 10 ЕД^мл гепарина, время начала вращения составило от 20 i 5 до 30 - 5 мин. Статистическая разница высоко достоверна при Р< 0,01.

Таким образом, установлено, что начало вращения ооцит-кумулюсного комплекса так же, как и переход к "гиперактивному" движению может служить показателем капацитации сперматозоидов.

3.2. Агрегация сперматозоидов при воздействии гепарина Одним из важных Физиологических показателей процесса капацитации сперматозоидов является их агрегация. •

Было установлено, что агрегация сперматозоидов - дозо-зависимый процесс, зависящий от концентрации гепарина в среде капацитации. С увеличением концентрации гепарина, как видно из табл. 2, происходит увеличение числа агрегированных сперматозоидов, причём эта закономерность характерна как при использовании нативной, так и криоконсервированной спермы. Так, при инкубации в течение 1 часа нативных сперматозоидов в среда капацитации (вт), содержащей 10 ЕД/мл гепарина, отмечается 40% агрегированных сперматозоидов. При • увеличении концентрации гепарина до 200 Eí/мл процент агрегированных сперматозоидов составил" 75 . Инкубация криоконсервированных сперматозоидов в среде с 10 Ед"мл гепарина способствовала агрегации 80% сперматозоидов, а в среде с 200 ЕД-тлл гепарина - 85% сперматозоидов (инкубация - 1 час).

Следует отметить, что 40% криоконсервированных сперматозоидов в среде капацитации (среда bw) без гепарина через 1 час инкубации агрегировали, в то' время как у нативных сперматозоидов при инкубации в среде без гепарина агрегацию не наблюдали. Видаю, ускоренный процесс капацитации криоконсервированных сперматозоидов связан с процессами криоконсервации и оттаивания сперматозоидов.

На процесс агрегации сперматозоидов, оказывают влияние бычий сыьороточный альбумин и сыворотка крови.

8

Агрегация спернатозояяов при воздействии гепарина (х+Зх)

Таблица 2

Показатели Агрегация сперматозоидов Ш пря конце-: 0 10 20 50 ;працяЧ гепарина, ЕД/кл . 100 200

Нативнне

сперматозоиды

ВИЙ 40+5 45±4 60+4 70±2 75+3

ВНК+ВЗй — 10+5 12±2 20+3 25+2 30+5

(Зиг/ил)

ВИН+1% фетальной сыворотки — 30+3 40+7 50+8 50+8 55±5

ВНЙ+102 Фетальной сыворотки — 8+2 10+2 18±3 25+3 40+5

Криоконсервированние

сперматозоиды

ВИЯ 40+5 80±5 82+6 90+? 92+5 95+5

ВНЙ+В5А 20+6 45+10 65+5 70+3 75+2 80+2

(Зиг/кл)

ВИН+12 фетальной сыворотки 30+5 80+12 В4±14 90+6 90+7 92+5

ВИН+10% фетальной сыворотки 15+5 53+8 60+6 63+7 70+11 80+8

Эксперименты показали, что включение в среду капацитации бычьего сывороточного альбумина уменьшает агрегацию сперматозоидов по сравнению с опытами, где сывороточный альбумин не применялся.

При исследовании влияния Фвтальной сыворотки на агрегацию сперматозоидов установили, что.с повышением концентрации Фвтальной сыворотки с 1 до 10%, число агрегированных сперматозоидов значительно уменьшается.

При сравнении агрегации сперматозоидов разных быков при, воздействии гепарина <10 Ед/мл) установили изменчивость этого пот-казателя. Исследования показали, что агрегация сперматозоидов быка Пастора проходила интенсивнее, чем сперматозоидов быков Дельфина и Ходкого. Так, через 60 минут инкубации 75Ж сперматозоидов быка Пастора были агрегированы, в то время как в сперме быков Дэльфинэ и Ходкого - только 40% сперматозоидов. Эта ' разница оказалась статистически достоверной при Р<0,01.

Таким образом, установлено, что .процесс агрегации сперматозоидов зависит как от условий капацитации (таких как концентрация гепарина, бычьего сывороточного альбумина и Фетальнои сыворотки), так и от свойств спермы разных быков.

3.3. Взаимодействие сперматозоидов быка с ооцитами

Одним из этапов оплодотворения является взаимодействие сперматозоидов с ооцитами.

В табл. 3 представлены параметры взаимодействия сперматозоидов, с ооцитами.

Оказалось,, что в зависимости от использованной спермы быка, число сперматозоидов,. прикрепленных к блестящей оболочке ооцота, колебалось от 3,8 (сперма быка Давнего) до 10,7 (сперма быка Ла<?вта). Рассчитанный показатель х2 показал высокую достоверность (х2®акт. = 21,0; х2теор. = 20,09; Р < 0,01) различия числа прикреплённых к ооциту сперматозоидов между разными быками.

При анализе изменчивости показателя выхода ооцитов с двумя полярными тельцами выявили, что этот показатель в зависимости от используемой спермы быков колебался от 9 (сперма быка Лодовика) до 59Ж (сперма быка Дельфина), Различия между быками по выходу ооцитов с двумя полярными Тельцами оказались достоверными при Р<0,05 (X2 = 14,01).

При анализе взаимосвязи между числом прикреплённых сперматозоидов к блестящей оболочке ооцита и процентом ооцитов с

10

Таблица 3. Взаимодействие сперматозоидов быков с ооцитами

Число сперматозоидов, Кличка Число прикрепленных к блестя- Ооциты о двумя быка ооцитов щей оболочке ооцита, полярными тельцами

п X - Sx r> %

Макс . 136 6,4 ± 0,3 73 54

ЛаФонтен 30 4,2 ± 0,5 3 9

Ходкий 18 7,9 ± 1,1 6 31

Давний ' 25 3,8 ± 0,6 8 33

Ла®ет 18 10,7 ± 1,2 5- 25

Пастор 51 8,0 ± 1,1 10 10

Черешок 24 5,8 i 0,7 3 12

Людовик 23 5,9*0.9 - -

Дельфин 100 5,8 i 0,1 ' 59 59

двумя полярными тельцами выявили, что из- 9 быков лишь 3 быка <ЛаФ0нтен, Ходкий и Черешок) сохранили' свои ранги. Остальные быки ранги изменили.- Рассчитанный коэффициент ранговой -корреляции Спирмена между числом прикрепленных сперматозоидов к блестящей оболочке ооцита и ооцитами с двумя полярными тельцами составил 0,09. Таким образом, корреляция между этими показателями практически отсутствует.

3.4. Исследование оплодотворякщзй способности спермы быков ' при оплодотворении ООЦИТОВ in vitro

Ключевым моментом в ' процессе оплодотворения, созревших . m vitro . яйцеклеток, является использований капацитированных сперматозоидов. Сперматозоид вступает в контакт с яйцеклеткой лишь после уого, как он подвергся изменениям, при которых приобретает оплодотворяющую способность. В атом случав сперматозоид, компетентный, к оплодотворению ооцита, можно рассматривать как пусковой механизм активации яйцеклетки и снятию блока мейоза на стадии mix.

Перед нами стояла задача - исследовать влияние сперматозоидов быков на оплодотворение ооцитов и раннюю стадию развития дробления эмбрионов.

С этой далью, были проведены исследования оплодотворяющей

11

способности криоконсервированной спермы быков черно-пестрой породы. В качестве критериев оценки оплодотворяющей способности были выбраны такие показатели, как выделение второго полярного тельца ооцигами и ранняя стадия дробления эмбрионов (2-8 клеток). Результаты экспериментов приведены в табл. 4.

Таблица 4. Влияние спермы разных быков на оплодотворение ооцитов и дробление ранних эмбрионов

{Снетка Число Ооциты с двумя Дробление 2-8-

быка ооцитов полярными тельцами клеточных эмбрионов

п п % и %

Макс 13В 73 ' 54 61 45,0

ЛзФонтен 30 3 9 4 12,0

Ходкий 18 'б 31 5 26,0

Давний К/О 8 33 11 44,0

ЛаФет ■ 18 : ' 5 • 25 ■ 5 28.0

Пастор 51 10 19 8 16.0

Черешок 24 3 12 3 12,0

Людовик ' 23 ■ - 8 ' 36.0

ДельФин 100 59 . 59 52 51,5

Видно, что при использовании спермы разных быков процент ооцитов с двумя полярными тельцами колебался от 9 до 59. 'Причём наилучшие . показатели были отмечены для спермы быков, Макса и ДельФина - 54 и 59% соответственно. Число дробящихся . ранних эмбрионов колебалось от 12,0 до 51,5%.

Следует отметить, что оплодотворяющая способность спермы быков, оценённая по наивысшему проценту ооцитов с дйумя полярными тельцами, соответствовала также высокому проценту дробления ранних эмбрионов. Так, при использовании, спермы быков Макса и ДельФина,' дробление ранних эмбрионов составило 45,0 и 51,5Ж соответственно.

Оцененный коэффициент ранговой корреляции Спирмена между ооцигами с двумя полярными тельцами и ранней стадией развития эмбрионов (2-8 клеток) составил 0,89 при достоверности Р=0,01.

Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов (Вгаскеи, еЪ а1. , 1982; Рагг1зЬ et .а!., 1986, 1988; иЯсИпд, 1993).

Результаты наших исследований свидетельствуют о высоком

12

разнообразии оплодотворяющей способности спорны индивидуальных быков, оцененной по выделении ооцитами второго полярного тельца и дроблению ранних эмбрионов. Установлена высокая корреляции между этими показателями, что позволяет прогнозировать дроблешю ранних эмбрионов.

3.5. Влияние некоторых характеристик капацитации спермы

разных быков на оплодотворение ооцитов Научный и практический интерес в биотехнологии оплодотворения ооцитов коров in vitro имеет изучение связи параметров капацитации сперматозоидов с оплодотворением. Полученные результаты экспериментов по этому вопросу представлены в табл. 5.

Таблица 5. Влияние капацитации сперматозоидов разных быков на оплодотворение ооцитов

Параметры капацитации Кличка быка

и оплодотворения ДельФИН Ходкий Пастор

Продолжительность "гиперактивного" движения сперматозоидов, мин 90 - 10 60 ± 5 , 30 i 5

Агрегация 50% сперматозоидов, мин 90 ± 30 100 ± 10 45 ± 5

Число сперматозоидов, прикрепленных к блестящей оболочке ооцита, п 5,8 ± 1,0 7,9 - 1,1 8,0 ± 1,1

Ооцоты с двумя по- • лярными тельцами, % ' 59 31 19

Дробление 2-3-клеточных эмбрионов, % 51,5 26,0 16,0

Отмечено, что : чем выше продолжительность "гитаратстивного" движения сперматозоидов, чем больше времени 'требуется для агрегации 50% сперматозоидов, тем выше выход ооцитов с двумя полярными тельцами и процент дробления ранних эмбрионов. Особенно выражена эта закономерность при использовании спермы быка Дельфина. Однако перечисленные параметры не связаны с числом сперматозоидов, прикрепленных к блестящей оболочка ооцига.

13

Таким образом, параметры капацитации сперматозоидов разных быков - продолжительность "гипэрактивного" движения, агрегация 50% сперматозоидов, являются важными показателеми оплодотворяющей способности спермы быков.

3.6. Оценка оплодотворяющей способности спермы быков

l.n vitro И in vivo

В современной литературе обсуждается вопрос об использовании оценки оплодотворяющей способности спермы быков in vitro и при искусственном осеменении коров в условиях производства. Однако результаты проведенных исследований противоречивы. С этой целью мы прошли исследования по сравнительной оценке оплодотворяющей способности спермы быков in vitro И in vivo (табл. 6).

Таблица 6. Сравнение оплодотворяющей способности спермы быков

in vi vo И i n vi tro

Дробление 2-8-клеточных Кличка Оплодотворяемость Число эмбрионов при оплодотво-быка коров in vivo ООЦИТОВ рении ООЦИГОВ in vitro

n % n ' n S

Дельфин 154 42 100 Б2 51,5

Ходкий 122 50 18 5 26,0

Пастор 56 58 51 8 16,0

Людовик 73 55 23 8 36,0

ЛаФет 115 57 18 5 28,0

Черешок . 62 62 24 3 12,0

Давний 107 60 25 11 44,0

Видно, что оплодотворяемость коров при искусственном осеменении колебалась от 42 до. 62%, тогда как при оплодотворении ооцигов in vitro наблюдалась вариабельность выхода ранних эмбрионов от 12,0 до 51,535.

Коэффициент ранговой корреляции Спирмена между оценкой оплодотворяющей способности спермы быков in vivo И in vitro составил rs=-0,53 при Р> 0,05.

Отсутствие положительной корреляции между оплодотворявшей способностью спермы быков in vivo и in vitro отмечается и другими исследователями COhgota et ai., 1988; Blottner et al., 1990; Байбеков, 1992). ' 14

Таким образом, по нашим и литературным данным, оплодотворяющая способность спермы быков in vitro не может являться критерием

ОПЛОДОТВОрЯЮЩеЙ СПОСОбНОСТИ СПерМЫ in vivo.

3.7. Гетероспермное осеменениэ при оплодотворении ооцитов

in vitro

В биологической литературе давно обсуждается проблема гетеро-спермного осеменения, что связано с вопросами повышения эффективности оплодотворения и эволюционного значения гаметического отбора при премейотическом контроле Фенотипа гамет у млекопитающих.

Повышение эффективности оплодотворения ооцитов коров in vi tro на основа использования гетеросгормного осеменения отмечается рядом авторов (King et al. , 1985; Tomer. 1988; Байбеков, 1992; Lei ding, 1993 И Др.).

В наших экспериментах мы использовали влияние гомогенного и гетерогенного осеменения на оплодотворение ооцитов in vitro (табл. 7).

Анализ таблицу показывает, что при использовании гетерогенной спермы быков ЛаФета и Ходкого наблюдается повышение оплодотворения ооцитов, оцененной та дроблению 2-4-клеточных эмбрионов, по сравнению с индивидуальным использованием спермы этих же быков. Оплодотворяемость ооцитов при гетероспэрмном осеменении составила 33,ОЖ, что на 11,0-12,036 выше, чем при общепринятом методе оплодотворения in vitro. Разница • статистически достоверна (F=4,l; Р<0,05). Однако при дальнейшем развитии эмбрионов эта разница сглаживается и между группами становится недостоверной.

Таблица. 7. Влияние, гетероспермного осеменения на оплодотворение

ООЦИТОВ in vitro

Кличка Число Дробление эмбрионов_

быка ооцитов 2-4-клвточные в и более 10-клеточные

п п . . • % ■ п %

4,0 0,0

9,5

ЛаФет, .101 21 21,0 ■ 4

Ходкий ' 27 в . 22,0 2

ЛаФвт 1

I 60 - 20 33,0 • в Ходкий J

Таким' образом, можно сделать вывод, что гетероспермное осеменение повышает огоюдотворяемость ооцетов in vitro.

Очевидно, гетероспермное осеменение поддерживает наиболее полноценные, гаметы а конкуренции за яйцэклетку (Дёмин, 1985).

3.8. Геоморфологический анализ эмбрионов, полученных in vitro

Цитоморфологический .анализ эмбрионов имеет важное значение в современной биологии раннего развития млекопитающих.

Нами проведана оценка морфологии 228 эмбрионов на стадии 2-16 бластошров, полученных через 40-116. часов после оплодотворения.

Результаты приведены в табл. 8.

На стадии 2-4 бдастомеров в среднем 40,556 эмбрионов не имели признаков дегенерации, в то время как на стадии 10-16 бластомэров таких, эмбрионов было в среднем 27,0%. У наибольшего числа дегене-рировзнных эмбрионов наблвдался лизис отдельных бластомеров, что прослеживается как у ранних- эмбрионов, так и на последующих стадиях развития. Неравномерное дробление эмбрионов происходит на 2-4-кл®точной стадии - 48,7 и 36,32 соответственно. Такое нарушение как Фрагментация встречается гораздо ниже' от 3,8 до 4,7%, причём только на начальных этапах дробления (2-4-клеточные стадии). Пикноз ядер в бластомврах и отсутствие ядер в них обнаруживается только у эмбрионов на стадии 10-16 клеток - в 5,5 и 13,3% случаев.

Таким образом, из 228 эмбрионов 37S5 характеризовались нормальной морФологиэа, остальные были с различными признаками дегенерации.

ВЫВОДЫ ' .

1. Обработка сперматозоидов быка • гепарином индуцирует процесс капацитации, выражающийся в изменении характера движения сперматозовдов, их агрегации и способности оплодотворять ооциты.

2. ' Процессы криоконсервации и оттаивания сперма вызывают аналогичные изменения в характере движения и агрегации сперматозоидов, что и при обработке нативных сперматозоидов гепарином в концентрации 10 ЩИлл.

3. При индукции капацитации переход к "гигаракгивному" движению и начало агрегации криоконсервированных сперматозоидов происходят значительно интенсивнее, чем нативных.

4. Установлена зависимость между временем перехода свермато-

16

Таблица 8

Морфологическая характеристика эмбрионов на разных стадиях развития

Стадия развития эмбрионов Сбластонерн)

Число Число

знбрио- вятакт- Лизис

нов ' них' отдедышх

эмбрионов бластонеров

и

Неравномерное дробление

п

Дегенерация Пккноз ядер в бласгоие-рах

п %

Фрагкеа- Отсутствие тацкя ядер в

отдельных бластерах п г п г

2 107 41 11 10,3 50 46.7 _ - 5 4,7 - -

4 52 22 20 38» 5 8 36,3 - ' - 2 3,8 - -

6-8 36 13 21 58,3 2 5,8 - - - - - -

10 18 6 10 55,6 - - 1 5,6 - - 1 5,6

12-16 15 3 8 53,3 - -• 2 13,3 - 2 13,3

Итого 228 85 70 30,7 60 28,3 3 1.3 7 3,1 3 1,3

зоидов к "гипорактивному" движению, началом их агрегации и оплодотворяющей способностью'спермы быков.

5. Выявлена вариабельность оплодотворения ооцитов и ранних стадий дробления эмбрионов, вызванная использованием спермы разных быков. Гетероспермное осеменение повышает оплодотворяемость яйцеклеток на 11-12% (Р< 0,05>. .

6. Между вьщелением второго полярного тельца оолитом и ранними стадиями дробления эмбрионов установлена тесная положительная корреляция (гs =-0,89; Р=0,01).

7. При оценке оплодотворяющей способности спермы быков in vitro и in vivo положительной коррелятивной связи не обнаружено (гд=-0,БЗ; Р>0,05).

' ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для ошнди капащггации и оплодотворяющей способности спермы быков in vitro рекомендуется использовать показатели, изложенные в диссертации.

2. Результаты исследований могут быть использованы в учебных курсах генетики, биотехнологии и разведения сельскохозяйственных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ташвва Л.Д., Бабушкина й.А., • Свиридов Б.Е., Зэвертяев Б.П. Оплодотворяющая способность спермы быков при исследовании in vitro /v Международный симп. по молекулярной генетике и биотехнологии в оценке и изменении геномов с.-х. к-х. -Санкт-Петербург-Пушкин, 1994. - С.51.

2. Бабушкина И.А., Федосков Е.Д. Взаимодействие сперматозоидов быков с яйцеклетками при. оплодотворении in vitro Тез. докл. 1-ой Междунар. научн. конф. молодых учёных и специалистов.-Киев, 1994. - С. 9.

3. Бабушкина И.А. Капацитация сперматозоидов быков и оплодотворение яйцеклеток коров в условиях in vitro ^ Тез. докл.' XIII Региональной научно-практической конференции молодух учёных и специалистов. - Оренбург, 1994. - С. 15.

4. Бабушкина И.А. Характер движения сперматозоидов быка при взаимодействии с гепарином х-/. Билл. ВНШГРЖ. - 1994. - и 140. -С. 14.

18