Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Активированный кислород во взаимоотношениях растений риса и возбудителя пирикуляриоза в связи с действием фунгицидов

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Активированный кислород во взаимоотношениях растений риса и возбудителя пирикуляриоза в связи с действием фунгицидов"

ГОСКОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ

ВСЕСОЮЗНЫЙ НЛУЧНО-НССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ

ФИТОПАТОЛОГИИ

АКТИВИРОВАННЫИ КИСЛОРОД ВО ВЗАИМООТНОШЕНИЯХ РАСТЕНИИ РИСА И ВОЗБУДИТЕЛЯ ГШРИКУЛЯРИОЗА В СВЯЗИ С ДЕЙСТВИЕМ ФУНГИЦИДОВ.

Специальность: 06.01.11 - защита растеннй от вредителей и болезней

Авторе ф ера т диссертации на соискаиие ученой степени кандидата биологичсс*

На правах рукописи

НИКОЛАЕВ Олег Николаевич

УДК 581.071 : 502.75

Голицыно - 1991

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Всесоюзного научно-исследовательского института фитопатологии Главагробиопрома при Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

ведущий научный сотрудник

А.А.Аверьянов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А.М.7инов

кандидат биологических наук

Н.В.Гужова

Ведущая организация: Институт микробиологии и вирусологии АН Украины

Защита состоится "1_3" декабря 1991 г. в 10 часов на заседании специализированного совета К.120.66.01. Всесоюзного научно-исследовательского института фитопатологии по адресу: 143050, Московская обл., Голицыне, ВНИИ®

-С диссертацией-моуно-ознакомиться-в-научной-библиотеке-

Всесоюзного НИИ фитопатологии

Автореферат разослан "Ц" ноября 1991 г.

Ученый секретарь

/ /

специализированного совета, . * у

кандидат биологических наук _-■ ■■' ^И.Н.Яковлева

-1-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пирикуляриоз - одно из наиболее вредоносных заболеваний риса, вызываемое грибом Pyricularla oryzœ, который поражает все надземные части растений. Потери урожая от болезни в среднем могут достигать 4-5%, а при эпифитотиях - 40% и более (Алешин и др., 198Б). Для борьбы с лирикуляриозом применяют как специально выведенные устойчивые сорта риса, так и обработку восприимчивых сортов фунгицидами. Несмотря на общеизвестные недостатки химических средств защиты растений, использование фунгицидов остается важнейшим приемом в борьбе с пирикуляриозом риса, что, в частности, позволяет возделывать хозяйственно ценные, но восприимчивые сорта. Следует отметить, что наиболее эффективные препараты против пирикуляриоза производятся за рубежом и их применение в нашей стране требует больших валютных затрат. Отечественные же фунгициды обладают сравнительно низкой активностью, что диктует необходимость поиска новых высокоэфЦюктивных препаратов (Хаскин, Мельников, 1986).

Один из новых подходов к совершенствованию методов защити растений связан с токсичными активными формами кислорода (А<Ж), которые являются естественными продуктами метаболизма и участвуют в самых разнообразных проявлениях жизнедеятельности (Fridovich, 1981). Сравнительно недавно появились данные об участии АФК в процессах взаимодействия высших растений и фитопатогенных микроорганизмов. Показано, что фунгитоксичность некоторых защитных веществ растений опосредована активными формами кислорода (Аверьянов, 1984). Имеются сведения об участии производных кислорода в проявлении сортовой и индуцированной устойчивости растений к заболеваниям (Dote, 1983, Аверьянов и др., 1987). При этом на поверхности зараженных листьев и, по-видалому, внутри клеток образуются кислородные радикалы, в той или иной степени подавляющие развитие пато-

гена. АФК участвуют также в повреждающем действии некоторых экстремальных абиотических факторов внешней среды, например, интенсивного освещения (Фрайкин и др., 1987). Поскольку все эти воздействия сопутствуют паразитизму, то патоген в естественных условиях должен быть достаточно резистентен к активным формам кислорода. Для защиты от АФК у всех аэробных организмов имеются различные антиокислительные системы (Halliwell, Gutteridge, 1984). Их активность у микроорганизмов (в том числе у паразитических) определяет чувствительность к окислительному повреждению и влияет на выживаемость.

Возможность участия активных форм кислорода в механизме действия фунгицидов не исследована. В этой связи можно предположить, что индуцируемая химическими агентами устойчивость растений к заболеваниям, по крайней мере, в некоторых случаях может быть опосредована кислородными радикалами. Поэтому представляет интерес изучение некоторых из применяемых фунгицидов, среди которых, возможно, выявятся такие, которые или усиливают генерацию активного кислорода хозяином, или, подавляя антиокислительные системы паразита, повышают его чувствительность к иммунным окислительным реакциям хозяина и к абиотическим факторам

среды. Если это предположение справедливо;—тот-по-видимому^—

возможна разработка новых фунгицидов с таким же механизмом действия.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение роли активированного кислорода во взаимоотношениях растений риса и возбудителя пирикуляриоза в связи с действием фунгицидов.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать антиокислительные системы гриба Pyrlcularla oryzae Cav.

-32. Провести сравнительную оценку влияния различных факторов и.

в том числе, применяемых фунгицидов: а) на активность антиокислительных систем гриба и его чувствительность к повреждению активированным кислородом;

в) на генерацию активных форм кислорода растениями;

г) на развитие болезни;

3. Оценить возможность использования данных подходов и методов для выявления веществ с фунгицидной активностью по отношению к пирикуляриозу риса.

Научная новизна работы. В работе впервые детально изучен антиокислительный аппарат возбудителя пирикуляриоза риса гриба Р.огу-гае и, в частности, измерена активность ферментов супероксвддас-мутазы (СОД), каталазы и глютатионредуктазы, а также каталазная активность интактных спор.

Установлено, что антиокислителышй аппарат Р.огугае обеспечивает его выживаемость в условиях окислительного повреждения, сопутствующего паразитизму, и поэтому может быть одним из факторов патогенности гриба и потенциальной мишенью для фунгицидов.

Экспериментально подтверждена возможность ингибирования антиокислительных систем различными способами, включая обработку некоторыми химическими агентами, что сенсибилизирует гриб к окислительному повреждению и приводит к ослаблению его инфекционности.

Впервые показано, что фунгициды могут действовать как стимуляторы процессов.активации кислорода в растении-хозяине и (или) как ингибиторы антиокислителышх систем паразита.

Результаты диссертации существенно дополнили представления о механизме фунгицидной активности широко применяемых против пирикуляриоза риса препаратов (трициклазола, фталида и пробеназола)., а также позволили выявить фунгицидные свойства у других соединений.

Практическая ценность работы. Найден принципиально новый под-

ход к направленному поиску фунгицидов, основанный на (1) подавлении ими антиокислительных систем и, как следствие, инфекционности паразитических микроорганизмов и (2) усилении активации кислорода в зараженном растении и, тем самым, индукции устойчивости к болезни. Разработанные методы анализа могут быть использованы для скрининга веществ на фунгицидную активность.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на: конференции молодых ученых ВНИИФ, Голицыне, 1985; Всесоюзных семинарах и Международной школе "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине", Минск, Рига, Ленинград, 1986-1991; V Всесоюзном симпозиуме по фенольным соединениям, Таллинн, 1986; конференции "Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням растений", Уфа, 1988; IV Всесоюзной конференции "Изучение грибов в биогеоценозах", Пермь, 1988; совещании "Антропогенная экология микромицетов, аспекты математического моделирования и охрана окружающей среда", Киев, 1990; IV Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки, Минск, 1990; Всесоюзной конференции "Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов", Вильнюс, 1990; II съезде Всесоюзного общества физиологов растений, Минск; 1990, семинарах Всесоюзного научно-исследовательского института фитопатологии:

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Объеи и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 1Т4 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 30 рисунков. Библиография на 24 страницах включает 224 наименований, из них 156 иностранных авторов.

МАТЕРШ1Ы И МЕТОДЫ

Работа выполнена на природном изолятз И-5-3 гриба РуПси1аг1а огугае Са?. и восприимчивом к нему сорте риса Shatloataao. Часть данных получена на меланиндефицитных непатогенних мутантах гоз-1 и а1Ь-1, полученных и описанных Т.М.Воиновой и др. (1984). В некоторых опытах изучали культуру Н-5-3, длительно (около 30 пассажей) культивируемую на синтетической среде ("старая культурз"), и тот же штамм гриба - через один пассаж после реизоляции из растения ("реизолят").

Исследовали антиокислительные ферменты: каталазу, СОД, глюта-тионпероксидазу и глютатионредуктазу. Активность супероксиддисму-тази определяли споктрофотометрически по ингибированию восстановления нитросинего тетразолия супороксидными радикалами, генерируемыми в ксантиноксидазной системе (ВеисЬашр, Гг1йо71сЬ, 1971). Каталазную активность препаратов измеряли (полярографически электродом Кларка) по скорости выделения кислорода в ходе разложения перекиси водорода (Ьезз1ег, 1982) или спектрофотометрически по убыли Н2Р2 (Ьиск, 1965). Активность глшатионпероксидазы измеряли по уменьшению концентрации 1ЩФ-Н в сопряженной реакции ревосста-вовления глютатиона редуктазой (Ланкин и др., 1981). Активность глютатионредуктазы определяли в сходной системе (Ланкин и др., 1981) по убыли НАДФ-Н в реакции восстановлегаш глютатиона редуктазой.

Мелашшовую пигментацию мицелия оценивали визуально по окраске колоний гриба, а пигментацию спор - по спектрам поглощения споровых суспензий и методом ЭПР-спектроскопии.

Сравнивали чувствительность спор к фотоповреждению, диффузатам листьев, токсичность которых обусловлена активированным кислородом, и к действию радикалов 0^, генерируемых в модельной химической системе НАДН-феназишетосульфат (Гг1е<1, 1975).

На здоровых и зараженных отрезках листьев получали капельные доффузаты. Их фунгитоксичность определяли по ингиОировашта прорастания свекеполученных спор гриба. Генерацию радикалов на поверхности листьев и в диффузатах измеряли по окислению экзогенного адреналина.

Перечисленные выше свойства хозяина и паразита исследовали также на фоне различных воздействий, способных подавить развитие болезни. Среди них: варьирование условий культивирования гриба и обработка паразита или растения коммерческими фунгицидами и веществами с предполагаемой фунгицидной активностью.

Статистическую обработку полученных д&нных проводили методами, описанными в руководстве Плохинского (1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕН®

В работе была измерена активность антиокислительных ферментов в экстрактах из мицелия или спор гриба Р.огцгае, а именно СОЛ, каталазы и глютатионредуктазы (табл.1), а также каталазная активность интактных спор (табл.2).

Активность СОД в мицелии и спорах у пигментных мутантов была меньше, чем у природного изолята. Учитывая антиокислительные свойства "меланинового -пигмента - < Аверьянов-и-др., -1987-),—можно_закляв.

чить, что пигментные мутации приводили к ослаблению сразу нескольких антиокислительных систем.

Активности ферментов зависели от условий культивирования. Умеренное освещение, не влияя на рост колоний гриба, в несколько раз стимулировало активность СОД в споровых экстрактах (табл.1) и каталазную активность интактных спор (табл.2). Каталазная активность интактных спор, выращенных на морковном отваре, была в несколько раз выше, чем на синтетической среде. У "старой культуры", по сравнению с "реизолятом", активности супероксиддисмутаэы и

Таблица 1.

Активности антиокислительных ферментов в иицельш и спорах, выращенных в темноте и на свету на синтетической среде.

ИГАММ Н-5-3 гоз-1 а1Ъ-1 Н-5-3 гоз-1 а\Ъ-1 Н-5-3 гоз-1 а1Ь-1 ЭКСТРАКТ МИЦЕЛИЯ ЭКСТРАКТ СПОР

ТЕМНОТА ТЕМНОТА СВЕТ

ед./мг белка ед./г сух. в-ва ед./мг белка ед./млн. спор ед./мг белка ед./млн. спор

0,75 ±0,2 0,32 ±0,1 0,44 ±0,1 4.4 ±1,7 3,1 ±0,5 3,9 ±0,5 Супероксгл 10,8 ±3,3 4,1 ±1,6 3,3 ±1,3 Калшазна 42 ±9 38 ±8 33 ±4 Глстатион, Юисмутазнс 2,3 ±0,5 0,83 0,74 ±0,1 е активное! 20 ±7 27 ±4 24 ±5 эедуктазна. 52 ±4 5.2 ±2 50 ±3 1Я активы 64,7 53 32 1Ь 326 ±53 494 ±103 487 ±121 [ активно 2,5 ±0,5 2,3 ±0,8 2,2 ±1 ость 6,1 1,21 1,13 25 ±3 20 ±8 22 ±4 жъ 60 ±2 57 ±5 51 ±3 179 76 50 218 ±11 326 ±27 394 ±96 3,6 ±0,6 2,6 ±0,6 2,3 ±1

Таблица 2.

Каталазная активность интактных спор Р.огугае (ед./илрд.спор), выращенных при разных условиях культивирования.

СИНТЕТИЧЕСКАЯ МОРКОВНЫЙ

ШТАММ СРЕДА ОТВАР

темнота свет темнота

Н-5-3 56 ±16 137 ±29 1728

гоз-1 161 ±32 304 ±72 972'

а1Ъ-1 91 ±25 324 ±75 279

каталазы в экстрактах спор гриба значительно уменьшались (табл.3).

Условия культивирования влияли не только на активности ферментов, но и на пигментацию. Оптическая плотность суспензии спор уменьшалась при выращивании гриба на искусственной среде по срав-

Таблица 3.

Влияние многократных пассажей на синтетической среде гриба Р.огугае на активности антиокислительных ферментов.

' АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Варианты опыта Экстракт спор Интактные споры

СОЛ Каталаза Каталаза

ед./мг белка ед/млн. спор ед/мг белка ед/млн. спор ед./млрд. спор

"Старая и культура 7 ±2 ' 14 ±7 52 ±8 80 ±13 100 ±15

Реизолят" 40 ±4 65 ±6 112 ±13 310 ±23 105 ±24

нению с морковной и в темновой культуре по сравнению со световой (рис.1), а также после многократных пассажей на искусственной питательной среде по сравнению с "реизолятом" (на рисунке не показано ).

длина волны, ни Рис.1. Влияние состава питательной среды и освещения при культивировании гриба Р.огугае на спектр поглощения его спор.

ШтаииЛ-5—3. Условия культивирования : (1)-синтетическая среда, теинота, (2)-то же, при освещении,(3)- иорковный отвар, теинота.

Естествегаю предположить, что гриб с антиокислительным аппаратом, ослабленным не только при мутациях, но и другими способами, будет, как и пигментные мутанты, более чувствителен к окислительному повреждению.

Обнаружено, что споры, полученные на синтетической среде (по сравнению с морковной), в темновой культуре (по сравнению со световой) и в "старой культуре" (по сравнению с "реизолятом"), более чувствительны к интенсивному освещению и токсичным выделениям листьев. Это могло быть обусловлено повышенной чувствительностью таких спор к радикалам кислорода, что подтверждено в модельной супероксид-генерирующей системе (рис.2, табл.4).

Таблица 4.

Влияние окислительного повреждения на прорастание спор Р.огугае.

Доза каждого из повреждающих факторов выражена в соответствующих единицах, указанных по оси абсцисс на рис.2.

Условия культивирования гриба Доза повреждения, ДД,5

Интенсивное освещение (клк) Диффузат листьев (процентное содержание в пробе) Система НАДННШС (мкМ ФМС)

Темновая культура

на синтетической среде 3,2 47 9

на морковном отваре 6,3 >100 20

Световая культура

на синтетической среде 11,2 >100 3560

"Старая культура" 0,7 15,7 1,1

"Реизолят" 8,9 >100 18

Среда без добавок 3,2 47 9

-и- с трициклазолом 1.3 22 1,5

-н- с фталидом 2,1 11 4,3

-«- с ДДК 0,4 12 0,2

Можно предположить, что инфекционность спор с ослабленным такими приемами антиокислительным аппаратом будет ослаблена, как и в случае с мутантами.

100

во

20

ЕД^, освещенность (клк): I - 36.2 В - 32,3 3 - 7.6

3 4 6 0 7 освещвявость, клх

'ЕД25, концентрации диффузога (X): 1 - >100

2 - >100 3-47

10 20 30 40 60 во 70 во ВО 100 ковцвнтрвциа двффуэ»та в смссв с вадоВ.%

«0

В

БД . концентрация ФМС (ихЯ): 50

в в 10 12 14 1в 18 20 22 24 2« вонцеяградхя ФНС, мхи

0

Рис.2. Чувствительность выращенных в разных условиях спор Р.огугае

к свету (А), к токсичным выделениям листьев (Б) и к радикалам 0^,

образованным в модельной химической системе (В).

Штамм Я-5-3. Условия культивирования: (1)-синтетическая среда при освещении, (2)-морковный отвар, темнота, (З)-синтетическая среда, темнота.

Действительно, при инокуляции фрагментов листьев спорами "старой культуры" гриба появлялось меньшее (приблизительно в 1,5 раза) по сравнению с "реизолятом" количество инфекционных пятен совместимого типа. Споры с ослабленным различными способами антиокислительным аппаратом при одной и той же пониженной концентрации инокулюма (1,2 тыс.спор/мл) совсем не вызывали появления симптомов заболевания, в то время как заражение спорами, выращенными на синтетической среде при освещении, морковном отваре или полученными с "реизолята", приводило при той же инфекционной нагрузке к образованию характерных инфекционных пятен совместимого типа.

Тагам образом, антиокислительные системы, обеспечивая паразиту некоторую резистентность как к иммунным реакциям хозяина, так и к абиотическим воздействиям среды, по-видимому, являются одним из факторов патогенности.

Далее мы попытались подавить эти системы известными фунгицидами против пирикуляриоза риса трициклазолом и фталидом, которые блокируют биосинтез меланина у лирикулярии.

Мы подтвердили (Б1з1ег, 1986), что присутствие фунгицидов в культуральной среде гриба и в инокулдае само по себе не вызывает фунги- и фитотоксических эффектов и предотвращает развитие болезни. Внесение в почву трициклазола, но не фталида, также полностью запищало растения от пирикуляриоза.

Обнаружено, что при выращивании гриба на среде с трициклазолом или с фталидом подавляется меланиновая пигментация не только мицелия, но и продуцируемых им спор. Кроме того, в экстракте спор, выращенных в присутствии фталида, была понижена активность катала-зы и в меньшей степени супероксиддисмутазы по сравнению с необработанным фунгицидом грибом.

Можно предположить, что утрата таким грибом патогенности, по крайней мере, отчасти связана с подавлением антиокислительных

систем и, вследствие того, с большей чувствительностью спор к окислительному повреждению. Во всех случаях гриб, обработанный трициклазолом или фталидом, был более чувствителен к интенсивному освещению, токсичным диффузатам листьев и супероксидным радикалам, генерируемым в модельной химической системе (табл.4).

Следует отметить, что в опытах с добавлением фунгицидов в культуральную среду наблюдалось лишь ослабление развития болезни. Полное подавление болезни происходило лишь тогда, когда фунгициды присутствовали в инфекционной капле и контактировали не только с грибом, но и с растешем. Поэтому было исследовано, как влияет на хозяина внесение фунгицидов в почву или в инокулюм, а именно, на токсичность выделений листьев и генерацию в них супероксидных радикалов.

Во всех случаях обнаружено усиление токсичности диффузатов листьев по сравнению с необработанными растениями (рис.ЗА). СОД и каталаза в значительной степени защищали споры тест-объекта от повреждения, что говорит о продукции листьями токсичных количеств АФК. Это же подтверждается усилением окисления адреналина, которое также ингибировалось СОД (рис.ЗБ).

При добавлении фталида в инокулюм выявлены такие же закономерности, как и с трициклазолом, а при добавлении в почву фталид не защищал от болезни и не усиливал токсичность диффузатов листьев и генерацию в них радикалов кислорода. Следовательно, трициклазол и фталид стимулировали активацию кислорода в растении только при таком способе обработки, при котором защищали от болезни.

Таким образом, с одной стороны, исследованные вещества стимулируют противоинфекционные окислительные реакции растения-хозяина, а с другой - подавляют антиокислительные механизмы патогена. Это, вероятно, делает последнего более чувствительным как к иммунным реакциям растения, так и к абиотическим факторам среды.

-13-

А

_ 123123

без добавление добавление веа добавление добавление добавок фунгицида фунгицида добавок фунгицида фунгицида в иноку™« в почву в инокулкж в почву

50

40 -

30 -

С

у 20 -I

10 -1

¿1

I-. Диффуэат

'-1 без добавок

Л

эдор лис

о вые стья

А

гЗН

Диффузат 1 + еид

зар алее иные листья

НЕ!

й-

I

й

гЬ

¿1

123 1 231 123123

без добавление добавление ; без добавление добавление добавок фунгицида фунгицида -добавок фунгицида фунгицида в инокулкш в почву в инокугаои в почву

Рис.3. Влияние фунгицидов трициклазола (1), фталида (2) и пробена-зола (3) на фунгитоксичность диффузатов листьев (А) и генерацию радикалов 0~ в даффузатах (Б).

По той же схеме был исследован другой фунгицид против пирику-ляриоза риса - пробеназол. В эффективных концентрациях это вещество также не фунги- и фитотоксично. Известно, что опрыскивание растений пробеназолом или добавление его в почву за несколько дней до заражения подавляет развитие пирикуляриоза.

В наших опытах внесение пробеназола в почву за 2 дня до инокуляции полностью предотвращало развитие пирикуляриоза. Однако при добавлении пробеназола в инокулт защитного эффекта не наблюдалось.

Пробеназол, добавленный в среду культивирования Р.огугае, на пигментацию мицелия и спор, чувствительность гриба к окислительному повреждению, активности антиокислительных ферментов и патоген-ность спор не влиял. Поэтому можно предположить, что он действует только на растение.

При инкубации раствора пробеназола на здоровых (но не на зараженных) листьях токсичность их диффузатов усиливалась по сравнению с необработанными растениями (рис.ЗА). Внесение пробеназола в почву усиливало токсичность выделений как здоровых, так и зараженных листьев. Во всех случаях токсичность ингибировалась СОД и каталазой.__

Как и в опытах с трициклазолом и фталидом, обнаружена четкая взаимосвязь между токсичностью диффузатов листьев и генерацией в них супероксидных радикалов (рис.ЗБ).

Следовательно, и пробеназол, защищая растения от болезни, токе стимулирует выделение листьями активных форм кислорода в фунгиток-сичных концентрациях.

В дальнейшем был исследован диэтилдитиокарбамат натрия (ДДК) -известный ингибитор медь-цинковой формы супероксиддисмутазы, которая преобладает у пирикулярии. Хотя многие другие соли дитиокарба-миновой кислоты широко применяются как фунгицида, в литературе,

по-видимому, нет данных о способности ДДК защищать рис от пирикуляриоза.

В первую очередь были проверены его фунгицидные свойства. Обнаружено, что это вещество значительно снижает степень развития болезни при опрыскивании целых растений как за сутки до инокуляции, так и через двое суток после.

Добавление ДЩ в культуральную среду не влияло на рост мицелия и на прорастание полученных спор, которые тем не менее были непатогенны. Выращивание Р.огугае на среде с диэтилдитиокарбаматом натрия приводило к практически полному исчезновению активности су-пероксиддисмутазы в мицелии и спорах. При этом оказалось, что ди-тиокарбамат подавлял и пигментацию мицелия и спор гриба. Конидии, выращенные в присутствии карбамата хуке, чем в контроле, прорастали при интенсивном освещении, в диффузатах листьев и в модельной системе генерации супероксидошх радикалодз (табл.4). Уязвимость спор была выражена сильнее, чем при обработке их трициклазолом, что могло быть одной из причин их непатогенности.

Поскольку исследованные ранее фунгициды стимулировали генерацию супероксидного радикала хозяином, то аналогичные исследования были проведены и с диэтилдитиокарбаматом. Выявлено резкое усиление (более чем в три раза) окисления адреналина на листьях, обработанных ДДК.

Следовательно, фунгицидное действие ДЩ так или иначе может быть связано с активацией кислорода.

Мы предположили, что выявленные в ходе работы закономерности могут быть использованы для поиска новых фунгицидов.

Было исследовано совершенно неизвестное как возможный фунгицид вещество - комплекс кобальта с о-фенантролином. Показано, что это соединение способно генерировать кислородные радикалы при окислении биологических субстратов (Вольпин, 1988), что позволило

предположить его фунгицидную активность.

Действительно, присутствие комплекса кобальта с о-фенантроли-ном в инокулюме пирикулярии, не вызывавшее фитотоксических эффектов, предотвращало болезнь. При внесении вещества в поливную воду появлялись единичные инфекционные пятна несовместимого типа.

Следует отметить, что фенантролиновый комплекс в изученных концентрациях не влиял ни на прорастание спор Р.оryzae In vitro, ни на скорость роста колоний гриба при добавлении в среду культивирования. Кроме того, это вещество обладает низкой токсичностью по отношению к теплокровным.

При внесении исследуемого соединения в инокулюм или в поливную воду токсичность диффузатов зараженных (но не здоровых) листьев усиливалась по сравнению с необработанными растениями и практически полностью ингибировалась супероксиддисмутазой. Во всех вариантах опыта усиление токсичности диффузатов сопровождалось возрастанием генерации в них супероксидных радикалов (табл.5).

Таблица 5.

Влияние коиплекса 1Со(Фен)3НСЮ4)2 на фукгитоксичность диффузатов зараженных листьев риса и на генерацию в диффузатах радикалов О".

Способ применения —исшжшаемосо__ вещества Ингибирование прорастания спор, (%) Окисление адреналина А492 . ю2

—^^-еод- + СОД

Без обработки Нанесение на листья Внесение в почву 4 ± 3 30 ± 5 25 ± 2 0 ± 3 2 ± 2 5 ± 3 10 ± 1 20 + 2 16 ± 1 1 ± 1 3 ± 2 2 ± 1

Таким образом, исследованный фенантролиновый комплекс кобальта действительно обладает фунгицидной активностью по отношению к пи-рикуляриозу риса, вероятно, за счет наблюдаемой стимуляции образования в растении-хозяине фунгитоксичных активных форм кислорода.

Итак, в ходе работы мы подтвердит участие активных форм кис-

лорода в фитоиммунитете.

Возбудигель пирикуляриоза риса при патогенезе подвергается окислительному повреждению активированным кислородом. Выживаемость паразита в условиях окислительного стресса зависит от активности его антиокислительных систем. Поэтому можно заключить, что такие системы Р.огугае, а возможно, и других фитопатогенных грибов являются одним из факторов патогенности, помимо известных ранее. Антиокислительные системы могут быть заингибированы различными способами, включая обработку некоторыми химическими агентами, в том числе фунгицидами. Это сенсибилизирует гриб к окислительному повреждению и приводит к ослаблению инфекционности. Подобная закономерность может быть использована для защиты растений от болезней.

Мы обнаружили, что фунгицидные свойства исследованных веществ связаны также со стимулированием активации кислорода в тканях растения-хозяина. При этом противоинфекционное действие проявляется именно в тех случаях, когда происходит гиперпродукция радикалов С>2 в зараженных тканях. Такими свойствами обладают как некоторые промышленные фунгициды, так и вещества, фунгицидная активность которых выявлена в настоящей работе.

Выводы диссертации и использованные в ней методы, по-видимому, применимы для создания новых защитных препаратов. В частности, может быть расширен ассортимент высокоэффективных фунгицидов для защиты риса от пирикуляриоза на базе известного класса соединений -органических комплексов кобальта, по активности превышающих широко применяемый в СССР рицид и не уступающих самому эффективному зарубежному препарату - трициклазолу. Кроме того, исследованный комплекс менее токсичен для теплокровных (в 5 раз по сравнению с ри-цидом и трициклазолом) и проявляет фунгицидные свойства при добавлении в поливные воды, в отличие, например, от рицида, используемого путем опрыскивания. Другое преимущество исследованного комп-

лекса перед испытанными нами коммерческими фунгицидами - стимуляция защитных реакций только у зараженных растений, поскольку предотвращается бесполезное включение этих реакций в отсутствие инфекции. Следует отметить не только эффективность, но также и сравнительную дешевизну исследованного комплекса, так как его легко получить из доступного коммерческого сырья в ходе одностадийного синтеза.

Таким образом мы показали, что механизм действия фунгицидов, помимо других причин, может быть, так или иначе связан с активацией кислорода. В частности, это свойственно промышленным препаратам против пирикуляриоза риса - трициклазолу, фталиду и пробеназо-лу.

Выводы работы существенно дополняют представления о механизме фунгицидного действия трициклазола и фталида. Считается, что они уменьшают мохашческую прочность стешот инфекционной гифы, что лишает ее способности к проникновению в хозяина. Наши данные свидетельствуют, что такой механизм не единственный.

В заключении можно сказать, что хотя нет оснований считать активацию кислорода главным механизмом болезнеустойчивости растений, многие примеры свидетельствуют о противоинфекционной роли соответ-

^вущих~реакщ1й~настоящая-работа-существенно_ушлиниваех_коли^__

чество таких примеров, что может иметь не только прикладное, но и фундаментальное значение.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено существование взаимосвязи между антиокислительным потенциалом различных изолятов гриба Руг1си1аг1а огугае (активности супероксиддисмутазы, каталазц и концентрация меланина) и их патогенностью. Те же антиокислительные системы обеспечивают устойчивость патогена к избыточному освещению и ток-

сичным выделениям листьев растения-хозяина.

2. Показано, что искусственное снижение антиокислительной активности грибных клеток путем изменения условий их культивирования или обработкой фунгицидами - ингибиторами меланиногенеза повышает чувствительность гриба к окислительному повреждению и частично или полностью подавляет его инфекционность.

3. Установлено, что противопирикуляриозная активность ряда коммерческих фунгицидов (трициклазол, фталид, пробеназол) может быть связана не только с их непосредственным воздействием на метаболические процессы гриба, но и по крайней мере частично обусловлена их способностью стимулировать в растениях риса генерацию фукгитоксичшх концентраций активированного кислорода.

4. Показано наличие высокой фунгицидной активности у диэтилдитио-карбамата натрия, являющегося мощным ингибитором супероксиддис-мутазы и биосинтеза меланина, и комплекса кобальта с о-фенан-тролином, способного генерировать кислородные радикалы при окислении биологических субстратов. Ни то, ни другое соединение в исслодова!шых концентрациях не подавляло развитие гриба при добавлении в его питательную среду, но обеспечивало значительное снижение интенсивности заболевания обработашшх растений, сопровождающееся существенным увеличением скорости генерации фунгитоксичных концентраций активированного кислорода в инфицированной растительной ткани.

5. На основании полученных данных предлагается принципиально новый подход к поиску средств химической защиты риса от пирикуляриоза среди ингибиторов антиокислительных систем гриба и веществ, стимулирующих активацию кислорода в растительных тканях.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Ыутмедхонов С.З.. Вавилова H.A., Тен Л.Н., Ериодинский B.C.. ■ Воинова f.U., Опепоничекко H.H., Николаев О.Н., Петелина Г.Г.,

Цхавахия В.Г. Пожкетидный путь биосинтеза меланина у Руг leudarla oryzae Cav. и его регуляция // Труда "V Всесоюзного симпозиума по фенольнш соединениям". Таллинн, 1986. С.12-13.

2. Николаев О.Н., Аверьянов A.A., Лапшова В.П.. Д*а&ахия В.Г. Антиокислительшй механизм устойчивости гриба Pyricularta oryzae Cav. к экстремальным воздействиям // Тез. IV Всесоюзн. конф. «Изучение грибов в биогеоценозах". Свердловск: Уральское отделение АН СССР, 1988. С.106.

3 Николаев О.Н.. Лапикова В.П., Аверьянов A.A. Возможные механизмы фунгицидного действия трициклазола // Тез. Всесоюзной конф. "Физиолого-биохимические основа иммунитета к грибным

болезням". Уфа: Башкирский научн. центр УрО АН СССР, 1988.

С.67.

4. Николаев О.Н., Лапикова В.П., Аверьянов A.A., Цхавахия В.Г. Супероксидзависимое подавление развития гриба I^rlculorta

oryzae

Cav. видимым светом // Микология и фитопатология. 1988.

Т.22. J64. С.335-339.

5 Николаев О.Н., Аверьянов A.A., Дшваш* В.Г. Антиокислительные ферменты гриба Pyrtcularia oryzae Cav. // Микология и фитопатология. 1989. Т.23. *5. С.439-444.

6 Николаев О.Н., Лберьякоб A.A. Влияние фунгицида трициклазола на пигментацию гриба Pyricularta oryzae Cav. на ранних стадиях развития // Агрохимия. 1990. Л5. 0.110-115.

7 Николаев О.Н. Изменение пигментации гриба Pyricularta oryzae Cav. на ранних стадиях развития // Тез. IV Всесоюзн. конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки. Минск: Институт экспериментальной ботаники АН БССР. 1990. С.124.

-218. Николаев О.В., Аверьянов A.A. Ослабление патогенности и антиокислительной активности у гриба Pyrlcularia oryzae Cav. при длительном культивировании на искусственной питательной среде // Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов. Вильнюс: Институт ботаники АН Литвы, 1990. С.102-105.

9. Николаев О.Н., Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Дхавахия В.Г. Антиокислительные свойства гриба Pyrlcularia oryzae Cav. в связи с устойчивостью к экстремальным воздействиям // Тез. Всесоюзн. конф. "Антропогенная экология микромицетов, аспекты математического моделирования и охрана окружающей среды". Киев: АН УССР, 1990. С.13-14.

10. Николаев О.Н., Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Дхавахия В.Г. Возможное участие активных форм кислорода в механизме фунги-цидного действия трициклазола // Физиология растений. 1990. Т.37. Ä16. С.161-167

11. Аверьянов A.A., Дтвахия В.Г., Лапикова В.П., Николаев О.Н., Петелина Г.Г. Участие активированного кислорода в иммунных реакциях растений // Тезисы докладов II съезда Всесоюзного общества физиологов растений. Минск, 1990. С.7.

12. Николаев О.Н., Аверьянов A.A. Влияние трициклазола и дизтилда-тиокарбамата натрия на антиокислительные свойства и патоген-ность гриба Pyrlcularia oryzae Cav. // Агрохимия. 1991. HZ С.110-117.

13. Николаев О.Н., Аверьянов A.A. Влияние многократных пассажей на искусственной питательной среде на антиокислительные свойства и патогенность гриба Pyrlcularia oryzae Cav. // Микробиологический журнал. 1991. Т.53. №2. С.45-49.

14. Николаев О.Н., Аверьянов A.A. Участие супероксидного радикала в механизме фунгицидного действия фталида и пробеназола //

Физиология растений. 1991 Т.38. J63. С.120-128. 15. Николаев О.Н., Новодарова Т.Н., Колосова E.U., Аверьянов A.A., Дхавахия В.Г., Волъпин U.E. Индукция устойчивости растений риса к пирикуляриозу под действием фенантролинового комплекса кобальта и ее возможный механизм // Доклады АН СССР.- 1991. Т.316. Лб. С.1515-1517.