Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активные формы кислорода и антиокислительные системы во взаимодействии фитопатогенного гриба и высшего растения

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Активные формы кислорода и антиокислительные системы во взаимодействии фитопатогенного гриба и высшего растения"

На правах рукописи

АВЕРЬЯНОВ Андрей Александрович

АКТИВНЫЕ ФОРШ КИСЛОРОДА И АНТИОККСЛИТЕЛЬНКЕ СИСТЕМЫ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА И ВЫСШЕГО РАСТЕНИЯ

03.00.24 - микология 03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена на кафедре физиологии растений биологического факультета Московского государственного университета и во Всероссийском институте фитопатологии Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный консультант:

доктор биологических наук, чл.-корр. РАСХН Д.И.ЧКАНИКОВ Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор И.Б.АФАНАСЬЕВ доктор биологических наук, профессор Ю.М.ПЛОТНИКОВА доктор биологических наук, Л.И.ИЛЬИНСКАЯ

Ведущая организация: Всероссийский институт защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится "26" мая 1995 г. в часов на заседании специализированного Совета Д.053.05.65 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

2<Г

Автореферат разослан "_" апреля 1995 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

С.Н.ЛЕКОМЦЕВА

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ а.лънос:тн проблемы. Для познания природы инфекционых

болезней и борьбы с ними необходима информация о физиолого-био-химических механизмах взаимодействия хозяина и паразита. Известно, что как патогенность грибов, так и болезнеустойчивость высших растений обусловлены комплексом причин. Вопросы их конкретного содержания и относительной роли всегда актуальны. Необходимо знать, каковы слагаемые наследственно-обусловленной сортовой устойчивости, почему фитсиммунные механизмы неэффективны в совместимых комбинациях и как они зависят от окружающей среды, какие из звеньев метаболизма гриба и растения могут быть мишенью для фунгицидов. Для более полных ответов на эти вопросы представлют ценность новые подходы.

С конца 60-х годов, работами И.Фридовича, Дж.Халливелла и других установлено, что практически любые аэробные организмы продуцирует супероксидный 0сг~ и гидроксильньгй -ОН свободные радикалы, и иногда синглетный молекулярный кислород 102. Эти соединения вместе с перекисью водорода составляют группу цитоток-сичных активных форм кислорода (АФК). Их образование (в дальнейшем "активация кислорода"), как правило, усиливается при разнообразных патологических состояниях, что само вызывает новые нарушения. АФК участвуют в перекисном окислении липидов, повреждают нуклеиновые кислоты и инактивируют ферменты.

В норме активация кислорода в клетках поддерживается на безопасном уровне, благодаря повсеместно распространенным анти-окисилительным системам, включающим как ферменты, в частности супероксиддисмутазу (СОД), так и низкомолекулярные вещества.

Мы предположили участие АФК в механизме устойчивости растений к грибным болезням (в т.ч. в подавлении хозяином развития патогена). Отсюда следовало, что способность гриба детоксициро-вать АФК может быть Фактором паразитизма.

К настоящему времени справедливость этих предположений подтверждена и нами, и другими авторами. Показано, что АФК могут быть но только непосредственно токсикантами, но и участвовать в других защитных механизмах (синтез фитоалексинов, этилена, лигнина и др.) и выполнять сигнальныэ функции.

леэнеустойчивости высших растений и антиокислительных механизмов паразитического грибов как Фактора патогенности.

Изучение возможной роли АФК как фактора бо-

1. Исследовать, участвуют ли АФК в механизме фунгитоксич-

ности фенольных соединений, связанных с фитоиммунитетом.

2. Проанализировать генерацию и фунгитоксические эффекты АФК в растениях разных по болезнеустойчивости сортов; выяснить, как действуют на активацию кислорода растением физические и химические Факторы, влияющие на болезнеустойчивость.

3. Проанализировать антиокислительные системы Фитоп&тоген-кых грибов и сопоставить с патогенными свойствами у разных штаммов и в разных условиях среды.

Основные эксперименты выполнены на возбудителе пирикуляри-оза Руг1си1аг1а огу^дв Салг. и растениях риса.

Няугтъя нпвитга. Впервые сформулирована концепция, согласно которой, генерация активных форм кислорода растениями является одним из механизмов наследственной и индуцированной болезнеустойчивости, а антиокислительныэ свойства Фитопатогенных грибов - одним из факторов паразитирования. Все основные положения, вынесенные на защиту, являются принципиально новыми.

Практическая знпчянип.

1. Генерация АФК зараженными листьями, измеренная химическим или биологическим методами, мохет бьггь досимптомным признаком сортовой болезнеустойчивости. Разработан и передан во ВНИИ риса соответствующий экспресс-метод.

2. Разработка новых Фунгицидов может основываться на их способности стимулировать генерацию АФК растением-хозяином и (или) подавлять антиокислительные системы паразита.

3. Разработанные автором лабораторные методы могут применятся в различных Фундаментальных и прикладных направлениях микологии, физиологии растений и фитопатологии.

Оснпттые положения, Г-ьпюпимыр КЯ яптг-ггУ.

1. Фунгитоксичность растительных фенольных соединений может быть опосредована АФК, образующимися при их спонтанном или пероксидаэном окислении.

2. Усиленная генерация АФК на поверхности листьев риса на досимптомных стадиях пирикуляриоза свойственна ряду сортов с вертикальной и горизонтальной устойчивостью к этой болезни, но не восприимчивым сортам. АФК образуются в фунгитоксичных концентрациях и могут быть одной из причин сортовой болезнеустойчивости.

3. Устойчивость риса, к пирикуляриозу, вызванная физическим (высокая температура) и химическим (Фунгициды и другие соедине-

ния) факторами сопровождается усиленной генерацией АФК на поверхности листьев, что может быть причиной данной устойчивости.

4. Антиокислительные системы фитопатогенных грибов несут двойную нагрузку, защищая их клетки от АФК, образованных как растением-хозяином, так и самим грибам. Подавление или стимуляция этих систем изменяет в том же направлении патогенные свойства гриба. Тем самым антиокислительная способность паразита, по-видимому, является одним из Факторов его патогенности.

всесоюзных и мегдународных конференциях, тезисы хоторых опубликованы: VII и VIII совещания по иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям, Новосибирск, 1981 и Рига, 1986, IV симпозиум по фенольным соединениям, Ташкент, 1932, VII конференция по споровым растениям Средней Азии и Казахстана, Алма-Ата, 1984, IV ко1гференция "Изучение грибов в биогеоценозах", Свердловск, 1988, конференция "Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням растений", Уфа, 1988, II съезд Всесоюзного общества физиологов растений, Минск, 1990, конференция "Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов", Вильнюс, 1990, конференция "Антропогенная экология микро:.ицетов, аспекты математического моделирования и охрана окрухаюшей среда", Киев, 1990, Междунар. школа по кислородным радикалам, Ленинград, 1991, VI Междунар. кош— ресс по патологии растений, Монреаль, 1993, Международный симпозиум по естественным фенолам в устойчивости растений, Мюнхен, 1993, V Международный микологический конгресс, Ванкувер, 1994.

Кроме того, результаты были представлены на совещании "Проблемы биохимии иммунитета растений к паразитарным грибам", Москва, 1977, симпозиуме "Биохемштюминесценция", Ивано-Франковск, 1981, семинарах "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине", Москва, 1983, Минск, 1984-86,1990,1992 и Рига, 1987-89, конференции "Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения", Ялта, 1984, конференции по экологии грибои, Ташкент, 1985, конференции "Экстремальные условия существования микромицетов и охрана окрухахядей среды", Киев, 1988, конференции "Биоантиоксиданты", Москва, 1986.

в 63 статьях и авторских свидетельствах.

Объем и етруктурл диппегугпиии. Диссертация изложена на 1бО

Материалы работы доложены и обсухдены на

Помимо тезисов, результаты работы опубликованы

страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и SO рисунков и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы исследования", семи глав результатов, заключения, выводов, приложения и списка литературы из 2ЧЧ источников, включая 37 на русском языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Qfi-se rrrrs. Основная часть работы выполнена на растениях риса (Úryza sativa L.) и грибе Pyricularia oryzae Cav. (синоним Magna рог the grísea (Herbert) Barr, для совершенной стадии), вызывающем пирикуляриоэ.

Исследованы сорта иэ международного набора дифференциаторов вертикальной устойчивости к пирикуляриозу и сорта, идентифицированные во БНИИФ как горизонтально-устойчивые. Взяты целые проростки и Фрагменты листьев на агаре с бензимидазолом.

Испытано несколько штаммов гриба, в основном Н5-3 (раса 007) и его меланиндефицитные мутанты alb-l и гов-1, полученные Т.М.Воиновой и В.Г.Джавахия и любезно предоставленные автору.

Кроме того, исследованы растения хлопчатника и гороха и грибы-возбудители вилта хлопчатника (Fusarium oxysporum Schlecht, и Verticilllim dahliae Kleb.) и стеблевой ржавчины пшеницы (.Pucclnia grajnlnis Pera. f.sp. tríticí Eriks, et Herrn.).

Листья onг.т^нцй плррхлли суспензией спор возбудителя (кко-кулюм), которую распыляли или наносили отдельными каплями.

Иипуплъны* пимптпмы болппни на листьях, зараженных опрыскиванием, оценивали общепринятыми методами (Гешеле, 1978). После заражения отдельными каплями подсчитывали, какая их чо ~ть (%) дала симптомы определенного типа.

Ря.чпитие гриба мл рягггении на ранних стадиях болезни оценивали под световым микроскопом по числу проросших спор и развившихся аппрессориэв.

Пплучрпип гпрнряцу рмпр,ппний и кппрльньгх лиффузатав листъ->?н. Корни выдерживали в небольшом объеме воды или буфера. Для стимуляции выхода корневых выделений корни инкубировали в гипертоническом растворе сахарозы, затем в дистиллированной воде.

На листья наносили отдельные капли споровой суспензии или воды. После инкубации (1 сутки во влажной камере в темноте) капли собирали и удаляли оставшиеся в них споры инокулюма фильтрацией или центрифугированием. Препарат в дальнейшем называли

диффузатсм зараженных или здоровых растений, соответственно.

нению спектров их поглощения (на спектрофотометра ЗЫтасЗзи ЦУ-260 или др.) и по потреблению Оа (с электродом Кларка).

определяли по ингибированию прорастания спор и образования апп-рессориев гриба (тест-объект). Реагенты а концентрациях, не ксичных порознь, смешивали между собой и со спорами одновременно. Фиксированные после инкубации споры наблюдали под инвертированным микроскопом.

Искусственными источниками АФК были: ксантиноксидазная и другие системы (супероксидный радикал), система фентона (г-ид-рогсильний радикал), фотодинпмические красители (синглетный кислород) и непосредственно Н2О2 з разных концентрациях.

О вкладе отдельных АФК в токсичность судили по влиянию на нее веществ, детоксицирукщих АФК. Это супероксиддисмутаза (СОД) и некоторые аытиокисданты (разрушающие супероксидный радикал), каталаза (соответственно - перекись водорода), перехватчики (гидро«сильный радикал), тушители (синглетный кислород). Чтобы еыявить участие ионов металлов переменной валентности использо-Еали десферриоксамин и другие хелаторы.

Xттчзаснй янплип АФК. Неспецифическим показателем генерации АФК служила спонтанная хемилюминесценция, измеренная на квантометрической установке с фотоумножителем ФЭУ-39.

Генерацию радикала 0г~ определяли по восстановлению экзогенного цитохрона с или окислению адреналина, радикала -ОН - по обесцвечиванию р-нитрозодиметиланилина (споктрофотометрия) и выделению этилена (ГЖХ) из кето-мзтилтиомасляной кислоты, перекись водорода - по окислению фенолового красного ' пероксидазой.

окислению о-Фениленлиамина в присутствии Н2О2-

СОД в экстракте из мицелия или спор грибов определяли спектрофотометрически по подавлению восстановления нитросинвго тотразолия, глютатионпероксидазу - по расходованию НАДФ-Н при сопряженном восстановлении глютатиона редуктазой. Активность хаталазы в экстракте в интактных спорах определяли полярографически по выделению Оа из добавленой Н2О2. Для проверки ферментативной природы активности использовали ингибиторы

(цианид, азид, диэтилдитиокарбамат) и кипячение.

Теми же методами измеряли супероксиддисмутазную и каталаз-ную активности препаратов меланина. Способность препаратов перехватывать гидроксильный радикал анализировали по ингибирова-нито разрушения кето-метилтиомасляной кислоты в система Фентона, а аналогичную способность Сахаров - по подавлению обесцвечивания р-нитрозодиметиланилина в той же системе. Содержание меланина в мицелии и спорах гриба оценивали по сигналу электронного парамагнитного резонанса и по спектрам поглощения споровых суспензий в интегрирующей сфере. О содержании каротиноидов в мицелии F. охузрогит судили по поглощению экстракта при 475 км.

Показателем чувствительности к окислительному повреждению спор разных штаммов или, выращенных в разных условиях, было ин-гибированио их прорастания в диффузатах или генерирующих АФК системах.

Врдл-гг-гтаг Почти все реактивы получены от Фирм "Sigma", "Aldrich" и др. и использованы как свежеприготовленные растворы в бидистиллированной воде. Исследованы также коммерческие Фунгициды трициклазол, Фталид, пробеназол и байлетон. Фенантроли-новый комплекс кобальта был синтезирован в Институте элементо-органических соединений РАН, а Фенольные соединения хлопчатника - предоставлены Институтом биоорганической химии АН Узбекистана. Меланин выделяли из мицелия P.oryzae, пггаыма Н5-3.

Статгтгчяптя- обпаблтк-л. " Во всех измерениях подсчитывали среднее арифметическое и среднее квадратичное отклонение. Кроме того, определяли достоверность различий при р=0.05.

Саввстенствонанип мртпппп рпвпты. Для промывки и концентрирования споровых суспензий разработан концентратор. Он основан на восходящей Фильтрации поверхностного, наиболее разряженного слоя суспензии. По сравнению с центрифугированием устройство обеспечивает в 6 раз большую производительность. Для устойчивого удержания большого числа водных капель в заданных точках листьев (необходимого для дозированного локального заражения и получения диффузатов) разработан капледержатель, не касающийся листьев. Для его использования с интактными растениями предложена специальная инокуляционная камера. Для сбора с листьев инфекционных капель с одновременным удалением спор инокулюма из диФФузата разработан Фильтрующий каллесборник.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Участие активных фор« кислорода в механизма фунттоксичносги защитных веществ раствний-Болеэ1геустойчиЕость растений зависит, в частности, от фе-нолышх соединений, один из механизмов действия которых - фун-гитоксические эффекты. Мы исследовали, образуют ли растительные фенолы активированный кислород, и участвует ли он в механизме их токсичности. К началу работы было известно, что вообще фенолам это свойственно, но такие примеры практически не касались растений и грибных болезней.

Гр.чврзшш суперсксипнппп р^пикпля пои 1птпоггиплрнии_Фзно-

Автоокисление фенолов проявлялось в поглощении Ог, когда их растворы в этаноле или в кислой воде разбавляли нейтральным или слабо-щелочным буфером. Одновременно наблюдались спектральные изменения, которые ингибировались при недостатке кислорода.

Об активации кислорода при автоокислении госсипола свидетельствует вспышка хемилюминесценции, высота которой возрастала с увеличением рН и уменьшалась в присутствии каталазы и СОД. О том хе говорит ингибирование автоокисления госсипола и галловой кислоты (соответственно на 80 и 90%) супероксиддисмутазой.

Продукция радикала 0г~ (измеренная по СОД-чувствительному восстановлению цитохрома с) триоксифенолом галловой кислотой была больше, чем ¡т-диоксифенолами пирокатехином, кофейной, хло-рогеновой или протокатеховой кислотами. Монооксифенол сиреневая кислота вел себя сходно с о-диоксифенолами, а остальные моноок-сифенолы (Феруловая, ванилиновая, р-кумаровая и р-оксибенэойная кислоты) не продуцировали супероксид.

Следовательно, по крайней мере несколько обычных растительных фенольных соединений, участвующих в иммунных реакциях, являются потенциаль!{Ыми источниками кислородных радикалов. Последние могут быть одной из причин Фунпитоксичности фенолов.

фуып-гга ксичнскутъ фонола я. Учитывая многообразие химических реакций in vivo, можно полагать, что в организме большее число фенольных субстратов способно к активации кислорода, по сравнению с нашей простой моделью. Мы исследовали Феруловую кислоту, которая относительно Фунгитоксична, и с помощью веществ, деток-сиоирующих активированный кислород, попытались выявить участие последнего в ее антигрибном действии.

Феруловая кислота тормозила прорастание конидий P.oryzae.

Эффект ослаблялся СОД, каталазой и перехватчиками гидроксильно-го радикала. Результат согласуется с современными представлениями о том, что непосредственной причиной цитотоксичности, инги-бируемой СОД, служит гидроксильный радикал (или сходный продукт). Он образуется при взаимодействии супероксида и перекиси водорода в реакции Хабера-Вейсса, катализированной ионами металлов переменной валентности, чаще всего Fe3-*" или Си2-*-:

Fe3- + 02- -* Fe2- + О2 (1)

Fe2- + Н2О2 -- Fe3- + -ОН + ОН- (2)

В нашем случае о том же говорит зашита спор хелатором ионов железа диэтилентриаминпентаацетатом. Близкий результат получен с Фитоалексином хлопчатника, гемигоссиполом и (+)катехином.

Генерация АФК и. их Фунгито.ксичсскае действие при Фермента-тиянаы окислении Фрнолов. Известно, что устойчивым растениям часто свойственно как более быстрое накопление противоинфекци-окных фенолов, так и большая активация окисляющих их пероксида-зы и палифенолоксидазы. Мы исследовали возможность образования и Фунгитоксического действия АФК при реакциях этих ферментов.

Окисление пероксидазой госсипола, кофейной или хлорогеко-вой кислот проявлялось в спектральных изменениях, наиболее выраженных в полной системе субстрат+фермент+перекись водорода.

На образование АФК, в частности Ог", при пероксидазном окислении госсипола указывает хемилюминесценшш, чувствительная к СОД и более сильная и длительная, чем при автоокислении. То есть, активация кислорода идет и при пероксидазном окислении, причем интенсивнее, чем при спонтанном. Прорастание спор возбудителя вертициллезного вилта подавлялось в пероксидазной системе, сильнее всего в начале реакции, а через час не подавлялось совсем; добавление СОД полностью защищало споры. То же наблюдалось с Феруловой кислотой {рис.1). Следовательно, токсичность

Рис.1. Динамика фунгитоксич-ности системы пероксидазного окисления феруловой кислоты и влияние СОД на фуигитоксичность.

Реагенты смешаны в начальный момент, а через указанное по оси абсцисс время в систему добавлены споры Р. oryzae. Их прорастание после инкубации 5 ч указано по оси ординат.

пероксидаэной системы обусловлена не конечными стабильными продуктами, а нестойкими интермедиатами, включающими супероксид.

При пероксидазном окислении кофейной или \эрогеновой кислот тзое обнаруживалась кратковременная токсичность, полностью опосредованная 0з~. Она значительно ослаблялась перехватчиками радикала -ОН, который мог быть непосредственным токсикантом. 3 тех же у с.-у . сх полифенолоксидаза в смеси с теми же субстратами подавляла ризиитио гриба, но эффект но бил нечувствителен ни к СОД, ни к перехватчикам -ОН и, вероятно,на зависел от кислородных радикалов. Различия ферментов, видимо.объясняются тем, что в пероксидаэной система образуется семихинон, автоокисляюкийся с образованием радикала 0г_, а в лолифенолоксидазной - выход семихинона (и 0г_) значительно мэньшо. Действительно, по нашим спектральным данным, в пероксидаэной системе з первые минуты появлялся интермедиа'!, воэмогю, семихинон, а в полифенолокси-дазной - происходила только монотонная убыль исходного субстрата и накопление конечного продукта. Существенно, что СОД, добавленная в пероксидазную систему, не препятствовала образованию веществ, определяемых спектрофотометрически. Поскольку СОД и перехватчики -ОН подавляли токсичность той ге системы, можно заключить, что в данном случае токсичность была непосредственно обусловлена не столько окрашенными продуктами, сколько АФК.

Таким образом, фенольные соединения, участвующие в механизмах фитоиммунитета, ¡-^.ут подавлять развитие разных фитопа-тогенных грибов за счет генерации фунгитоксичных АФК, образующихся, например, при спонтанном или-пероксидазном окислении.

3.2. Генерация активных форм кислорода тканями растений в связи с их сортовой болезнеустойчивостыо.

Модельные системы позволяют с большой определенностью судить о протекающих в них процессах, но для окончательных выводов нужны исследования на целом организме.

Аналнч лгг-птяпии гсислорппл д ткгч(<гх ряатрнпй. Один из признаков активации кислорода - сверхслабая спонтанная хамили-минесценция, свойственная многим растениям. Неясной была ее локализация, очевидно, связанная с функциями.

Мы установили, что в гомогенате корней гороха наиболее тяжелая Фракция, обогащенная клеточными стенками, испускает света в 2 - 5 раз больше любой другой фракции. Добавление к корням

НАД-Н немедленно вызывало вспышку. Столь же быстро усиливали свечение экзогенные Н2О2 или люминол - хамилюминесцентный индикатор ка перекись. Каталаэа частично ингибировала свечение. Осмотический шок, стимулирующий выход экэометаболитов, усиливал хемилюминесценцию корней гороха и хлопчатника, что полностью блокировалось каталазой. Препарат корневых выделений стимулировал свечение необработанных корней. Следовательно, хемилюминес-центные реакции корня, по крайней мере частично, протекают на его поверхности, возможно в клеточных стенках, при участии экэометаболитов и с образованием перекиси водорода.

Мы измерили генерацию супероксидного радикала на поверхности корня гороха по окислению адреналина. Реакция наблюдалась с интактным, но не кипяченым корнем, и менее чем за 1 мин инги-бировалась экзогенной СОД. Окисление адреналина, вероятно, связано и с перекисью водорода, поскольку немедленно и полностью блокировалось каталазой и стимулировалось добавлением НгОа -Препарат корневых выделений ускорял окисление адреналина необработанным корнем и сам окислял адреналин, правда, медленее, чем корень, но так же с ингибированием СОД и каталазой и стимуляцией перекисью водорода.

Таким образом, хемилюминесцентный и химический анализы обнаружили АФК на поверхности растения. Цитотоксичность и пограничная локализация АФК позволяли предположить, что они служат химическим барьером для патогенной микрофлоры. Для проверки этой гипотезы мы сравнили здоровые и зараженные ткани растений, различающихся своей болезнеустойчивостью.

Г/>юр.чпгщ пгтпрдпыми И ллрлгргт?,rvftf пирикуляриоэпм

листыту.и риса, в свяяи с вертикальной устойчиппптию к этпй_frc.-

лр^ни. На интактной поверхности листьев риса тем же химическим методом обнаружен супероксидный радикал. На устойчивом сорте 2enith через 15 - 24 ч после заражения генерация 0z~ усиливалась в 2 -3 раза и гораздо меньше - на восприимчивом Sha-ti-ao-tsao (рис.2). Этот радикал обнаруживался и в собранных с листьев капельных диффузатах с сохранением сортовых различий. На поверхности и в диффузатах листьев устойчивого сорта химическими методами обнаружены такхе Н2О2 и -ОН.

Чтобы проверить, характерны ли сортовые различия продукции Ог", был исследован набор сортов, различающихся по вертикальной устойчивости. Диффузаты листьев в любом случае окисляли адрена-

В

в

А

V77A Й

Sl~a-tiao— tsao

Zenith

Sha-t¡ao—tcao

f.ic.

Генаращга супсрагсадетго раг.шшла листь»5( риса

разных по устойчивости сортов, здоровых и зараженных P. ory~zas и токсичность гапелымс ди^фузатов лнстьез для возбудителя.

"лена - оптическая плотность (А430 х Ю-3) адреналина, проинкубированного на поверхности листьев, з точка;:, где до этого находились капли воды (А) или споровой суспензии (В).

Справа - ингибпрсвание Cí) прорастания опер тест-сс-ьекта з диффузатах листьев.

лии, что ичг-ибиронплось coa. После capa.,- :'ч листьев устойчивых сортов реакция, как правило, усиливалась. У зараженных листьев восприимчивых сортов максимальная скорость окисления адреналина в диФФузате за перЕые два дня превышала автсокисление не более, чей вдвое, а у устойчивы;', сортов - больше, чем вдЕсе.

Следовательно, растительные ткани способны генерировать супероксидный радикал. Процесс ускоряется при пирикуляриозе. причем ранее, чем появляются симптомы, и в несовместимы-: комбинациях сильней, чем в совместим!--:. То есть, усиленная актинаиия кислорода сопутствует болезнеустойчивости, ко неясно, в качестве причини или следствия. Если сна служит причиной, подавляя развитие патогена, то, очеЕидко, что там, где образуется АФК, следовало ожидать фунгитоксических г-Ф^эктоэ, тем более сильньпс, чем интенсивнее активация кислорода, и чувствительных к химическим агентам, разрушающим АФК. Для проверки мы исследовали развитие Еозбудителя болезни на поверхности листьев и з их диф-фузатах.

Дпф'фуэаты фрагментов листьев сортов Sha-tiao-tsao и Zenith незначительно подавляли прорастание спор P.oryzae. Заражение увеличивало эту токсичность у устойчивого сорта сильнее, чем у восприимчивого (рис.2). Диффузат спор, пророщенных э той же

В

концентрации in vitro, не был токсичен. Прорастание спор гриба на листо устойчивого сорта было пояоиюно на 63% и лишь на 0% -на восприимчивом. Образование аплрассориев было эаингибировано, соответственно, до уровня 1 и 11%. То есть, фунгитоксичность диффузатов отражает антигрибные свойства листьев.

Подавление прорастания спор в диффузатах предотвращалось экзогенной СОД и веществами, детоксицирующими НгОг и -ОН, и, следовательно, связано с АФК (табл.1). Непосредственным токсикантом мог быть гидроксильный радикал (или близкий по активности продукт), образованный в реакции Хабера-Вейсса. О том свидетельствовала и защита спор хелаторами, связывающими ионы катализатора в неактивный комплекс. Существенно, что АФК (кроме Н2О2) имеют малое время жизни и, выделившись из клеток, не могут сохраняться в инфекционной капле. Поэтому АФК, обнаруженные в ухе собранном диффузате, в нем же и образуются, очевидно, при взаимодействии ранее выделенных реагентов. Последние, по-видимому, довольно быстро расходуются, так как токсичность исчезала через несколько часов инкубации диффузата до контакта со спорами (в т.ч. при +4°) или быстрее (за 30 минут) при кипячении.

Мы повторили опыты с токсичностью диффузатов на наборе сортов. У большинства устойчивых сортов этот показатель увеличивался ухе через сутки после заражения пирикуляриоэом, а у восприимчивых - если и увеличивался, то в меньшей степени. В целом, в первые 2 суток ингибирование прорастания спор в диффузате зараженных листьев восприимчивых сортов не превосходило 40%, а у устойчивых - было больше.

Таким образом, ранняя усиленная продукция АФК зараженным хозяином, по-видимому, не только признак, но и одна из причин сортовой устойчивости риса к пирикуляриозу.

Грчрря.чис? АФК 1ГГПРПГ>ЬГН1Г и зяоагеннм«и пионкуляриоаам листьями рксз я связи с гпт^антяльнай устойчивостью .г этой <?о-леэяи. Горизонтальная (частичная, рзсонеспецифическая) болезнеустойчивость отличается от вертикальной (расоспецифической) тем, что визуальные симптомы болезни качественно выглядят так хе, как и на восприимчивых растениях, но количественно выражены гораздо слабее. Горизонтальная устойчивость имеет то преимущество, что проявляется более или менее одинаково по отношению ко многим расам возбудителя, и сравнительно мал риск появления новых рас, способных ее преодолеть. Рост гриба в тканях таких

сортов подавлен по неизвестным причинам и не сопровождается сверхчувствительной реакцией (Parlevllet, 1993). Лля изучения возможного механизма антигрибной активности мы воспользовались

подходами, опробованными на вертикально устойчивых сортах.

В диффуэатах здоровых листьев горизонтально устойчивого сорта Shimokita ингибирование прорастания спор было сильнее, чем у вертикально устойчивого Zenith, а после заражения увеличивалось до большего, чем у Zenith, уровня. На обоих сортах Фунгитоксичность дифуэатов полностью' или в значительной степени устранялось хаталазой, перехватчиками гидроксильного радикала маннитом и Формиатом, а также хелатором ионов Fa3- десферриок-сиамином (табл.1). СОД, тайрон и тиомичевина не влияли на ан-

Таблица 1

Влияние ШГГИОГЧСЛИТОЛЫ1ЫХ реагентов на фунгитоксичность диффузата зараженных листьев риса сортов Zenith и Shimokita.

Ингибирование прорастания спор, X

Состав среды —

Zenith Shimokita

Диффузат То же + СОД

+ тайрон + ¡саталаза + формиат натрия + маннит + тисмочевина + мочевина + десферриоксамин -"- после кипячения

63 -5 2 О 21 25 -3 59 -2 -7

75 80 77 -8 13 -4 80 73 5 86

тигрибные свойства диффузата горизонтально устойчивого сорта, хотя подавляли их практически полностью в случае вертикально устойчивого. Кроме того, диффузат Shimokita совершенно не терял токсичности ни за сутки инкубации, ни даже после кипячения. Свет усиливал токсичность диффуэатов Zenith, но на Shimokita. Токсичность диффузата горизонтально устойчивого сорта. очевидно, связана с мнэкомолекулярными соединениями, поскольку исчезала после диализа и не устранялась добавлением протеииазы К. Возможно, что у обоих сортов токсичность диффуэатов обусловлена гидроксильным радикалом. образующимся в реакции Фентона (2). Однако, если у Zenith восстановителем участвующих в реакции ионов служит супероксид (1), то у Shimokita - другие вещества.

Горизонтально устойчивые сорта Horin 18, China 1039 и CNAB kweichow в комбинации с Н5-3 и другими штаммами вели себя в основном сходно с Shimokita. но их токсичность в незначительной степени устранялась СОД, тиомочевиной или кипячением.

Таким образом, одна из возможных причин горизонтальной устойчивости риса к пирикуляриоэу - высокая Фунгитокснчность вы-долиний ого лнстьаи. Она связана с АФК, которые образуются, по-видимому, иначе, чем у вертикально устойчивых сортов.

3.3. Гаыераиия АФК листьями растений в связи с ненаследственной болезнеустойчивостью.

Устойчивость к инфекционным болезням, зависящая от комбинации генов хозяина и паразита, проявляется только при определенных физиологических условиях. Некоторые внешние воздействия делают устойчивыми растения, восприимчивые в обычных условиях. Нас интересовало возможное участие АФК в действии этих ненаследственных факторов.

Уптойчиппгтъ риса к пирикулпрнппу. инпуиноапянная пнспкпй тампяр.чтурой. Повышение ночной температуры до уровня дневной (около 30°) придает устойчивость растениям воспримчивых сортов, в несколько раз уменьшая число и размеры инфекционных пятен совместимого типа (Катакг1аЬпап, 1967). В наших опытах это наблюдалось при инкубации зараженных Фрагментов листьев восприимчивого сорта ЗЬа-Мао^аао при 28° вместо обычных 23° (рис.3).

Рис.3. Влияниа повышенной температуры и шггиогислительных ферментов на развитие симптомов пирикуляриоэа риса.

Фрагменты листьев сорта

БЬа£1ао-1аао, сразу после эара-женния Р. огугае, инкубировали 24 ч при указанной температуре и возвращали в климатическую камеру. В инокулюм не добавляли (1) или добавляли СОД (2) или ката-лаэу (3). По оси ординат - частота несовместимых симптомов (инфекционные пятна несовместимого типа плюс бессимптомные исходы, X от общего числа инфекционных капель).

□ 1 Шг ЕЗз

Нагревание усиливало генерацию супероксидного радикала (по СОД-чувствит<?лъному окислению адреналина) п диФФузатах (здоровых и зараженных) листьев и фунгитоксичность диффуэатов. Дополнительная токсичность устранялась СОД или каталазой. Добавление этих ферментов в инокулюм полностью предотвращало вызванное нагреванием повышение устойчивости (рис.3).

Таким образом, этот вид индуцированной болезнеустойчивости связан с усиленной продукцией АФК на поверхности листьев, что подавляет раэЕитиэ паразита.

освещение поЕьгшает устойчивость риса к пирикуляриозу, очевидно, непосредственно повреждая клетки возбудителя (Hemmi, 1933). Вместе с тем дояе слабое и недолгое освещение, безразличное для прорастания спор в воде, усиливало их повреждение в диффуэатах листьев. Светозависимая токсичность, как и "темповая" компонента, устранялась СОД или каталазой и, таким образем, связана с активацией кислорода. На ппр-гикально устойчивых сортах плилипп света было сильное, чем на на восприимчивом, но не обнаруживалось на частично устойчивых.

Устойчивость к болезням разных частей одного растения не олинакова. Мы определили продукцию 0а~ и фунгитоксичность диФ-фузатов в разных точках интактного зараженного листа. Сорт Zenith превосходил Sha-tiao-tsao по обоим показателям. В распределении по длине листа они взаимно положительно коррелировали, достигая минимума в его средней части. На восприимчивом сорта в этой зоне появлялись самые крупные инфекционные пятна.

Таким образом, вызванная физическими факторами и Физиологическими различиями устойчивость растений к инфекционным болезням может быть связана с АФК.

3.4. Мохтгизм образования активировл -того кислорода, участвующего в противоинфекционних реакциях.

Хотя описано много биологических источников АФК, неясно, какие из них участвуют в фитоиммунитете. Доке (1987) пр -лполо-хил продукцию супероксидного рп г'"-яла НАДФ-Н -оксидазсй плазма-леммы. В нашем случае, однако, маловероятно, что этот мембран-но-связанный ^рмент выделялся в диффузат из непс^ре.чеденних клеток. Есть свидетельства генерации Ос- и другими связанными с Фитоиммунитетом ферментами, что было проверено нами в отношении

токсичности диФФузатов вертикально устойчивого сорта Zenith.

Известно участие пероксидазы в Фитоиммунных реакциях и образование ею супероксидного радикала. Выделение пероксидазы корнями и клеточными ¡.урами известно тоже, но для листьев

таких данных, по-видимому, не было. Мы обнаружили активность фермента в дналиэованных диффузатах листьев. В последнем случае активность составляла около Ю-7 ед./мл и у зараженных листьев была больше, чем у здоровых. Пероксидаза, присутствующая в диффузатах. в принципе может генерировать супероксид, что, однако, не исключает других возможностей.

Недавно сообщалось о ксантиноксидазной реакции как источнике 0а~. необходимом для сверхчувствительной реакции CMonta.1-bini, 1992). Нами установлено, что субстраты ксантиноксидазы ксантик и гипоксантин усиливают токсичность диФФузатов листьев. В присутствии субстратов антигрибное действие диФФузатов значительно ослаблялось СОД и в равной мере - ингибитором ксантиноксидазы аллопуринолом. Токсичность диФФузатов, утраченная после их длительной инкубация или кипячения (но не посла диализа) восстанавливалась при добавлении тех же субстратов. В этом случае она устранялась СОД или аллопуринолом полностью. Следовательно, листья риса выделяют метаболиты, образующие с субстратами ксантиноксидазы супероксидный радикал в Фунгитоксичной концентрации. Участие же самого этого фермента сомнительно, так как ксантик- и гипоксантин-зависимый источник 0z~ оказался, в отличие от ксантиноксидазы, термостабильным и низкомолекулярным. Чувствительность реакции к аллопурннолу может объясняться не специфическим ингибированием фермента, а известной способностью аллопуринола перехватывать гидроксильный радикал.

Супероксидзависимая фототоксичность выделений листьев может быть обусловлена присутствием фотосенсибилиэаторов, действующих по I механизму (через образование свободных радикалов).

Таким образом, участвующий в противоинфекционных реакциях радикал 02~, вероятно, имеет несколько источников.

3.5. Генерация АФК возбудителем болезни.

Исход болезней растений зависит от инфекционной нагрузки, которая влияет прежде всего на самого возбудителя. Развитие грибов заторможено d слишком концентрированных, но и и чрезмерно разбавленных споровых суспензиях. Экзометаболиты, служащие

тому причиной, не всегда известны. Мы попытались еыявить участие АФК з самоингибировакии развития Р. огусае.

Был найден диапазон оптимальных :;ентраций спор Р. огу-гае, вне которого прорастание было подавлено почти вдвое, а образование аппрессориеэ - еще сильнее. Добавление СОД, каталаэы или перехватчиков гидроксильного радикала не влияло на развитие гриба при оптимальных концентрациях спор, но ослабляло или уст— раняло ингибирокание развития при других концентрациях. Диффу-заты спор, причем только из разбавленных или концентрированных суспензий, ингибировали прорастание спор тест-объекта, взятых в оптимальной концентрации (рис.4). Эффект так же устранялся веществами, детоксицирумщими АФК. Образование спорами радикалов Ог- и -ОН подтверждено химическими методами.

5 ¡г О

Рис.4. Влияние концентрации спор Р. огу-гао на их прорастание.

Среда не содержала (1) или содержала (2) СОД.

10

50

200

Концентрация спор, тыс./1-1.1 Таким образом, Фитопатогенный гриб способен к активации

кислорода, в определенных условиях ингибирующей его развитие.

Некоторые грибы нуждаются в стимуляторах прорастания, например,

сахарах, выделяемых самими спорами или листьями. Возможно, что

хотя бы иногда стимуляторы фактически устраненяют самоингибиро-

вания, например, за счет перехвата радикала -ОН, о чем сказано

далее.

Механизм актигзаиии кислорода спорами Р. огух&о неясен. Сообщалось, что они выделяют пиколиновую кислоту, которая угнота-ат развитие в плотной популяции, а з комплексе с ионами железа катализирует реакцию Хабера-Вейсса. Мы, однако, не обнаружили (ВЭЖХ) пиколиновую кислоту в диффузатах проросших спор. Ее фун-гитоксичность незначительно ослаблялась каталазой, но не изменялась в присутствии СОД или перехватчиков -ОН. Поэтому участие

- la -

пиколиновой кислоты в наблюдаемых эффектах маловероятно.

Активированный кислород обусловливает повреждение растений грибным токсином церкоспорином (Daub, 1987), то есть служит фактором совместимости. У нас его роль, скорее всего, противоположна, так как концентрации инокулюма, неблагоприятные для развития гриба, были неблагоприятны и для заражения.

2. в. Антиогаслительша механизмы в связи с восприимчивостью к болезни.

Если болезнеустойчивость хотя бы отчасти зависит от активации кислорода, то ингибирование последней должно способствовать восприимчивости. Предположение вполне уместное, ибо любые аэробные клетки содержат антиокислительныэ системы, двтоксици-рующиа АФК. Возможно, что избыток такой способности растения-хозяина ослабляет его болезнеустойчивость. С другой стороны, антиокислительные системы паразита, вероятно, яетоксицируют и "собственный" активный кислород, и образованный хозяином, чем помогают преодолевать химический противоинфекциокный барьер. Абиотические экстремальные факторы также могут усиливать активацию кислорода в клетках. Очевидно, что больше шансов на выживание -имеют патогены с более мощной антиокислительной системой.

Сяудря. Высшие растения содержат много разнообразных Сахаров, с содержанием которых прямо коррелирует восприимчивость к некоторым болезням. Фитопатогенные грибы также богаты сахарами. Например, мицелий P. oryzae и уредоспоры стеблевой ржавчины на 10% состоят иэ маннита. Роль Сахаров в инфекционной патологии обычно ограничивают тем, что они служат питательным субстратом для паразита. Поскольку эти вещества перехватывают гидроксиль-ный радикал, возможно, что они также ингибируют опосредованные АФК иммунные реакции хозяина.

Мы подтвердили химическим методом способность маннита, маннозы, глюкозы, фруктозы, сахарозы, инозита и сорбита перехватывать гидроксильный радикал. Они же ослабляли подавление прорастания спор Р.огугав как в диффуэате листьев риса, так и в ■ОН-генерирующей модельной системе.

Таким образом, обычные сахара защищают клетки паразита от повреждения токсичными выделениями хозяина, чем, видимо, способствуют совместимой реакции. Возможно, что ту же роль играют другие антиокислительные реагенты, например, аминокислоты и

спирты. С этих позиций мы исследовали грибной меланин.

№е>ла.нин Р о г у.где обычно содержится в клеточных стенках. Нами исследованы также мутанты, у которых пигмент отсутствует (а1Ь-1) или замещен другими продуктами (гоэ-1). Такие мутанты, как и штамм дикого типа с искусственно нарушенным синтоэом пигмента, практически неспособны вызывать болезнь. Считается, что меланин помогает аппрессориям прикрепляться к листу и придает жесткость стенке инфекционной гифы (31з1ег, Каёзва1е, 1987). Вместе с тем у многих грибов наличие меланина сочетается с неспецифической резистентностью к экстремальным факторам. Мы предположили , что пигмент паразита также защищает последнего от неблагоприятных воздействий, сопутствующих паразитизму.

В самом деле, альбинос оказался в несколько раз чувствительнее к диффузату листьев, чем родительский штамм Н5-3, а мутант с дефектным пигментом занимал промежуточное положение (рис.5). Избыток экзогенного пигмента полностью устранял ток-

Кс»с*нтрацуя диСфумта, %

Рис.Ь. Лрорастаиио спор разных штаммов Р. огугав и диффузатв листьев риса.

По оси абсцисс -концентрация диффуэата здоровых листьев (сорта ЗЬа-^ао^эао) в разной степени разбавленного водой.

По оси ординат - прорастание (%) спор штаммов: Н5-3 (1), Н-9 (2). гоз-1 (3) и а1Ь-1 (4).

Рис. 6. Нлитдае меланина Р. огуяпа и форммата на образование гидроксильного радикала а системе феытона.

По оси абсцисс - время реакции (мин) .

По оси ординат - концентрация этилена (нл/мл), выделившегося из кето-метилтиомасля-ной кислоты в ее реакции с -ОН в системе Фентона <ре50ч + Н2О2) без добавок (1) или с добавлением 25 икг/мл меланина (2), Формиата натрия (3) или 100 мкг/мл меланина (4).

сичность диффуэата, подтверждая протекторную роль, энлогчннпга

пигмента. Мы установили, что фотоингибирование прорастания спор шггенсивным светом ослабляется СОЛ и каталазой, то есть является окислительным повреждением. По чувствительность к нему штаммы различались так же, как и к томновой токсичности диффуэатов.

Следовательно, меланин придает спорам устойчивость к этим природным экстремальным факторам. Физическое экранирование им свата может объяснить защиту от фотоповрвждения, но не от тем-нопой токсичности диффузатов. Мы предположили, что пигмент де-токсицирует АФК, участвующие в механизме повреждения клеток. Тогда повреждение спор активированным кислородом, полученным любым другим способом, должно выявить такие лез итаммовыо различия, а экзогенный меланин - быть протектором и в этих случаях.

Действительно, любая испытанная 0г~ -генерирующая система подавляла прорастание спор Р.огузае, что устранялось добавлением СОД. Так же, как и в диффузате листьев, мутант а1Ъ-1 был в насколько раз чувствительнее к ингибированию, чем штамм с нормальным меланином, а мутант гоз-1 занимал промежуточное положение . Добавление избытка препарата меланина в реакционные смеси полностью предотвращало их токсичность. То же повторялись в •ОН-генерирующей системе Фентона, при действии чистой НгОг и фотодинамичаских красителей, образующих синглетный кислород.

Добавление меланина в модальные системы после прекращения генерации в них АФК не защищало споры. По-видимому, он предотвращал, а не репарировал повреждения клеток, что могло объясняться предполоденой способностью разрушать АФК. Мы обнаружили у препарата меланина супероксиддисмутазную и каталазную активности (примерно по 0.5 ед/мг). В система Фентона он подавлял выход радикала -ОН. вероятно, за счет его перехвата (рис.6).

Следовательно, грибной меланин разрушает любые АФК и защищает гриб от вызваш!ых ими повреждений. Относительная резистентность дикого типа и, напротив, уязвимость мутантов для токсичных выделений листьев могут быть обусловлены тем, что диффу-эаты продуцируют активированный кислород, вызывающий окислительное повреждение, которое предотвращается антпокислительными свойствами меланина. Возможно, что это относится и к Фотоповреждениям. Дефицит антиокислительной способности может быть одной из причин непатогенности меланиндефицитных мутантов.

В описанных опытах штамм гоа-1 неизменно был устойчивее, чем альбинос. Возможно, что продукты нарушенного синтеза мела-

нина у гоз-1 обладают защитными свойствами, но более слабыми, чем у меланина. Действительно, препарат, выделенный из мицелия гоз-1, защищал споры от диффузатов листьев, системы Фентона и фотодинамического повреждения. Но даже в избытке этот препарат был менее эффективен, чем меланин, а препарат из alb-1 — практически не эффективен. Известно, что меланин имеет парамагнитную активность. Мы подтвердили ее наличие в мицелии, спорах и изолированном меланине из Н5-3, и отсутствие - в таких же образцах из alb-1. У гоа-1 обнаружен аналогичный сигнал ЭПР, который в мицелии и спорах был меньше, а в выделенном пигменте -примерно такой же, как у родительского штамма. Не исключено, что клетки гоа-1 содержат полимер из более ранних или побочных интермедиатов биосинтеза меланина. Такой продукт, по-видимому, обладая парамагнитными и антиокислительными свойствами, все же менее эффективен в защите от окислительного повреждения.

У природного штамма Н-9 клетки нормально пигментированы, но его развитие на листьях заикгибировано настолько же, как и штампа гоз-1. Споры Н-Э были более, чем Н5-3, чувствительны к диффузату листьев и системе Фентона. Меланин, выделенный из Н-9, в обоих случаях оказался слабым протектором, примерно таким же, как препарат из гоа-1. Возможно, по этой причине инфек-ционность игамма Н-9 крайне низка.

Далее мы исследовали, связаны ли изменения агрессивности патогенного штамма под влиянием условий среды с изменениями содержания меланина и антиокислительной способности.

Многократные пассажи патогенных грибов на искусственной среде, как известно, ослабляют их агрессивность, которая восстанавливается после заражения растений и реизоляции паразита. Это подтверждено нами на штамме Н5-3. В спорах реизолята меланина содержалось вдвое больше, чем в спорах из аксеничной культуры. В первом случае споры оказались более резистентными к диффузату листьев и интенсивному освещению. Различия могли быть связаны с разной чувствительностью спор к АФК, так как наблюдались и в 0г~ -генерирующей модельной системе.

Более интенсивная пигментация спор развивалась в культуре на морковном отваре, по сравнению со средой с гидролизатом казеина и при умеренном освещении по сравнению с темнотой. В обоих случаях споры, содержащие больше меланина, были устойчивее к диффузату листьев и другим окислительным повреждениям. При оп-

тимальной инфекционной нагрузке исход заражения не записал от условий культивирования патогена. При пониженных концентрациях инокулюма более меланизированные споры вызывали совместимые симптомы с большей частотой, то есть были более агрессивны.

Таким образом, возбудителю пирикулприоза свойственна относительная резистентность к активированному кислороду, обеспеченная, в частности, антиокислительными свойствами меланина. Утрата пигмента, уменьшение его количества или качественные нарушения в нем ослабляют стойкость гриба к окислительному повреждению, сопутствующему паразитизму, что в той или иной степени препятствует развитию болезни.

Таким образом, к известным Функциям меланина в патогенезе, очевидно, следует добавить антиокислительную. Она, однако, свойственна и другим метаболитам, в частности, Ферментам. Поэтому имело смысл исследовать основные антиокислительные ферменты гриба Р. огугао в связи с его патогенностью.

Атиокиплитпльнып Фпрмтггн Р. пгухая. Активность СОД (медь-цинковой формы) в экстрактах разрушенных спор была вдвое больше, чем в экстрактах мицелия. У пигментных мутантов в мицелии она была вдвое, а в спорах - втрое меньше, чем у родительского штамма. Каталазная активность в спорах была в 4 - 9 раз выше, чем в мицелии, но исследуемые штаммы не различал:: по данному параметру. Каталазная активность найдена и у интактных спор и при выращивании гриба на морковном отваре убывала в ряду: Н5-3, гоз-1, а1Ь-1. То есть, нарушение биосинтеза меланина у Р.огугае вследствие мутаций сопровождалось уменьшением активности СОД в мицелии и спорах, а в некоторых случаях - и ката-лазной активности интактных спор. При варьировании условий выращивания штамма Н5-3 активность СОД и каталазы в спорах менялись в том же направлении, что ¡. „сдержанно меланина.

Таким образом, активность некоторых антиокислительных Ферментов, как и меланиновая пигментация в клетках патогена изменялись и при мутациях, и под влиянием окружающей среды. Эти изменения могли быть причиной одновременных сдвигов чувствительности гриба к окислительному повреждению и, как следствие, его патогенных свойств. В то же время, учитывая разнообразие антиокислительного комплекса, можно полагать, что чувствительность Р.сгущав к АФК, зависела и от других соединений. Возможную роль еще одной группы вьществ мы изучили на примере другого гриба.

К яротиноипч и янтиакислителг-.ные Феучон-гы Каяягтит пхуярп-пт Этот фитопатогенный гриб богат каротиноидами, которые являются эффективными тушителями синглетного кислорода. Обычно их синтез индуцируется светом, причем только в аэробных условиях и, возможно, при участии АФК. О том говорит индукция каротино-генеза в темноте под действием Н2О2 и повышенная чувствительность бескаротиноидных мутантов к Фотодинамическому повреждению. Возможно, что синтез каротиноидов - в некоторой мере адап-тиЕная реакция, предотвращающая повреждение активированым кислородом. Легко допустить, что каротиноиды патогенных грибов, подобно меланинам, предохраняют паразита от АФК, образованных как в иммукнкых реакциях хозяина, так и самим грибом.

Мы исследовали два штамма Р. охуэросит, различающиеся по способности к каротиногенеэу, чтобы выяснить, как они соотносятся по активности антиокислительных ферментов в условиях окислительного стресса.

Подтверждено, что нормально 'пигментированный штамм N15 синтезирует каротиноиды только на свету, причем в среде с фотодинамическим красителем метиленовоым синим - в 7 раз интенсивнее. Альбиносный штамм N61 был лишен пигмента в любом варианте опыта. Мицелий обоих штаммов проявлял супероксиддисмутазную активность, причем свет увеличивал ее у первого и уменьшал - у второго штамма. Метиленовый синий на свету дополнительно активировал СОД у обоих штаммов, но у N15 сильнее, чем у альбиноса. Каталазная активность усиливалась на свету у обоих штаммов; краситель не влиял на нее в случае пигментированного мицелия и уменьшал - в случае неокрашенного. Во всех световых вариантах опыта активность обоих ферментов у штамма, способного к кароти-ногенезу, была выше, чем у альбиноса.

Таким образом, у штамма N15 все три компонента антиокисли-телкного комплекса были мощнее и способны к еще большему усилению при окислительном стрессе. Важно, что этот штамм как возбудитель вилта хлопчатника агрессивнее, чем N61, что помимо прочих причин, может зависеть от антиокислительной способности.

Как известно, что споры возбудителей ржавчинных болезней также богаты каротиноидами, которые таким же образом могут быть фактором патогенности.

Материалы данной главы позволяют заключить, что антиокис-

лительные системы патогенных грибов несут двойную нагрузку, защищая и от "собственного" активного кислорода, и от образованного растением-хозяином. Достаточно высокая активность этих систем, по-видимому, является одним из необходимых (но, разумеется, не достаточных) условий паразитизма.

3.7. Участив АФК в механизме действия фунгицидов.

Мы получили свидетельства участия активированного кислорода в механизме противоинфекционного действия некоторых веществ, в том числе известных Фунгицидов.

Фунгипилы кяк стимуляторы яктипяггин киолооолп_расге.ЧИ-

рм-.т.ч(типом Поскольку продукция АФК растением и сопутствующая болезнеустойчивость могут быть усилены внешними воздействиями, легко допустить, что устойчивость, вызванная фунгицидами, может, кроме известных механизмов, иметь в основе аналогичный эффект. Мы исследовали три фунгицида против пирикуляриоза - три-циклазол, фталид и пробеназол, нетоксичные для возбудителя.

Внесение любого из препаратов в дозе, полностью предотвращавшей болезнь, стимулировало продукцию супероксидного радикала в диффуэате листьев (химический тест). Этого не наблюдалось при способах обработки, не защищавших от болезни (внесение пробена-эола в инокулюм или фталида в почву) или после обработки байле-тоном, который не эффективен против пирикуляриоза. О подавлении развития паразита при участии АФК свидетельствует токсичность диФФузатов листьев, которая коррелировала с продукцией 02" и ингибировалась СОД и каталазой (рис.7).

Следовательно, в дополнение к известным механизмам указанные фунгициды, по-видимому, могут защищать от болезни, стимулируя генерацию растением-хозяином фунгитоксичных доз АФК. Не исключено, что способность веществ стимулировать активацию кислорода в растении может быть использована для выявления потенциальных фунгицидов.

В этом плане мы исследовали фенантролиновый комплекс кобальта (II), известный генерацией АФК в модельной системе. Его добавление как в инокулюм (10 мкг/мл), так и в почву (20 мг/кг) усиливало продукцию супероксидного радикала в диффузатах зараженных листьев и СОД-ингибируемую Фунгитоксичность диФФузатов. Комплекс полностью защищал рис от пирикуляриоза при обоих способах внесения, хотя не был токсичен для возбудителя.

Ь—1 * 1.ид

'"."1 ГГ)

4

к и

п К

и

К и

П К и

Рис. 7. Плнннио ло— которых фунгицидов на продукцию супероксидного радикала в диффуза-тах здоровых (слева) и эарахенных Р. о гут: а а (справа) листьоп риса и на токсичность диффузатов.

Вверху - оптическая плотность (А402 х 103) адреналина, проинкубированного в диффуэатах листьев.

Внизу - ингибировз-ние (%) прорастания спор по отношению к контролю (воде >. В верхней части каждого графика указаны вещества, добавленные в диф-фузат: СОЛ или катала-за. Под осями абсцисс обозначены диффузаты необработанных растений (К) или при внесении в инокулюм (И) или в почву (П) трициклазола (1). фталида . (2) или пробеназола (3) в дозе 0.5 мкг/мл инокулюма и 20 мг/кг почвы (1) пли, соответственно, 20 мкг/ мл и 40 мг/кг (2 и 3). Использованы фрагменты листьев сорта ¡ЗЬа-М-ао-Ъвао, инокулюм и тест-объект - штамм Н5-3.

Таким образом, химические соединения различных классов способны стимулировать активацию кислорода растением и (по крайней мере отчасти) поэтому защищать от болезни.

-I-

I

3 I

п

Ингибнуппзние янтиохислитр.пьны:у гяпйггя пягппит.ч Фунгипи-Как уже сказано, антиокислительные системы патогенного гриба могут быть эаингибированы, что повышает его чувствительность к АФК и частично или полностью лишает патогенных споистп. Мы исследовали, не оказывают ли Фунгициды такое влияние.

Упомянутые трициклазол и Фталид подавляют синтез грибного меланина, причем основной причиной зашиты от болезни считается неспособность депигментиропанного гриба к прободению клеточной

стенки хозяина (Мо1азЬик еЪ а1., 1983). Учитывая антиокислительные свойства меланина, можно полагать, что при зтом повышается чувствительность возбудителя к окислительному повреждению.

Установлено, что трициклазол или фталид в питательной среде нарушают пигментацию и мииелия, и спор. У последних, действительно, возрастала чувствительность к диффузату листьев, интенсивному свету и искусственно образованному супероксидному радикалу. Интересно, что фталид та.... е понижал активность ферментов СОД и каталазы в спорах. Чувствительность спор к окислительному повреждению, очевидно, возрастала из-за ослабления всего антиокислителького комплекса.

Был проверен также известный ингибитор СОД - диэтилдитио-карбамат. Он почти полностью лишал спори активности СОД, на затрагивая каталазы, а также ингибировал синтез меланина. Споры из обработанной культуры нормально прорастали в воде, но проявляли повышенную уязвимость к окислительным повреждениям и (возможно, отчасти поэтому) не вызывали болезнь.

Таким образом, к новостным мехшиюмам действия Фунгицидов, по-видимому, можно добавить стимуляцию образования АФК хозяином и сенсибилизацию паразита к отравлению этими продуктами.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Атмосферный кислород за редкими исключениями составляет естественный, но не нейтральный фон жизни. Помимо участия в дыхании, он вмешивается во многие биологические процессы, причем часто через образование активных форм, которые иногда играют ключевую роль. Любое универсальное явление предполагает стандартные подходы для его познания и практического использования, применимые в самых разнообразных областях. Инфекционные болезни растений - сравнительно новая область, потенциально связанная с АФК и ставшая предметом диссертационной работы.

Активировация кислорода в организме в норме поддерживается на низком фоновом уровне, но в экстремальных условиях, как правило , усиливается, и АФК ведут себя как типичные стрессовые метаболиты (Е1з^ег еЬ а1. , 1994 ) . У восприимчивых растений на поздних фазах инфекционной болезни активация кислорода являются частью процессов обширного разрушения зараженных тканей (Мерзляк, 1989; Иванова и др.,1991). На этой стадии инфекционная патология принципиально не отличается от любой другой. Тем не ме-

нее, подъем активации кислорода происходит и в противоположной ситуации, на устойчивом хозяине и ранних стадиях болезни.

Именно к последнему случаю относятся основные выводы нашей работы: (1) генерация АФК растением-хозяином служит одним из факторов болезнеустойчивости, а (2) способность паразита деток-сицировать АФК служат одним из условий его патогенности. Рисунок 8 обобщает как наши, так и литературные данные.

Противоположные последствия активции кислорода в контрастных по совместимости комбинациях. вероятно, связаны с тем, что на устойчивом хозяине этот процесс, как и сверхчувствительное некрозообразование, происходит локально, что в конечном счете локализует инфекцию. Тем самым в несовместимых комбинациях АФК служат Фактором стабилизации живой системы. а не разрушения, как в совместимых. В последнем случае гриб не испытывает угнетения, видимо, потому, что бездействуют другие защитные механизмы, а продукция АФК усиливается сравнительно медленно, и ан-

Заражение Факторы,

несовместимым вызывающие Экстремальные

патогеном болезнеустойчивость воздействия

Рис.8. Общие закономерности: активация кислорода и роль шгпюкнслителышх систем в связи с устойчивостью рлстений к инфекционным заболеваниям.

ЛНТИОКИСЛИТЕЛЫШЕ СИСТЕМЫ

тиокислительный аппарат паразита успевает адаптироваться.

Антиокислительные механизмы паразитов, по-видимому, реализуют ту же стратегию, что и грибные Ферменты, разрушающие фито-

алексины. Характер действия АФК и фитоалексинов сходен и в том, ито те и другие неспецифически цитотоксичны, но их образование специфически усиливается при заражении, хотя индукторами могут быть и абиотические факторы, совершенно нэсхохиэ с биологическими _-.;иситорами.

Стоит подчеркнуть, что активация кислорода — это малая часть процессов, защищающих растения от инфекции. Количественно очинить dkjiu« АФК и болозиеустойчииость нинозможно, поскольку эти продукты действуют и самостоятельно, и в составе других защитных реакций. Существенно, что активация кислорода - одно из самых ранних событий во взаимоотношениях хозяина и паразита. По последним данным, именно АФК служат трансмембранным сигналом, запускающим каскад иммунных реакций растения при контакте с патогеном (Mehdi, 1994). Заражение риса несовместимым штаммом P.ocyzae через 30 минут стимулирует продукцию 0з~ и только через несколько часов - активность ферментов, связанных с иммунитетом (Sekizawa et al., 1990). Еще быстрее клетки реагируют на элиситоры. В согласии с этими данными, АФК, образующиеся на поверхности листьев, могут ингибировать развитие возбудителя пи-рикулприоза на эктофитной стадии его развития. Это легко обнаруживалось по фунгитоксичности диФФузатов листьев, сопровождавшей болезнеустойчивость, вызванную разными причинами.

Время участия АФК в иммунитете, вероятно, но ограничивается первым контактом хозяина и патогена. В приобретенной системной устойчивости АФК служит посредником другого эндогенного индуктора, салициловой кислоты, что происходит позднее, на удалении от маета первичной инокуляции (Chen et al., 1993). При грибном и бактериальном заражении отмечены два пика активации кислорода, из которых только второй характерен для несовместимых комбинаций. Еще позднее наблюдается усиление перекисного окисления мембранных липидов, увеличение проницаемости мембран, сверхчувствительный некроз и синтез фитоалексинов, причем эта временная последовательность считается причинно-следственной.

Многое указывает на связь активации кислорода и сверхчувствительной реакции, хотя, судя по нашим данным, при некоторых типах устойчивости, например, горизонтальной, активация кислорода не сопряжена со сверхчувствителностью. Тогда же, когда сверхчувствительная реакция происходит, АФК, по-видимому, могут быть не только ее отдаленными индукторами, но и образовываться

во время некрогенеэа, повреждая клетки непосредственно. Возможные источники АФК в этом случав: . перекисное окисление липидов, ксантиноксидазная реакция и, как показано нами, пероксидазное окисление фенолов. В зеленых тканях можно назвать еще один потенциальный источник, хлорофилл и его производные.

Предполагается несколько путей практического применения работ, связанных с активацией кислорода. Она может быть полезным маркером для экспресс-диагностики сортовой болезнеустойчивости при селекции. Поиски химических стимуляторов активации кислорода (как хозяином, так и паразитом) могут выявить вещества, перспективные как структурная основа для новых фунгицидов. Другое возможное направление конструирования фунгицидов - изыскание ингибиторов антиокислительных систем возбудителей болезней. Выявление участия АФК может подсказать пути совершенствования биологических методов борьбы, например, иммунизации растений непатогенными формами возбудителей или их элиситорами. В этом плане интересен также микробый антагонизм, поскольку недавно появились сведения об участии АФК в нем.

В заключении напомним, что медицинские исследования активации кислорода перестали быть поисковыми н уже привели к созданию новых лекарств. Можно надеяться на аналогичный прогресс и в растениеводстве.

Ряд разделов работы выполнен при содействии сотрудников лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ В.П.Лапиковой. О.Н.Николаева. Г.Г.Петелиной, Т.Д.Пасечник и В.Г.Джавахия, которым автор выражает свою признательность.

ВЫВОДЫ

1. Некоторые фенольные соединения, участвующие в болезнеустойчивости растений, способны генеровать супероксидный радикал при спонтанном и пероксидазном окислении. Фунгитокеичность соответствующих химических систем опосредована активными Формами кислорода.

2. Интактные корни и листья растений выделяют в окружающую водную среду супероксидный радикал и перекись водорода.

3. Листья зараженных пирикуляриозом вертикально устойчивых сортов риса выделяют в инфекционую каплю супероксидный радикал, причем интенсивнее. чем листья восприимчивых сортов. За счет этого капельные диффузаты листьев устойчивых сортов более ток-

сичны для возбудителя болезни. Токсичность в основном обусловлена гидрокснльным радикалом (или сходным по активности продуктом), образующимся, по-видимому, при взаимодействии радикала 0-2~ и перекиси водорода, катализированном ионами хелеза.

4. Выделения здоровых и в большей степени зараженных пири-I. ;-ляриозом листьев горизонтально устойчивых к нему сортов также подавляют ра^иитие Р.ovyzae. Антигрибное действие, по-видимому, связано с НсОг, ионами железа и гидроксильным, но не суперок-сидкым радикалом.

5. Свет усиливает токсичность диффуэатов листьев восприимчивого и вертнкально-устойчивого, но не горизонтально устойчивого сортов риса для возбудителя пирикуляриоэа. фотоэффект опосредован НгОз и 0z~ и, возможно, служит одной из причин усиления болезнеустойчивости при интенсивном длительном освещении.

6. Высокая температура усиливает генерацию радикала в диФФузатах здоровых и зараженных пирикуляриозом листьев риса и зависящую от АФК Фунгитоксичность диффузатов, которая, по-видимому, является одной из причин болезнеустойчивости, индуцированной нагреванием.

7. Фунгициды против пирикуляриоэа, нетоксичные для возбудителя болезни (трициклаэол, фталид, пробеназол), усиливают активацию кислорода и связанную с ней токсичность диффуэатов листьев, причем только при тех способах внесения, которые защищают от болезни. Такие же свойства, включая противоинфекцион-ные, проявляет Фенантролиновый комплекс кобальта.

Q. Прористгшио спор Р. oz*yzao и чриэмирпо концоитрироиан-ных или, напротив, разбавленных суспензиях заингибировано за счет выделения ими АФК. Эффект может быть причиной слабого развития болезни при концентрациях инокулюма, неблагоприятных для прорастания.

9. Меланин Р.oryzae обладает антиокислительными свойствами и придает клеткам гриба резистентность к повреждению различными АФК. Меланиндефицитные мутанты имеют также меньшую активность антиокислительных ферментов и более чувствительны к окислительному повреждению, чем штамм дикого типа, что может быть одной из причин их непатогенности. Сходно различаются штаммы гриба Fusarium oxysporum, возбудителя вилта хлопчатника, где неспособность к синтезу каротиноидов (тушители синглетного кислорода) сочетается с меньшей активностью супероксиддисмутаэы и ка-

талаэы, а также ослабленной агрессивностью.

10. Варьирование условий культивирования гриба P. oryzae параллельно изменяет активность антиокислительного комплекса его спор и их резистентность к окислительному повреждению, что может быть причиной сопутствующих изменений агрессивности.

11. Фунгициды против пирикуляриоза трициклаэол и Фталид (но не пробеназол), а также сходно действующий диэтилдитиокар-бамат. подавляют антиокислительную способность возбудителя пирикуляриоза, что может быть одной из причин их противоинфекци-онного действия.

12. Общий вывод состоит в том. что генерация АФК растением-хозяином, служит одним из факторов болоэнеустопчивостп, а способность паразита детоксицировать АФК - одним нэ Факторов патогенности.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аверьянов A.A., Наркаропз. E.H., Романовская Л.А., Орлова И. Г. Сверхслабое свечение корней хлопчатника // Сельскохоэ. биология. 1977. Т.12. N2. С.215-221.

2. Аверьянов A.A. Камера для одновременного измерения хемилю-минесценцин и концентрации кислорода // Биол. науки. 1977. N9. С.131-134.

3. Аверьянов A.A. Устройство для тонкой регулировки температуры в экспериментальной ячейке // Биол. науки. 1978. N9. С. 115-116.

4. Аверьянов A.A., Мерзляк М.Н. . Рубин В.А. Хемилюминесценция при окислении госсипола пероксидаэой // Биохимия. 1978. Т.43. N9. С.1594-1601.

5. Погосян С.И., Аверьянов A.A., Мерзляк М.Н., Веселовский

B. А. Енеклеточная хемилюминесценция корней растений //Докл. АН СССР. 1978. Т.239. N4. С.974-976.

6. Аверьянов A.A. Микродоэатор простой конструкшт // Биол. науки. 1979. N12. С.94-95.

7. Лверья7Гов A.A., Панайотов Ч.А., Рубин Б. А. Фунгистатическое действие и хемилюминесценция системы госсипол - пероксндаэа - перекись водорода // Микол. и фитопатол. 1979. Т.13, N2.

C.115-118.

8. Аверьянов A.A. Генерация супероксидных анион-радикалов при автоокислении пирогаллола // Биол.науки. 1980. N11. С.78-81

9. Аверьянов A.A., Корнилова В.Ф., Мерзляк M. H., Панайотов Ч.А. Возможное участие супероксидных анион-радикалов в Фун-гнтоксическом действии системы пероксндазного окисления госсипола // Виол, науки. 1980. N8. С.77-79.

10. Аверьянов A.A. Генерация супероксидных анион-радикалов и перекиси водорода при аатоокислении кофейной кислоты // Биохимия. 1981. Т.46. N2. С.256-261.

11. Аверьянов A.A. , Гужова. N.B. , Мочалов В.В. Влияние света на биохимические свойства мицелия Fusarium oxyaparum Schlecht. // Микология и фитопатология. 1981. Т.15. Ы5. С.361-365.

12. Аверьянов /3..<1. Влияние света на рост разных по пигментации штаммов Pyricularla oryzae Сav. // Микол. и фитопатол. 1383. Т.17. N4. С.305-310.

13. Аверьянов Л./l. Генерация супероксидных аннон-радикалов некоторыми фенолами // Биол. науки. 1984. N7. С.39-44.

14. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Активированный кислород как возможный посредник в противоинфакционном действии растительных фенолов // Кислородные радикалы в химии и биологии. Минск: Наука и техника, 1984. С.5-13.

15. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Петелина Г. Г. Участие супероксидного радикала в механизме токсичности кофейной кислоты // Биохимия. 1984. Т.49. N2. С.321-327.

16. Аверьянов A.A. Генерация супероксидного радикала интактными корнями гороха // Физиол. раст. 1985. Т.32. N2. С.268- 273.

17. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Супероксидзависимая фунгиток-сичность выделений листьев риса // Докл. АН СССР. 19Ö5. Т.282. N4. С.1004-1006.

13. Аверьянов A.A. , Лапикова В.П. Участие активных форм кислорода в механизме токсичности форуловой кислоты // Изв. АН СССР, сор. биол. 1985. N4. С.521-527.

19. Аверьянов A.A., Исмаилов А.И. Участие супароксидного радикала в автоокислении госсипола // Биол. науки. 1.986. N5. С.76-78.

20. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Петелина Г. Г., Джавахия В. Г. Зашита грибными меланинами от фотодинамического повреждения // Изв. АН СССР, сер. биол. 1986. N4. С.541-549.

21. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Петелина Г. Г., Джавахия В. Г., Умнов А.М. , Стекольщиков М.В. Влияние меланина на ци-тотоксичность кислородных радикалов // Биохимия. 1987.

Т.52. N9. С.1539-1546.

22. Аверьянов A.A.. Лапикова В. П., Умнов A.M., Дхявахия В. Г. Генерация листьями риса радикала Ог~ в связи с устойчивостью к пирикуляриоэу // Физиол. раст. 1987, Т.34. N2. С.373- 379.

23. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. фунгитоксичность выделений листьев риса, обусловленная активными формами кислорода // Физиол. раст. 1988. Т.35. N6. С.1142-1151.

24. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Генерация кислородных радикалов фенольными соединениями в связи с иммунитетом растений // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига: Рижский медицинский институт, 1988. С.203-222.

25. Лапикова В.П., Аверьянов-А.А., Кривошевв Л.Г. Инокулятор для поверхностного капельного заражения узких листьев // Авторское свидетельство N 1412653. Открытия изобретения. 1988. N28. С.13.

26. Николаев О.Н., Лапикова В.П., Аверьянов A.A., Дхав&хня В. Г. Супероксидзависимое подавление развития гриба Pyricularia oryzae Cav. видимым светом // Микол. и Фитопатол. 1988. Т.22. N4. С.335-339.

27. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Активные формы кислорода во взаимодействии патогенных грибов и высших растений //Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями. Пущино, 1989. С.131-134.

28. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Взаимодействие Сахаров с гид-роксильным радикалом в связи с фунгитоксичностью выделений листьев // Биохимия. 1989. Т.54. N10. 0.1646-1651.

29. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Простые устройства для работы с капельными диффуэатами растений // Биол. науки. 1989. N9. С.107-111.

30. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Ослабление супероксиддисмута-зой токсичности выделений интактных листьев риса для спор Pyrxcularia oryzae. Утрата защитных сеойств этого фермента при его инкубации на листьях // Биол. науки. 1989. N2. С.85-89.

31. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Фунгитоксичность систем Ферментативного окисления о-диоксифенолов, обусловленная радикалами кислорода // Изв. АН COOP, сер. биол. 1989. N5. С.776-780.

32. Аверьянов A.A., Лапикова. В. П., Петелина Г. Г., Джавахия В. Г. Повышенная чувствительность пигментных мутантов Pyricularia oryzae к токсичным выделениям листьев риса // Физиол. раст. 1989. Т.36. N6. С.1088-1095.

33. Николаев О.Н., Аверьянов A.A., Дхавахия В. Г. Антиокислительные ферменты гриба Pyricularia oryzae Cav. // Микол. и фитопатол. 1989. Т. 23. N5. С. 439-44-1.

34. Аверьилов A.A.. Лапикова В.П. Активированный кислород как возможный фактор самоингибирования прорастания спор гриба Pyricularia oryzae // Биохимия. 1990. Т.55. N10. С. 1867-1873.

35. Дхавахия В. Г., Аверьянов A.A., Минаев В.И., Ермолинский Б. С., Воинова Т.М., Лапикова В.П., Петелина Г. Г., Вавилова H.A. Структура и функции меланина клеточной стенки микроми-цета Pyricularia oryzae Cav. - возбудителя пирикуляриоза риса // Журнал общей биологии. 1990. Т.51. N4. С.528-535.

36. Лапикова В.П., Аверьянов A.A. Применение инвертированной микроскопии и ячеистых пластин для изучения ранних стадий развития грибов // Микол. и фитопатол. 1990. Т.24. N1. С.77-81.

37. Николаев О.Н. , Аверьянов A.A. Влияние Фунгицида трициклазо-ла на пигментацию гриба Pyricularia oryzae Cav. на ранних стадиях развития // Агрохимия. 1990. N5. С.110-115.

38. Николаев О.Н., Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Дхавахия В.Г. Возможное участие активных форм кислорода в механизме Фун-гиидного действия трициклаэола // физиол. раст. 1990. Т.37. N1. С.161-168.

39. Аверьянов A.A. Активные формы кислорода и иммунитет растений // Усп. совр. биол. 1991. Т.111. N5. С.722-737.

40. Аверьянов A.A., Дхавахия В. Г., Донцов А.Е., Лапикова В. П., Островский М.А., Петелина Г. Г. Скрининг химических соединений, обладающих фунгицидной активностью и ингибирующих биосинтез меланина у возбудителей пирикуляриоза риса // Авторское свидетельство N1635094. // Открытия изобретения. 1991. N10. С.144.

41. Николаев О.Н. , Аверьянов A.A. Влияние пассажей на искусственной питательной среде на антиокислительные свойства и патогонность гриба Pyricularia oryzae Cav. // Мпкробиол. журн. 1991. Т.53. N2. С.44-49.

42. Николаев О.Н., Аверьянов A.A. Влияние трициклаэола и диэ-тилдитиокарбамата натрия на антиокислительные свойства и патогенность гриба Pyricularia oryzae Cav. // Агрохимия.

1991. N2. С.110-117.

43. Николаев О.И., Аверьянов A.A. Участие супороксидпого радикала в механизме фунгицидного действия фталида и пробоназо-ла // Физиол. раст. 1991 7.38. ЫЗ. С.512-520.

44. Николаев О.Н., Новодзрова Г.Н. , Колосова E.H., Аверьянов A.A.. Джавахия В.Г., Вольпин М.Е. Индукция устойчивости растений риса к пирикуляриоэу под действием фенантролиново-го комплекса кобальта и ее возможный механизм // Докл. АН СССР. 1991. Т.316. N6. С.1515-1517.

45. Петелина Г. Г.. Донцов А.Е., Островский И. А., Лапикова В.П.. Аверьянов A.A., Джавахия В. Г. Исследование методом ЭПР пигментов фитопатогенного гриба Pyricularia oryzae // Биол. науки. 1991. N4. С.77-80.

46. Лапикова В.П. , Аверьянов A.A. Концентратор суспензий //

1992. Авторское свидетельство N1736558.

47. Лапикова В.П., Аверьянов A.A. Концентратор с плавающим фильтродержателем для биологических суспензий // Физиол. раст. 1992 Т.39. N3. С.613-617.

48. Петелина Г. Г., Донцов А.Е., Островский М.А., Лапикова В.П., Аверьянов A.A., Николаев О.Н. , Дхявахия В.Г. Влияние некоторых Фунгицидов на сигнал ЭПР клеток возбудителя пирикуля-риоэа риса // Микробиол. журн. 1992. Т.54. N4. С.66-69.

49. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Лабораторный охлаждающий сосуд // Клинич. лабораторная диагностика. 1993. N2. С.71-72.

50. Лапикова В.П., Аверьянов A.A. Участие активных Форм кислорода в механизме устойчивости риса к пирикуляриоэу, индуцированной высокой температурой // Докл. АН. 1993. Т.329. N2. С.253-255.

51. Пасечник Т.Д., Свиридов С.И., А.А.Аверьянов, Лапикова В.П. Токсичность пиколиновой кислоты для спор Pyricularia oryzae Cav. в связи с самоингибированием их прорастания // Микол.

и фитопатол. 1993 Т.27. N3 С.38-42.

52. Averjanov A.A.. Lapikova V.P., Nlkolaev O.N., Dzhakhia V.G. Active oxygen and resistance of rice to blast disease // Plant Biotechnology and Molecular bioilogy. Ed. by Skryabin K.G. Moscow: Pu3hchlno Research Centre, 1993. P.5-16.

- об -

53. .4v-:?r'rancn-- . Laplkova V.P.. DJawakhla. V.G. Active oxygen mediates heat-induced resistance of rice plant to blaat disease Plant Science. 1Э93. V.32. Ml. P.27-34.

54. Лапикова В.П.. Аверьянов Я.Л.. Петелина Г. Г.. Коломиеи Т.И.. Коваленко Е.Л. Фунглтоксичность выделений листьев риса, связанная с сортовой устойчивостью к пирикуляриозу /'. Физиол. раст. 1Э94 Т.41. HI. С.123-129.

55. уанл-- A.A. Active oxygen and plant resistance to infective diseases // Free Radical Biology and Medicine. 1994. V.16. N1. P.9.

5ti. Аверьянов А.А. Активные формы кислорода в механизме устойчивости высших растений к инфекционным болезням // Рукопись. депонированная в ВИНИТИ 30.03.94, N778-В34. Москва: ВИНИТИ, 1994, 183 с.

57. Аверьянов А.А., Лапикова. В.П. Ксантин-эависимая Фунгиток-сичность выделений здоровых и зараженных пирикуляриозом листьев риса, связанная с супероксидным радикалом // Доклады Академии Наук. 1994. V.336. N5. Р.116-11Й.

50. Лиег'уалок .4.Л., Laplkova V.P. Active oxygen-and fungitoxl-clty of plant phenols // Acta Horticulturae. V.381. Wageningen: int. Soc. for Horticultural Sol., 1994, P.336-339.

59. Nlkolaev O.N. , Aver' yanov A.A. , Lapikova V.P., Djavakhia l/.u. Розз1Ь1е involvement of reactive oxygen зрес1ез in action of some anti-blast fungicides // Pestic. Biochem. Phy-3iol. 1Э04. V.50. P.219-228.

60. Лапикова В.П., Аверьянов А.А., Пасечник Т.Д. Устройства для получения капельных диФФузатов листьев злаков // Никол. и фитопатол. 1Э95. Т.29. N2. С.38-42.

<31. Аверьянов А.А. . Шабанова A.M. Фунгитоксичность 6-меток-си-2,З-бензоксазолпнона, не связанная с активацией кислорода // Микол. и Фитопатол. 1Э95. Т.29. N3.

62. Аверьянов А.А.. Лапикова В.П. Пероксидаэная активность выделений здоровых и зараженных пирикуляриозом листьев рисе // Докл. АН. 1995. T.3V0. N5 Р.702-704,

63. Пасечник Г.Д.. Аверьянов А.А.. Лапикова В.П.. Коваменкс Е.Д. , Чернова Н.А. Фунгитокснчность выделений листьев риса, вызванная активированным кислородом и связанная с частично! устойчивостью к пирикуляриоэу // Физиол. раст. 1а95. Т.42 N3. С.377-004.