Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы образования и разрушения метгемоглобиннитрита в растворе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы образования и разрушения метгемоглобиннитрита в растворе"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ < О С

0® 4

УДК 577.3: 547.963.4 + 546.173

Стародубцева Мария Николаевна

МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ И РАЗРУШЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИН-НИТРИТА В РАСТВОРЕ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степеии кандидата биологических наук

Минск

!999

Работа выполнена в Белорусском государственном университете и в Гомельском государственном медицинском институте.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Черенкевич С. Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мажу ль В. М.; доктор химических наук, ст. научн. сотр. Костюк В. А.

Оппонирующая организация -

Институт биохимии Национальной академии наук

Беларуси.

Зашита состоится " 22" октября 1999 г. в 12°° часов на заседании совета по защите диссертаций Д 01.37.01 в Институте фотобиологии HAH Беларуси по адресу: 220072, Минск, ул. Академическая, 27. Телефон ученого секретаря - 284-23-57.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии HAH Беларуси.

сентября 1999 г.

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций,

кандидат биологических наук

рм 7 ■ о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации

Проблема воздействия на организм человека неорганических кислородсодержащих соединений азота (ЫОх-соединений: нитритов, нитратов, азотистой и азотной кислот, оксидов азота, пероксинитритов, пероксинит-ратов н др.) в настоящее время является актуальной. Уровень поступления Ж)х-соедннений в организм человеха в связи с расширением областей их использования и с увеличением степени загрязнения окружающей среды постоянно увеличивается (с питьевой водой, пищей, лекарствами, вдыхаемым воздухом). Чрезмерное накопление N0*-соединений в организме вызывает поражение органов и тканей, приводящее к нарушениям физиологических процессов. Для нашей страны ситуация усугубляется в связи с повышенным радиационным фоном. В экономически развитых странах интенсивно проводятся работы по нормированию поступления N Отсоединений в организм человека ограничению их содержания в продуктах питания, в питьевой воде, в воздухе больших городов. Решение этих задач осуществляется одновременно с изучением особенностей поступления, распределения и выведения КОх-соединений из организма человека, с изучением реакций 1\!0,-соед1шений с важнейшими биомолекулами тканей организма. Одной из причин нарушения здоровья человека является взаимодействие МХ-соединений с гемоглобином. Конечным продуктом многих реакций в организме человека при поступлении извне МОу-соединений являются нитрит-ионы. Нитрит-ионы взаимодействуют с гемоглобином с образованием различных форм гемоглобина, в том числе метгемоглобин-нитрита - комплекса метгемоглобинз с нитрит-ионами. Метгемоглобин-нитрит (лшНЬ-ЫОз) является малоизученной формой гемоглобина. Следует ожидать, что метгемоглобин-иктрит и нитрозилгемогаобин (№N0), как и другие N0,-соединения, могут обладать высокой химической активностью. Все это делает актуальным изучение свойств метгемоглобин-нитрнта и степени его участия в различных процессах в организме человека.

Связь работы с крупными научными программами, темами

Результаты, положенные в основу диссертационной работы, был» получены в рамках Государственной программы «Биофизические механизмы регуляции неспецифических реакции иммунитета» (1946-1997 гг.. ЛЬ госрегистрации 19963652) и Государственной программы «Синергетика» Министерства образования Республики Беларусь на 1996--000 гг. (темы «Молекулярно-мембранные механизмы трансдукщш и процесс« нга сигнала в клетках иммунной системы--). № 838/09) кафедры биофизики физического факультета Белорусского государственного университета, а так-

же в рамках темы «Изучение механизмов действия физических и химических факторов на белки и форменные элементы крови» кафедры медицкн-скоГ' и биологической физики Гомельского государственного медицинского института (1994-1998 гг.).

Цель и задачи исследования

Целью работы является установление закономерностей образования и разрушения метгемоглобин-нитрита в водных растворах и в эритроцитах человека, а также влияния ультразвука на эти процессы.

В диссертации поставлены и.решены следующие основные задачи:

• Установить закономерности образования и разрушения метгемоглобин-нитрита в процессе взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионами в водных растворах. Провести теоретический анализ модели обратимого одноместного связывания нитрит-ионов с атомом железа субъединицы мет-гемоглобина, описывающей процесс взаимодействия метгемоглобина с нитрит-ионами в растворе, и проверить ее соответствие экспериментальным данным. Разработать методику определения концентраций различных форм гемоглобина, одновременно находящихся в растворе, по спектрам электронного поглощения при ограниченной информации о коэффициентах экетинкини одной из форм гемоглобина.

• Исследовать взаимодействие метгемоглобин-нитрита с пероксидом водорода (НтО;). в том числе с помощью хемилюминесценции (люминол-зависимой и спонтанной), с целью установления основных интермедиатов процесса.

• Определить возможность и установить закономерности образования метгемоглобин-нитрита в эритроцитах челоьека.

• Выявить влияние ультразвука (УЗ) на процесс образования метгемоглобин-нитрита в водных растворах. Изучить изменения химической структуры нитроз ил гемоглобина под действием УЗ в водных и водно-спиртовых растворах.

Объект и предмет исследования

Объектом исследования являлись гемоглобин, а также эритроциты человека. Предметом исследования являлись механизмы образования и разрушения метгемоглобин-нитрита пра взаимодействии гемоглобина в водных растворах и 8 эритроцитах с нитрит-ионами.

Методология и методы ггравгдениого исследования В работе использовались спектрофотометрические, хемклюминес центные, флуоресцентные и химические методы анализа.

Научная новизна и значимость полученных результатов

Впервые систематически исследованы процессы образования и разрушения малоизученной формы гемоглобина — метгемоглобин-нитрита. Установлено, что процесс взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионами в водном растворе включает в себя обратимую и необратимые реакции. Показано, что метгемоглобин-нитрит является промежуточным продуктом процесса взаимодействия ферро-форм гемоглобина с нитрит-ионами, в результате которого разрушается химическая структура гемоглобина. Взаимодействие нитрит-иона с железом метгемоглобина с образованием метгемоглобин-нитрита является обратимым й удовлетворительно описывается моделью одноместного связывания. Выявлено образование белков с нарушенной структурой порфиринового кольца гема при взаимодействии гемоглобина с нитрит-ионами, метгемоглобин-нитрита с РЬСЬ, а также в водно-спиртовых растворах нитрозилгемоглобина под действием УЗ. Показано, что продуктом взаимодействия метгемоглобин-нитрита с Н2О2 и инициатором образования такого рода структур является пероксинитритная кислота. Установлено образование метгемоглобин-нитрита в эритроцитах человека при наличии в окружающей эритроцит среде нитрит-ионов. Показана взаимосвязь состояния эритроцита и нитрит-модифицированных форм гемоглобина (метгемоглобина и метгемоглобкн-яшрита) при воздействии на эритроцит нитрит-ионов. Экспериментально показано образование в реакции нитрита натрия (ЫаМО:) с Н2О2 в водных растворах траяс- и цис-форм пероксиннтритной кислоты и ее возбужденного состояния. Выявлен си-нергический эффект совместного воздействия на водные раствори гемоглобина УЗ и нитрит-ионо». Установлено увеличение под действием УЗ скорости окисления железа (II) гемоглобина нитрит-ионами и константы равновесия реакции образования-распада метгемоглобин-нитрита. Показано уменьшение скорости денатурации белкового компонента гемоглобина э озвучиваемых водных растворах в присутствии нитрит-ионов.

Практическая значимость полученных результатов

Практический интерес для научных работников и специалистов системы здравоохранения представляют выводы об образовании метгемоглобин-нитрита в эритроцитах и в полных растворах при взаимодействии гемоглобина с нитрит-ионами в малых концентрациях, а также данные о взаимодействии этой формы гемоглобина с ЬЬСЬ, результатом которого является разрушение химической структуры гемоглобина- Учет еше одной формы гемоглобина позволяет с новых позиций рассматривать многие процессы, происходящие а эритроцитах. Выявленные закономерности образования и разрушения четгемоглобин-нитркга могут быть использованы .ия управления процессами в растворах гемоглобина и в эритроцитах с

участием N0*-соединений. Результаты хемилюминесцентного исследования реакции нитрита натрия с Н202 в водных растворах могут быть -использованы при разработке хемилюминесцентного метода определения изомерных форм пероксинитритной кислоты. Разработанная методика определения концентраций форм гемоглобина (АО, превращающихся по схеме А|->А2<-*Аз, с одновременной оценкой неизвестного коэффициента экс-тинкции одной из форм гемоглобина может быть полезна при изучении малоисследованных форм гемоглобина. Обнаруженные закономерности взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионами в водных растворах и внутри эритроцитов, особенности химических свойств метгемоглобин-нитрита и совместного влияния на водные растворы гемоглобина нитритов и УЗ могут быть использованы медицинскими работниками при составлении рекомендаций по предотвращению и лечению отравлений нит-рит(нитраг)содержащими веществами, а также по использованию лекарств. включающих нитриты, оксиды азота и другие ЫОх-соединения, в условиях воздействия на человека УЗ и ионизирующего излучения.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Гемоглобин (ферро-форма) в процессе его взаимодействия с нитрит-ионами в водном растворе претерпевает ряд изменений структуры, описываемых схемой: ферро-НЬ-те1НЫ-»те1НЬ-Т^02-»разрушение лорфирн-нового кольца тема и глобина.

2. Пероксинитритная кислота является промежуточным продуктом процесса взаимодействия метгемоглобин-нитрита с Н2О2 и инициатором наблюдаемых при этом необратимых изменений химической структуры гемоглобина в водных растворах при рН< 7,5.

3. Уровень накопления в эритроцитах нитрит-модифицированной формы гемоглобина при воздействии на эритроциты нитрит-ионов связан с их метаболическим состоянием. При взаимодействии внутриэритроцитарнопо гемоглобина с нитрит-ионами образуются две ферри-формы гемоглобина -метгемоглобин в метгемоглобин-нитрит.

4. В реакции №N0; с Н^СЬ в водных растворах образуются химически высокоактивные продукты - транс- и цис-изомеры пероксинитритной кислоты и ее возбужденное состояние.

Личный вклад соискателя

Экспериментальный материал получен автором самостоятельно. Выбор методов исследований, условий экспериментов, интерпретация результатов и анализ полученных данных выполнены при решающем участии автора.

Апробация результатов диссертации

Основные результаты, полученные в ходе исследований, докладывались и представлялись на Международном симпозиуме «Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов» (г. Гродно, 1995 г.), Международной научной конференции, посвященной пятилетию образования ГоГМИ (г. Гомель, 1995 г.), Международном симпозиуме «Кислород и свободные радикалы» (г. Гродно, 1996 г.), Международном научном конгрессе «Чернобыль - Вильседе» (г. Гомель, 1997 г.), И белорусско-российском симпозиуме «Биологические механизмы эндогенной интоксикации» (г. Гродно. 1997 г.), II и III съездах белорусского общества фотобиологов и биофизиков (г. Минск, 1996 и 1998 гг.), Международной науч-но-практическон конференции «Экология и молодежь» (г. Гомель, 1998 г.). Международном симпозиуме «Biological Chemistry and Cellular Targets of Nitric Oxide» (г. Граи, 1998 г.), Международной конференции «Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности» (г. Минск, 1998 г.).

Опубликоватюсть результатов

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 5 научных статей (в научных журналах — 3, в сборниках научных статей - 2) и 12 тезисов докладов. Общее количество страниц опубликованных материалов-36.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, общей характеристики, 5 глав и заключения. Список цитируемой литературы включает 269 наименований. Работа изложена на ИЗ страницах, содержит 6 таблиц и 39 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава содержит обзор литературы, посещенной изучению структуры гемоглобина, взаимодействию гемоглобина с неорганическими кислородсодержащими соединениями азота, сключаа нитрит-ионы. Анализируются химические свойства нитрит-иона и активных форм азота. Особое внимание уделено вопросам структуры я химических свойств перок-си нитритной кислоты и ее аниона. Сформулированы цели и задачи работы.

Во «торой главе описаны объекты исследования, методы их приготовления и исследования. Okviu'смоглобин получали из донорской крови по методу Бенеша с соавторами {Benesch R. Е„ 1972]. Метгемогжюин получали обработкой оксигемогдобина феррицианидом калия. троокси^смоглооим - п процессе продувки раствора оксигемогдобина

монооксидом углерода [Kampen Е. J., 1983]. Нитроштгемоглобин получали при взаимодействии гемоглобина с нитрит-ионами в анаэробных условиях [Doyle М. Р., 1981]. Эритроциты, содержащие преимущественно гемоглобин в мет-форме, получали путем их инкубирования с 1-10 мМ NaNC>2 в течение 10-20 мин с последующей 3-х кратной отмывкой физиологическим раствором. Эритроциты, содержащие преимущественно модифицированный Н2С>2 метгемоглобин-нитрит, получали путем их инкубирования с 20-50 мМ NaNOj с последующими обработкой 10 мМ HiCK и 3-х кратной отмывкой физиологическим раствором. Основными методами исследования являлись оптические- методы: спектрофотометрах и хеми-люминесценция (люминол-зависгшая и спонтанная). Спектры электронного поглощения растворов гемоглобина и его производных записывали на регистрирующих спектрофотометрах СФ-18 (Россия) и Specord UV-VIS (Германия). Хелшчюмтесцещию растворов изучали на биохемшпомино-метре БХЛ-1 (Беларусь, Минск, БГУ). Инициирование реакций, сопровождающихся свечением, осуществляли введением Н20: в темноте в кювету, содержащую 2 мл буферного раствора NaNOi и/или гемоглобина. В главе опнсана разработанная автором методика определения концентрации форм гемоглобина в смеси, содержащей три различные формы гемоглобина (A|, Aj, Aj), участвующие в химических превращениях типа A|-*-Ar*-»Aj, по спектрам электронного поглощения. Особенностью методики является то, что она применима при ограниченных данных о значениях коэффициентов экстинкции одной из форм гемоглобина. Методика рассматривается на примере определения концентрации форм гемоглобина в растворе, взаимопрезрашагошихся по схеме HbCO->metHtx->metHb-NO:. Методика основана на зависимости оптической плотности многокомпонентного раствора от суммы произведений концентраций каждого из компонентов раствора и коэффициентов экстинкции компонентов. Допускается, что гемоглобин в процессе его взаимодействия с нитрит-ионами в растворе находится преимущественно в трех вышеназванных формах, доля остальных форм гемоглобина не превышает 3-5%. Ограничение информации о коэффициентах экстинкции metHb-NO? заключается в том, что один из коэффициентов, необходимых для расчета концентраций форм гемоглобина, является неизвестным. Неизвестный коэффициент экстинкции metHb-NOz на длине волны 500 нм - е*» вычисляется по известному коэффициенту экстинкции на другой длине волны - £538 с помощью решения системы уравнен?!й, описывающей оптические плотности раствора при полном превращении одной из форм гемоглобина (НЬСО) в две другое (metHb и metHb-NQz). Полученный с использованием разработанной методики коэффициент экстинкции теШЬ-ЖЬ - с5Ю равен 6,985±О.ОБ6 л мМ' (Р = 0,95). Компьютерный анализ существенно ускоряет решение задачи

нахождения концентраций форм гемоглобина в растворе с одновременной оценкой численного значения неизвестного коэффициента экстинкции од-нон из форм гемоглобина. Обработку растворов гемоглобина ультразвуком проводили в стеклянном сосуде, который устанавливали на кварцевый излучатель диаметром 4 см ультразвукового терапевтического аппарата УТП-1 (880 кГц, 2,0 Вт/см2). Ультразвуковой излучатель и пробы находились в термостатируемом устройстве.

В главе 3 описаны результаты исследования образования mctHb-NO; в реакциях различных форм гемоглобина (НЬСЬ, HbCO, metHb) с нитрит-ионами. а также разрушения шеШЬ-ЫОг в водном растворе. В разделе 3./ приведены результаты исследования образования metHb-NCb в реакции metHb с нитрит-ионами в водном растворе. Как известно, в аэробных условиях в водном растворе NaNCK нитрит-ион является практически единственным модифицирующим metHb агентом, так как в этих условиях константа скорости реакции второго модифицирующего метгемоглобин агента - NO - с кислородом воздуха на 2-3 порядка выше, чем константа скорости реакции N0 с metHb. В результате анализа кривых связывания нитрит-ионов metHb нами показано существование единственного центра связывания нитрит-иона на субъединице metHb. Спектр электронного поглощения metHb-NO> характеризуется полосами поглощения с максимумами при 410-412 нм, 538 нм и 625-627 нм иЗ-мя изобесгаческими точками перехода metHb в metHb-NOj (рис.1). Показано также, что образование metHb-NOi яштяется обратимым процессом.

0,8

0,4

0,0

D

450

550

65\,нм Р"6-8-

Рис. 1. Спектры электронного поглощения раствора тиНЪ в отсутствие (1, 5) и в присутствии 0.5 мМ (2>. 5 мМ (3). 50 мМ (4, 6) №МСЪ. Концентрация гемоглобина в растворах, спектры электронного поглощения юото-. рых представлены кривыми 5 и 6. в 25 раз меньше, чем з растворах. спектры поглощения когорых представлены кривыми 1 - 4. 0.15 М фосфатный буфер:

В разделе рассмотрена модель обратимого одноместного связывания нитрит-ионов с субъединнцами metHb. MetHb-NO? находится а растворе в динамическом равновесии с metHb м ннтрит-ноками:

metHb 4- NO ~

К

metHb -NO

где тегНЬ, теШЬ-КОг - соответственно свободные и связанные с нитрит-ионами субъединицы метгемоглобина, К =. [теМЬ^СЬ] I [те1НЬ][ЬЮ;>~] -константа равновесия процесса (1).

В рамках этой модели относительная концентрация т^НЬ-МО? (к = [теМЬ-ЫСЬ] / [теМЬ],,) представляет собой сложную функцию начальных концентраций тесНЬ ([те1НЬ]э) и нитрит-ионов ([N02"],,), а также величины К:

где Р = [NCb"]o+ [metHb]o + 1/К, 0 < k < 1. Кривые связывания нитрит-ионов с metHb. построенные в рамках модели, хорошо согласуются с экспериментальными кривыми связывания (рис. 2). Вычисленная в рамках модели константа равновесия процесса (1) К1ЫЧ равна 800 ± 150 (с учетом погрешностей экспериментальных данных) и близка к экспериментально определенной константе равновесия Коп= 650 ± 68 (Р = 0,95; pH 6.5), а также к известной из литературы (К = 620, pH 6,5; Uchida, Klapper, 1970).

к. отн. ед. Рис.2. Зависимость отно

2 [metHb] о

(2)

0,8

0,4

0,0"

[metHb]o = 7.68 мкМ.

принимает значения 2000(1). 800(2). 200(3). © - экспериментальные данные.

сительной концентрации nietHb-ЫСЬ от начальной концентрации нитрит-ионов в водной растворе.

4,0

8,0 [Ю/ЪМ

В рамках модели полумены выражения для расчета относительной концентрации теМЬ-Ж^ (2) и оценки константы равновесия реакции образования и распада теМЫЧОг в растворах гемоглобина в присутствии нитрит-ионов. На основе анализа модели выбраны оптимальные условия получения растворов, содержащих гемоглобин преимущественно в форме тегНЬ-КО:- В качестве таких растворов в работе использовали водные растворы гемоглобина (30-80 мкМ) в присутствии 5-10 мМ К'аЫО:.

В разделе 3.2 показано, что при взаимодействии ферро-форм >емо-глобина (НЬО;, НЬСО) с нитрит-ионами з растворе имеют место две реакции: окисление ферро-формы гемоглобина до те1НЬ и образование пипНЬ-N0: (формула 1). Лимитирующей накопление в растворе теШЬ-КО? реакцией является окисление ферро-формы гемоглобина. Полученные результаты и литературные данные позволяют рассматривать реакцию образования теМЬ-ЫСЬ при малых концентрациях нитрит-ионов в растворе в качестве дополнительной к известной схеме процесса окисления ферро-формы гемоглобина нитрит-ионами.

В разделе 3.3 представлен анализ результатов исследования необратимых изменений структуры гемоглобина в процессе его взаимодействия с нитрит-ионами. Обнаружено, что взаимодействие гемоглобина (НЬО; и НЬСО) с нитрит-ионами приводит к разрушению порфиринового кольца гема и глобина (рис. 3). Одним из промежуточных продуктов процесса является белок с нарушенной структурой порфиринового кольца гема, названный нами хромогеном-613. Спектр электронного поглощения хромо-гена-613 характеризуется полосами поглощения с максимумами при 412 нм (полоса Соре) и 613-615 им (см. рис. 3, кривая 4), а также плечом полосы Соре в области 440-460 нм.

О

Рис. 3. Спектры электронного поглощения растворов окснгечогло бииа (50 мкМ) (1) и продуктов его взаимодействия с 0,5 *лМ (2>. 5 мМ (3). 50 мМ (4) 0.15 М фосфатный буфер. рН 4.7. Время инкубации растворов - 2 часа.

Подобные спектры поглощения характерны для белков с нарушенной структурой порфиринового кольца гема: белков холеглобинового типа, сульфгемоглобинов и аддуктов с ковалентной связью гема с белком. Скорость образования хромогена-613 н разрушения структуры гемоглобина увеличивается с уменьшением величины рН раствора и с увеличением концентрации нитрит-ионов в растворе. Предполагается, что разрушение структуры гемоглобина в этом процессе обусловлено реакцией теШЬ-КО; с Н;03 (Н:Ог является продуктом окисления белковой части гемоглобина нитритом). В результате анализа полученных нами и литературных данных предложена схема механизма превращений гемоглобина в процессе его взаимодействия с нитрит-ионами (рис.4).

ферро-НЬ

теШЬ

+N02" ;

"1 теШЬ-1^02

! •+Н?СЬ { -

Разрушение порфиринового кольца гема а гло5;ша

Рис. 4. Схема превращений стр\ет\-ры гемоглобина в процессе его взаимодействия с нитрит-ионами в водных растворах.

В главе 4 приведены результаты исследования процесса взаимодействия тегНЬ-ЫО: с НгСЬ, ИаЫОз с Н2Оз в водных растворах, а также внут-риэритрошггарного гемоглобина с нитрит-ионами. В разделах 4.1 и 4.2 обсуждаются результаты изучения взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионами и Н2Оз. Выявлены необратимые изменения структуры гемоглобина при взаимодействии шеШЬ-ЫО» с НгСЬ- Наиболее выражены изменения структуры гемоглобина в слабокислых и кислых растворах. Спектры электронного поглощения этих растворов характеризуются полосами поглощения с максимумами при 408-410 им, 711-712 нм ц в области 585-600 нм. Подобные спектры поглощения характерны для окисленных аддуктов с ковалентной связью гема с белком, биливердина и т. п. При замене последовательности вступления реагентов (нитрит-ионов и Н:0:) в реакцию с гемоглобином, то есть при введении в раствор гемоглобина скачала Н20;. а затем нитрят'ионав, наблюдается образование феррил-гемоглобииа, кото-

рый затем восстанавливается до тетНЫМОз нитрит-ионами. Нами обнаружена спонтанная хемилюминесценция раствора гемоглобина с нитрит-ионами и Н:02. Процесс хемилюминесценции имеет два характерных периода нарастания свечения: вспышку (в течение первой минуты процесса) и длительное (в течение 30-40 минут) свечение. На основании литературных данных и результатов наших экспериментов предлагается связать длительную стадию свечения с образованием долгоживущих радикалов ароматических аминокислот белка. Результаты анализа зависимостей параметров хемилюминесценции от рН раствора и от начальных концентраций реагентов позволяют сделать вывод об образовании пероксиннтритной кислоты в реакции те1НЬ->Ю: с Н202. Так, интенсивность хемилюлинесцен-ции увеличивается прямо пропорционально увеличению концентрации п^НЬ-ЫОг в растворе при постоянных значениях концентраций нитрит-ионов и Н>0:. Кривые, описывающие зависимости интенсивности хемилюминесценции от концентрации Н;Оз и нитрит-ионов в растворе, сходны с кривыми, описывающими зависимости скорости образования пероксиннтритной кислоты в растворе, содержащем Н;02 и КаЫСК Кроме того, область критических значений рН раствора (6,5-7,5) для параметров хемилюминесценции включает в себя значения рК, пероксиннтритной кислоты (см. рис.4).

Рис. 4. Зависимость параметров хемилюминесценции. сопровождающей ■ взаимодействие НЬ02 (31 мкМ) с 4,7 мМ ЫаЫО, и 5 мМ Н^Оз. от рН среды. - интегральная интенсивность хемилю-минесдениии; !,-> - время, в течение которого интенсивность хемилюминесценции достигает половинного от максимального значения интенсивности медленной стадии развития свечения. 0.05 М фосфатный буфер.

В разделе 4.3. описаны результаты изучения хемилюминесценции (люминол-зависимой и спонтанной) раствора №N0^ и Н202 в диапазоне рН 4-9. Нами обнаружено свечение люминола при рН < 7 в растворе МаМО: и Н2СЬ (рис. 5 А). В этой области значений рН единственным продуктом реакции №N0;. и Н2О2 в эквимолярных концентрациях является

пероксинитритная кислота. Значение рН, при котором интенсивность хе-милюминесценции, обусловленной образованием продукта этой реакции с люминалом, уменьшается в два раза, соответствует величине рК, цис-формы пероксинитритной кислоты (рКа = 6,5-6,8). Показано, что цистеин, введенный в раствор ЫаМСЬ до введения НЮ^, полностью подавляет развитие свечения, а также тушит уже развившееся свечение во всем исследованном диапазоне рН (маннит и этанол не оказывают существенного влияния на развитие свечения). Нами также обнаружена спонтанная хемилю-минесценция раствора КаЫ02 и Н202, интенсивность которой на один-два порядка ниже интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценцин. Зависимость интенсивности спонтанной хемилюминесценцин. обусловленной образованием продукта реакции ЫаЫО> и НЛЭз, от рН раствора имеет вид кривой с максимумом при рН 7,0 (рис. 5 Б). Результаты анализа рН-зависимости интенсивности хемилюминесценцин, спектра хемилюминесценцин, а также данных литературы позволяют связать свечение с образованием транс-формы пероксинитритной кислоты и дезактивацией ее возбужденного состояния.

lyeiea А Ьувю g

Рис. 5. Л: рН-зависнмссть максимального значеяиг интенсивности быстрой стадии развития свечения люминала (12.5 мкМ) в растворе, содержащем 5 мМ NaN'03( 1,3), 5 .uMHjOjO. 2, 3). 10 мМ шгстеши (3.4). Б: рИ-зависимость максимального значения интенсивности спонтанной хеии-лючшнссцсшши раствора.содержащего 0,1 М NaNO, (1) и 0.1 М !. 2). 0.05 М фосфашый буфер.

В paicicie 4.4 представлены результаты изучения взаимодействия внутрюритроцитарного гемоглобина с нитрит-ионами. Показано образование metí íb-NO; в эритроцитах. Установлено, что в нормальных эритро-

цитах результатом взаимодействии внутриэритроцитариого гемоглобина с нитрит-ионами является преимущественное образование теМЬ, а в метаболически истощенных - п^НЬ-МСК Характер повреждений эритроцита, обусловленных образованием двух нитрит-модифицированных форм гемоглобина, различен. На основе результатов анализа полученных нами и литературных данных предлагается дополнить известную схему превращений внутриэритроцитариого гемоглобина реакциями образования тсМЬ-N0: и разрушения теМЪ-КСЪ с образованием пероксинитритной кислоты и радикала белка.

Глава 5 посвящена исследованию влияния УЗ на взаимодействие гемоглобина с иитрит-ионами в водных растворах в аэробных условиях и воздействия УЗ на водные и водно-спиртовые растворы НЪЫО. Озвучиваемые в аэробных условиях водные растворы содержат в больших количествах активные формы кислорода н N0,-соединения, в том числе пероксинитрит, N0, N02 - В разделе 5.1. представлены результаты изучения совместного действия нитрит-ионов и УЗ на водные растворы гемоглобина. Показано, что ультразвук ускоряет процесс окпсленшпкелеза (2+) гемоглобина (НЬСО) и увеличивает константу равновесия реакции образования и распада теШЬ-ЫО? в 5-6 раз. С другой стороны, присутствие нитрит-ионов в озвучиваемом растворе НЬСО приводит к защитному эффекту от разрушающего действия УЗ на глобин, обусловленному, по-видимому, реакцией нитрит-ионов с основным модифицирующим белок агентом — ОН-радикалом. В разделе 5.2 изложены результаты исследования изменений химической структуры №N0 в водных и водно-спиртовых растворах под действием УЗ. В отличие от озвучиваемых водных растворов НЬСЪ и НЬСО. где введение этанола защищает гемоглобин от разрушения УЗ, введение этанола в раствор №N0 способствует разрушению химической структуры гемоглобина На спектрах электронного поглощения озвучиваемых водно-спиртовых растворов НЬЫО наблюдается появление полос поглощения с максимумами при 408-422 нм я 610-620 нм, характерных для спектра поглощения хромогена-613.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

I. Систематически исследованы процессы образования л разрушения метгемоглоб ин-нитрита в водных растворах. Установлено, что меггемог-лобин-нитрит является промежуточным продуктом процесса взаимодействия ферро-форм гемоглобина с шприт-ионами, результатом которого является разрушение химической структуры гемоглобина. Процесс взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионами включает обратимую и необрати-

мую стадии. Взаимодействие нитрит-иона с атомом железа метгемоглоби-на с образованием метгемоглобин-нитрита является обратимым и удовлетворительно описывается моделью одноместного связывания [12, 13, 15, 16].

2. Установлено, что взаимодействие метгемоглобин-нитрита с перок-сидом водорода в водных растворах при рН < 7,5 приводит к необратимым изменениям структуры гемоглобина- Инициатором необратимых изменений структуры гемоглобина является пероксинитритная кислота. Показано, что аналогичные изменения структуры гемоглобина наблюдаются и при взаимодействии гемоглобина с нитрит-ионами в водных растворах, а также в водно-спиртовых растворах нитрозилгемоглобина под действием ультразвука. Обнаружено, что ультразвук ускоряет процесс окисления железа (II ) гемоглобина ннтрит-ионами. Присутствие нитрит-ионов в озвучиваемых водных растворах вызывает защитный эффект для белкового компонента гемоглобина |3-5, 8-10,17].

3. Обнаружено образование в реакции нитрита натрия с пероксидом водорода в водных растворах изомерных форм (транс и цис) пероксинит-р;ггной кислоты [1].

4. Показано, что метгемоглобин-нитрит образуется в эритроцитах человека при наличии в окружающей эритроцит среде нитрит-ионов. Уровень накопления метгемоглобин-нитрита в эритроцитах определяется их мета-боличес ким состоянием [6,7, 11,14].

5. Разработана методика определения относительных концентраций форм гемоглобина в водном растворе в процессе химических превращений типа ПЬСО-ип^НЫ-^гаеШЬ-МО!, основанная на использовании спектро-фотометричсских данных, особенность которой заключается в том, что она применима при ограниченной информации о коэффициентах экстинкцин одной из форм гемоглобина [2].

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Стародубцева М. Н., Черенкевнч С. Н., Семенкова Г. Н. Изучение взаимодействия нитрита натрия с пероксидом водорода в водных растворах методом хемилюмниесцекции /! Жури, прикладн. спектроскопии. - 1999. -Т. 66, Д» 3- С. 436-440.

2. Стародубцева М. Н., Игнатенко В. А., Черенкевич С. Н. Анализ содержания молекулярных форм гемоглобина в растворе по спектрам хзеетрон-ного поглощения // Весш Нацыян. акад. навук Беларусь Сер. бил. назчк.-1999,- ,Ч1> I,- С. 101-103.

3. Образование холеглобнна под действием свободных радикалов и веществ, содержащих азот и пероксидные группы ! В. А. Игнатенко, М. Н. Стародубцева, Б. К. Кузнецов, А. В. Лысенкова // Чернобыль: экология и здоровье.- 1996.- № З.-С. 66-71.

4. Превращение гемоглобина при его взаимодействии с нитритом натрия и лероксидом водорода / М. Н. Стародубцева, В. А. Игнатенко, С. Н. Черен-кевич, Б. К. Кузнецов, А. Л. Казущик // Морфофункциональные аспекты действия радионуклидов на процессы антенатального и постнатального развития: Сб. науч. трудов / ГоГМИ; Гл. ред. Ю. И. Бандажевский.- Гомель, 1996.-С. 131-134.

5. Стародубцева М. Н., Игнатенко В. А., Кузнецов Б. К. Структурные изменения гемоглобина в ультразвуковом поле под воздействием активных форм азота И Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности: Сб. статей / Под ред. В. Н. Турина, В. А. Кульчицкого, А. Г. Чумака.- Мн.: По-либиг, 1998.-С. 160-162.

6. Особенности взаимодействия нитрита натрия с гемоглобином в натив-ных эритроцитах человека / М. Н. Стародубцева, В. А. Игнатенко, Б. К. Кузнецов, А. В. Лысенкова // Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов: Тез. докл. междунар. симпозиума.- Гродно, 1995.-С. 219.

7. К механизму взаимодействия нитрита натрия с гемоглобином нативных эритроцитов человека / М. Н. Стародубцева, В. А. Игнатенко, Б. К. Кузнецов, А. В. Лысенкова И Международная научная конференция, посвященная 5-летию образования ГоГМИ: Тез. докл. конф., Гомель, 9-10 ноября

1995 г. / ГоГМИ - Гомель, 1995.- С.79.

8. Образование холеглобнна при окислении гемоглобина в растворе / В. А. Игнатенко, М. Н. Стародубцева, С. Н. Черенкевич, Б. К. Кузнецов, А. Л. Казущик, А. В. Лысенкова И Мод екулярно-клеточные основы функционирования биосистем: Тез. докл. 2-го съезда БОФБ, Минск, 25-27 июня

1996 г. / Б ГУ.- Минск, 1996.- С. 91.

9. Окисление нитрозилгемоглобина в водных растворзх в ультразвуковом поле / М. Н. Стародубцева, С. Н. Черенкевич, А. Л. Казущик, Б. К. Кузнецов, В. А. Игнатенко, А. В. Лысенкова /1 Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем: Тез. докл. 2-го съезда БОФБ, Минск, 25-27 июня 1996 г. /' БГУ.- Минск, 1996.- С. 127.

10. Неферментативный путь образования холеглобнна IМ. Н. Стародубцева, В. А. Игнатенко, Б. К. Кузнецов, А. Л. Казушик // Кислород и свободные радикалы: Тез. докл. междунар. симпозиума, Гродно, 19-22 ноября 1996 г. / ГТМИ.- Гродно, 1996,- С. 110-111.

И. Пути потери биологической функции эритроцитами под воздействием нитритов / М. Н. Стародубцева, В. А. Игнатенко, С. Н. Черенкевич,

Б. К. Кузнецов // Биологические механизмы эндогенной интоксикации: Тез. докл. 2-го белорусско-российск. симпозиума.- Гродно, 1997,- С. 95-96.

12. Стародубцева М. Н., Игнатенко В. А., Кузнецов Б. К. Некооперативный характер связывания нитрит-ионов с метгемоглобином // Чернобыль -Вильседе VII: Тез. докл. междунар. научн. конгресса / ГоГМИ- Гомель, 1997.-С. 88-89.

13. MetHb-NCb as an intermediate in the process of hemoglobin oxidation by nitrite / M. N. Starodubtseva, S. N. Cherenkevich, V. A. Ignatenko, В. K. Kuznetsov // Nitric Oxide: Biology and Chemistiy.- 1998,- V. 2 - P. 307.

14. Стародубцева M. HL Роль нитритов, нитратов и активных форм азота в развитии патологических процессов в крови И Экология и молодежь (Исследования экосистем в условиях радиационного и техногенного загрязнения окружающей среды): Тез, докл. 1-ой междунар. нэучно-ярактич. хон-фер., Т. 2 IГТУ.- Гомель, 1998.- С. 55-56.

15. Индуцирование нитритами необратимых изменений структуры гемоглобина I С. Н. Черенкевич, М. Н. Стародубцева, В. А. Игнатенко. Б. К. Кузнецов, А. Л. Казущик // Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем: Тез. докл. 3-го съезда БОФБ. Минск, 21-23 октября 1998 г./Ин-т фотобиол. НАНБ.- Минск, 1998.- С. 151.

16. MetHb-NQi как иитермедиат в процессе нитритного окисления гемоглобина / М. Н. Стародубцева, С. Н. Черенкевич, В. А. Игнатенко, Б. К. Кузнецов // Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем: Тез. докл. 3-го съезда БОФБ, Минск, 21-23 октября 1998 г.! Ин-т фотобиол. НАНБ.-Минск, 1998.-С. 152.

17. Starodubtsevg М. N.. IgnatenJco V. A., fjuznetsov В. К. Role of reactive nitrogen species in formation of human hemoglobin structural damaging in ultrasound field it Nitric Oxide: Biology and Chemistry.- 1998,- V. 2,- P. 307.

РЭЗЮМЕ

Старадубцава Марыя М1калаеуна Мехажзмы утварэння 1 разбурэння метгемаглабш-штрыту у растворы.

Ключавыя словы: гемаглабш, метгемаглабш-жтрыт, штразш-гемаглабж, штрыт, перакад вадароду, перакаштрытная юслата, эрытрацыт. спекграфогамегрыя гемаглабшу, хемклюмшесцэнцыя.

Аб'екты вывучэння: гемаглабш 1 эрытрацыты чалавека. Мэта працы заключаецца ва устанауленш заканамернасцей утварэння 1 разбурэння маладаследаванай формы гемаглабЗну - метгемаглабш-штрыту - у водным растворы 1 у эрытрацытах, а таксама уплыву ультрагуку на гэтыя працэсы. Асноуныя вынш працы атрыманы з выкарыстаннем аптычных метадау даследавання: спектрафотаметрьн 1 хемипомшесцэнцьп (спантаннай \ люмжол-залежнай).

Выяулены механЬм узаемаператварэння форм гемаглаб!ну 1 разбурэння яго Х1м1чнай структуры у працэсе узаемадзеяння гемаглаб1ну з штрыт-юнам1 у водным растворы, уключаючы абарачальную, звязаную з утварэннем метгемоглобш-штрыту, \ неабарачальныя, звязанныя з утварэннем метгемаглабшу 1 разбурэннем парф!рынавага кольца тема 1 глабшу. стадьн. Паказана утварэнне метгемаглабш-штрыту у эрытрацытах \ выяулены уплыу метабаш'чнага вычарпання эрытрацьггау на узровень утварэння у эрытрацытах метгемаглабш-штрыту. Установлены заканамернасш' узаемадзеяння метгемаглабш-штрыту з перакадам вадароду у водных растворах, вышкам якога з'яуляюцца неабарачальныя змяненж х1М1чнай структуры гемаглабшу, а прамежкавым прадуктам -перакс1штрыгная юслата. Паказана, цгго падобныя змяненш структуры гемаглабшу наглядаюцца пры узаемадзеянтп гемаглабшу з штрыт-юнам! у водна-стртавых растворах ттразшгемаглаб1ну пры уздзеянш ультратуку.. Экспериментальна паказана утварэнне у рэакцьп штрьпу натрыя з перакс1аам вадароду ¡замерных форм (цыс 1 транс) перакснптрытнай к!слаты. Выяулены с:нэрпчны эфскг сумеснага уздзеяння ультрагуку 1 штрьгг-юнау на водныя растворы гемаглабшу. Атрыманыя вынш могуць быць выкарыспшы для юравання працэсам1 з удзелам исларод-утрымл1ваючых злучэнняу азоту у растворах ггмаглаб1ну 1 у эрытрацытах.

Галшы прымянення: бшфшка, бя1х1м'|я, гематалопя.

РЕЗЮМЕ

Стародубцева Мария Николаевна

Механизмы образования и разрушения метгемоглобин-нитрита в растворе.

Ключевые слова: гемоглобин, метгемоглобин-нитрит, нитрозилге-моглобин, нитрит, пероксид водорода, пероксинитритная кислота, эритроцит, спектрофотометрия гемоглобина, хемилюминесценция.

Объекты исследования: гемоглобин и эритроциты человека. Цель работы состоит в установлении закономерностей образования и разрушения малоизученной формы гемоглобина - метгемоглобин-нитрита - в водном растворе и в эритроцитах, а также влияния ультразвука на эти процессы. Основные результаты работы получены с применением оптических методов исследования: спектрофотометрии и хемкпюминесценции (спонтанной и люминол-зависимой).

Выявлен механизм взаимопревращения форм гемоглобина и разрушения его химической структуры в процессе взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионами в водном растворе, включающий обратимую, связанную с образованием метгемоглобин-нитрита, и необратимые, связанные с образованием метгемоглобина и разрушением порфиринового кольца гема и глобина, стадий. Обнаружено образование метгемоглобин-нитрита в эритроцитах и выявлено влияние метаболического истощения эритроцитов на уровень образования в них метгемоглобин-нитрита. Установлены закономерности взаимодействия метгемоглобин-нитрита н перокснда водорода в водных растворах, результатом которого яазяются необратимые изменения химической структуры гемоглобину, а промежуточным продуктом -пероксинитритная кислота. Показано, что подобные изменения структуры гемоглобина наблюдаются при взаимодействии гемоглобина с нитрит-ионами и в водно-спиртовых растворах нитрозилгемоглобина под действием ультразвука. Экспериментально показано образование в реакции нитрита натрия с пероксидом водорода изомерных форм (цис и транс ).пе роке и-шпритной кислоты. Установлен синергический эффект совместного действия ультразвука и нитрит-ионов на водные растворы гемоглобина. Полученные результаты могут быть использованы для управления процессами с участием кислородсодержащих соединений азота в растворах гемоглобина и в эритроцитах.

Области применения: биофизика, биохимия, гематология.

SUMMARY

Starodubtseva Mariya Nikolayevna

Mechanisms of formation and destruction of methemoglobin-nitrite in a solution.

Key words: hemoglobin, methemoglobin-nitrite, nitrosylhemoglobin, nitrite, hydrogen peroxide, peroxynitrous acid, erythrocyte, spectrophotometry of hemoglobin, chemiluminescence.

Objects of research: human hemoglobin and erythrocytes. The purpose of work consists in the ascertainment of laws of formation and destruction of insufficiently explored hemoglobin form - methemoglobin-nitrite - in an aqueous solution and in erythrocytes, as well as ultrasound influence on these processes. The basic results of work are received with application of optical methods of research: spectrophotometry and chemiluminescence (spontaneous arid luminol-dependent).

The mechanism of transformation of hemoglobin forms and destruction of its chemical structure is revealed during interaction nf hemoglobin with nitriteions in an aqueous solution including reversible stage, connected with methemoglobin-nitrite formation, and irreversible stages, connected with methemo-globin formation and decomposition of heme porphyrin ring and globin. The methemoglobin-nitrite formation in erythrocytes are found, as well as the influence of metabolic exhaustion of erythrocytes on the level of methemoglobin-nitrite accumulation in them are revealed. The laws ofinteraction of methemoglobin-nitrite with hydrogen peroxide in aqueous solutions that results in the irreversible changes of hemoglobin chemical structure and intermediate of this process is peroxynitrous acid are ascertained. The similar changes of hemoglobin structure are shown to be observed when interacting of hemoglobin with nitrite-ions and under action of ultrasound in aqua-spirituous solutions of nitrosylhemoglobin. The formation of peroxynitrous acid isomers (cis and trans) in reaction between nitrogen nitrite and hydrogen peroxide is experimentally shown. The sinergetic effect of combined action of ultrasound and nitrite-ions on aqueous solutions of hemoglobin is described. The received results can be used for management of processes with participation oxygen-containing compounds of nitrogen in hemoglobin solutions and in erythrocytes.

Ranges application: biophysics, biochemistry, and hematology.