Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

АКТИВИРОВАННЫЙ КИСЛОРОД ВО ВЗАИМООТНОШЕНИЯХ РАСТЕНИИ РИСА И ВОЗБУДИТЕЛЯ ПИРИКУЛЯРИОЗА В СВЯЗИ ДЕЙСТВИЕМ ФУНГИЦИДОВ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "АКТИВИРОВАННЫЙ КИСЛОРОД ВО ВЗАИМООТНОШЕНИЯХ РАСТЕНИИ РИСА И ВОЗБУДИТЕЛЯ ПИРИКУЛЯРИОЗА В СВЯЗИ ДЕЙСТВИЕМ ФУНГИЦИДОВ"



госкомиссия совета министров ссср по продовольствию и закупкам

всесоюзный научно-исследовательский институт

фитопатологии

На правах рукописи

, НИКОЛАЕВ Олег Николаевич

УДК 581,071 : 502.75

АКТИВИРОВАННЫМ КИСЛОРОД ВО ВЗАИМООТНОШЕНИЯХ РАСТЕНИИ РИСА И ВОЗБУДИТЕЛЯ ПИРИКУЛЯРИОЗА В СВЯЗИ ДЕЙСТВИЕМ ОУИГИЦИДОВ .

- V Специальность: 06.01.11 т защита растений

от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Гол и цып о - 1991

Работа выполнена в лаборатории Молекулярной биологии Всесоюзного научно-исследовательского института (итопатологии Главагробиоярома при Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

ведущий научный сотрудник,

¿.А.Аверьянов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

А.м.Уинов

кандидат биологических наук,

Н.В.Гухова

Вадупая организация: Институт микробиологии и вирусологии АН Украины

Защита состоится "Л1991 г. в /¿) часов на заседании специализированного совета К.120.66.01. Всесоюзного научно-исследовательского института Аитопато* - • по адресу: 143050, Московская обл., Голицыно, ВНИИФ

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Всесоюзного НИИ фитопатологии

Автореферат разослан "//" 991 г. ^

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук ____И.Н.Якев^-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ■

Актуальность проблемы. Пирикуляриоэ - одно из наиболее вредоносных заболеваний риса, вызываемое гриОом ГуЧмДагЧа огугае, который поражает все надземные части растения. Потерн: урожая от болезни в среднем могут достигать 4-5Ж, а при эпифитотиях - 40% и более (Алешин и др., 1986). Для борьбы с пирикуляриозом применяют как специально выведенные устойчивые сорта риса, так и обработку восприимчивы! сортов фунгицидами. Несмотря на общеизвестные недостатки химических средств зашиты растений, использование фунгицидов остается важнейшим приемом в борьбе с пирикуляриозом риса, что, в частности, позволяет возделывать хозяйственно ценные, ко восприимчивые сорта. Следует отметить, что наиболее эффективные препараты против гогрикуляриоза производятся за рубежом и их применение в нашел стране требует больших валютных затрат. Отечественные же фунгициды обладают сравнительно низкой активностью, что диктует необходимость поиска новых высокоэффективных препаратов (Хаскин, Мельников, 1935).

Один из новых подходов к совершенствованию методов защити растений связан с токсичными активными формами кислорода * (ЛФК), которые являются естественными продуктами метаболизма и участвуют в самых разнообразных, проявлениях кизнедеятельности [Гг1йот1с1», '1931). Сравнительно недавно появились данные об участии АФК в процессах взаимодействия высших растений и фитопатогенных микроорганизмов. Показано, что фунгитоксичность некоторых защитных веществ растений- опосредована активными формами кислорода (Аверьянов, 1934). Имеются сведения об участии производных кислорода в проявлении сортовой и индуцированной устойчивости растений к заболеваниям (Цоке, 1983, Аверьянов и др., 1937). При атом на поверхности зараженных листьев и, по-видимому, внутри клеток образуются кислородные радикалы ¿"той и^ДОЗД^ЗД^Г "П31*зляш1ие развитие пато-

НАУЧ -¿Я I .ЛИОТЕКА Мо*,.. ■ ел о'' академии

Л-. . •. н, ' ,

Пив. Гч-э ггт!

гена. АФК участвуй; такие в поврзждапцем действии некоторых экстремальных абиотических факторов внешней среди, например, интенсивного освещения (Фрайкин и др., 1937). Поскольку все эти воздействия сопутствуют паразитизму, то патоген в естественных условиях должен Сыть достаточно резистентен к активным формам кислорода. Для защиты от АФК у всех аэробных организмов имеется различные антиокислительные системы (На111?ге11, СиПег^е, 1934). Их активность у микроорганизмов (в том числе, у паразитических) определяет чувствительность к окислительному повреждению и влияет на выживаемость.

Возможность участия активных форм кислорода- в механизме действия фунгицидов не исследована. В этой связи можно предположить, что индуцируемая химическими агентами устойчивость растений к заболеваниям, по крайней мере, в некоторых случаях может бить опосредована кислородными радикалами. Поэтому представляет интерес изучение некоторых из применяемых фунгицидов, среди которых возможно выявятся такие, которые или усиливают генерацию активного кислорода хозяином, шш, подавляя антиокислительные системы паразита, повышают его чувствительность к иммунным окислительным реакциям хозяина и к абиотическим факторам среды • Если это предположение справедливо, то, по-видимому, возможна разработка новых фунгицидов с таким же механизмом действия.

Цель и задачи работы. Цель» настоящей работы являлось изучение

*

роли активированного кислорода во взаимоотношениях растений риса и возбудителя пирикуляриоза в связи с действием Фунгицидов,

Для этого необходимо- было решить следующие задачи:;

1. Исследовать антиокислительные системы гриба РуПси1аг1а огугае Сат.

2. Провести сравнительную оценку влияния различных факторов и. в том числе, применяемы! фунгицидов

а) на активность антиокислительных систем гриоа и его чувствительность к повреждению активированным кислородом;

В) на генерацию активных форм кислорода растениями;

г) на развитие болезни:

3. Оценить возможность использования данных подходов и методов для выявления веществ с Фунгицидной активностью по отношению к пирикуляриозу риса

Научная'новизна работы. В работе впервые детально изучен антиокислительный аппарат возбудителя пирикуляриоза риса гриба Р.огу-гае ' и, в частности, измерена активность ферментов супероксиддис-мутазы-(СОД), каталазы и глютатионредуктазы, а также каталазная активность интактных спор.

Установлено, что антиокислителышй аппарат-Р.огугаз обеспечивает его выживаемость в условиях окислительного повреждения, сопутствующего паразитизму, и поэтому может быть одним из факторов патогенности гриба и потенциальной мишенью для фунгицидов.

- Экспериментально подтверждена возможность ингибировакия антиокислительных.систем различными способами, включая обработку некоторыми химическими агентами, что сенсибилизирует гриб к окислительному повреждению и приводит к ослаблению его инфекционности.

Впервые показано, что фунгициды могут действовать как стимуляторы процессов активации кислорода в растении-хозяине к (или) как ингибиторы антиокислитель) шх систем паразита.

Результаты диссертации существенно дополнили представления о механизме Фагагишшюй активности широко применяемых против пирикуляриоза pica препаратов (трициклааола, фталвда и пробеназола), з также позволили выявить фунгицидные свойства у других соединений.

Практическая ценность работы. Найден принципиально новый под-

ход к направленному. поиску фунгицидов, основанный на (1) подавлении ши. аятиокислительнах систем и, как следствие; инфекционности паразитических микроорганизмов и <2) усилении активации кислорода в зараженном растеши и, тем самым, индукции устойчивости к болезни. Разработанные метод» .'анализа могут быть использованы для скрининга веществ на фунгицидну» активность.

Апробация работы.,Материалы диссертационной работы доложены на: конференции Молодых ученых ВКШФ, Голицына, 1985; Всесоюзных' семинарах и Международной школе "Кислородные радикалы^ в химии, биологии и медицине",. Минск, Рига, Ленинград, 1986-1991; V Всесоюзном симпозиуме по фенольным соединениям, Таллинн, 1986; конференции "Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням растений". Уфа, 1933;- Г7 Всесоюзной конференции Изучение грибов в биогеоценозах", Пермь, 1988; совещании "Антропогенная экология микромицетов, аспекты математического моделирования и охрана окружающей среды",-Киев, 1990; IV Всесоюзной конференции . молодых ученых во физиологии растительной клетки, Минск, 1990; Всесоюзной конференции "Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов", Вильнюс, 1990; II съезде!Всесо-юного общества физиологов растений, Минск. 1990, семинарах Всесоюзного научно-исследовательского института фитопатологии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Объем а структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсукдения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 30 рисунков. Библиография на1 24 страницах включает 224 наименований, из них 156 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ' Работа выполнена на природном изоляте ЛГ-5-3 гриба Руг1си.1аг1а огугов Сат. и восприимчивом к нему сорте риса £Ъа11оа1зао. Часть данных получена на меленпндефищшшх непатогенных мутантах гоз-1 и а1Ь—*, полученных и описанных Т.Н.Воиновой и др. (1984). в некоторых опытах изуяали культуру а-5-3, длительно (около 30 пассаиеЯ) культивируемую на синтетической среде ("старая культура"), и тот же штамм гриба - через один пассаж после реизоляцин из растения ("реизолят").' ■*"■"'.

Исследовали антиокислителыше ■ ферменты: ката лазу,' СОД, глюта-тионпероксидазу и глютатионредуктазу. Активность супероксиддисму-тазы определяли спектрофотометрически по ингибированию восстановления нитросинего тетразолия супероксшшыми радикалами, генерируемыми в ксантиноксидазной: системе (ВецсЬашр, Гг1с1071с11, 1971). Каталазную активность препаратов измеряли (полярографически электродом Кларка) по скорости выделения кислорода в ходе* разложения перекиси водорода (Ьезз1ег, 1932) или спектрофотометрически по убыли Н^.(Ьиск. 1965). Активность' глютатяонпероксидазы измеряли по уменьшению концентрации НАДФ-Н в сопряженной реакции ре восстановления -глютатиона редухтазой (Ланкин и' др., 1981). Активность глютатионредуктазы определяли'в сходной' системе. (Ланкин- и др., 1981) по убили НАДФ-Н в реакции восстановления глютатиона редуктазой. ■ •

Меланиновую-пигментацию мишлия оценивали визуально'по окраске' колоний гриба, а пигментация спор - по спектрам поглощения споровых суспензий и методом ЭПР-спектроскопии.

Сравнивали чувствительность спор к фатоповрежденшо, даффуэатам листьев,- токсичность которых обусловлена1 активированным кислородом, и к действии радикалов , генерируемых в модельной химической система КАДН-фепазинметосульфат (Гг1ей, 1ЭТ5).

На здоровых и зараженных отрезках листьев получали капельные .диФКгзаты, Их фунгитоксичность определяли по ингибированша прорастания свенеполученных спор гриба. Генерации радикалов на поверхности листьев и в диффузатах измеряли по окислению экзогенного адреналина. •

Перечисленные выше свойства ..хозяина, и паразита исследовали также на фоне различных воздействий, способных - подавить -, развитие болезни. Среди них: варьирование условий'культивирования гриба и обработка паразита или растения коммерческими фунгицидами и веществами с предполагаемой фунгицидной активностью.

Статистическую обработку полученных д1нных проводили методами; описанными в руководстве Плохинского (1970).

РЁЗУЛЬТАШ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В работе была измерена активность антиокислительных ферментов в экстрактах из мицелия или спор гриба Р.огугое. а именно. СОД, каталазы и глитатионредуктаэы;(табл.1), а также каталазная активность интактннх спор{табл.2). ,

Активность СОД в мицелии и спорах у пигментных- мутантов была меньше, чем у природного изолята. Учитывая антиокислительные;свойства меланииового аишента (Аверьянов и др., 1987),можно заключить, что пигментные мутации приводили к ослабления:сразу нескольких антиокислительных систем

Активности ферментов зависели от условий, культивирования. Умеренное освещение, не влияя на рост колоний гриба, в несколько раз стимулировало активность СОД в споровых, экстрактах (табл.1) и каталаэную активность кнтзктных спор (табл.2). Каталазная активность интактных спор, выращенных па морковном отваре, была в несколько раз вше, чем на синтетической среде. У "старой культуры", по сравнению с "реизо ля том", активности, супероксиддисмутаза и-

Таблица I.

Активности; антиокислятельных ферментов в изделии и>спорах, выращенных в темноте и на свету на синтетической среде.

штдш ЭКСТРАКТ МИЦЕЛИЯ - ЭКСТРАКТ СПОР

ТЕМНОТА . ТШГОТА СВЕТ

ед./мг белка ед./г сух. в-ва ед./Ш* Оелка ед.Лми. спор ед./мг Оелка ед./млн. спор

Н'5-3 гоз-1 агь-1 Я-5-3 ГОЭ-1 Ы-5-3 гоз-1 агЬ-1 0.75 ±0,2 0,32 ±0,1 0,44 ±0.1 4.4 ±1,7 3.1 10,5 3.9 *0,5 Супероксгм 10,8 ±3,3 4,1 ±1.6 3,3 ±1.3 Каталазна 42 ±9 38 18 33 ±4 Гмжятюн ¡Оисмутазнс 2.3 10,5 0.83 0.74 ±0.1 [ активноо 20 17 27 14 24 15 «дукшзна, 52 ±4 52 ±2 50 ±3 ашибн-64.7" 53 32 1Ь 326 153 494 1103 487 1121 1 адоибно« 2,5 ±0,5 2,3.±0,8 2.2 ±1 ЗСЯЬ-6.1 1,21 1,13 25 13 20 ±8 22 14 эяъ 60 ±2 57 ±5 51 ±3 179 76 -50 218 И1 326 127 394 196 3,6 ±0,6 2,6 10,6 2.3 11

Таблица 2.

Каталвэкая активность интактных спор Р.огугае (ед./ылрд.сгюр),выра!цешшх при разных условиях культивирования.

ИГГАММ СИНТЕТИЧЕСКАЯ СРШ МОРКОВНЫЙ .ОТВАР

темнота свет темнота

Н-5-3 56 116 137 ±29 1728

го з-Т 161 ±32 304 ±72 972

а1Ъ-1 91 ±25 324 ±75 279

каталазы в-экстрактах спор гриба значительно уменьшались (таОл.З). Условия культивирования влияли не только на активности фермен-- тов. во и на пигментацию. Оптическая, плотность суспензии спор уменьшалась при выращивании гриба на искусственной среде по срав-

Таблица 3.

Влияние многократных пассажей на синтетической среде гриба Р.огуяае ка активности антиокислительних ферментов,.

Варианты опыта АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Экстракт спор Интакгные споры

СОЯ Каталаза Каталаза

ед./мг белка ел/млн. спор ед/мг белка ел/млн. спор ед./млрд. спор

"Старая н культура i* Реизолят" 7 12 40 ±4 • 14 ±7 65 ±6 52 ±8 112 *1Э 80 t13 310 ±23 100 »15' 105 ±24

нении с морковной и в темновой культуре по сравнению со световой (рис.1), а такие после 'многократных пассажей на искусственной питательной среде по сравнению с "реизолйтом" (на рисунке не показано ).

длина волки, ш Рис.1. Влияние состава питательной среди я освещения при культивировании гриба Р.огуъае на спектр поглощения его спор.

Штаны П-5-3. Условия кутетивироватк: (1)-скхггегкческа* среда, темнота, (2)-*о же, при освещеник.(Э)- морковный отвар, темнота.

Естествешга дредполокить, что гриб с антиокислителъным аппаратом, ослабленным не только при мутациях, но и другими способами, будет,.как и пигментные мутанты, более чувствителен к окислительному повреждении. _

Обнаружено, что споры, полученные на.синтетической среде (по сравнению с морковной), в темноаой культуре' (по сравнению со све-' товой) й в "старой культуре" (по сравнению с "реязолятом") более чувствительны к интенсивному освещению, и токсичным выделениям листьев. Это могло быть обусловлено повышенной чувствительность» .таких спор к радикалам кислорода, что подтверждено в модельной супероксяд-геверируицеа система (рис.2, табл.4).

Таблица 4.

Влияние окислительного повреждения на прорастание спор Р.огугае.

Доза каждого из повреждавши! факторов вырвкена в соответствуют« единицах, указанных по оси абсцисс на рис.2.

Условия культивирования гриба Лоза повреждения, ЕД^

Интенсивное освешеиие (клк) Диффуэат листьев (процентное содержание в пробе) Система шдн-мс (мкМ 5ЫС)

Тедаовая культура

на синтетической среде 3,2 47- 9

на морковном отваре 6,3 >100 20

Световая культура

на синтетической среде 11,2 >100 3560

"Старая культура" 0,7 15,7 1.1

"Реизолят" 8,9 >100 18

Среда без добавок 3,2 47 9

с трициклаэолом 1,3 22 1.8

с фталидом 2,1 11 4,3

с ДЦК 0.4 12 0,2

Можно предположить, что инфэкционность спор с ослабленным та-

кими приемами антиокислительным аппаратом будет ослаблена, как и в случае с мутантами.

<®<—-1-------■-------■-1—а-1--

о я * « а ю и и I» га м м

*мц*жф 4ЦЙ

Рис.2. Чувствительность выращенных в разных условиях спор Р.огугав :

к свету (А), к токсичным выделениям листьев (Б) и к радикалам

образованным в модельной химической системе (В), ■ * ■

Штамм И-5-3. Условия культивирования: (1)-синтетическая среда при освещении, (2)-морковный отвар, темнота, (3)-синтетическая среда, , ■ темнота.

Действительно, при инокуляции фрагментов листьев спорами "ста--рой культуры" гриба появлялось меньшее (приблизительное 1,5 раза) во сравнении с "реиэолятом" количество инфекционных, пятен совместимого типа. Споры с ослабленным различными способами ентио-кислите лышм аппаратом при одной и той же пониженной концентрации иноку лша (1,2 тыс.шор/мл) совсем не вызывали появления симптомов заболевания, в то время как заражение спорами." выращенными на синтетической среде при освещении, морковном отваре или полученными с ■ "реизолята", приводило при той же инфекционной нагрузке к образованию характерных инфекционных пятен совместимого типа.

- Таким образом, антиокислительные системы, обеспечивая паразиту некоторую резистентность как к иммунным реакциям хозяина, так и к 'абиотэтеским воздействиям среды,,по-видимому, являются одним из факторов патогенности.

Далее мы попытались подавить эти системы известными фунгицидами против пирпкуляриоза риса трициклазолом и фталидом, которые блокируют биосинтез меланина у пирикулярии.

Мы подтвердили (51зХег, 1986). что присутствие фунгицидов в культуральной среде гриба и в инокулше само по себе не вызывает фунги- и фитотокснческих аффектов и предотвращает развитие болезни. Внесение в почву трициклазола, но не фталида, также - полностью' защищало растения от пирикуляриоза.

Обнаружено,, что при выращивании гриба на среде с трициклазолом или с фталидом подавляется меланиповая пигментация не только мицелия; но и продуцируемых им спор. Кроме того, в экстракте спор, выращенных в присутствии фталида. была пожжена активность катала-зы и, в меньшей степени, суперокошшсмутазы по сравнению с необработанным фунгицидом грибом.

Можно предположить, что утрата тагам грибом патогенности, по крайней мере отчасти; связана с подавлением' антиокислительных

систем, и, вследствии того, с большей чувствительность» спор к окислительному повреждению. Во всех случаях гриб,- обработанный трициклазолом или фталидом, был более чувствителен к интенсивному освещению, токсичным ди4фузатам листьев и супероксидным радикалам, генерируемым в модельной химической системе (табл.4).

Следует отметить, что в опытах с добавлением Фунгицидов в культуральную среду наблюдалось лишь ослабление развития болезни. Полное подавление болезни происходило лишь тогда,.когда фунгицида, присутствовали в инфекционной капле и контактировали не только с грибом, но и с растением. Поэтому было исследовано, как влияет, на хозяина внесение фунгицидов в почву или в инокулш, а именно, на токсичность выделений листьев и генерацию в них супероксидных радикалов.

Во всех случаях обнаружено усиление токсичности диффузатов листьев по сравнению с необработанными растениями (рис.ЭА). СОЛ и каталаза в значительной степени защищали споры тест-объекта от по-. вре здания, что говорит о продукции листьями; токсичных количеств АФК. Это же подтверждается усилением окисления адреналина, которое также ингибировалось СОД (рис.ЗБ).. _

При добавлении фталида в инокулш выявлены такие же закономерности, как и с трициклазолом, а.при добавлении в почву фталид не защищал от болезни и не усиливал токсичность диффузатов листьев, и генерации в них радикалов кислорода. Следовательно, трициклазол- и фталид стимулировали активацию кислорода в растении' только, при таком способе обработки, при котором■защищали от болезни..

Таким образом, с одной стороны исследованные вещества стимулируют противоин$екционные окислительные реакции растения-хозяина, а с другой - подавляют автиокислительные механизмы патогена. Это. вероятно, делает последнего более чувствительным как; к иммунным реакциям растения, так и к абиотическим факторам среди;

Рис.3. Влияние фунгицидов трициклазола (1 ). фталида (2) и пробена-зода (3) на фунгитоксичность диффузатов листьев {А) и генерацию радикалов ОХ в дгадазатах (Б). " . '

По той же схеме был исследован другой фунгицид против пирику-ляриоза риса - пробеназол. В эффективных концентрациях это вещество также не фунги- и ф«тотоксично. Известно, что опрыскивание растений пробеназолом или добавление его в почву за несколько дней до заражения подавляет развитие пирикуляриоза.

В наших опытах внесение пробеназола-в почву за 2 дня до инокуляции полностью предотвращало развитие пирикуляриоэа. Однако,- при добавлении пробеназола в инокулш защитного эффекта не каблша-лось.

Пробеназол, добавленный в среду культивирования Р.огугав, на пигментацию мицелия и спор, чувствительность гриба к окислительному повреждению, активности антиокислителышх ферментов и патоген-ность спор не влиял. Поэтому можно предположить, что он действует только на растение.

При инкубации раствора пробеназола на здоровых (но не на зараженных) листьях токсичность их диффузатов усиливалась по сравнению с необработанными растениями (рис.ЗА). Внесение пробеназола: в почву усиливало токсичность выделений как здоровых, так и зараженных листьев..Во всех случаях токсичность ингибировалрсь СОД и каталазой.

Как и в опытах с трипиклазолом и фталидом обнаружена четкая взаимосвязь между токсичностью даффуэатов листьев и- генерацией в них супероксиддах радикалов.(рис.ЗБ),

Следовательно, и пробеназол, защищая растения от болезни, тоже стимулирует выделение листьями,активных форм кислорода в фунгиток-сичных концентрациях.

В дальнейшем был исследован диэтклдитиокербемат натрия (ДИК) -известный ингибитор медь-цинковой формы супероксиддисмутазы, которая преобладает у пирикулярии. Хотя многие другие соли дитиокарба-миновой кислоты широко применяются как Фунгициды, в литературе.

по-видимому. нет данных о способности ДДК_защищать рис от; таркку-ляриоза.

В первую очередь были проверены, его фунгицддаше свойства. Обнаружено, что это вещество значительно сникает степень развития болезни при опрыскивании.целых растений как за сутки до инокуляции, так и через двое суток после.

Добавление ДНК в культуральную среду не влияло на рост мицелия и на прорастание полученных спор., которые тем не менее были непатогенны. Выращивание Р.огугае на среде с диэтилдитиокарбаматом натрия приводило к практически полному исчезновению активности су-пероксиддиемутаэы в мицелии и спорах. При этом оказалось, что ди-тиокарбамат подавлял и пигментацию мицелия и спор гриба. Конидии, выращенные в присутствии карбамата хуже, чем в контроле, прорастали при интенсивном освещении, в диффузатах листьев и в модельной системе генерации супероксидных радикалов (табл.4). Уязвимость*, спор была выражена сильнее, чем при обработке их трициклазолом, что могло быть одной из причин их непатогенности.

Поскольку исследованные ранее фунгицида стимулировали генерацию супероксидного радикала хозяином, то аналогичные исследования были проведены и с диэтилдитиокарбаматом. Выявлено резкое усиление (более, чем в три раза) окисления адреналина на листьях, обработанных ДНК.

Следовательно, фунгицидаое действие ДДК так или иначе может быть связано с активацией кислорода.

Мы предположили, что выявленные в ходе работы закономерности могут быть использованы для поиска новых фунгицидов.

Было исследовано совершенно неизвестное как возможный фунгицид вещество - комплекс кобальта с о-фенантролином. Показано, что- это соединение способно генерировать кислородные радикалы при окислении биологических субстратов (Волышн, 1988), что позволило

предоолокить его фунгицидную активность.

Действительно, присутствие комплекса кобальта с о-фензнтроли-ном в инокулюмо пирикулярии, не вызывавшее фитотоксических эффектов ,.предотвращало болезнь. При внесение вещества в поливную воду появлялись единичные инфэкционныз пятна несовместимого типа;

Следует отметить, что фенантродиновый комплекс в изученных концентрациях не влиял ни на прорастание спор Р.огугав 1п оСТго, ни.на скорость роста колоний гриба при добавлении в среду культивирования. Кроме того» это вещество обладает низкой токсичностью по отношению к теплокровным.

При внесении исследуемого соединения в инокулюм или в поливную воду токсичность диффузатов зараженных (но не здоровых) листьев усиливалась по сравнении с необработанными растениями и практически полностью шнгибировалась суиероксиддисмутазой. во всех вариантах опыта усиление токсичности диффузатов сопровождалось возрастанием генерации в них супероксидных радикалов (табл:5).

Таблица 5.

Влияние комплекса (Со(Фгн)31(СЮ4)2 да фукгктокскчность диффуэатов зараженных листьев риса и на генерацию в диффуэатах радикалов

Способ применения испытываемого вещества йнгиоирование прорастания спор, (%) Окисление А492 адреналина ■ 102

- СОД + СОД - СОД + СОД"*

Без обработки 4*3 0*3 10 * 1 1 * 1

Нанесение на

листья 30 * 5 2 12 го * г 3*2

Внесение в почву 25 * 2 5*3 16 * 1 г * 1

Таким образом, исследованный фенактролиновый комплекс кобальта действительно обладает фунгишшюй вктивность» по отношению к пи-рикуляриозу риса, вероятно, за счет наблюдаемой стимуляции образования в растении-хозяине фунгитоксичных/активных форм кислорода.

Итак, в хода работы мы подтвердили участие активных форм кис-.

лорода в фнтоиммунитете.

Возбудитель шрикуляриоза риса при патогенезе подвергается ~ окислительному повреждению активированным кислородом. Выживаемость паразита в условиях окислительного стресса зависит от активности его антиокислителышх систем. Поэтому можно заключить, что такие: системы Р.огугав, в возможно, и других фитопатогенных грибов являются одним из факторов патогенности, помимо известных ранее. Аяти-окислителыше система могут быть заингибированы различными способами, включая обработку некоторыми химическими агентами, в том-числе фунгицидами. это сенсибилизирует гриб к окислительному повреждению и приводит к ослаблению инфекционности. Подобная эаконо-мерность мокет быть использована для защиты растений от болезней.

Мы обнаружили, что фунгишшше свойства исследованных , веществ связаны такие со стимулированием' активации кислорода в тканях растения-хозяина'. При этом противоинфекционное действие проявляет- . ся именно в тех'случаях, когда происходит гиперпродукция радикалов О" в зараженных тканях. Такими свойствами обладают как некоторые промышленные фунгициды, так и вещества, фунгицидная активность которых выявлена в настоящей работе.

Выводы диссертации и использованные вней методы, по-видимому, применимы для создания новых защитных препаратов..В частности, может быть расширен ассортимент высокоэффективных фунгицидов для зашиты риса от пирикуляриоза на базе известного класса соединений -органических комплексов кобальта, по активности превышающих широко-применяемый в СССР рицид и не уступающих самому аффективному зарубежному препарату - трициклазолу. Кроме того, исследованный комплекс менее токсичен для теплокровных (в 5 раз по сравнению о ри-цидом и трициклазолом) и'проявляет фунгицидные свойства при добавлении в поливные воды, в отличие, например, от рицвда, , используемого путем опрыскивания. Другое преимущество исследованного комп-

лекса перед испытанными наш коммерческими фунгицидами - стимуляция защитных реакций только у зараженных растений, поскольку предотвращается бесполезное включение этих реакций в отсутствие- инфекции. Следует отметить не только эффективность, но также и сравнительную дешевизну исследованного комплекса, так как- его легко получить из доступного коммерческого сырья в ходе одностадийного синтеза. , '

Таким образом мы показали, что механизм действия фунгицидов, помимо других причин, может быть, так или иначе связан с активацией кислорода. В частности, это свойственно промышленным препаратам против пирикуляриоза риса - тришпслазолу, фгалиду и пробеназо-лу.

Выводы работы существенно дополняют представления о механизма фунпщшшого действия трициклазола и фталида. Считается,; что они уменьшают механическую прочность стенки инфекционной гиф*, что лишает ее способности к проникновению в хозяина. Наши данные свидетельствуют, что такой механизм не единственный.

В.заключении можно сказать, что хотя нет оснований считать активацию кислорода главным механизмом болезнеустойчивости растений, многие примеры свидетельствуют о противоинфекдаонной-роли.соответ-ствущих реакций. Настоящая работа существенно увеличивает количество таких примеров, что может иметь не только прикладное, но и фундаментальное значение.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено существование взаимосвязи между антиокислительным потенциалом различных изолятов гриба _ Руг1си1аг1а огугае (активности супе роксиддиемутазы, каталазы и концентрация- меланина) и их патогенностью. Те же антиокислительные системы обеспечивают устойчивость патогена к избыточному освещению и ток-

сичдам выделениям листьев растения-хозяина.

Показано, что искусственное снижение антиокислительной активности, грибных клеток, путем изменения условий их культивирования или обработкой фунгицидами - ингибиторами меланшюгенеза повышает .чувствительность гриба , к окислительному повреждению и частично.или полностью:подавляет его инфекционность.^ Установлено, что противопирикуляриозная активность ряда коммерческих фунгицидов (трициклазол, фгалид, пробеназол) может быть связана не только с их непосредственным - воздействием на метаболические процессы гриба, но и по крайней мере частично обусловлена их способностью стимулировать в растениях риса генерацию фунгмтоксичных концентраций активированного кислорода Показано наличие высокой фунгицндной активности у диэтилдитио-карбамата натрия, являющегося шщш*м ингабитором супероксиддис-мутазыи биосинтеза меланина, и комплекса кобальта с о-фенан-тролином; способного генерировать кислородные радикалы при окислении биологических субстратов. Ни то, ни другое соединение в исследованных концентрациях не подавляло развитие гриба при добавлении в его.питательную среду, но обеспечивало значитель-ное:снижение интенсивности заболевания обработанных растений, сопровождающееся существенным- увеличением- скорости генерации фунгитоксдчных концентраций активированного кислорода в инфицированной растительной ткани. ,

На основании полученных данных предлагается принципиально новый подход'к поиску-средств химической защиты риса от пирикулярио'за среди ингибиторов антиокислительных систем гриба и веществ, стимулирующие активацию кислорода в растительных тканях.

Сшсок работ I опубликованных по материалам диссертации",

1. Ыухаяедханоб.С.ЗВавилова Й.Л., Ген JI.H., Ер.*олшский.- B.C.,-Воинова Г.if.» Степаникенко H.H., Николаев О.Н., Петелина г.г., Ддавахия В.Г. Поликвтидкый путь биосинтеза меланина у Tyrlcu-larla oryzae Сат. и его регуляция // Труда "V Всесоюзного симпозиума по фенольшм соединениям": Таллинн, 1986. C.J2-13.

2. Николаев О.Я., Аверьянов A.A., Мапикова fi.ff., Дхабахця В.Г. Антиокислительный механизм устойчивости гриба ij/ricularta . oryzae Cav. к экстремальным воздействиям // Тез. IV - Всесошн. конф. "Изучение грибов в биогеоценозах". Свердловск: Уральское отделение АН СССР, 1Э88. С.106.

3. Николаев O.R., Лапикова В.П., Аверьянов A.A. Возможные меха- низмы фунгицидного действия ■трициклазола // Тез. Всесоюзной

конф. "Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным Селезням*1. Уфа: Башкирский научн, центр УрО АН СССР, 1933. С.67, '

4. Вшсомзев O.ff., Лтихова'В.П.,-Аверьянов A.A., Джабахия- В.Г. ' Супероксидзависимое подавление развития гриба Pyrtcularta

1 oryzae Саг. видимым светом // Микология и фитопатология. 1988. . Т.22. #4. С.335-339.

5. Николаев Ö.H., Аверьянов A.A., Джавахия В.Г. Антиокислительные ферменты гриба fyrlcularla oryzae Сат. // Микология и фитопатология. 1989. Т.23. JS5. С.439-444.

6.-Николаев О,If., Аверьянов A.A. Влияние^ фунгицида трициклазода - на пигментацию гриба Pyrtcularta oryzae Сат. на ранних стадиях

развития // Агрохимия. 1900. Jf6. С.110-115.

7. Николаев О.Я. Изменение пигментации гриба Pyricularia oryzae . Сат. га ранних стадиях развития // Тез.. IV Все союза; конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки. Минск: Институт экспериментальной ботаники АН БССР. 1900. С.124.

е. Николаев О.И., Аверьянов A.A. Ослабление патогенности и антиокислительной активности у гриба Pyrlcularla oryzae Cav. при. длительном культивировашю на искусственной питательной среде // Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов. Вильнюс: Институт ботаники АН. Литвы, 1990, С.102-105.

9. Николаев О.И., -Дверьякоб A.A., Лапикова В.П., Джавахия В.Г. Антиокислительные свойства гриба Pyrlcularla oryzae Сат. в связи с устойчивостью к экстремальным воздействиям // Тез.. Всесоюзн. конф. "Антропогенная экология микромицетов, аспекты математического моделирования и охрана окружающей среда"; Киев: АН УССР, 1990. С.13-14.

10..Николаев О.И., Аберывюв A.A.. Лапикова 0.П., Дяаватд В.Г. Возможное участие активных форм кислорода в механизме фунги-цидного действия трициклазола // Физиология растений. 1990. Т.37. Л16. С. 161-167

11. Аверьянов A.A.. Джавахия В.Г., Лапикова В.П., Ншолаев О.Н., Петелина Г.Г. Участие активированного кислорода в иммунных реакциях растений // Тезисы докладов II съезда Всесоюзного общества физиологов растений. Минск, 1990. С.7.

12. Николаев О.Н., Аберъянов A.A. Влияние трициклазола и диэтилди-тиокарбамата натрия на антиокислительные свойства и патоген-ность гриба Pyrlcularla oryzae Car. // Агрохимия. 199t. Х2 C.I KM 17.

t3. Николаев 0.if., Аверьянов A.A. Влияние многократных пассажей на искусственной питательной среде на антиокислительные свойства и патогенность гриба Ругtcutarta oryzae Cay. // Микробиологи-■ ческий журнал. 1991. Т.53. JC2. С.45-49.

14. Николаев О.Н., Аверьянов A.A. Участие супероксидного радикала, в механизме фунгицидного действия фталида и пробеназола //

Физиалогия растений. 1991 Т.38. Ä3. С.120-128. Никоиюеб О.Н., Цоводарова. Г.Н., Колосова E.if., Аверьянов A.A., ДжаВахия В.Г.. Вольпин ¡I.E. Индукция устойчивости растений риса к пирикуляриозу под действием фенантролинового комплекса кобальта и ее возможный механизм // Доклады АН СССР. .1991. Т.316. М. С.1515-1517.