Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование механизмов регуляторного и токсического действия нитритов и NO-генерирующих веществ в биологических системах
ВАК РФ 03.00.13, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов регуляторного и токсического действия нитритов и NO-генерирующих веществ в биологических системах"
ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ РАН
На правах рукописи
РЕУТОВ Валентин Палладиевич
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯТОРНОГО И ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НИТРИТОВ И NO-ГЕНЕРИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
СИСТЕМАХ
03.00.13 -физиология 03.00.02 - биофизика
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада
Москва - 2004 г
Научные консультанты - заслуженный деятель науки РФ,
доктор биологических наук, профессор Н.С. Косицьш; академик РАМН и НАН Беларуси, доктор медицинских наук, профессор В.Н. Гурин
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор Доктор физ.-мат. наук, профессор Доктор биологических наук, профессор
Ю.В. Архипенко Э.К. Рууге А.Н. Саприн
Ведуп$ая организация:
НИИ фэщей патологии и патофизиологии РАМН
Защита состоится 31 мая 2004 г. в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.
Диссертация в виде научного доклада разослана .2004 г
Ученый секретарь совета, доктор биологических наук
[ I
Б.А. Умарова
"Мы мало считаемся с тем, что все процессы в организме протекают циклически, и каждый отдельный процесс имеет свою цикличность..."
ЛА. Орбели
"Всякое обобщение до известной степени предполагает веру в единство и простоту природы. Что касается единства, то мы не сможем встретить здесь каких-либо затруднений... Нам нужно задать себе вопрос не о том, едина ли природа, но вопрос: каким образом она является единой?"
А. Пуанкаре
ВВЕДЕНИЕ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Нитросоединения (нитраты, нитриты и оксиды азота) широко используются в различных отраслях промышленности, в агрохимии и фармакологии. В организм человека эти вещества поступают вместе с воздухом, водой, продуктами питания и лекарственными препаратами. В последние годы стало известно, что эти соединения способны также эндогенно синтезироваться в живых организмах из L-аргинина. В качестве промежуточного соединения в этой реакции образуется оксид азота (N0) -чрезвычайно важный регулятор, участвующий во внутри- и межклеточной сигнализации и способный оказывать свое влияние на многочисленные процессы в клетках и в организме (А.Н. Саприн и др., 1968-2002; М.К. Пулатова и др., 1985-2003; З.В. Куроптева и др. 1985-2004; А.А. Каменский, К.В. Савельева, В.А. Дубынин, И.П. Ашмарин, 1994, 1996, 2002; В.Б. Кошелев, А.Л. Крушинский, B.C. Кузенков, 1999; А.С. Пивоваров, У. Эхидо-Вилларреаль, 1995; СМ. Струкова, Б.А. Умарова, Т.Н. Дугина и др., 1999; А.П. Бонарцев, С.А. Гаврилова, М.П. Давыдова, А.Б. Постников, Н.А. Медведева, 2001; А.Я. Коц, М.А. Графов, И.В. Овчинников, А.С. Куликов, Ю.В. Хропов, Т.В. Буларпша, 1998; М. Mori, Т. Gotoh, 2000; P. Sarti et al., 2000). В 1992 г журнал "Science" назвал NO молекулой года, а в 1998 г трое американских исследователей Р. Фурчготт, Л. Игнарро и Ф. Мурад были удостоены Нобелевской премии за "открытие роли оксида азота как сигнальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы" (R.F. Furchgott, I.V. Zawadzki, 1980; L.J. Ignarro et al., 1987-2000; F. Murad et al., 1978-1994; R.M.J. Palmer et al., 1987; S. Moncada et al., 1987 - 1991). Однако проблема NO в биологии и медицине, как правило, изучается отдельно от проблемы нитросоединений, синтезирующихся эндогенно, или поступающих вместе с воздухом, водой и пищевыми продуктами, способных высвобождать NO, и, тем самым, оказывать воздействие на организм человека и животных 1977,
{ РОС НАЦИОНАЛЬНА» i
i библиотека i
1
1979; R. Kahl, et al., 1978; H.G. Shertzer, G.B. Duthu, 1979; R.H. Morse, S.I. Chan, 1980; A. Tomoda et al., 1997; J.A. Wingrow, P.H. OTarrell, 1999).
Отсутствие целостного понимания взаимосвязанных задач и проблем затрудняет дальнейший прогресс и в частных исследованиях проблемы N0 (А.В. Гурин, В.Н. Гурин, 1994-2003; В.В. Зинчук, 1999; В.А Кульчицкий, СВ. Кульчицкий, 1998; В.Г. Башкатова, К.С. Раевский, 1996-2000; И.Ю. Малышев, Е.Б. Манухина, 1994-2004; И.И. Степуро, 1997; А.Г. Чумак, 2003; АА. Мойбенко, В.Ф. Сагач, 1998-2004; A.R Гоженко, 1997-2004; А.Л. Зефиров, 1998-2004; А.Х. Уразаев, 1995-1999). Таким образом, становится очевидным, что наши представления о роли NO в биологических системах представляют совокупность неполных и разрозненных объяснений, характерных для данного уровня знаний.
За последние 30 лет проблема воздействия нитросоединений на организм человека и животных приобрела, по крайней мере, три аспекта: регуляторный, фармакологический и токсикологический (М.Р. Doyle et al., 1981, 1982; Н. Kosaka, et al., 1979; A.V. Kozlov et al., 1999; A. Tomoda, et al., 1997; M. Mori, T. Gotoh, 2000). Вместе с тем показано, что характер воздействия нитросоединений (от регуляторпого до токсического) прежде всего, зависит от дозы вещества, поступившего в организм человека или животного. Поэтому также имеется внутренняя логика в том, чтобы механизмы токсического и регуляторного действия нитритов не противопоставлялись друг другу, а изучались в контексте указанных выше двух больших проблем современной биологии и медицины - нитратно-нитритной и NO.
Изучение проблемы NO в биологических системах в России начали почти одновременно две группы исследователей: Л.А. Блюменфельд, А.Ф. Ванин и Р.М. Налбандян - первая группа и вторая группа - Я.И. Ажипа, Л.П. Каюшин, и Е.И. Никишкин. Достижение первой группы состояло в том, что, входящие в эту группу исследователи, впервые обнаружили в пекарских дрожжах парамагнитные центры, характеризующиеся сигналом ЭПР с gA, ~ 2,03. Основное достижение второй группы состояло в том, что они обнаружили новые сигналы в крови и тканях крыс после введения им NaNO2 и, основываясь на результатах модельных исследований Горди и Рексроуда (1961), назвали парамагнитные комплексы, ответственные за эти сигналы, нитрозильными комплексами железа. В дальнейшем результаты своих исследований Я.И. Ажипа, Л.П. Каюшин и Е.И. Никишкин зарегистрировали в Госкомитете по делам открытий и изобретений как научное открытие за №148. Интерес к этим комплексам возрос после того, как было установлено, что образование их резко увеличивается при канцерогенезе, токсикозах, а также при воздействии анестетиков (АН. Саприн, Т.С. Шуляковская 1968, 1969; А.Н. Саприн, 1974; Л.В. Вахнина, Э.К. Рууге, 1972; Е.П. Сидорик, 1973-1981; А.Ф. Ванин и соавторы, 1971-1975; М.И. Кузин и соавторы, 1971; В.Л. Шарыгин и соавторы, 1971-1979, М.К. Пулатова и соавторы, 1985-2003, З.В. Куроптева и соавторы, 1985-2001). Однако механизмы образования NO из NO2" и локализация мест восстановления нитритных ионов в оксид азота в организме млекопитающих оставались в значительной степени не выясненными (Н. Kosaka, et al., 1979; R.
Kruszyna, et al., 1987; A.V. Kozlov et al., 1999; J.M. May et al., 2000; A. Tomoda, et al., 1997). Более того, "популярность" молекулы N0 в биологических системах отодвинула на задний план продукты превращения этой молекулы -NO2- и NO3\ Поэтому проблема восстановления ионов NO2- в N0 в организме млекопитающих, в основном, оставалась вне поля зрения исследователей. В отдельных же работах, посвященных токсическому, фармакологическому или регуляторному действию нитритов в явной или в неявной форме предполагалось, что ионы NO2- превращаются в N0 неферментативным путем (J.L. Zweier et al., 1995; 1999).
Вместе с тем, весьма актуальными для фармакологии, токсикологии и биохимии были следующие задачи: 1) локализация мест восстановления ионов NO2- в N0; 2) идентификация ферментов и ферме 1ггных систем, которые могли бы принимать участие в восстановлении ионов NO2- в N0; и, наконец, 3) выяснение факторов, которые могли бы влиять на интенсивность превращения ионов NO2- в N0.
Цель работы состояла в обнаружении, выяснении и анализе основных закономерностей, которые определяют широкий спектр токсического и регуляторного действия нитритов, а также в изучении механизмов восстановления ионов NO2- в N0 в крови и тканях млекопитающих и анализе роли реакции восстановления нитритов в N0 в осуществлении регуляторного и токсического действия нитритов в организме животных. В задачи работы входило:
1) выяснить, почему нитриты обладают широким спектром действия на организм млекопитающих, проявляющимся, практически на всех структурно-функциональных уровнях;
2) исследовать роль реакции восстановления ионов NO2- в N0 в механизме токсического действия нитритов;
3) локализовать места восстановления нитритных ионов в N0;
4) идентифицировать ферменты или ферментные системы, которые могли бы принимать участие в восстановлении ионов NO2- в N0;
5) исследовать факторы, которые могли бы влиять на интенсивность восстановления ионов NO2- в N0.
6) изучить механизмы восстановления ионов NO2- в крови;
7) выяснить факторы, влияющие на образование и распад комплексов гемоглобина с N0;
8) изучить механизмы восстановления ионов NO2- в тканях;
9) проанализировать и обобщить известные данные об оксиде азота и продуктах его метаболизма с полученными нами данными о роли нитритредуктазной активности в крови и тканях млекопитающих в виде повой концепции, позволяющей более глубоко понять роль NO-сшггазной и нитритредуктазной систем в живых организмах.
Рабочие гипотезы. Впервые в середине 70-х гг. автором диссертации было высказано предположение, что основное токсическое действие нитритов на организм животных и человека связано с превращением ионов NO2- в NO (В.П. Реутов, Я.И. Ажипа, Л.П. Каюшин, 1975-1978). Именно образование N0 и
NO2 из нитритных ионов, согласно нашей гипотезе, запускает развитие многочисленных регуляторных и токсических эффектов, после поступления нитритов в организм. Эта рабочая гипотеза проверялась нами на протяжении почти 30 лет, как в наших собственных экспериментах, так и в экспериментах, проведенных нами с другими исследовательскими группами на различных биологических моделях: эритроциты крови крыс, митохондрии печени и почек крыс, зернистые клетки мозжечка крыс, мыши A/Snell и гибриды F1(C57B1XCBA), крысы линии Wistar, нейроны мозжечка крыс Wistar, лягушки Rana temporaria и нейроны улитки Helix Lucorum. В указанных выше экспериментах наша рабочая гипотеза была подтверждена, что нашло отражение в совместных публикациях. В настоящее время благодаря работам западных исследователей стало известно, что оксид азота, взаимодействуя с супероксидом, способен образовывать ионы пероксинитритов - ONOO", которые после протонирования (ONOO + Н+ —> ONOOH) способны распадаться с высвобождением высокореакционных молекул диоксида азота (NO2) и ОН-радикалов (ONOOH NO2 + ОН). Таким образом, наши данные о важной роли N0 и Ж>2 в механизме токсического действия нитритов (В .П. Реутов и др., 1978 а,б) также нашли свое подтверждение в работах зарубежных исследователей, опубликованных в 90-х гг. XX в. и в начале XXI в.
В связи с тем, что многочисленные данные литературы указывали на то, что дефицит кислорода в организме (гипоксия, ишемия, анаэробиоз) является необходимым условием для образования комплексов, ответственных за сигнал ЭПР с g-фактором 2,03 (Я.И. Ажипа, Л.П. Каюшин, Е.И. Никишкин, 1966; 1967; 1983; А.Ф. Ванин и соавторы, 1965-1975; А.Н. Саприн, Т.С. Шуляковская, 1968, 1969; А.Н. Саприн, 1974; Т.С. Шуляковская, 1973; Е.П. Сидорик, 1973-1981; М.И. Кузин и соавторы, 1971; В.Л. Шарыгин и соавторы, 1971-1979, М.К. Пулатова и соавторы, 1985-1999, З.В. Куроптева и соавторы, 1985-2001), можно было предположить, что нитриты конкурируют с теми восстановителями, которые связывают кислород. Среди кислородсвязывающих компонентов клеток основными являются гемсодержащие белки. В связи с этим требовалось проанализировать по данным литературы эволюционные аспекты гемсодержащих белков. И, если гемсодержащие белки, способные связывать кислород, могли когда-либо в процессе эволюции жизни на Земле участвовать в переносе электронов на нитриты, то в качестве рабочей гипотезы можно было бы предположить возможность участия гемсодержащих белков в восстановлении ионов NO2* в NO. Кроме того, интересно отметить, что именно гемоглобин, который относится к гемсодержащим белкам, способным связывать кислород, является мишенью токсического действия нитритов и способен ими окисляться. В то же время хорошо известно, что в тех реакциях, где имеет место окисление одпих веществ, можно предполагать возможность восстановления других веществ. Анализ механизмов восстановления ионов NO2 в NO в организме млекопитающих позволил дополнить цепочку превращения L-аргинина —> NO— • NO2/NO3" нитритредуктазным звеном NO2 — • NO, что позволило сформулировать принципиально новую концепцию цикла оксида азота (В.П. Реутов, 1992-2003).
Концепция. Впервые на основании обобщений экспериментальных данных литературы и собственных результатов исследований, а также анализа существующей системы принципов, концепций и теорий сформулирована принципиально новая концепция, согласно которой нитритредуктазные реакции с участием гемсодержащих белков, находящихся в дезокси-форме, способны замыкать цепочку превращений: L-аргинин -> NO -> NCV/NCb* в цикл, который был нами назван циклом оксида азота (В.П. Реутов, 1992-2003). Эта концепция позволяет объяснить целый ряд экспериментальных дшгаых и хорошо согласуется с современными представлениями о нитратном дыхании как предшественнике кислородного дыхания и с эндосимбиотической гипотезой происхождения митохондрий. Эта концепция также дополняет и расширяет совремеш1ые представления о биохимическом единстве всех живых организмов - от микроорганизмов до млекопитающих, а также о единстве основных принципов организации живой материи. Дальнейший анализ структурпо-функционального единства NO-синтазных и нитритредуктазных систем позволил еще раз убедиться в том, что живые организмы в самой организации ферментных систем и метаболических путей хранят информацию о своем эволюционном происхождении. В настоящее время концепция цикла оксида азота получила подтверждение в работах зарубежных и отечественных исследователей (J. Millar, 1995; Ю.В. Данилович, 2001; В.Н. Коробов, 2003). Анализ концепции цикла оксида азота с позиций принципов симметрии, а также анализ данных литературы, позволил сформулировать новый биологический принцип - принцип циклической организации метаболических процессов (или принцип цикличности). Этот принцип открывает перспективы как для постановки новых задач и проведения экспериментов, так и для более глубокого понимания уже имеющихся экспериментальных данных. Он также позволяет осуществить преемственную связь между уже существующими идеями, концепциями, принципами и только еще возникающими, а также дает ответы на некоторые вопросы, поставленные физиологом Л.А. Орбели и математиком А. Пуанкаре, работы которого оказали значительное влияние на развитие биофизики. Таким образом, можно ожидать, что этот принцип позволит более глубоко понять, каким образом осуществляется взаимосвязь между различными структурно-функциональными уровнями, и тем самым, позволит с единых позиций рассмотреть некоторые аспекты живых систем, которые изучают физиологи и биофизики.
Научная новизна. Впервые высказана гипотеза, показано и обосновано, что в основе многообразных токсических эффектов нитритов, имеющих место на различных структурно-функциональных уровнях, может лежать реакция превращения ионов NO2- в NO. Лишь после образования NO из ионов NO2-возможно протекание дальнейших реакций, в ходе которых могут образовываться еще более реакционные соединения. Данные, полученные нами, как указывалось выше, нашли многочислашые подтверждения после того, как стало известно, что оксид азота способен в присутствии супероксидных анион-радикалов превращаться в пероксинитрит, который, в
свою очередь, распадается с образованием ОН-радикалов и свободно-радикального соединения N0^
Впервые показано, что ионы N0^ восстанавливаются в крови при участии гемоглобина и тех систем, которые поддерживают его в восстановленном состоянии. Нитритредуктазные свойства гемоглобина значительно повышаются в отсутствие кислорода. Впервые установлено, что кислород, связанный с гемоглобином, ингибирует процесс восстановления ионов N0^ в N0 (В.П. Реутов и др., 1983). Взаимодействие дезоксигемоглобина с ионами N0^ приводит к образованию только Я-конформеров №-N0 комплексов (Я.И. Ажипа, В.П. Реутов, Л.П. Каюшин, 1983). В такой форме N0 может транспортироваться на относительно большие расстояния в организме и вместе с током крови доставляться в те органы и ткани, которые нуждаются в этом соединении. Впервые предложен механизм транспорта и высвобождения N0 вместе с №-N0 комплексами (Я. И. Ажипа, В.П. Реутов, Л.П. Каюшин, 1983; В.П. Реутов, 1995; В.П. Реутов, Е.Г. Сорокина, В.Е. Охотен, Н.С. Косицын, 1997; 1998).
При физиологических концентрациях оксида азота в крови для высвобождения N0 необходим Я->Т переход №-N0 комплексов, который по-видимому осуществляется при участии естественных регуляторов (например, 2,3-дифосфоглицерата, ионов Н+, СОг и др.). Одной из причин появления Т-конформеров №-N0 при относительно высоких дозах нитритов, по-видимому, может быть также частичная денатурация глобина оксидами азота, образующимися при восстановлении ионов N0^ в тканях. Показано, что оксигенация Т-конформеров №-N0 комплексов может снижать концентрацию этих комплексов в крови.
Методами ЭПР, спектрофлуориметрии и спектрофотометрии получены новые данные, свидетельствующие о том, что при блокировании дыхательной цепи KCN ионы N0^ не могут акцептировать электроны и восстанавливаться в N0. Полученные данные указывают на возможность участия ферментов дыхательной цепи митохондрий в восстановлении ионов N02. Локализованы места восстановления ионов N0^ в митохондриях и показано, что ионы N0^ могут акцептировать электроны с терминального участка дыхательной цепи -цитохромоксидазы.
Методами полярографии и спектрофлуориметрии показано ингибирующее действие ионов N0^ на транспорт электронов по дыхательной цепи митохондрий. Обнаружено, что важную роль в этом процессе играет способность N0 образовывать комплексы с негемовым железом митохондрий. Этими же методами установлено разобщающее действие нитритов на окислительное фосфорилирование митохондрий. Эффект разобщения окислительного фосфорилировапия начинал проявляться лишь при высоких концентрациях №N02 (10"3 М и выше) спустя некоторое время (от 30 сек и больше) после добавления этого вещества к среде инкубации. Предполагается, что за разобщение окислительного фосфорилирования ответственны не столько ионы N0^, сколько накапливающиеся со временем высокореакционные продукты их превращения - N0 и N0^ которые обладают способностью
участвовать в нитрозировании тирозиновых остатков белков и в свободно-радикальном окислении ненасыщенных жирных кислот.
Методом ЭПР также показано, что при взаимодействии К02 с ненасыщенными жирными кислотами и аминокислотой тирозином образуются парамагнитные центры. Предполагается, что ненасыщенные жирные кислоты и тирозшювые остатки мембранных липопротеиновых комплексов могут явиться своеобразными мишенями, с которыми взаимодействует N0^ а образование парамагнитных центров в реакции N02 с указанными выше веществами -первичным актом повреждения мембран.
Научно-практическая значимость. Настоящая работа является продолжением тех исследований, которые были зарегистрированы Госкомитетом СССР по делам открытий и изобретений как научное открытие за №148. Научная значимость настоящей работы состоит в том, что в ней впервые были представлены данные о ключевых механизмах токсического и регуляторного действия нитритов, сформулированы и обоснованы концепция цикла оксида азота и принцип цикличности. Полученные в работе данные могут быть использованы в клинике при лечении интоксикаций, связанных с поступлением в организм человека и животных нитросоединений. Локализация мест восстановления нитритных ионов указывает на способ регуляции процессом восстановления этих ионов. Оксигенация крови может защитить гемоглобин от окисления ионами NCV и уменьшить концентрацию N0, образующегося в крови в результате восстановления гемоглобином нитритных ионов. С другой стороны, оксигепация крови может существенно снизить концентрацию Т-конформеров №-N0 комплексов.
Таким образом, проведение оксигемотерапии в клинической практике позволит: защитить гемоглобин от окисления ионами N0^, уменьшить концентрацию высокотоксичных оксидов азота - N0 и N0^ уменьшить концентрацию стабильных Я- конформеров №-N0 комплексов.
Поскольку ионы NCV могут акцептировать электроны с дыхательной цепи митохондрий, то уменьшение скорости переноса электронов по дыхательной цепи митохондрий может явиться благоприятным фактором при интоксикации нитритами. Известно, что снижение энергетических потребностей в организме животных приводит к уменьшению скорости переноса электронов по дыхательной цепи митохондрий. Поэтому для уменьшения интенсивности восстановления ионов N0/ в N0, а, следовательно, и для уменьшения токсического действия ионов N0^, благоприятными мерами могут быть те, которые снижают энергетические потребности организма. Перевод животного в состояние, близкое к физиологическому сну, удовлетворяет тем условиям, которые можно рассматривать как благоприятные. Таким образом, полученные нами данные указывают на то, что оптимальным состоянием (или близким к нему) при нитритной интоксикации может явиться оксигенация крови в состояния сна.
Основные положения, выносимые на защиту.
1) Превращение ионов N0^ в N0 является одной из определяющих стадий в реализации механизмов токсического и регуляторного действия нитритов.
2) Ионы N0^ могут восстанавливаться в N0 в эритроцитах крови с участием гемоглобина, находящегося в дезокси-форме.
3) Ионы N0^ могут восстанавливаться в N0 в митохондриях в результате акцептирования электронов с терминального участка дыхательной цепи
4) Восстановление ионов N0^ с участием гемсодержащих белков, находящихся в дезокси-форме, может играть существенную роль при гипоксии, как один из регуляторных механизмов, обеспечивающих вместе с N0-синтазами контроль за содержанием N0 в живых организмах.
Внедрение. Разделы работы, посвященные изучению механизмов восстановления нитритов в оксид азота в крови и митохондриях млекопитающих, и рекомендации по уменьшению токсического действия нитросоединений на организм человека и животных были представлены на ВДНХ СССР в павильоне "Биология", а авторский коллектив (Я.И. Ажипа, Л П. Каюшин, Е.И Никишкин и В П. Реутов) награжден одной серебряной и тремя бронзовыми медалями ВДНХ СССР. Результаты этих исследований также вошли в отчет Президиума АН СССР за 20-летний период (1963-1983) и отнесены к тем работам, которые имеют наибольшее практическое значение. В 1996 г две работы: "Цикл окиси азота в организме млекопитающих" и "Механизмы токсического действия нитратов и нитритов" были представлены Институтом высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН в Президиуме Российской Академии Наук на выставке "Академическая наука -народному хозяйству". Дальнейшие разработки методов диагностики нитратно-нитритных интоксикаций были также представлены в Президиуме РАН на выставке "Экология и Здравоохранение" (Москва, 1998) и отнесены к существенным достижениям академической науки в области экологии и здравоохранения. Результаты диссертационной работы использованы как отечественными, так и зарубежными исследователями при обсуждении новых их данных в многочисленных статьях и в 7 книгах.
Результаты диссертациошюй работы, свидетельствующие о том, что при нитратно-нитритных интоксикациях образуются Я- и Т-конформеры №-N0 комплексов, с преобладанием Я-конформеров при тяжелых интоксикациях с летальным исходом, приняты Республиканским научным центром по судебной медицине при МЗ России и используются при чтении лекций на кафедрах судебной медицины в медицинских ВУЗах.
Результаты диссертационной работы, свидетельствующие о том, что при гипоксии снижается содержание Ь-аргинина в сыворотке крови, применяются в Московском НИИ глазных болезней им. Гельмгольца Минздрава РФ при анализе слезной жидкости, используемой для ранней диагностики ишемических изменений сетчатки у больных с диабетической ангиоретинопатией. В зависимости от величины этого показателя (он также характеризует и стадию
процесса), при лечении сосудистых заболеваний глаз применяют либо ингибиторы синтеза N0, либо доноры оксида азота, обладающие антиагрегационным и фибринолитическим действием.
Личный вклад автора состоял в планировании, постановке и выполнении экспериментальной работы. Все фрагменты работы, в которых принимали участие студенты-дипломники, лаборанты и научные сотрудники отмечены в диссертации, а в указателе литературы представлены опубликованные совместные статьи. Автору диссертации принадлежит формулировка и обоснование всех концепций и гипотез, представленных в книгах, теоретических и обзорных статьях. Личный вклад автора заключался также в развитии, популяризации и изменении сложившихся теоретических представлений о механизме токсического действия нитритов, метаболизме ионов NO2- в организме млекопитающих и циклическом превращении оксида азота. Значительная часть статей и книги написаны лично автором диссертации и небольшая часть - при активном его участии вместе с другими соавторами.
Апробация. Основные результаты исследований были представлены и обсуждены на V Международном биофизическом конгрессе (Копенгаген, 1975), на Всесоюзных симпозиумах "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Москва, 1977, 1981, 1989, 1991, 1996), на XI Всесоюзном симпозиуме "Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции" (Пущино, 1981), на 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982) и 2-ом Всероссийском биофизическом съезде (Москва, 1999), на VI Всесоюзной конференции по экологической физиологии (Сыктывкар, 1982), на VII и VIII Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Лейпциг, 1983; Рига, 1985), на 14 Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), на Всесоюзной конференции "Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде" (Пущино, 1989); на Всесоюзном симпозиуме "Канцерогенные N нитрозосоединения и их предшественники - образование и определение в окружающей среде" (Таллинн, 1990), на 2-м Всесоюзном симпозиуме по экологической онкологии "Образование канцерогенных ^нитрозосоединений в экосистемах" (Киев, 1990), на международных симпозиумах по гипоксии (Берлин, 1991, 1994), на международном симпозиуме "Структура и функция регуляторных полипептидов" (Москва, 1992), на симпозиуме "Проблемы экспериментальной легочно-сердечной недостаточности" (Киев, 1992), на симпозиуме "Пути передачи внеклеточного сигнала" (Звенигород, 1993), на конференции "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации" (Москва, 1993), на 11-ом Международном БиофизическОхМ конгрессе (Будапешт, 1993), на XV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Минск, 1993), на специальном FEBS симпозиуме по биологическим мембранам (Хельсинки, 1994), на международном симпозиуме "Физиологические и биохимические основы активности мозга" (С-Петербург, 1994), на 27-ом Международном Ампер-конгрессе, посвященном 50-летию открытия явления магнитного резонанса (Казань, 1994), на II нейрогистологической конференции, посвященной памяти чл.-корр. АН СССР и АМН СССР Н.Г. Колосова "Колосовские чтения-94" (С-Петербург, 1994), на
международном симпозиуме "Простые нервные системы" (Пущино, 1994), на Первом Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием (Москва, 1996), на международной конференции по ЭПР-спектроскопии оксида азота в биологических системах (Суздаль, 1996), на международном симпозиуме "Свободные радикалы в биологии и медицине" (София, 1997), на ХХХШ международном конгрессе физиологических наук (С.-Петербург, 1997), на 12-й международной конференции Европейского Общества по нейрохимии (С-Петербург, 1998), на 17-м Физиологическом съезде (Ростов, 1998), на международной научной конференции "Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1998); на международной конференции, посвящешгай 150-летию со дня рождения И.П. Павлова "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1999), на III Национальном конгрессе патофизиологов Украины (Одесса, 2000).
Результаты исследований были доложены на семинарах и конференциях в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, в Институте проблем передачи информации РАН, Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, Институте биологической физики СССР (Пущицо), Институте химической физики (лаборатория радиоспектроскопии) РАН, Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева, Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова (кафедры физиологии, высшей нервной деятельности, биофизики), Институте патологической физиологии РАМН, Институте педиатрии РАМН, Институте питания РАМН, Институте мозга РАМН, Институте усовершенствования врачей Минздрава СССР (кафедра патофизиологии), Одесском медицинском университете (кафедра патофизиологии), Институте физиологии НАН Беларуси, Шституте физиологии НАН Украины им А.А. Богомольца. На конкурсах научных работ доклады и статьи, написанные по материалам диссертации, неоднократно занимали призовые места и были отмечены 1-ой, 2-й и 3-ей премиями.
Диссертационная работа прошла также апробацию в ходе совместных исследований на различных биологических моделях с многочисленными сотрудниками, участие которых отражено в цитируемых публикациях (список работ, опубликованных по теме диссертации). По всем ключевым механизмам, представленным в диссертации, имеются прямые экспериментальные подтверждения в работах других авторов, опубликованных в журналах с высоким индексом цитирования. Многие исследователи проблемы оксида азота смогли более глубоко понять свои экспериментальные данные, проанализировав их с позиций, изложенных в опубликованных статьях. Последнее послужило тому, что идеи, результаты исследований и выводы, вытекающие их этих результатов, получили новый импульс развития в других медико-биологических проблемах, связанных с участием нитритов и оксида азота, как в работах отечественных, так и зарубежных авторов. Материалы, представленные в диссертационной работе, известны специалистам. В настоящее время имеются более 270 ссылок на книги и статьи автора диссертационной работы, опубликованные как в отечественных, так и в зарубежных изданиях, в том числе и в журналах с высоким индексом
цитирования ("Cell" (1999. Vol.98. P.105-114), J. Biol. Chem. (2002. Vol.277. №50. 48472-48478), PNAS (2003. Vol.100. №2. P.461-466), FEBS Letters (1999. Vol. 453. P.229-235), Toxicol. Letters (2001. Vol. 121. P.57-61. и др.). На книгу "Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих" М.: Наука, 156 с. в журналах "Успехи современной биологии" (1999. Т.119. №4. С.414); "Успехи физиологических наук" (1998. Т.29. №4.С.1О8.) и в "Журнале эволюционной биохимии и физиологии (1999. Т.35. №4. С.339-340) опубликованы рецешии известных ученых с положительной оценкой концепции и основных ее положений. Опубликованы также положительные рецензии известных ученых и на книгу "Проблема оксида азота в биологии и медицине и принцип цикличности. Ретроспективный анализ идей, принципов и концепций." (1000 экз.) М.: Издательство научной и учебной литературы, Едиториал УРСС. 2003. 96 с. ("Успехи физиологических наук" (2004. Т.35. №1. С. 109), "Успехи современной биологии" (2004. Т.224. №1. С...).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 182 работы, среди них 2 книги: "Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих" М.: Наука, 156 с. (тираж 1000 экз. в 1997 г. и 500 экз. в 1998 г.) и "Проблема оксида азота в биологии и медицине и принцип цикличности. Ретроспективный анализ идей, принципов и концепций. М.: Издательство научной и учебной литературы. Едиториал. УРСС. 2003. 96 с. (тираж 1000 экз); 2 брошюры: Бердиев У.Б., Кузнецов Ю.П., Куклин М.Г., Реутов В.П., Шекшеев Э.М. "Моделирование спектров ЭПР парамагнитных центров крови на персональных ЭВМ типа IBM PC/XT/AT. M.: Институт химической физики АН СССР, 1989, 31с; Реутов В.П., Гоженко А.И., Насибуллин Б.А., Доломатов СИ.. Косицын Н.С. Анализ циклических процессов с участием оксида азота в организмах и молекулярного азота в биосфере с позиций голографического принципа и принципа цикличности. Одесса: Одесский медуниверситет. 2003. 66 с; 54_ статьи (26 из них переведены и опубликованы на английском языке) и 124 кратких сообщения в журналах, книгах и сборниках. Основные статьи автора диссертационной работы, представленные в рецензируемых журналах: "Биохимия" (5 статей); "Доклады АН СССР и РАН" (7 статей); "Известия АН СССР, сер. биол." (2 статьи); "Бюлл. эксперим. биол. и мед." (2 статьи); "Физиология человека" (3 статьи); "Росс, физиол. журн. им. И.М. Сеченова" (1 статья); "Вести национальной академии наук Беларуси" (News of Biomedical Sciences - 5 статей), "Биол. мембраны" (2 статьи), "Экспериментальная онкология" (Experimental oncology - 1 статья) переведены и опубликованы на английском языке. В 30 публикациях (статьях и книгах) соискатель является первым автором. В системах Интернета (Google), Пабмеда (PubMed) и Медлайна (Medline) имеются данные о более 100 публикациях автора и цитировании его работ (Reutov V.P., Reutov Valentin P., Реутов Валентин П.) по ключевым словам NO, Nitric Oxide, EPR, ESR, Nitrite, Cyclicity Principle, Hypoxia.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (гранты№№94-04-11950,98-04-48679,00-04-48412)
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Систематизированы данные литературы относительно механизмов токсического и регуляторного действия нитритов и N0-генерирующих соединений на организм млекопитающих [1, 2, 10, 12]. Обобщены результаты исследований по механизмам восстановления нитритов в N0 [10, 17, 18], а также данные литературы о механизмах синтеза N0 из Ь-аргинина [1, 22]. Сформулирована цель диссертационной работы и осуществлена постановка задач, в ходе решения которых должна быть достигнута основная цель исследований. Как указывалось выше, основная цель диссертационной работы состояла: 1) в обнаружении, выяснении и анализе основных закономерностей, которые определяют широкий спектр токсического и регуляторного действия нитритов; 2) в изучении механизмов восстановления ионов N0^ в N0 в крови и тканях млекопитающих и 3) в анализе роли реакции восстановления нитритов в N0 в осуществлении регуляторного и токсического действия нитритов в организме животных [1,2,27,35].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объект исследования. Эксперименты были проведены на 1124 крысах-самцах линии Wistar и 340 беспородных крысах весом 150-160 г. Раствор нитрита натрия в зависимости от конкретной цели эксперимента вводили в бедренную вену, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно. Основная часть исследований была выполнена при внутривенных и внутрибрюшинных введениях. Дозы №N02 варьировали от 0,5 до 14 мг на 100 г массы тела. Время от момента введения №N02 до декапитации составляло от 1 мин до 24 часов. Сразу же после декапитации готовили образцы крови и тканей для исследований.
Определение содержания, гемоглобина в крови животных осуществляли с помощью у1гафицированного гемиглобин-цианидного метода. Принцип метода основан на окислении гемоглобина в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием (красная кровяная соль). Образующийся с ацетон-циангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяли спектрофотометрически.
Определение содержания метгемоглобина в крови животных осуществляли с помощью унифицированного спектрофотометрического метода с использованием CN - метгемоглобина.
Методика приготовления образцов крови и тканей для ЭПР-исследованип. Образцы крови готовили двумя способами. В первом случае кровь животного после декапитации набирали в тефлоновые пресс-формы. Пресс-формы позволяли изготавливать образцы в виде цишшдрических "таблеток" точпо калиброванного объема. Высота "таблетки" была равна 20 мм, диаметр - 7 мм. После замораживания образца в жидком азоте таблетку выдавливали из пресс-формы. Этот способ приготовления образцов более целесообразно использовать в лабораторных условиях. Аналогичным образом
готовили образцы тканей. Эту методику использовали для определения зависимости формы и интенсивности сигналов ЭПР крови и тканей от величины введенной дозы NaNO2. Второй способ приготовления образцов был использован в опытах по изучению интесивности и формы спектров ЭПР гемоглобин-NO комплексов, образующихся после введения NaNO2 in vivo и после инкубации цитратной крови с NaNCA in vitro. Этот способ приготовления образцов более удобен в клинической практике. Процесс получения цитратной крови, содержащей гемоглобин-NO комплексы, образующиеся in vivo после внутривенного введения NaNO2, состоял в следующем: готовили инкубационную среду, содержащую 0,20 М цитрата Na и 0,15 М NaCI. Затем в эту среду добавляли кровь животных, полученную после их декашггации. Отношение объема инкубационной среды к объему крови составляло 1:1. После этого 0,2 мл цитратной крови набирали в кварцевые капилляры с внутренним диаметром 3 мм и замораживали в жидком азоте.
Регистрация спектров ЭПР и расчет некоторых их параметров. Спектры ЭПР биологических препаратов регистрировали на 3-сантиметровом радиоспектрометре отражательного типа с двойной модуляцией магнитного поля. Во избежание эффектов насыщения, сигналы ЭПР свободных радикалов записывали при можности СВЧ порядка 100-200 AW, а сигналы парамагнитных комплексов металлов переменной валентности - при мощностях СВЧ порядка 10-15 raW. Амплитуда ВЧ-модуляции магнитного поля составляла 5-8 эрстед для свободных радикалов и 10-15 эрстед для комплексов металлов переменной валентности. Первую производную сигналов поглощения ЭПР препаратов крови и гемоглобина записывали параллельно с сигналом ЭПР встроенного в резонатор спектрометра эталона рубина с фиксированной концентрацией парамагнитных центров. Концентрацию парамагнитных комплексов изучаемых образцов крови и гемоглобина определяли методом двойного интегрирования первой производной сигнала поглощения ЭПР. В некоторых случаях концентрацию парамагнитных комплексов выражали в относительных единицах, представляющих собой отношение площади сигнала ЭПР ткани к площади сигнала ЭПР эталона сравнения с пересчетом на 1 г влажной ткани:
Сотн - концентрация парамагнитных центров в отн. ед.
S обр - площадь под кривой сигнала ЭПР ткани,
S этал - площадь под кривой сигнала ЭПР эталона,
Р мг - навеска тканевого препарата
Расчет величины g-фактора, ширины линии и величины сверхтонкого расщепления наблюдаемых спектров поглощения ЭПР проводили по известной величине g-фактора 3-ей и 4-ой линий поглощения ЭПР эталона кристаллического Мл + в MgO. Значения величин g-фактора 3-ей и 4-ой линий
поглощения ЭПР Мп2+ в MgO, как известно, равны соответственно 2,03114 и 1,98150.
Изучение содержания аминокислот в сыворотке крови контрольных крыс до и после введения нитритов. Анализ содержания свободных аминокислот в сыворотке крови проводили с использованием сочетания одномерной хроматографии на пластинах Фиксион-50х8 (Венгрия) и двумерной хроматографии на пластинах с целлюлозным покрытием (Merck, Германия). Преимуществом пластин Фиксион-50х8 является возможность проведения одномерной хроматографии с одновременным нанесением не менее 9-ти образцов и стандартной смеси аминокислот на одну и ту же пластину. Метод сочетания одномерной и двумерной хроматографии свободных аминокислот дал хорошие результаты и позволил проводить исследования в небольших количествах сыворотки крови. Часть экспериментов по определению содержания свободных аминокислот в сыворотке крови была дополнительно проверена на аминокислотном анализаторе Avtolab (Швеция) в Институте кровозаменителей и гормональных препаратов. Сопоставление результатов количественного определения свободных аминокислот на аминокислотном анализаторе и на пластинах показало, что метод тонкослойной хроматографии является достаточно точным и впоследствии основная часть исследования содержания аминокислот в сыворотке крови была сделана с использованием метода сочетания одномерной и двумерной хроматографии.
Определение суммарного а-аминоазота осуществляли при помощи спектрофотометрического метода Rubinstein, Ргусе (1959) по реакции а-аминогрупп с шшгидршюм в слабокислой среде. В ходе реакции в присутствии детергента образуется окрашенный комплекс с максимумом поглощения при Я. = 570 нм. Расчеты осуществляли по калибровочной кривой.
Определение содержания альбумина осуществляли унифицированным методом по реакции с бромкрезоловым зеленым в слабокислой среде. Оптическую плотность измеряли при Я. = 625 нм. Расчеты осуществляли по калибровочной кривой.
Для определения содержания cGMP в плазме крови применяли этанольную экстракцию с последующим высушиванием под струей азота и спектрофотометрическим определением при = 492 нм с помощью
иммуноферментных наборов фирмы "Экрос" и "Биоиммуноген" (Россия).
Разделение белков и пептидов сыворотки крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Белки и пептиды сыворотки крови разделяли методом высокоэффективной жидкостпой хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором при X = 280 нм на приборе фирмы "Waters" (США).
Методика выделения плазмы крови, теней эритроцитов и очистка гемоглобина высаливанием. Свежевыделенную кровь собирали в сосуд, содержащий NaCI и цитрат Na в концентрациях 0,15 М и 0.20 М соответственно. Отношение объема антикоагулянта к объему крови составляло 1:1. Плазму крови отделяли от эритроцитов центрифугированием при 600 g в
течение 15 мин. Осадок (эритроциты) промывали холодным физиологическим раствором (0,15 М №С1) и центрифугировали при 600 g в течение 15 мин при 4°С. Процедуру повторяли 3 раза. Супернатант удаляли водоструйным насосом. После чего к осадку приливали 2 объема бидистиллированной холодной воды (4°С) и оставляли на ночь. Затем центрифугировали, отделяя тени эритроцитов при 10 000 g в течение 1 часа. Осадок (тени эритроцитов) оставляли в центрифужных пробирках, а супернатант повторно центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин. Тени эритроцитов многократно промывали холодным физиологическим раствором вплоть до отсутствия в последнем следов гемоглобина, наличие которых проверяли на спектрофометре по характерным спектрам поглощения. Плазму крови и тени эритроцитов использовали для выяснения возможности восстановления нитритных ионов в оксид азота при участии этих компонентов крови. Полученный супернатант в дальнейшем подвергали очистке методом высаливания. Для чего к 20 мл раствора гемоглобина добавляли при 4°С 5 мл нейтрального насыщенного раствора ^И4)2804. Этот раствор центрифугировали при 10000 g (1 = 4°С) в течение 5 мин. Осадок удаляли, а супернатант, содержащий гемоглобин, собирали в отдельную пробирку. Затем этот супернатант пропускали через колонку с сефадексом 0-25 (2,5смх30см), предварительно уравновешенную 0,2 М цитратным буфером, содержащим 0,15 М №С1, рИ 7,4, и, таким образом, освобождали раствор гемоглобина от низкомолекулярных соединений.
ПолучениеR- и Т-конформеровHb-NOкомплексов. Я-конформеры №-N0 комплексов получали в результате взаимодействия дезоксигемоглобина с N0 в отсутствии кислорода. Для этого отросток "а" сосуда (рис.1), заполняли 5 мл раствора гемоглобина, концентрацией 10"3М, а отросток "б" - 5 мл раствора NN02, концентрацией 5хЮ"3М.
Рис 1. Сосуды для проведения дезоксигенации крови, гемолизата и растворов: гемоглобина и миоглобина:
/ - капилляр для заполнения отростка "а" кровью или гемоглобином; он же - измерительный капилляр; 2 - капилляр для заполнения отростка "б" раствором №N0^
Затем капилляр 2, с надетой на него резиновой трубкой, перекрывали зажимом. После чего, используя метод последовательного замораживания-размораживания растворов, из сосуда откачивали воздух до давления 10'3 мм
рт. ст. После достижения в сосуде вакуума ~ 10"3 мм рт. ст. растворы гемоглобина в отростке "а" и NaNCb в отростке "б" замораживали. Затем в отросток "б" доливали 5 мл аскорбиновой кислоты (5x10" М) над раствором №N62 и тут же замораживали содержимое отростка "б". Вследствие того, что растворы №N02 и аскорбиновой кислоты были заморожены, реакция восстановления ионов NCV в N0 аскорбиновой кислотой практически не происходила. Затем снова из сосудов откачивали воздух. Для того, чтобы как можно полнее избавиться от кислорода, находящегося в растворе аскорбиновой кислоты, ее раствор последовательно замораживали и размораживали до достижения вакуума 10"2 мм рт. ст. В процессе замораживания-размораживания раствора аскорбиновой кислоты растворы гемоглобина и NaNd содержали в замороженном состоянии. Затем растворы гемоглобина в отростке V и замороженные, наслоенные друг на друга растворы №N02 и аскорбиновой кислоты, в отростке "б" размораживали. В отростке "б" после размораживания начиналась реакция восстановления ионов N02^ в N0 аскорбиновой кислотой. Гемоглобин в отростке "а", находящийся в дезоксисостоянии образовывал парамагнитные комплексы с N0, спектр ЭПР которых был идентичен спектру ЭПР К-конформеров ^-N0 комплексов. Если реакция взаимодействия N0 с гемоглобином проходила в присутствии кислорода, наблюдали образование парамагнитных комплексов, спектр ЭПР которых по своим параметрам совпадал со спектром ЭПР Т-конформеров ^-N0 комплексов.
Методика дезоксигенации и оксигенации крови и гемоглобина. Опыты по дезоксигенации крови и раствора гемоглобина проводили в сосудах, изображенных на рис. 1. При этом в отросток "а" опытных и контрольных сосудов наливали 5 мл крови (гемоглобина). Концентрация гемоглобина в растворе и концентрация гемоглобина в цитратной крови, полученной по описанию в 2.1.3. методике, составляла 10"3 М. В отросток "б" наливали 5 мл эквимолярного раствора №N02. Затем из всех сосудов, используя метод последовательного замораживания- размораживания крови (гемоглобина), в течение одпого часа откачивали воздух и выжидали 30 мин. После этого измерительные капилляры опытной группы сосудов (вакуум 10'3 мм рт. ст.) запаивали в пламени газовой горелки, а капилляры контрольной группы сосудов - в присутствии кислорода. Затем раствор №N02 смешивали с цитратной кровью (раствором гемоглобипа) в опытных и контрольных сосудах и смесь переливали в измерительные капилляры. Последние, спустя различное время после начала реакции №N02 с гемоглобином, замораживали в жидком азоте и в дальнейшем использовали для ЭПР измерений.
Регистрация спектров поглощения крови, гемоглобина и цитохрома с. Спектры поглощения крови, гемоглобина и цитохрома с регистрировали на спектрофотометрах СФ-10, СФ-18, СФ-26. Концентрацию гемоглобина и цитохрома с определяли спектрофотометрически по величине оптической плотности с учетом коэффициента молярной экстинкции.
Изучение окислительно-восстановительных свойств плазмы крови по скорости гибели иминоксилъного радикала. Для изучения окислительно-
восстановительных свойств плазмы крови использовали иминоксильный радикал (ИР) 2,-2,-6>-6,-тетраметил-4-оксипиперидин- 1-оксил. Стабильность радикалов такого типа обусловлена тем, что метильныс группы (СНз) достаточно хорошо блокируют доступ к неспаренному электрону. Однако электроны и протоны вследствие малых своих размеров могут легко взаимодействовать с иминоксильными радикалами, приводя к их гибели. Благодаря этому свойству иминоксильный радикал 2,-2,-6,-6,-тетраметил-4-оксипиперидин-1-оксил часто используют для анализа методом ЭПР окислительно-восстановительных свойств крови и других биологических жидкостей.
В опытах использовали водный раствор ИР (концентрация ЮЛМ). Для того чтобы предотвратить изменения в скорости гибели ИР вследствие нагревания образцов в резонаторе ЭПР-спектрометра, плазму крови и раствор ИР предварительно выдерживали в термостате при температуре воздуха внутри резонатора. Затем плазму крови и раствор ИР смешивали в пропорции 1:1. Смесь быстро набирали в капилляр диаметром 1,5 мм и высотой 10 мм и помещали в резонатор спектрометра ЭПР. Кинетику гибели ИР измеряли по скорости уменьшения интенсивности сигнала ЭПР.
Спектрофотометрический метод определение содержания ионов N0^ и N0^ в сыворотке крови. Метод определения содержания нитритов в исследуемых растворах основан на образовании окрашенного азосоединения при взаимодействии ионов КСУ с сульфониловой кислотой и а-нафтиламином. Эта реакция впервые была предложена Гриссом в 1879 г и поэтому иосит его имя. Реакция Грисса весьма специфична для нитритов и протекает в две стадии: а) диазотирование иона N0^ в кислой среде ароматическим амином; б) взаимодействие диазосоединения с ароматическим соединением, имеющим амино- или оксигруппу и образование окрашенного в фиолетовый цвет азосоединения. В реакциях сульфаниловой кислоты и НЭДА, а также сульфаниламида и НЭДА выход окрашенного азосоединения максимален при рН ~ 3,0 ± 0,2. Изменение рН в ту или иную сторону резко снижает интенсивность окраски. При определении нитритов в растворах с высоким содержанием хлора (например, в моче) предпочтительно вместо сульфониловой кислоты выбрать сульфаниламид, так как ионы СГ влияют на реакцию нитритов с сульфаниловой кислотой.
Нитраты и нитриты достаточно хорошо растворяются в воде. Однако ионы N0^ и N0^ могут связываться с белками. Поэтому для повышения полноты выделения использовали нагревание на водяной бане (50-70 ° С) в течение 30 мин при нейтральном или слабощелочном значении рН. Для осаждения белков использовали ЩСЬ. Для более эффективного осаждения белков и получения прозрачных образцов исследуемый раствор центрифугировали в течение 20 мин при 10 000 g, а затем фильтровали через мембранные фильтры с ё=0,25 мкм.
Определение концентрации ионов N0^ осуществляли следующим образом. В пробирку вносили 1 мл сыворотки, добавляли 1 мл Н20 и проводили цветную реакцию, используя при этом 0,25 мл 4% раствора НС1, содержащий 1
мг сульфаниламида, перемешивали и оставляли на 5 мин. Затем добавляли 0,05 мл 0,2% раствора К-(1-нафтил)этилендиамин дигидрохлорида (ГОДА), доводили до объема 5 мл, перемешивали и через 10 мин колориметрировали по отношению к контрольному раствору в кюветах толщиной 1 см при длине волны А.=538 нм. Количественное определение нитритов проводили, используя градуировочный график, построенный с учетом оптической плотности стандартных растворов нитрита натрия. Для построения калибровочной кривой использовали вышеописанную процедуру и стандартные растворы №N0*.
Полярографическое измерение скорости дыхания. Полярографический метод определения концентрации веществ заключается в проведении электролиза исследуемого раствора в электрохимической ячейке. Этот метод основан на интерпретации зависимости между силой тока, проходящего через систему при подведении к этой системе внешней электродвижущей силы. Концентрацию кислорода в среде инкубации при дыхании митохондрий в закрытой ячейке определяли полярографически с помощью вращающегося платинового электрода. В качестве электрода сравнения использовали хлорсеребряный электрод, соединяющийся с измерительной ячейкой агар-агаровым мостиком. Последовательность операций по проведению полярографического измерения скорости дыхания заключалась в следующем. В полярографическую ячейку вносили среду инкубации, субстраты окисления и регистрировали нулевую линию, характеризующую диффузионный ток, пропорциональный начальной концентрации кислорода в полярографической ячейке. Через специальное отверстие с помощью автоматической пипетки вносили суспензию митохондрий из расчета 1,5-2 мг белка в 1 мл среды инкубации. На самописце регистрировали изменение тока, пропорциональное изменению концентрации кислорода в полярографической ячейке.
Концентрацию белка в суспезии митохондрий определяли по методу Лоури (1951).
Получение оксида и диоксида азота осуществляли соответственно по методу Тиля (Карякин, 1955) и И.Е. Иопша и О.П. Спиридоновой (1939). Оксид азота получали по методу Тиля. Для этого к раствору БеСЬ в 50% соляной кислоте после 10-15 минутного продувания всей системы аргоном по каплям с помощью шприца добавляли концентрированный раствор №N0*. При этом происходила реакция восстановления N0)" в N0:
БеСЬ +ИаШ2 +2НС1 =РсС13 + ЫаС1 + Н20 + N0 (1)
Образующийся газообразный оксид азота пропускали через концентрированный раствор щелочи для удаления примесей и подавали в сосуд, содержащий гемоглобин, кровь, гомогенат ткани или суспензию митохондрий или микросом.
Диоксид азота получали по методу И.Е. Иошпа и О.П. Спиридиновой, который заключался в действии азотной кислоты на NN02:
2NaN02 + 2HN03 NaN03 + H20 + NO + N02 (2)
с последующим окислением N0 в NO2. В качестве сырья использовали "химически чистый" NaNO2 следующего состава (показатели качества по ГОСТ):
Азотистокислый натрий, не менее 99%; Хлориды (С1), не более 0,005%; Сульфаты (SO4), не более 0,005%; Тяжелые металлы (РЬ), не более 0,0002%; Железо (Fe), не более 0,0002%; Калий (К), не более 0,002%
Измерение флуоресценции пиридиннуклеотидов в митохондриях. Для измерения окислительно-восстановительных реакций пиридин- 1гуклеотидов в митохондриях печени использовали флуоресцентный метод. Источником света служила ртутно-кварцевая лампа СВД-120А
Растворы для перфузии тканей. Эти растворы готовили на свежей дистиллированной воде с рН 7,4 с добавлением 8,0 г NaCl и 300 мг гепарина на 1л.
Среда выделения митохондрий печени. Состав среды выделения: 250 мМ сахарозы, 10 мМ трис-HCl, рН 7,4.
Среда инкубации митохондрий печени. Состав среды инкубации: 250 мМ сахарозы, 30 мМ КС1,3 мМ КН2Р04,10 мМ MgCl2, 5 мМ трис-HCl, рН 7,4.
Методы математической статистики. Статистический анализ данных осуществляли с помощью пакетов программ GrafPadPrizm, Statgrafïcs и Microsoft Excel с использованием критерия Стьюдента.
ЧАСТЬ 1. ИССЛЕДОВАНИЯ РЕГУЛЯТОРНОГО И ТОКСИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НИТРИТОВ И ПРОДУКТОВ ИХ ПРЕВРАЩЕНИЯ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
Глава 1. Влияние нитритов на содержание гемоглобина в крови
животных
Метгемоглобинобразующее действие нитритов
Поступление токсических доз нитритов в кровь in vivo в течение первых 5-10 мин приводит к заметному (5-25% от максимальных значений гемоглобина) образованию метгемоглобина и Hb-NO комплексов. Отношение окисленного гемоглобина в крови к интактному (метНЬ/НЬ) зависит от дозы нитритов, поступивших в кровь. Через 30 мин после поступления нитритов в кровь концентрация метгемоглобина достигает 35-50% от максимальных значений, а спустя приблизительно через 1 ч. отмечаются максимальные концентрации метгемоглоглобина и гемоглобин-NO комплексов. На рис. 2 а, б представлены оптические спектры поглощения гемоглобина, выделенного из крови крыс до и через 1 ч после введения NaNO2 в дозе 5 мг/100 г массы тела (а), и спектры ЭПР крови через 1 ч после введения NaNO2 в дозе 5 мг/100 г массы тела (б), а на рис. 3 - динамика образования метгемоглобина после поступления нитритов в дозах 2-7 мг/100 г массы тела. Концентрация метгемоглобина в крови, как указывалось выше, зависит от дозы нитритов, поступивших в организм. Дозы нитритов менее 0,1 мг/100 г массы тела практически не влияют на содержание метгемоглобина в крови. Начиная с доз равных 0,5-1,0 мг/ 100 г массы тела у отдельных животных начинает повышаться уровень метгемоглобина, который, однако, не превышает 5-7% (при норме 1-2,5%). Заметное повышение метгемоглобина наблюдается, начиная с доз NaNO2 2 мг/100 г массы тела. Именно поэтому особое внимание мы уделили воздействию доз NaNO2 от 2 мг/100 г до смертельных 7 мг/100 г массы тела а, в некоторых случаях, и более высоких доз.
На рис. 3 представлена динамика образования метгемоглобина после введения NaNO2 в дозах 2-7 мг/100 г массы тела. Видно, что в течение первого часа происходит увеличение концентрации метгемоглобина, которая, достигнув экстремума через 50-60 мин, практически не изменяется до 1,5 ч, а затем относительно медленно начинает снижаться. Спустя 5-7 часов уровень метгемоглобина приближается к контрольным значениям. Анализируя кривые образования и восстановления метгемоглобина интересно при этом отметить то обстоятельство, что время восстановления метгемоглобина приблизительно одинаково в случаях поступления относительно низких и высоких доз нитритов.
Рис 2. Оптические спектры поглощения гемоглобина, выделенного из крови крыс до и через 1 ч после введения NN0., в дозе 5 мг/100 г тела (а), и спектры ЭПР крови через 1 ч после введения №N0., в дозе 5 мг/100 г в дозе 5 мг/100 г массы тела (б)
а - оптические спектры поглощения гемоглобина крови контрольных животных (пунктирная линия) и у животных спустя 1 ч после введения NN0. (сплошная линия); б -спектры ЭПР метгемоглобина с g ~ 6,0 и №-N0 комплексов с g = 2,01. Условия регистрации сигнала ЭПР: мощность СВЧ -10 мВт; амплитуда модуляции - 5Гс, усиление -5-10, частота модуляции - 100 кГц, постоянная времени - 0,032 с, микроволновая частота - 9,3 Ггц, магнитное поле - 2200 Гс, диапазон сканирования магнитного поля - 4,0 кГс, температура регистрации - 77 К.
Рис 3. Динамика образования метгемоглобина в крови животных при введении различных доз №N0.,, а - доза 7 мг/100 г массы тела, б-S мг/100 г, в - 3 мг/100 г, г - 2 мг/100 г
По оси ординат - содержание метгемоглобина в % от общей концентрации гемоглобина; по оси абсцисс - время от момента введения №N01, ч. Значком " +" отмечена концентрация метНЬ в крови в момент гибели 3-х животных после введения 7мг/100 г массы тела
Поэтому можно сделать вывод: чем выше уровень метгемоглобина, тем выше и скорость его восстановления. Естественно возникают вопросы: 1) каким образом осуществляется окисление гемоглобина в метгемоглобин и восстановление последнего снова в гемоглобин? 2) какие компенсаторно -приспособительные механизмы включаются при поступлении относительно высоких концентраций нитритов? 3) какие факторы влияют на активацию процесса восстановления метгемоглобина в крови при поступлении относительно высоких концентраций нитритов? и, наконец, 4) каким образом можно защитить пострадавших при нитратно-нитритных интоксикациях? Выясняя механизмы регуляторного и токсического действия нитритов на живые организмы, мы старались найти ответы на эти вопросы, давно стоящие перед врачами-токсикологами.
Глава 2. Токсическое и регуляторное действие нитритов и продуктов их превращения - N0 и на уровне мембран клеток и субклеточных
структур
В клетке, как известно, содержится несколько тысяч белков, действие которых должно быть строго согласовано между собой во времени и во внутриклеточном пространстве. Одним из механизмов регуляции активности ферментов является образование из групп белков организованных систем. Связывание белков на мембранах повышает стабильность белков, и, как правило, увеличивает активность тех белков-ферментов, которые включены в мультиферментные комплексы. Изучая механизмы восстановления ионов N0^ в N0 в крови мы обратили внимание, что в эритроцитах на фоне образования НЬ - N0 комплексов происходит снижение содержания пигмента крови (рис. 4 а). Кроме того, на фоне повышения содержания а-аминоазота (рис. 4 г) было отмечено снижение содержания альбумина и общего белка в сыворотке крови (рис. 4 б, в). Объяснить результаты этих исследований нам помогли наши данные, свидетельствующие о том, что продукт превращения N0 - диоксид азота (N02), может индуцировать на ненасыщенных жирных кислотах и некоторых аминокислотах (тирозине) образование парамагнитных центров. Само образование парамагнитных центров на ненасыщенных жирных кислотах и белках могло явиться одним из ключевых механизмов, лежащих в основе как повреждающего действия нитритов и продуктов их метаболизма - N0 и N02, так и компенсаторно-приспособительных механизмов, включающихся в ответ на действие окислительного стресса, связанного с действием указанных выше нитросоединений. Повреждающее действие, как известно, связано с действием экстремальных факторов и доз химических соединений, а реализация компенсаторно-приспособительных механизмов осуществляется на фоне кратковременных или умеренных факторов стресса. Справедливость нашей гипотезы о том, что образование парамагнитных центров на ненасыщенных жирпых кислотах и белках могло явиться одним из ключевых механизмов, лежащих в основе как повреждающего действия нитритов
Рис 4. Содержание гемоглобина (а), общего белка (£), альбумина (в) и а -аминоазота (г) в крови крыс через 1 ч после введения NaNO2 в дозе 5 мг на 100 г массы тела
Светлые столбики - контроль; заштрихованные - опыт. Звездочка -р й 0,001. По оси ординат - содержание: а, б, в - в г/л, г - в мг/л.
и продуктов их метаболизма - NO и NO2, так и компенсаторно-приспособительных механизмов, мы проверяли в течение более двух десятилетий. Эти исследования были проведены на различных биологических моделях с участием разных исследовательских групп, которые могли бы подтвердить или опровергнуть плодотворность нашей гипотезы. Эти данные послужили также основой для того, чтобы предложить исследователям проблемы нитратов, нитритов и М-нитрозаминов дополнить цепочку, состоящую из указанных трех звеньев еще двумя другими звеньями - N0 и N0.
Известно, что популярность триады нитратов, нитритов и N-нитрозаминов продержалась почти 40 лет, вплоть до конца XX в. С открытием "эры нитрозаминов", начало которой положила работа P. Magee и J. Barnes (1956), нитраты и нитриты оказались в центре внимания в качестве главных предшественников канцерогенных N-нитрозосоединений (НС), а ее авторы стали одними из наиболее часто цитируемых авторов. Долгое время эндогенное образование нитросоединений считалось единственным механизмом, определяющим канцерогенную опасность, связанную с поступлением нитратов и нитритов в организм животных и человека. Интерес к нитритам и нитрозосоединениям особенно возрос после работы J. Sander (1967). В этой работе впервые была доказана возможность образования канцерогенных нитросоединений in vitro из нитритов и вторичных аминов в желудочном соке человека.
Во второй половине XX в. нитратам, нитритам и шггрозаминам были посвящены экспериментальные исследования, а также проблемные и обзорные статьи ведущих ученых, работающих в различных областях биологии и медицины. Под этим названием проходили многочисленные конференции и симпозиумы. Многие документы, разрабатываемые специальными комиссиями и представителями ООН в области медицины, были посвящены нитратам, нитритам и N-нитрозаминам. В этих условиях внедрить два звена (рис. 5), связанного с N0 и NO2, до наступления "эры" N0 в биологии и медицины было чрезвычайно сложно.
Рис 5. Свободно-радикальные продукты, образующиеся при восстановлении нитритов
Образование парамагнитных продуктов при взаимодействии оксидов азота с аминокислотами
Были изучены продукты взаимодействия N0 и N02 с насыщенными в деионизованной воде растворами 20 аминокислот, входящими в состав белков животного происхождения. Взаимодействие осуществляли путем 10 мин продувания N0 и N02 при комнатной температуре через насыщенные растворы отдельных аминокислот.
В опытах по взаимодействию N0 с насыщенными растворами аминокислот нам не удалось обнаружить образования парамапштньгх продуктов. Однако при взаимодействии N02 с насыщенными растворами аминокислот образование парамагнитных продуктов удалось наблюдать лишь при взаимодействии диоксида азота с насыщенным раствором тирозина. Сигнал ЭПР этих парамагнитных продуктов представлял собой одиночную линию с g-
фактором 2,005 и шириной линии ДН = 9Гс(рис. 6). Ранее парамагнитные продукты тирозина были обнаружены в условиях облучения водных растворов УФ светом при 77 °К. За возникавший при этом сигнал ЭПР были ответственны продукты двух типов: феноксильный радикал и электроны, захваченные средой инкубации.
Тирозин относится к группе фенолов животного происхождения. Поэтому его можно рассматривать как биологический антиоксидант (биоантиоксидант). Согласно существующим представлениям взаимодействие между фенолом и радикалом происходит в результате постепенного образования комплексного соединения, когда верхний единственный электрон переходит на общий уровень комплекса, образованного между фенолом и радикалом.
Рис. 6. Спектр ЭПР свободных радикалов тирозина после его взаимодействия с NO2 в течение 10 мин при 20°С
Температура регистрации 77 К. Стрелками обозначены 3-я и 4-я линии поглощения эталона Мм" (ё3 - фактор 2,031 и & - 1,981 соответственно). Ниже представлена предполагаемая реакция образования феноксильного радикала (П) при взаимодействии NCb с тирозином и реакция образования нитротирозина (Ш).
Диоксид азота К02 является весьма активным окислителем, сродство к электрону которого равно 4+0,16 эв, что почти на порядок выше сродства к электрону у кислорода (0,44 эв). Отсутствие парамагнитных продуктов при взаимодействии К02 с ароматической аминокислотой фенилаланином, который отличается от тирозина отсутствием ОН-группы в 4-м положении, дает основание предполагать, что парамагнитные центры тирозина возникают в результате отрыва атома Н от гидроксильной группы (рис. 6 и схема образования феноксильного радикала и нитротирозина).
Причиной отсутствия парамагнитных продуктов в реакции N0 с тирозином являются, по-видимому, более низкие электронно-акцепторные свойства N0 по сравнению с N0^ Изучение продуктов взаимодействия N0 и N02 с сывороточным альбумином человека (концентрация 10"3 М) не выявило образования парамагнитных продуктов в растворе белка. Следствием отсутствия парамагнитных продуктов явилась, по-видимому, относительно низкая концентрация тирозиновых остатков, которая не позволила выявить их нашим методом. Однако нельзя также исключить и того, что N0 в отличие от N02 не способен отрывать атом Н от ОН-группы тирозина.
В настоящее время известно, что в процессе взаимодействия оксидов азота с тирозином происходит нитрование этого ароматического соединения и образуется нитротирозин. Некоторые авторы считают, что оксид и диоксид азота, связываясь с тирозиновыми остатками, входящими в состав белков, могут переноситься с кровью на большие расстояния, соизмеримые с теми, когда оксид азота связывается с гемоглобином крови.
Итак, можно предположить, что в зависимости от концентраций оксидов азота (и особенно диоксида азота) последние могут участвовать в токсическом или регуляторном действии. Можно ожидать, что образование феноксильных радикалов тирозиновых остатков белковых молекул может явиться одним из первичных актов реакций, в ходе которых происходит его нитрование. Можно так же полагать, что высокие концентрации N0 и N02, могут явиться одной из причин образования относительно высоких концентраций пероксинитритов, которые, распадаясь, могут, в свою очередь, приводить к образованию весьма реакционноспособных радикалов, способных повреждать белки и другие органические соединения, одними из которых могут быть ненасыщенные жирные кислоты. Ниже будут приведены результаты исследования действия оксидов азота на насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты.
Образование парамагнитных продуктов при взаимодействии оксидов азота с жирными кислотами
Изучали продукты взаимодействия N0 и N02 с насыщенными жирными кислотами - масляной, пальмитиновой и стеариновой. Образования парамагнитных центров в этих реакциях не было обнаружено. При
взаимодействии NCb с олеиновой кислотой (ненасыщенная жирная кислота) было обнаружено несколько парамагнитных продуктов.
В первые минуты реакции NO2 с олеиновой кислотой спектр ЭПР представлял собой широкий неразрешенный сигнал с g-фaктopoм = 2,003 и шириной линии между точками максимального наклона АН = 8,4Гс;[рис.7а). Последующее взаимодействие NCh с олеиновой кислотой приводило к существенному изменению формы спектра ЭПР (рис.7б). По своим параметрам он совпадал со спектром ЭПР иминоксильного радикала 2,2,6,6 - тетраметил-4-окситшеридин-1-оксил, растворенного в олеиновой кислоте, и измеренного при 77° К.
Такие нитроксильные радикалы, оставались стабильными в течение нескольких часов, после чего на фоне уменьшения концентрации этих радикалов наблюдали изменение интенсивности отдельных компонент сигнала ЭПР. На рис. 7 в представлен сигнал ЭПР олеиновой кислоты спустя 24 часа после реакции с NO2.
Рис 7. Спектры ЭПР олеиновой кислоты после взаимодействия с NO2 при 20° С: а-1-2 мин, 0-30 мин, в-24 ч
Спектры регистрировали при 77 К. Ниже представлены предполагаемые реакции образования нитроксильных радикалов
Известно, что образование радикалов ненасыщенных жирных кислот происходит при отрыве электрона или атома водорода от реагирующей молекулы. Наименьшую энергию необходимо затратить, чтобы оторвать атом водорода от углерода, находящегося в а-положении по отношению к двойной связи. Обнаружение нами широкого сигнала ЭПР в начальной стадии реакции NO2 с олеиновой кислотой может явиться подтверждением свободнорадикального механизма окисления последней. Несколько большую энергию нужно затратить для разрыва С-Н - связи у углеродного атома с двойной связью. Можно полагать, что на этой стадии реакция не заканчивается и в дальнейшем, по-видимому, протекает по схеме, представленной на рис. 7. Широкий спектр ЭПР, наблюдаемый спустя 24 ч после взаимодействия олеиновой кислоты с N0^ по-видимому, обусловлен продуктами разрушения шпроксильных радикалов.
Исходя из полученных результатов, можно думать, что ненасыщенные жирные кислоты и тирозиновые остатки мембранных липопротеиновых структур могут явиться своеобразными мишенями, с которыми взаимодействует диоксид азота, а образование парамагнитных центров с указанными выше веществами - первичным актом повреждения мембран.
Исследование влияние нитритов на мембраны эритроцитов крови крыс
На рис.8я-г представлены данные электронно-микроскопического анализа эритроцитов до и после введения ^N0^ Видно, что в примембранной области эритроцитов возникают осмиофильные электронно-плотные зоны. Кроме того, такие же зоны можно было также наблюдать и на поверхности эритроцитов (рис. 9). В некоторых случаях отмечали образование неравномерно расположенных участков с повышенной осмиофильностью. Таким образом, совместное использование биохимических методов анализа содержания белков, в ходе проведения которых было обнаружено снижение содержания белков (рис. Ла-в) и метода электронной микроскопии (рис. 8, 9), позволило показать, что при действии NO-генерирующих соединений в клетках возникают условия, благоприятные для перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние.
Однако вместе с перераспределением белков из растворимого в мембранно-связанное состояние была отмечена локальная перфорация мембран и выход белков из эритроцитов (рис. 9). Эти данные указывали на то, что повышенная концентрация оксида азота и продуктов его превращения может явиться причиной тех явлений, которые ведут к гибели клеток по типу некроза не только в эритроцитах, но и в других клетках, например, в нейронах мозга теплокровных и холоднокровных животных [23,33,34,40,41,49, 55].
Рис 8. Микрофотографии эритроцитов крыс до и после введения NaNCh в дозе 5 мг/100 г массы тела
Контроль: а - х 6000, б - х 10000, в - х 60000, через 30 мин после введения №N0,; г - х 8000, д - х 10000, е - х 10000, ж - х 12000, через 60 мин после введения №N02.
Рис 9. Микрофотографии эритроцитов крыс после введения NaNCb в дозе 5 мг/100 г массы тела
Через 60 мин после введения NaNCV. з - х 30000, и - фрагмент локального нарушения мембраны, представленного на микрофотографии з. к - х 30000; л - фрагмент локального нарушения мембраны, представленного на микрофотографии к\з, и-начальная стадия выхода белков из эритроцита; к, л - более поздняя стадия разрушения мембраны.
Через 2 ч после введения NN0^ М - 80000; через 4 ч после введения №N0,^-80000.
Обсуждение механизмов перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние и связанных с ними процессов
Мы полагаем, что данные полученные нами методом ЭПР и свидетельствующие о возможности образования парамагнитных центров на аминокислотах и ненасыщенных жирных кислотах позволяют приблизиться к пониманию некоторых механизмов, лежащих в основе, индукции явления перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние.
Анализ и обобщение данных литературы, а также результатов собственных исследований, позволили нам предложить объяснение наблюдаемым явлениям. Согласно нашим представлениям механизм индукции такого перераспределения состоит в том, что свободно-радикальные соединения N0 и N02 вызывают на фоне внутриклеточного ацидоза образование парамагнитных центров как на цитоплазматических и мембранных белках, так и на ненасыщенных жирных кислотах, входящих в состав липидов мембран. Эти парамагнитные центры могут явиться центрами полимеризации белков цитоплазмы с мембранно-связанными белками и липидами, входящими в состав мембран.
Оксид и диоксид азота, являясь свободным радикалом, способен участвовать в цепных свободно-радикальных реакциях, в ходе которых наряду с актами продолжения и обрыва цепей, могут осуществляться также и элементарные реакции размножения активных центров, т.е. те реакции, которые были названы Н.Н.Семеновым реакциями разветвления цепей. Одним из наиболее ярких доказательств реальности цепных механизмов является обнаружение цепной природы реакций полимеризации, при которых о прохождении цепи можно судить по оставленному ею "следу" - молекуле полимера. Явление перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние, по-видимому, является следствием реакции полимеризации, возникающей благодаря инициации N0 свободно-радикальных реакций. Таким образом, наличие у N0 и N02 неспарешюго электрона и вследствие этого повышенная химическая активность, обеспечивающая возможность реакции полимеризации, позволяет объяснить образование комплексов белков с белками и белков с липидами.
Анализ данных литературы позволил нам предсказать, а затем и подтвердить вместе с другими соавторами благоприятный эффект малых доз N0-генерирующих соединений при действии стрессирующих факторов [41, 4345, 52]. Этот эффект мы объяснили тем, что малые дозы N0-генерирующих соединений, вызывающие перераспределение белков из растворимого в мембранно-связанное состояние, могут оказывать защитное действие от повреждения наиболее уязвимых для N02 ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав мембран клеток и субклеточных структур. Каким же образом белки, находящиеся в примембранной области, могут защищать ненасыщенные жирные кислоты? Мы полагаем, что защитное действие белков, находящихся в примембранной области, может быть обусловлено тем, что оксид и диоксид азота, вступая во взаимодействие с рядом функционально
активных группировок аминокислот, входящих в состав белков, могут связываться с ними. Это имеет место, например, при взаимодействии N0 или NO2 с 8И-группами серосодержащих аминокислот. Или отрывать электрон или атом водорода от ОН-группы, как это было показано в случае реакции с тирозином, и тем самым уменьшать. вероятность окисления ненасыщенных жирных кислот этими высокореакционными соединениями. Таким образом, белки, расположенные в примембранной области, могут выполнять защитную функцию для наиболее уязвимых компонентов мембран - ненасыщенных жирных кислот. Такие защитные эффекты могут иметь место при развитии стрессорных повреждений, связанных с судорожными состояниями [41, 43-45, 52]. В дальнейшем вместе с другими соавторами [19,28, 30, 41,43] нам удалось объяснить некоторые особенности повреждающего действия N0 при токсическом воздействии глутамата на нейроны мозга [19, 28, 54] и действии некоторых пестицидов на организм млекопитающих в присутствии' и в отсутствие повышенной нитратно-нитритной нагрузки [9]. Благодаря этим результатам появилась возможность для проведения совместных исследований с сотрудниками ряда лабораторий Институтов РАН и РАМН. Основной целью этих совместных исследований была проверка указанной выше гипотезы о роли N0 и N02 в реализации механизмов токсического и регуляторного действия нитритов.
Кроме того, в ходе конференций, симпозиумов и, особенно, дискуссий о роли нитритов и продуктов их превращения в реализации - компенсаторно-приспособительных реакций и патологических изменений, мы. старались изменить сложившиеся представления. Особенно это относилось к механизмам, лежащих в основе благоприятных и токсических эффектов нитритов. Как. указывалось выше, мы предлагали ввести в цепочку нитраты-* нитриты -> Ы-нитрозамины два других соединения - N0 и КОг. Однако, дополняя цепочку: нитраты-* нитриты —> Ы-нитрозамины оксидом и диоксидом азота (N0 и N02), которые в жидких средах превращаются снова в нитриты и нитраты, мы не могли не заметить, что указанная цепочка с неизбежностью трансформируется в цикл (рис. 9).
Таким образом, исследуя механизмы токсического и регуляторного действия нитритов, мы невольно выходили на циклические превращения N0 и продуктов его превращения - нитратов и нитритов. Естественно возникает вопрос: какие регуляторные механизмы могут включаться при активации синтеза нитратов, нитритов и N0 в организме млекопитающих?
Основным сигнальным механизмом для оксида азота, по-прежнему, остается активация растворимой гемсодержащей гуанилатциклазы, повышение концентрации свМР, активация в-киназ, а также активация синтеза белков теплового шока. Вместе с тем, полученные нами данные могут свидетельствовать о том, что еще до начала синтеза белков теплового шока, которые могут участвовать в механизмах адаптации, постоянно
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ^ БИБЛИОТЕКА 1 СПтрвург £ 09 МО «с« X
Рис 9. Циклическая схема основных путей метаболизма нитратов и нитритов в организме млекопитающих
существующие в цитоплазме белки могут переходить из растворимого в мембранно-связанное состояние и, тем самым, участвовать в реализации компенсаторно-приспособительных реакций.
Активация ферментных систем после перехода их из растворимого в мембранно-связанное состояние известна несколько десятилетий. Так, например, известно, что повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ индуцирует переход протеинкиназы с из растворимого в мембранно-связанное состояние. Однако при этом ничего не было известно о возможности участия в этом процессе N0 или продуктов метаболизма этого соединения. В наших работах впервые был предложен и обоснован механизм перехода белков из растворимого в мембранно-связанное состояние либо при участии N0 и N0-генерирующих соединений, либо при активации нитритредуктазных систем при гипоксии, что также связано с активацией процессов образования N0 [1]. Мы полагаем, что явление перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное „при участии N0 или продуктов метаболизма этого соединения может иметь большое значение для понимания еще одного (кроме того, который осуществляется с участием еОЫР1 сигнального механизма. А именно, механизма, в котором принимают участие нитриты и продукты их превращения (N0 и N0Л), индуцирующие перераспределение белков из растворимого в мембранно-связанное состояние. Такой сигнальный механизм был известен для протеинкиназы с, которая, как известно, в присутствии ионов Са2+ способна переходить из растворимого в мембранно-связанпое состояние, для активации ферментов гликолиза в условиях внутриклеточного ацидоза (повышение концентрации протонов Н+) при гипоксии и для некоторых других процессов. Однако, насколько нам известно, никто еще не показывал, что подобный механизм может активироваться N0 и продуктами его превращения. Тем не менее, повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ с неизбежностью должно повышать активность N0-синтаз в тех клетках, где эти ферменты присутствуют. Известно также, что повышение концентрации ионов Н* (внутриклеточный ацидоз) всегда приводит к активации неферментативных реакций превращения нитритов в N0 (так называемый неэнзиматический путь образования оксида. азота).. И,~ наконец, дефицит кислорода, как это было показано в наших работах и работах наших коллег всегда приводит к активации
ферментативного образования NO из нитритных ионов при участии нитритредуктазных систем. Таким образом, все перечисленные процессы оказываются взаимосвязанными и могут взаимно усиливать процессы активации образования N0 и метаболические процессы.
Действительно, мы видели, что повышение доз нитритов в крови, а, следовательно, и метгемоглобина не приводит к увеличению длительности процесса восстановления окисленного гемоглобина (рис. 3). Следовательно, повышение концентрации метгемоглобипа должно с необходимостью приводить к увеличению скорости восстановления метгемоглобина, поскольку большее количество метгемоглобина восстанавливается приблизительно за одно и то же время (рис. 3). Все эти процессы осуществляются на фоне перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние (рис. 8, 9). Поэтому имеются все основания полагать, что перераспределение белков из растворимого в мембранно-связанное состояние приводит к активации метаболических процессов, связанных с восстановлением метгемоглобина внутри эритроцитов. Интересно также отметить, что важную роль в процессе восстановления метгемоглобина играют гликолитические процессы. Известно также, что активация гликолиза происходит при перераспределении двух ключевых гликолитических ферментов - 3-фосфоглицеринальдегиддегидрогеназы и лактатдегидрогеназы из растворимого в мембранно-связанное состояние. Таким образом, наши данные и развиваемые представления хорошо согласуются с данными литературы. Если этот механизм носит универсальный характер, тогда можно говорить об обнаружении нового механизма регуляции метаболических процессов при участии нитритов, N0 и продуктов их метаболизма. Насколько этот механизм действительно является универсальным, можно было проверить в ходе наших совместных исследований с разными исследовательскими группами, работающих на различных биологических моделях.
А теперь еще раз подчеркнем, что биологическое значение перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние может заключаться во-первых, в защите наиболее уязвимых компонентов клеток - ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов мембран клеток и субклеточных структур, и, во-вторых, в активации ферментативных процессов при образовании полиферментных комплексов вблизи мембран клеток и субклеточных структур. Методами биохимии это можно обнаружить по снижению содержания белков в растворимой части клеток и субклеточных структур (рис. 4), а морфологически по просветлению цитоплазмы и матрикса субклеточных структур с одновременным увеличением осмиофильности в примембранной области клеток (рис. 8, 9).
Таким образом, полученные нами данные о возможности индукции пространственного перераспределения белков в результате действия N0 и продуктов его метаболизма (NO2) позволили объяснить механизм перехода белков из растворимого в мембранно-связанное состояние. Мы полагаем, что этот механизм можно рассматривать как систему быстрого реагирования в ответ на действие экстремальных факторов. Наличие такой системы быстрого
реагирования, по-видимому, позволяет резко менять уровень клеточного метаболизма за время, в течение которого не успевают включиться процессы биосинтеза белков. Действительно, связывание белков на плазматической мембране и на мембранах субклеточных структур, по сути дела, является их иммобилизацией. При такой иммобилизации значительно увеличивается стабильность белков и время их жизни. Кроме того, при иммобилизации белков на мембранах возрастает скорость ферментативных реакций, в том числе и тех, которые увеличивают синтез АТФ. А это, в свою очередь, может запускать механизмы компенсаторно-приспособительных изменепий. Согласуются ли развиваемые нами представления с имеющимися данными и существующими в настоящее время в литературе концепциями и теориями?
Согласно теории Г. Селье при избыточных нагрузках на организм и ткани, па так называемой "стадии устойчивости", как правило, развиваются компенсаторно-приспособительные изменения (стресс-реакция, по Г. Селье), которые мобилизуют энергетические и структурные ресурсы клеток и организма в целом и обеспечивают направленную передачу их из неактивных тканей в активную. "Стадия устойчивости", как известно, наблюдается в тех случаях, когда продолжающееся влияние стрессора соизмеримо с адаптацией. После долговременного воздействия сильного стрессора (в нашем случае химического стрессора - ионов N0^ и, особенно, продуктов их превращения -N0 и N02) наблюдаются необратимые изменения в клетках, которые могут привести к гибели организма. Какие молекулы клеток способны участвовать в развитии "общего адаптационного синдрома"?
Известно, что из всех разновидностей молекул клеток именно белковые макромолекулы находятся в неравновесном состоянии. Они способны путем изменения конформации (конформационная перестройка), перехода из растворимого в мембранно-связанное состояние (обратимая альтерация по Д.Н. Насонову и В.Я. Александрову) или путем синтеза так называемых "белков теплового шока" участвовать в формировании системного структурного следа (Ф.З. Меерсон). Благодаря такой комплексной перестройки работы белковых макромолекул достигается гомеостаз тканевых систем, как при повреждении, так и изменении эволюционной нормы адаптации клеток организма.
Полученные нами данные и развиваемые представления о механизме перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние мы постарались проверить в совместных экспериментах с другими исследователями.
Ультраструктурные изменения клеток тканей млекопитающих при гипоксии/ишемии. Известно, что морфо-функциональные показатели изменения клеток при гипоксии возникают стереотипно в различных тканях животных. Такая неспецифичность ответных реакций клеток может свидетельствовать о наличии универсального молекулярного механизма, вызывающего развитие сходных ответов. Так, например, в лаборатории профессора Н.С. Косицына методами оптической и электронной микроскопии исследовали структурно-функциональные перестройки в идентифицированной зоне соматосенсорной коры мозга кошки при экспериментальной
гипоксии/ишемии, вызванной перевязкой сонной артерии. Показано, что в идентифицированной зоне соматосенсорной области коры мозга кошки наиболее чувствительными структурными компонентами пирамидных нейронов V слоя коры больших полушарий при гипоксии являются апикальные депдриты. Электронно-микроскопическое исследование той же соматосенсорной области коры головного мозга кошки показало, что увеличение плотности распределения шипиков апикальных дендритов пирамидных нейронов V слоя при гипоксии/ишемии сопровождается ультраструктурными изменениями: наблюдается усложнение строения шипикового аппарата, увеличение протяженности активных зон синаптических контактов, увеличение электронной плотности отдельных областей матрикса цитоплазмы. Наблюдаемые структурные изменения при экспериментальной гипоксии могли свидетельствовать о мобилизации метаболических процессов и повышении функциональной активности мозга. Однако механизмы, лежащие в основе таких ультраструктурных изменений в мозге долгое время оставались неизвестными. Полученные нами данные о возможности активации процесса перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние под влияние оксида азота были использованы для проверки, предложенного нами объяснения причин увеличения протяженности активных зон синаптических контактов и изменения электронной плотности отдельных областей матрикса цитоплазмы. В связи с тем, что при гипоксии/ишемии активируется синтез оксида азота, можно было предположить возможность участия этого химически и физиологически активного соединения в механизмах, которые лежат в основе изменения концентрации белков в примембранной области и в отдельных областях матрикса цитоплазмы. Вместе с сотрудниками лаборатории Н.С. Косицына нами были проведены эксперименты, которые подтвердили развиваемые нами представления. Так, совместно с М.М. Свиновым было изучено влияние аппликации 1% раствора нитроглицерина на ультраструктурные изменения плексиморфного слоя коры головного мозга и показано, что под влиянием этого N0-генерирующего соединения происходит увеличение протяженности активных зон синаптических контактов (в среднем на 18-20%) [25]. Дальнейшие исследования, проводимые нами в лаборатории Н.С. Косицына, подтвердили факт того, что активация синтеза оксида азота при гипоксии может индуцировать пространственное перераспределение белков из растворимого в мембранно-связанное состояние, что в свою очередь может явиться одной из причин увеличения протяженности активных зон синаптических контактов и изменения электронной плотности отдельных областей матрикса цитоплазмы [27].
Для того чтобы убедиться в том, что эти данные можно распространять не только на плексиморфный слой коры головного мозга, нами были проведены эксперименты совместно с сотрудниками 3-х лабораторий: Института педиатрии Научного центра детей РАМН, Института мозга РАМН и Института патофизиологии РАМН, руководителями которых являлись профессоры В.Г.
Пинелис, И.В. Викторов и Б.И. Ходоров. В работе также принимали участие сотрудники Е.Г. Сорокина, Н.П. Винская, Т.П. Сторожевых, А. Юрявичус. Общей целью этих экспериментов было провести анализ ультраструктурных изменений зернистых клеток мозжечка при токсическом воздействии нитрита натрия и глутамата и сопоставить эти изменения с выживаемостью и некоторыми биохимическими показателями. Целью наших конкретных исследований было проверить истинность собственных представлений о механизмах токсического и регуляторного действия нитритов, как N0-генерирующих соединений. Поэтому мы будем обсуждать лишь те данные, которые непосредственно касаются механизмов токсического и регуляторного действия нитритов и NO-генерирующих веществ.
Влияние NO-генерирующих соединений на выживаемость нейронов в присутствии альбумина, обладающего способностью связывать жирные кислоты. В таблице 1 представлены данные влияния нитрита натрия нитропруссида натрия на гибель нейронов через 4 часа после воздействия. ТАБЛИЦА.
ВЛИЯНИЕ НИТРИТА НАТРИЯ И НИТРОПРУССИДА НАТРИЯ (10; 100 и ЮООшМ) НА ГИБЕЛЬ НЕЙРОНОВ (% МЕРТВЫХ КЛЕТОК; М±т) ЧЕРЕЗ 4 ЧАСА ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ
Контроль NaN02 SNP
ЮмкМ 100 мкМ ЮООмкМ ЮмхМ ЮОмкМ ЮООмкМ
6,9±1,2 9,2±1,8 18,4+2,1 26,0+4,0 16,1±2,8 27,1± 1,9 49,1±8,9
Сам факт окрашивания клеток трипановым голубым при токсическом воздействии NaNCb и нитропруссида натрия свидетельствовал о нарушении целостности мембран клеток. Ранее мы указывали, что оксиды азота (N0 и особешю NO2) способны повреждать ненасыщенные жирные кислоты [5, 6], входящие в состав мембран клеток. Жирные кислоты, как известно, хорошо связываются альбумином. В связи с этим в другой работе [31] мы проверили возможность участия нитритов и продуктов их превращения в повреждении мембран клеток в присутствии альбумина.
Эксперименты показали, что альбумин заметно потенцирует нейротоксичность NaNO2. В присутствии альбумина гибель нейронов при
воздействии ЮмкМ NaNO2 возрастала с 7,4±2,0% в контроле до 26,5+1,9%
(р<0,001) в опыте. При воздействии 100 мкМ NaNO2 в отсутствие и в
присутствии альбумина гибель нейронов возрастала с 18,9+0,8% до 37,7+3,5% (р< 0,001). Альбумин потенцировал и действие нитропруссида №. Так, при воздействии 10 мкМ SNP в отсутствие и в присутствии альбумина гибель нейронов возрастала с 9,6+0,8% до 16,3+2,6% (р<0,01), а при воздействии 100 мкМ SNP гибель нейронов возрастала соответственно с 19,7+2,1% до 29,6+2,1% (р<0,01) [31]. Эти данные подтвердили наше предположение о том, что NO-генерирующие соединения играют важную роль в механизме повреждения
мембран нейронов и, что потенцирующее действие альбумина на гибель нейронов в присутствии нитритов может быть обусловлено повреждающим воздействием N0 и, возможно, продуктов превращения этого высокореакционного соединения, например, двуокиси азота N02 и
пероксинитрита (ONOO). Как указывалось выше мишенями токсического действия окислов азота являются как белки (тирозиновые остатки), так и ненасыщенные жирные кислоты [5, 6]. Можно было предполагать, что потенцирующее действие альбумина связано, прежде всего, с прооксидантным действием N0 и N02 на ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав липидов мембран.
Если высказанные нами представления о механизме потенцирующего действия альбумина действительно связаны с прооксидантным действием окислов азота, тогда и другие соединения, отличные от N0 и N02 и обладающие прооксидантным действием на ненасыщенные жирные кислоты, также должны усиливать свое повреждающее действие в присутствии альбумина. Исследование действия прооксиданта FeCl2 (10 мкМ) на гибель зернистых клеток мозжечка в отсутствие и в присутствии альбумина [31] подтвердило наши представления о том, что потенцирующее действие альбумина на гибель нейронов может быть связано с прооксидантным действием свободно-радикальных соединений. Так, например, воздействие 10 мкМ FeCl2 приводило к 21,3+2,3% гибели нейронов в культуре. В присутствии альбумина процент гибели нейронов возрастал до 51,5+4,0% (р<0,001). Поскольку FeCl2 активирует перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот, можно предполагать, что мишенями токсического действия окислов азота могут быть именно ненасыщенные жирные кислот [31].
Возможная роль оксида азота и продуктов его метаболизма в повреждении глутаматных рецепторов при эпилепсии. Данные, свидетельствующие о том, что оксид азота и продукты его метаболизма (например, NO2) могут участвовать в повреждении мембран клеток мы старались применить в разных моделях, где активируются NO-синтазы и повышается концентрация N0 и нитритов. Действительно, центральным звеном в цепочке нейрональных нарушений является увеличение концентрации внутриклеточного кальция, который в свою очередь активирует синтез оксида азота. Наряду с данными, свидетельствующими о повреждающем действии N0 и продуктов его превращения при целом ряде заболеваний нервной системы, имеются также данные и о способности этого вещества защищать нейроны мозга при эпилепсии. Поэтому нередко говорят, что оксид азота ведет себя как "двуликий Янус".
Одним из последних достижений медицинской нейрохимии явилось развитие иммуноферментных методов диагностики эпилепсии. Показано, что в крови людей, страдающих эпилепсией и у крыс с экспериментально вызванной эпилепсией, наблюдается значительное повышение содержания аутоантител (аАТ) к АМРА-подтипу ионотропных глутаматных рецепторов Glu Ri.
Доказано, что указанные выше аутоантитела могут рассматриваться как маркеры функционального поражения головного мозга и использоваться для диагностики пароксизмалыюй активности. В нашей работе [49] мы проанализировали роль нитритов и N0 в повышении образования аАТ к подтипу глутаматных рецепторов (GluRi) у крыс с аудиогенно вызванными судорогами. С этой целью сравнивали образование аАТ к подтипу глутаматных рецепторов (Glu Ri) у крыс с аудиогенно вызванными судорогами, у контрольных животных и у крыс с повышенным образованием оксида азота после введения нитрита натрия.
Содержание аАТ к Glu R1 оценивали в относительных единицах по оптической плотности (ЕОП) при X = 492 нм, выражая данные в процентах по отношению к контролю, при этом значения ЕОП контрольных животных принимали за 100 %. Результаты исследования показали, что уровень аАТ к глутаматным рецепторам Glu Ri в сыворотке крови у крыс линии КМ сразу после судорожного припадка не изменялся (0,369 ± 0,03 ЕОП - в контроле, 0,367 ± 0,03 ЕОП - после припадка). Однако через 3 дня у этих крыс отмечалось достоверное повышение уровня аАТ к глутаматным рецепторам (0,519 ± 0,01 ЕОП до повторного припадка, 0,596 ± 0,02 ЕОП - после повторного припадкар <, 0,05). В аналогичных условиях у крыс линии Wistar, не предрасположенных к судорожной готовности, уровень аАТ Glu Ri через 3 дня после аудиогенного стресса оставался неизменным. При действии нитрита натрия обнаружен сильно выраженный дозозависимый и развивающийся со временем эффект повышения уровня аАТ к Glu Ri через 2-3 дня после введения этого вещества. Введение 0,9% раствора NaCl не вызывало повышения аАТ к Glu Ri, в то время как введения NaNO2 приводило к достоверному увеличению аАТ к Glu Ri на 46 % (р <. 0,001 по сравнению с контролем). Через 1 час после введения NaNO2 уровень аАТ в крови возрастал на 11%, через 3 суток - на 89%, при этом дополнительная инъекция аналогичной дозы NaNO2 приводила к еще большему росту концентрации аАТ к Glu Ri (на 104%). Влияние NaNO2 на рост концентрации аАТ имело выраженный дозозависимый характер. Так при введении NaNO2 в дозе 3 мг/100 г массы тела после двух инъекций содержание аАТ в крови возрастало на 55% по сравнению с уровнем аАТ к Glu Ri у контрольных крыс, которым вводили 0,9% раствор NaCl. Введение большей дозы NaNO2 (5 мг/100 г массы тела) по аналогичной схеме приводило к увеличению уровня аутоантител на 176% по сравнению с контрольными животными [49]. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что активация процессов, связанных с синтезом нитритов, оксида азота и продуктов его метаболизма, в живых организмах может приводить к повышению уровня аутоантител к глутаматным рецепторам. Какие механизмы могут лежать в основе такого повышения уровня аАТ к Glu Ri?
Ранее было показано, что оксид азота и особенно его свободно-радикальные продукты превращения (NO2) могут воздействовать на ненасыщенные жирные кислоты и вызывать локальные повреждения плазматических мембран. Не исключено, что именно такие повреждения
мембран могут быть причиной высвобождения некоторых субъединиц глутаматных рецепторов и повышения уровня аЛТ к этим рецепторам. Естественно возникает вопрос: не является ли такая способность оксида азота высвобождать глутаматные рецепторы одним из механизмов защиты этих клеток от чрезмерного воздействия глутамата. На этот вопрос еще предстоит ответить специалистам, изучающим глутаматпую нейротоксичность. Для нас же главное в этой работе заключается в том, что мы смогли применить данные, полученные при работе с ненасыщенными жирными кислотами и N0-генерирующими соединения для объяснения ранее пепонятных для нейропатологов и нейрохимиков процессов.
Кроме того, полученные в ходе этих исследований данные могут быть использованы для идентификации нитратно-нитритных интоксикаций спустя 23 суток, когда признаков метгемоглобинемии в крови уже нет, но остался повышенный уровень аАТ к Glu Ri. Поэтому, если у пациентов по данным электроэнцефалограммы нет признаков, которые можно отнести к слабовыражешюй (или скрытой) эпилепсии, то повышенный уровень аутоантител аАТ к Glu R\ может быть дополнительным критерием к клинической картине при анализе нитратно-нитритных интоксикаций, которые, иногда трудно идентифицируются. Более подробно этот вопрос будет обсужден в части 2.
Ультраструктурные изменения мозжечка лягушки Rana Temporaria при токсическом воздействии нитрита. Серия работ, проведенных нами и опубликованных совместно с Н.В. Самосудовой, Н.П. Ларионовой и Л.М. Чайлахяном [24, 36, 37, 45, 52, 60], была обусловлена и продиктована тем, что нас интересовала, прежде всего, проверка тех механизмов токсического и регуляторного действия нитритов, которые были описаны выше. Доказательство того, что эти механизмы работают как на теплокровных, так и на холоднокровных животных подтверждало бы универсальный характер их действия.
В работах [24, 36, 37, 45, 52, 60] мы исследовали ультраструктурные изменения клеток мозжечка лягушки Rana Temporaria при воздействии на них нитрита натрия. Наши интересы, прежде всего, были связаны с тем, чтобы проверить возможность перфорации плазматических мембран при токсическом воздействии нитритов и продуктов их метаболизма. Действительно, если верны наши представления относительно N0 и, особенно, NO2, то окисление ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов мембран, должно было привести к нарушению целостности мембран. Таким образом, наша совместная работа могла бы подтвердить наши более ранние данные и основахшые на них представления о механизме токсического действия нитритов. Результаты этих исследований подтвердили тот факт, что нитриты и продукты их превращения (оксид и диоксид азота) способны вызывать перфорацию мембран и у холоднокровных животных [24,36,37,45,52,60].
В работе [37], проведенной нами совместно с Н.В. Самосудовой и Н.П. Ларионовой, было исследовано влияние нитрита натрия на ультраструктуру нейронов и глиальных клеток мозжечка лягушки Rana temporaria. Показано,
что в присутствии нитритов на фоне изменения клеточной структуры повышается контрастность отдельных элементов цитоскелета и тем самым улучшается их визуализация. Обнаружено также, что контрастность элементов цитоскелета зависит от концентрации нитритов: усиливается при относительно умеренных концентрациях и снижается при высоких концентрациях этого соединения. На основании анализа данных литературы и результатов собственных исследований мы предположили, что усиление контрастности элементов цитоскелета может быть связано с переходом белка из растворимого в мембранно-связанное состояние, тогда как снижение контрастности - с распадом белковых нитей, например, с трансформацией фибриллярного актина в глобулярный. Полученные результаты могли свидетельствовать о ведущей роли цитоскелета в реализации компенсаторно-приспособительных изменений нейронной сети мозжечка в условиях действия нитритов, как N0-генерирующих соединений. Таким образом, тот факт, что оксид азота может выступать в качестве модулятора контрастности основных элементов цитоскелета в нейронах лягушки, подтверждал наши данные и те представления, которые мы проверяли в ходе этих совместных исследований.
В дальнейшем в другой нашей работе [52], было проведено более детальное изучение локализации электронно-плотного осадка, связанного с микротрубочками аксонов зернистых клеток и дендритов клеток Пуркинье. Установлено, что осадок локализуется на микротрубочках аксонов и дендритов с определенной периодичностью, равной примерно 24-25 нм. Имеются основания считать, что этот электронно-плотный осадок содержит Са2+, поскольку после обработки срезов хелатором Са2+ - раствором ЭГТА (20 мМ) осадок исчезал. Следует подчеркнуть, что осадок особенно хорошо образуется при стимуляции мозжечка в присутствии N0. Стимуляция, как это хорошо известно, значительно повышает концентрацию Са2+ в межклеточном пространстве, а N0 обладает способностью индуцировать перераспределение белков в клетках мозжечка. В контрольных эксперимиггах инкубация мозжечка в растворе Рипгера в присутствии N0, но без стимуляции не вызывала появления осадка ни на микротрубочках, ни на других структурах, упомянутых выше. Результаты этих исследований свидетельствовали о том, что этот осадок либо вообще не появляется, либо содержание его заметно ниже, чем в опытах со стимуляцией изолированного мозжечка в присутствии N0-генерирующего соединения [52].
Оксид азота как один из факторов повышения резистентности животных к патогенным воздействиям. Ранее в Институте патофизиологии РАМН, а также на кафедрах физиологии и высшей нервной деятельности Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова при участии сотрудников Института неврологии РАМН было установлено, что адаптацию к гипоксии можно рассматривать как неспецифический фактор повышения резистентности к многочисленным патогенным воздействиям. В частности было показано, что 2-х недельная адаптация крыс линии Крушинского-Молодкиной в условиях реального высокогорья или в интервальном режиме в
барокамере (5000 м) приводила к достоверному снижению смертности, тяжести общей и локальной неврологической симптоматики при аудиогенном стрессе.
В связи с тем, что при гипоксии активируются процессы образования оксида азота, мы предположили, что одним из факторов защитного действия может быть N0 и продукты его метаболизма, которые способны индуцировать перераспределение белков из растворимого в мембранно-связанное состояние. Нами было предложено коллективу исследователей, работающих в МГУ им. М.В. Ломоносова, провести совместные исследования, чтобы проверить гипотезу о возможном участии нитритов и N0 в механизмах повышения резистентности к патогенным воздействиям у крыс линии Крушинского-Молодкиной. Мы предполагали, что под влиянием N0 и продуктов его метаболизма будет иметь место переход белков из растворимого в мембранно-связашюе состояние и тем самым будут защищаться ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав липидов мембран. Благодаря перераспределению белков из растворимого в мембранно-связанное состояние вероятность повреждения клеток тканей будет уменьшаться, а это может привести к уменьшению площади кровоизлияний. В работе принимали участие проф. В.Б. Кошелев и сотрудники А.Л. Крушинский, B.C. Кузенков, Т.В. Рясина, О.Е. Фадюкова. Целью работы явилось изучение влияния нитрита натрия и блокатора NO-синтазы на устойчивость животных к действию стрессирующего фактора, приводящего к сердечно-сосудистым нарушениям и внутричерепным кровоизлияниям. Удобным объектом для этого исследования явились крысы линии Крушинского-Молодкиной (КМ), генетически предрасположенные к аудиогенным судорожным припадкам. У этих животных длительное акустическое воздействие приводит к резкому возбуждению мозга, развитию судорожных припадков, вегетативным нарушениям и внутричерепным кровоизлияниям, которые в ряде случаев заканчиваются смертью.
Проведенные эксперименты показали [48], что нитрит натрия в дозе 0,5 мг/100 г массы тела, практически не повышающий уровень метгемоглобина в крови, оказывал значительный защитный эффект на животных в условиях акустической экспозиции. Это проявлялось в уменьшении смертности в опытной группе по сравнению с контролем (0% и 25% соответственно, р £ 0,001). Средняя площадь субдуральных и видимых суарахноидальных кровоизлияний у опытных животных в 6,7 раз меньше, чем в контроле (12,1 ± 5,9 мм2 и 80,9 ± 18,3 мм2 соответственно, р ^ 0,001).
Нитрит натрия в дозе 5 мг/100 г, вызывающий образование метгемоглобина в пределах 50-65%, снижал устойчивость животных в условиях акустического стресса. Это проявлялось в увеличении доли животных с тяжелыми нарушениями движений в опытной группе по сравнению с контролем (90,9% и 50% соответственно, р й 0,05). У опытных животных выражена тенденция к увеличению средних площадей субдуральных и видимых субарахноидальных кровоизлияний по сравнению с контрольными (205 ± 15,6 мм2 и 149 ± 16,6 мм2, р <; 0,13). Показатели, характеризующие
возбудимость центральной нервной системы достоверно не различались в обеих группах.
Блокатор N0-синтазы L-NNA в 3-х изученных дозах (0,25 мг/100 г, 2,5 мг/100 г и 25 мг/100 г) достоверно снижал устойчивость крыс в условиях акустической экспозиции, увеличивая смертность и тяжесть нарушений движений [48]. Наблюдалось также увеличение площадей субдуральных и видимых субарахноидальных кровоизлияний у опытных животных по сравнению с контрольными при увеличении дозы блокатора Так, при дозе 0,25 мг/100 г достоверные различия по этому показателю между опытными и контрольными животными отсутствовали (39,9 ± 10,5 мм2 и 43,4 ± 13,0 мм2). При дозе 2,5 мг/100 г наблюдалась тенденция возрастания субдуральных и видимых субарахноидальных кровоизлияний у опытных животных по сравнению с контрольными (73,9 ± 16,8 мм2 и 43,4 ± 13,0 мм2 соответственно) При дозе 25 мг/100 г массы тела наблюдаются четкие различия между площадями субдуральных и субарахноидальных кровоизлияний у опытных и контрольных животных (173 ± 21,6 мм2 и 83,2 ± 3,3 мм2 соответственно, РЛ,01)
При одновременном введении блокатора N0-синтазы L-NNA в дозах 0,25 мг/100 г или 2,5 мг/100 г массы тела и нитрита натрия ^0-генерирующего соединения) в дозе 0,5 мг/100 г массы тела эффект блокатора N0-синтазы был достоверно снижен Это проявилось в значительном снижении смертности и тяжести нарушений движений у животных, получавших одновременно L-NNA и нитрит натрия по сравнению с животными, получавших только L-NNA. При одновременном введении L-NNA в дозе 25 мг/100 г и нитрита натрия в дозе 0,5 мг/100 г массы тела повреждающий эффект блокатора N0-синтазы на животных в условиях акустической экспозиции сохранялся.
В проведенных экспериментах установлено, что нитрит натрия в дозах 0,5 мг/100 г и 5 мг/100 обладает разнонаправленным действием на животных в условиях акустического стресса. Снижение устойчивости животных в условиях акустической экспозиции при введении нитрита натрия в дозе 5 мг/100 г можно объяснить развитием под влиянием этой дозы №N02 гемической формы гипоксии Известно, что гипоксия мозга является одним из критических факторов при развитии внутричерепных кровоизлияний. Известно также, что усиление синтеза оксида азота при восстановлении ионов N02 может вызывать ингибирование дыхательной цепи митохондрий. Кроме того, известно, что образование N0 в дозах, превосходящих нормальный физиологический уровень, может приводить к активации синтеза анионов пероксинитрита ^N00') При физиологических рН эти анионы, присоединяя протон Н*, в течение секунды распадаются с высвобождением высокореакционного свободно-радикального соединения диоксида азота (N02) и гидроксильного ('ОН) радикала Последние, как известно, могут участвовать в повреждении ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав мембран нервных и эндотелиальных клеток, а также приводить к нарушению целостности мембран
эритроцитов, кровеносных сосудов и вызывать локальные кровоизлияния. Увеличение площадей субдуральных и видимых субарахноидальных кровоизлияний под влиянием высоких доз нитрита натрия, по-видимому, связано именно с такими нарушениями мембран клеток и кровеносных сосудов.
Действие относительно низких доз нитрита натрия - 0,5 мг/100 г массы тела, не вызывающее увеличение содержания метгемоглобина, приводило к повышению устойчивости крыс к действию акустического стресса. Какие механизмы могут лежать в основе этого действия? Ранее нами было показано, что умеренное повышение содержания N0 и продуктов его метаболизма индуцирует пространственное перераспределение белков из растворимого в мембранно-связанное состояние [1]. При таком перераспределении белков может значительно увеличиваться как стабильность этих белков, так и стабильность мембран. Кроме того, при перераспределении белков и ферментов из растворимого в мембранно-связанное состояние могут активироваться многие ферментные системы, в том числе и ферменты гликолиза, участвующие в синтезе АТФ. При этом могут запускаться многочисленные механизмы комлепсаторно-приспособительных изменений, одним из которых, как это было показано нами совместно с И.П. Левшиной и Н.Н. Шуйкиным [48], является повышение скорости локального кровотока. Благодаря этому может повышаться скорость доставки в ткани кислорода и тех физиологически активных веществ, которые способны увеличивать резервные возможности организма. К числу физиологически активных соединений, способных переноситься с током крови и проникать через гематоэнцефалический барьер, можно отнести оксид азота. Переносчиками оксида азота могут быть гемоглобин (гемовые группы), альбумин ^Н-группы), а также низкомолекулярные соединения NO-глутатион (нитрозоглутатион), цистеин (нитрозоцистеин), низкомолекулярные комплексы, включающие железо и серу (например, динитрозильные комплексы железа) и др.
Использование ингибитора NO-синтазы L-NNA показало [62], что этот ингибитор во всех изученных дозах (0,25 мг/100 г, 2,5 мг/100 г и 25 мг/100 г) увеличивал стрессорные повреждения, возникающие в результате акустического воздействия. При одновременном введении L-NNA в дозах 0,25 мг/100 г или 2,5 мг/100 г и нитрита натрия в дозе 0,5 мг/100 г наблюдали снижение стрессорных повреждений, вызванных блокатором NO-синтазы в условиях акустической экспозиции. Эти данные свидетельствовали о том, что нитриты и продукты его метаболизма в организме млекопитающих, в частности NO, могут оказывать благоприятное влияние при близких к физиологическим значениям концентраций этого вещества. Однако при токсических дозах этого вещества можно наблюдать не только метгемоглобинемию, но и локальные повреждения мембран клеток и субклеточных, структур, что по-видимому, связано с ранее описанными нами процессами повреждения ненасыщенных жирных кислот.
Проверка возможности активации процессов перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние в эритроцитах онкобольных и опухолевых клетках животных. В связи с тем, что активация синтеза оксида азота наблюдается при опухолевых процессах, мы обратились в отдел патоморфологии Онкологического научного центра РАМН с целью сопоставить полученные нами экспериментальные данные с их клиническим материалом.
Лечащие врачи, работающие в Онкологическом научном центре РАМН, как и многие другие врачи давно обратили внимание на значительное снижение концентрации гемоглобина у онкобольных. Содержание гемоглобина в крови таких больных могло снижаться до 7-8 г% (70-80 г/л) и ниже. Патоморфологи, имеющие дело с биопсийным материалом, в тех случаях, когда вместе с этих материалом в поле зрения оказывались эритроциты, нередко наблюдали электронно-плотные участки в примембранной области эритроцитов. При этом они никогда не связывали эти явления с перераспределением гемоглобина и других внутри- и внеэритроцитарных белков в примембранную область. В связи с тем, что ранее мы наблюдали снижение содержания гемоглобина внутри эритроцитов и уменьшение белка в сыворотке крови, а электронно-микроскопические исследования показывали в этих случаях усиление осмиофильности в примембранной области, то нам легко было прийти к пониманию этих процессов, как явления перераспределения белка из растворимого в мембранно-связанное состояние.
Сопоставление наших экспериментальных данных с клиническим материалом нашло дальнейшее свое продолжение в виде 2-х статей [37, 52]. В одной из них [52] было исследовано влияние пероксидных радикалов и оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток. В этой работе было показано, что оксид азота при малых концентрациях [10"7-10"8М] не только не усиливает токсичность свободно-радикальных агентов, но и защищает опухолевых клетки от их повреждающего воздействия. Кроме того, было показано, что в указанных выше концентрациях N0-генерирующие соединения повышают включение [3Н]-тимидина в клетки карциномы Эрлиха, что свидетельствовало о стимуляции пролиферации опухолевых клеток относительно низкими концентрациями оксида азота. Эти новые данные подтверждали результаты предыдущих исследований и развиваемые нами представления, полученные в более ранних наших работах. При действии высоких концентраций (КГ4-10"3 М) веществ, генерирующих N0, наблюдалось проявление токсического их действия, что также хорошо согласовалось с другими данными, полученными нами в сотрудничестве с нашими коллегами. Так данные, полученные на опухолевых клетках, хорошо согласовывались, с результатами, опубликованными нами с другими коллегами, которые были получены на мышах высокораковых линий Д/ЗпеИ и гибридах (С57В1ХСВА) [37]. В этой работе было показано, что важную роль в развитии опухолевого процесса играют реакции превращения нитритов в свободные радикалы N0 и N02. Ингибирование свободных радикалов, образующимися при восстановлении нитритов в N0, антиоксидшггами снижало процент
животных, у которых под влиянием NO-генерирующих соединений развивались опухоли. Кроме того, следует отметить, что эффекты, связанные с действием NO-генерирующих веществ, зависели от их доз. Все эти данные свидетельствовали о важной роли реакции восстановления нитритов в N0. Более подробно механизмы восстановления нитритов в N0 будут рассмотрены в следующих главах.
Глава 3. Восстановление ионов NO2~ в крови
3.1. R- и Т-конформеры Hb-NO комплексов, образующиеся при восстановлении нитритов в N0
В работах [7, 10] было показано, что при взаимодействии крови и гемоглобина с NaN02 in vitro наблюдается образование парамагнитных комплексов, спектры ЭПР которых по форме были идентичны со спектрами ЭПР R-коиформеров Hb-NO комплексов (рис. 10). При внутривенном введении нитрита натрия форма спектров ЭПР парамагнитных комплексов, образующихся в крови, зависит от дозы NaN02. При введении низких доз NaNO2 (от 1 до 5 мг/100 г) в крови образуются парамагнитные комплексы, спектры ЭПР которых близки по своей форме спектрам ЭПР Т-конформеров Hb-NO комплексов (рис. 11). Однако по мере увеличения доз NaNO2 до летальных или близких к ним (выше 7 мг/100 г массы тела) вместе с ростом интенсивности стлала ЭПР изменяется его форма: спектр ЭПР из триплетного переходит в слабоструктурированный сигнал с g=2,03, форма которого соответствует сигналу ЭПР Hb-NO комплексов, находящихся в R-конформации (рис. 12,13).
Для того чтобы выяснить, отличаются ли парамагнитные комплексы, образующиеся при взаимодействии NaNO2 с кровью in vitro и in vivo и имеющие спектр ЭПР с g-фактором 2,01, по своим свойствам от R-конформеров Hb-NO комплексов, были поставлены эксперименты по изучению действия натрия додецилсульфата (НДС), изменения рН среды инкубации и оксигенации исследуемых парамагнитных комплексов. В этих опытах не было обнаружено отличия в свойствах парамагнитных комплексов, образующихся в крови при действии NaNO2, по сравнению с известными свойствами R-конформеров Hb-NO комплексов. Эти данные позволили нам отнести парамагнитные комплексы, имеющие спектр ЭПР с g-фактором 2,01 и образующиеся при взаимодействии NaNO2 с кровью in vitro и in vivo, к R-конформерам Hb-NO комплексов.
В опытах in vitro было обнаружено, что парамагнитные комплексы крови, имеющие спектр ЭПР, идентичный со спектром ЭПР R-конформеров Hb-NO комплексов, могут под влиянием дополнительного продувания N0 изменять свои спектры, которые при этом становятся по своей форме подобными Т-конформерам Hb-NO комплексов.
ГЕМ
Рис. 10. Спектр ЭПР (а) и локализация железа гема в R-конформерах Hb-NO комплексов (б, в)
Рис 11. Спектр ЭПР (а) и локализация железа гема в Т-конформерах Hb-NO комплексов (б, в)
Рис 12. Спектры ЭПР Т-конформеров ИЪ-КО комплексов, образующихся в крови крыс спустя 1 ч после внутривенного введения нитрита натрия в дозе 4 мг/100 г (А-К - образцы крови от 10 животных) (слева)
Рис 13. Спектры ЭПР Я-конформеров ИЪ-КО комплексов, образующихся в крови крыс спустя 1 ч после внутривенного введения нитрита натрия в дозе 8 мг/100 г (А-Л - образцы крови от 11 животных) (справа)
Выявлено отличие свойств Я- и Т-конформеров №-N0 комплексов по отношению к оксигенации. Показано, что оксигенация Т-конформеров №-N0 комплексов приводит к уменьшению их концентрации. Я-конформеры №-N0 комплексов оказались весьма устойчивыми по отношению к действию кислорода. Совокупность этих данных позволила понять роль Я- и Т-конформеров в процессе транспорта кислорода и оксида азота в живых организмах [1, 7, 10, 18]. Так, например, в тех случаях, когда организму необходимо доставить молекулу N0 на расстояния, значительно превышающие
межклеточные, транспорт этого соединения осуществляется в виде №-N0 комплексов с последующим Я->Т-переходом и высвобождением N0 в тех тканях, где понижено содержание кислорода. При этом первоначально образовавшиеся Я-конформеры №-N0 комплексов освобождаются от части связанного с гемоглобином кислорода и переходят в условиях недостатка кислорода в Т-конформеры №-N0 комплексов, которые значительно слабее удерживают лиганд N0. Согласно развиваемым нами представлениям Я<->Т-переходы чрезвычайно важны для связывания лиганда N0 и удерживания его в процессе транспорта в Я-конформации. В местах с пониженным содержанием кислорода, когда Я-конформеры №-N0 комплексов переходят в Т-конформеры этих комплесов происходит высвобождение N0. Полученные нами данные в настоящее время подтверждены в работах Ю.А. Владимирова, его коллег и учеников. Так, в частности, в работах профессора Г.И. Клебанова и его коллег -А.Н. Осипова и Г.Г. Борисенко (1997) было показано, что при действии низкоинтенсивного лазерного излучения на №-N0 комплексы происходят Я-ЛТ-переходы, которые сопровождаются высвобождением лиганда N0 и снижением концентрации парамагнитных №-N0 комплексов.
3.2. Восстановление нитритов в реакции с дезокси- и оксигемоглобином
Для того, чтобы проверить способность гемоглобина восстанавливать ионы в N0^ в N0, были проведены опыты по инкубации окси- и дезоксигемоглобина с №N02 [1, 8]. Обнаружено, что при взаимодействии №N02 с дезоксигемоглобином образуются только Я-конформеры №-N0 комплексов. Причем кинетика образования Я-конформеров №-N0 комплексов зависит от наличия кислорода. В присутствии кислорода наблюдается более чем 3-х часовой индукционный период. В бескислородных условиях инкубационный период отсутствовал. Спустя 12 часов концентрация Я-конформеров №-N0 комплексов, образовавшихся в присутствии кислорода, была почти в 6 раз меньше по сравнению с концентрацией этих комплексов в отсутствие кислорода. Однако спустя 2-е суток после начала реакции гемоглобина с уровень парамагнитных комплексов, образовавшихся в
первом и во втором случае, различался только в 1,6 раза.
При взаимодействии NaN02 с метгемоглобином (НЬ3+), полученным в результате окисления гемоглобина (НЬ2+) феррицианидом, образования №-N0 комплексов вообще не наблюдали. Продувание N0 через раствор метгемоглобина приводило к появлению парамагнитных комплексов пигмента крови с N0. Эти данные свидетельствовали о том, что метгемоглобин теряет способность восстанавливать ионы N0^ в N0, а не способность образовывать парамагнитные комплексы в реакции с N0. Имеются основания предполагать, что в процессе взаимодействия N0 с метгемоглобином, электрон с N0 может переходить на железо метгемоглобина с последующим восстановлением метгемоглобина до гемоглобина и в дальнейшем образования комплексов НЬ2+-N0. Можно также ожидать, что часть молекул N0 при взаимодействии с метгемоглобином может отдавать ему один электрон с образованием N0+.
Для того чтобы понять причину существования индукционного (латентного) периода в кинетике образования Hb-NO комплексов, было проведено сопоставление датгых, получаемых методом ЭПР и оптической спектрофотометрии. Согласно данным спектрофотометрии в первые минуты (или даже секунды) взаимодействия оксигемоглобина с NaNC>2 происходят такие изменения оптических спектров поглощения пигмента крови, какие наблюдаются при его окислении. Однако в окислительно-восстановительных реакциях окисление одного компонента реакции (оксигемоглобина в метгемоглобин) должно сопровождаться восстановлением второго компонента этой реакции (ионов NCV в N0). Поэтому, если бы оксигемоглобин в первые секунды взаимодействия с №N02 действительно бы окислялся в метгемоглобин, тогда бы мы не наблюдали индукционного периода в кинетике образования Hb-NO комплексов Наличие индукционного периода в кинетике образования Hb-NO комплексов свидетельствует о том, что на первой стадии взаимодействия оксигемоглобина с ^N02 не происходит окисления пигмента крови
Для того чтобы найти объяснение как данным ЭПР-спектрометрии, так и данным спектрофотометрии, мы предположили, что стадии окисления оксигемоглобина ионами NO2- предшествует стадия перераспределения электронной плотности в молекуле оксигемоглобина с переносом электрона на кислород и образованием супероксидного анион-радикала. В дальнейших работах как отечественных, так и зарубежных исследователей, предложенный нами механизм окисления метгемоглобина с образованием супероксидных анион-радикалов был подтвержден Более того, было показано, что добавление супероксиддисмутазы к раствору, содержащему гемоглобин и нитрит натрия, существенно увеличивает латентный период в кинетике окисления пигмента крови. Эти данные свидетельствовали о том, что не только нитритные ионы, но и супероксидные анион-радикалы (или продукты их превращения) участвуют в окислении пигмента крови. Нельзя также исключить, что наличие супероксидных анион-радикалов является одной из причин образования в реакции взаимодействия нитритов с оксигемоглобином пероксинитритов, которые окисляют гемоглобин в метгемоглобин без образования Hb-NO комплексов. Однако по мере выделения кислорода и снижения концентрации супероксидных анион-радикалов, часть нитритов успевает восстановиться до N0 и образовать Hb-NO комплексы. Именно поэтому, можно предположить, что в кинетике образования Hb-NO комплексов в присутствии кислорода отмечается латентный период и снижена концентрация указанных выше парамагнитных комплексов.
Оксигемоглобин, согласно представлениям М. Перутца (1970), является динамической системой, третичная и четвертичная структура которой осциллирует между окси- и дезоксиконформациями. Нами было показано, что активно восстанавливать ионы NO2- может дезоксигемоглобин, а не оксигемоглобин. Поэтому мы считаем, что для восстановления ионов NO2- в N0 оксигемоглобин должен предварительно перейти в дезокси-состояние. Наличие связанного с гемоглобином кислорода ингибирует нитритредуктазную
активность гемоглобина, что и является причиной индукционного (латентного) периода в кинетике образования №-N0 комплексов в присутствии кислорода.
НЬ2+ + Ш2" + 2Н* -> НЬ3+ + N0 +Н20 (2)
Образующийся N0, согласно данным литературы, может связываться с восстановленным гемоглобином и образовывать с ним прочные комплексы. В реакции взаимодействия N0 с метгемоглобином образуются слабосвязанные комплексы, которые либо распадаются (см. обратную реакцию), либо за счет переноса электрона от N0 меттемоглобин восстанавливается до НЬ2* с последующим образованием Hb2+-N0:
В связи с тем, что в литературе имелись неоднозначные данные о количестве №-N0 комплексов, образующихся при взаимодействии нитритов с пигментом крови, была предпринята попытка оценить при помощи метода ЭПР содержание этих комплексов. Оценка процентного содержания №-N0 комплексов по отношению к общему содержанию гемоглобина, участвующего в процессе взаимодействия с нитритами, заняла промежуточное значение среди данных литературы и составила 10-12%. Однако в процессе взаимодействия нитритов с пигментом крови действует ряд факторов, способствующих уменьшению количества №-N0 комплексов. Поэтому указанное выше процентное содержание этих комплексов не может явиться точной характеристикой нитритредуктазной способности гемоглобина.
Итак, каким же образом происходит восстановление ионов N0^ в N0 в крови при участии гемоглобина в самых общих чертах? После поступления в кровь ионы N0^ проникают через эритроцитарные мембраны. Механизм транспорта ионов N0^ через плазматические мембраны, в том числе и эритроцитарные мембраны, пока еще не изучен. Однако ряд авторов обсуждают возможность проникновения ионов N0^ внутрь эритроцитов при участии анионного обменника, известного как "белок полосы 3", и посредством простой диффузии. Транспорт ионов N0^ осуществляется достаточно быстро, что приводит, как было нами установлено, уже в первые 5 мин после внутривенного введения раствора NN0^ в дозах 2-7 мг/100 г массы тела к образованию достаточно высокого уровня метгемоглобина в крови - от 10 до 45%. Одновременно с окислением гемоглобина наблюдается образование НЬ-
N0 комплексов и метгемоглобина, что указывает на сопряженность этих процессов. Наиболее эффективно восстанавливает ионы NO2-B NO гемоглобин, находящийся в дезокси-форме. Кислород, связанный с гемоглобином является ингибитором нитритредуктазной активности пигмента крови. Кроме того, следует также учитывать, что восстанавливать нитритные ионы в N0 может гемоглобин, у которого железо гема находится в восстановленном 2-х валентном состоянии. Поэтому нельзя не учитывать роль ферментативных и неферментативных систем, участвующих в восстановлении гемоглобина крови.
З.З.Оценка влияния аскорбиновой кислоты на образование комплексов гемоглобина с оксидом азота в крови животных
Данные литературы свидетельствовали о том, что у животных, которым вводили NaNO2, повышается содержание аскорбиновой кислоты плазме крови. Аскорбиновая кислота, как известно, является не только восстановителем метНЬ, но и одним из восстановителей ионов NO2-. Поэтому можно было ожидать увеличение интенсивности процесса восстановления ионов NO2* in vivo под влиянием аскорбиновой кислоты, поступающей из тканей в кровь в ответ на введение NaNO2-. Чувствительным тестом на аскорбиновую кислоту является иминоксильный радикал (ИР). Являясь акцептором электронов, ИР при взаимодействии с донорами электронов типа аскорбиновой кислоты переходит в непарамагнитное вещество. Изучая кинетику гибели ИР в опыте и контроле можно следить за изменением окислительно-восстановительных свойств биологических жидкостей (рис. 14).
5
4 3 21
0 5 10 15 20 КМИН)
Рис 14. Кинетика гибели иминоксильного радикала (ИР) в плазме крови, взятой у животных до (1) и после введения №N02 в дозах 5 мг/ 100 г массы тела (2), 10 мг/100 г массы тела (3) и 15 мг/100 г массы тела (4). По оси ординат - концентрация ИР в молях, по оси абсцисс - время в мин.
В наших экспериментах был использован ИР 2,2,6,6-тетраметил-4-оксипиперидин-1-оксил, формула которого представлена в описании методики
С х 10"5 М
экспериментов. На рис. 14 представлена кинетика гибели ИР в плазме крови, взятой у животных через 30 мин после введения им различных доз NaNCA. Видно заметное возрастание скорости гибели ИР в плазме крови по мере увеличения доз NaNO2 от 5 мг/100 г до 15 мг/100 г. При взаимодействии ИР с плазмой крови контрольных животных скорость гибели последнего была чрезвычайно мала (рис. 14). Под влиянием внутривенного введения NaNO2 восстановительная способность плазмы крови повышалась.
Введение аскорбиновой кислоты контрольным животным в дозах от 0,1 мг/100 до 5'мг/100 г приводило через 30 мин к аналогичному увеличению восстановительной способности плазмы крови (рис. 15). Сравнение кинетик гибели ИР под влиянием введения NaNC>2 (рис. 14) и аскорбиновой кислоты (рис. 15) показывает, что восстановительная способность плазмы крови изменяется в первом случае на величину, соответствующую введению аскорбиновой кислоты в дозах до 0,1 мг/100 г.
В другой серии экспериментов было изучено влияние аскорбиновой кислоты на процесс образования' Hb-NO комплексов in vivo. Для этого одновременно вводили животным NaNO2 в дозе 7 мг/100 г и аскорбиновую кислоту в дозах от 0,1 мг до 70 мг/100 г. Через 30 мин после введения NaNO2 и аскорбиновой кислоты измеряли концентрацию НЪ-NO комплексов в крови и в тканях животных. На рис. 16 представлено изменение концентрации Hb-NO комплексов в крови животных под влиянием аскорбиновой кислоты. Видно, что введение аскорбиновой кислоты в дозах 0,1 мг до 5 мг/100 г давало вклад в увеличение концентрации Hb-NO комплексов не более чем на 5-10%, то есть находилось в пределах погрешности эксперимента.
Рис 15. Кинетика гибели ИР в плазме крови контрольных животных (1) и в-плазме крови, взятой через 30 мин после введения аскорбиновой кислоты в дозах: 0,1 мг/ 100 г массы тела (2), 1 мг/100 г массы тела (3), 3 мг/100 г массы тела (4) и 5 мг/100 г массы. тела« (5). Остальные обозначения те же, что и на рис 14.
Дальнейшее увеличение доз аскорбиновой кислоты до 30 мг/100 г приводило к росту концентрации Hb-NO комплексов. Наиболее заметное влияние аскорбиновой кислоты на процесс образования Hb-NO комплексов было отмечено в циркулирующей крови. В остальных исследованных тканях -сердце, печени, селезенке, почке и легком - также наблюдалось повышение уровня Hb-NO комплексов по сравнению с контролем (без введения аскорбиновой кислоты), но несколько меньшее, чем в циркулирующей крови. В пределах доз аскорбиновой кислоты от 5 мг до 30 мг/100 г изменение концентрации Hb-NO комплексов подчинялось линейному закону. При более высоких дозах аскорбиновой кислоты кривая изменения концентрации Hb-NO комплексов выходит на плато.
Итак, проведенные эксперименты показали, что введение аскорбиновой кислоты в дозах от 0,1 до 5 мг/100 г веса животного практически не влияет на интенсивность процесса восстановления ионов MV в N0 крови. Сопоставление скорости гибели ИР при введении NaNO2 в дозах от 1 мг/100 г до 15 мг/100 г со скоростью гибели ИР при введении аскорбиновой кислоты от 0,1 до 5 мг/100 г показывает, что роль эндогенной аскорбиновой кислоты в активации нитритредукции незначительна. Это предположение подкрепляется тем, что при инкубации крови с NaNO2 образуются только R-конформеры комплексов.
Рис 16. Изменение концентрации- Hb-NO комплексов, образующихся в крови животных через 30 мин после внутривенного введения 7 мг/100 г NaNO2, под влиянием аскорбиновой кислоты. По оси ординат - концентрация Hb-NO комплексов в относительных единицах, по оси абсцисс-дозы аскорбиновой кислоты в мг/100 г.
Глава - 4. Взаимодействие нитритов с тканями животных 4.1. Восстановление нитритов в тканях млекопитающих
Исследуя спектры ЭПР крови и тканей млекопитающих нами было показано, что при введении доз NaNO2 близких к летальным в циркулирующей крови животных образуются преимущественно R-конформеры Hb-NO комплексов. В это же время в тканях животных (печени, селезенке, почке, легком) образуются преимущественно Т-конформеры этих комплексов. В сердце мы всегда наблюдали образование R-конформеров комплексов N0 с гемовым железом, что могло указывать на то, что эти комплексы образованы с миоглобином, находящимся в миокарде. Миоглобин, как. известно, представляет собой одну из субъединиц гемоглобина, и может существовать лишь в R-конформации. Опыты, проведенные с миоглобином в присутствии и в отсутствие кислорода, подтвердили, что миоглобин, как и гемоглобин, в дезокси-форме способен восстанавливать нитриты в N0. В других опытах, проведенных с гомогенатом печени, предварительно отмытой от крови, мы наблюдали образование комплексов негемового железа с N0 [1, 10]. Таким образом, результаты этих исследований свидетельствуют, что не только гемоглобин крови вместе с электронно-донорными системами может выступать в качестве восстановителя нитритных ионов. В одних тканях, например, миокарде, восстановителем нитритов может быть миоглобин, а в других, например, печени, почках, селезенке, мозге и т.д., нельзя было исключить возможности восстановления нитритов как в клетках, так и субклеточных структурах.
В тех опытах, когда инкубируемый с NaNC>2 гомогенат печени не был отмыт от крови, наблюдали образование комплексов Hb-NO, находящихся преимущественно в Т-конформации. Инкубация крови или гемоглобина с NaNO2 без гомогената печени, как указывалось ранее, приводит к образованию R-конформеров Hb-NO комплексов. Таким образом, форма спектров ЭПР тканей зависит от условий проведения экспериментов. В депонированной в тканях крови происходит преимущественное образование Т-конформеров. В крови in vitro без гомогената ткани, как и в циркулирующей крови in vivo, при введении летальных доз NaN02 образуются преимущественно R-конформеры Hb-NO комплексов. Одной из причин такого отличия может быть дефицит кислорода в- тканях. Действительно, известно, что соотношение R- и Т-конформеров Hb-NO комплексов зависит от степени насыщения гемоглобина лигандом О2. С другой стороны, взаимодействие N0 и NO2, образующихся при восстановлении нитритов в тканях, с глобином может приводить к R -» Т переходам Hb-NO комплексов. Поэтому мы предполагаем, что второй причиной образования in vivo Т-конформеров Hb-NO комплексов может быть поступление в кровь N0, образующейся при взаимодействии нитритов с электроннодонорными системами тканей.
4.2. Восстановление ионов NO/ митохондриями печени
Образование комплексов негемового железа с N0 при инкубации митохондрий печени с №К02 наблюдали авторы многих работ. Л. В. Вахпина и Э.К. Рууге (1972) установили существование корреляции между интенсивностью сигнала ЭПР с g-фактором 2,03 и торможением скорости поглощения кислорода в митохондриях печени крысы при взаимодействии их с №N0^ В наших работах мы подтвердили возможность образования комплексов негемового железа с N0 при взаимодействии №NN0 с суспензиями митохондрий печени (рис. 17).
Рис 17. Спектр ЭПР комплексов негемового железа с N0 в митохондриях печени крыс после инкубации их с NaN02 в течение 3 ч.
Температура инкубации 22 °С. Концентрации белка: 98 мг/мл, NaN02 - 0,3 М. Температура регистрации 77 К.
Полученные данные свидетельствовали о том, что митохондрии являются теми или одними из тех субклеточных структур, которые вносят вклад в восстановление ионов NO2- в N0, осуществляющееся в клетках животных.
Известно, что нитритредуктазные системы микроорганизмов по своему ферментативному составу близки переносчикам электронов в электроннотранспортной цепи митохондрий. Более того, цитохром с и цитохромоксидаза из Micrococcus denitnficans и Pseudomonas aeruginosa no своим физико-химическим свойствам подобны митохондриальным [1, 10]. В связи с общностью состава дыхательной цепи митохондрий и электронно-транспортной цепи микроорганизмов, участвующих в специфическом восстановлении нитратов и нитритов, можно было предполагать участие дыхательной цепи митохондрий в восстановлении нитритов. Изучив реакцию взаимодействия митохондрий с NaNO2 в присутствии и в отсутствие ингибиторов дыхательной цепи митохондрий можно было ответить на вопрос:
участвуют ли ферменты и белки электронно-транспортной цепи в процессе восстановления ионов N0 в N 0.
4.3. Взаимодействие нитритов с дыхательной цепью митохондрий
В состав дыхательной цепи митохондрий входят ферменты, близкие по своей структуре и функциям к тем ферментам, которые присутствуют в микроорганизмах, способных к денитрификации. В связи с этим можно было предполагать возможность участия ферментов дыхательной цепи митохондрий в нитритредуктазной активности тканей животных. Для проверки этой возможности были использованы методы ЭПР, спектрофлуориметрии, полярографии и оптической спектрофотометрии.
Было показано, что инкубация митохондрий печени с нитритом № в присутствии. ротенона приводит к значительному снижению интенсивности сигнала ЭПР парамагнитных комплексов негемового железа с N0 [1].
При инкубации митохондрий печени с нитритом натрия в присутствии KCN образования комплексов негемового железа с N0, ответственных за сигнал ЭПР с g-фактором 2,03, мы вообще не наблюдали. В этих условиях появлялся сигнал ЭПР, состоящий из 3-х компонент с g-фактором центральной компоненты равной 2,007 [1].
Дополнительное продувание N0 через суспензию митохондрий, предварительно проинкубированных с течение суток с KCN и NN0), приводило к гибели парамагнитных центров, ответственных за сигнал ЭПР с g-фактором 2,007, и появлению сигнала ЭПР с g-фактором 2,004 и шириной линии между точками максимального наклона равной 9,4 в.
Поскольку концентрация парамагнитных центров, ответственных за сигнал ЭПР с g-фактором 2,007, уменьшалась под влиянием дополнительного продувания N 0, можно сказать, что в состав этих парамагнитных центров N0 не входит. А это свидетельствовало о том, что ионы NO2- присутствии KCN не восстанавливаются в N0 митохондриями.
Таким образом, результаты экспериментов показали, что ингибирование транспорта электронов по дыхательной цепи митохондрий KCN, который, как известно, блокирует дыхательную цепь на уровне цитохромоксидазы, предотвращает восстановление ионов NO2- в N0. Полученные данные подтверждали наше предположение о возможности участия ферментов дыхательной цепи митохондрий в восстановлении ионов NCV в N0. И, конечно же, особое внимание требовалось обратить на терминальный участок дыхательной цепи митохондрий (цитохромоксидазу).
В опытах с использованием спектрофлуориметрического метода было показано, что при блокировании дыхательной цепи KCN ионы NO2- не могут акцептировать электроны и снижать, таким образом, степень восстановленности пиридиннуклеотидов [1].
При добавлении NaNO2 к интактным митохондриям наблюдали развитие медленного процесса снижения уровня флуоресценции восстановленных
пиридиннуклеотидов. Добавление KCN или ротенона останавливало этот медленный процесс. Таким образом, данные ЭПР спектроскопии и спектрофлуориметрии дополняли и подтверждали друг друга. Они свидетельствовали, что ионы NO2- могут акцептировать электроны и восстанавливаться в N0 при взаимодействии только с интактной дыхательной цепью митохондрий.
Ранее в ряде работ зарубежных исследователей было показано, что у некоторых микроорганизмов, а именно Paracoccus {Micrococcus) denitrificans и Pseudomonas aeruginosa нитритредуктаза может одновремешю осуществлять и функцию цитохромоксидазы. Более того, нитритредуктаза, выделенная из Paracoccus {Micrococcus) denitrificans, оказалась способной взаимодействовать с цитохромом с, выделенного из тканей животных. Последнее указывало на близость функциональных свойств нититредуктазы из Paracoccus {Micrococcus) denitrificans с цитохромоксидазой млекопитающих. В связи с этим нами было предприпято изучение возможности окисления экзогенного восстановленного цитохрома с ионами NCV через терминальный участок дыхательной цепи митохондрий печени [1].
Предварительно нами было показано, что ионы NCV при нейтральных значениях рН и эквимолярных концентрациях не могут окислять экзогенный восстановленный цитохром с. В то же время инкубация экзогенного восстановленного цитохрома с с суспензией митохондрий печени и нитритом натрия в атмосфере аргона приводила к окислению экзогенного восстановленного цитохрома с. Если же нитритные ионы в среде инкубации отсутствовали или, если дыхательная цепь митохондрий была ингибирована KCN, то окисления экзогенного цитохрома с при этом не наблюдали.
Полученные данные показывали, что нитритные ионы могут окислять экзогенный восстановленный цитохром с через терминальный участок дыхательной цепи митохондрий печени. Наиболее вероятным ферментом, способным выполнять роль донора электронов для ионов NCV, на наш взгляд, является цитохромоксидаза.
4.4. Влияние ионов NCV и продуктов их восстановления на некоторые функциональные показатели митохондрий печени
В ходе исследования влияния нитритов на- митохондрии1 печени спектрофлуориметрическим методом было обнаружено развитие медленного процесса снижения уровня флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов. Можно было предположить несколько причин наблюдающегося явления:
1) увеличение скорости переноса электронов по дыхательной цепи за счет акцептирования электронов ионами NO2-;
2) скорости переноса электронов по дыхательной цепи вследствие разобщения окислительного фосфорилирования;
3) ингибирование сукцииатдегидрогеназы и, вследствие этого уменьшение уровня восстановленных пиридиннуклеотидов, пополняющегося в ходе обратного переноса электронов;
4) тушение флуоресценции пиридиннуклеотидов образующимися продуктами восстановления ионов NCY - N0 и N02 .
Используя методы полярографии, спектрофлуориметрии и спектрофотометрии было показано, что все четыре рассмотренных выше явления могут вносить свой вклад в процесс снижения уровня флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов. Причем запускающим импульсом, приводящим к развитию факторов, способных вызвать уменьшение уровня флуоресценции восстановленных пиридишгуклеотидов, может явиться акцептирование электронов ионами NO2- с терминального участка дыхательной цепи митохондрий.
ЧАСТЬ 2. ИССЛЕДОВАНИЯ РЕГУЛЯТОРНОГОП ТОКСИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НИТРИТОВ И ПРОДУКТОВ ИХ ПРЕВРАЩЕНИЯ, ИМЕЮЩИЕ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
2.1. Механизмы благотворного и отрицательного воздействия аскорбиновой кислоты при нитратно-нитритных интоксикациях
В середине 70- хх XX в. особую актуальность приобрели исследования механизмов положительного воздействия на ряд физиологических процессов аскорбиновой кислоты. В частности, многие исследователи обратили внимание на способность аскорбиновой кислоты восстанавливать метгемоглобин. Вместе с тем на фоне благотворного действия аскорбиновой кислоты практические врачи обнаружили, что аскорбиновая кислота может при нитратно-нитритных интоксикациях оказывать и отрицательное влияние. Механизмы такого пеоднозначного действия аскорбиновой кислоты оставались неизвестными.
Изучая влияние аскорбиновой кислоты (аскорбата) на выживаемость животных после введения этого вещества на различных стадиях интоксикации нитритами, нами было обнаружено, что отрицательное влияние аскорбиновая кислота способна оказывать лишь на ранних стадиях интоксикации, когда отмечается повышение содержания метгемоглобина в крови (рис. 4). В дальнейшем было установлено, что эти стадии интоксикации характеризуются относительно высокими концентрациями нитритов в крови (рис.18).
В связи с тем, что аскорбиновая кислота обладает способностью восстанавливать не только метгемоглобин в крови животных и человека, но и нитритные ионы в N0, мы объяснили неоднозначное поведение аскорбиновой кислоты процессами активации восстановления нитритов в N0, а врачам было предложено использовать аскорбиновую кислоту лишь на стадиях снижения уровня метгемоглобина в крови [1,10].
Рис 18. Изменение содержания ионов 1ЧЮ2 (а), N0)" (б), мегНЬ (Ф) и НЬ-1\0 комплексов (А ) (к) в крови крыс после введения №N0, в дозе 5 мг/100 г массы тела.
По осям абсцисс - время, ч, а по осям ординат - концентрация ионов (а, б); в - % от общего содержания НЬ в крови.
2.2. Идентификация стадии интоксикации при нитратно-нитритных интоксикациях
Известно, что при нитратно-нитритных интоксикациях в клиниках, как правило, используют одно-двукратное определение содержания метгемоглобина в параллельных пробах крови. Нами было предложено анализировать содержание метгемоглобина в крови человека или животных с 3-х - 5-ти мин интервалом и не менее 3-4-х раз. Благодаря такому подходу удается определить в какую сторону (увеличения или снижения) изменяется содержание метгемоглобина в крови. Рекомендовано использовать аскорбиновую кислоту только в тех случаях, когда содержание метгемоглобина снижается, поскольку в этот период нитратно-нитритной интоксикации содержание нитритов уменьшается до безопасных величин.
2.3. Использование соотношения R- и Т-конформеров Hb-NO комплексов для идентификации нитратно-нитритной интоксикации
Наличие метгемоглобина в крови животных и человека не всегда является свидетельством шпратно-нитритпых интоксикаций. Для того чтобы можно было сказать с уверенностью, что причиной интоксикации является нитратно-нитритное отравление необходимо показать, что в крови (или в моче) присутствует достаточно высокое содержание нитратов и нитритов. Однако для идентификации нитратно-нитритных интоксикаций можно использовать метод
ЭПР спектроскопии, который по наличию в крови R- и Т-конформеров Hb-NO комплексов позволяет в короткое время идентифицировать нитратно-нитритное отравление. Кроме того, в наших исследованиях было показано, что при поступлении нитритов в низких и умеренных дозах в крови присутствуют только Т-конформеры Hb-NO-комплексов, спектр ЭПР которых представлен на рис. 12. Повышение доз до смертельных или близким к ним приводит к тому, что в крови начинают преобладать R-конформеры Hb-NO комплексов (рис. 12, 13). Таким образом по соотношению R- и Т- конформерам Hb-NO комплексов в крови можно сказать о причине летального исхода при нитратно--нитритных интоксикациях. Это позволило нам рекомендовать этот метод для использования в судебно-медицинской практике.
2.4. Использование аутоантител к глутаматным рецепторам АМРА-типа (Glu R1) как дополнительный тест при идентификациях нитратно-нитритных интоксикаций *
При подозрениях на нитратно-нитритные интоксикации врачи-лаборанты в токсикологических отделениях, как указывалось выше, должны определять содержание метгемоглобина в крови и концентрацию нитратов и нитритов в крови или в моче. Однако нередко бывает, что время для однозначного определения указанных выше параметров проходит и появляется необходимость в привлечении дополнительных средств для идентификации нитратно-нитритных интоксикаций.
Изучая механизмы токсического действия оксидов азота на ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав мембран клеток и субклеточных структур, мы показали, что NO2 может оказывать повреждающее действие и предложили реакции, которые могут протекать в процессе такого повреждения [1]. Используя методы электронной микроскопии нами было показало, что под влиянием NO2 могут происходить локальные повреждения мембран с частичным выходом белков из цитоплазмы во внеклеточное пространство [1]. Все это дало нам основание предположить, что NO2 может участвовать в повреждении некоторых рецепторов, входящих в состав плазматических мембран клеток. Такой механизм мог бы также использоваться клетками в качестве компенсаторно-приспособительных реакций в тех случаях, когда взаимодействие некоторых медиаторов с рецепторами ведет к патологическим изменениям в клетках, способных вызвать их гибель. Одним из таких примеров является глутаматная нейротоксичность при воздействиях токсических доз глутамата на нейроны. Предложенный нами механизм был подтвержден в ходе совместных исследований в работах [30, 32], а для нашей работы появилась возможность использования антител к глутаматным рецепторам АМРА-типа для дополнительного подтверждения нитритных интоксикаций.
2.5. Использование снижения содержания Ь-аргинина в сыворотке крови как тест гнпоксических изменений в организме
Мы обратили внимание на L-аргинин в связи тем, что источником эндогенного синтеза N0, а также нитритов и нитратов в клетках животных является именно эта аминокислота. Известны также данные о том, что L-аргинин может защищать животных от гипоксии и, таким образом, обладает противогипоксическим действием. В связи с этим нами был использован метод тонкослойной хроматографии для анализа изменений содержания L-аргинина в сыворотке крови [1]. На рис. 19 представлены данные тонкослойной хроматограммы аминокислот сыворотки крови до и через 1 ч после введения в дозе 5 мг/100 г массы тела. Результаты этих исследований показали, что содержание L-аргинина при воздействии 5 мг/100 г массы тела существенно снижается по сравнению с контролем (рис. 19).
Рис 19. Тонкослойная хроматограмма аминокислот сыворотки крови до и через 1 ч после введения КаК02 в дозе 5 мг/100 г массы тела
Результаты, полученные в нашей работе [1], были подтверждены в Московском НИИ глазных болезней им. Гельмгольца Минздрава РФ при анализе слезной жидкости, используемой для ранней диагностики ишемических изменений сетчатки у больных с диабетической ретинопатией. В зависимости от величины этого показателя (он также характеризует и стадию процесса), при лечении сосудистых заболеваний глаз применяют либо ингибиторы синтеза
N0, либо доноры оксида азота, обладающие антиагрегационным и фибринолитическим действием.
ЧАСТЬ 3. КОЦЕПЦИЯ ЦИКЛА ОКСИДА АЗОТА И ПРИНЦИП ЦИКЛИЧНОСТИ
Анализ результатов собственных экспериментов и данных литературы, а также обобщение существующей системы принципов, концепций и теорий позволили нам сформулировать новую концепцию, согласно которой нитритредуктазные реакции с участием гемсодержащих белков, находящихся в дезокси-форме, способны замыкать цепочку превращений: L-аргинин -» N0 -> NO2-/NO3~ в цикл, который был нами назван циклом оксида азота [1,13,18].
Рассматривая триаду нитратов, нитритов и нитрозамжов, мы указывали, что нитриты, превращаясь в N0 и NO2, создают условия, для того чтобы цепочка ^-аргинин -> NO -> NChTNCV) функционировала как цикл. Это связано, прежде всего, с тем, что физико-химические свойства N0 и NO2-таковы, что в водной среде они будут превращаться снова в нитриты и нитраты. Поэтому при наличии соответствующих доноров электронов, способных восстанавливать нитраты в нитриты, а нитриты в N0, создаются условия, чтобы в присутствии кислорода N0 окислялся в N02, а в водной среде N0 и N0 вновь превращались бы в нитриты и нитраты. Несомненно, в открытой системе всегда будет частично теряться энергия, а газообразные N0 и N02 будут выделяться в окружающую среду. Однако сами физико-химические свойства нитратов, нитритов и оксидов азота, как указывалось выше, создают предпосылки для того, чтобы в водной среде взаимопревращения этих соединений осуществлялось в виде цикла. Естественно возникает вопрос о механизме превращения нитратов в нитриты, а нитритов в N0 и о природе доноров электронов, способных выполнять нитрат- и нитритредуктазную функцию в биологических системах. В этой связи целесообразно вспомнить слова Сцент-Дьерди, который подчеркивал, что в живых организмах достаточно много доноров электронов и очень мало акцепторов электронов. Именно поэтому акцепторы электронов способны при низких концентациях выполнять свою регуляторную функцию. Поэтому, указывал Сцент-Дьерди, многие лекарственные препараты по своей природе относятся к акцепторам электронов. Нитраты, нитриты и оксиды азота являются, прежде всего, акцепторами электронов. В некоторых случаях N0 (в реакциях с сильными акцепторами электронов) способен выполнять роль донора электронов. Однако в большинстве случаев нитраты, нитриты и оксиды азота ведут себя как акцепторы электронов.
После того, как стало известно, что источником эндогенного синтеза нитратов, нитритов и N0 является L-аргинин, мы включили в нашу схему это вещество (рис. 20). Однако следовало определить условия, при которых нитраты и нитриты способны превращаться в N0. В работах отечественных и зарубежных исследователей ранее было установлено, что нитрат-редуктазной
активностью обладают Mo-содержащие ферменты. Одним из таких ферментов в живых организмах является ферментный комплекс ксантин-оксидаза/ксантин-дегидрогеназа. Однако нитраты превращаются в нитриты, а затем в N0, намного менее интенсивно, чем нитриты восстанавливаются в N0. Это, по-видимому, является одной из причин того, что токсические свойства нитритов приблизительно в 30 раз выше, чем нитратов. Именно поэтому мы решили исследовать, прежде всего, механизмы восстановления нитритов в N0.
Ранее нами было показано, что один из продуктов превращения N0 -ионы N0^ могут весьма эффективно в условиях дефицита кислорода снова превращаться в N0 [1, 8, 13, 18]. Таким образом, наличие NO-синтазного механизма, обеспечивает эндогенный синтез N 0, ионов N0^ и NO3
Ь-аргинин N0 Ш27Шз*, (1)
а высокая активность нитритредуктазных систем создает условия для того, чтобы цепочка (1) функционировала как замкнутый цикл, который мы назвали циклом N0. Для ферментативного окисления L-аргинина при участии N0-синтаз, как указывалось выше, требуется кислород. Поэтому при ишемии/гипоксии NO-синтазный механизм должен ингибироваться. В то же время дефицит кислорода является тем фактором, который, как было показало выше, обеспечивает активную работу нитритредуктазшах систем, связанных с гсмсодержащими белками. Нами было показано, что НЬ, Mb, и цитохромоксидаза способны выполнять роль доноров электронов для нитритных ионов. В ряде других работ было показано, что такой способностью обладает и цитохромом Р-450. Таким образом, гемсодержащие белки - НЬ, Mb, цитохромоксидаза и цитохром Р-450, обычно взаимодействующие с кислородом, в дезоксиформе могут восстанавливать ионы N0^ 15 N0 и, таким образом, замыкать цепочку превращений (1) в единый цикл N0 (рис. 20). В настоящее время стали известны работы, авторы которых рассматривают возможность циклических реакций с участием N0 и продуктов его превращения, что является подтверждением нашим работам и развиваемой нами концепции о цикле оксида азота в организме млекопитающих.
Эта концепция дополняет и расширяет современные представления о биохимическом единстве всех живых организмов - от микроорганизмов до млекопитающих, поскольку показывает, что нитритредукция характерна не только для растений и микроорганизмов, но и для млекопитающих. А это, в свою очередь, свидетельствует о единстве основных принципов организации живой материи. Анализ NO-синтазных и нитритредуктазных систем показал, что основные компоненты, входящие в состав этих систем, имеют общее строение, а именно, состоят из восстановленных пиридиннуклсотидов, выполняющих роль донора электронов, промежуточного БАБ или содержащего переносчика электронов и гемсодержащего белка. Таким образом, проведенный анализ NO-синтазных и нитритредуктазных систем показал наличие в них структурно-функционального единства. А это еще раз позволяет
Рис 20. Цикл оксида азота в организме млекопитающих.
Образование N0 может осуществляться как в результате окисления гуанидинового азота Ь-арга1гаиа, так и в результате восстановления ионов N0^ в N0 при участии гемсодержащих белков, находящихся в дезокси-форме. В связи с этим в цикле оксида азота можно выделить N0-синтазную и нитритредуктазную компоненты.
убедиться в том, что живые организмы в самой организации ферментных систем и метаболических путей хранят информацию о своем эволюционном происхождении. Анализ концепции цикла оксида азота с позиций принципов симметрии, а также анализ данных литературы, позволил сформулировать новый биологический принцип - принцип циклической организации метаболических процессов (или принцип цикличности). Этот принцип открывает новые перспективы как для постановки новых задач и проведения экспериментов, так и для более глубокого понимания уже имеющихся экспериментальных данных. В чем же суть принципа цикличности и как можно убедиться в его справедливости?
Физиологи, биофизики и биохимики знают, для того, чтобы выяснить, насколько важна та или иная функция в организме, достаточно ее выключить и посмотреть, что же при этом произойдет. Мы предлагаем нашим читателям представить, что же произойдет, если выключить все циклические (или периодические) процессы. Исчезнут при этом все биологические ритмы, в том числе периодические процессы в мозге и в сердце. Гемоглобин при этом перестанет отдавать и присоединять кислород, остановится кровообращение, остановятся все насосы, осуществляющие откачку одних ионов и поступление других в клетки тканей, перестанет работать сердце. Естественно при этом перестанут работать все ферменты, работа которых осуществляется в циклическом режиме. А это значит, что остановятся все энергетические процессы. Таким образом, если нет циклических процессов, то не будут работать и NO-синтазы. Если прекратится функционирование NO-синтаз, то не будет и самой молекулы N0. Если останавливаются и прекращаются все биологические ритмы, циклические физиологические и биохимические процессы, то не будет и жизни на планете Земля. Таким образом, исчезает как предмет обсуждения, так и субъекты, обсуждающие этот предмет. Вот почему мы считаем, что в настоящее время самым главным в проблеме N0 в биологии и медицине является проблема цикличности, которая также, опять-таки с нашей точки зрения, является одной из важнейших проблем биологии и медицины.
ВЫВОДЫ
1. Впервые выявлены ключевые механизмы регуляторного и токсического действия нитритов и показано, что реакция восстановления ионов NO2- в N0 играет определяющую роль в реализации как регуляторного, так и токсического действия нитросоединений на организм млекопитающих. Показано, что регуляторное или токсическое воздействие на живые организмы нитритов, прежде всего, зависит от их дозы.
2. Установлено, что диоксид азота (NO2), образующийся при окислении N0 кислородом воздуха или при распаде пероксинитритов, обладает более высокими токсическими свойствами по сравнению с N0 и способен повреждать ненасыщенные жирные кислоты и отдельные аминокислоты (например, тирозин), входящие в состав белков.
3. Впервые показано, что нитриты, превращаясь в N0 и N0^ способны индуцировать при относительно низких их концентрациях процессы перераспределения белков из растворимого в мембранно-связашюе состояние, а при высоких концентрациях вызывают локальную перфорацию мембран клеток. Перераспределение белков из растворимого в мембранно-связашюе состояние может явиться одним из регуляторных механизмов, активирующих многие метаболические процессы (в том числе восстановление метгемоглобина), а перфорация мембран клеток и субклеточных структур может быть одним из повреждающих факторов, лежащих в основе гибели клеток.
4. Показано, что в крови и тканях млекопитающих содержатся биохимические системы, восстанавливающие нитриты в N0. Вследствие этого при поступлении нитритов в организм в крови могут образовываться Я- и Т-конформеры №-N0 комплексов, которые могут участвовать в транспорте N0 вместе с током крови. Соотношение Я- и Т-конформеров зависит от доз нитритов, поступивших в организм животных.
5. Локализованы места восстановления нитритов в крови и установлено, что основной вклад в процесс восстановления ионов N0^ в N0 вносит гемоглобин крови, находящийся в дезокси-форме. Наличие связанного с гемоглобином кислорода в значительной степени снижает 1жтритредуктазные свойства пигмента крови. Предложена схема реакций, в ходе которых осуществляется восстановление ионов N0^ в N0 и образование №-N0 комплексов в крови при взаимодействии нитритов с окси- и дезоксигемоглобином.
6. Обнаружено, что ионы N0^ могут восстанавливаться в N0 в митохондриях. Показано, что инкубация митохондрий печени с нитритами в присутствии ингибиторов транспорта электронов по дыхательной цепи - ротеноном и KCN - приводит к значительному снижению интенсивности сигнала ЭПР с g-фактором 2,03. Полученные данные указывали на возможность участия ферментов дыхательной цепи митохондрий в восстановлении ионов N0^ в N0.
7. Локализованы места акцептирования электронов ионами N0^ в митохондриях. Методом спектрофотометрии показано, что ионы N0^ могут окислять экзогенный восстановленный цитохром с через терминальный участок дыхательной цепи митохондрий. Ингибирование цитохромоксидазы митохондрий KCN останавливало процесс окисления экзогенного цитохрома с ионами N02. Методом спектрофлуориметрии получены дополнительные данные, свидетельствующие о том, что при блокировании дыхательной цепи митохондрий KCN (на уровне
. цитохромоксидазы) ионы N0^ не могут окислять восстановленные пиридиннуклеотиды. Проведенные эксперименты с использованием метода ЭПР, спектрофотометрии и спектрофлуориметрии хорошо дополняют друг друга и согласуются между собой. Они дают основание считать, что восстановление ионов N0^ в N0 в митохондриях
осуществляется в результате акцептирования электронов с дыхательной цепи митохондрий на уровне цитохромоксидазы.
8. Показано, что при нитритных интоксикациях аскорбиновая кислота может оказывать неоднозначное действие: усугублять действие ионов N0^ на стадии повышения содержания метгемоглобина и благотворно действовать на стадии снижения содержания метгемоглобина. Такое неоднозначное действие аскорбиновой кислоты связано с тем, что на ранних стадиях интоксикации, когда в крови присутствуют относительно высокие концентрации нитритов, аскорбиновая кислота действует преимущественно как восстановитель нитритных ионов. На поздних стадиях, когда содержание нитритов в крови снижается, аскорбиновая кислота действует преимущественно как восстановитель метгемоглобина.
9. На основании обобщения данных литературы и результатов собственных исследований впервые предложена новая концепция цикла оксида азота. Эта концепция позволяет найти взаимосвязь между нитратно-нитритной проблемой и проблемой оксида азота в биологии и медицине, а также хорошо согласуется с современными представлениями о нитратном дыхании как предшественнике кислородного дыхания и с эндосимбиотической гипотезой происхождения митохондрий. Эта концепция также дополняет и расширяет современные представления о биохимическом единстве всех октвых организмов - от микроорганизмов до млекопитающих, а также о единстве основных принципов организации живой материи.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации на русском языке:
1. Реутов B.IL, Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. "Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих " (тираж 1-го издания книги, 1000 экз.) М.: Наука. 1997. 156 с; Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. "Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих" (тираж 2-го издания книги, 500 экз.) М.: Наука. 1998. 156 с. (КНИГА).
2. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Косицын Н.С, Охотин В.Е. "Проблема оксида азота в биологии и медицине и принцип цикличности. Ретроспективный анализ идей, принципов и концепций" (тираж книги 1000 экз.) М.: Издательство научной и учебной литературы. Едиториал УРСС. 2003. 96 с. (КНИГА).
3. Бердиев У.Б., Кузнецов Ю.П., Куклин М.Г., Реутов В.П., Шекшеев Э.М. Моделирование спектров ЭПР парамагнитных центров крови на персональных ЭВМ типа IBM PC/XT/AT. М.: Институт химической физики АН СССР. 1989. 31с (БРОШЮРА).
4. Реутов В.П., Гоженко А.И., Насибуллин Б.А., Доломатов СИ., Косицын Н.С. Анализ циклических процессов с участием оксида азота в организмах и молекулярного азота в биосфере с позиций голографического принципа и
принципа цикличности. Одесса: Одесский медуниверситет. 2003. 66 с. (БРОШЮРА).
5. Реутов В.П., Ажипа Я.И., Каюшин Л.П. Изучение методом электронного парамагнитного резонанса продуктов взаимодействия окислов азота с некоторыми органическими соединениями. // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 1978. №9. С.299-301.
6. Реутов В.П., Ажипа Я.И., Каюшин Л.П. Исследование парамагнитных центров, возникающих при взаимодействии двуокиси азота с олеиновой кислотой и тирозином. // Докл. АН СССР. 1978. Т.241. №6. С.1375-1377.
7. Ажипа Л.И., Реутов В.П., Каюппш Л.П., Никишкин Е.И. Конформационные изомеры комплексов гемоглобина с окисью азота, возникающие в крови при действии нитрита натрия. //Изв. АН СССР. сер. биол. 1983. №2. С.240-250.
8. Реутов В.П., Ажипа Я.И., Каюшин Л.П. Кислород как ингибитор нитритредуктазной активности гемоглобина. // Изв. АН СССР. сер. биол. 1983. №3. С.408-418.
9. Бердиев У.Б., Реутов В.П., Вишневский Е.С., Каюшин Л.П., Шекшеев Э.М. Использование автоматизированного метода ЭПР для исследования влияния пестицидов и нитритов на парамагнитные свойства крови млекопитающих.// Биофизика. 1990. Т.35. вып.2. Ст. депонирована в ВИНИТИ С. 1-17.
10. Ажипа Я.И., Реутов В.П., Каюшин Л. П. Экологические и медико-биологические аспекты проблемы загрязнения окружающей среды нитратами и нитритами.// Физиология человека. 1990. Т. 20. №3. С.165-174.
11. Бердиев У.Б., Реутов В.П., Вишневский Е.И., Каюшин Л.П., Шекшеев Э.М. Применение автоматизированного метода ЭПР спектроскопии для изучения влияния пестицидов и нитритов на парамагнитные свойства крови млекопитающих.//Биофизика. 1990. Т.35. №2. С.382-383.
12. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г., Коршунова Т.С, Родионов А.А., Кошелев В.Б., Струкова СМ., Каюшин Л.П., Браке П., Комиссарова Л.Х. Компенсаторно-приспособительные механизмы при нитритной гипоксии у крыс. // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 1993. № 11. С.506-508.
13. Реутов В.П., Орлов С.Н. Физиологическое значение гуанилатциклазы и роль окиси азота и нитросоединений в регуляции активности этого фермента.// Физиол. человека. 1993. Т.19. №.1. С.124-137.
14. Реутов В.П., Каюшин Л.П., Сорокина Е.Г. Цикл окиси азота как адаптационный механизм при гипоксии организма. // Успехи физиологических наук 1994. Т.25. №4. С.36.
15. Реутов В.П., Каюшин Л.П., Сорокина Е.Г. Физиологическая роль цикла окиси азота в организме человека и животных.// Физиология человека. 1994. Т.20. №.3. С.165-174.
16. Дьяконова ТЛ., Реутов В.П. Нитриты блокируют Са2+-зависимое привыкание нейронов на уровне электровозбудимой мембраны: возможная роль окиси азота. // Вопр. мед, химии. 1994. Т.40. №.6. С.20-25.
П.Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Пинелис В.Г., Коршунова Т.С. Взаимосвязь между содержанием окиси азота, циклического гуанозинмонофосфата и эндотелина в крови при нитритной гипоксии.// Успехи физиологических наук. 1994. Т.25. №4. С.70-71.
18. Комиссарова Л.Х., Реутов В.П., Комиссаров А.Л. Возможность использования некоторых антиоксидантов для восстановления ферригема. // Вопр. мед. химии. 1994. Т.40. №.6. С.25-26.
19. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г., Коршунова Т.С., Родионов А.А., Кошелев В.Б., Струкова СМ., Каюшин Л.П., Браке П., Комиссарова Л.Х. Участвуют ли нитритные ионы в регуляции систем внутри- и межклеточной сигнализации?// Вопр. мед. химии. 1994. Т.40. №.6. С.27-30.
20. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Каюшин Л.П., Родионов А.А. Окись азота как индуктор пространственного перераспределения белков в клетках млекопитающих при гипоксии.// Успехи физиологических наук 1994. Т.25. №4. С.36 - 37.
21. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Каюшин Л.П. Цикл окиси азота и нитритредуктазная активность гемсодержащих белков в организме млекопитающих.//Вопр. мед. химии. 1994. Т.40. No.6. С.31-35.
22. Реутов В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих. // Успехи биол. химии. 1995. Т.35. С. 189-228.
23.Пинелис В.Г.,Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Винская Н.П., Исаев Н.К., Викторов И.В. Влияние токсического воздействия глутамата и нитрита на содержание циклического ГМФ в нейронах и их выживаемость// Докл. РАН. 1997. Т.352. N2. С.259-261.
24.Ильницкий А.П., Реутов В.П., Рыжева Н.И., Колпакова А.С., Дерягина В.П., Некрасова Е.А., Савлучинская Л.А., Травкин А. Г. Модифицирующее действие нитритов на уретан-индуцированную легочную аденому и лейкемию Раушера: возможная роль оксида и диоксида азота.// Экспериментальная онкология. 1997. Т.19.№2.С. 101-109.
25. Реутов В.П., Сорокина Е.Г. NO-Синтазная и нитритредуктазная компоненты цикла оксида азота. // Биохимия. 1998. Т.63. №7. С. 1029-1040.
26. Реутов В.П., Сорокина Е.Г. Цикл окиси азота - новый метаболический цикл, участвующий в регуляции внутриклеточной сигнализации. // Мол. биол. 1998. Т.32. №2. С.377-378.
27. Самосудова Н.В., Ларионова Н.П., Реутов В.П., Чайлахян Л.М. Изменение молекулярного слоя мозжечка лягушки Rana temporaria под влиянием NO-генерирующего соединения. // Докл. РАН. 1998. Т.361. № 5. С.704-708.
28.Косицын Н.С., Реутов В.П., Свинов М.М., Ионкина Е.Г., Сорокина Е.Г. Механизм морфо-функциональных изменений клеток тканей млекопитающих при гипоксии. //Мол. биол. 1998. Т.32. №2. С.369-370.
29. Дьяконова Т.Л., Реутов В.П. Влияние нитрита на возбудимость нейронов мозга виноградной улитки. // Росс. Физиол. Журн. Им. И.М. Сеченова. 1998. Т. 84. №11. С. 1264-1272.
30. Реутов В.П., Косицын Н.С., Свинов М.М., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Львов КМ., Шекшеев Э.М., Филиппова Н.А. Активация цикла окиси азота при гипоксии индуцирует перераспределение белков в клетках тканей млекопитающих из растворимого в мембранносвязанное состояние. // Мол. биол. 1998. Т.32. №2. С.378-379.
31. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. Цикл оксида азота и механизмы его активации при гипоксии. // В сб. статей: Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности. Минск: "Полибиг". 1998. С.68 - 71.
32. Реутов В.П. Циклы оксида азота и супероксида: новые данные, следствия и гипотезы. // В сб. статей: Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности. Минск: Полибиг. 1999. С. 185-187.
33.Реутов В.П. Биохимическое предопределение NO-синтазной и нитритредуктазной компонент цикла оксида азота. // Биохимия. 1999. Т.64. №5. С.634-651.
34. Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Вергун О.В., Ходоров Б.И. Механизм потенцирующего действия альбумина при токсическом воздействии глутамата: возможная роль окиси азота. // Биологические мембраны. 1999.T.16.№3.C.318-323.
35. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г., Коршунова Т.С., Родионов А.А., Шекшеев Э.М., Косицын Н.С. Участие оксида азота и эндотелина-1,2 в реализации компенсаторно-приспособительных механизмов при гемической форме гипоксии. // В сб. статей: Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности. Минск: Полибиг. 1999. С. 191-193.
36. Сорокина Е.Г., Реутов В.ПМ Гранстрем O.K., Фадюкова О.Е., Обрезчикова М.Н., Крушинский А.Л., Кошелев В.Б., Дамбинова СА, Пинелис В.Г. Участвует ли оксид азота в повреждении глутаматных рецепторов при эпилепсии?// В сб. статей: Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности. Минск: Полибиг. 1999. С.204-206.
37. Реутов В.П., Дьяконова Т.Л. Существует ли цикл оксида азота в нейронах улитки? // В сб. статей: Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности. Минск: Полибиг. 1999. С. 188-190.
38. Шульгина Г.И., Швец-Тэнета-Гурий Т.Б., Реутов В.П. Влияние N0-генерирующих соединений на изменение окислительно-восстановительного состояния коры головного мозга и реализацию предварительно выработанных оборонительных и тормозных условных рефлексов. // В сб. статей: Роль иейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности. Минск: Полибиг. 1999. С.218-220.
39. Ларионова Н.П., Самосудова Н.В., Реутов В.П. Чайлахян Л.М. Сравнительное исследование изменения количественных характеристик структуры молекулярного слоя мозжечка лягушки Rana Temporaria под влиянием L-глутамата и NO-генерирующего соединения.// Докл. РАН. 1999. Т. 309. №6. С. 836-840.
40. Самосудова Н.В., Реутов В.П., Ларионова Н.П. Оксид азота как модулятор контрастности основных элементов цитоскелета.// Цитология. 2000.Т.42. №1. 7278.
41. Реутов В.П. Медико-биологические аспекты циклов оксида азота и супероксидного анион-радикала.// Вестник РАМН. 2000. №4. С.35-41.
42.Ильницкий А.П., Реутов В.П., Рыжова Н.И., Колпакова А.С, Дерягина В.П., Некрасова Е.А., Савлучинская Л.А., Травкин АХ. Модифицирующее действие нитритов на легочный бластомогенез и вирусный лейкозогенез у мышей: возможная роль окиси и двуокиси азота. // Вестник РАМН. 2000. №7. С. 11-16.
43.Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г., Коршунова Т.С., Родионов А.А., Шекшеев Э.М., Косицын Н.С. Оксид азота и эндотелин-1,2 участвуют в реализации компенсаторно-приспособительных механизмов при гемической форме гипоксии. // В кн.: Дисфункция эндотелия. Витебск: Витебский государственный медицинский университет. 2000. С. 22-26.
44. Меньшикова Е.Б., Зсшсов Н.К, Реутов B.IL Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях. // Биохимия. 2000. Т.65. №4. С.485-503.
45. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Реутов В.П. NO-синтазы в норме и при патологии различного генеза. // Вестник РАМН. 2000. №4. С.30-34.
46. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Косицын Н.С. Медико-биологические аспекты циклов оксида азота и супероксида: новые данные, следствия и гипотезы.// ФЬюлопчний журнал. 2000. Т.46. №2.С.35-36.
47. Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Гранстрем O.K., Фадюкова О.Е., Обрезчикова М.Н., Крушинский А.Л., Кузенков B.C., Кошелев В.Б., Дамбинова СА., Пинелис В.Г. Повреждение глутаматных рецепторов при их гиперстимуляции: роль оксида азота.// Ф1зюлопчний журнал. 2000. Т.46. №2. С. 146-147.
48. Ларионова Н.П., Самосудова Н.В., Реутов В.П., Чайлахян Л.М. Сравнительное исследование изменений структуры нейрон-нейронного взаимодействия в молекулярном слое мозжечка лягушки Rana Temporaria под влиянием L-глутамата и NO-генерирующего соединения. //Доклады РАН. 2001. Т.376. №5. С.701-706.
49. Самосудова Н.В., Реутов В.П., Ларионова Н.П., Чайлахян Л.М. Возможное участие оксида азота в межиейрошюм взаимодействии.// Докл. РАН, 2001. Т.378. №3. С.417-420.
50. Чумак Л.Г., Солтанов В.В., Реутов В.П., Тришин Л.С. Эффермгтная импульсация почечного нерва при перегревании животных в условиях блокады синтеза монооксида азота. // В сб. статей: Функциональная роль монооксида азота и пуринов. Минск: Национальная академия наук Беларуси, Бизнессофтсет, 2001, С. 196-200.
51. Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Косицын Н.С., Гранстрем O.K., Дамбинова С.А., Кузенков B.C., Крушинский А.Л., Кошелев В.Б., Винская Н.П., Гордеева Г.Ф., Пинелис В.Г. Нитритная гипоксия вызывает повреждение глутаматных рецепторов у крыс. // В сб. статей: Функциональная роль монооксида азота и пуринов. Минск: Национальная академия наук Беларуси, Бизнессофтсет, 2001. С. 167-168.
52. Реутов В.П. Цикл оксида азота в организме млекопитающих и принцип цикличности. // Биохимия. 2002. Т.67. №3. С.353-376.
53.Реутов В.П., Кузенков B.C., Крушинский А.Л., Кошелев В.Б., Рясина Т.В., Левшина И.П., Шуйкин Н.Н., Косицын Н.С., Айрапетянц М.Г. Развитие стрессорпых повреждений у крыс линии Крушинского-Молодкиной, генетически предрасположешгъгх к судорожным припадкам, при действии NO-генерирующего соединения и блокатора NO-синтазы. // Вести национальной академии наук Беларуси. Серия медико-биологических наук. 2002. №1. С.5-10.
54. Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Гранстрем O.K., Фадюкова О.Е., Обрезчикова М.Н., Крушинский А.Л., Кузенков B.C., Кошелев В.Б., Дамбинова С.А., Пинелис В.Г. Возможная роль оксида азота в повреждении глутаматных рецепторов при эпилепсии.// Вести национальной академии наук Беларуси. Серия медико-биологических наук. 2002. №1. С. 18-22.
55. Сорокина Е.Г., Реутов B.IL, Пинелис В.Г., Винская Н.П., Гранстрем O.K., Дамбинова С.А., Крушинский А.Л., Кузенков B.C., Фадюкова О.Е., Косицын Н.С., Кошелев В.Б. Роль оксида азота в образовании аутоантител к рецепторам глутамата. // Нейроиммунология. Санкт-Петербург. 2002. С.267-269.
56. Самосудова Н.В., Реутов В.П., Ларионова Н.П., Чайлахян Л.М. Локализация кальция в микротрубочках, выявляемая электрической стимуляцией мозжечка в присутствии NO-генерирующего соединения. // Биологические мембраны. 2003. Т.20. №1. С.27-33.
57. Кондакова И.В., Загребельная Г.В., Реутов В.П. Влияние пероксидных радикалов и оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток. // Вести национальной академии наук Беларуси. Серия медико-биологических наук. 2003. №1. С.78-82.
58. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г., Самосудова Н.В., Ларионова Н.П., Филиппова Н.А., Косицын Н.С. Резистентность нервных клеток к действию токсических доз соединений нитрита натрия у теплокровных и холоднокровных животных. // Вести национальной академии наук Беларуси. Серия медико-биологических наук. 2003. №1. С.75-78.
59. Реутов В.П. О Л.А. Блгоменфельде - ученом, педагоге, поэте и человеке и о проблеме оксида азота, начало которой было положено в его лаборатории. // Успехи физиологических наук. 2003. Т.34.№2. С. 103-128
60. Реутов В.П. Памяти Льва Александровича Блюменфельда. Что же является самым важным в проблеме оксида азота на данном этапе развития биологии и медицины? //Биохимия. 2003. Т.68. №3. С.445-447.
61. Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Гранстрем O.K.. Косицын Н.С., Крушинский А.Л.. Кузенков B.C., Кошелев В.Б., Фадюкова О.Е., Дамбинова С.А., Пинелис ВТ. Изучение механизмов образования аутоантител при эпилепсии и гипоксии. // Нейроиммунология. 2003. Т.1. №2. С. 137-138.
62.3апорожан В.Н., Гоженко А.И., Насибуллин Б.А., Галич СР., Реутов В.П. Возможная роль NO-синтазной системы в патогенезе плацентарной недостаточности при гестозе. // В сб. статей: Пурины и монооксид азота. Регуляторная функция в организме. Минск.: Технопринт. 2003. С.43-45.
63. Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Винская Н.П., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г. Частичное ингибирование цитохромоксидазы митохондрий в нейронах мозжечка защищает их от повреждений при действии токсических доз глутамата и нитрита. // Вести национальной академии наук Беларуси. Серия медико-биологических наук. 2003. №2. С.59-63.
64. Пинелис В.Г., Юрявичус А.И., Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Винская Н.П., Сторожевых Т.П., Сурин А.А., Вергун О.В., Арсеньева Е.Н., Ходоров Б.И. Влияние NO-генерирующих соединений и глутамата на внутриклеточное содержание ионов Са2+ и энергетическую функцию митохондрий нейронов мозжечка крыс. // В сб. статей: Пурины и монооксид азота. Регуляторная функция в организме. Минск: Технопринт. 2003. С.95-97.
65. Ларионова Н.П., Реутов В.П., Самосудова Н.В., Чайлахян Л.М. Сравнительный анализ пластичности нейро-нейронных и нейро-глиальных инкапсулирующих взаимодействий молекулярного слоя изолированного мозжечка лягушки в условиях избытка L-глутамата и NO-генерирующего соединения. // Доклады РАН. 2003. Т.393. №5. С.698-702.
66. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Косицын Н.С., Дудина Ю.В., Охотин В.Е. Что можно назвать самым главным в проблеме оксида азота на данном этапе развития биологии и медицины? // В сб. статей: Пурины и монооксид азота. Регуляторная функция в организме. Минск: Технопринт. 2003. С. 102-105.
67. Насибуллин Б.А., Гоженко А.И. Реутов В.П. Изменение активности NADPH-диафоразы/ЪЮ-синтазы в динамике черегаю-мозговой травмы у крыс. // В сб. статей: Пурины и монооксид азота. Регуляторная функция в организме. Минск: Технопринт. 2003. С.79-81.
68. Реутов В.П., Самосудова Н.В., Ларионова Н.П., Чайлахян Л.М. Ультраструктурные изменения нейронной сети мозжечка под влиянием глутамата и NO-генерирующего соединения. // Сборник научных трудов. Нейроинформатика-2004.4.1. Москва: МИФИ. 2004. T.I. C.83-88.
69.Кошелев В.Б., Крушинский А.Л., Кузенков B.C., Реутов В.П. Ингибитор N0-синтазы повышает стрессовые повреждения у крыс линии Крушинского-Молодкиной. // Вести национальной академии наук Беларуси. Серия медико-биологических наук. 2004. (В печати).
70. Самосудова Н.В., Реутов В.П., Ларионова Н.П., Чайлахян Л.М. О возможной защитной роли аутотшшческих контактов при повреждении нейронной сети мозжечка токсическими дозами NO-генерирующего соединения. // Цитология. 2004. (В печати).
71. Крушинский А.Л., Кузенков ВС, Реутов В.П., Кошелев В.Б., Алесеенко А А., Сорокина Е.Г., Косицын Н.С. Влияние L-аргинина на развитие стрессорных повреждений у крыс линии Крушинского-Молодкиной.// Вести национальной академии наук Беларуси. Серия медико-биологических наук. 2004. (В печати).
72. Реутов В.П., Самосудова Н.В., Ларионова Н.П, Чайлахян Л.М. Влияние глутамата и NO-генсрирующего соединения на ультраструктурные изменения нейронной сети мозжечка.// Вести национальной академии наук Беларуси. Серия медико-биологических наук. 2004. (В печати).
73. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Косицын Н.С. Проблемы оксида азота и цикличности в биологии и медицине. // Успехи современной биологии. 2004. (В печати)
'Публикации на английском языке:
1. Reutov V.P., Azhipa Ya.L, and Kayushin L.P. Oxygen as the inhibitor of hemoglobin nitrite-reductase activity. // Biology Bulletin. 1983. №3. P.408-418.
2. Azhipa Ya.L, Reutov V.P., Kayushin L.P., and Nikishkin E.I. Conformational isomers of complexes hemoglobin-nitric oxide, formed in blood under sodium nitrite influence. // Biology Bulletin. 1983. №2. P.240-250.
3. Azhipa Ya.1., Reutov V.P., Kayushin L.P. Ecological and medico-biological aspects of problem pollution of environmental by nitrates and nitrites.// Human Physiology. 1990. Vol. 20. №3. C. 165-174.
4. Reutov V.P., Sorokina E.G., Rodionov A.A., Korshunova T.S. Peptides and amino acids in blood of mammals under the action of nitrites// Symposium Structure & Function ofRegulatory Polypeptides. Moscow. 1992. P.67.
5. Reutov V.P., Sorokina E.G., Pinelis V.G., Korshunova T.S., Rodionov A.A., Koshelev V.B., Strukova S.M., Kayushin L.P., Braquet P., Komissarova L.Kh. Compensatory and adaptive mechanisms in rats at nitrite hypoxia. // Bull. Exp. Biol. and Med. 1993. №11. P.506-508.
6. Reutov V.P., Orlov S.N. Physiological Importance of Guanylatcyclase and the Role ofNitric Oxide and Ather Nitrocompounds in the Regulation of This Enzyme Activity. // Human Physiology. 1993. Vol.19. №1. P. 124-137.
7. Reutov V.P., Kayushin L.P., Sorokina E.G. Cycle of nitric oxide in mammalian organism.// 11 th International Biophysics Congress. 1993. Budapest, Hungary, P.223.
8. Kayushin L.P., Reutov V.P., Sorokina E.G. Mechanism of the reduction of NCV ions in mammals.// 11th International Biophysics Congress. 1993. Budapest, Hungary, P.223.
9. Reutov V.P., Kayushin L.P., Sorokina E.G. Physiologic Role of the nitric oxide cycle in man and animals. // Human physiology. 1994. Vol. 20. №3. P. 165-174.
10. Reutov V.P. The nitric oxide cycle - a new metabolic cycle of intracellular signalling system regulation.// The International symposium "Physiological and biochemical basis ofbrain activity". Abstracts. St Petersburg. 1994. P.68.
11. Reutov V.P., Kayushin L.P., Sorokina E.G. Free radical reactions and the nitric oxide cycle in mammals. // Magnetic resonans and related phenomena. XXVII Congress Ampere. Kazan. 1994. V.I. P.498.
12. Kositzyn N., Reutov V., Svinov M. Morpho-functional changes in nervous cells in respons to hypoxia: The possible role of nitric oxide.// Abstracts of Fourth IBRO World Congress ofNeuroscience. 9-14 July 1995, Kyoto, Japan. 1995. A5.4. P. 132
13. Dyakonova T., Reutov V. Effect ofnitrite ions on Helix brain neurons: the possible role of nitric oxide.// Abstracts of Fourth IBRO World Congress of Neuroscience. 9-14 July 1995, Kyoto, Japan.1995. A5.8. P. 133.
14. Reutov V., Sorokina E. The nitric oxyde cycle - a new metabolic, cycle of intracellular signalling systems. // Abstracts of Fourth IBRO World Congress of Neuroscience. 9-14 July 1995, Kyoto, Japan. 1995. A5.7. P. 133.
15. Sorokina E.G., Reutov V.P., Vinskaya N.P., Khodorov B.I. and Pinelis V.G. Potentiation of glutamate neurotoxicity by serum albumin. Role of free radicals. // Society for Neuroscience. Abstracts. 1996. V.22. Part 1, P. 803.
16. Imitsky ..P., Reutov V.P., Ryzhova N.I., Kolpakova A.S., Deryagina V.P., Nekrasova E.A., Savluchinskaya, and A.G. Travkin. Urethan-induced pulmonary adenoma and Rausher's leukemia modified by sodium nitrite in mice: A possible role of nitric oxide and nitric dioxide.// Experimental Oncology. 1997. Vol. 19. N 2 P.101-109.
17. Sorokina E.G., Reutov V.P., Pinelis V.G., Vinskaya N.P., Khodorov B.I. The role of nitric oxide and albumin in glutamate neurotoxocity.//XXXIII International Congress ofPhysiologiocal Sciences. St. Petersburg. 1997. P010.18.
18. Reutov V.P., Sorokina E.G. NO-Synthase and nitrite-reductase components of the nitric oxide cycle. // XXXIII International Congress of Physiologiocal Sciences. St Petersburg. 1997. P062.18.
19. Reutov V.P., and Sorokina E.G. NO-synthase and nitrite-reductase components of the nitric oxide cycle. //Biochemistry (Moscow). 1998. Vol. 63. №7. P. 1029-1040.
20. Reutov V.P., Sorokina E.G. The Nitric Oxide Cycle - a Molecular-Biological Mechanism Participating in Intracellular Signal Transduction. // J. of Neurochcmistry.1998. Vol.71. Suppl.l. P. 61.
21. Larionova N., Samosudova N., Reutov V. Pathological influence of nitric oxide (NO) on frog cerebellum neuronal net in vitro.// European J. of Neuroscience. 1998. Vol.10., Suppl.10, 119.13.
22. Sorokina E.G., Reutov V.P., Granstrem O.K., Fadyukova O.E., Obrezchikova M.N., Krushinsky A.L., Koshelev V.B., Dambinova S.A. Participation of nitric
oxide in damage of glutamate receptors at seizures. // J. of Neurochemistry.1998. Vol.71. SuppU. P.88.
23. Menshikova E.B., Zenkov N.K., and Reutov V.P. Nitric Oxide and NO-Synthases in Mammals in Different Functional States. // Biochemistry (Moscow). 2000. Vol.65. №4. P.409-426.
24. Reutov V.P., Sorokina E.G., Pinelis V.G., Samosudova N.V., Larionova N.P., Filippova N.A., and Kositzin N.S. Different Resistance of Nervous Cells to Toxic Doses of a Nitric Oxide-Generating Compound in Homeothermal and Poikilothermal Animals. // Medico-Biological Problems of Thermophysiology. Minsk: Institute ofPhysiology NAN Belorus, Bisnesoftset, 2002. P. 129-131.
25. Reutov V.P., and Sorokina E.G. The Nitric Oxide Cycle. // Modern Appl. EPR/ESR. Proc. Asia-Pac. EPR/ESR Symposium. 1997. P.32-39.
26. Pinelis V.G., Sorokina E.G., Reutov V.P., Vinskaya N.P., Isaev N.K., Viktorov I.V. The influence of toxic action of glutamate and nitrite on the level of cyclic GMP in neurons and the viability. // Dokl. Akad. Nauk. 1997. Vol. 352. №2. P.259-261.
27. Samosudova N.V., Larionova N.P., Reutov V.P., Chailakhyan L.M. The structural changes of the frog cerebellar molecular layer under the influence of NO-generating compounds. // Dokl. Akad. Nauk. 1998. Vol.361. №5. P.704-708.
28. Kositzyn N.S., Reutov V.P., Svinov M.M. Morpho-functional changes in nervous cells: the possible role of nitric oxide.// J. of Neurochemistry. 1998. Vol.71. Suppl.l.P.50.
29. Reutov V.P. Biochemical Predetermination of the NO-Synthase and Nitrite reductase Components of the Nitric Oxide Cycle. // Biochemistry (Mosc). 1999. Vol64.№5.P. 634-651.
30. Larionova N.P., Samosudova N.V., Reutov V.P., Chailakhian L.M. Comparative study of changes in the quantitative characteristics of the frog Rana Temporaria cerebellar molecular layer structure when exposed to L-glutamate and NO-generating compounds. // Dokl. Akad. Nauk. 1999. Vol.369. №6. P.836-840.
31. Sorokina E.G., Reutov V.P., Pinelis V.G., Vinskaya N.P., Vergun O.V., and Khodorov B.I. The Mechanism of Potentiation of the Glutamate-Induced Neurotoxicity by Serum Albumin. // Membrane & Cell Biology. 2000. Vol.13. №3. P. 389-396.
32. Dyakonova T.L., Reutov V.P. The effects of nitrite on the excitability of brain neurons in the common snail. // Neurosci. Behav. Physiol. 2000. Vol30. №2. P.179-186.
33. Samosudova N.V., Reutov V.P., Larionova N.P., Chailakhyan L.M.// Dokl. Biol. Sci. 2001. Vol. 378. № 3. p. 213-216.
34. Reutov V.P., Kuzenkov VS., Krushinsky A.L., Koshelev V.B., Ryasina T.V., Levshina I.P., Shuikin N.N., Kositzyn N.S., Airapetiants M.G. Effects ofthe N0-generating drug and the NO-synthase inhibitor on the development of acoustic stress-induced disorders in rats of Krushinsky-Molodkina strain. // News of Biomedical Sciences. 2002. №1. P.5-10.
35. Reutov V.P. Nitric Oxide Cycle in Mammals and the Cyclicity Principle. // Biochemistry (Moscow). 2002. Vol.67. №3. P.293-311.
36. Sorokina E.G., Reutov V.P., N.P. Vinskaya, T.P. Storozhevykh, and V.G. Pinelis. Partial inhibition of mitochondrial's cytochrome oxidase protects cerebellar
neurons from damage from toxic glutamate and nitrite. // News of Biomedical Sciences. 2003. №2. P.59-63.
37. Reutov V.P., Sorokina E.G., Pinelis V.G., Samosudova N.V., Larionova N.P., Filippova N.N., and Kositzyn N.S. Resistance to toxic doses of sodium nitrite in warm-blooded and cold-blooded animals. // News of Biomedical Sciences. 2003. №1. P.75-77.
38. Kondakova I.V., Zagrebelnaya G.V., and Reutov V.P. Influence of peroxide radicals and nitric oxide on malignant cells and their proliferative activity. // News ofBiomedical Sciences. 2003. №1. P.78-82. *
Основные статьи соискателя, представленные в рецензируемых, журналах: "Биохимия" (Biochemistry (Mosc.) (5 статей); "Доклады АН СССР и РАН" (Dokl. Akad. Nauk или Dokl. Biol. Sci. - 7 статей); "Известия АН СССР, сер. биол." (Biology Bulletin - 2 статьи); "Бюлл. эксперим. биол. и мед." (Bull. Exp. BioL and Med. - 2 статьи); "Физиология человека" (Human physiology - 3 статьи); "Росс, физиол. журн. им. И.М. Сеченова" (1 статья); "Вести национальной академии наук Беларуси" (News of Biomedical Sciences - 5 статей), "Биол. мембраны" (2 статьи), "Экспериментальная онкология" (Experimental oncology - 1 статья) переведены и опубликованы на английском языке. Полный текст или краткое содержание статей (Abstracts) также имеются в поисковых системах Интернета (Google), Пабмеда (PubMed) и Медлайна (Medline) по темам (или ключевым словам) Nitric Oxide, Nitrite, Nitric Oxide Cycle, Cyclicity Principle, Hypoxia с добавлением фамилии (Reutov, Reutov V.P., Reutov Valentin P.)
Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 19.04.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 5,0. Тираж 100 экз. Заказ 446. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.
i'IJí 80
-
Реутов, Валентин Палладиевич
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.13
- Взаимодействие нитритас антиокислительными ферментамии гемоглобином как важнейшийэлемент его токсичности
- Влияние нитрита натрия на адаптивные реакции лейкоцитов крови
- Морфофизиологические и биохимические показатели гидробионтов в условиях нитритной интоксикации
- Металлсодержащие белки нитритвосстановливающей цепи Ps. Aeruginosa. Получение, физико-химические свойства и реакция с нитритом
- Влияние оксида азота и гипоксического прекондиционирования на устойчивость крыс линии КМ к звуковому стрессу
