Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие нитритас антиокислительными ферментамии гемоглобином как важнейшийэлемент его токсичности

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие нитритас антиокислительными ферментамии гемоглобином как важнейшийэлемент его токсичности"

На правах рукописи

Р Г Б ОД

Марголина Анна Александровна

" 3 ДПР 2000

Взаимодействие нитрита с антиокислительными ферментами и гемоглобином как важнейший элемент его токсичности

03.00.02-Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре биофизики Российского Государственного медицинского университета

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент Петренко Юрий Михайлович

кандидат биологических наук Титов Владимир Юрьевич.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ванин Анатолий Федорович

доктор биологических наук, профессор Азизова Офелия Охатовна

Ведущая организация:

Факультет фундаментальной медицины МГУ

Защита состоится "----"............... 2000 года в____часов на заседании

диссертационного совета в Российском государственном медицинском университете по адресу: 117437 г Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан "____"..............2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К-084-14-04

к.б.н., доцент Буромский И.В.

ОС !,/

N

о

о

>

с

,Г)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Нитрит ионы относятся к числу наиболее токсичных и долгоживущих соединений азота. Наряду с нитратами нитриты поступают в организм человека экзогенно с водой и пищей, а также образуются эндогенно из окиси азота или за счет восстановлении нитратов микрофлорой (Green L. et al. 1982, Hartman Ph. 1982, Bruning-Fann С. et al. 1993 ). Нитриты вызывают поражение ЖКТ, обладают канцерогенным действием. При попадании данных соединений в кровь возникает метгемоглобинемия различной степени тяжести (Keatling J. Р. et al, 1973). В некоторых случаях (чаще всего у детей) это заболевание приводит к летальному исходу.

В настоящее время безопасные и эффективные средства лечения нитрит индуцированной метгемоглобинемии отсутствуют (Бурбелло Ф.Т. с соавт., 1991, Coleman MD., 1996). Это во многом объясняется тем, что механизм взаимодействия нитрита и гемоглобина остается неясным.

Многие исследователи отмечают, что трудности в изучении процессов с участием нитрита объясняются отсутствием надежных методов измерения концентрации нитрита в биологических объектах. Кислая среда, необходимая для колориметрического определения концентрации нитрита (например по методу Грисса), создает условия для взаимодействия нитрита и аскорбата, что приводит к потерям нитрита и искажению результата анализа (Riise Е., Berg-Nielsen К., 1990). Кроме того, большинство методов неприменимы для анализа содержания нитрита в биологических объектах, где измерению мешают мутность раствора, наличие восстановителей, некоторых органических и неорганических веществ. Таким образом, разработка метода, позволяющего проводить измерение концентрации нитрита при нейтральных pH в мутных образцах при наличии аскорбата и других восстановителей, является актуальной и практически важной.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было выяснение механизма развития нитрит индуцированной метгемоглобинемии, роли антиокислителей и других

физиологически активных соединений в данном процессе, определение путей его предотвращения.

В работе были поставлены и решались следующие задачи:

1. Разработка нового метода количественного определения нитритов в биообъектах.

2. Исследование воздействия нитрита на активность антиокислительных ферментов (каталазы, гемовых пероксидаз) с целью выяснения

• возможной физиологической роли данного воздействия.

3. Определение роли перекиси водорода и других активных форм кислорода на различных стадиях процесса путем использования антиокислительных ферментов, неферментных антиоксидантов, а также соединений, способных окисляться в пероксидазной реакции.

4. На основании данных, полученных на модельных системах, получить представление о механизме нитрит индуцированного окисления гемоглобина в условиях ¡n vivo.

Новизна исследования С помощью калориметрического метода регистрации кинетики ферментативных реакций (Титов В.Ю. и др. 1988, Петренко Ю.М. и др. 1989) впервые показано, что нитрит в концентрациях 10"5 - 10"6 М, т.е. реально встречающихся в органах и тканях, способен обратимо ингибировать каталазу в присутствии нормальных для плазмы крови концентраций хлорида и тиоцианата, а также в присутствии бромида. Используя каталазу как детектор на нитрит ион, мы разработали новый метод количественного определения нитритов в биообъектах (Титов В.Ю. и др, 1997,1998).

Мы исследовали кинетические закономерности окисления гемоглобина в присутствии нитрита и ряда биологически активных веществ и установили, что способностью блокировать нитрит индуцированное окисление гемоглобина обладают соединения, способные окисляться в пероксидазной реакции, катализируемой метгемоглобином. На основании результатов, полученных на модельной системе, содержащей гемолизат эритроцитов или целые эритроциты, мы предложили схему взаимодействия нитрита с гемоглобином в условиях организма, что позволило нам дать рекомендации по поиску средств лечения и предотвращения нитрит индуцированной метгемоглобинемии.

Научно-практическая значимость работы

Разработанный нами метод определения нитрита при помощи каталазы как биодетектора может быть использованным не только в научных исследованиях, но и в клинике. Метод не уступает в чувствительности общепринятым методикам (Sen N. et al. 1978; Norwitz G. et al. 1986, 1987; Kaveeshwar R. et al. 1991; Емченко C.B. и др. 1993) и является в настоящее время единственным методом, за исключением предложенного Hamano T. et al. (1998), позволяющим количественно определять нитриты в нейтральной среде и тем самым избегать неконтролируемых потерь исследуемого вещества при наличии аскорбата и других восстановителей. В отличии от последнего он не требует предварительных процедур по снижению изначальной мутности или окрашенности объекта, так как не основан на фотометрической регистрации. Таким образом, все неконтролируемые потери исследуемого вещества сведены к минимуму.

Предложенный в данной работе механизм развития индуцированной метгемоглобинемии позволяет определить характеристики, которыми должны обладать средства профилактики и купирования данного патологического процесса, подвести теоретическую базу под поиск таких средств, что сделает его более эффективным .

Апробация работы

Результаты работы были доложены и обсуждены на совместном заседании кафедры биофизики МВФ РГМУ и отдела биофизики НИИ Физико-химической медицины МЗМП РФ от 24 декабря 1999 г.

Публикации

Основное содержание диссертации изложено в 9 печатных работах.

Объем работы

Диссертация состаоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Объем диссертационной работы 120 страниц печатного текста. Список литературы состоит из 105 источников цитируемой литературы.

з

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В главе 1. приведены сведения о путях поступления нитратов и нитритов в организм, об их эндогенном образовании и метаболизме в органах и тканях (Wolff I. et al. 1972, Culliton В. е. а. 1978, Green L. et al. 1982, Hartman Ph. 1982, Bruning-Fann C. et al. 1993, Ellis G. et al. 1998), а также обсуждаются предлагаемые механизмы их токсического действия. Показано, в частности, что ни одна из современных схем развития нитрит индуцированной метгемоглобинемии (Roy А. et al. 1969; Tomoda А. et al. 1981; Kosaka H. et al. 1979,1982,1987; Spagnuolo C. et al. 1987; Doyle M. et al. 1985; Arduini A. et al. 1992) не моделирует процесс, наблюдаемый in vivo в экспериментах на лабораторных животных, а так же у людей при отравлении. В результате нет единого взгляда на патогенез нитрит индуцированной метгемоглобинемии и не определены характеристики, которыми должны обладать средства для ее предотвращения. В связи с этим поиски таких средств до сих пор не имели большого успеха (Бурбелло Ф.Т. и др. 1991, Unnikrishnan М. et al. 1992, Arduini А. et al. 1992).

На наш взгляд, одним из главных препятствий к выяснению механизма нитрит индуцированной метгемоглобинемии является отсутствие методик быстрого и адекватного определения концентрации нитритов в биологических объектах. Последнее признается многими исследователями (Norwitz G. et al. 1986,1987; Riise E. et al. 1990; Kaveeshwar R. et al. 1991; Tsikas D. et al. 1997; Hamano T. et al. 1998). В разделе подробно описаны современные методики количественного определения нитритов и нитратов с обсуждением их достоинств и недостатков. Сделан вывод, что без совершенствования данных методик невозможен дальнейший прогресс в исследовании механизмов токсического воздействия данных соединений.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В работе использовались следующие методы:

1) Динамическая калориметрия (для определения активности каталазы и пероксидазы).

2) Динамическая фотометрия (для контроля кинетики окисления гемоглобина в гемолизатах, а так же кинетики образования метгемоглобинперекисных комплексов).

3) Дифференциальная спекгрофотометрия с использованием сферы Ульбрихта (для контроля окисления гемоглобина в эритроцитах).

4) Стандартный метод определения концентрации нитрита с пользованием п-1 -нафтил-эталендиаминдигидрохлорида.

5) Перманганатометрический метод (для определения концентрации перекиси водорода).

Главы 3,4. Результаты исследования и обсуждение. 1. Ингибирование каталазы в присутствии нитрита - важнейший элемент его токсичности.

Мы исследовали взаимодействие нитрита с каталазой (использовался изолированный фермент из печени быка, а также гемолизат эритроцитов кролика, курицы, коровы, человека). Скорость разложения перекиси водорода каталазой регистрировалась калориметрическим методом. Метод основан на регистрации количества теплоты, выделяющейся при разложении введенной перекиси водорода каталазой. При этом количество выделяющейся теплоты пропорционально количеству разрушенной перекиси (Титов В.Ю. и др. 1988, Петренко Ю.М. и др. 1989)) Из рисунков 1-3 видно, что в присутствии хлорида, бромида и псевдогалоида тиоцианата нитрит в концентрациях 10"5 - 10"6 М, т.е. реальных в условиях ¡n vivo (Torre D. et al. 1996), способен эффективно снижать способность каталазы разлагать перекись водорода. Замена галоид анионов и тиоцианата на сульфат, фосфат, ацетат и цитрат анионы снимала ингибирующий эффект (рис.2). Мы сделали вывод, что происходит именно ингибирование фермента, а не изменение пути разложения перекиси водорода, так как количество теплоты, выделяющейся при полном разложении вводимого количества перекиси, было одинаково как в контрольных образцах, так и в образцах, содержащих нитрит и хлорид. Это свидетельствует о том, что во всех случаях разложение Н2О2 идет по каталазному пути, поскольку тепловые эффекты пероксидазного и свободно-радикального пути в несколько раз выше (Титов В.Ю. и др. 1988, Петренко Ю.М. и др. 1989).

Время, с.

Рис 1 Кинетические кривые разложения перекиси водорода каталазой в присутствии нитрита и хлорид-иона

Образцы (1-5) изначально содержали 40 мМ ЫаНгРО^ 8 нМ каталазы А так же: (1) - 5 мкМ КШ2 и160 мМ N301, (2) - 5 мкМ ЮЧ02, затем 160 мМ №С1 добавляли за 10 сек до третьего ввода Н2О2, (3-4) - 160 мМ №С1, в образец 3 за 10 сек до второго ввода Н2О2 добавили 5 мкМ КЫ02. (5) - не содержал КЖ>2 и ИаС1. Стрелками Р обозначены моменты ввода 9 мМ Н2О2. Везде рН 6.5

Концентрация №С1, тМ

Рис 2. Степень ингибирования каталазы (I) нитритом в зависимости от содержания галоид ионов в реакционной среде.

I = Ац -Ап.100%. где Ао и Ак- каталазная активность соответственно Ак

исследуемого и контрольного образца, не содержащего КЖ)2, определенная по тангенсу угла наклона начального прямолинейного участка кинетической кривой (Титов В.Ю. и др 1988).

Все образцы (1-8) изначально содержали 40 мМ НаНгРО^ 8нМ каталазы, 250.0 (1, 3, 5-8) или 12.5 (2,4) мкМ КЫОг, а так же №С1 в концентрации, указанной на оси абсцисс. Образцы 3 и 4, вместо №С1 содержали аналогичные концентрации ЫаВг, а образцы 5, 6, 7, 8 - соответственно КН2РО4, N82804, СНзСООК, С607Н5Кз. Везде рН 7.4

Снижение скорости разложения перекиси водорода каталазой наблюдалось лишь в присутствии нитрита и хлорида и не наблюдалось в отсутствии хотя бы одного из них (рис.1). Степень ингибирования не изменялась при последующих вводах Н2Ог. Ввод недостающего компонента (нитрита либо хлорида) перед вторым либо третьим вводом перекиси вызывал ингибирование фермента идентично случаю, когда оба компонента исходно присутствовали перед первым вводом. Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирующая субстанция не накапливается и не расходуется в процессе реакции.

Из данных, представленных на рис.4, следует, что ингибирование обратимо, поскольку при разведении реакционной среды, содержащей каталазу, нитрит и хлорид, в 10 раз наблюдается та же степень ингибирования, как и в образцах, изначально содержащих данные компоненты в той же концентрации, что и получаемой при разведении.

Из представленных на рис. 2 и 3 зависимостей степени ингибирования фермента от концентрации хлорида, бромида и тиоцианата видно, что кривые выходят на плато при одних и тех же концентрациях СГ, Вг" и БСЫ" вне зависимости от концентрации нитрита. Кроме того, в случае тиоцианата плато достигается при концентрациях КЭСЫ меньших, чем используемая концентрация нитрита (рис.3). Дополнительный ввод как тиоцианата, так и хлорида не способствовал увеличению степени ингибирования. Эти данные говорят о том, что, по-видимому, нитрит и галоид анионы обратимо связываются с различными структурами апофермента. В то же время исследованные нами гемовые пероксидазы: лактопероксидаза, пероксидаза хрена и метгемоглобин проявили значительно большую устойчивость к ингибированию нитритом (Титов В.Ю. и др. 1999). Так нитрит в концентрации до 0.1 тМ не оказывал существенного влияния на кинетику образования метгемоглобинперекисных комплексов как в присутствии СГ, Вг" и БСЫ", так и в их отсутствии. На кинетику восстановления комплексов нитритом данные анионы также не влияли (рис.5). Это зафиксировано как при рН 7.4, так и при рН 6.0. Данные рис.6 свидетельствуют о том, что в системе, содержащей метгемоглобин, каталазу и нитрит, присутствие плазменных концентраций хлорида и тиоцианата, а также бромида вызывает усиление интенсивности образования метгемоглобинперекисных комплексов.

Концентрация КБСМ мкМ

Рис 3. Степень ингибирования каталазы нитритом в зависимости от концентрации тиоцианата в реакционной среде. I - степень ингибирования фермента, определяемая аналогично рис 2. Все образцы (1-3) изначально содержали 40 мМ НаН2РС>4, 8нМ каталазы, 12.5 (1), 37.5 (2), 250.0 (3) мкМ КЫОг, а так же КБСЫ в концентрации, указанной на оси абсцисс. Везде рН 7.4.

ДЩгОг], мМ

Время, с.

Рис 4. Обратимость ингибирования каталазы нитритом в присутствии хлорид ионов. Образцы изначально содержали: 40 мМ КаН2Р04, 8 нМ каталазы (1-3,6), 80 нм каталазы (4,5). А так же: (1)— 160 мМ ЫаС1 и 7.5 мкМ ЮГО2> (2) —16 мМ КаС1 и 7.5 мкМ КШ2> (3) —160 мМ ИаС1 и 75 мкМ КК02, (4) -160 мМ ИаС1 и 75 мкМ КЖ>2. После 30 мин инкубации при 25 С, образец (4) был разведен в 10 раз 40мМ ]^1аН2Р04. (5) - аналогичен (4), но, после разведения, концентрация №С1 доведена до 160 мМ. (6) - образец не содержал ИаС1 и КЫ02. Стрелкой Р обозначен ввод в образцы 9 мМ Н202. Везде рН 6.5

В отсутствии нитрита данные анионы не проявляют такого действия. Увеличение образования метгемоглобинперекисных комплексов в присутствии нитрита должно вести к усилению его окисления данными комплексами (Arduini A. et al. 1992, Титов В.Ю. и др. 1997), что чревато усилением продукции токсичного NO2'.

2. Возможность использования каталазы для количественного определения нитритов в биообъектах.

На рис.7 приведены зависимости степени ингибирования каталазы от концентрации нитрита в среде, содержащей 150 mM NaCI. По мере закисления среды степень ингибирования каталазы возрастает. Приведенные на рис.7 зависимости имели одинаковый характер как для изолированного фермента из печени быка, так и в случае исследованных нами биообъектов: гемолизатов эритроцитов кролика, курицы, коровы, человека. Учитывая все эти обстоятельства, можно предположить возможность использования каталазы как детектора содержания нитрита в биообъектах, используя данные рис.7 в качестве калибровочной кривой (рис.7). Наличие в реакционной среде аскорбата (до 0.5 мМ) не оказывало на ингибирование каталазы нитритом никакого влияния. Не влияли и хелаторы металлов переменной валентности ЭДТА и о-фенантролин (рис.8). Присутствие в реакционной среде метгемоглобина значительно сказывалось только при рН 6.0. При рН 6.5 метгемоглобин в концентрации до 50 цМ достоверно не влиял на степень ингибирования каталазы при первом и повторном вводе перекиси (рис.9).

3.Нитрит индуцированное окисление гемоглобина в эритроцитах и их гемолизатах. Механизм, пути защиты и профилактики.

Взаимодействие нитрита с гемоглобином было исследовано в гемолизате эритроцитов, а также в суспензии эритроцитов. На рис.10 представлены кинетические кривые нитрит индуцированного окисления гемоглобина в гемолизатах эритроцитов при различных концентрациях нитрита. Ввод 1мМ нитрита в реакционную среду, содержащую гемолизат эритроцитов (100 мкМ гемоглобина), приводил к увеличению оптической плотности при X = 630 нм (рис.11).

Рис 5. Образование метгемоглобин - перекисных комплексов и восстановление их нитритом Образцы (1-13) изначально содержали: 40 мМ NaH2P04, 20 мкМ метгемоглобина, Образцы (2,6,11) содержали 150 мМ NaCl, (3,7,12) - 150 мМ КВг, (4,8,13) - 50 мкМ KSCN. Стрелкой N обозначен момент ввода в образцы KN02(mM): 1.0 -(1-4), 0.1 - (5-8), 0.03 -(9) и 0- (10-13). Стрелкой Р обозначен ввод 1.0 мМ Н2О2, Стрелкой К - ввод 0.2 мкМ каталазы. Везде рН 7.4.

AD540

Время, с

Рис б Образование метгемоглобин-перекисных комплексов в присутствии каталазы и нитрита. Образцы изначально содержали: (1-4) - 40 мМ NaH2P04, 20 мкМ метгемоглобина, 50 мкМ KN02, 12 нМ каталазы, а так же: (2) - 150 мМ NaCl, (3) - 150 мМ КВг, (4) - 0.1 мМ KSCN. Образцы (5-8) аналогичны (1-4), но нитрит отсутствовал. (9) аналогичен (5), но содержал 6 нМ каталазы. В моменты обозначенные стрелками, в образцы вводили 0.5 мМ Нг02. Везде рН 7.4.

Рис 7 Концентрационная зависимость величины ингибирующего эффекта нитрита на каталазу при различных значениях рН.

Образцы (1-4) изначально содержали: 40 мМ NaH2P04, 150 мМ NaCl, 8 нМ каталазы и соответствующие концентрации KN02. «А» - активность фермента в присутствии нитрита, определенная по тангенсу угла наклона начального прямолинейного участка кинетики теплопродукции, наблюдающейся после ввода 9.0 мМ Н2О2. «Ао» - активность фермента в отсутствии нитрита. рН: (1) -6.0, (2)-6.5,(3)-7.4, (4)-8.5

Рис 8. Калориметрическая регистрация инактивации нитритом каталазной активности гемолизата эритроцитов. Реакционная среда изначально содержала: 20 мМ трис буфера, 0.158 M NaCl, гемолизат эритроцитов (концентрация гемоглобина 7.0 мкМ), а так же NaN02 в концентрации (мкМ): (1) - 0, (2) - 2.5, (3) - 5.0, (4) - 20.0; (5,7,9) и (6,8,10) аналогичны 1 и 3 соответственно, но среда дополнительно содержала: в случаях (5) и (6) - 1 мМ KNO3, (7) и (8) - 0.5 мМ аскорбата, (9) и (10) - 1мМ ЭДТА+1мМ о-фенантролина. Стрелкой Р обозначен момент ввода 9.0 мМ Н2О2 в калориметрическую ячейку. Везде рН 6.5.

И

Оценка спектра светопоглощения продукта, образующегося при выходе кинетических кривых рис.11 на плато, по методике Salvati А. е.а. (1969), а также его сравнение со спектром раствора фирменного препарата метгемоглобина свидетельствовали о полном окислении содержащегося в реакционной среде гемоглобина до метгемоглобина. Так как последний имеет характеристический максимум при бЗОнм, а не окисленный гемоглобин при данной длине волны практически не поглощает, то кинетика увеличения оптической плотности при 630 нм идентична кинетике накопления метгемоглобина.

Из представленных на рис.11 кинетических кривых нитрит индуцированного окисления гемоглобина в гемолизатах эритроцитов видно, что накопление метгемоглобина идет по S-образной кинетике, регистрируемой практически во всех модельных системах, где исследовалось окисление чистого гемоглобина и гемолизатов эритроцитов под действием нитрита (Roy А. et al. 1969; Kosaka Н. et al. 1979,1982,1987; Doyle М. et al. 1985; Arduini А. et al. 1992). Многие исследователи выделяют в ней фазу инициации и аутокаталитическую фазу. Увеличение концентрации нитрита укорачивает фазу инициации и убыстряет аутокаталитическую (рис. 11). Как следует из данных, представленных на рис. 11, фаза инициации сокращается до минимума, если в реакционной среде присутствует перекись водорода. Ввод дополнительного количества каталазы, наоборот вызывал удлинение фазы инициации. Изначальное присутствие метгемоглобина способствовало ее укорочению. На аутокаталитическую фазу все эти факторы не влияли (рис. 11). Таким образом, между данными фазами есть качественная разница. Присутствие аскорбата, а также соединений, способных окисляться в пероксидазной реакции, катализируемой метгемоглобином: бензидина, ß-нафтола, серотонина, ß-эстрадиола препятствовало окислению гемоглобина, оказывая влияние на обе фазы (рис.12). Причем эффективность данных соединений как протекторов гемоглобина пропорциональна их эффективности как пероксидазных субстратов (Петренко Ю.М. и др. 1995, 1999). Наиболее эффективные пероксидазные субстраты, например бензидин, способны блокировать процесс на любой стадии, присутствуя в концентрациях многократно меньших, чем концентрации гемоглобина и нитрита (рис. 12).

u _1_I_L.

0 50 100

[MtHb] mkM

Рис9. Влияние метгемоглобина на степень ингибирования каталазы нитритом.

! _ 4,-л .юру - степень снижения каталазной активности относительно

4,

контрольных образцов, имеющих аналогичный состав, но в которых отсутствует ингибитор, где Ао и А — каталазная активность контрольного и опытного образца соответственно. Реакционная среда изначально содержала: 20 мМ трис буфера, 0.158 M NaCl, 0.006 мкМ каталазы, метгемоглобин в концентрации указанной на оси абсцисс, а так же NaNCb (мкМ): (1) -30.0; (2) - 4.0; (3) - 2.0. рН среды: (1) - 7.4; (2) - 6.5; (3) - 6.0.

N

Время, мин.

РисЮ Кинетика окисления гемоглобина гемолизата эритроцитов под действием различных концентраций нитрита. Состав реакционной среды: 40 мМ КН2РО4, гемолизат эритроцитов (ЮОмкМ гемоглобина), рН 7.4. В моменты обозначенные стрелкой "Ы" , в образцы вводили № Ж>2 (шМ): (1) - 1.0; (2) - 0.5; (3) - 0.25; (4) - 0.1; (5)-0.0

Время, мин

Рис11. Кинетика окисления гемоглобина в гемолизате эритроцитов под действием высокой концентрации нитрита. Влияние каталазы, перекиси водорода и метгемоглобина. Реакционная среда изначально содержала: 20 мМ трис буфера, 0.158 М ЫаС1, гемолизат эритроцитов (100 мкМ гемоглобина), рН 7.4. Образец (2) дополнительно содержал 1 мкМ каталазы, образец (3) - 20 мкМ метгемоглобина. Время введения 1мМ №N02 во все образцы обозначено стрелкой Ы, а время введения 70 мкМ Н2О2 в образец 4 стрелкой Р.

Время, мин

Рис12. Кинетика нитрит-индуцированного окисления гемоглобина в присутствии ряда физиологически активных веществ. Все образцы (1-14) изначально содержали: 20 мМ трис-буфер, 0.158 M NaCl, гемолизат эритроцитов (100 мкМ гемоглобина). Кроме этого образцы дополнительно содержали: (1) - 100 мкМ тестостерона, (2) -50 мМ маннитола, (3) - 10 мМ ЭДТА, (4) - 1 мМ KNO3, (5) - 1М этанола, (6) - аликвота физраствора, (7, 8, 9) - 4, 0.2, 0.1 мкМ бензидина, соответственно, (10) - 5 мкМ серотонина, (11)

- 1 мкМ р-нафтола, (12) - 20 мкМ р-эстрадиола, (13) - 10 мкМ аскорбата, (14)

- 4 мкМ бензидина (момент ввода бензидина обозначен стрелкой Б), стрелкой N обозначен ввод в образцы 1 мМ NaNOî. Везде рН 7.4.

О 10 20

Время, мин

Рис13 Кинетика нитритиндуцированного окисления гемоглобина в присутствии р-нафтола. Все образцы (1-6) изначально содержали: 20 мМ трис-буфер, 0.158 M NaCl, гемолизат эритроцитов (100 мкМ гемоглобина). Кроме этого образцы дополнительно содержали Р-нафтол (мкМ): (1,2) — 2, (3) — 10,(4)— 25,(5)— 50,(6)— 0. Стрелкой N обозначен ввод в образцы, 1 мМ NaNOî стрелками Ф— ввод 100 мкМ Н2О2 в образцы 2-5. Везде рН 7.4.

дО630 LX

0,30 р / у/

0,15 -

N Р'Р 3

0 \\М ------ 4,5,6,7

0 35 70 Время, мин

А

Рис14 Кинетика окисления гемоглобина в гемолизате эритроцитов под действием низких концентрации нитрита. Влияние метгемоглобина и перекиси водорода. Все образцы изначально содержали: 20 мМ трис-буфер, 0.158 М NaCl, гемолизат эритроцитов) - образцы (1-9) - 100 мкМ гемоглобина, образец 10- 200 мкМ гемоглобина). Кроме этого образцы дополнительно содержали: А. (2 и 4) - 10 мкМ метгемоглобина. Стрелкой N обозначен ввод 200 мкМ NaNC>2 в образцы (1-5), Р — ввод 70 мкМ Н2О2 в образцы (1,2,6), (Р')— ввод 70 мкМ Н2О2 в образец 3. В образец (7) NaNC>2 и Н2Ог не вводили.

Б. Стрелкой N обозначен ввод 50 мкМ NaN02 во образцы (8,10) и ввод 1 мМ NaN02 в образец (9), Г— ввод 100 мкМ гемоглобина (гемолизат эритроцитов) в образцы (8,9). В образцы 8,10 после введения NaNOj с интервалом 150 сек добавляли 60 порций Н2О2 по 100 мкМ. В образец 9 Н2О2 не вводили. Везде рН 7.4.

Вещества, неспособные окисляться в пероксидазной реакции, катализируемой метгемоглобином, даже при наличии антиокислительных свойств на процесс не влияли (рис.12).

Добавление экзогенной перекиси водорода к гемолизату эритроцитов, содержащему большие концентрации высокоэффективного пероксидазного субстрата, вызывало инициацию окисления гемоглобина. Но в зависимости от концентрации субстрата кинетика принимала либо самоускоряющийся, либо прямолинейный, либо затухающий характер, так что для поддержания процесса требовался ввод новых порций Н2О2 (рис.13). Эта закономерность получена в экспериментах с р-нафтолом, бензидином, аскорбатом. Аналогичная ситуация наблюдалась при использовании в пять и более раз ■ меньших концентраций нитрита (рис. 14).

Без ввода экзогенной перекиси в течение 60 минут окисления гемоглобина практически не наблюдалось и нитрит не расходовался. Ввод экзогенной перекиси индуцировал окисление гемоглобина, но Б-образной кинетики при этом не наблюдалось. Напротив, кинетика принимала затухающий характер. При вводе последующих порций перекиси окисление возобновлялось. Крутизна кинетической кривой возрастала по сравнению с предыдущим вводом, однако характер кинетики не менялся. Изначальное присутствие метгемоглобина ускоряло окисление гемоглобина. Окисление гемоглобина в присутствии малых концентраций нитрита (меньших, чем гемоглобина) показывает, что количество окисленного гемоглобина может многократно превышать убыль нитрита в реакционной среде (рис.15). После исчезновения нитрита из реакционной среды окисление вновь введенного гемоглобина начиналось лишь после ввода новой порции нитрита (рис.146), что говорит о том, что окончательные продукты окисления нитрита не способны индуцировать окисление гемоглобина.

Хотя нитрит ингибирует каталазу (рис.7), но как показали наши предыдущие исследования (Титов В.Ю. и др., 1991 г.), оставшейся ее активности вполне хватает, чтобы полностью предотвратить чисто перекисную деструкцию гемоглобина при всех используемых здесь концентрациях нитрита и перекиси. Ввод перекиси в образцы, не содержащие нитрита, не приводил к образованию метгемоглобина (рис.15).

ftl^ijo

OJO 3

О. IS N

О I 1 —i- -»S-lli -i _!

0 10 20 t,mln — -

Рис 15. Кинетика нитрит-индуцированного окисления гемоглобина гемолизата эритроцитов. Влияние каталазы, хлорида, бромида и тиоциаиата. Все образцы изначально содержали: 40 мМ NaH2P04, гемолизат эритроцитов (100 мкМ гемоглобина, а так же: (1) и (9) - 150 мМ NaCl, (2) и (10) - 150 мМ КВг, (3) и (11) - 50 мкМ KSCN, (4) - 150 мМ NaCl+ 0,2 мкМ каталазы, (6) - 200 мМ NaH2P04, (7) - 120 мМ Na2S04. В момент обозначенный стрелкой "N" в образцы вводили 200 мкМ KN02, маленькими стрелками -100 мкМ Н202. В образцы (8-11) KN02 не вводили. рН везде 7,4.

д06зо

Рис. 16 Влияние лактопероксидазы, метгемоглобина и пероксидазы хрена на нитрит индуцированное окисление гемоглобина. Состав реакционной среды: 40 мМ НаН2Р04, гемолизат эритроцитов (ЮОмкМ гемоглобина), а так же (2) - 1,5 мкМ пероксидазы хрена, (3) - 10 мкМ метгемоглобина, (4) - 1,0 мкМ лактоперокосидазы. В момент, обозначенный стрелкой «№> в образцы вводили 0,2 мМ КЫ02, после чего через каждую минуту вводили порции Н202 по 0,1 мМ. Образцы (5-8) аналогичны (1-4), но ЮЧ02. рН везде 7.4

Тем не менее в присутствии 0.2 мМ нитрита интенсивность окисления гемоглобина многократно снижалась при добавлении в среду каталазы в количестве равном уже содержащемуся в гемолизате. Присутствие в реакционной среде плазменных концентраций хлорида и тиоцианата, а также бромида, приводило к существенной интенсификации окисления гемоглобина (рис.15). В связи с тем, что хлорид, бромид и тиоцианат способствуют ингибированию каталазы в присутствии нитрита, в то время, как пероксидазная активность метгемоглобина по отношению к нитриту не меняется (рис.3,5), есть основание предположить, что в этом и заключается причина интенсификации. Известно, что в норме концентрация анионов внутри клетки многократно меньше, чем во внеклеточной среде. Так концентрация хлорида внутри клетки, по данным некоторых исследователей, около 5 mM (Mori Y. е.а. 1996). В таких условиях ингибирование каталазы в присутствии нитрита в концентрации до 0.2 мМ незначительно (рис.3).

Окисление значительно ускорялось при изначальном присутствии метгемоглобина, но особенно в присутствии лактопероксидазы, которая является высокоэффективным окислителем нитрита. Пероксидаза хрена, сродство которой к нитриту как к субстрату незначительно, оказывала очень слабое влияние на процесс (рис.16)

В суспензии эритроцитов процесс идет аналогичным образом, и количество окисленного гемоглобина может многократно превышать изначально введенное количество нитрита (рис.17). Эритроциты, в отличие от их гемолизатов, обладают значительно большей устойчивостью к нитрит индуцированному окислению гемоглобина. Так нитрит в концентрации 1 мМ, вызывающий полное окисление гемолизата, содержащего 0,1 мМ гемоглобина, за 8 минут (рис.10,11) не вызывал значительного образования метгемоглобина в суспензии эритроцитов, содержащей равное количество гемоглобина за 60 минут (рис.18). В отсутствие ввода перекиси водорода окисления гемоглобина не происходило и нитрит не расходовался. Также из данных, представленных на рис.18, следует, что эритроциты можно отмыть от нитрита. В эритроцитах, проинкубированных в течение 10 минут с 0,3 мМ нитрита, а затем отмытых от него физиологическим раствором, метгемоглобин не образовывался даже при систематическом вводе перекиси.

[4 нь02]/[л км02]

6 -

5 4 3

1:1 2:1 4:1

[д ньо2]0/[д кыог]0

Рис. 17. Стехиометрия иитритиндуцированного окисления гемоглобина

По оси абсцисс: начальное соотношение концентрации оксигемоглобина и нитрита По оси ординат: соотношение между количеством окисленного гемоглобина и израсходованного нитрита, зафиксированное после полного окисления гемоглобина. Состав реакционной среды и ход эксперимента аналогичен рис. 15.

Время, мин

Рис 18 Кинетика иитритиндуцированного окисления гемоглобина в суспензии эритроцитов. Влияние перекиси водорода Все образцы изначально содержали: 20 мМ трис-буфер, 0.158 М КаС1, суспензию эритроцитов (100 мкМ гемоглобина). Стрелкой N обозначен ввод в реакционную среду №N(>2 (мкМ): (1) — 1 ООО, (2) — 100, (3) — 10, (4) — 300,(5)— 5, (6) — 1000, (7)-0 . В образцы (1- 3, 5, 7) после ввода №N02 вводили (55 раз с интервалом 1 мин) 70 мкМ Н2О2 . Образец (4) — после введения №N02 и 10 мин инкубации, эритроциты трижды отмывали физраствором, а затем ресуспензировали в прежней концентрации и вводили Н2О2 в указанном выше порядке. Везде рН 7.4.

Полученные данные позволяют предложить следующую схему нитрит индуцированного окисления гемоглобина:

Непосредственным окислителем гемоглобина является диоксид азота (N02). Он образуется в результате пероксидазного окисления нитрита. В качестве пероксидазы в данном случае выступает метгемоглобин, который образует комплексы с перекисью водорода.

Hb' + Н202 -»НЬООН + Н+ (1)

Комплекс НЬООН, являясь двухэквивалентным окислителем, способен окислить две молекулы нитрита до N02' (Doyle М. et al. 1985).

Н+ + НЬООН + NO2' -у [HbOH]+ + N02 + OH' (2)

[HbOH]+ + N02" Hb+ +N02 + OH"

Следует отметить, что комплексы НЬООН в норме всегда присутствуют в эритроците в результате спонтанного аутоокисления гемоглобина, а также поступления перекиси водорода в эритроцит из плазмы крови, где в норме последняя всегда присутствует в результате действия нейтрофилов, а также различных оксидаз (Weiss S. 1982, Morse Е. 1988). Перекись связывается с метгемоглобином (НЬ+), который в норме содержится в эритроците в количестве до 2% от общего количества гемоглобина (Carrell R. е.а. 1975).

Наличие в реакционной среде пероксидазных субстратов -конкурентов нитрита (H2S) препятствует окислению последнего и, соответственно, продукции N02- и окислению гемоглобина.

Н+ + НЬООН + H2S S + 2НгО + Hb* (3)

Продукты окисления субстратов - конкурентов не способны индуцировать окисление гемоглобина. Как было показано ранее (Титов В.Ю. и др. 1991), окисление гемоглобина при наличии в среде кислорода всегда сопряжено с продукцией перекиси водорода. Не является исключением и рассматриваемый здесь процесс. Известно, что нитрит индуцированное окисление гемоглобина-кислородозависимый процесс (Chiodi Н. et al. 1983, Степуро И. И. и др. 1997). Тот факт, что пероксидазные субстраты-конкуренты способны тормозить данный процесс на любой стадии (рис. 12) позволяет предположить, что пероксидазное окисление нитрита является ключевым звеном процесса на всем его протяжении. Для этого необходима перекись водорода, которая, должна постоянно образовываться на всем протяжении

кинетической кривой. Тем не менее каталаза и другие ферменты, разлагающие перекись водорода, оказывают влияние лишь на фазу инициации и не влияют на аутокаталитическую фазу (рис.11). Это показано и другими исследователями на чистом гемоглобине ( Roy А. et al. 1969, Kosaka Н. et al. 1982, Doyle М. et al. 1985). Данное противоречие можно объяснить лишь тем, что окисление гемоглобина с образованием перекиси преимущественно происходит без выхода последней в окружающую среду. Это может быть реализовано, в частности, при внутриглобулярной дисмутации двух супероксидных радикалов, образующихся при окислении соответствующей субъединицы (Титов В.Ю. и др. 1991).

Известно, что в молекуле гемоглобина окисление одной субъединицы стимулирует окисление другой (Huisman Т. 1966). Ранее нами (Титов В.Ю. и др., 1997 г.) предложен механизм, согласно которому NO2' окисляет определенную структуру апофермента, что стимулирует окисление сначала одной, а потом соседней субъединицы с образованием супероксидных радикалов, дисмутирующихся в пределах глобулы. Сам диоксид азота при этом восстанавливается до нитрита.

(+)

N02- + (НЬ02)4 + Н+ (НЬ02)2(НЬ+)(НЬ00Н) +N02- + 02 (4)

Возможны и другие механизмы окисления гемоглобина, например, через образование пероксинитрата (Doyle М. et al. 1985). Но в любом случае образующаяся перекись недоступна для каталазы, что возможно лишь в том случае, если перекись не выходит за пределы глобулы гемоглобина.

Образующиеся комплексы НЬООН способны окислять новые молекулы нитрита, порождая таким образом новые комплексы. Если больше половины НЬООН окисляет примесные субстраты, то каждый комплекс в среднем порождает менее одного нового, и кинетика процесса будет иметь затухающий характер, и для его поддержания будут необходимы периодические вводы перекиси в среду (рис.13). Таким образом, интенсивность окисления гемоглобина и характер кинетики процесса зависят прежде всего не от абсолютной концентрации нитрита, а от соотношения эффективностей нитрита и других присутствующих в реакционной среде соединений как пероксидазных субстратов.

Реакцией, в результате которой нитрит исчезает из реакционной среды, является взаимодействие двух NO2 между собой (Doyle М. et al. 1985).

Н20

2NOz о N204 -> N02" + N03" +2Н+ (5)

Стехиометрия процесса, таким образом, зависит от соотношения интенсивностей процессов (4) и (5), если в среде отсутствуют другие соединения, способные вступать с NO2' в реакции, в которых последний не восстанавливается до нитрита.

Аутокаталитическая стадия может развиться лишь в том случае, если все субстраты-конкуренты будут окислены. Именно это, по-видимому, и происходит на стадии инициации, протяженность которой зависит от наличия данных субстратов (рис.13), а также от наличия в среде свободной перекиси и пероксидаз (рис.11, 14). Пероксидазные субстраты всегда содержатся в эритроцитах, их гемолизатах и растворах гемоглобина, так как ими могут быть, в частности, отдельные аминокислоты, различные вещества, сорбированные на апоферменте (Yamazaki I et al. 1957,1961).

Окисление субстратов конкурентов возможно лишь при поступлении перекиси извне. Поэтому скорость данного процесса зависит от наличия перекись генерирующих систем (в эритроците или его окружении) и от активности каталазы.

Выводы

1. Мы исследовали взаимодействие нитрита с каталазой - одним из важнейших антиокислительных ферментов и обнаружили, что нитрит является ингибитором каталазы в присутствии ионов хлорида, бромида и тиоцианата. Степень ингибирования зависит от pH среды, от концентрации галоид анионов в реакционной среде, а так же пропорциональна концентрации нитрита.

2. На основании обнаруженного эффекта ингибирования нитритом каталазы и, используя разработанный ранее калориметрический метод определения скорости разложения перекиси водорода каталазой, мы разработали метод, позволяющий определять концентрацию нитрита в биологических средах при нейтральных и близким к нейтральным pH. Метод

позволяет определять концентрацию нитрита с точностью до 0,5 мкМ.

3. Исследуя процесс нитрит индуцированного окисления гемоглобина мы установили, что пероксидазные субстраты (аскорбат, р-эстрадиол, р-нафтол, бензидин, серотонин) способны замедлять и даже полностью блокировать нитрит индуцированное окисление гемоглобина на всем протяжении кинетической кривой. Вещества, не способные окисляться в пероксидазной реакции (этанол, тестостерон, манитол, ЭДТА) не оказывали влияния на процесс.

5. Некоторые пероксидазные субстраты блокировали процесс нитрит индуцированного окисления гемоглобина даже в том случае, если их концентрация была на порядок меньше концентраций нитрита и гемоглобина. Это можно объяснить лишь тем, что непосредственного окислительно-восстановительного взаимодействия нитрита и гемоглобина, на чем настаивали другие авторы, не происходит.

6. Наличие в реакционной среде метгемоглобина или лактопероксидазы, к которой нитрит имеет высокое сродство, значительно ускоряет процесс нитрит индуцированного окисления гемоглобина. В то же время пероксидаза хрена, сродство нитрита к которой незначительно, практически не оказывает влияния на данный процесс. Мы делаем вывод, что пероксидазное окисление нитрита является ключевым звеном в процессе нитрит индуцированного окисления гемоглобина на всем его протяжении.

7. На основании изложенного выше, мы предлагаем схему нитрит индуцированного окисления гемоглобина, в которой ключевым звеном является окисление нитрита до диоксида азота метгемоглобинперекисными комплексами. Продуктом окисления гемоглобина диоксидом азота являются также метгемоглобинперекисные комплексы без выхода перекиси в реакционную среду. Наличие фазы инициации объясняется наличием пероксидазных субстратов - конкурентов нитрита. Аутокаталитическая стадия возможна лишь после их окисления.

Практические рекомендации

1) Разработанный в результате настоящего исследования метод определения концентрации нитрита можно рекомендовать к использованию в клинических исследованиях, в работе санэпидемстанций, в пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Чувствительность метода 0,5 мкМ.

Он позволяет быстро, используя минимум реактивов, вести измерения в мутных и сильноокрашенных средах, а также в объектах, богатых аскорбатом и другими восстановителями..

2) Исходя из предложенной нами схемы нитрит индуцированного окисления гемоглобина, следует вывод, что способностью предотвращать и блокировать развитие нитрит индуцированной метгемоглобинемии должны обладать вещества, которые окисляются в пероксидазной реакции и способны конкурировать с нитритом. Среди этой группы веществ и должен вестись поиск средств для лечения и профилактики нитрит индуцированной токсичности.

Публикации по материалам диссертации.

1. Титов В.Ю, Марголина А.А., Петренко Ю.М. «Ингибирование нитритами каталазы - важнейший элемент их токсического действия. Возможность использования каталазы, как детектора на нитрит ион» «Химия в сельском хозяйстве»1997 № 1:8-12

2. Титов В. Ю, Фисинин В. И., Столляр Т. А., Марголина А. А., Петренко Ю. М. «Механизм развития нитрит-индуцированной метгемоглобинемии у животных и человека. Пути предотвращения и профилактики» "Сельскохозяйственная биология" 1997 №4: 34-46

3. Титов В.Ю, Марголина А.А., Столляр Т.А., Петренко Ю.М. «Ингибирование каталазы нитритом и гидроксиламином в присутствии галоид ионов. Механизм и физиологическая значимость» "Сельскохозяйственная биология" 1998 № 4:24-32

4. Титов В.Ю, Петренко Ю.М., Марголина А.А. «Взаимодействие нитритов с антиокислительными ферментами - важнейший элемент их токсичности. Физиологические механизмы защиты» Сельскохозяйственная биология 1999; (6): 10-22

5. Titov V. Yu., Fisinin V. I., Stollyar T. A. , Margolina A. A., Petrenko Yu. M., "Mechanism of nitrite-indused methemoglobinemia development. Ways of its prevention and prophylactic measures" Problem of ecological security in agriculture; 1996;2:40-52

6. Titov V. Yu., Margolina A. A., Petrenko Yu. "Catalase inhibition by nitrite - as the highly important element of its toxic efect. Catalase as nitrite

detector". Problem of ecological security in agriculture; 1996;2: 32-39

7. Titov V.Yu., Margolina A.A., Petrenko Yu.M, Stollyar T. A.. "Catalase inhibition by nitrite and hydroxilamine in presence of halide-ions. Mehanism and phisiological significance"; Problem of ecological security in agriculture; 1998; 3: 16-25

8. Титов В.Ю, Марголина A.A., Столляр T.A., Петренко Ю.М. "Ингибирование каталазы нитритом в присутствии галоид-ионов. Механизм и практическая значимость"; Материалы международной научно-практической конференции "Проблемы экологически безопасных технологий производства, переработки и хранения сельскохозяйственной продукции"; г. Сергиев Посад; 1998; Выпуск 3; 20-30

9. V.Yu Titov, Т.А. Stolliar, А.А. Margolina, Yu. M. Petrenko "Catalase inhibition by nitrite is the highly impotrant element of it's toxic action. Using of catalase as a nitrite detector for poultry products* WPSA-lsrael BRANCH? 10th European Poultry Conference, lerusalem, Israel, 21-26 June, 1998.

Заказ № 51 Тираж 100

Отпечатано Отделением выпуска официальных изданий ФИПС 121873, г. Москва, Бережковская наб., д. 24, стр. 2 тел. 240-30-11