Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование технологии криоконсервирования эмбрионов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование технологии криоконсервирования эмбрионов крупного рогатого скота"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

На правах рукописи Для служебного пользования

п>ооч?

Фецюшкин Алексей Федорович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕ РА Т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п, Дубровиды Московской области 1991

Работа выполнена в Центре по трансплантации эмбрионов с.-х. кжвотныг Всесоюзного научно-исследовательского институт животноводства

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Н.И.СЕРГЕЕВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.Д.БУГРОВ

кандидат биологических наук Н.М.РЕШЕТНИКОВА

Ведущее учреждение: Всесовзный научно-исследовательский институт разведения и генетики с.-х. животных ,

.Защита диссертации состоится в /С/' часов, на заседании специализированного совета Д.020.16.02 при Всесоюзном ордена Трудового фасного Знамени научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012, Московская обл., Подольский р-о: пос. Дубровицы.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

и.и.шшгин

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Трансплантация эмбрионов является одним из биотехнических приемов селекции в животноводстве, ускоряющий совершенствование стада в ряде поколений. Программа трансплантации эмбрионов включает в себя метод замораживания и длительного хранения эмбрионов, что позволяет рационально и экономически эффективно решать острейшую проблему интенсификации животноводства и разведение высокопродуктивного скота.

Криоконсервирование - многоэтапный и кногофакторный процесс, в течение которого биологические объекты подвергаются действию различных физико-химических факторов, обусловленных изменениями температуры, составом компонентов и системы. Для достижения этой цели применяются искусственные среды, в состав которых входят специальные защитные вещества - криопрогекторы, а само охлаждение осуществляется программно.

Замораживание эьйрконов позволяет существенно удешевить и упростить программу трансплантации, внести элементы плановости и перевести ее на промышленную и коммерческую основу.

Актуальность. Криоконсервирование зародышей имеет большое значение как для практики животноводства, так и для фундаментальных исследований. С помощью этого метода возможно создание генетических банков, значение которых заключается в возможности сохранения инбредных, мутантных и рекомбинанткнх линий, которые представляют необходимый материал для экспериментальных биологических исследований:

- в накоплении необходимого числа однородных эмбрионов для шлекулярнв -биологических и других исследований;

- подбирать спонтанных реципиентов, соответствующих по половому циклу, возрасту эмбрионов и проводить пересадку в условиях ферм.

Для предохранения зародышей от холодозого шока используют обогащенный фосфатно-солевой буфер, содержащий 1,4 М глицерина. Другим криопротектором для защиты эмбрионов монет быть использован I,2-пропандиол.

На процесс успешного криоконсервирования оказывает большое влияние не только криопротектор, но, и совокупность охлаждающих скоростей, на основании которых выполняется программное замора-кивание эмбрионов. Режиму охлаждения должен соответствовать и

режим оттаивания.

Для повышения эффективности замораживания эг.йрцонов необходим поиск малотоксичных криопротекторов с целью внедрения в практику криоконсервирования эмбрионов метода витрификации.

Цель и задачи исследования. Цель исследований-заключалась в повышении жизнеспособности замороженно-оттаянных эмбрионов, путем совершенствования технологии криоконсервирования с учетом стадии развития и качества зародышей, сравнительных испытаний стационарных и мобильных замораживателей, режимов охлаждения и отогрева, с применением высоких концентраций эдиопротектора глицерина в сочетании 1,2-цропацдиола и замораживании в газообразном азоте с неравномерным температурным полем, оттаивании и выведение криопротектора из эмбриона с использованием сахарозы.

В задачу исследований входило:

- изучить факторы, влняодив на жизнеспособность и приживляемо с ть замороженно-оттаянных эмбрионов;

- определить влияние щжогенных устройств, технологии замораживания и оттаивания на жизнеспособность эмбрионов;

- сопоставить в сравнительном аспекте морфологическую оценку качества свежеполученных и замороженно-оттаянных эмЗрионов;

- сравнить методику замораживания в газообразном азоте с традиционным методом замораживания;

- выявить оптимальные режимы насыщения, криопротектором охлаждения и отогрева, определить влияние времени от получения до замораживания на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов;

- разработать методику криоконсервирования эмбрионов с по-тщью высоких концентраций смеси криопротекторов глицерина с 1,2-пропандиолом на ФБС, путем прямого охлаждения в газообразном азоте;

- исследовать метод оттаивания эмбрионов и выведения крио-консерванта с помощью раствора сахарозы.

Научная новизна работы заключается в определении влияния криогенных устройств на выживаемость эмбрионов, а также скоростей охладцения я оттаивания, высокой концентрации смеси глицерина с 1,2-прошшдиолом, усовершенствовании технологии криоконсервирования эибрионов в газообразном азоте в неравномерном температурном поле и выведение криоцротактора сахарозой.

Практическая значимость работы состоит в усовершенствовании технологии замораживания эмбрионов крупного рогатого скота при использовании смеси криопрогекторов глицерина с 1,2-пропандио-лом на ФБС, что дает возможность сократить процесс криоконсер-вирования в 10 раз по сравнению с традиционным методом и исключить дорогостоящую аппаратуру.

Реализация результатов исследований

Результаты исследований внедрены в центре по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных (ВШ) и подтверзде-ны положительным решением по заявке на изобретение й 4909691/1313832 от 12 февраля 1991 г.

Апробация работа. Результаты исследований докладывались на ежегодных производственных совещаниях по трансплантации эмбрионов, на конференциях молодых ученых при Всесоюзном научно-исследовательском институте (Дубровицы, 1989, 1990).

Объем работы. Диссертация-изложена-на -122 -страницах кашно-писного текста. Состоит из введения, обзора литературы, результатов и собственных исследований, выводов и практических предложений. Иллюстрирована 19 таблицами и 19 рисунками. Список использованной литературы включает 199 наименований, в том числе 138 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ КССЛЭДОВАНШ

Исследования по усовершенствованию технологии криоконсерви-рования эмбрионов крупного рогатого скота проведены в ВШе в период с 1988 по 1991 гг.

Эмбрионы получали от суперовулировавших коров, обработанных гормональными препаратами ФСГ (США), ФСГ отечественного производства - графолон, фоллитропин, фоллнкотропин (ЧСФР) и СЯК с антисывороткой нехирургическим методом. .

Морфологическую оценку проводили под лупой при 100-кратном увеличении или под инвертированным микроскопом "РЬо-Ьоаооп" при 400-кратном увеличении. Для криоконсервированкя отбирали эмбрионы с неповрежденными равномерны?® по толщине ополесцирую-щими оболочками, клеточный комплекс которых соответствовал воз- .. расту от оплодотворения до извлечения (7-8 дней). Биологически полноценными считали эмбрионы, имеющие правильную шарообразную форму, гомогенную светлую цитоплазму, неповрежденную оболочку,

одинакового размера бластомеры с плотним межклеточным комплексом. Морфологическую оценку жизнеспособности свежеполученньге и замороженно-оттаянннх эмбрионов проводили по пятибалльной шкале,, разработанной в ВИЕе.

Эмбрионы замораживали в растворе криопротектора 1,4 М концентрации глицерина на замораживающих устройствах "Planer" Н-204-, УОП-1, РПЗ, ЗПЭ, ЗЭМ-I и в газообразном азоте. Так же в качестве криопротектора использовали глицерин в сочетании с I,2-про дандиолом и замораживали в газообразном азоте. Все необходимые растворы готовили на фосфатно-солевом буфере Дюльбекко (®С).

В соответствии с методикой исследований эмбрионы были разделены на три группы. Первая группа - эмбрионы насыщали раствором 1,4 Ы концентрации глицерина в 4 этапа. Вторая - смесь криопротектора 25$ глицерина + 25$ 1,2-пропандиола и насыщали эмбрионы в два этапа. Третья - эмбрионы насыщали криопрогекторной смесью, состоящей из 20$ глицерина + 40$ 1,2-пропандиола в три ступени. Эмбрионы, насыщенные в растзоре 1,4 М глицерина, замораживали на программном замораживателе и в газообразном азоте. Скорость охлаждения - от,комнатной температуры до -7°С была 1°С/мин, кристаллизация и далее со скоростью 0,3°С/мин до -36°С, затем переносили эмбрионы в жидкий азот для хранения. Замораживание эмбрионов второй и третьей группы проводили методом витри-фякации, который осуществлялся в газообразном азоте. С помощьи температурного датчика укладку паетт с эмбрионами устанавливали в газообразном поле жидкого азота на уровне температуры -60-65°С и наблвдали как криопротектор принимал стекловидное состояние, т.е. застывал без образования кристаллов, данное состояние наступало через 1,5-2 мин. В течение 10 мин выдерживали на данном уровне газообразного азота, а затем погружали в жидкий азот на хранение.

Оттаивание замороженных паетт с эмбриона® проводили в водяной бане при температуре +37°С и +30°С в течение 8-10 секунд, это если биоматериал криоконсервирован в растворе криопротектора 1,4 М концентрации глицерина. Эмбрионы были замороженные в смеси растворов: 25$ глицерина + 25$ 1,2-пропандиола осуществляли отогрев при температуре +37°С, 20$ глицерина + 40$ I,2-про-

пандиола были оттаяны при температуре водяной бани +20°С в течение 3-5 секунд.

Отогретые паетты освобождали от маркерной пробки с одного конца, а с другого отрезали пыя и ее содержимое переносилось на часовое стекло, где проводили поиск и. морфологическую оценку эмбрионов. Жизнеспособные, пригодные для пересадки эмбрионы, использовали для трансплантации.

Выведение криопротектора из эмбриона осуществляли с помощью раствора сахарозы в 0,5 М (3-5 минут) и I М (5-10 минут).

После отмывания эмбрионов от криопротектора и морфологически оцененных их помещали в паетты и пересаливали реципиентам. В качестве реципиентов использовали телок черно-пестрой породы в возрасте 16-18 месяцев с живой массой 350-380 кг. Телкам -реципиентам по спонтанной и синхронизированной охоте в день гормональной обработки вводили фронтально тетравит в дозе 5,0 мл.

Полученные" экспериментальные ..даншге_,__ подвергали статистической обработке по методике Л^р^ьевой Е.К. (1970) с помощью X2, предложенного К.Црисоном.

Экспериментальную работу проводили в соответствии со схемой исследований.

СХЕМ ИССЛЕДОВАНИЙ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. влияние биологических факторов на жизнеспособность эмбрионов при криоконсервированзш

Морфологическая оценка состояния зародышей является одним из основных методов комплексной оценки в производственных условиях. Ее цель - отбор пригодных для замораживания и трансплантации эмбрионов, выбраковка дегенерированннх зародышей и вкявле ние аномалий в их развитии. Решающее значение в оценке качества трансплантируемых замороженно-оттаянных эмбрионов имеет их жизнеспособность, проверяемая культивированием вне организма или пересадкой реципиентам.

Показатели морфологической оценки очень ваяны, потому что видимая морфологическая разнокачественность является показателем внутренней физиологической ж биологической неполноценности зародышей. Особое внимание обращают на колебание объема эмбрионов, их форму, целостность, состояние прозрачной оболочки и протоплазмы. Критерий - уровень дробления - особенно важен, так как отставание в тешах развития в 90% случаев свидетельствует о начальных стадиях дегенерации эмбриона.

Биологически полноценными считают эмбрионы, тлеющие шаре образную форму, гомогенную цитоплазму, неповрежденную прозрачную оболочку, одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным контактом и должны соответствовать по уровню дроблен® возрасту от момента оплодотворения до их извлечения.

Нормальные морулы имеют форму сферы. Удваивание числа бластомеров в морулах происходит каждые 24 часа. Степень дроблг ния эшрионов в ранний период развития может быть обусловлено растянутостью овуляции. У некоторых морул отдельные клетки могут выпячиваться в паревителзшовое пространство, на их поверхности допустимы небольпше пузырьки.

Исследования показали, что жизнеспособность и пркживляе-иэсть эмбрионов крупного рогатого скота после замораживания -оттаивания и пересадки зависит от морфологического состояния и стадии развития (табл. I).

Данные таблицы I показывают, что с увеличением процента жизнеспособных от числа замороженных эмбрионов (морулы 89,3$,

ранние бластоцисты 79,4$ и поздние бластоцисты 99,1$) увеличивается и процент стельности от числа пересаженных (31,2%; 45,3$ и 57,7%), соответственно.

Таблица I

Жизнеспособность и приживляемое« заиороженно-оттачнных эмбрионов в зависимости от стадии развития

Стадия развития

Показатель морулы бластоцисты

поздние ранние поздние

Заморожено и оттаяно эмбрионов 272 277 228

Пригодных к пересадке 243 220 226

Процент от числа замороженных 89,3х* 79,4 99,1

Количество пересадок 237 214 220

Стельных реципиентов 74 97 127

Процент стельности, 31,2** 45,3 57,7"

ХР<0,05; ХХР<;0,01

Для замораживания в производственны:-: условиях ml лсполь;о;.г-ли эмбрионы отличного, хорошего и удовлетворительного качества (табл. 2).

Таблица 2

Влияние качества заморояенно-отгаянных эмбрионов перед пересадкой на их приживляемоеть

Показатель

Замороженно-оттаянных эмбрионов Жизнеспособных после отогрева Процент сохранности Пересажено эмбрионов Стельных реципиентов Процент стельности

Качество эмбрионов (баллы)

отличные хоропие удовлет-

_вотжтелъни-.

29 419 329

28 389 286

96,6 92,8 83,9

28 389 286

22 190 86

78,6 48,8 30,1

Данные таблицы 2 показывают прямую зависимость принивля-емости от качества эмбрионов. Так, лри замораживании и оттаивании процент сохранности эмбрионов отличного качества соста-

вил 96,6%, хорошего - 92,8$ и удовлетворительного - 83,9$. Процент стельности от пересадки эмбрионов отличного качества составил 78,6$ и заметно.ниже при пересадке эмбрионов хорошего качества (48,8$; и удовлетворительного качества (30,1$;.

При замораживании и оттаивании эмбрионов на их биологическую полноценность, вероятно, может оказывать влияние соотношение в крови ФСГ и ЛГ на день обработки. Так, наблюдения показывают, что выживаемость эмбрионов имеет связь с типом го-надотропина и днем его введения (табл. 3).

Таблица 3

Низнеспособность и приживляемость замороженно-оттаянных эмбрионов в зависимости от дня обработки донора и типа гонадотропина

показатель

ФСГ (США)

Фоллитропин

день астрального цикла

9 -10

11-12 9-10 11-12

Заворожено и оттаяно эмбрионов

Пересажено эмбрионов Стельных реципиентов Процент стельности

76 56 45 75

76 56 45 71

35 22 18 26

46,1 39,3 40,0 36,6

Из таблицы 3 видно, что наибольшая приживляемость была при введении <*СГ производства США в дозе 36 мг на 9-10 день цикла по сравнению с 11-12 днями (46,1 против 39,3$), так же был Еыие и процент стельности - 40,0$ ка 9-10 день и 36,6$ при обработке коров на 11-12 день цикла.

В вриоконсервировании эмбрионов выделяют несколько этапов, каждый из которых отличается своей специфичностью друг от друга. Одним из таких факторов является продолжительность нахождения эмбриона в среде при подготовке его к замораживанию (табл.4).

Продолжительность хранения эмбрионов от извлечения до замораживания отрицательно сказывается на их жизнеспособность и приживляемость. После оттаиЕания и пересадки наивысший процент стельности реципиентов был 53,1$ при хранении эмбрионов до замораживания не более 2-х часов. С увеличением продолжительное-

ти хранения эмбрионов от извлечения до замораживания снижалась их жизнеспособность и приживляемость после пересадки. Из приведенного следует, что хранение эмбрионов более 2-х часов от извлечения до замораживания нецелесообразно..

Таблица 4

Влияние времени хранения эмбрионов в среде до замораживания на их жизнеспособность и приживляемость

Продолжительность хранения (час) до 2-х • 2-3 . 3-4

Заморожено и оттаяно 51

эмбрионов 60 43

жизнеспособных эмбрионов 49 62 31

Процент от числа оттаянных 96,1 91,1 72,1

Пересажено эмбрионов 49 62 31

Стельных реципиентов 2ST "28-

Процент стельности 53,1х 45,2 22,5:

ХР <0,05; ХХРС0,01.

3.2. Воздействие физико-химических процессов на криоконсервирование эмбрионов крупного рогатого скота

Основным направлением данных исследований является поиск наиболее простых и экономичных, но в то же время эффективных методов замораживания и оттаивания зародышей, позволяющих максимально сохранять их жизнеспособность.

В основу входило изучение влияния режимов охлаждения с минусовых температур и замораживание в газообразном азоте на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов, а также определение эффективности применения различных типов программных замо-раживателей.

В качестве контроля при оценке замораживателей использовали замораживатель "Planer" R-204.

В первом варианте охлаждение эмбрионов от +20°С до -7°С проводили со скоростью 1°С/мин. При достижении -7°С вызывали искусственную кристаллизацию. После этого замораживание прово-

дшш со скоростью 0,3 °С/шк до -36°С и затем образцы переносила на ранение в жидкий азог.

•Во втором варианте паегты с эмбрионами помещали в камеру замораяивателя со стабилизированной температурой -5°С, выдерживали 10 минут, потом проводили искусственную кристаллизацию, далее охлаждали в режиме 0,5°С/мин до -36°С, а затем помещали эмбрионы в жидкий азот на хранение (табл. 5).

Таблица 5

Влияние режима охлаждения на жизнеспособность эмбрионов

Показатель Охлаждение от Охлаждение от

+20°С -5°С

Заморожено и оттаяно эмбрионов 63 64

Жизнеспособных эмЗрионов (п-$) 54-85,7 58-90,6

Пересажено эмбрионов 54 58

Стельцых реципиентов (п-&) 28-51,8 31-53,4

-Данные таблицы 5 показывают, что замораживание эмбрионов, начиная с минусовых температур, позволяет получить почти равные результаты сохранения жизнеспособности эмбрионов (85,7% против 90,6$) с пркживляемосгью при нехирургической пересадке 51,8$ и 53,4$ соответственно. Применение данного метода обеспечивает сокращение затрат рабочего времени с 2,5 ч до 2 ч на один цикл замораживания, что очень важно при работе в условиях практической трансплантации.

В настоящее время нашел применение способ замораживания эмбрионов в газообразном азоте. Для охлаждения применяется сосуд Дьвара типа СДС-2, универсальный штатив и камера из фтор-пласта.

Сравнительные испытания замораживания эмбрионов на мо-б:ш>ном задараживателе ЗЭМ-1 и в газообразном азоте без прог-реолыных замораживателей показали, что этот технологический прием может быть с равной долей успеха использован в условиях ферм (табл. 6.}.

Таблица 6

Жизнеспособность эмбрионов, замороженных в газообразном азоте

Показатель

Программный замораживатель ЗЭМ-1

Замораживание в газообразном азоте

Заморожено и оттаяно эмбрионов 112

Жизнеспособных эмбрионов 101

Процент от числа оттаянных 90,2

Стельных реципиентоБ 40

Процент стельности 39,6

112 98

87.5 42

45.6

При замораживании эмбрионов в газообразном азоте жизнеспособность. послеоттаивания сохранилась у 87,5% эдарионов и

получена стельность у 4572^рейипибятовг--~............."

Нами была исследована эффективность замораживания эмбрионов при использовании различных программных новых моделей отечественных заыораживателей У0П-1, ЗЭМ-1, ЗП, РПЗ в сравнении с мобильным замораживателем "Планер" в-204. Замораживание проводили по схеме от +20°С до -7°С со скоростью 1°С/мин, кристаллизация и далее со скоростью 0,3°С/ыин до -36°С и затем перенос в жидкий азот (табл. 7).

Проведенные испытания криогенной техники показали, что жизнеспособность эмбрионов после отогрева превышала контроль: ЗЭМ-1 - 90,2$; Ш - 92,3$; ШЗ - 92,0$ по сравнению с н_204 84,7$) и УОП-1 (85,9$). Стельность после пересадки замороженно-оттаянных эмбрионов составила 45,5$ при замораживании на 11-204 и 45,7$ при использовании РПЗ, соответственно.

Результаты сравнительных испытаний 5-ти моделей программных замораживателей показали, что любая из испытанных машин может быть использована с равной долей успеха в "практической криобиологии. Имеющиеся различия, вероятно, связаны с качеством эмЗрионов перед замораживанием.

Тейшзда ?

Жизнеспособность и пржашляеиость вибрионов крупного рогатого скота, завороженных на разных замораниватедях

Зашраяиватели

Показатель —-——--—-. --———

В-204 ГОП-1 'ЗЗИ-1 ЗП ' ШЗ

Заморожено и оттаяно эмбрионов 236 228 112 39 50

Жизнеспособных эмбрионов 200 196 101 . 36 46

Процент от числа оттаянных 84,7 85,9 90,2 92,3 Э2,0

Пересажено эмбрионов 200 196 101 36 46

Стельных реципиентов 91 91 40 13 21

Процент стельности 45,5 46,4 39,6 36,1 45,7

3.3. Криоконсервирование эмбрионов методом витрификации

Испытывали два метода - замораживание эмбрионов с цримене-кием криопротектора глицерина 1,4 М концентрации на программном зашраживателе со скоростью охлаждения от +20°С до -7°С 1°С/мин, при -7°С прозодили кристаллизацию и далее охлаждение осуществляли со скоростью 0,3°С/дан до -36°С, затем соломинки с эмбрионами переносили в жидкий азот;

- замораживание эмбрионов методом витрификации, включающий криопротекторы глицерин в сочетании с I,2-пропандиолом в растворе ФЕС в высоких концентрациях и охлаждение в газообразном азоте в течение нескольких шнут, а затем погружение в низкий азот. Замораживание осуществляли без программного зачоракива-теля, ко с применением специального устройства (табл. 8).

Данные таблицы 8 показывают, что процент выживаемости эмбрионов в контроле составил 92,3^ н был выше на 5,5$. Однако данный метод криоконсервирования может быть использован в трансплантации эмбрионов, так как процент выживаемости зародышей достаточно высок (86,8^).

Сравнивая схему двух процессов замораживания, приведенных

на рисунках I и 2, необходимо отметить, что метод витрификации позволяет сократить процесс во времени с 2.5 часов до 15 минут, т.е. в 10 раз.

Таблица 8

Жизнеспособность эмбрионов при замораживании ■ разными способами

Метод криоконсервирования

Показатель --——_—=—,---—

общепринятый зигрификация

Замотожено и оттаяно эмбрионов ~ 39 38

Низнйснособнш: эмбрионов 36 33

Процент выживаемости 92,3 - 86,8х

ХР => 0,05 ~~

Взд крпопрот'ектора его-концентрация-жез! да; ешсле-тл э:йрионов особое значение. Механизм защитного действия сводится к эффекту растворения солей, внутриклеточному замораживанию и стабилизации клеточных мембран. В практической криобиологии достаточно щроко используются проникающие в клетку крио-защитныэ вещества (днкекисульфоксид, глицерин, 1,2-пропандисл, этилен-гликоль ж др.), Одним аз основных требований к криопро-текторам является наличие низкой токсичности при высоких концентрациях н легкая дгф^узия в клетке, а текзэ массопереход из жидкого в твердое состояние и наличие мелких кристаллов в замерзшем состояние.

При смешивании двух растворов в первом случае 25$ глщор.:-на + 25$ 1,2-пропанднола на ФБС при з&мораяшзгнки выявлено, что уровень м&ссоперехода из жидкого состояния в твердое понизился в сравнении с отдельно взятым раствором и находился в пределах от минус 46°С до минус 54°С, и естественно уровень обратного перехода из твердого в жидкое состояние сдвигался от -24°С до -8°с. Сравнивая представленные графики, можно отметить отсутствие резкого выброса тепла при переходе в твердое состояние (рис. 3).

При замораживании смеси раствора криопротектсра, состоящего из 20$ глицерина и 40$ 1,2-лропандиола на ФБС, охлаждение

- I4t-

Pac.'I.. Схеьа общепринятого метода заморалсяванзя:

I - охлаждение; 2 - отогрев; 3 - кристаллизация; 4 - рекристаллизация«

ÍS JUUH -i, мин

Ряс.2. Схе:,а заморадззакля методом Езтрлфикацдз:

I - охлаядекие; 2 - отогрев; 3 - затзевценание; 4 - оттаисваше.

проводили до -76°С (рис. 4) и на всем отрезке замораживания не было эффективного выброса тепла, то есть раствор стал твердым без кристаллов. Теоретическая точка массоперехода из жидкого состояния в твердое находилась в пределах от -54 до -60 °С. При рекристаллизации зарегистрировано снижение уровня массоперехода из твердого в жидкое состояние на уровне температур от -28°С до -14°С. Наличие такого плавного перехода из одного состояния в другое способствует большей стабильности эмбриона, так как в данном случае не будет смещения клеточных структур зародыша при переходах раствора из твердого в гадкое состояние и наоборот.

Однако криопротекторы, хотя ограничивают и предотвращают криоповреждения, могут и сами поврездать клетки эмбриона посредством осмотических изменений. Исходя из этого, целью нашей работы было определить влияние глицерина и его сочетаний с 1,2-пропакдиолом на жизнеспособность эмбрионов после замораживания и оттаивания, а также установить оптимальное время насыщения их криопротектором. Данный процесс наблюдали под микроскопом " йк^оаооп " при 400-кратном увеличении, по реакции деформации оболочки эмбриона, которая изменяла свою сферу при выходе свободной воды.

Начало деформации оболочки зародыша наблюдали в криопротек-торной смеси 15$ глицерина + 20$ I,2-пропандиола на ФБС в течение первых 3 минут, с возвращением в первоначальное положение.

Цредельная деформация эмбриона при насыщении раствором 20$ глицерина + 40$ I,2-пропандиола на ФБС наступала через 5 минут, что свидетельствует об оптимальном времени насыщения.

Способ насыщения эмбрионов крупного рогатого скота криопротектором еысоких концентраций осуществляли двумя методами до конечных концентраций: I способ 25$ глицерина + 25$ I,2-пропандиола на ФБС и П способ 20$ глицерина + 40$ I,2-пропандиола на ФБС (табл. 9).

Процент выживаемости от числа замороженных, при насыщении 20$ глицерина + 40$ I,2-пропандиола на ФБС был значительно выше и составил 94,4$, чем в первом случае (80,0$).

Критерием эффективности замораживания эмбрионов при использовании высоких концентраций криопротекторов в результате витрификации является их жизнеспособность после оттаивания.

Рис.3.; Криопротектор 25$ раствора глицерина и 25$ 1,2-про-

i

пандаола: I - замораживание} 2 - отогрев.'

Pec.4. " Криопротекгор 2Q% раствора глицерина и 4Q% 1,2-пропавдиола: I - заморакивание; 2 » отогрев.'

Таблица 9

Жизнеспособность эмбрионов в зависимости от концентрации криопротекторов при Еигрификации

Концентрация раствора

Показатель ■—--—-

25$ глицерина + 20$ глицерина + 25$ 1,2-пропандиол 40$ 1,2-пропандио.ч

Заморожено и оттаяно эмбрионов 20 18

Жизнеспособных после отогрева 16 I?

Процент выживаемости 80,0 94,4"

ХР<0,05

Отогрев, лаетт проводила в водяной бане пр;: темпэратуре вс-д» +-20°С в опыте и в контроле +37°Стечение 5-8 секунд до ;. чезновения аморфного и твердого состояния. Культивирование доводили в фосшатно-солевом растворе Дшьбекко с добавлением 30 фетальной сыворотки теленка в термостате в течение 12 часов (табл. 10).

Таблица 10

Влияние температуры оттаивания на жизнеспособность эмбрионов при культивировании

Температура оттаивания Показатель _(+ Т°С)_

_20_37

Поставлено на культивирование 10 12 Количество развивающихся после

12 ч культивирования 9 8

Процент жизнеспособных 90,0 66,7

Результаты исследований показывают, что развитие эмбрионов в течение 12 часов было лучше при отогреве в водяной банз +20°С (90$), чем при+37°С (66,7$). При снижении температуры уменьшается осмотическое давление. Оттаивание паетт с эмбрионами в водяной бане при +20 °С оказывало более благоприятное влияние на их жизнеспособность.

После оттаивания эмбрионы' находились в высокотоксичном растворе криопротектора и для сокращения времени дегидротации зародыши помещали в 0,5 М, а потом и I М раствор сахарозы. Воздействие сахарозы в данной последовательности снижает пороговый перепад осмотического давления и ограничивает движение воды через мембраны клеток в течение диффузии глицерина и 1,2-пропандиола из эмбриона. Стельность после пересадки зародышей реципиентам приведены в таблице II.

Таблица II

Цриживляемость эмбрионов после реконсервации с использованием сахарозы

Показатель Раствор сахарозы_

I (М) 0,5 и I (М)

Пересажено эмбрионов 8 8

Стельных реципиентов 1.3

Процент стельности 12,5 37,5

Способ выведения криопротектора раствором сахарозы можно считать удовлетворительным, процент стельности во втором случае составил 37,5$ против 12,5$ при выведении криопротектор-ной смеси глицерина с 1,2-пропандиолом с помощью раствора сахарозы последовательно в 0,5 и I М концентрации. В итоге приведенных исследований можно отметить, что метод витрификации пригоден как способ криоконсервирования эмбрионов, при концентрации криопротектора 20$ глицерина + 40$ 1,2-пропандиола на ФБС. При наличии благоприятного исхода криоконсервирования эмбр! онов методом витрификации, сокращаются затраты на замораживание I эмбриона в сравнении с традиционным методом (табл. 12).

Данные таблицы 12 показывают, что при криоконсервировании эмбрионов методом витрификации можно сократить не только процесс замораживания во времени с 2,5 часов до 15 минут, но и материальные затраты и тем самым снизить себестоимость одного эмбриона с 235,20 рублей до 224,05 рублей, то есть примерно на 5%.

По результатам исследований разработано изобретение "Способ быстрого замораживания биологических объектов" (заявка

Таблица 12

Затраты при двух методах криоконсервирования

эмбрионов '

Показатель

Затраты на замораживание I эмбриона (руб)

традиционный

метод витри-Фикации

Стоимость аппаратуры 7,05 Процесс I цикла замораживания

(час) 3 0,25

Оплата рабочего времени оператора (руб) 3,94 0,66

Расход жидкого азота (литр) 10 2

Стоимость жидкого азота I 0,2

Количество потребляемой электроэнергии на I цикл охлаждения,

(квт) Г,5

Стоимость электроэнергии 0,02

Себестоимость эмбриона 235-20 224-05

Процентное соотношение себестоимости эмбриона 100 95,25

fö 490969I/I3-I3832 от 12 февраля 1991 г., авторы: профессор д.б.н. Сергеев H.H., старший научный сотрудник к.б.н. Мазепкин С.А., инженер Плаксеев A.A., аспиранты Сукачева Л.П., Федюш-кин А.Ф.), на которое получено положительное решение ВНИИГПЭ от 16 августа 1991 г. о выдаче авторского свидетельства.

ВЫВОДЫ

1. Эффективность пересадки занороженно-оттаянных эмбрионов зависит от иг качества до замораживания и после оттаивания. При пересадке эмбрионов отличного и хорошего качества можно получить 78,6$ стельности реципиентов. Для замораживания наиболее подходящими являются эмбрионы на стадии поздней морулы и ранней бластоцисты в возрасте 7-7,5 дней.

2. Замораживание эмбрионов, начиная с минусовых температур (-5°С) с использованием программных замораживателей можно использовать с равной долей успеха в практической криобиоло-

гии, обеспечивающие сокращение времени на цикл замораживания на 30 мин. Способ замораживания эмбрионов в газообразном азоте без программных замораживателей является простым и может быть использован особенно в условиях ферм и неустойчивого энергоснабзг ния'с высокой эффективностью.

3. Отечественные программные мобильные замораживатели РПЗ и ЗЭМ-I по своим техническим и технологическим параметрам не уступают своим зарубежным аналогам R-204 "Планер" и обеспечивают сохранение жизнеспособности у 92,0$ эмбрионов с прижнв-ляемостью до 45,7$ после пересадки.

4. Криопротйктор, состоящий из 20$ глицерина + 40$ 1,2-цропандиола на ФБС, является эффективным защитным средством при замораживании эмбрионов методом витрификации, обеспечивает сохранение жизнеспособности у 94,4$ эмбрионов. Оттаивание эмбрионов, замороженных данным способом, проводить в водяной бане при температуре -i-20oC в течение 6-8 секунд. Удаление криоцро-тектора осуществлять в два этапа с раствором сахарозы в концентрации 0,5 М и 1,0 М на ФБС в течение 5 минут.

5. Сокращение времени пребывания эмбрионов в питательяей среде может быть достигнуто быстрым их охлаждением в газообразном азоте до промежуточной температуры минус 60°С, а затем .путем погружения контейнеров с эмбрионами в жидкий азот«

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

I. Для снижения трудоемкости и затрат проводить криокон-сервирование эмбрионов крупного рогатого скота методом витрификации в газообразном азоте с неравномерным температурным полем -60°С. При оттаивании эмбрионов использовать водяную баню с температурой +20°С. Удаление криопротектора из эмбриона осуществлять раствором сахарозы в концентрате! 0,5 Ми 1,0 М последовательно в течение 3-5 минут.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Сергеев Н.И., Мазепкин С.А., Федюшкин А.Ф. Способы замора-^вшшя^скота // Зоотехния. - 1989, - Я II. - С.47-50.

2. Режимы заморакивания и оттаивания эмбрионов. Сергеев Н.И., Ыазепкин С.А., Федюшкин А.Ф., Алмарданов A.A. / Рекомендации по криоконсервированшэ эмбрионов крупного рогатого ско-

та. Дубровины. - 1990. - С.31-45.

3. Мазепкин С.А., Федюшкин А.Ф., Сукачева Л.П. Замораживание эмбрионов крупного рогатого скота / Сб. Проблемы развития биотехнологии в животноводстве. Дубровицы. - 1990. - С.59-61.

4. Федюшкин А.Ф., Мазепкин С.А. Жизнеспособность замороженно-оттаянных эмбрионов в зависимости от дня обработки и типа гонадотропина / Тезисы докладов Республиканской научной конференции (Достижения биотехнологии и перспективы их раз-

• вития). Львов. - 1991, - С. 42.