Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Защитное действие глицерина при замораживании эмбрионов млекопитающих для их микрохирургического разделения и транслантации

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Защитное действие глицерина при замораживании эмбрионов млекопитающих для их микрохирургического разделения и транслантации"

вя -1 9 2

р..^ УКР

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК

УКРАИНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

На правах рукописи

ГОРДИЕНКО НИНА АЛЕКСАНДРОВНА

уда 591.15.16

ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГЛИЦЕРИНА ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ ИХ МИКРОХИРУРГИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ И ТРАНСПЛАНТАЦИИ

03.00.13. - Физиология человека и животных.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Харьков - 19Э1

Работа выполнена в отделе.биологии размножения и искусственного осеменения сельскохозяйственных кивотных Украинского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель: ОСТАШКО Федор Иванович, академик УААН, доктор биологических наук, профессор.

Официальные оппоненты: ЯБЛОНСКИЙ Валентин Андреевич, доктор биологических наук. ВИШНЕВСКИЙ Валентин Иосифович, доктор биологических наук.

Ведущее предприятие: Украинский научно-исследовательский институт биохимии и физиологии сельскохозяйственных животных, г.львое.

Защита состоится _199^года в 4^0 часов на

заседании специализированного СоЕета Д.020.10.02. при Украинском научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте животноводства (312120, г.Харьков, п/о Кулиотчи).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан "/5" >£У/ 199/ года.

' Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Соловьева Т.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

'•с"1

Актуальность темы. Современное состояние сельскохозяйственной науки, в частности биотехнологии воспроизводства животных, предусматривает увеличение поголовья животных с высоким генетическим потенциалом, повышение продуктивности животных, тесной взаимосвязи и взаимообогащения теории и практики. Используя метода трансплантации, криоконбервации спермы и эмбрионов, микрохирургического разделения зародышей, можно получать больнее количество потомков с хозяйственно полезными признаками. -

Замораживание зародышей млекопитающих является неотъемлемой частью как научных исследований по проблеме трансплантации, так и вопроса практического использования этого метода.

Криоконсервация эмбрионов млекопитающих позволяет. сберегать зародыши неограниченный срок и, тем самым, создавать банк эмбрионов с целью сохранения генофонда домашних и диких видов животных. ¡Значительно проще перевозить зародыш, чем живые особи, и"меньше риск'завоза заболеваний. Замораживание зародышей является методом дешевого и быстрого размножения сельскохозяйственных животных и сохранения потенциально ценных линий и пород для будущего использования:

Существующие метода криоконсервации зародышей предполагают обязательное использование защитных веществ - криопротекторов. Однако, неправильное их применение может привести к необратимым изменениям эмбрионов. Используемые методики эквилибрации клеток в растворах криопротекторов обеспечивают сохранность эмбрионов, но так как эти режимы были подобраны эмпирически, не ясно» в какой степени они оптимальны и технологичны. Не выяснены физиологические особенности, определяющие особенности реакции эмбрионов на воздействие низких температур. Не решен вопрос о механизме / проницаемости глицерина через цитоплазматические мембраны эмбрионов. Существующие метода предполагают насыщение бласгокеров криопротектором, но неизвестно, обязательно ли защитному веществу, проникать внутрь эмбриона для защиты его или достаточно присутствия защитного вечфства во внеклеточной среде.- Решение этих вопросов даст возможность подобрать оптимальнее режимы добавления криопротектора перед замораживанием а удаления его из среда после оттаивания.

В настоящее время разработаны способы получения монозиготйых двоен из эмбрионов многих видов животных' (ЯШайаеп ЭЛ., 1979:

ladsen S.M., lehn-Jensen H., Pehllly O.G., 1981). Однако, при микрохирургическом разделении эмбрионов многие бластомеры зародила бывают механически разрушены и, как результат, половинки зародышей оказываются нежизнеспособными. В связи с этим, необходима разработка более ладящего способа разделения эмбрионов на половинки. Сочетание глубокого замораживания и длительного хранения с микрохирургическим разделением ставит перед исследователем ноше задачи, а именно: возможно ли получать половинки из деконсервированных эмбрионов и достаточно ли эффективно защищает используемый криопротектор зародыши в течение криоконсервации, чтобы при юс делении были получены полноценные эмбрионы.

Цель и задачи исследований. В связи с вышеизложенным, цель» исследование является выяснение особенностей защитного действия глицерина при замораживании эмбрионов млекопитающих для их микрохирургического разделения и трансплантации. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить механизм транспорта глицерина через цитоплазматичес-кие мембраны эмбрионов млекопитающих.

2. Разработать методику криоконсервации эмбрионов при эндо- и акзоцеллглярной защите глицерином.

3. Выяснить необходимость проникновения криопротектора внутрь бластомвров для защиты их от повреждения низкими температурами.

4. Изучить возможность микрохирургического разделения деконсервированных эмбрионов млекопитающих.

Б.. Разработать технологичный способ микрохирургического разделения эмбрионов млекопитающих.

Научная новизна работы.

~ установлен факт неконкурентного янпкйгровании ионами mjm в концентрации Зх1СГ*Ы транспорта глицерина через цитоплазматичесхнв мембраны зародааа;

- показано, что после оплодотворения яйцеклетки и каждого дроб-'ления бластомвров происходит достоверное увеличение удельной проницаемости цитоплазматических мембран эмбрионов к глицерину;

- доказано, что после оплодотворения и процессе развития эмбриона происходит формирование 'системы пассивного транспорта глицерина типа облегченной диффузия;

- разработана методика криоконсервации эмбрионов только с эндо-и только с экзоцеллюлярной криопротекцией на основе температурной зависимости проницаемости мембран эмбрионов к глицерину;

- установлено, что успешное замораживание 8-клеточных эмбрионов и ранних морул возможно не только при наличии глицерина внутри эмбрионов и во внеклеточной среда, но также и только при экзо- или толь ко при эидоцеллюлярной криопротекции;

- показано, что криоконсервация поздних морул и бластоцист требует обязательного присутствия глицерина как в зародыше, так и в окружающей среде;

- предложен способ разделения зародышей одним микроинструментом без фиксации эмбриона, установлен оптимальный угол между осью микроиглы для разделения и плоскостью предметного стекла;

- показано, что разрезание зоны пвллюцида, извлечение зародыша из оболочки и помещение в оболочку эмбриона или его частей в 1,БМ растворе НаС1 обеспечивает высокую сохранность зародыша и зона пвллюцида;

- показано, что глицерин достаточно эффективно защищает зародыши в течение криоконсервации, чтобы получать из них полноценные половинки эмбрионов;

- получено потомство (в том числе монозиготная двойня) от трансплантации половинок деконсервированных зародышей крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы. Разработан способ определения жизнеспособности эмбрионов в гипертоническом растворе, который позволяет повысить достоверность определения сохранности зародыша, облегчить процесс исследования и упростить применяемое оборудование.

Предложен метод разрезания зоны пеллюцида, извлечения зародыша из оболочки, пересадка в зону целых или частей эмбриона в 1,511 растворе ЫаС1 для обеспечения сохранности прозрачной оболочки и собственно зародыша.

Ка основании результатов проведенных исследований разработаны методики криоконсервации эмбрионов только с эндо- и только с экзо-целлюяярной защитой. Предложен метод криоконсервации 8-клеточных эмбрионов и ранних морул, при котором не требуется выведение криопро-тектора после оттаивания.

Внедрение результатов работы. Разработанные способы определения жизнеспособности эмбрионов и. способы проведения микрохирургических операций с зародышами заявлены как изобретения. На изобретения "Способ проведения микрохирургических операций с биологическими объектами, имеющими внеклеточную оболочку" и "Слособ получения животных с прогнозируемыми признаками" получены положительные решения Госкомизобретений СССР .на выдачу авторских свидетельств.

Разработки используются в лаборатории трансплантации эмбрионов колхоза "Коммунар" Ахтырского района Сумской области, ПНО "Прогресс"' Алтайского края.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на ежегодных ученых Советах НИИ животноводства Лесостепи и Полесья УССР, в отчетах о научно-исследовательской работе за 1985-1991 годы, на 2-й республиканской научно-производственной конференции молодах ученых н специалистов (г.Харьков, 1986), Всесоюзном римпозиуме по трансплантации эмбрионов (г.Тарту, I98G), Республиканской научно-практической конференции (г.Львов, 1987), Республиканских практических конференциях (г.Харьков, 1988; г.Львов, 1990), опубликованы в трудах 11-го Международного конгресса по воспроизводству и искусственному осеменению животных (г.Дублин, 1988) и 25-го Международного конгресса по криобиологии (г.Аахен, 1988).

Объем работы. Диссертация изложена на 1Г2 страницах мапинопис-ного текста, включает 17 таблиц и 24 рисунка. Список использованной литературы состоит из 119 источников, в том числе 76 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследований были использованы яйцеклетки и эмбрионы линейных мышей и крупного рогатого скота. Зародыши изучаемой стадии развития йолучвли по стандартным методикам (Дыбан A.n., 19(75: Rowson L.E.A. et al., 1969). Жизнеспособность эмбрионов оценивалась в зависимости от изучаемого процесса одним из нижеперечисленных способов: морфологическим (методом световой микроскопии), в растворе флуоресцентного зонда (Botman В..Papermster B.W., 1966), по результатам культивирования In rltro (Wftittingharo D.С.,1974) или пересадок зародаавй животным-реципиентам.

Проницаемость цитоплазматических мембран яйцеклеток и эмбрионов изучали методом волюмоыетрии (Безуглый К.Д., 1984).

Криоюнсервацию зародышей мыши и коровы проводили по; стандартным методикам на разработанной в нашем институте установке для замораживания эмбрионов (Остаапсо Ф.И. и др., 1988). '

Микрохирургические операции с зародышами проводит с использованием комплекса приборов ПШ1-1. Инструмент'для разделения изготавливали из стеклянных капилляров на микрокузнице.

Полученные результаты были статистически' обработаны (Плохинс-кий H.A., IS69).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ-I. Механизм транспорта глицерина через цитоплазматические мембраны яйцеклеток и эмбрионов разных стадий развитая., ■

При помещении в гипертонический раствор глицерина физиологачест кая реакция яйцеклеток и эмбрионов различных стадий развития аналогична таковой для других клеток и изменение объема происходит следующим образом. Так как проницаемость цитоплазматических мембран к глицерину намного ниже, чем к воде, перепад осмотического давления выравнивается за счет выхода вода из клетки и объем эмбриона резко уменьшается. Затем зародам начинает восстанавливать свой объем в результате входа глицерина и вода- внутрь клетки до выравнивания его внутри- и внеклеточной концентрации. На рпс.1 показана характерная осмотическая реакция эмбрионов млекопитащих в растворе глицерина на примере морулы мыши. Как следует из теоретических расчетов, так и из экспериментальных данных, восстановление объема происходит с замедляющейся скоростью. В связи с этим, нами был'сделан.вы вод о том, что регистрацию клеточного объема необходимо' проводить через удлиняющиеся промежутки времени, то -есть выбирать логарифмический масштаб времени.

Нами был определен временной интервал, через который необходимо проводить регистрацию'клеточного объема для яйцеклетки, зиготы, 2-, 4-, 8-клеточннх эмбрионов, морулы и бластоцисты мили (табл.Т).

Для понимания механизма транспорта глицерина через цитоплазматические мембраны важную роль может сыграть изучение изменения удельной проницаемости в течение эмбриогенеза.

Таблица 1

Временные интервалы фотосъемки процесса изменения относительного объема яйцеклеток и вибрионов мыши в 1М растворе глицерина, Т=22°С. -•

Стадия развития . Время фото^афированш! . . - ' (начало отсчета - помещение клетки в 1М раствор глицерина), 1;, мин.

яйцеклетка 1 2 3 4 6 8 10 13 18 25 35 50 70 90 .120 140 .170 360

зигота I' 2 3 4 6 8 10 13 18 25 ' 35 50 70 90 120 140 170 240

2-клет. эмбрион I 1,5 2 2,5 3. 4 5 7 ЛО 15 20 25 30 50 70 90 120 180

4-клет. эмбрион 0,5 I 1,5 2 2,5 3 4 5 8 II 15 20 25 35 50 70' 100 - \

8-клет. эмбрион 0,5 I 1,5 2 2,5 3 . 4 5 7 8 10 13 16 20 25 30 -

ранняя морула 0,5 0,7- I 1,5 '2 2,5 3 4 5 б 8 II 15 20 25 -

морула 0,3 0,5 0,7 I 1,5 2 2^5 3 4 5 6 8 II 15 - - - -

0 2 4 6 8 10 20 г(мин)

Рис Л. Изменение объема морулн мыши при помещении в 1М раствор глицерина.

На рис.2 показано изменение относительного объема мышиных яйцеклеток и эмбрионов, начиная зиготой и заканчивая морулой, в 1М растворе •глицерина в логарифмическом масштабе времени. Как видно из графика, длительность процесса уравновешивания существенно отличается для различных стадий развития и. уменьшается с 3 часов для яйцеклетки до 10 минут для морулы.

V

1.0

0,8

0,6 0,4

морула , р.морула

8-кл.

4-кл

2-кл зигота ■яйцеклетка

2 3 _1_!_

10 20 -и.

50 100

200 _1_

-Г--—I—--1--^---г—-г-

0 1 2 3 4 5 6

Рис.2. Изменение объема яйцеклетки и эмбрионов мшу.в 1Н растворе глицерина.

1п -1

По изменению относительного объема была рассчитана удельная • проницаемость к глицерину эмбрионов различных стадий развития. Данные табл.2 свидетельствуют, что эта величина постоянно возрастает после оплодотворения и в течение развития эмбриона и на стадии морали в 100 раз превышает таковую для яйцеклетки. Увеличение коэффициента проницаемости после оплодотворения и каждого дробления бласто-меров статистически достоверно (р>0,99). -

Таблица 2'. ' у

. Удельная проницаемость к глицерину цитоплазматических мембран эмбрионов мыши. . .

N п/п Стадия развития Количество эмбрионов в опыте, п (шт) Коэффициент проницаемости к' глицерину, РхЮ4 см/мин, М±ш

I яйаеадетйа 18 0,Ю±0,01

2 зигота 15 0,32±0,04

3 • 2-клеточный 20 0,45±0,05

.4 4-клеточный 19 • 1,50±0,2

5 8-клетоттай 17 . 3,20±0,4

6 р,морула 18 ' 6,00^0,7

7 морула 19 . 10,00-2,1

Исходя из того, что удельная проницаемость к воде не изменяется в процессе развития эмбриона, а проницаемость к глицерину возрастает многократно, мокно предположить, что у глицерина другой механизм проникновения через цитоплазматические мембррчы. Глицерин проникает в яйцеклетки иамбрионы только по градиенту концентрации, следовательно, это пассивный транспорт.

Чтобы определить вид пассивного транспорта, был.проведен эксперимент по неконкурентному ингибированию ионами меди (Си?>) проникновения глицерина через цитоплазматические мембраны. Как1 видно из 'рис.3, ионы двухвалентной меда в концентрации Зх1СГ4Ц значительно замедляют проникновение глицерина, восстановление клеточного объема, как для 8-клеточного эмбриона, так и для морулы мыши, происходит намного медленней, чем в среде без ионов меди. Удельная проницаемость

Рис.3. Изменение объема 8-клеточных эмбрионов (») и морулы (.) мыии в фосфатно-солевом буфере и в присутствии 3x10"4 ионов меда (—) •

для морулы - в 7,3 раза. В то же время присутствие ионов меди в среде не оказывает влияния на транспорт глицерина -в яйцеклетки. Сравнение полученных значений с удельной проницаемостью цитоплазматических мембран к глицерину других объектов показывает, что коэффициент проницаемости к .глицерину яйцеклеток аналогичен таковому для эритроцитов крупного рогатого скота, для которых известно, что глицерин проникает через мембраны путем пассивной диффузии. Значение удельной' проницаемости для ыорул сравнимо со.значением коэффициента прохшцаэ-ыости к глицерину эритроцитов человека, у которых транспорт нроисхо дат путем облегченной диффузии. К тому ш, при аналогичных исследованиях на эритроцитах человека было установлено, что коня меди обра-

зуют прочный комплекс с имидозольной группой гистидина и блокирует транспорт глицерина. Факт многократного замедления проникновения .глицерина в эмбрионы в присутствии ионов меди так s;e говорит о том, что как в эритроциты, так и в эмбрионы глицерин проникает через каналы, образованные молекулами гистидина. Таким образом, совокупность полученных результатов позволяет заключить, что после оплодотворения яйцеклетки и в процессе развития пародииа происходит формирование пассивного транспорта глицерина типа облегченной диффузии.

Установленное явление связано, возможно, с тем, что глицерин, используемый нами как криопротектор, является активным метаболитом, в том числе интенсивна используется дробящимися клетюми в синтезе липидов для построения вдтоплазматических и внутриклеточных мембран. Если на стадии яйцеклетки потребность в глицерине удовлетворяется за счет внутренних запасов, го физиологические изменения мембран в течение раннего :^мбриогенеза обеспечивают поступление этого вещества из внеклеточного пространства.

2. Cnocqp определения жизнеспособности эмбрионов.

Проводя эксперименты по изучению осмотической реакции эмбрионов ■в неизотонических растворах, нами было обнаружено, что эмбрионы, имеющие повреждения мембран, не изменяют свой объем. Это позволило нам предложить способ определения жизнеспособности эмбрионов, основанный на общеизвестном факте, что с точки зрения физиологии необходимым условием жизнеспособности клетки является обладание цитоплаз-матической мембраной свойством избирательной проницаемости.Если при помещении в неизотонический раствор зародыш изменяет свой объем - < значит, мембраны целы я эмбрион жизнеспособен, если объем не изменяется - эмбрион не жизнеспособен. В таблице 3 приведены данные о сравнении двух методов определения жизнеспособности: по предлагаемому нами - в гипертоническом (1,2М) растворе МаС1 и по известному - в раствора флуоресцентного зонда.

Реципиентам были пересажены как полноценные, так и нежизнеспособные зародыши. Из таблицы видно, что общая прядашляемость как полноценных, так и нежизнеспособных эмбрионов в обоих тестах была одинакова. Б то же время,, приживляемость полноценных эмбрионов, оцененных по предлагаемому способу, вшз на 9%, чем эмбриилов, оцененных в растворе флуоресцентного зонда. К тому же, после пересади: 5 нежизнеспо-'

Таблица 3. Оценка жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота.

Способ оценки Количество эмбрионов, оцененных морфологически как Приживляемость после трансплантации эмбрионов, п, (Ж)

полноценные ,п,-(%) нежизнеспособные ,п, (%) полноценных нежизнеспособных общая

1.2М КаС1 (п=24) . 18 (75). 6 (25) 7 (39) 0 7 (29)

флуоресцентный зонд(п=22) 17 (77) 5 (23) 5 (30) I (20) ' 6 (27)

собшх эмбрионов, оцененных в растворе флуоресцентного-зонда, 'был стельным один реципиент. Таким образом, использование гипертонического раствора при оценке жизнеспособности зародышей позволяет более достоверно определять сохранность яйцеклеток и эмбрионов, упростить процесс исследования и применяемое оборудование.

3. Защитное действие глицерина при замораживании эмбрионов с различным местонахождением криопротектора.

Различные методы криоконсервации эмбрионов предполагают экви-либрацию в растворе криопротектора при различных температурах. Проницаемость цитоплазматических мембран эмбрионов к глицерину зависит от температура. На рис.4 приведены графики изменения относительного объема 8-клеточных эмбрионов мыши при различных температурах. Понижение температуры значительно замедляет, транспорт глицерина череп цитоплазматические мембраны. Значение удельной проницаемости при снижении температуры 'от 37°С до 0°С уменьшается более чем в 24 раза.

Скорость пассивного транспорта глицерина с изменением, температуры изменяется по закону Дррвниуса:

Р = Ро ехр (-4 - 4-} . (I)

где Р - удельная проницаемость цитоплазматических майоран к глицери-

ну при данной температуре; Р0-. у дй льная проницаемость мембран при температуре Tö;; Zaot - анергия активации транспорта глицерина; Б -универсальная газовая постоянная; Т - температура. Анализируя пзме-

JL.

1,0 0,8 0,6 0.4

О I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 t

Рис.4. Изменение объема 8-клвточного эмбриона мьшги в IU растворе глицерина при указанных температурах.

(мин)

некие удельной проницаемости-при изменении температуры, были определены значения анергии активации. Для 8-клеточных эмбрионов мыши значение энергии активации составляет 59,5 кДж/моль, морулы мыши -67,0 кДк/моль, морулы крупного рогатого скота - 63,3 кДк/моль. Использование аппарата математического моделирования осмотической реакции эмбрионов позволяет определить длительность эквилибрации.эмбрионов перед замораживанием для их полного насыщения:

{ =

P(S/7)iBO

(3,95 +

ЗСр

я!вО

(2)

где (S/V)1*® - поверхностно-объемное соотношение в изотонических ус-ловнях; Ср - концентрация криопротектора; С1во - изотоническая концентрация внутриклеточных веществ.

Если насыщение проводить при различных температурах - удельнуи проницаемость можно вычислить используя уравнение' (I). В табл.4 , в качостве примера, представлена зависимость времени выдержки зародышей мшш перед замораживанием при комнатной температуре.

Таблица 4

Зависимость втмени выдержки зародышей мыши перед замораживание от стадии развитая (Т=22°С)

Стадия развития яйцеклетка зигота 2-клеточный 4-клеточный 8-кле-точный ранняя морула морула

Длительность экви-либрации, мин 180 120 90 79 40 15- 8

В настояшее время криоконпервация эмбрионов предполагает обязательное насыщение зародышей криопротектором перед замораживание и, Как следствие, выведение защитного вещества после оттаивания. Однако неизвестно, нужно ли защитному веществу проникать внутрь зародыша, или достаточно присутствие »то в окружающей среде.

Чтобы выяснить локализацию глицерина для успешного замораживания нами были разработаны методики эндо- и зкзоцеллюлярной криопро-текции..Методики были разработаны на основе температурной зависимости удельной проницаемости цитоплазматических мембран. В табл.5 показана схема проведения опытов по выяснению локализации глицерина.

В случае экзоцеллюлярной защитой глицерином криопротектор находится только в окружаюцей среде. Эмбрион переносили в пробирки для замораживания со средой, содержащей 1,0М глицерина, охлажденной до 0°С и продолжали снижать температуру по стандартной методике. При этом глицерин практически не проникал внутрь зародыша и можно говорить, что эмбрион был заморожен без криопротектор» внутри. При эндо-целлшярной криопротекции зародыши насыщали глицерином, переносили в среду с 0.75М сахароз, при С? С и продолжали снижение температуры. Оттаивали эмбрионы до 0°С й переносили зародыши без глицерина внутри в фосфатно-солевой буфер, а эмбрионы с глицерином - в фосфатно-соле-вой буфер с 0,75« сахарозы для выведения криопротектора. В, качестве контроля использовали эмбрионы, замороженные по стандатэтноЯ методике: с насыщением и выведением криопротвктора.

Таблица 5.

Саечка проведения опытов по выяснению локализации глицерина ' при криоконсервации.

Локализация глицерина Внутри эмбриона и во внеклеточной среде Только во внеклеточной среде Только внутри эмбриона

Насыщение эмбриона глицерином есть нет есть

Среда для-замораживания эмбрионов ФСБ(-2<ЖО 1М глицерина ФСБ+2ОТФС+ 1М глицерина ФСБ+20ШЛ-0,7£Мсахарозы

Температура начала замораживания, °С 22 0 0

Конечная температура оттаивания, °С 22 0 0

Среда для помещения эмбриона после оттаивания ФСБ+2МФС+ 0,75М сахарозы «СБ+203ЯС ФСБ+20%ФС+ 0,75Мсахарозы

Выведений крио-протектора есть нет есть

В табл.6 показана сохранность эмбрионов мыши и коровы после криоконсервации с различным шетоиахоадениеы глицерина.

Как следует из таблицы, криорезистентность эмбрионов разше стадий развития при эндо- и вкзоцеллшярной защите различна. Данные морфологической оценки, результатов культивирования и пересадок эмбрионов реципиентам коррелируют между собой. Успешное замораживание 8-клеточных зародышей и ранних (Л6 клеток) морул мыш может быт1 произведено как в случае, когда глицерин находится только внутр зародыша, так и в случае, когда защитное вещество присутствует только в окрукаидай среде. Для йародашай более поздних стадий развит;« (поздняя морула-ранняя бластоциста, бластоциста шла и поздняя мору-

Таблица 6

Сохранность эмбрионов после криоконсервации с различним местонахождением глицерина.

Вид объекта Вид крио-протектора Сохранность (по морфологическим признакам), % Доля жизнеспособных эмбрионов (по результатам культивирования ) Д 1......... - Доля беременных-реципиентов, %

8-клеточ- эвдо- 70 (п=28) 53 46

ный эмб- экзо- 67 (п=28) 50 42

рион мыши энло/экзб 90 (п=29) 80 57

ранняя эндо- 60 <п=32) 42 36

морула экзо- 57 <п=28) 35 30

мыши эндо/экзо 82 (п=22) G7 50

поздняя эндо- 22 (п=9) II

морула экао- 8 (п=12) 0 -

коровы эндо/экзо 89 (п=63) 80 39

бласто- эндо- 21 (п=24) 23 20

циста экзо- 4 (п=23) Т 0

коровы эндо/экзо 91 (п=21) 50 I 44

* - Пересами нэ производились.

1а, бластоциста крупного рогатого скота) необходимо обязательное нападение зародашей криопротектором перед замораживанием и наличие за-1итного вещества в окружающей среде при снижении температуры.

Отличие н криорезистентности эмбрионов различных стадий развития можно объяснить физиологическими изменениями при компактизации юрулн и при бластуляши зародыша. Все бластомеры 8-клеточного заро-¡ыша контактируют с окружающей средой. У эмбрионов на стадии 16 кле-'ок пятнадцать бластомеров имеют контакт с окружающей средой, а один (аходится в окружении других бластомеров (Карлсон С., 1983). Возмож-ю, что зародыши на этих стадиях сохраняют зетзнеспособность- при за-юряживании в среде с криопротектором без насыщения зародыша глице-шом за счет того, что мембраны всех, бластомеров контактируют с мо~

лекулзми защятюго вещества. Таким ке образом можно объяснить спо-собноыь насыщенных глицерином зародышей выдерживать замораживание в •среде без криопротектора. Однако, доля жизнеспособных, эмбрионов в данном случае' была меньше.

Криоконсврвация эмбрионов мыши и крупного рогатого скота на стадиях поздняя морула-бластоциста и поздняя бластоциста может быть успешной, если эмбрионы насыщают защитным веществом и замораживают в среде с .криопрстектором. Если глицерин находится только в окружающей среде, многие бластомеры не будут контактировать с криопротектором и при снижении температуры большая их часть погибает. К тому же, необходимо учитывать, что поело "бластулящш эмбриона происходит даффе-ренцировка клеток на внутриклеточную массу и трофобласт, что приведет к различной их устойчивости к действию низких температур.

4. Микрохирургическое разделение де;:онсервированных эмбрионов мыши и крупного рогатого скота.

Обычно при разделении эмбрионов млекопитающих используют несколько микроинструментов (МаэБАр А. &Х а1., 1985), что требует применения сложных микроманипуляторов и делает процесс разделения трудоемким. Зародам помещают в физиологический раствор, микроприсоской фиксируют клетку, а затем разрезают микроноком прозрачную оболочку,, извлекают зародыш и разрезают его на части (0г11 .Т.Р., 1982). При таком способе проведения микрохирургических операций нужно использовать несколько микроманипуляторов, изготавливать минимум два микро-иаструменга, а, следовательно, способ сложный и не очень технологичный. Кроме того, разрезание микроноком повреждает часть бластомеров и существует большая вероятность гибели половинок зародышей.

В предложенном нами способе разделение эмбрионов на части производится одним микроинструментом без фиксации эмбриона микроприсоской. Одним из определяющих параметров данного способа разделения является расположение ыикроиглы для разделения. Инструмент для разделения выполняет кроме своей основной функции и вспомогательную, но крайне необходимую - фиксацию зародыша на предметном стекле.

Основном параметром, определяющим расположение иглы дли разде-, леция* является угол (а) меаду ее осью и плоскостью предметного стекла,на котором производится деление Этот угол мы назвали "углом атака". Правильный выбор его позволяет игле не только делить эмбрион, Во и одновременно удерживать его на одном месте во время деления.

Если угол а=0, зародыш удобно фиксировать, но разделить трудно, вв-тому что рабочая часть. гораздо тоньше части, которая удерживается позиционером и игла при опускании нэ соприкасается с плоскостью деления. При большом "угле атаки" зародыш зафиксировать очень трудно и при делении микроигла может поломаться о предазтное стокло.

Был определен оптимальный угол наклона микроиглы. Проводили деление зародыша мыши на стадии морулы иглой, расположенной под различным "углом атаки" и определили возможность разделения. Результаты исследований представлены в табл.7.

Таблица 7.

Результаты микрохирургического разделения зародышей с помощью одного микроинструмента.

Угол расположения микроиглы Количество разделенных эмбрионов Количество . успешных разделений Вероятность •разделения, %

0 12 6 • 50

8-12 14 8 78

15-20 21 19 90

30-35 II 6 55

45-50 9 2 22

Было установлено, что наибольшая вероятность успешного разделения зародышей при наклоне микроиглы 15-2СР относительно плоскости предметного стекла. • .

Следует отметать, что при общепринятом разделении эмбриона мяк-роскзльпелем возможно разрезание отдельных бластомеров, тогда как разделение микроиглой является физиологически более щадящим, так как игла разрывает межклеточные связи между бластомерами и, в итоге, половинки зародшдей меньше повреждены.

Предложенным способом были разделены эмбрионы мыши и коровы на стадии морулн после деконсервации. Зародыши оттаивали, выводили криопротектор и оценивали качество. Делешш зародшиеЛ проводили, не извлекая его из зоны пеллюцида, на предметном стекле под микроскопом МБС-9. Помещали эмбрион в каплю ФСБ и подводили к зародышу иглу для деления. Прашльно сориентировав положение зародыша, устанавливала над ним иглу под углом 15-20°. С помощь» микровинта медленно опускали иглу на эмбрион и небольшими поступательными движениями иглы до-

бивалирь разрыва зоны пеллюцида и связей между бластомерами зародышей. Операция разделения эмбрионов на половинки, включая помещение целого зародыша на предметное стекло и перенос полученных половинок в чашку Петри, занимала не более 2 минут. После разделения эмбрионы мыши культивировали в ФСБ с 20% феталъной сыворотки в течение 8 часов в термостате, йизнеспособные половинки за это время формировали морулу несколько меньших размеров, чем обычная, а некоторые развивались'' до стадии бластоцисты. После разделения 24 эмбрионов мыши 13 половинок эмбрионов (54%) были жизнеспособными.

Замороженные эмбрионы крупного рогатого скота на стадии морулы оттаивали, выводили криопротектор и оценивали их качество. Деление зародышей 1фупного рогатого скота проводили так а;о, как и деление эмбрионов мыши. Полученные половинки без зоны пеллюцида пересаживали синхронизированным реципиентам по половинке в каздый рог матки. В результате пересадок 20 половинок 10 реципиентам родилась монозиготная двойня в возрасте 7 месяцев и 2 теленка у двух реципиентов (при-живляемость 40%). После пересадок 4 половинок зародышей в Барнаульском центре трансплантации был стельным один реципиент. Средняя при-живляемость в пунктах составила 35,72.

Таким образом, использование глицерина при криоконсервации эмбрионов млекопитающих позволяет; получить зародыши, пригодные к разделению. Использование в качестве микроинструмента стеклянной микроиглы дает возможность проводить микрохирургическое разделение без фиксирования зародыша микроприсоской и без .удаления зона пеллюцида. •

В ходе экспериментов по разделению зародашей мы столкнулись с одной из особенностей проведения микрохирургических операций, значительно' осложняющей саму технику проведения таковых. Известно много способов проведения микрохирургических операций, и общим в них является проведение манипуляций в изотоническом растворе (Baker R.D. & Shea В.Р., 1985; Agrawala P. et al., 198T). В ходе микрохирургических операций часто зародыш нужно извлекать из собственной прозрачной оболочки либо пересаживать эмбрион или его часть после операции и зону пеллюцида. Наличие внеклеточной прозрачной оболочки создает определенные трудности для проведения микрохирургических' операций, так как усложняет доступ к,клеточной массе эмбриона, требует проведения операций с самой оболочкой. Ери проведении микрохирургических операций необходимы специализированные ыикроманипуляторя, а также есть больиая вероятность повревдения клеточной оболочки и собственно кле-

тки.»

Обычно микрохирургические операции с эмбрионами проводят с помощью одного или нескольких манипуляторов. Эмбрион, находящийся в изотоническом физиологическом.растворе, удеркивают микроприсоской, а остро заточенной пипеткой прокалывают прозрачную оболочку и втягивают один или несколько бластомеров, извлекают из собственной прозрачной оболочки, проводят необходимые микрохирургические операции и пересаживает в зону пеллюцида.

Для дальнейшего' развития зародышей ранних стадий in vivo важна целостность как зародыша, так и зоны пеллвцида. Показано, что на жизнеспособность In vitro эмбрионов не влияет удаление зоны пеллвци-дэ, в то время как для развития зародышей ранних стадий in vivo после пересадки наличие прозрачной оболочки играет'большую роль (Норе R.W. & Bavlster B.D., 1983). Поэтому разрез или прокол зоны пеллюци-да должен быть как можно меньше, чтобы обеспечить сохранность зародышей после пересадки, и в то же время достаточно большим, чтобы эмбрион во F-ремя извлечения не повредился механически.

Нами предложен способ проведения микрохирургических операций с эмбрионами, основанный на физиологических свойствах эмбриона как. системы зона йеллюцида-клегочная масса. Ранее было установлено (Бе-зуглый Н.Д., 1984), что размеры пор зоны пеллюцида сравнимы с характерными размерами высокомолекулярных соединений, и она не является полупроницаемым барьером для низкомолекулярных, ее влиянием на транспорт таких веществ можно пренебречь. Осмотическая реакция яйцеклеток и эмбрионов млвкоггатавдих в растворах низкомолекулярных соединений определяется только избирательной проницаемостью цитошгазмати-ческих мембран и не зависит от свойств зоны пеллюцида. Это приводит к тому, что при помещении в гипертонические растворы непроникащих через цитоплэзматнческие мембраны веществ объем клеточной массы зародыша уменьшается, а размера внеклеточной оболочки не изменяются. Сжатие клетки происходит в результате выхода вода из зародыша по градиенту концентрации. В результате сжатия в зародыше увеличивается расстояние мевду; зоной пеллюцида и собственно клеточной массой Теперь при проведении надреза или прокола клеточной оболочки возможность механического повреждения самого зародшва значительно снижается. Разрез оболочки можно сделать меньше, так как размеры самого зародыша уменьшаются и его можно извлечь из зона через меньшее отверстие. Разрезанная таким образом зона пеллюцида может быть исполь-

зована в дальнейшей работе, в ней можно пересаживать реципиентам целый амнион или его часть.. ' '

В предложенном нами способе используется раствор КаС1 в концентрации 1,5М. При'помещении зародыша в такой раствор объем клеточной массы уменьшается в 2,8 раза. Выбор концентрации 1.5М обуслйвлен тем, что при более низкой концентрации уменьшение клеточного объема незначительно и извлечь эмбрион из внеклеточной оболочки трудно, а более- высокая концентрация повреждает клетки.

Мы использовали предложенный способ проведения микрохирургических операций при разделении эмбрионов мыши. Работы проводились с зародышами на стадии морулы-бластоцнсти. Разделение эмбрионов на две частя проводали в капле . изотонической среды стеклянной иглой баз фиксации зародыша. Половинки непродолжительное время культивировали в.ФСБ и наблюдали их развитие. Пустые зоны пеллюцида получали из дегенерировании эмбрионов или яйцеклеток в гипертоническом раствора, где извлекали их содержимое через небольшой разрез оболочки. В том же гипертоническом растворе "половинки зародышей, которые формировали при культивировании морулы меньших размеров, переносили в пустые зоны, удерживая их микроприсоской, а отверстие в зоне раздвигали двумя иглами. Половинки эмбрионов в зон$ пеллюцада помещали в.изотонический физиологический раствор, а затем пересаживали синхронизированным реципиентам. Беременность составила ЗОЖ. . .

Таким образом, использование гипертонического раствора при выполнении мшдюхирургических операций с эмбрионами позволяет мани-щшфовать с зародышами без риска их повредить, а, следовательно, повысить процент жизнеспособных после манипуляций с эмбрионами, увеличить сохранность клеточных оболочек и улучшить технологичность проведения микрохирургических операций.

ВЫВОДЫ.

1. Удельная проницаемость цитоплазматичаских мембран яйцеклеток и эмбрионов мыши достоверно увеличивается после оплодотворения и каждого дробления Оластсмеров.

2. Коны шда (в концентрации ЗхЮ_4М) на оказывают влияния,на проницаемость цятоплазнаткческих мембран яйцеклеток мыши к глицерину* но в то ка время достоверно замедляют проникновение глицерина через цитоплазматическиэ мембраны 8-клеточных эмбрионов и мо-

рул.

3. После оплодотворения яйцеклеток и в процессе развития зародыша происходит формирование пассивного транспорта глицерина типа облегченной диффузии.

4. Изменение клеточного объема в гипартонпесхсм растворе свидетельствует о жизнеспособности эмбриона, а сохранение объема -о гибели зародыша.

5. Замедление скорости проникновения глицерина через цито-плазматические мембраны 8-клеточных зародышей, морул и бластоцист мыши и крупного рогатого скота при понижении температуры позволяет производить замораживание как с эндо-, так и с экзоцвллюлярной криопротекцией.

6. Успешное замораживание 8-кле точных эмбрионов и ранних морул мыши возможно не только при наличии глицерина внутри эмбриона и во внеклеточной среде, но также и при экзоцвллюлярной защите этим криопротектором.

7. Криоконсервация поздних морул и бластоцист мыии и крупного рогатого скота требует обязательного присутствия глицерина как в зародыше, так и в окружающей среде.

8. Использование стеклянной микроиглы под определенным углом наклона к предметному стеклу (15-20°) позволяет проводить бисекцию зародышей мыши и крупного рогатого скота вместе с зоной пеллюцида без дополнительной фиксации эмбриона.

9. Использование свойств зародыша как абсолютного осмометра значительно облегчает проведение микрохирургических операций с клеточной массой зародыша, его частями и зоной паялмдада.

10. Защита глицерином в течение криоконсервации эмбрионов мыши и коровы о1*»)спвчмвает получение полноценного потомства посла трансплантации половинок декоисервированшх эмбрионов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. При изучении осмотической реакции регистрацию клеточного объема при изменении осмолярности сроет необходимо проводить через удлиняющиеся промежутки времени.

2. Вид осмотической реакции в гипертоническом растворе является тесто», определения жизнеспособности: если эмбрион изменяет

свой объем - op жизнеспособен, постоянство объема свидетельствует о rod ели объекта.

3. Эквилибрацня 8-клеточннх эмбрионов и ранних морул мши в растворе глицерина ори 0°С позволяет успешно проводить замораживание при экзоцвллшяряой криопротекции и не проводить отмывку глицерина после деконсервации.

4. Микрохирургическов разделение эмбрионов предлагается прободать стеклянной микроиглой, расположенной, под углом I5-2CP к првдовтноцу стеклу без дополнительной фиксации.

6. Микрохирургические операции по извлечению и помещению клеточной мессы зародышей или ее частей из зоны пеллюцида или в нее рекомендуется проводить в гипертоническом растворе NaCl осмоляр-ностью 1,511,

Список научных работ, опубликованшн по теме-диссертации.

t.Метод применения глицерина при криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота //Тезисы докл. 2-й республиканской научно-производственной конференции молодых ученых и специалистов.- г.Харьков, 1986 -с.16.

2.Одноступенчатое насыщение и выведение криопротекторов при замораживании вибрионов млекопитающих //Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота".-г.Тарту¿ 1986 - с.48-50 (в соавторстве).

Э.Микрохирургическое разделение деконсервированных эмбрионов крупного рогатого скота //Тезисы докл .республиканской научно-практической конференции "О широком использовании метода трансплантации эмбрионов в ускорении качественного совершенствования с.-х. животных".- г.Львов, 1987 - с.57-68 (в соавторстве).

Л.Харьковская технология асептического получения, криоконсервации и траасалантацш эмбрионов крупного рогатого скота //Тезисы докл. республиканской научно-практической конференции "О широком использовании метода трансплантации вибрионов в ускорении качественного совершенствования с.-х. животных". - г.Львов, 1987 -с.53-54 (в соавторстве).

5.îhe Technological Method for Cryocoiœervation of Cattle йп-bryoa //nth International Congress of Animal Reproduction and at-

tlficlal Insemination. - Dublin, 1983 - p.143-146(«lth other authors).

¿.Glycerol Transport to Mammalian Ora and йвЪгуов during Cryo Conservation //Ibid., p.181-183 (ulth other authors).

7.Cattle Bnbryo Resistance to Temperature Shock: Practical Use for Freezing and Short-Term Preservation //26th Annual Meeting. - Aachen, 1988 - p.160 (with other authors).

a.The Kharkov Technology of Cattle Bnbryo Cryoconaervatlon // Ibid.,'p.158 (with other authors).

9.Способ микрохирургического разделения деконсервироваяных эмбрионов крупного рогатого скота в производственных условиях // Тезисы докл. республиканское конференции "Состояние и перспективы развития биотехнологии в животноводстве" - г.Харьков, 1988 - С.6 (в соавторстве).

Ю.Защитное действие глицерина при замораживании эмбрионов крупного рогатого скота //Там же, с.14.

11.Спос1б проведения м1крох1рург1чних операц1й з зародками /У Тези допов1д1в республ1кан-;ько1 науково1 коаференцИ "Б1отехноло-г1чн1 досд1дження 1 перспектив« 1х роавитку". - м.Льв1в, 1990 -с.113-114.

12.Способ проведения микрохирургических операций с биологическими объектами, имеющими внеклеточную оболочку /Заявка в Госком-изобретений СССР N 48325440. Положительное решение о выдаче авторского свидетельства от 21.02.91.

13.Способ получения животных с прогнозируемым* признаками / Заявка в Госкомизобретение СССР N 4903679 . Половйвльное решение о выдаче авторского свидетельства от 25.06.91.

Подписано к печати" ¿5."__IZ______ 1991 г.

Объем 1,0 п.л. йраж 100 зкз. Заказ НПО»

Ротапринт УкрНМ растениеводства, селекции в гвяетжхи ик. В Л .Юрьева

г.^арьков-60, пр .Московский, 142.