Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие нитрита с антиокислительными ферментами и гемоглобином как важнейший элемент его токсичности

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие нитрита с антиокислительными ферментами и гемоглобином как важнейший элемент его токсичности"

На правах рукописи

РГб од

Марголина Анна Александровна

" 3 АПР 2003

Взаимодействие нитрита с антиокислительными ферментами и гемоглобином как важнейший элемент его токсичности

03.00.02-Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре биофизики Российского Государственного медицинского университета

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент Петренко Юрий Михайлович

кандидат биологических наук Титов Владимир Юрьевич.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ванин Анатолий Федорович

доктор биологических наук, профессор Азизова Офелия Охатовиа

Ведущая организация:

Факультет фундаментальной медицины МГУ

Защита состоится "----"............... 2000 года в____часов на заседании

диссертационного совета в Российском государственном медицинском университете по адресу: 117437 г Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан "____"..............2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К-084-14-04

к.б.н., доцент Буромский И.В.

■ <2 г и С I/ I! , • с | ; у '/[ч ,

* ."/х< ' ! 1 ? I !'•-,/ |

0

н ■ >

о о

. г )

С ¡0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Нитрит ионы относятся к числу наиболее токсичных и долгоживущих соединений азота. Наряду с нитратами нитриты поступают в организм человека экзогенно с водой и пищей, а также образуются эндогенно из окиси азота или за счет восстановлении нитратов микрофлорой (Green L. et al. 1982, Hartman Ph. 1982, Bruning-Fartn С. et al. 1993 ). Нитриты вызывают поражение ЖКТ, обладают канцерогенным действием. При попадании данных соединений в кровь возникает метгемоглобинемия различной степени тяжести (Keatling J. Р. et al, 1973). В некоторых случаях (чаще всего у детей) это заболевание приводит к летальному исходу.

В настоящее время безопасные и эффективные средства лечения нитрит индуцированной метгемоглобинемии отсутствуют (Бурбелло Ф.Т. с соавт., 1991, Coleman MD., 1996). Это во многом объясняется тем, что механизм взаимодействия нитрита и гемоглобина остается неясным.

Многие исследователи отмечают, что трудности в изучении процессов с участием нитрита объясняются отсутствием надежных методов измерения концентрации нитрита в биологических объектах. Кислая среда, необходимая для колориметрического определения концентрации нитрита (например по методу Грисса), создает условия для взаимодействия нитрита и аскорбата, что приводит к потерям нитрита и искажению результата анализа (Riise Е., Berg-Nielsen К., 1990). Кроме того, большинство методов неприменимы для анализа содержания нитрита в биологических объектах, где измерению мешают мутность раствора, наличие восстановителей, некоторых органических и неорганических веществ. Таким образом, разработка метода, позволяющего проводить измерение концентрации нитрита при нейтральных pH в мутных образцах при наличии аскорбата и других восстановителей, является актуальной и практически важной.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было выяснение механизма развития нитрит индуцированной метгемоглобинемии, роли антиокислителей и других

физиологически активных соединений в данном процессе, определение путей его предотвращения.

В работе были поставлены и решались следующие задачи:

1. Разработка нового метода количественного определения нитритов в биообъектах.

2. Исследование воздействия нитрита на активность антиокислительных ферментов (каталазы, гемовых пероксидаз) с целью выяснения

• возможной физиологической роли данного воздействия.

3. Определение роли перекиси водорода и других активных форм кислорода на различных стадиях процесса путем использования антиокислительных ферментов, неферментных антиоксидантов, а также соединений, способных окисляться в пероксидазной реакции.

4. На основании данных, полученных на модельных системах, получить представление о механизме нитрит индуцированного окисления гемоглобина в условиях in vivo.

Новизна исследования С помощью калориметрического метода регистрации кинетики ферментативных реакций (Титов В.Ю. и др. 1988, Петренко Ю.М. и др. 1989) впервые показано, что нитрит в концентрациях 10"5 - 10"6 М, т.е. реально встречающихся в органах и тканях, способен обратимо ингибировать каталазу в присутствии нормальных для плазмы крови концентраций хлорида и тиоцианата, а также в присутствии бромида. Используя каталазу как детектор на нитрит ион, мы разработали новый метод количественного определения нитритов в биообъектах (Титов В.Ю. и др, 1997,1998).

Мы исследовали кинетические закономерности окисления гемоглобина в присутствии нитрита и ряда биологически активных веществ и установили, что способностью блокировать нитрит индуцированное окисление гемоглобина обладают соединения, способные окисляться в пероксидазной реакции, катализируемой метгемоглобином. На основании результатов, полученных на модельной системе, содержащей гемолизат эритроцитов или целые эритроциты, мы предложили схему взаимодействия нитрита с гемоглобином в условиях организма, что позволило нам дать рекомендации по поиску средств лечения и предотвращения нитрит индуцированной метгемоглобинемии.

Научно-практическая значимость работы

Разработанный нами метод определения нитрита при помощи каталазы как биодетектора может быть использованным не только в научных исследованиях, но и в клинике. Метод не уступает в чувствительности общепринятым методикам (Sen N. et al. 1978; Norwitz G. et al. 1986, 1987; Kaveeshwar R. et al. 1991; Емченко C.B. и др. 1993) и является в настоящее время единственным методом, за исключением предложенного Hamano T. et al. (1998), позволяющим количественно определять нитриты в нейтральной среде и тем самым избегать неконтролируемых потерь исследуемого вещества при наличии аскорбата и других восстановителей. В отличии от последнего он не требует предварительных процедур по снижению изначальной мутности или окрашенности объекта, так как не основан на фотометрической регистрации. Таким образом, все неконтролируемые потери исследуемого вещества сведены к минимуму.

Предложенный в данной работе механизм развития индуцированной метгемоглобинемии позволяет определить характеристики, которыми должны обладать средства профилактики и купирования данного патологического процесса, подвести теоретическую базу под поиск таких средств, что сделает его более эффективным.

Апробация работы

Результаты работы были доложены и обсуждены на совместном заседании кафедры биофизики МВФ РГМУ и отдела биофизики НИИ Физико-химической медицины МЗМП РФ от 24 декабря 1999 г.

Публикации

Основное содержание диссертации изложено в 9 печатных работах.

Объем работы

Диссертация состаоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Объем диссертационной работы 120 страниц печатного текста. Список литературы состоит из 105 источников цитируемой литературы.

з

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В главе 1. приведены сведения о путях поступления нитратов и нитритов в организм, об их эндогенном образовании и метаболизме в органах и тканях (Wolff I. et al. 1972, Culliton В. е. а. 1978, Green L. et al. 1982, Hartman Ph. 1982, Bruning-Fann C. et al. 1993, Ellis G. et al. 1998), а также обсуждаются предлагаемые механизмы их токсического действия. Показано, в частности, что ни одна из современных схем развития нитрит индуцированной метгемоглобинемии (Roy А. et al. 1969; Tomoda А. et al. 1981; Kosaka H. et al. 1979,1982,1987; Spagnuolo C. et al. 1987; Doyle M. et al. 1985; Arduini A. et al. 1992) не моделирует процесс, наблюдаемый in vivo в экспериментах на лабораторных животных, а так же у людей при отравлении. В результате нет единого взгляда на патогенез нитрит индуцированной метгемоглобинемии и не определены характеристики, которыми должны обладать средства для ее предотвращения. В связи с этим поиски таких средств до сих пор не имели большого успеха (Бурбелло Ф.Т. и др. 1991, Unnikrishnan М. et al. 1992, Arduini А. et al. 1992).

На наш взгляд, одним из главных препятствий к выяснению механизма нитрит индуцированной метгемоглобинемии является отсутствие методик быстрого и адекватного определения концентрации нитритов в биологических объектах. Последнее признается многими исследователями (Norwitz G. et al. 1986,1987; Riise E. et al. 1990; Kaveeshwar R. et al. 1991; Tsikas D. et al. 1997; Hamano T. et al. 1998). В разделе подробно описаны современные методики количественного определения нитритов и нитратов с обсуждением их достоинств и недостатков. Сделан вывод, что без совершенствования данных методик невозможен дальнейший прогресс в исследовании механизмов токсического воздействия данных соединений.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В работе использовались следующие методы:

1) Динамическая калориметрия (для определения активности каталазы и пероксидазы).

2) Динамическая фотометрия (для контроля кинетики окисления гемоглобина в гемолизатах, а так же кинетики образования метгемоглобинперекисных комплексов).

3) Дифференциальная спектрофотометрия с использованием сферы Ульбрихта (для контроля окисления гемоглобина в эритроцитах).

4) Стандартный метод определения концентрации нитрита с пользованием п-1 -нафтил-этилендиаминдигидрохлорида.

5) Перманганатометрический метод (для определения концентрации перекиси водорода).

Главы 3,4. Результаты исследования и обсуждение. 1. Ингибирование катал азы в присутствии нитрита - важнейший элемент его токсичности.

Мы исследовали взаимодействие нитрита с каталазой (использовался изолированный фермент из печени быка, а также гемолизат эритроцитов кролика, курицы, коровы, человека). Скорость разложения перекиси водорода каталазой регистрировалась калориметрическим методом. Метод основан на регистрации количества теплоты, выделяющейся при разложении введенной перекиси водорода каталазой. При этом количество выделяющейся теплоты пропорционально количеству разрушенной перекиси (Титов В.Ю. и др. 1988, Петренко Ю.М. и др. 1989)) Из рисунков 1-3 видно, что в присутствии хлорида, бромида и псевдогалоида тиоцианата нитрит в концентрациях 10"5 - 10"6 М, т.е. реальных в условиях ¡n vivo (Torre D. et al. 1996), способен эффективно снижать способность каталазы разлагать перекись водорода. Замена галоид анионов и тиоцианата на сульфат, фосфат, ацетат и цитрат анионы снимала ингибирующий эффект (рис.2). Мы сделали вывод, что происходит именно ингибирование фермента, а не изменение пути разложения перекиси водорода, так как количество теплоты, выделяющейся при полном разложении вводимого количества перекиси, было одинаково как в контрольных образцах, так и в образцах, содержащих нитрит и хлорид. Это свидетельствует о том, что во всех случаях разложение Н2О2 идет по каталазному пути, поскольку тепловые эффекты пероксидазного и свободно-радикального пути в несколько раз выше (Титов В.Ю. и др. 1988, Петренко Ю.М. и др. 1989).

Время, с.

Рис 1 Кинетические кривые разложения перекиси водорода каталазой в присутствии нитрита и хлорид-иона

Образцы (1-5) изначально содержали 40 мМ ЫаН2Р04, 8 нМ каталазы А так же: (1) - 5 мкМ КЖ)2 и160 мМ №С1, (2) - 5 мкМ КЫОг, затем 160 мМ №01 добавляли за 10 сек до третьего ввода Н2О2, (3-4) - 160 мМ №С1, в образец 3 за 10 сек до второго ввода Н2О2 добавили 5 мкМ КЖ>2- (5) - не содержал КЖ>2 и ЫаС1. Стрелками Р обозначены моменты ввода 9 мМ Н2О2. Везде рН 6.5

Концентрация ЫаС1, шМ

Рис 2. Степень ингибирования каталазы (I) нитритом в зависимости от содержания галоид ионов в реакционной среде.

I = Аь -Ап.100%, где Ао и А, - каталазная активность соответственно Ак

исследуемого и контрольного образца, не содержащего КЫОг, определенная по тангенсу угла наклона начального прямолинейного участка кинетической кривой (Титов В.Ю. и др 1988).

Все образцы (1-8) изначально содержали 40 мМ КаНгРО^ 8нМ каталазы, 250.0 (1, 3, 5-8) или 12.5 (2,4) мкМ КЫОг, а так же №С1 в концентрации, указанной на оси абсцисс. Образцы 3 и 4, вместо №С1 содержали аналогичные концентрации КаВг, а образцы 5, 6, 7, 8 - соответственно КН2РО4, №2804, СНзСООК, С6О7Н5К3. Везде рН 7.4

б

Снижение скорости разложения перекиси водорода каталазой наблюдалось лишь в присутствии нитрита и хлорида и не наблюдалось в отсутствии хотя бы одного из них (рис.1). Степень ингибирования не изменялась при последующих вводах Н2О2. Ввод недостающего компонента (нитрита либо хлорида) перед вторым либо третьим вводом перекиси вызывал ингибирование фермента идентично случаю, когда оба компонента исходно присутствовали перед первым вводом. Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирующая субстанция не накапливается и не расходуется в процессе реакции.

Из данных, представленных на рис.4, следует, что ингибирование обратимо, поскольку при разведении реакционной среды, содержащей каталазу, нитрит и хлорид, в 10 раз наблюдается та же степень ингибирования, как и в образцах, изначально содержащих данные компоненты в той же концентрации, что и получаемой при разведении.

Из представленных на рис. 2 и 3 зависимостей степени ингибирования фермента от концентрации хлорида, бромида и тиоцианата видно, что кривые выходят на плато при одних и тех же концентрациях СГ, Вг' и БСЫ" вне зависимости от концентрации нитрита. Кроме того, в случае тиоцианата плато достигается при концентрациях КБСЫ меньших, чем используемая концентрация нитрита (рис.3). Дополнительный ввод как тиоцианата, так и хлорида не способствовал увеличению степени ингибирования. Эти данные говорят о том, что, по-видимому, нитрит и галоид анионы обратимо связываются с различными структурами апофермента. В то же время исследованные нами гемовые пероксидазы: лактопероксидаза, пероксидаза хрена и метгемоглобин проявили значительно большую устойчивость к ингибированию нитритом (Титов В.Ю. и др. 1999). Так нитрит в концентрации до 0.1 тМ не оказывал существенного влияния на кинетику образования метгемоглобинперекисных комплексов как в присутствии СГ, Вг" и вСЫ", так и в их отсутствии. На кинетику восстановления комплексов нитритом данные анионы также не влияли (рис.5). Это зафиксировано как при рН 7.4, так и при рН 6.0. Данные рис.6 свидетельствуют о том, что в системе, содержащей метгемоглобин, каталазу и нитрит, присутствие плазменных концентраций хлорида и тиоцианата, а также бромида вызывает усиление интенсивности образования метгемоглобинперекисных комплексов.

3

1— -1

70 / ^---- I- -1

/ / ____ 1- -1

35 Г

0

0 10 20 30 I 50

Концентрация КвСМ мкМ

Рис 3. Степень ингибирования каталазы нитритом в зависимости от концентрации тиоцианата в реакционной среде. I - степень ингибирования фермента, определяемая аналогично рис 2. Все образцы (1-3) изначально содержали 40 мМ ИаНгРО*, 8нМ каталазы, 12.5 (1), 37.5 (2), 250.0 (3) мкМ КЫ02, а так же КЗСЫ в концентрации, указанной на оси абсцисс. Везде рН 7.4.

ДДОг], мМ

Время, с.

Рис 4. Обратимость ингибирования каталазы нитритом в присутствии хлорид ионов. Образцы изначально содержали: 40 мМ КаН2Р04, 8 нМ каталазы (1-3,6), 80 нм каталазы (4,5). А так же: (1)— 160 мМ №С1 и 7.5 мкМ КШ2, (2) —16 мМ ЫаС1 и 7.5 мкМ КЫ02, (3) —160 мМ N301 и 75 мкМ КЫОг, (4) -160 мМ №С1 и 75 мкМ КМ02. После 30 мин инкубации при 25 С, образец (4) был разведен в 10 раз 40мМКаНгР04. (5) - аналогичен (4), но, после разведения, концентрация №С1 доведена до 160 мМ. (6) - образец не содержал ЫаС1 и КЫОз. Стрелкой Р обозначен ввод в образцы 9 мМ Н2О2. Везде рН 6.5

В отсутствии нитрита данные анионы не проявляют такого действия. Увеличение образования метгемоглобинперекисных комплексов в присутствии нитрита должно вести к усилению его окисления данными комплексами (Arduini A. et al. 1992, Титов В.Ю. и др. 1997), что чревато усилением продукции токсичного NO2'.

2. Возможность использования каталазы для количественного определения нитритов в биообъектах.

На рис.7 приведены зависимости степени ингибирования каталазы от концентрации нитрита в среде, содержащей 150 mM NaCI. По мере закисления среды степень ингибирования каталазы возрастает. Приведенные на рис.7 зависимости имели одинаковый характер как для изолированного фермента из печени быка, так и в случае исследованных нами биообъектов: гемолизатов эритроцитов кролика, курицы, коровы, человека. Учитывая все эти обстоятельства, можно предположить возможность использования каталазы как детектора содержания нитрита в биообъектах, используя данные рис.7 в качестве калибровочной кривой (рис.7). Наличие в реакционной среде аскорбата (до 0.5 мМ) не оказывало на ингибирование каталазы нитритом никакого влияния. Не влияли и хелаторы металлов переменной валентности ЭДТА и о-фенантролин (рис.8). Присутствие в реакционной среде метгемоглобина значительно сказывалось только при рН 6.0. При рН 6.5 метгемоглобин в концентрации до 50 цМ достоверно не влиял на степень ингибирования каталазы при первом и повторном вводе перекиси (рис.9).

3.Нитрит индуцированное окисление гемоглобина в эритроцитах и их гемолизатах. Механизм, пути защиты и профилактики.

Взаимодействие нитрита с гемоглобином было исследовано в гемолизате эритроцитов, а также в суспензии эритроцитов. На рис.10 представлены кинетические кривые нитрит индуцированного окисления гемоглобина в гемолизатах эритроцитов при различных концентрациях нитрита. Ввод 1мМ нитрита в реакционную среду, содержащую гемолизат эритроцитов (100 мкМ гемоглобина), приводил к увеличению оптической плотности при X = 630 нм (рис.11).

Рис 5. Образование метгемоглобин - перекисных комплексов и восстановление их нитритом Образцы (1-13) изначально содержали: 40 мМ NaH2P04, 20 мкМ метгемоглобина, Образцы (2,6,11) содержали 150 мМ NaCl, (3,7,12) - 150 мМ КВг, (4,8,13) - 50 мкМ KSCN. Стрелкой N обозначен момент ввода в образцы KNO2 (мМ): 1.0 - (1-4), 0.1 - (5-8), 0.03 -(9) и 0- (10-13). Стрелкой Р обозначен ввод 1.0 мМ Н2О2, Стрелкой К - ввод 0.2 мкМ каталазы. Везде рН 7.4.

ADmo

О 200 400

Время, с

Рис 6 Образование метгемоглобин-перекисных комплексов в присутствии каталазы и нитрита. Образцы изначально содержали: (1-4) - 40 мМ NaH2P04, 20 мкМ метгемоглобина, 50 мкМ KN02, 12 нМ каталазы, а так же: (2) - 150 мМ NaCl, (3) - 150 мМ КВг, (4) - 0.1 мМ KSCN. Образцы (5-8) аналогичны (1-4), но нитрит отсутствовал. (9) аналогичен (5), но содержал 6 нМ каталазы. В моменты обозначенные стрелками, в образцы вводили 0.5 мМ Н2О2. Везде рН 7.4.

.4.0 '3 (nitrite)

Рис 7 Концентрационная зависимость величины ингибирующего эффекта нитрита на каталазу при различных значениях рН.

Образцы (1-4) изначально содержали: 40 мМ NaH2P04, 150 мМ NaCl, 8 нМ каталазы и соответствующие концентрации KNO2. «А» - активность фермента в присутствии нитрита, определенная по тангенсу угла наклона начального прямолинейного участка кинетики теплопродукции, наблюдающейся после ввода 9.0 мМ Н2О2. «Ао» - активность фермента в отсутствии нитрита. рН: (1) -6.0, (2)-6.5, (3)-7.4, (4)-8.5

Рис 8. Калориметрическая регистрация инактивации нитритом каталазной активности гемолизата эритроцитов. Реакционная среда изначально содержала: 20 мМ трис буфера, 0.158 M NaCl, гемолизат эритроцитов (концентрация гемоглобина 7.0 мкМ), а так же NaNC>2 в концентрации (мкМ): (1) - 0, (2) - 2.5, (3) - 5.0, (4) - 20.0; (5,7,9) и (6,8,10) аналогичны 1 и 3 соответственно, но среда дополнительно содержала: в случаях (5) и (6) - 1 мМ KN03, (7) и (8) - 0.5 мМ аскорбата, (9) и (10) - 1мМ ЭДТА+1мМ о-фенантролина. Стрелкой Р обозначен момент ввода 9.0 мМ Н2Ог в калориметрическую ячейку. Везде рН 6.5.

Оценка спектра светопоглощения продукта, образующегося при выходе кинетических кривых рис.11 на плато, по методике Salvati А. е.а. (1969), а также его сравнение со спектром раствора фирменного препарата метгемоглобина свидетельствовали о полном окислении содержащегося в реакционной среде гемоглобина до метгемоглобина. Так как последний имеет характеристический максимум при бЗОнм, а не окисленный гемоглобин при данной длине волны практически не поглощает, то кинетика увеличения оптической плотности при 630 нм идентична кинетике накопления метгемоглобина.

Из представленных на рис.11 кинетических кривых нитрит индуцированного окисления гемоглобина в гемолизатах эритроцитов видно, что накопление метгемоглобина идет по S-образной кинетике, регистрируемой практически во всех модельных системах, где исследовалось окисление чистого гемоглобина и гемолизатов эритроцитов под действием нитрита (Roy А. et al. 1969; Kosaka Н. et al. 1979,1982,1987; Doyle М. et al. 1985; Arduini А. et al. 1992). Многие исследователи выделяют в ней фазу инициации и аутокаталитическую фазу. Увеличение концентрации нитрита укорачивает фазу инициации и убыстряет аутокаталитическую (рис.11). Как следует из данных, представленных на рис. 11, фаза инициации сокращается до минимума, если в реакционной среде присутствует перекись водорода. Ввод дополнительного количества каталазы, наоборот вызывал удлинение фазы инициации. Изначальное присутствие метгемоглобина способствовало ее укорочению. На аутокаталитическую фазу все эти факторы не влияли (рис. 11). Таким образом, между данными фазами есть качественная разница. Присутствие аскорбата, а также соединений, способных окисляться в пероксидазной реакции, катализируемой метгемоглобином: бензидина, ß-нафтола, серотонина, ß-эстрадиола препятствовало окислению гемоглобина, оказывая влияние на обе фазы (рис.12). Причем эффективность данных соединений как протекторов гемоглобина пропорциональна их эффективности как пероксидазных субстратов (Петренко Ю.М. и др. 1995, 1999). Наиболее эффективные пероксидазные субстраты, например бензидин, способны блокировать процесс на любой стадии, присутствуя в концентрациях многократно меньших, чем концентрации гемоглобина и нитрита (рис. 12).

Рис9. Влияние метгемоглобина на степень ннгибирования каталазы нитритом.

/ = And.юо°/ - степень снижения каталазной активности относительно Л

контрольных образцов, имеющих аналогичный состав, но в которых отсутствует ингибитор, где Ао и А - каталазная активность контрольного и опытного образца соответственно. Реакционная среда изначально содержала: 20 мМ трис буфера, 0.158 M NaCl, 0.006 мкМ каталазы, метгемоглобин в концентрации указанной на оси абсцисс, а так же NaNCh (мкМ): (1) -30.0; (2) - 4.0; (3) - 2.0. рН среды: (1) - 7.4; (2) - 6.5; (3) - 6.0.

N

Время, мин.

РисЮ Кинетика окисления гемоглобина гемолизата эритроцитов под действием различных концентраций нитрита. Состав реакционной среды: 40 мМ КН2РО4, гемолизат эритроцитов (ЮОмкМ гемоглобина), рН 7.4. В моменты обозначенные стрелкой "К" , в образцы вводили N3 Ж)2 (тМ): (1) - 1.0; (2) - 0.5; (3) - 0.25; (4) - 0.1; (5)-0.0

Время, мин

Рис11. Кинетика окисления гемоглобина в гемолизате эритроцитов под действием высокой концентрации нитрита. Влияние каталазы, перекиси водорода и метгемоглобина. Реакционная среда изначально содержала: 20 мМ трис буфера, 0.158 М №С1, гемолизат эритроцитов (100 мкМ гемоглобина), рН 7.4. Образец (2) дополнительно содержал 1 мкМ каталазы, образец (3) - 20 мкМ метгемоглобина. Время введения 1мМ №N02 во все образцы обозначено стрелкой N. а время введения 70 мкМ Н2О2 в образец 4 стрелкой Р.

Время, мин

Рис12. Кинетика нитрит-индуцированного окисления гемоглобина в присутствии ряда физиологически активных веществ. Все образцы (1-14) изначально содержали: 20 мМ трис-буфер, 0.158 M NaCl, гемолизат эритроцитов (100 мкМ гемоглобина). Кроме этого образцы дополнительно содержали: (1) - 100 мкМ тестостерона, (2) -50 мМ маннитола, (3) - 10 мМ ЭДТА, (4) - 1 мМ KNO3, (5) - 1М этанола, (6) - аликвота физраствора, (7, 8, 9) - 4, 0.2, 0.1 мкМ бензидина, соответственно, (10) - 5 мкМ серотонина, (11)

- 1 мкМ Р-нафтола, (12) - 20 мкМ р-эстрадиола, (13) - 10 мкМ аскорбата, (14)

- 4 мкМ бензидина (момент ввода бензидина обозначен стрелкой Б), стрелкой N обозначен ввод в образцы 1 мМ NaNCh. Везде рН 7.4.

Время, мин

Рис13 Кинетика нитритиндуцированного окисления гемоглобина в присутствии р-нафтола. Все образцы (1-6) изначально содержали: 20 мМ трис-буфер, 0.158 M NaCl, гемолизат эритроцитов (100 мкМ гемоглобина). Кроме этого образцы дополнительно содержали р-нафтол (мкМ): (1, 2) — 2, (3) — 10, (4) — 25, (5) — 50, (6) — 0. Стрелкой N обозначен ввод в образцы, 1 мМ NaNC>2 стрелками Ф— ввод 100 мкМ Н2О2 в образцы 2-5. Везде рН 7.4.

лО630 р Уг Р

0,30 V / Р /у

0,15 N Р1 Р у 3

0 ИМ ------- 5, 6, 7

0 35 70 Время, мин

А

Рис14 Кинетика окисления гемоглобина в гемолизате эритроцитов под действием ннзкнх концентрации нитрита. Влияние метгемоглобина и перекиси водорода. Все образцы изначально содержали: 20 мМ трис-буфер, 0.158 М NaCl, гемолизат эритроцитов) - образцы (1-9) - 100 мкМ гемоглобина, образец 10- 200 мкМ гемоглобина). Кроме этого образцы дополнительно содержали: А. (2 и 4) - 10 мкМ метгемоглобина. Стрелкой N обозначен ввод 200 мкМ NaN02 в образцы (1-5), Р — ввод 70 мкМ Н2О2 в образцы (1,2,6), (Р')— ввод 70 мкМ Н2О2 в образец 3. В образец (7) NaNCh и Нг02 не вводили.

Б. Стрелкой N обозначен ввод 50 мкМ NaNC>2 во образцы (8,10) и ввод 1 мМ NaN02 в образец (9), Г — ввод 100 мкМ гемоглобина (гемолизат эритроцитов) в образцы (8,9). В образцы 8,10 после введения NaNC>2 с интервалом 150 сек добавляли 60 порций Н2О2 по 100 мкМ. В образец 9 Н2О2 не вводили. Везде рН 7.4.

Вещества, неспособные окисляться в пероксидазной реакции, катализируемой метгемоглобином, даже при наличии антиокислительных свойств на процесс не влияли (рис.12).

Добавление экзогенной перекиси водорода к гемолизату эритроцитов, содержащему большие концентрации высокоэффективного пероксидазного субстрата, вызывало инициацию окисления гемоглобина. Но в зависимости от концентрации субстрата кинетика принимала либо самоускоряющийся, либо прямолинейный, либо затухающий характер, так что для поддержания процесса требовался ввод новых порций Н2О2 (рис.13). Эта закономерность получена в экспериментах с р-нафтолом, бензидином, аскорбатом. Аналогичная ситуация наблюдалась при использовании в пять и более раз • меньших концентраций нитрита (рис. 14).

Без ввода экзогенной перекиси в течение 60 минут окисления гемоглобина практически не наблюдалось и нитрит не расходовался. Ввод экзогенной перекиси индуцировал окисление гемоглобина, но Э-образной кинетики при этом не наблюдалось. Напротив, кинетика принимала затухающий характер. При вводе последующих порций перекиси окисление возобновлялось. Крутизна кинетической кривой возрастала по сравнению с предыдущим вводом, однако характер кинетики не менялся. Изначальное присутствие метгемоглобина ускоряло окисление гемоглобина. Окисление гемоглобина в присутствии малых концентраций нитрита (меньших, чем гемоглобина) показывает, что количество окисленного гемоглобина может многократно превышать убыль нитрита в реакционной среде (рис.15). После исчезновения нитрита из реакционной среды окисление вновь введенного гемоглобина начиналось лишь после ввода новой порции нитрита (рис.146), что говорит о том, что окончательные продукты окисления нитрита не способны индуцировать окисление гемоглобина.

Хотя нитрит ингибирует каталазу (рис.7), но как показали наши предыдущие исследования (Титов В.Ю. и др., 1991 г.), оставшейся ее активности вполне хватает, чтобы полностью предотвратить чисто перекисную деструкцию гемоглобина при всех используемых здесь концентрациях нитрита и перекиси. Ввод перекиси в образцы, не содержащие нитрита, не приводил к образованию метгемоглобина (рис.15).

(1 д т

OJO 3

0.15 ej

О N | 1 — f i a-i i ¿ v T

О 10 20 t,mín — -

Рис 15. Кинетика нитрит-индуцированного окисления гемоглобина гемолизата эритроцитов. Влияние каталазы, хлорида, бромида и тиоцианата. Все образцы изначально содержали: 40 мМ NaFhPOí, гемолизат эритроцитов (100 мкМ гемоглобина, а так же: (1) и (9) - 150 мМ NaCl, (2) и (10) - 150 мМ КВг, (3) и (11) - 50 мкМ KSCN, (4) - 150 мМ NaCl+ 0,2 мкМ каталазы, (6) - 200 мМ NaH2P04, (7) - 120 мМ Na2S04. В момент обозначенный стрелкой "N" в образцы вводили 200 мкМ KN02, маленькими стрелками -100 мкМ Н202. В образцы (8-11) KN02 не вводили. рН везде 7,4.

¿D63o

Рис. 16 Влияние лактопероксидазы, метгемоглобина и пероксидазы хрена на нитрит индуцированное окисление гемоглобина. Состав реакционной среды: 40 мМ №Н2РС>4, гемолизат эритроцитов (ЮОмкМ гемоглобина), а так же (2) - 1,5 мкМ пероксидазы хрена, (3) - 10 мкМ метгемоглобина, (4) - 1,0 мкМ лактоперокосидазы. В момент, обозначенный стрелкой «К» в образцы вводили 0,2 мМ ЮЧОг, после чего через каждую минуту вводили порции Н202 по 0,1 мМ. Образцы (5-8) аналогичны (1-4), но КМ02. рН везде 7.4

Тем не менее в присутствии 0.2 мМ нитрита интенсивность окисления гемоглобина многократно снижалась при добавлении в среду каталазы в количестве равном уже содержащемуся в гемолизате. Присутствие в реакционной среде плазменных концентраций хлорида и тиоцианата, а также бромида, приводило к существенной интенсификации окисления гемоглобина (рис.15). В связи с тем, что хлорид, бромид и тиоцианат способствуют ингибированию каталазы в присутствии нитрита, в то время, как пероксидазная активность метгемоглобина по отношению к нитриту не меняется (рис.3,5), есть основание предположить, что в этом и заключается причина интенсификации. Известно, что в норме концентрация анионов внутри клетки многократно меньше, чем во внеклеточной среде. Так концентрация хлорида внутри клетки, по данным некоторых исследователей, около 5 mM (Mori Y. е.а. 1996). В таких условиях ингибирование каталазы в присутствии нитрита в концентрации до 0.2 мМ незначительно (рис.3).

Окисление значительно ускорялось при изначальном присутствии метгемоглобина, но особенно в присутствии лактопероксидазы, которая является высокоэффективным окислителем нитрита. Пероксидаза хрена, сродство которой к нитриту как к субстрату незначительно, оказывала очень слабое влияние на процесс (рис.16)

В суспензии эритроцитов процесс идет аналогичным образом, и количество окисленного гемоглобина может многократно превышать изначально введенное количество нитрита (рис.17). Эритроциты, в отличие от их гемолизатов, обладают значительно большей устойчивостью к нитрит индуцированному окислению гемоглобина. Так нитрит в концентрации 1 мМ, вызывающий полное окисление гемолизата, содержащего 0,1 мМ гемоглобина, за 8 минут (рис.10,11) не вызывал значительного образования метгемоглобина в суспензии эритроцитов, содержащей равное количество гемоглобина за 60 минут (рис.18). В отсутствие ввода перекиси водорода окисления гемоглобина не происходило и нитрит не расходовался. Также из данных, представленных на рис.18, следует, что эритроциты можно отмыть от нитрита. В эритроцитах, проинкубированных в течение 10 минут с 0,3 мМ нитрита, а затем отмытых от него физиологическим раствором, метгемоглобин не образовывался даже при систематическом вводе перекиси.

Рис. 17. Стехиометрия нитритиндуцированиого окисления гемоглобина

По оси абсцисс: начальное соотношение концентрации оксигемоглобина и нитрита По оси ординат: соотношение между количеством окисленного гемоглобина и израсходованного нитрита, зафиксированное после полного окисления гемоглобина. Состав реакционной среды и ход эксперимента аналогичен рис. 15.

Время, мин

Рис 18 Кинетика нитритиндуцированиого окисления гемоглобина в суспензии эритроцитов. Влияние перекиси водорода Все образцы изначально содержали: 20 мМ трис-буфер, 0.158 M NaCl, суспензию эритроцитов (100 мкМ гемоглобина). Стрелкой N обозначен ввод в реакционную среду NaN02(MKM):(l)— 1000,(2)—100,(3) — 10, (4) — 300,(5)— 5, (6)— 1000, (7)-0 . В образцы (1-3, 5, 7) после ввода NaN02 вводили (55 раз с интервалом 1 мин) 70 мкМ Н202 . Образец (4)— после введения NaNOî и 10 мин инкубации, эритроциты трижды отмывали физраствором, а затем ресуспензировали в прежней концентрации и вводили Н2О2 в указанном выше порядке. Везде рН 7.4.

Полученные данные позволяют предложить следующую схему нитрит индуцированного окисления гемоглобина:

Непосредственным окислителем гемоглобина является диоксид азота (N02). Он образуется в результате пероксидазного окисления нитрита. В качестве пероксидазы в данном случае выступает метгемоглобин, который образует комплексы с перекисью водорода.

Hb' + Н202 ->НЬООН + Н+ (1)

Комплекс НЬООН, являясь двухэквивалентным окислителем, способен окислить две молекулы нитрита до N02' (Doyle М. et al. 1985).

Н+ + НЬООН + N02" -> [НЬОНГ + NO2 + ОН" (2) [НЬОНГ + NO2- -» Hb+ +N02 + ОН-

Следует отметить, что комплексы НЬООН в норме всегда присутствуют в эритроците в результате спонтанного аутоокисления гемоглобина, а также поступления перекиси водорода в эритроцит из плазмы крови, где в норме последняя всегда присутствует в результате действия нейтрофилов, а также различных оксидаз (Weiss S. 1982, Morse Е. 1988). Перекись связывается с метгемоглобином (НЬ+), который в норме содержится в эритроците в количестве до 2% от общего количества гемоглобина (Carrell R. е.а. 1975).

Наличие в реакционной среде пероксидазных субстратов -конкурентов нитрита (H2S) препятствует окислению последнего и, соответственно, продукции N02 и окислению гемоглобина.

Н+ + НЬООН + H2S -> S + 2НгО + НЬ+ (3)

Продукты окисления субстратов - конкурентов не способны индуцировать окисление гемоглобина. Как было показано ранее (Титов В.Ю. и др. 1991), окисление гемоглобина при наличии в среде кислорода всегда сопряжено с продукцией перекиси водорода. Не является исключением и рассматриваемый здесь процесс. Известно, что нитрит индуцированное окисление гемоглобина-кислородозависимый процесс (Chiodi Н. et al. 1983, Степуро И.И. и др. 1997). Тот факт, что пероксидазные субстраты-конкуренты способны тормозить данный процесс на любой стадии (рис. 12) позволяет предположить, что пероксидазное окисление нитрита является ключевым звеном процесса на всем его протяжении. Для этого необходима перекись водорода, которая, должна постоянно образовываться на всем протяжении

кинетической кривой. Тем не менее каталаза и другие ферменты, разлагающие перекись водорода, оказывают влияние лишь на фазу инициации и не влияют на аутокаталитическую фазу (рис.11). Это показано и другими исследователями на чистом гемоглобине ( Roy А. et al. 1969, Kosaka Н. et al. 1982, Doyle М. et al. 1985). Данное противоречие можно объяснить лишь тем, что окисление гемоглобина с образованием перекиси преимущественно происходит без выхода последней в окружающую среду. Это может быть реализовано, в частности, при внутриглобулярной дисмутации двух супероксидных радикалов, образующихся при окислении соответствующей субъединицы (Титов В.Ю. и др. 1991).

Известно, что в молекуле гемоглобина окисление одной субъединицы стимулирует окисление другой (Huisman Т. 1966). Ранее нами (Титов В.Ю. и др., 1997 г.) предложен механизм, согласно которому NO2' окисляет определенную структуру апофермента, что стимулирует окисление сначала одной, а потом соседней субъединицы с образованием супероксидных радикалов, дисмутирующихся в пределах глобулы. Сам диоксид азота при этом восстанавливается до нитрита.

(+)

N02 + (НЬ02)4 + Н+ (Hb02)2(Hb+)(Hb00H) +N02" + 02 (4)

Возможны и другие механизмы окисления гемоглобина, например, через образование пероксинитрата (Doyle М. et al. 1985). Но в любом случае образующаяся перекись недоступна для каталазы, что возможно лишь в том случае, если перекись не выходит за пределы глобулы гемоглобина.

Образующиеся комплексы НЬООН способны окислять новые молекулы нитрита, порождая таким образом новые комплексы. Если больше половины НЬООН окисляет примесные субстраты, то каждый комплекс в среднем порождает менее одного нового, и кинетика процесса будет иметь затухающий характер, и для его поддержания будут необходимы периодические вводы перекиси в среду (рис.13). Таким образом, интенсивность окисления гемоглобина и характер кинетики процесса зависят прежде всего не от абсолютной концентрации нитрита, а от соотношения эффекгивностей нитрита и других присутствующих в реакционной среде соединений как пероксидазных субстратов.

Реакцией, в результате которой нитрит исчезает из реакционной среды, является взаимодействие двух N02 между собой (Doyle М. et al. 1985).

Н20

2N02 <=> N204 -> N02" + N03" +2Н+ (5)

Стехиометрия процесса, таким образом, зависит от соотношения интенсивностей процессов (4) и (5), если в среде отсутствуют другие соединения, способные вступать с N02 в реакции, в которых последний не восстанавливается до нитрита.

Аутокаталитическая стадия может развиться лишь в том случае, если все субстраты-конкуренты будут окислены. Именно это, по-видимому, и происходит на стадии инициации, протяженность которой зависит от наличия данных субстратов (рис.13), а также от наличия в среде свободной перекиси и пероксидаз (рис.11, 14). Пероксидазные субстраты всегда содержатся в эритроцитах, их гемолизатах и растворах гемоглобина, так как ими могут быть, в частности, отдельные аминокислоты, различные вещества, сорбированные на апоферменте (Yamazaki I et al. 1957,1961).

Окисление субстратов конкурентов возможно лишь при поступлении перекиси извне. Поэтому скорость данного процесса зависит от наличия перекись генерирующих систем (в эритроците или его окружении) и от активности каталазы.

Выводы

1. Мы исследовали взаимодействие нитрита с каталазой - одним из важнейших антиокислительных ферментов и обнаружили, что нитрит является ингибитором каталазы в присутствии ионов хлорида, бромида и тиоцианата. Степень ингибирования зависит от pH среды, от концентрации галоид анионов в реакционной среде, а так же пропорциональна концентрации нитрита.

2. На основании обнаруженного эффекта ингибирования нитритом каталазы и, используя разработанный ранее калориметрический метод определения скорости разложения перекиси водорода каталазой, мы разработали метод, позволяющий определять концентрацию нитрита в биологических средах при нейтральных и близким к нейтральным pH. Метод

позволяет определять концентрацию нитрита с точностью до 0,5 мкМ.

3. Исследуя процесс нитрит индуцированного окисления гемоглобина мы установили, что пероксидазные субстраты (аскорбат, р-эстрадиол, р-нафтол, бензидин, серотонин) способны замедлять и даже полностью блокировать нитрит индуцированное окисление гемоглобина на всем протяжении кинетической кривой. Вещества, не способные окисляться в пероксидазной реакции (этанол, тестостерон, манитол, ЭДТА) не оказывали влияния на процесс.

5. Некоторые пероксидазные субстраты блокировали процесс нитрит индуцированного окисления гемоглобина даже в том случае, если их концентрация была на порядок меньше концентраций нитрита и гемоглобина. Это можно объяснить лишь тем, что непосредственного окислительно-восстановительного взаимодействия нитрита и гемоглобина, на чем настаивали другие авторы, не происходит.

6. Наличие в реакционной среде метгемоглобина или лактопероксидазы, к которой нитрит имеет высокое сродство, значительно ускоряет процесс нитрит индуцированного окисления гемоглобина. В то же время пероксидаза хрена, сродство нитрита к которой незначительно, практически не оказывает влияния на данный процесс. Мы делаем вывод, что пероксидазное окисление нитрита является ключевым звеном в процессе нитрит индуцированного окисления гемоглобина на всем его протяжении.

7. На основании изложенного выше, мы предлагаем схему нитрит индуцированного окисления гемоглобина, в которой ключевым звеном является окисление нитрита до диоксида азота метгемоглобинперекисными комплексами. Продуктом окисления гемоглобина диоксидом азота являются также метгемоглобинперекисные комплексы без выхода перекиси в реакционную среду. Наличие фазы инициации объясняется наличием пероксидазных субстратов - конкурентов нитрита. Аутокаталитическая стадия возможна лишь после их окисления.

Практические рекомендации

1) Разработанный в результате настоящего исследования метод определения концентрации нитрита можно рекомендовать к использованию в клинических исследованиях, в работе санэпидемстанций, в пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Чувствительность метода 0,5 мкМ.

Он позволяет быстро, используя минимум реактивов, вести измерения в мутных и сильноокрашенных средах, а также в объектах, богатых аскорбатом и другими восстановителями..

2) Исходя из предложенной нами схемы нитрит индуцированного окисления гемоглобина, следует вывод, что способностью предотвращать и блокировать развитие нитрит индуцированной метгемоглобинемии должны обладать вещества, которые окисляются в пероксидазной реакции и способны конкурировать с нитритом. Среди этой группы веществ и должен вестись поиск средств для лечения и профилактики нитрит индуцированной токсичности.

Публикации по материалам диссертации.

1. Титов В.Ю, Марголина А.А., Петренко Ю.М. «Ингибирование нитритами каталазы - важнейший элемент их токсического действия. Возможность использования каталазы, как детектора на нитрит ион» «Химия в сельском хозяйстве»1997 № 1:8-12

2. Титов В. Ю, Фисинин В. И., Столляр Т. А., Марголина А. А., Петренко Ю. М. «Механизм развития нитрит-индуцированной метгемоглобинемии у животных и человека. Пути предотвращения и профилактики» "Сельскохозяйственная биология" 1997 №4: 34-46

3. Титов В.Ю, Марголина А.А., Столляр Т.А., Петренко Ю.М. «Ингибирование каталазы нитритом и гидроксиламином в присутствии галоид ионов. Механизм и физиологическая значимость» "Сельскохозяйственная биология" 1998 № 4: 24-32

4. Титов В.Ю, Петренко Ю.М., Марголина А.А. «Взаимодействие нитритов с антиокислительными ферментами - важнейший элемент их токсичности. Физиологические механизмы защиты» Сельскохозяйственная биология 1999; (6): 10-22

5. Titov V. Yu., Fisinin V. I., Stollyar Т. A. , Margolina A. A., Petrenko Yu. M., "Mechanism of nitrite-indused methemoglobinemia development. Ways of its prevention and prophylactic measures" Problem of ecological security in agriculture; 1996;2:40-52

6. Titov V. Yu., Margolina A. A., Petrenko Yu. "Catalase inhibition by nitrite - as the highly important element of its toxic efect. Catalase as nitrite

■

detector". Problem of ecological security in agriculture; 1996;2: 32-39

7. Titov V.Yu., Margolina A.A., Petrenko Yu.M, Stollyar T. A.. "Catalase inhibition by nitrite and hydroxllamine in presence of halide-ions. Mehanism and phisiological significance"; Problem of ecological security in agriculture; 1998; 3: 16-25

8. Титов В.Ю, Марголина A.A., Столляр T.A., Петренко Ю.М. "Ингибирование каталазы нитритом в присутствии галоид-ионов. Механизм и практическая значимость"; Материалы международной научно-практической конференции "Проблемы экологически безопасных технологий производства, переработки и хранения сельскохозяйственной продукции"; г. Сергиев Посад; 1998; Выпуск 3; 20-30

9. V.Yu Tltov, Т.А. Stolliar, А.А. Margolina, Yu. M. Petrenko "Catalase inhibition by nitrite is the highly impotrant element of It's toxic action. Using of catalase as a nitrite detector for poultry products" WPSA-lsrael BRANCH? 10th European Poultry Conference, lerusalem, Israel, 21-26 June, 1998.

Заказ № 51 Тираж 100

Отпечатано Отделением выпуска официальных изданий ФИПС 121873, г. Москва, Бережковская наб., д. 24, стр. 2 тел. 240-30-11

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марголина, Анна Александровна

Содержание

Введение.

Глава I. Обзор литературы

1.1. Основные источники солей азотной и азотистой кислоты в организме 10 человека.

1.1.1 Экзогенные нитраты как источник нитрита в организме.

1.1.2 Экзогенное поступление нитритов в организм человека.

1.1.3 Окись азота как основной эндогенный источник нитрита.

1.2. Токсические эффекты нитрита.

1.2.1 Общее представление о токсичности нитрита

I.2.2. Нитрит индуцированная метгемоглобинемия.

1.2.3.1. Исследование , закономерностей развития нитрит 20 индуцированной метгемоглобинемии в условиях ín vivo.

1.2.3.2. Исследование процесса нитрит индуцированного 22 меггемоглобинобразования на модельных системах.

1.2.3.3. Существующие схемы развития нитрит индуцированной 23 метгемоглобинемии.

1.3. Пероксидазное окисление нитрита.

1.3.1 Образование нитрит-радикала при пероксидазном окислении 35 нитрита.

1.3.2 Образование пероксинитрита, его физиологическое значение. 42 I.3.3 Роль антиокислительных ферментов в токсических эффектах 46 нитрита.

I.4. Методы определения нитратов и нитритов в биологических объектах.

Глава II. Материалы и методы

11.1 Приготовление растворов и сред.

11.2 Препаративные методы. 54 11.2.1 Методика выделения эритроцитов.

11.3 Аналитические методы.

11.3.1 Перманганатометрический метод определения концентрации 55 перекиси водорода.

11.3.2 Определение содержания нитрита с помощью реактива НЕДА.

11.3.3 Метод динамической калориметрии. 57 II.3.3 Спектрофотометрические исследования.

11.3.3.1. Спекгрофотометрическая регистрация окисления гемоглобина.

11.3.3.2. Динамическая фотометрия. 62 II.4. Статистическая обработка данных.

Глава III. Результаты

111.1. Ингибирование каталазы в присутствии нитрита - важнейший 64 механизм его токсичности.

111.2. Возможность использования каталазы для количественного 72 определения нитритов в биообъектах.

111.3. Нитрит индуцированное окисление гемоглобина в эритроцитах 76 и их гемолизатах. Механизм, пути защиты и профилактики.

Глава IV. Обсуждение

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие нитрита с антиокислительными ферментами и гемоглобином как важнейший элемент его токсичности"

Актуальность проблемы.

Нитрит-ионы относятся к числу наиболее токсичных и долгоживущих соединений азота. Наряду с нитратами нитриты поступают в организм человека экзо-генно с водой и пищей, а также образуются эндогенно из окиси азота или за счет восстановления нитратов микрофлорой (Green L. et al. 1982, Hartman Ph. 1982, Bruning-Fann С. et al. 1993 ). Нитриты вызывают поражение желудочно кишечного тракта (ЖКТ), обладают канцерогенным действием. При попадании данных соединений в кровь возникает метгемоглобинемия различной степени тяжести (Keatling J.Р. et al, 1973). В некоторых случаях (чаще всего у детей) это заболевание приводит к летальному исходу.

В настоящее время безопасные и эффективные средства лечения нитрит индуцированной метгемоглобинемии отсутствуют (Бурбелло Ф.Т. с соавт., 1991, Coleman M.D., 1996). Это во многом объясняется тем, что механизм взаимодействия нитрита и гемоглобина остается неясным.

Многие исследователи отмечают, что трудности в изучении процессов с участием нитрита объясняются отсутствием надежных методов измерения концентрации нитрита в биологических объектах. Кислая среда, необходимая для колориметрического определения концентрации нитрита (например по методу Грис-са), создает условия для взаимодействия нитрита и аскорбата, что приводит к потерям нитрита и искажению результата анализа (Riise Е., Berg-Nielsen К., 1990).

Кроме того, большинство методов неприменимы для анализа содержания нитрита в биологических объектах, где измерению мешают мутность раствора, наличие восстановителей, некоторых органических и неорганических веществ. Таким образом, разработка метода, позволяющего проводить измерение концентрации нитрита при нейтральных рН в мутных образцах при наличии аскорбата и других восстановителей, является актуальной и практически важной.

Цель и задачи исследования Целью данной работы было выяснение механизма развития нитрит индуцированной метгемоглобинемии, роли антиокислителей и других физиологически активных соединений в данном процессе, определение путей его предотвращения. В работе были поставлены и решались следующие задачи:

1. Разработка нового метода количественного определения нитритов в биообъектах лишенного недостатков, присущих современным официальным методикам, и позволяющего достоверно определять содержание нитритов в биообъектах вне зависимости от их химического состава и оптических свойств.

2. Исследование воздействия нитрита на активность антиокислительных ферментов (каталазы, гемовых пероксидаз) с целью выяснения возможной физиологической роли данного воздействия.

3. Определение роли перекиси водорода и других активных форм кислорода на различных стадиях процесса путем использования антиокислительных ферментов, неферментативных антиоксидантов, а также соединений, способных окисляться в пероксидазной реакции.

4. Выяснение закономерностей кинетики нитрит индуцированного окисления гемоглобина при различных концентрациях нитрита и определение стехиометрии процесса.

5. Разработка на основании данных, полученных при выполнении предыдущих пунктов, схемы протекания процесса ¡n vivo.

Научная новизна

С помощью калориметрического метода регистрации кинетики ферментативных реакций (Титов В.Ю. и др. 1988, Петренко Ю.М. и др. 1989) впервые показано, что нитрит в концентрациях 10"5 - 10"6 М, т.е. реально встречающихся в органах и тканях, способен обратимо ингибировать каталазу в присутствии нормальных для плазмы крови концентраций хлорида и тиоцианата, а также в присутствии бромида. При отсутствии данных галоидов и псевдогалоида ингибирования не происходит. Это показано как на изолированной каталазе из печени быка, так и на каталазе гемолизатов эритроцитов кролика, курицы, коровы и человека, а также на гомогенатах печени курицы. В то же время по отношению к исследованным нами пероксидазам - хрена, лактопероксидазе, а также по отношению к пероксидазной активности метгемоглобина нитрит при тех же условиях не проявлял ингибирую-щего эффекта даже будучи взятым в концентрациях на несколько порядков больших, чем те, которые полностью ингибировали каталазу.

Таким образом, присутствие нитрита при одновременном наличии хлорида и тиоцианата, а также бромида:

1) Снижает устойчивость органов и тканей к токсическому действию перекиси водорода за счет ингибирования каталазы, поскольку этот фермент наиболее эффективно защищает клетки от перекиси (Саундес Б. 1978, Титов В.Ю. и др. 1991).

2) Блокируя каталазный путь разложения перекиси, увеличивает долю пе-роксидазного пути в ее метаболизме. Последнее было продемонстрировано на системе, содержащей каталазу и метгемоглобин. Так как нитрит способен окисляться в пероксидазной реакции с образованием высокотоксичного NO2 (Roman R. et al. 1973, van der Vliet et al. 1997), то, ингибируя каталазу, он способствует увеличению выхода NO2, усиливая тем самым собственную токсичность. Последнее было продемонстрировано на системе, содержащей гемолизат эритроцитов, нитрит и перекись.

Таким образом, установлен еще один важнейший механизм токсичности нитрита.

3) То обстоятельство, что зависимость степени ингибирования каталазы от концентрации нитрита была одинаковой для всех исследованных нами биологических объектов, дает возможность использовать данный фермент как детектор на нитриты, позволяющий, в отличие от официальных методик, производить определение в нейтральной среде, без закисления, и тем самым избегать неконтролируемых потерь исследуемого вещества, особенно при наличии аскорбата и других восстановителей (Norwitz G. et al. 1986, 1987; Riise E. et al. 1990; Kaveeshwar R. et al. 1991; Hamano T. et al. 1998). Поэтому нами Благодаря ему была установлена стехиометрия нитрит индуцированного окисления гемоглобина.

4) Нами установлено, что нитрит при добавлении к гемоглобину при наличии соединений, блокирующих его окисление в пероксидазной реакции (бензиди-на, ß-нафтола и др. активных пероксидазных субстратов), не вызывает окисления гемоглобина. Наиболее эффективные пероксидазные субстраты способны полностью предотвращать окисление гемоглобина будучи взятыми в концентрациях на несколько порядков меньших, чем концентрации гемоглобина и нитрита. Последнее говорит о том, что вопреки установившемуся мнению (Kosaka Н. et al. 1982, 1987; Doyle М. et al. 1985; Arduini A. et al. 1992), непосредственное окислительно-восстановительное взаимодействие между гемоглобином и нитритом в нейтральной среде практически отсутствует. Непосредственным окислителем гемоглобина, по-видимому, является короткоживущий продукт пероксидазного окисления нитрита метгемоглобиноперекисными комплексами, восстанавливающийся при окислении до нитрита. Таким образом, количество окисленного гемоглобина может более чем на порядок превышать количество израсходованного нитрита. Последнее также было установлено при помощи предложенного нами биодетектора.

5) На основании кинетических закономерностей окисления гемоглобина, а также сопряженного с ним расхода нитрита как в цельных эритроцитах так и в их гемолизатах и данных о воздействии на процесс ферментных (каталаза, гемовые пероксидазы) и неферментных антиоксидантов (маннитол, этанол, аскорбат) и ряда физиологически активных веществ (серотонин, половые гормоны и др.) предложена схема развития нитрит индуцированной метгемоглобинемии в условиях in vivo и меры по ее предотвращению и профилактике.

Научно-практическая значимость работы

Разработанный нами метод определения нитрита при помощи каталазы как биодетектора может быть использованным не только в научных исследованиях, но и в клинике. По чувствительности метод не уступает общепринятым методикам (Sen N. et al. 1978; Norwitz G. et al. 1986, 1987; Kaveeshwar R. et al. 1991; Емченко C.B. и др. 1993) и является в настоящее время единственным методом, за исключением предложенного HamanoT. et al. (1998), позволяющим количественно определять нитриты в нейтральной среде и тем самым избегать неконтролируемых потерь исследуемого вещества при наличии аскорбата и других восстановителей. В отличии от последнего он не требует предварительных процедур по снижению изначальной мутности или окрашенности объекта, так как не основан на фотометрической регистрации. Таким образом, все неконтролируемые потери исследуемого вещества сведены к минимуму.

Предложенный в данной работе механизм развития индуцированной метге-моглобинемии позволяет определить характеристики, которыми должны обладать средства профилактики и купирования данного патологического процесса, подвести теоретическую базу под поиск таких средств.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Марголина, Анна Александровна

Выводы

1. Мы исследовали взаимодействие нитрита с каталазой - одним из важнейших антиокислительных ферментов и обнаружили, что нитрит является ингибитором каталазы в присутствии ионов хлорида, бромида и тиоцианата. Степень ингибирования зависит от рН среды, от концентрации галоид-анионов в реакционной среде, а так же пропорциональна концентрации нитрита.

2. На основании обнаруженного эффекта ингибирования нитритом каталазы и, используя разработанный ранее калориметрический метод определения скорости разложения перекиси водорода каталазой, мы разработали метод, позволяющий определять концентрацию нитрита в биологических средах при нейтральных и близким к нейтральным рН. Метод позволяет определять концентрацию нитрита с точностью до 0,5 мкМ.

3. Исследуя процесс нитрит индуцированного окисления гемоглобина, мы установили, что пероксидазные субстраты (аскорбат, р-эстрадиол, р-нафтол, бензидин, серотонин) способны замедлять и даже полностью блокировать нитрит индуцированное окисление гемоглобина на всем протяжении кинетической кривой. Вещества, не способные окисляться в пероксидазной реакции (этанол, тестостерон, манитол, ЭДТА), не оказывали влияния на процесс.

5. Некоторые пероксидазные субстраты блокировали процесс нитрит индуцированного окисления гемоглобина даже в том случае, если их концентрация была на порядок меньше концентраций нитрита и гемоглобина. Это можно объяснить лишь тем, что непосредственного окислительно-восстановительного автор: Марголина Анна Александровна тема: «Взаимодействие нитрита с антиокислительными ферментами и гемоглобином как важнейший элемент его токсичности».

102 взаимодействия нитрита и гемоглобина, на чем настаивали другие авторы, не происходит.

6. Наличие в реакционной среде метгемоглобина или лактопероксидазы, к которой нитрит имеет высокое сродство, значительно ускоряет процесс нитрит индуцированного окисления гемоглобина. В то же время пероксидаза хрена, сродство нитрита к которой незначительно, практически не оказывает влияния на данный процесс. Мы делаем вывод, что пероксидазное окисление нитрита может быть ключевым звеном в процессе нитрит индуцированного окисления гемоглобина. 7. На основании изложенного выше, мы предлагаем схему нитрит индуцированного окисления гемоглобина, в которой ключевым звеном является окисление нитрита до диоксида азота метгемоглобинперекисными комплексами. Продуктом окисления гемоглобина диоксидом азота являются также метгемоглобинперекисные комплексы без выхода перекиси в реакционную среду. Наличие фазы инициации объясняется наличием пероксидазных субстратов -конкурентов нитрита. Аутокаталитическая стадия возможна лишь после их окисления. автор: Марголина Анна Александровна тема: «Взаимодействие нитрита с антиокислительными ферментами и гемоглобином как важнейший элемент его токсичности». 103

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марголина, Анна Александровна, Москва

1. Arduini A., Mancinelli G., Luca Radatti G., Hochstein P., Cadenas E. Possible mechanism of inhibition of nitrite induced oxidation of oxyhemoglobin by ergothioneine and uric acid. Arch. Biochem. Biophys., 1992;294 (2):398-402.

2. Azoulay E, Lachia L, Blayo M.C., Pocidalo J.J. "Methaemoglobinemia induced by nitric oxide in whole blood. Quantitative relationship." Toxicol Eur Res 1978 Jan;1(1):7-12

3. Bailey «Methemoglobinemia acute nitrate poisoning in infants: second report» J Am Ostheopath.Assn.1966; 66: 431-434

4. Barnard R.D. «The reaction of nitrite with hemoglobin derivates" J Biol Chem1937; 120:177-191

5. Beckman J. S., Chen J., Ischiropoulos H., Crow J. "Oxidative chemistry of peroxynitrite" Methods in Enzymology 1994;233:229-240

6. Beckman J. S., Ischiropoulos H., Zhu L., van der Woerd M., Smith C., Chen J., Harrison J., Martin J., Tsai M., "Kinetics of superoxide dismutase- and iron-catalised nitration of phenole by peroxinitrite" Arch Biochem Biophis 1992; 298 (2): 438-445

7. Beckman J.S., Koppenol W.H. "Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and ugly." Am J 1996;271(5 Pt 1):C1424-37

8. BruningFann C.S. Kaneene J.В. "The effects of nitrate, nitrite and N-nitroso compounds on human health: a review" Vet Human toxicol 1993;35:521-538

9. Carrell R.W., Winterbourn C.C., Rachmilewitz E.A. "Activated oxygen and haemolysis." Brit. J. Haematol., 1975;30 (3):259-264.

10. Chan T.Y. "Food-borne nitrates and nitrites as a cause of methemoglobinemia." Southeast Asian J Trop Med Public Health 1996 Mar;27(1): 189-92

11. Chance В., "The kinetics and stoichiometry of transition from the primary to the secondary peroxidase complexes" Arch Biochem. Biophis., 1952; 41 (2):416-424

12. Chiodi H, Mohler JG "Nonautocatalytic methemoglobin formation by sodium nitrite under aerobic and anaerobic conditions." Environ Res 1987 Oct;44(1):45-55

13. Chung Y., Xu D., Jue Th. "Nitrite oxidation of myoglobin in perfused myocardium: implications for energy coupling in respiration." Am. J.Physiol., 1996;271 (3) (Pt 2), P. H1166- H1173.

14. Cohen G., Martinez M., Hochstein P." Generation of hydrogen peroxide during the reaction of nitrite with oxihemoglobin" Biochemistry 1964;3(7):901-903

15. Coleman MD, Coleman NA "Drug-induced methaemoglobinaemia. Treatment issues." Drug Saf 1996 Jun;14(6):394-405

16. Cox R.D., Frank C.W. "Determination of nitrate and nitrite in blood and urine by chemiluminescence." J Anal Toxicol 1982 May-Jun;6(3): 148-52

17. Curi T.C., De Melo M.P., Palanch A.C., Miyasaka C.K., Curi R. "Percentage of phagocytosis, production of 02.-, H202 and NO, and antioxidant enzyme activities of rat neutrophils in culture." Cell Biochem Funct 1998 Mar;16(1):43-9

18. Dalton D., Russell S., Hanus F.J., Pascoe G., Evans H. «Enzymatic reactions of ascorbate and glutathione that prevent peroxide damage in soybean root nodules.» Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986; 83 (11):3811-3815.

19. Dennis M.J. Key PE, Papworth T, Pointer M, Massey RC "The determination of nitrate and nitrite in cured meat by HPLC/UV." Food Addit Contam 1990 Jul-Aug;7(4):455-61

20. Doyle M.P., Herman J.G., Dykstra R.L. "Autocatalytic oxidation of hemoglobin induced by nirtite: activation and chemical inhibition" J. Free Radic. Biol.Med., 1985;1 (2):145-153.

21. Faivre J, Faivre M, Klepping C, Roche .[Methemoglobinemias caused by ingestion of nitrites and nitrates., [Article in French]Ann Nutr Aliment 1976;30(5-6):831-8

22. Foger Ch., Halliwell B. "Purification and properties of dehydroascorbate reductase from spinach leaves." Phytochemistry, 1977;16 (9):1347-1350.

23. Furchgott RF "A research trail over half a century" Annu Rev Pharmacol Toxicol 1995;35:1-27

24. Fukuyama N., Nakazawa H. "Superoxide, nitric oxide and peroxinitrite" Nippon Yakurigaku Zasshi 1998; 112(3): 169-176

25. Gaetani G.F., Kirman H.N., Mangerini R.,Ferraris A.M. «Importance of catalase in the disposal of hydrogen peroxide within human erythrocytes.» Blood, 1994;84 (1) : 325-330.

26. Green L.C., Rait D., Tannenbaum S.R., "Nitrate, nitrite and N-nitroso-comapounds: biochemistry, metabolism, toxicity and cancerogenicity", In Neuberger, Tukes "Human Nutritions" Eds: Jack К Burgess Inc., Englewood, NJ 1982 pp 87-140

27. Gruener N., Shuval H.I., "Studies on the toxicology of nitrites" Enviromental Quality and Safety 1973;11:219-229

28. Hall A.H., Kulig K.W., Rumack B.H. "Drug- and chemical-induced methaemoglobinaemia. Clinical features and management.Med Toxicol" 1986 Jul-Aug;1(4):253-60

29. Hamano Т., Mitsuhashi Y., Aoki N., Semma M., Ito Y., Oji Y. "Enzymic method for the determination of nitrite in meat an,d fish products." Analyst 1998 May; 123(5): 1127-9

30. Hanuokuglu A., Fired D., Bodnu D., "Methaemoglobinemia in infants with enteritis" J Pediatrics 1983; 102(1): 161 -162

31. Hartman Ph.E. "Nitrates and nitrites: ingestion, pharmacodynamics and toxicology" In "Chemical Mutagens" 1982 ;7: 211-294 In de Serres, Hollaender, eds

32. Hecht S.S., "Approaches to cancer prevention based on an understanding of N-nitrosamine carcinogenesis." Proc Soc Exp Biol Med 1997 Nov;216(2):181-91

33. Hibbs J.B. Jr., Taintor R.R., Vavrin Z., Rachlin E M. "Nitric oxide: a cytotoxic activated macrophage effector molecule.» Biochem Biophys,Res Commun 1988 Nov 30,157(1 ):87-94

34. Ischiropoulos H., Zhu L., Chen J., Tsai M., Martin J., Smith C., Beckman J. S. " Peroxinitrite-mediated tirosine nitration catalised by superoxide dismutase" Arch Biochem. Biophis. 1992; 198 (2): 431-437

35. Jaffe E.R. "Methaemoglobinemia" Clin Haematol 1981 ;10(1 ):99-122

36. Kamm L., McKeown G., Smith D.M., "New Colorimetric Method for the Determination of the Nitrate and Nitrite Content of Baby Foods" J. Assoc. Off Agric. Chem. 1995; 48(5):892-897.

37. Keatling J.P., Lell M.E., Strauss A.W., Zarkowsky H„ Smith G.E. "Infantile methemoglobinemia caused by carrot juice" New Engl J Med 1973;288(16):824-826

38. Keilin D., Hartree E., F., "Catalase peroxidase and methemoglobin as catalists of coupled peroxidatic reaction." Biochem. J., 1955; 60(2):310-325

39. Keilin D., Nicholls P., "Reactions of catalase with hydrogen peroxide and hydrogen donors". B.B.A. 1958; 29(2):302-307

40. Klebanoff S.J. «Reactive nitrogen intermediates and antimicrobial activity: role of nitrite.» Free Radic. Biol. & Med.;, 1993, v. 14, №4, P. 351-360.

41. Kosaka H., Tyuma I. "Mechanism of autocatalytic oxidation of oxyhemoglobin by nitrite." Environ Health Perspect 1987 Aug;73:147-51

42. Kosaka H, Tyuma I, Imaizumi K. "Mechanism of autocatalytic oxidation of oxyhemoglobin by nitrite" Biomed Biochim Acta 1983;42(11-12):S144-8

43. Kosaka Н., Uozumi М. "Inhibition by amines indicates involvement of nitrogen dioxide in autocatalytic oxidation of oxyhemoglobin by nitrite." Biochim Biophys Acta 1986 May 12;871(1):14-8

44. Kosaka H., Uozumi M., Tyuma I. "The interaction between nitrogen oxides and hemoglobin and endothelium-derived relaxing factor." Free Radic Biol Med 1989;7(6):653-8

45. Kosaka H., Imaizumi K., Tyuma I. «Mechanism of autocatalytic oxidation of oxyhemoglobin by nitrite. An intermediate detected by electron spin resonance.» B.B.A., 1982, v.702, №2, P. 237-241.

46. Kosiba R., Sleight S. "Nitrite toxicosis in the ascorbic acid-deficient guinea pigs" Toxicol and Applied Pharm 1970;16:424-429

47. Kurz M.A., Boyer Th.D., Whalen R., Peterson Т.Е., Harrison D.G. "Nitroglycerin metabolism in vascular tissue.role of glutationtransferrases and relationship between NO and N02 formation" Biochem J 1993;292(Pt2):545-550

48. Lee C.Y.,Shallenberger R.S., Downing D.L., Stoewsand G.S., Peck N.M. «Nitrate and nitrite nitrogen in fresh, stored and processed table beets and spinach from different levels of field nitrogen fertilisation" J Sci Food Agric; 1971;22:90-92

49. Leone A.M., Francis P.L., Rhodes P., Moncada S. "A Rapid and simple method for the measurement of nitrite and nitrate in plasma by high performance capillary electrophoresis." B.B. Res. Commun., 1994, v.200, № 2, P. 951-957.

50. Marietta М.А., Yoon P.S., Iyengar R., Leaf C.D., Wishnok J.S. "Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate" Biochemistry 1988 Nov 29;27(24):8706-11

51. May R.B. «An Infant with sepsis and methaemoglobinemia» J Energ Med 1985;3:261-264

52. Mehlhorn H. " Ethylene promoted ascorbate peroxidase activity protects plants against hydrogen peroxide, ozone and paraquat." Plant. Cell. Envir., 1990, v. 13, №9, P.971-976.

53. Mehlhorn H., Leladais M., Korth H.G., Foyer C.H. "Ascorbate is the natural substrate for plant peroxidases." FEBS Letters, 1996, v.378, №3, P.203-206.

54. Miller L.W. «Methemoglobinemia assotiated with well water» J Amer Med Ass 1971 ;216(10): 1642-1643

55. Modi S., Deodhar S., Behere D., Mitra S. "Lactoperoxidase catalyzed oxidation of thiocyanate by hydrogen peroxide: 15N nuclear magnetic resonance and optical spectral studies." Biochemistry, 1991, v.30, №1, P. 118-124.

56. Moncada S, Palmer RM, Higgs EA "The discovery of nitric oxide as the endogenous nitrovasodilator." Hypertension 1988 Oct; 12(4):365-72

57. Moncada S., Palmer R., Higgs E. "Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology." Pharm. Rev., 1991, v.43, № 2, P.109-142.

58. Mori Y., Murakami S., Sagae Т., Hayashi H., Sakata M., Sagai M., Kumagai Y. "Inhibition of catalase activity in vitro by diesel exhaust particles." J. Toxicol. Environ. Health, 1996, v.47, №2, P. 125-134.

59. Nakahara Н, Sato EF, Ishisaka R, Kanno T, Yoshioka T, Yasuda T, Inoue M, Utsumi К "Biochemical properties of human oral polymorphonuclear leukocytes." Free Radic Res 1998 May;28(5):485-95

60. Norwitz J., Keliher P. N., "Study of organic interferences in the spectrophotometric determination of nitrate using composite diazotisation-coupling reagents" Analyst 1986; 111 (9):1033-1037

61. Norwitz J., Keliher P.N. "Interference of ascorbic and isoascorbic acids in the spectrophotometric determination of nitrite by the diazotisation-coupling technique" Analist 1987; 112(6):903-907

62. Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S "Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor." Nature 1987 Jun 11-17;327(6122):524-6

63. Palmer RM, Rees DD, Ashton DS, Moncada S "L-arginine is the physiological precursor for the formation of nitric oxide in endothelium-dependent relaxation." Biochem Biophys Res Commun 1988 Jun 30;153(3):1251-6

64. Priitz W.A., Monig H., Butler J., Land E.J. «Reaction of nitrogen dioxide in aqueous model systems: oxidation of tyrosine units in peptides and proteins.» Arch Biochem Biophys. 1985 Nov 15;243(1): 125,-34.

65. Pryor W.A., Lightsey J.W. «Mechanisms of nitrogen dioxide reactions: initiation of lipid peroxidation and the production of nitrous acid.» Science, 1981,v.214, № 4519, P. 435-437.

66. Riise Е., Berg-Nielsen К. «Improved extraction method for avoiding the interference of ascorbic acid in the spectrophotometric determination of nitrite in meat products." Analyst, 1990, v. 115, № 9, P. 1265-1267.

67. Roman R., Dunford H., "Studies on horseradish peroxidase. XII. A kinetic study of the oxidation of sulfite and nitrite by compound I and II." Can. J. Chem. 1973:51(4): 588-596

68. Rose R.C. «Transport of ascorbic acid and other water-soluble vitamins.» B.B.A., 1988, v.947, №2, P. 335-366.

69. Sampson J.В., Ye Y., Rosen H., Beckman J.S. "Myeloperoxidase and horseradish peroxidase catalyze tyrosine nitration in proteins from nitrite and hydrogen peroxide." Arch Biochem Biophys 1998 Aug 15;356(2):207-13

70. Sapeika N «Meat and dairy products», In «Food science and technology. Toxic constitituent of animal foodstuffs» Ed by Liener IE 1974 Acad Press New York, London pp:1-38

71. Sen N.P., Donaldson B. "Improved Colorimetric Method for Determination nitrate and nitrite in foods". J. Assoc. Anal. Chem. 1978;61 (6): 1389-1394

72. Shepherd V.L. "The role of the respiratory burst of phagocytes in host defense." Semin Respir Infect 1986 Jun;1(2):99-106

73. Sherken S. "Ion selective method for the determination of nitrite in smoked fish" J Assoc Off Anal Chem 1976 Sep;59(5):971-4

74. ShugaIei I.V., Tselinskii I.V., Malinina T.V. Toxic effects of sodium nitrite., [Article in Russian] Gig Sanit 1991 Apr;(4):49-53

75. Slungaard A, Mahoney J.R. "Thiocyanate is the major substrate for eosinophil peroxidase in physiologic fluids. Implications for cytotoxicity." J Biol Chem 1991 Mar 15;266(8):4903-10

76. Spagnuolo C., Rinelli P., Coletta M., Chiancone E., Ascoli F. "Oxidation reaction of human oxyhemoglobin with nitrite: a reexamination." Biochim Biophys Acta 1987 Jan 5;911(1):59-65

77. Squadrito G.L., Pryor W.A. "Oxidative chemistry of nitric oxide: the roles of superoxide, peroxynitrite, and carbon dioxide." Free Radic Biol Med 1998 Sep;25(4-5) .392-403

78. Stringer D.A. "Nitrate and Drinking Water" In Technical Report #27 ECETOS Brussels 1988

79. Tarano Т., Miyazaki Y., Nakata K, "Interaction of nitrite with catalase in the perfused rat liver.""Food. Chem., Toxicol 1988; 26(10):837-839

80. Thomas E.L., Fishman M. "Physiol Oxidation of chloride and thiocyanate by isolated leukocytes."J Biol Chem 1986 Jul 25;261(21):9694-702

81. Tomoda A., Tsuji A., Yoneyama Y. "Involvement of superoxide anion in the reaction mechanism of haemoglobin oxidation by nitrite." Biochem J 1981 Jan 1 ;193(1):16979

82. Tomoda A., Tsuji A., Yoneyama Y. "Mechanism of hemoglobin oxidation by ferricytochrome с and nitrite." Acta Biol Med Ger 1981;40(7-8):943-54

83. Wang R., Ghahary A., Shen Y.J.,-.Scott P.G., Tredget E:E. "Human dermal fibroblasts produce nitric oxide and express both constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms." J Invest Dermatol 1996 Mar; 106(3):419-27

84. Wink D. A., Mitchell J.В. "Chemical biology of nitric oxide: insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide." Free Radic Biol. Med 1998;25(4-5):434-456

85. Wolff I.A. Wasserman A.E. "Nitrates, nitrites and nitrosamines" Sci., 1972;177:4043

86. Бурбелло Ф.Т., Баскович Г.А., Доброхотова Е.Г., Слесарев В.И. «Защитное действие антиоксидантов при метгемоглобинемии, вызванной нитритом натрия в эксперименте» Гигиена Труда и Профзаболеваний 1991;4:13-15

87. Емченко С.В. Цыганенко О.И. «Методы определения нитратов и нитритов в пищевых продуктах», Аналитические обзоры, Серия «Экология» РАН, Сибирское отделние, Новосибирск, 1993 вып 27: 95-115

88. Мурох В.И. «Содержание нитратов и нитритов в пищевых продуктах растительного происхождения, выращенных с использованием минеральных удобрений.» Вопр. Питания, 1986, №4, С.65-67.

89. Опополь Н.И. Добрянская E.JB. «Нитраты» Кишинев 1986:44-86

90. Петренко Ю.М., Матюшин А.И., Титов В.Ю. «Новый взгляд на биотрансформацию эстрадиола в организме. Метаболизм эстрадиола в эритроцитах путем пероксидазной реакции.» Эксп. клин, фармакол., 1994, т.57, №4, С. 45-49.

91. Саундес Б. К. В сб. "Неорганическая биохимия" под ред. Г. Эйхгорна, перевод. И. Я. Левитина, под ред. М.Е. Вольпин и К. Б. Яцимирский. 1978, М. "Мир"; 2: 434-470

92. Титов В. Ю., Петренко Ю. М., Петров В. А., Владимиров Ю. А., «Механизм окисления оксигемоглобина, индуцированного перекисью водорода» БЭБМ 1991; CXII; 112(7): 46-49

93. Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Владимиров Ю.А. «Изучение реакции каталазы с перекисью водорода калориметрическим методом.» Биофизика, 1988, т.ЗЗ, №1, С. 162.

94. Ханке Т., Эберт Б. «Исследование методом ЭПР свободных радикалов при окислении производных бензидина при помощи пероксидазы и перекиси водорода.» Биофизика, 1987, т.32, вып.4, С. 569-572.

95. Шамб У., Сеттерфилд Ч., Вентворс Р. В кн. "Перекись водорода" М. Издательство иностранной литературы, 1958, 576 с.