Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Металлсодержащие белки нитритвосстановливающей цепи Ps. Aeruginosa. Получение, физико-химические свойства и реакция с нитритом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Металлсодержащие белки нитритвосстановливающей цепи Ps. Aeruginosa. Получение, физико-химические свойства и реакция с нитритом"

»3 и ^ ■ >■-

АКАДЕМИЯ НАУК АРМЯНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

КАМАЛЯН МАРГАРИТА ГУРГЕНОВНА

УДК 577.112_|_579.841 -¡-631.461.4

МЕТАЛЛСОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКИ НИТРИТВОССТАНАВЛИВАЮЩЕИ ЦЕПИ PS. AERUGINOSA. ПОЛУЧЕНИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И РЕАКЦИЯ С НИТРИТОМ

03.00.04—Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН — 1 9 8 8

Работа выполнена в лаборатории физической химии белков Института биохимии АН АрмССР (директор Института—академик АН АрмССР А. А. Галоян)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Налбандян Р- М.

Официальные оппоненты:

Член-корр АН АрмССР, доктор биологических наук,

профессор Давтян М. А.

Доктор биологических наук, профессор Аколян Ж. И.

Ведущее учреждение: Ереванский ордена Трудового Красного Знамени Государственный медицинский институт (кафедра биохимии)..

Защита диссертации состоится «——»^^^1988 . г. в П 00

—--часов па заседании специализированного Совета

(Д 005.15.01) по защите' диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии АН АрмССР.

Адрес: 375044, г: Ереван, ул. П. Севака 5/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН АрмССР.

¡4

Автореферат разослан «--— т>= 1988 г.

Ученый секретарь

специализированного Совета, доктор ^чА. А. СИМОНЯН

* .а®4" /

биологических наук, профессор

Ьг /

к' -* ? 1 " „•

, ^а'зл' ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность тени. Денитрификация - это сложный биохимический процесс, приводящий в конечном итоге к изменению содержания азота в клетках и тканях. Различают два типа денитрифи-кации I) с образованием в качестве конечного продукта аммиака, при этом общее содержание азота растет за счет накопления белковой массы., 2) с образованием летучих азотсодержащих соединений из нитратов и нитритов, при этом происходит общее снижение содержания азота; именно этот процесс обозначается как "истинная " денитрификация.

Денитрификация происходит как в животных и растительных тканях, так и у микроорганизмов, В процесс денитрификация вовлекается ряд ферментных и белковых систем. Наиболее изучена денитрификация некоторых почвенных микроорганизмов, для которых показано, что она осуществляется благодаря наличию в них специальной электронтранспортной цепи, состоящей из ряда ме-таллопротеидов.

В последние годы наблюдается значительный интерес к изучению механизмов денитрификации, связанный, во-первых, с той отрицательной ролью, которую играют почвенные денитрификаторы в разрушении вносимых в почву азотных удобрений; во-вторых, с возможностью использования денитрифицирующих микроорганизмов и отдельных ферментов для очистки питьевой и сточных вод, загрязненных окислами азота; в-третьих, в связи о увеличением поступления в организм человека нитратов и нитритов с пищей, лекарственными средствами, а также в результате загрязнения окружающей среды, что остро ставит проблему защиты организма от токсического действия этих чужеродных соединений. Среди токсического действия нитратов и нитритов на организм животных можно выделить: I) нейротоксический эффект, связанный с' разрушением дофаминовых рецепторов и гипоксию мозга, 2) мет-гемоглобинемию, 3) канцерогенность. Известен также токсический эффект нитритов и на растительные ткани и микроорганизмы. Однако механизмы денитрификации в животных и растениях остаются практически неизученными.

Цель и задачи исследования. Денитрифицирующая система

микроорганизма (ЬеиЛ^гтьо^хаЛ aevu.gi.rvo-5-с^, особенно биохимия нитритвосстанавливающего участка, является наиболее изученной. В состав денитрифицирующей системы Л. агг^опо^си как известно, входят несколько Металлсодержащих белков и ферментов. Очистка этих компонентов, изучение их свойств и взаимодействия мевду ними являются необходимыми этапами изучения механизма денитрификации. Кроме того, вовлечение металлсодержащих белков и ферментов (в частности, медьсодержащих) в процесс денитрификации у микроорганизмов и обнаружение процесса "истинной" денитрификации в растениях определили значение исследования реакции нитрйта с медьсодержащими белками - переносчиками электронов из растительных объектов, В связи с вышеизложенным пе£ед Нами были поставлены следующие задачи:

1. Очистка компонентов денитрифицирующей (нитритвосстанавлива-ющей) Цепи СЬе-гидыъс^а- и изучение их физико-химических свойств.

2. Исследование взаимодействия нитрита с компонентами денитрифицирующей (нитритвосстанавливающей) цепи

3. Исследование взаимодействия нитрита с медьсодержащими белками - переносчиками электронов из растительных источников с долью поиска денитрифицирующих систем в растениях и выявления возможных звеньев токсического действия нитрита.

Научная новизна И Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований разработан метод одновременного получения семи меФаллсодержащих белковых фракций,(шесть из которых очищоны до электрофоретически гомогенного состояния) из денитрифицирующего микроорганизма . <х.<уии) ьп&ь-а,. Изуче ны физико-химические свойства .цитохромоксидазы (нитритредук-тозы), цитохромов с-551, с-55^ и азурина, позволившие выявить ряд особенностей их как медиаторов процесса восстановления интрига. Обнаружена реакция восстановления нитрита цитохро-мои с-551 и аэурином, показано влияние условий среды (рН, концентрации реагентов, ионной силы) изг эти окислительно-восстановительные реакции. Полученные результаты позволили предложить схему взаимодействия нитрита с терминальным участком нитритвосстанавливающей цепи. Рассмотрено также взаимодействие

- -

нитрита с медьсодержащими белками растении (плант&цианином, етеллацианином и пластоцианипом). Показано, что в случае этих белков нитрит также способен выступать как окислитель, однако л отличие от остальных изученных белков пластоцианин в присутствии шсоких концентраций ннтрича инактивировалси. Полученные результаты свидетельствуют о ы/згложной регуляторной роли нитрита в процессах денитрифшсацип в микроорганизмах и растениях.

Публикации и апробация работы. Основное содержание диссертации изложило в восьми печатных работах. Материалы диссертации докладывались на республиканской конференции "Макромоле-кули и (функционирование клетки" (Ереван, 1906), на III И 1У республиканских молодежных конференциях по физико-химической биологии (Агвераи, 1985 и Ереван, 198?), <5или представлены на 1-ой Всесоюзной конференции "Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах и их моделях" (Вильнюс, 1985).

Структура и об!.ем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитированной литературы. Первая глава посвящена обзору литературы по теме диссертации. Первая часть обзора включает литературу относительно токсического действия нитратов и нитритов на животные, растительные и микроорганизмы. Во второй части рассматриваются биологическое значение и типы денитрификации. В третьей части приводятся ли-' тературные данные об участии металлопротеидов в процессе денитрификации у микроорганизмов и в последней части литературного обзора приводятся данные о свойствах белков и ферментов нитритвосстанавливающей цепи O'-i. cvo'ui^ Ltvo} л-. Вторая глава содержит описание использованных в работе материалов и методов исследования, приборов и реактивов. В третьей главе приводятся результаты собственных исследований. В четвертой заключающей главе обсуждаются полученные результаты. В выводах сформулированы главные итоги проведенного исследования.

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 5 таблиц. Библиография включает 146 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Метода исследования

В работе использован штамм 3F0 3000 денитрифицирующих бактерий föiudotnofiaA amujinoia-, полученный из коллекции микроорганизмов Ин-та микробиологии AJI Арм.ССР. Культуру выращивали в анаэробных условиях на полусинтетической среде, описанной в работе Пярра и др. (фалг $. ft. ct id, 1976). Из 100 л культуральной среды обычно получали около 900 г влажной пасты бактериальных клеток. Содержание белка определяли по методу Лоури и сотр. (оСо-U/г^ O-Dt ttof.,1951), а для окрашенных белков также из общепринятых величин коэффициентов экстинкции характерных полос.поглощения в видимой области. Молекулярные массы белков определяли методом электрофореза в 10% Полиакриламидном геле (ПАЛГ) по Беберу и Ос-борну (ЦЛ&ыъ Ку Oibvui М-, 1969) и методом гель-фильтрации по Эндрюсу (dfukiiusi 9.) 1965). Содержание меди в белковых препаратах определяли методом химического анализа, основанном на спек-трофо т ом е три че с ком определении окрашенных комплексов меди со специфическим реагентом - тетраэтилтиурамдисульфидом согласно Матсу-ба и Такагаши {Jllatsul'ii J., tTakaluuiuJ/l^O). Кроме того, содержание меди было определено также методом двойного интегрирования спектров ЭПР. О гомогенности получен1шх белковых препаратов судили по форме эляционной диаграммы, полученной в ходе гель-фильтрации через сефадекси, по количеству белковых полос при аналитическом электрофорезе в % ПЛАТ, по Дэвису (00.1/м ß.J-, 1964), а также по спектральным индексам чистоты препаратов, представляющим собой отношение поглощений при 280 нм и характерной полосы в видимой области. Цитохромоксидазную активность определяли спектро-фотомегрически в 0,01 М фосфатном буфере при pH 7,0 в присутствии Ю-4 М ЭДГА, прослеживая уменьшение интенсивности d-полосы цитохрома с-551 из <Ä. ci&iwjinoiiX, либо по увеличению интенсивности полосы 630 нм азурина. Активность фермента выражали в виде числа оборотов в минуту. Супероксидцисмутазную (СОД) активность препаратов определяли по способности аликвотов этих растворов ингибировать реакцию восстановления питротетразолиевого синего супероксиднши радикалами согласно Нишикими и сотр. {tü-ihLhirrilМ.,1972), я также по методу Мисра и Фридовича Qxidovick- 2') 1972), ооиованному на ингибировании СОД реакции автоокисления адреналина в адронохром в щелочных средах. Ano-

азурии получали инкубацией препарата белка в присутствии 10 ыМ диэтилдитиокарбамата. От избытка хелатора.и связанной с ним меда освобождались гель-фильтрацией через сефадекс G -25 и последующей ионообменной хроматографией на КМ-целлмозе. Для получения тема cij и апо-белка (гем ¿-содержащей части цитохромоксидазы) использовали методики, описанные в работах Яманака и Окунуки ('Ijamatwla ^¡Okiuiuki Л, 1963) и Хилла, Варгана (ЗШ1 Ji.i., U'lhuitoпЗ.С.,1Э78). Восстановленные формы цитохрома с-551, азурина, илантацианина, стеллацианина и пластоцианина получали добавлением кристаллов дитионита к растворам окисленных белков с последующим удалением избытка восстановителя гель-фильтрацией через сефадекс. К восстановленным препаратам этих белков добавляли аликвоты определенных концентраций нитрита, раствор 0,005 М аммоний-ацетатного буфера с желаемым рН и другие необходимые добавки и прослеживали кинетики окисления этих белков по соответствующим полосам в видимой области. Влияние ионной силы прослеживали, варьируя содержание JVaCL в смеси. В специальной серии контрольных измерений было проверено влияние аэробных условий на кинетику окисления цитохрома с-551 и азурина нитритом. В связи с этим все последующие измерения проводились в аэробных условиях. В исследовашюм диапазоне рН не было обнаружено также заметного автоокисления азурина и цитохрома с-551, а также пластоцианина и плантацианина в отсутствие нитрита даже при очень высокой ионной силе (0,2 М J\T&CL), по крайней мере в течение времени, в котором проводили эксперименты (несколько часов). Кинетические данные для стеллацианина корректировались с учетом незначительного автоокисления этого белка. ЭПР спектры в виде первой производной регистрировали на приборе "В-4" фирмы "VaxttMi. ЯМР-спектры получены на спектрометре "WH-360" фирмы "Jhukei ". Оптические спектры записаны -на спектрометрах "-i^ucord М-40" и ",$ub«.art М-26".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нашей первоочередной задачей было получение уже известных и поиск новых металлсодержащих белков и ферментов в aczugi -noia. В основу разработанной схемы очистки была положена методика Парра и др. (9avi S,K.dd, 1976), модификация которой позволила нам получить одновременно 7 растворимых металлсодержащих белковых фракций из одного и того же экстракта клеток, 6 из этих

фракций были получены после дальнейшей очистки л алектро(}юрети-чески гомогенном состоянии.

В типичной процедуре очистки клетки <М. acnyinoja (250 г) суспендировали в I л 0,02 M К-фосфатного буфера, рН 7,0 при 4°С. Суспензию озвучивали на холоду и надосадочный раствор, полученный .после центрифугирования суспензии, подвергали дробному фракционированию сульфатом аммония, собирая фракцию, осавдипцуюсл между 45 и 100% насыщения. <>гот осадок суспендировали в минимальном объеме 0,02 M'К-фосфатного буфера, рН 7,0 и подвергали диализу против этого же буфера. После диализа экстракт подвергали гель-фильтрации через колошу с сефэдексоы (г -75 (тонкий), уравновешенным 0,02 M К-фосфатным буфером, рИ 7,0. Полученные (фракции анализировали но цитохромоксидазиуы, супероксидапсмутазную активности, а также на содержание меди. Кроме того, регистрировали спектры поглощения основных фракций в видимой области. Типичная элкционная диаграмма приведена на Рис.1. Фракции, имеющие характерное для цитохромоксидаэы поглощение в видимой области (эта же фракция имела супсроксидцисмутазную активность), собирали, разбавляли вдвое водой и наносили на колонку с целлюлозой DE-52, уравновешенной 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,4. Эта процедура позволяет избавиться от примесей белка с каталазной активностью. Фракции цитохромоксидаэы диализовали против 0,002 M буфера, рН 7,4, и вновь подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозе ТЬЕ-52, уравновешенной 0,01 M К-фосфатным буфером, рН 7,4. Колонку промывали линейным градиентом фосфатного буфера от 0,01 M до 0,1 M общим объемом 200 мл, Цитохромоксидазные фракции объединяли, рН объединенной фракции приводили к 6,4 с помощью 0,01 M КН2РО4 и подвергали хроматографии на целлюлозе И,1-32, уравновешенной 0,01 M фосфатным буфером, рН 6,4. Формирующуюся в'верхней части колонки полосу зеленого цвета элюировали 0,05 M буфером, рН 6,9. Последующая хроматография на колонке с сифадексом &-ID0 (сверхтонкий) приводила к олектрофоретически гомогенному препарату цитохромоксидаэы со спектральным индексом чистоты ^jq/A^qq, равным 1,17. На протяжении всех стадий очистки препарат цитохромоксидаэы проявлял также СОД-активность, которая сохранялась и у електрофоретически гомогенного препарата, что указывает на наличие у % цитохромоксидаэы еще одной активности - супероксиддис-мутазной, которая однако в работе подробно не изучалась.

Фракции, содержащие цитохром с-551 и азурин, полученные при гель-фильтрации исходного экстракта, объединяли, приводили рН к 4,1 с помощью 50%-ой уксусной кислоты и после удаления образовавшегося осадка центрифугированием надосадочный раствор адсорбировали на колонке с целлюлозой СМ-32, уравновешенной 0,05 М ашо-

Рис.1. Разделение экстракта клеток аъгид'игоях, на колонке (3x80) с сефадексом О -75 (скорость алюирования 100 мл-ч): ци-тохромоксидаза (а), цитохром с-553 и Уе.-супероксиддисмутаза (б), новый медьсодержащий белок (в), азурин (г) и цитохром с-551 (д).

ний-ацетатным буфером рН 4,1. Цитохром с-551 элюировали буфером с рН 4,45 (400 мл), а азурин - буфером с рН 4,65 (300 мл). Оба белка в отдельности концентрировали при помощи целлшозы СМ-32, элюируя буфером с рН 6,0 после исчерпывающего промывания буфером с рН 4,1. Цитохром с-551 после гель-фильтрации через сефа-декс О -25 (сверхтонкий) при электрофорезе в 7% ПААГ обнаруживал одну полосу и имел, спектральный индекс чистоты А551/А280 1,14 для восстановленного препарата. Тель-фильтрация азурина через колонку с сефадексом Сг -50 (сверхтонкий) приводила к электг трофоретически гомогенному препарату со спектральным индексом-а63(Уа280 = Однако он содержал низкомолекулярную примесь, шглощаыцую при 410 нм и создающую дополнительный фон при флуоресцентных исследованиях. Для очистки от этой примеси использо-

- G _

вали дополнительную хроматографию на целлюлозе Ъ Е-52. При этих условиях азурин элюируется несколько быстрее, что позволило отделить от него гемовую примесь. Благодаря описанному методу удалось получить препарат азурина со спектральным индексом 0,62, пригодный и для флуоресцентных исследований. Этот препарат, по-видимому, является наиболее очищенным из всех описанных до настоящего времени препаратов азурина.

Фракции, содержащие цитохром с-553 и СОД-активность объединяли, разбавляли вдвое водой и подвергали ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой DE-52, уравновешенной 0,01 M К-фюсфатным буфером, pH 7,4. При этих условиях цитохром с-553 адсорбировался на вершине колонки, а фракция с СОД активностью элюировалась без задержки. Цитохром с-553 элюировали 0,2 M буфером и далее подвергали гель-фильтрации через колонку с сефадек-сом О -75 (сверхтонкий), собирая гемсодертащую фракцию. Полученный препарат был электрофоретически гомогенным и имел спектральный индекс чистоты A2gQ/A553 = 9,6.

Фракция с СОД-активностью (Рис.1), не связанной с цитохром-оксидазой, представляет собой железосодержащую сулероксиддисмута-зу. В ходе очистки кроме азурина была обнаружена еще одна медьсодержащая фракция (Рис.1), оказавшаяся новым медьсодержащим белком СJuviapxtiav> (I.V., JlamatùMi- ГП.(г;71а1Ьлс1у(т/Ш.,1986). Поскольку изучение этих двух белков выходило за рамки поставленной перед нами задачи, их дальнейшая очистка и свойства в данной диссертации не рассматриваются.

Белковые препараты хранили при -Ю°С в течение нескольких месяцев без потери активности и заметного изменения свойств. Ев-хода белков'приведены в Таблице.

Физико-химические свойства полученных белков.

т^ • Выход из Молск. Простетичсскпя

iUK 250 г пас- масса группа

ты, мг

icxiL

GQClJ

Цитохромоксидаза 180 . 120 . Гем с (2) и

( 60 кДа х 2) гем gr (2)

Цитохром с-553 50 ( 50 Гем cj (!)

Азурин 160 16,6.(1) Си-(II) (I)

Цитохром с-551 70 8,1 (I) Гем ç (I)

Основиие физико-химические характеристики полученных белков.

ГГолучешше из atxuqLiwbvu два цптохрома типа с различаются преаде всего по своим молекулярным массам, оптическим свойством, однако оба белка содержат только по одному гему типа с. Они различают»? по максимуму локализации dL -полосы (соответственно при 551 и 553 им). В отличие от цитохрома с-551 восстановленный цитохром с-553 при попытке удаления остатков восстановителя (дитионита) гель-фильтрацией через сефадекс подвергался мгновенному автоокислению.

Цитохромоксидаза из u&.cum^uwio. представляет собой 2-ге-мовий цитохром, содержащий геиы типа с и dj- (цитохром ct/j), о чем свидетельствуют его оптические спектры в окисленном и восстановленном состоянии (Рис.2). Молекулярная масса фермента, определенная методом гель-фильтрации (120 кДэ) и методом электрофореза в ДДС-ПЛАГ (60 кД^),свидетельствует, что фермент состоит из 2 идентичных (по крайней мере по молекулярной массе) субъеданиц. Обработка фермента кислим ацетоном приводит к удалению из белковой части только гема d^, тогда как гем с остается в связанном с белком состоянии. Фракция цитохромоксидазы на всех'этапах очистки обладает определенной СОД-активностью. Электрофоретически чистый препарат фермента также обладал СОД-активностью, что позволило предположить, что .цитохромоксидаза помимо уже известных для нее цитохром с оксидазной и нитритредуктазной активностей обладает также СОД-активностью. Добавление цитохромоксидазы приводило к 50$-"ому ингибированию образования формазана при концентрации фермента 4-Ю-8 М, то есть ее СОД-активиость была на порядок ниже активности Са,£а-С0Д и, по крайней мерз, равна (если не более активна), чем Jc - или .Ml-содержащие супероксвд-дасмутазы из различных источников (6lcLrtd, С 3-(flj|att Оге^ог.^ iS%3 ). Оксидазная активность фермента со-

ставляла 120 об-мин"** при использовании в качество субстрата азурина и 90 об-мшГ1 для другого субстрата цитохрома с-551.Тем самим можно заключить, что цитохром с-551 и азурин являются аль-Т0пнахив1шми субстратами для цитохромоксидазы азурин

цитохромоксидаза ■—у 0о

цитохром с-551^

(11«)

Рис.2. Спектры поглощения цитохромоксидаэы (А), цитохро-

ма с-551 (Б) и азурина (С). - окисленная форма,

--- восстановленная форма.

хотя азурин и имеет примерно на 30% более высокую активность как субстрат, чем цитохром с-551. Можно поэтому с равным и даже большим правом называть фермент не цитохромоксидазой, а азуриноксидэ-

зой. Поэтому в работе азурин, как потенциальный более важный субстрат цитохромоксидазы, был изучен более подробно.

Характерный для нотивпого азурипа спектр в видимой области (Рис.2) наблюдается в диапазоне рН 3,0-7,5. Выше и ниже этих значений рН происходит быстрое обесцвечивание азурипа. Наблюдающиеся при рН<2',0 изменения формы сигнала ЭДР азурипа были обратимы (обратное титрование щелочью до рН 5,5 вновь приводит к аксиальному сигналу). С другой стороны, изменения формы при рН 13,0 были необратимы при обратном титровании до рН 5,0. Однако добавление феррицианида к щелочному раствору азурипа вновь приводит к появлению сигнала аксиальной формы. Помимо этого, появляется еще один сигнал ЭПР, представляющий собой синглет с л Нт равным-20 э в о -фактором, 2,008. Этот сигнал значительно сильнее насыщается СВЧ-мощностыо, чем сигнал меди (Рис.3). На основании этого ¿[акта, а также параметров сигнала ЭПР данного сигнала можно заключить, что он принадлежит свободнорадикальному состоянию одной из функциональных групп белка. Интенсивность этого сигнала не изменялась при увеличении концентрации феррицианида от 1СГ* до 10~2 ¡.1, но увеличивалась с увеличением концентрации белка. Аналогичный сигнал, однако значительно меньшей интенсивности наблюдался после добавления феррицианида к раствору белка при рН 10,0. Добавление феррицианида к раствору азурина при рН<2,0 приводило к исчезновению сигнала меди. При этом никакого сигнала с д = 2,008 не возникало (Рис.3).

Происшедшее при рН < 2,0 обесцвечивание белка не связано с восстановлением меди, т.е. медь остается двухвалентной (парамагнитной), поскольку сигна. ЭПР в этих средах имеет такую же интегральную интенсивность, как и в нейтральной среде, хотя форма сигнала, т.е. окружение меди в сильнокислой среде существенно отличается от формы сигнала в нейтральной или слабокислой среде. Изменения оптических и магнитных свойств азурина при изменении рН могут происходить как за счет локальных вменений в окружении меди, так и за счет индуцируемых рН изменений во коричной или третичной структуре белка, которые далее приводят к измене-

ниш непосредственного окружения меди. Происходящее в щелочных средах обесцвечивание азурипа также связано не с восстановлением меди, а с измененном ее окружения. Как установлено, ато изменение окружения обратимо не при обратном титровании кислотой, а при одновременном добавлении окислителя. Таким образом, после щелочной обработки окружение меди возвращается к характерному дли нативнсго состояния только после окисления какой-то функциональной группы. Аналогичная реакция с феррицианидом была описана

гаоа зооо эгооv заоо

ъш

Рис.3. ЭПР-спегсгри азурина. I - при pli 2,5-6,0; 2 - к раствору азурипа при рН 2,0 добавлен феррицианид; 3 - при рН 13,0; 4 -образец 3 после приведения к рН 5,0; справа - добавление феррициа-нида к раствору азурина при рН 13,0: (верхний) - часть спектра ЭДР белка в высоких полях при СВЧ-мощности 120 мВт и 3 мВт (нижний), усиления подобраны таким образом, чтобы нормировать сигнал меди. Спектры записали при амплитуде модуляции 6,3 гаусса, постоянной времени 0,3 с и СВЧ-мощиости 10 мВт.

ранее для шшстоцианина ( 0газойли 1974). Поэтому

можно было предположить, что имеется по крайней мере одна общая груша в окружении этих двух белков. Действительно, сравнительные ЯМР и рентгеноструктураие исследования этих белков показывают, что общими аминокислотами в окружении меди ъ этих, двух "синих" медьсодержащих белках являются кроме лигандных (2 цистешш, I гистидин, I ыатионин) также тирозин, триптофан и фенцлалаиин. Таким образом, хотя имеется несколько альтернативных групп, ко-

торые могли бы переходить в свободпорадикалыюе состояние при их окислении, представляется наиболее вероятным, что оно возникает на цистеине или ароматических аминокислотах. В любом случае эта функциональная группа оказывается вовлеченной в процесс внутримолекулярного переноса электрона в азурине, Именно при участии этой группы осуществляется перенос электрона в ходе рэдокс превращений азурииа. Полученные к настоящему времени результаты позволяют считать, что такая же группа имеется и в других "синих" медьсодержащих белках, в частности, из растений. Таким образом, эти результаты позволяют сделать обобщающее предположение о значении органической функциональной группы для переноса электронов не только в азурине, но также в других "синих" медьсодержащих белках. Окончательная идентификация этой группы в будущих исследованиях представляется исключительно важной задачей, поскольку в ходе переноса электронов в белковых окислительно-восстановительных цепях активные центры, подвергающиеся попеременным редокс превращениям, непосредственно друг с другом не взаимодействуют и, следовательно, металлы, входящие в их состав, не могут непосредственно передать электрон друг другу. Этот перенос электронов между центрами осуществляется при участии белковой группы или групп органической природы, которая скорее всего представляет собой боковую цепь одной из аминокислот.

При использовании в качестве терминального акцептора электронов нитрита вместо кислорода, цитохромоксидаза будет функционировать как нитритредуктаза, восстанавливая его до ЖО

В связи с этим перед нами была поставлена следующая основная задача: выяснить, не могут ли промежуточные переносчики нитритвос-станавливагацей цепи также окисляться нитритом без участия фермента, нитритредуктазы, или же единственным местом взаимодействия нитрита с цепью является этот фермент.

Результаты исследований показали, что восстановленные азу-рин и цитохром с-551 способны окисляться нитритом.' Следовательно','. йомимо своего взаимодействия с терминальной нитритредукта-зой, нитрит может "вмешиваться" в перенос электронов на более

Азурин Цитохром с-5Ь+

ранних этапах и тем самым уменьшать поток электронов к нитритре-

дуктазе. Иначе говоря, нитрит, акцептируя электроны от промежуточных переносчиков электрона, сникает уровень нитритредуктаз-ной активности цепи. Возможно, в этом и заключается один из механизмов регуляции нитритом денитрификации.

Следует подчеркнуть, что добавление нитрита или нитрата к окислошшм азуршгу и цитохрому с-551, а также нитритредуктазе не оказывало влияния на оптические и магнитные свойства всех этих белков. Било рассмотрено влияние факторов среды на окисление азурина и цитохрома с-551 нитритом. В нейтральных средах скорость окисления этих белков била незначительной, однако с уменьшением рП она резко возрастала, достигая при рН 4,0 значений, не измеряемых методами стационарной кинетики. При одинаковом значении pil скорость окисления нитритом зависела также от концентрации реагентов (как нитрита, так и белка). При этом суммарная реакция может быть записана следующим уравнением: JVO/ + Си- (азурин) + 2H+-^JV0f+ C,tJr+ Н20 JVQjT '(цитохром с-551) Mî+ït?**+ HgO

Эти уравнения естественным образом объясняют влияние рН на скорость реакции (Рис.4). Так, уже при рН 5,0 2,5-1СГ2 M нитрита практически полностью окисляют 0,11*10^ M азурина или 0,12 «ПТ^М цитохрома с-551 примерно за 2 минуты. Проведение реаюиш в более кислых средах позволяет избежать использования больших избытков нитрита над белком, приблизить соотношение реагентов к стехиомет-рнчесюш. В диапазоне концентраций нитрита 10"% - 5*1СГ^М скорость окисления цитохрома линейно зависела от концентрации нитрата. В случае азурина линейная зависимость наблюдалась в пределах 10~~ - 5>1СГ2 M нитрита, при более высоких его концентрациях происходило отклонение от линейной зависимости. Это отклонение, вероятно, отражает неспецифическое воздействие ионной силы^на скорость окисления азурина нитритом. Как было обнаружено, высокая ионная сила оказывает стимулирующее влияние на окисление азурина. В случае цитохрома с-551 такого эффекта ионной силы не на-блвдалось, не отмечалось также иигибирования реакции при высокой ионной силе. Сравненир скоростей окисления азурина и цитохрома При одинаковых условиях (рН, ионная сила, концентрация-белка и нитрита) в диапазоне сохранения линейной зависимости окорости от концентрации нитрита позволяет заключить, что скорости окисления этих электронных переносчиков нитритом примерно одинаковы.

Рис.4. Влияние рН на окисление цитохрома с-551 (А) и азурина (Б) нитритом. А - концентрации нитрита и белка составляют 2,5-10"% и 0,23-КГ^ М соответственно, Б - концентрация нитрита и белка соответственно - 2,5-Ю-1 м и 0.42-1СГ4 И.

Однако требовал анализа вопрос, почему в случае азурина ионная сила стимулирует окислопие, тогда как в случае цптохрома она не влияет на окисление. В работе высказано предположение, что эффект ионной силы отражает особенности распределения зартда вблизи нитритсвнзивающего участка поверхности белка. В рамках этого предположения положительный эффект ионной силы означает, что ней-трализацин (экранизация) зарядов на поверхности облегчает перенос электрона от белка нитриту. Не исключено однако, что существенна также экранизация внутренних, а не только поверхностных зарядов.

Так как азурин и цитохром с-551 являются однозлектронними переносчиками, кокно предположить, что продуктом их реакции с нитритом должна быть окись азота. На это указывает, в частности, спектр поглощения продуктов реакции. Вайю отметить, что нитрит не вызывает каких-либо необратимых изменений в белковой части этих электронных переносчиков, поскольку ни спектральные, ни магнитные (ЭЛР, ЯМР), ни кислотно-основные свойства белков после обработки нитритом при рН 4,0 - 7,5 не отличались от характеристик нативиых окисленных белков, которые не подвергались обработке нитритом. В исследованном диапазоне рН не наблюдалась реакция диазотирования с азурином или цитохромом с-551. Так, нам не удалось обнаружить сколько-нибудь заметной модификации этих белков, судя по их хроматографическим свойствам и ЯМР данным.

На наш взгляд, значение обнаруженной окислительно-восстановительной реакции нитрита с азурином и цитохромом с-551 состоит в том, что эти электронные переносчики денитрифицируадей цепи ранее не рассматривались как компоненты, способные взаимодействовать с нитритом, являющимся терминальным акцептором электронов цепи. Полагали, что их роль состоит только в переносе электронов к цитохрому с(Х[ (нитритредуктазе). Согласно имеющимся представлениям компонентом, непосредственно взаимодействующим с нитритом внутри нитритредуктазы, является гем ^, тогда как гем с играет роль акцептора электронов от цитохрома с-551 и азурина. Таким образом, электроны в нитритредуктазе идут от гема с к тему О^ и далее на нитрит. Приведенные доказательства того" что восстановленные цитохром с-551 и азурин способны также окисляться нитритом, позволяют нам предложить следующую более' общую схему организации терминального участка нитритредуктазной цепи в

- 17 -

денитрифицирующих бактериях асгидспеэ-а.

I

азурин] х

__' 'V

гоц а1 | —- ]\[()1

цитохром с-5511 \

Согласно этой схеме нитрит может выступать ¡сак акцептор электронов не только для тема нитритредуктазн, но и для цитохрома и азурина. Азурин и цитохром с-551 восстанавливаются предшественниками и способны также передавать электроны друг другу и тему с нитритредуктазы.

В связи с полученными данными заслуживает внимания тот факт, что процесс денитрпфикации в системе т. т/Кл-О и в лизато клеток имеет оптимум рН в слабокислой области. Тем самым, не исключено , что и в системе 1а \zivo при высокой концентрации нитрита становится возможным взаимодействие нитрита не только с цитохро-мом сс^. но также и с такими компонентами денитрифицирующей цепи, как цитохром с-551 и азурин. Кроме того, известно, что после лизиса бактерий денитрифицирующие ферменты, а значит и белки - переносчики электронов, иммобилизуясь в почве, продолжают процзсс денитрификации уже после гибели бактерий.

Б связи с результатами, полученными дта азурина о способ- _ • ности нитрита окислять его восстановленную форму, представилось целесообразным изучить взаимодействие нитрита с другими "синими" медьсодержащими белками, в частности, из растений, поскольку растения (по крайней мере некоторые из них) также содержат системы "истинной" денитрификации [Ъыиь V., Зкст^иг^.Ь.ДЭВб, Ияоухгькл' Cíttou7 J.0.й/1984). Кроме того, из растений получен целый ряд "синих" медьсодержащих белков с одним атомом меди, то есть напоминающих азурин, роль которых еще не установлена. К ним относятся плантацианин и стеллзциаиин. Кроме того, к этой группе "синих" белков относится также пластоцианин, функционирующий^в

качестве электронного переносчика так называемой "промежуточной" электронтранспортной цепи, связывающей две фотосистемы растений. Имеются косвенные данные о возможной роли плантацнанина в системе нитритредактазы растений ( Ног¿¿-^¿сых- Л.М., сС о1.) 1985). Мы исследовали влияние нитрита па ряд "синих" медьсодержащих белков из растений: пластоциашшы из шшшата и мари, стеллацианин и плантациашш из кожуры огурца. Из всех исследованных белков наиболее близким по свойствам к азурину является пластоциатш. Так, он имеет спектр ЭИР, практически совпадающий по форме со спектром азурина. Кроме того, ЯМР и рентгеноструктурпые данные [Сйл~ Ьсхл О'. IV'., с! а£.; 1984; ^гсетаа КС., с I а£., 1978; 6'о1'тш1 УМ.

аХ-) 1978; Оим ], М., '¿геетал Ж1^1983 ) указывают, что ок-рукение меди в' этих двух белках практически аналогично. Поэтому представилось интересным сравнить особенности взаимодействия этих белков с нитритом.

Добавление нитрата в 1000-кратном и большем молярном избытке, как и в случае азурина и цитохрома с-551, не приводило к окислению этих белков, нитрат не изменял и оптических спектров окисленных белков. Нитрит также не влиял на оптические спектры окисленных алантацианина и стеллацианина. В то же время добавление нитрита к восстановленным (обесцвеченным) формам белков приводило к развитию синей окраски (поглощение в области 600 нм). Из этого эксперимента можно заключить, что нитрит окисляет восстановленные формы этих белков. Шло исследовано влияние рН, ионной силы, концентрации реагентов на скорость окисления, которое было аналогично влиянию этих факторов среды на скорость окисления нитритом азурина.

Проведенные исследования показали, что восстановленные плантациашш и стеллацианин ведут себя в реакции с нитритом подобно азурину. Однако реакция нитрита с шшеюцнапином из обоих источников была"более сложной, чем с азуршюм, плантациашшом или стеллациашшом.' Добавление нитрита к восстановленному пластоциа-нину вначале вызывало окисление этого белка, как 1! в случае с другими изученными белками с одним атомом меди. Одна ¡со более продолжительная инкубация пластоциашша с нитритом приводила к обесцвечиванию окисленных препаратов (Рис.5). Изменение формы и параметров сигнала ЭПР реакционной смеси в течение этих двух стадий (окисление гогастоцианина и его дальнейшее обесцвечивание)

I

2700 3000 \ / 5300

Рис.5. А - окисление и последующее обесцвечивание восстановленных пластоцианинов (I) из шпината, 8 КГ М и (2) мари,

9 1СГ5М в присутствии нитрита, 5 10Г% при рН 4,0.

Б - измененио ЭПР спектра восстановленного пластоционшш из шпината при инкубации с нитритом. 1-восстановленный препарат, 2-после 2минутной инкубации с нитрйтом при рН 5,5; 3-после 2-часовой инкубации. Спектры записаны при амплитуде модуляции

10 гаусс, постоянной времени 0,3 сек и СВЧ-мощности 10 мВт.

доказало, что к концу первой стадии пластоциании полностью окисляется, тогда как на второй стадии происходит инактивация окисленного белка (Рис.5). Таким образом, нитрит при дальнейшей инкубации с пластоцианином вызывает инактивацию окисленной формы этого белка, прослеживаемую по характерному ЭПР спектру. Действительно, добавление нитрита к окисленным пластоцианинам из обоих источников приводило к их инактивации. Это обстоятельство выделяет пластоцианин в ряду "синих" медьсодержащих белков с одним атомом меди, изученных в работе, поскольку окисленные формы стеллацианина, плантацианина и азурина не претерпевали каких-либо изменений под влиянием нитрита. По-видимому, в пластоцианинах содержится вблизи медного центра группа, способная вступать во взаимодействие' с нитритом. Среди наиболее вероятных групп ¿-аминогруппа лизина, триптофан и аргинин, которые способны в кислой среде подвергаться модификации нитритом, в частности, в результате протекания реакции диазотирования, которая является необратимой и ведет к изменению окружения меди. Предполагается, что инактивация пластоцианина и является одним из путей проявления токсического действия нитрита на растения, выражающееся, в частности, в резком снижении под его влиянием активности фотосинте-."»пческого аппарата.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика одновременного крупномасштабного получения из денитрифицирующих бактерий <%. аьш^ыьоуа. в высоко-очищенном состоянии 6 растворимых металлсодержащих белков и ферментов.

2. Изучены физико-химические свойства нитритредуктэзы, азурина, цитохромов с-553 и с-551 и осуществлена реконструкция lit uihо терминального участка нитритвосстанавливающей цепи. Показано, что помимо нитритредуктазы, цитохром с-551 и аэурии таете способны окисляться нитритом. Изучено влияние рН, ионной силы, концентрации реагентов на эту реакцию.

3. На основании полученных данных предложена схема переноса электронов в терминальном участке нитритвосстанавливающей цо-пи Si, (XVluAjiM-yu, , согласно которой нитрит взаимодействует не только с терминальным ферментом, но также способен акцептировать электрон с промежуточных электронных переносчиков. Эта схема позволяет также объяснить ингибирование дснит-рификации высокими концентрациями нитрита.

4. Изучена реакция с нитритом "синих" медьсодержащих белков -переносчиков электронов в растениях: плантацианина, пласто-цианина и стеллацианина. Показано, что нитрит также способен окислять восстановленные формы этих белков и реакция характеризуется теми же особенностями, которые отмечались для реакции азурина с нитритом. В то же время взаимодействие нитрита с пластоцианином имеет ряд особенностей, обусловленных неустойчивостью окисленной формы зтого белка в среде, содержащей нитрит.

5. Исхода из полученных данных, выдвинуты предположения о возможных механизмах токсического действия нитрата и нитрита на животные клетки и фотосинтетический аппарат растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Камалян М.Г., Налбандян P.M. Оптические и магнитные свойства азурина из JïuiMsOmanaA <xcxu^iru»a.. - Биохимия, 1977, т.42, Вып. 2, с.223-229.

2. Камалян М.Г,, Карапетян A.B. Получение и некоторые свойства • компонентов дыхательной цепи денитрифицирующих бактерий 'Леи -dotnvnat) а&гш}ífbo . - Тезисы III республиканской молодежной конференции по физико-химической биологии, Агверан, 1985, с.28.

3. Камалян М.Г., Карапетян A.B., Налбандян P.M. Металлсодержащие белки и ферменты денитрифицирующих микроорганизмов. Их свойства и роль. - Тезисы республиканской конференции "Макромолекулы и функционирование клетки", Ереван, 1986, с.22,

4. Камалян М.Г., Карапетян A.B. Окисление азурина и цнтохро-

ма C55J нитритом. - Тезисы I Всесоюзной конференции "Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах и их моделях, Вильнюс, 1985, с.55.

5. Камалян М.Г., Карапетян A.B., Налбандян P.M. Растворимые металлсодержащие белки Tsciuiomotim axiuauwtcL. - Биохимия, 1906, т.51, вып.9, с.1420-1425.

6. Камалян М.Г., Карапетян A.B., Налбандян P.M. Окисление цито-хрома Cgcjj и азурина нитритом. - Биохимия, 1987, т.52, вып.4, с.638-642.

7. Камалян М.Г. Окисление "синих" медьсодержащих белков нитритом. - Тезисы 1У республиканской молодежной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию Великого Октября, Ереван, 1987, с.21.

8. Karnpotinn А.V., Kamaliaл H.G., Nalbandyan R.M. On the superoxide) diemutaBe activity of cytocherome oxidase from Pseudo-шоптп aeruginosa. - In: Superoxide and Superoxide Dismutase in Chemistry, Biology and Medicine. Ed. G.Rotilio, Elsevier/ Scionce Publishers B.V. (Biomedical Division), Amsterdam,1986. P. 72-76.