Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Оптимизация тест-систем испытаний биологически активных веществ растений против некоторых фитопатогенных грибов из отдела Deuteromycota

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация тест-систем испытаний биологически активных веществ растений против некоторых фитопатогенных грибов из отдела Deuteromycota"

На правах рукописи

Зайцев Дмитрий Викторович

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМ ИСПЫТАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

РАСТЕНИЙ ПРОТИВ НЕКОТОРЫХ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ ИЗ ОТДЕЛА БЕиТЕИОМУСОТА

Специальность 06.01.07-Защита растений

2 8 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

005540964 Москва-2013

005540964

Диссертационная работа выполнена на кафедре защиты растений Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К. А. Тимирязева

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Смирнов Алексей Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий научный

сотрудник кафедры микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Лихачёв Александр Николаевич

кандидат биологических наук,

специалист по семенам цветочным культур ООО «Сингента» Троицкая Юлия Сергеевна

Ведущая организация ГНУ Всероссийский научно-сследовательский

институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии.

Защита состоится «17» «декабря» 2013 г. в II00 часов на заседании диссертационного совета Д220.043.04 при ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К. А. Тимирязева» по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15 (тел./факс 8(499)976-24-92).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К. А. Тимирязева.

Автореферат разослан « 15 » ноября 2013 г.

Учёный секретарь с__~г~у------------

диссертационного совета //-"—Гриценко В. В.

Общая характеристика работы

Актуальность исследований. Факультативные паразиты из родов Alternaría, Bipolaris (Helminthosporium), Botrytis и Fusarium являются весьма опасными патогенами, поражающими большое количество сельскохозяйственных и декоративных культур. В годы эпифитотий потери от этих грибов составляют от 40 до 100% урожая.

Против возбудителей этих болезней необходимо подбирать эффективные и, по возможности, экологически чистые средства и способы защиты. Для этого необходимо получать достоверную информацию о биологических свойствах возбудителей, работая с их чистыми культурами. Между тем, имеются причины, затрудняющие изучение свойств возбудителей данных болезней, выделенных в чистую культуру. В работе проводится систематизация этих причин в лабораторных условиях и оптимизация имеющихся методик работы с ними.

На этапе скрининга веществ растительного происхождения, обладающих фунгистатическим действием, усовершенствованы методики тестирования веществ различной природы, доступных в очень малых количествах, на активность против грибных факультативных паразитов. Это имеет принципиальное значение для выявления перспективных средств биологизированной защиты растений.

Цель исследования — провести комплексные лабораторные исследования, направленные на оптимизацию методик определения активности веществ, доступных в очень малых количествах, против Alternaría alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schl..

Для выполнения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Оптимизация образования и прорастания конидий, а также роста колоний некоторых, использованных в работе, грибных факультативных паразитов при различных условиях инкубирования.

2. Оценка агрессивности Alternaría alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schl. в отношении ряда декоративных растений.

3. Выявление эффекта растительных экстрактов белковой и органической природы из звездчатки средней (Stellaria media (L.) и ежовника обыкновенного (Echinochloa erus-galli (L.) Beauv.) на Alternaría alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schl.

Научная новизна. Усовершенствованы методики определения агрессивности грибных факультативных паразитов на растениях-тестерах, позволяющие оценивать интенсивность роста, спороношения и токсичность данных грибов. Выявлены различные эффекты (от ингибирующего до стимулирующего) белковых и органических экстрактов, выделенных из звездчатки средней (Stellaria media (L.) и ежовника обыкновенного (Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) на развитие Alternaría alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusaríum oxysporum Schl.

Практическая ценность работы. Предложенный нами комплексный подход, объединяющий и оптимизирующий различные методики определения прорастания конидий и инфекционного потенциала Alternaría alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusaríum oxysporum Schl. в лабораторных условиях, существенно облегчает проведение данных исследований и тестирований. Выявлен in vitro существенный фунгистатический эффект экстракта из звездчатки средней {Stellaria media (L.) Vill.) на рост и развитие Botrytis cinerea Pers.

Апробация и публикация результатов исследования. Материалы диссертации доложены на международной научной конференции молодых учёных и специалистов РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева (июнь 2011 и 2012 гг.) и всероссийской, с международным участием, конференции «Научное наследие Н. И. Вавилова и современность» в РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева (декабрь 2012 г.).

По материалам работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 — в журналах списка ВАК.

Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на 198 машинописных страницах, состоит из введения, частей «Обзор литературы», «Материалы, использованные в работе», «Методики проведения экспериментов», «Результаты и обсуждение», выводов, библиографического списка, состоящего из 100 источников, из которых 35 - на иностранном языке. Работа включает 94 рисунка и 43 таблицы.

Содержание диссертации

Введение. Показана актуальность, новизна и практическая ценность работы. Проведена систематизация трудностей и проблем, возникающих при работе с фитопатогенными несовершенными грибами.

Глава I. Обзор литературы.

Дана характеристика декоративным растениям и культурам фитопатогенных грибов, используемым в работе. Проведён сбор сведений о методиках работы с фитопатогенными несовершенными грибами. Проанализированы методики тестирования веществ различной природы на активность по отношению к грибным факультативным паразитам.

Глава II. Места проведения опытов, материалы и методы исследований.

Лабораторные и полевые исследования проведены на кафедре защиты растений (сектор фитопатологии) и в лаборатории защиты растений РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, а также в питомнике ООО «Розовая поляна» Рузского района Московской области.

В работе использовали: изоляты грибов Alternaría alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers., Fusarium oxysporum Schl.; акалифу гаитянскую (Acalypha hispaniolae Urb.) [А], гибискус китайский (Hibiscus rosa-sinensis L.) [Гиб], пеларгонию щитовидную (Pelargonium peltatum (L.) L'Her.) [Г], петунию садовую (Petunia x hybrida (Vilm.) Hort. [П], фикус Бенджамина (Ficus benjamina L.) [Ф], шлюмбергеру Бакли (Schlumbergera x buckleyi Hunt) [Ш], а также различные сорта розы (Rosa L.): Dbora (розовая) [Dbp], Kosmos (белая) [Ks6], Barbara (красная) [Brk], Juliette Child (жёлтая) [JC>k], HBoterro (красная) [HBk], Lions Rose (белая) [LR6], Sangría (красная) [SAk], La Franse (розовая) [LFp]; растительные экстракты из звездчатки средней (Stellaria media (L.) Vill.). и ежовника обыкновенного (Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.).

Фитопатогенные грибы выращивали в чашках Петри на: овсяном (ОИПС), картофельно-глюкозном (КГА) и картофелыю-морковном (КМА) агарах в течение 10-12 дней при температуре 20-22° С и 26-28° С. Инокуляцию грибов в органы растения проводили суспензией конидий, инфекционно-мицелиальными блоками, а также с помощью мелкодисперсного опрыскивания.

В экспериментах по росту колонии и образованию конидий исследуемых грибов, а также в работе по изучению влияния минимальной среды на их рост и развитие использовали следующие температурные условия: -19 - -21° С, 5-7° С, 20-22° С и 26-28° С.

В опытах по прорастанию конидий исследовали следующие питательные растворы: дистиллированная вода, 3% растворы глюкозы и сахарозы, 10% картофельный и морковный бульоны, 5% картофельно-морковный бульон, 5% аскорбиновую кислоту.

В экспериментах по оценке декоративных растений, розы и петунии, на возможность заражения их указанными выше фитопатогенными грибами, использовали варианты с поранением ткани органа растения и без её предварительного поранения.

В опытах по оценке активности растительных экстрактов из звездчатки средней и ежовника обыкновенного в отношении указанных выше фитопатогенных грибов использовали варианты с экспозицией суспензии конидий с экстрактом в течение 2-3 часов перед инокуляцией в орган растения и без предварительной экспозиции.

Полученные данные в исследованиях с растениями, а также их органами, переводили в баллы, на основе которых проводили расчёт показателей индекса агрессивности (ИА) и итогового индекса агрессивности (ИИА) патогена.

Частота инфекции (ЧИ): 1 - заражения нет; 2-1 сегмент заражён; 3-2 сегмента заражено; 4-3 сегмента заражено; 5-4 сегмента заражено.

Размер хлороза (РХ): 1 - хлороза нет; 2 - хлороз до 10% поверхности; 3 - 10-25% поверхности покрыто хлорозом; 4 - 25-50% поверхности покрыто хлорозом; 5 - 50-80% поверхности покрыто хлорозом; 6 - хлороз занимает 80-100% поверхности.

Размер некроза (РН): 1 - некрозов нет; 2 - до 10% некротизировано; 3 - 11-30% некротизировано; 4 - 31-60% некротизировано; 5 - 61-90% некротизированно; 6 - 91-100% некротизированно.

Интенсивность спороношения (ИС): 1 - спороношения нет; 2 - до 10% покрыто спороношением; 3 - 10,1- 30% покрыто спороношением; 4 -30,1-60% покрыто спороношением; 5 - 60,1-90% покрыто спороношением; 6 -более 90% покрыто спороношением.

Инкубационный период 1 (ИП-1) - это период в сутках до появления первых признаков хлороза.

Инкубационный период 2 (ИП-2) - это период в сутках до появления некроза.

Латентный период или период споруляции (ЛП) - это период в сутках до появления спороношения. (ван дер Планк, 1966)

Индекс агрессивности (ИА) рассчитывали по следующей формуле:

ИА = ЧИ * РХ * РН * ИС Итоговый индекс агрессивности (ИИА) рассчитывали по следующей формуле:

ИИА = (ЧИ * РХ * РН * ИС) / (ИП-1 * ИП-2 * ЛП) За основу взята методика индекса агрессивности Phytophthora infestans (Смирнов, Кузнецов, 2006), которая была дополнена показателями РХ и ИП-1, в связи с тем, что несовершенные грибы медленно заражают растения. Появляются хлороз и антоцианоз, которые являются частью проявления агрессивности патогена и отражают уровень вивотоксинов и микотоксинов, убивающих ткани растения и облегчающих развитие мицелия грибов (Пенкин, 2012).

III. Результаты исследований и их обсуждение.

1. Оптимизация условий прорастания конидий А. alternata, В. sorokiniana, В. cinerea, F. oxysporum Прорастание конидий А. alternata в дистиллированной воде на третьи сутки инкубирования достигало 78,1 и 95% (для российского и иранского изолята, соответственно); конидий В. sorokiniana - составило 23%; конидий В. cinerea и F. oxysporum - не превысило 2% и 6%, соответственно. В данной среде наблюдалось массовое разрушение, как проросших гиф грибов, так и самих конидий уже при первом учёте.

Конидии иранского и российского изолятов гриба А. alternata полностью прорастали во всех из представленных растворов Сахаров. Прорастание конидий В. sorokiniana, В. cinerea и F. oxysporum в 3% растворе сахарозы было выше, чем в 3% растворе глюкозы в 2 - 4 раза и достигало приблизительно 93% (для В. sorokiniana) на 3-й сутки инкубирования.

Конидии иранского и российского изолятов гриба А. alternata, а также конидии В. sorokiniana полностью прорастали во всех видах овощных бульонов уже на первый день учёта (рис. 1). Однако в смеси бульонов прорастание конидии В. sorokiniana опускалось до уровня 80%. Прорастание конидий В. cinerea в морковном бульоне достигало почти 80% (рис. 1). Инкубирование конидий данного гриба в картофельном бульоне снижало процент прорастания почти в два раза (42%), а в смеси этих двух бульонов прорастание не превышало 32% (табл. 1). Наибольшее прорастание макроконидий F. oxysporum наблюдалось в смеси картофельного и морковного бульонов (около 50%). В морковном бульоне этот показатель снижался до 15%, а в картофельном - не превышал и 5%. В отличие от макроконидий, микроконидии и хламидоспоры F. oxysporum во всех видах

бульонов прорастали очень слабо, однако наибольший процент наблюдался в морковном (до 4%). Проросшие гифы хорошо ветвились.

Таблица 1. Эффективность применения различных составов питательных растворов для прорастания конидий В. cinerea, %

Вариант (фактор А/фактор В) 1-й день 3-й день

Дистиллированная вода 1,1 1,8

3%-ный раствор глюкозы 0,0 4,4

3%-ный раствор сахарозы 13,1 16,4

КБ 39,6 42,1

МБ 70,0 78,7

КМБ 12,2 31,6

5%-ный раствор аскорбиновой кислоты 0,0 0,3

где, КБ - картофельный бульон; МБ - морковный бульон; КМБ -картофельно-морковный бульон

Таблица 1.1. Значения НСР05 по факторам, для взаимодействия _факторов, а также для частных различий_^_

Дистил- 3-% 3-% КБ МБ КМБ 5-%

Среднее лированная раствор раствор са- раствор

по фактору вода глюкозы харозы аскорбиновой

А: кислоты

1,5 2,2 14,8 40,9 74,4 21,9 0,2

Среднее по фактору В: 1-й день 19,4 3-й день 25,0

По фактору А: 0,11 (+;рф= 64,73) По фактору В: 0,06 (+; F$= 5,29) Для А и В: 0,11 (+; Бф= 2,43) Для частных различий: 0,15

В 5% аскорбиновой кислоте прорастание конидий иранского изолята

A. alternata, доходило до 100% на третьи сутки инкубирования. Однако конидии российского изолята в тех же условиях прорастали достаточно слабо - 21,5% на третий день. Наблюдался ингибирующий эффект воздействия 5% раствора аскорбиновой кислоты на конидии В. sorokiniana, В. cinerea и F. oxysporum. Прорастание их не превышало 0,5% и 1,5% (для В. cinerea и

B. sorokiniana, соответственно) (рис. 2). У F. oxysporum прорастания конидий вообще не наблюдалось. Проросшие гифы гриба ветвились слабо.

Рисунок 1. Проросшие конидии В. cinerea (слева) и В. sorokiniana (справа) в морковном бульоне на 3-й день инкубирования.

Рисунок 2. Ингибирование прорастания конидии В. cinerea (слева) и В. sorokiniana (справа) в 5% аскорбиновой кислоте на 3-й день инкубирования.

2. Оптимизация условий роста колонии и образования конидий А.

alternata и В. cinerea, в зависимости от среды выращивания и температурных условий

Рост колонии иранского и российского изолята гриба А. alternata на овсяной среде в среднем на 5-10 мм опережал рост на картофельно-морковном агаре как при температуре 20-22° С, так и при 26-28° С.

При выращивании иранского и российского изолятов гриба А. alternata при температуре 20-22° С среднее количество образовавшихся конидий было низким, однако на ОИПС этот показатель со временем незначительно повышался, в то время как на КМА оставался на одном уровне. При выращивании гриба А. alternata при температуре 26-28° С на КМА, среднее количество образовавшихся конидий возрастало ко времени второго учёта и далее оставалось неизменным, в то время как на овсяном агаре происходил резкий рост образования конидий к 8-му дню инкубирования и такой же резкий спад к 10-му дню. Среднее количество конидий российского изолята гриба А. alternata несколько превышало среднее количество конидий иранского изолята в каждом из вариантов опыта.

Рост колонии изолятов BMdS/S и PY/HT гриба В. cinerea на картофельно-морковном агаре в среднем на 20-30 мм опережал рост на овсяной среде как при температуре 20-22° С, так и при 26-28° С.

При выращивании изолятов BMdS/S и PY/HT гриба В. cinerea при температуре 20-22° С среднее количество образовавшихся конидий как на ОИПС, так и на КМА со временем повышалось. При выращивании гриба В. cinerea при температуре 26-28° С на обеих средах происходил резкий рост образования конидий к 8-му дню инкубирования и такой же резкий спад к 10-му дню. Среднее количество конидий гриба В. cinerea на картофельно-морковном агаре превышало среднее количество конидий на овсяной среде в каждом из вариантов опыта.

3. Оптимизация способности конидий A alternata к образованию колонии, в зависимости от температурных условий инкубирования и среды

выращивания

Конидии иранского и российского изолятов A. alternata сохраняли способность образовывать колонии в каждом из вариантов опыта.

Во всех вариантах рост колоний иранского и российского изолятов гриба A. alternata на овсяной искусственной питательной среде (ОИПС) превышал рост колоний на картофельно-морковном агаре (КМА) в среднем на 5-10 мм. Также рост колоний гриба A. alternata каждого из изолятов был наиболее интенсивным после 9-и дневного инкубирования его конидий во всех температурных условиях.

Интенсивность роста колонии каждого из изолятов гриба A. alternata была выше после предварительного инкубирования его конидий при -19 — 21°С (табл. 2) или при 26-28°С, чем после инкубирования их при 5-7°С или при 18-20°С. Однако после инкубирования конидий гриба при -19 —21°С, контаминация растущей колонии была намного ниже (особенно на овсяном агаре), чем после инкубирования конидий гриба при 26-28°С.

Таблица 2. Средние значения диаметров колоний гриба A. alternata, мм

День учёта российский изолят иранский изолят

ОИПС КМА ОИПС КМА

3-й день 14,8 15,3 11,9 11,6

4-й день 32,4 25,1 31,2 21,8

5-й день 64,1 43,8 54,1 38,4

где, КМА - картофельно-морковный агар; ОИПС - овсяный агар.

Таблица 2.1. Средние значения и значения НСР05 по факторам, их _ взаимодействию, а также для частных различий_

Среднее по фактору А: российский изолят 32,6 иранский изолят 28,2 HCPos по фактору А: 4,10 (+; БФ = 13,96)

Среднее по фактору В: оипс 34,8 КМА 26,0 HCPos по фактору В: 4,10 (+; Иф = 54,68)

Среднее по фактору С: 3-й день 13,4 4-й день 27,6 5-й день 50,1 HCPos по фактору С: 3,35 (+; РФ = 325,69)

Для А и В: 3,35 (-; Fi = 0,06) Для А и С: 4,10 (-; Fi= 1,94) Для В и С: 4,10 (+; Рф = 19,50) Для частных различий: 5,80

где, фактор А - изолят гриба; фактор В - среда выращивания; фактор С -день учёта.

4. Определение влияния минимальной среды («голодного» агара) на рост и развитие конидий В. cinerea и F. oxysporum

Для изучения прорастания конидий грибов В. cinerea и F. oxysporum, в аэробных условиях, исследуемые конидии поместили на минимальную среду («голодный» агар).

Было установлено, что при температуре 5-7° С инкубируемые на минимальной среде конидии В. cinerea прорастали крайне слабо даже на 3 сутки инкубирования, а микроконидии F. oxysporum вовсе подверглись разрушению уже на первый день учёта (рис. 3). При температуре инкубирования 20-22° С конидии В. cinerea и микроконидии F. oxysporum на минимальной среде прорастали длинными хорошо ветвящимися гифами, наблюдалась некоторая агрегация конидий этих грибов (рис. 4). Также на проросших гифах микроконидий F. oxysporum фиксировали образование вздутий, внешне схожих с макроконидиями данного гриба. Инкубируемые при температуре 26-28° С конидии В. cinerea прорастали слабо. Также наблюдалась агрегация их в цепочки (рис. 5). Микроконидии F. oxysporum в данных условиях прорастали длинными слабо ветвящимися гифами, с небольшими вздутиями, которые к 3 дню учёта превращались в конидиеносцы с макроконидиями (рис. 5).

Рисунок 3. Конидии В. cinerea (слева), а также полное отсутствие конидий F. oxysporum (справа), после инкубирования их на минимальной среде («голодном» агаре) при температуре 5-7° С в течение 3 и 1 суток, соответственно.

Рисунок 4. Конидии В. cinerea (слева) и F. oxysporum (справа), после инкубирования их на минимальной среде («голодном» агаре) при температуре 20-22° С в течение 1 и 3 суток, соответственно.

А

ф Ы 'Ч!

t

Рисунок 5. Конидии В. cinerea (слева) и F. oxysporum (справа), после инкубирования их на минимальной среде («голодном» агаре) при температуре

26-28° С в течение 3 суток.

5. Оценка лепестков и листьев различных сортов роз на возможность заражения их В. cinerea

Проведённые исследования показали, что В. cinerea проявлял большую агрессивность в отношении розово- и белоокращенных лепестков (ИИА равен 27,2 и 32,8 соответственно) и листьев растений, чьи лепестки были данного цвета (ИИА равен 2,43 и 3,21 соответственно). Напротив, красно- и жёлтоокрашенные лепестки (ИИА равен 10, 8 и 7,3 соответственно) и листья растений, чьи лепестки были данного цвета (ИИА равен 0,04 и 0,64 соответственно), инфицировались В. cinerea гораздо хуже (рис. 6, табл. 3).

Таблица 3. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного _ гриба В. cinerea Pers. в отношении лепестков розы_

Среднее по фактору А: Dbp 3,9 Ks6 3,3 Brk 13,1 JC ж 7,3 HBk LR6 13,3 32,8 SAk 10,8 LFp 27,2 HCPos по фактору А: 3,46 (+; Иф = 48,69)

Среднее по фактору В: К 11,0 I 9,7 II 12,9 III 23,3 HCPos по фактору В: 4,89 (+; = 37,37)

Среднее по фактору С: б/п 14,4 с/п 14,7 HCPos но фактору С: 6,92 (-; = 2,08)

Для А и В: 6,92 (+; Бф = 22,46) Для А и С: 3,46 (+; Бф = 4,03) Для В и С: 4,89 (+; Бф = 36,93) Для частных различий: 9,79

где, фактор А - сорта розы и окраска их лепестков; фактор В - концентрация суспензии конидий В. cinerea; фактор С - предварительное поранение лепестка розы; К - контроль; I - 5000 конидий в 1 мл, II - 50000 конидий в 1 мл, III - 200000 конидий в 1 мл; б/п - без предварительного поранения, с/п - с предварительным поранением.

Между тем, не было выявлено закономерностей развития В. cinerea, исходя из концентрации его конидий в суспензии, а также поранения. Зачастую, размер некроза при заражении суспензией конидий меньшей концентрации (II — 50000 конидий в 1 мл) был выше, чем при более высоких её показателях (III - 200000 конидий в 1 мл). Процент развития некрозов на

Рисунок 6. Развитие фитопатогенного гриба В. cinerea на лепестках роз жёлтого, красного, розового и белого цветов.

лепестках в контроле, от естественного заражения грибом также был соизмерим с размерами некрозов от искусственного заражения, а в ряде вариантов превосходил их (рис. 7). Также при появлении спороношения на лепестках, наблюдалась контаминация грибами из других родов Fusarium, Mucor, Pénicillium и др. При этом спороношение В. cinerea практически не наблюдалось.

Рисунок 7. Развитие фитопатогенного гриба В. cinerea на лепестках роз, при естественном (слева) и искусственном (справа) инфекционных фонах.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод о невозможности и нецелесообразности использования лепестков и листьев роз в качестве растений-тестеров веществ различной природы.

6. Оценка ряда декоративных растений на возможность заражения их А. alternata, В. sorokiniana, В. cinerea, F. oxysporum

Максимальную агрессивность гриб А. alternata проявлял на листьях пеларгонии при инокуляции её инфекционно-мецилиальным блоком и суспензией конидий (рис. 8) с предварительным поранением ткани листа.

Рисунок 8. Инфицирование пеларгонии инфекционно-мицелиальным блоком (слева) и суспензией конидий (справа) фитопатогенного гриба А. акегпМа.

Таблица 4. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного _гриба А. а11егпа(а в отношении ряда декоративных растений_

Средние по фактору А: П 5,03 А 3,45 Ф 0,38 Ш 0,02 Гиб 1.08 НСР05 по фактору А: 0,80 (+; Рф= 13,5)

Средние по фактору В: с/п 3,73 б/п 0,17 НСРог по фактору В: 0,18 (+;БФ= 11,2)

Средние по фактору С: с/к 3,57 и.м. 2,47 НСР05 по фактору С: 0,26 (+;Рф= 4,6)

Для А и В: 0,26 (+; Бф= 4,6) Для А и С: 0.80 (+; Бф= 10,3) Для В и С: 0.18 (+; Рф= 1,5) Для частных различий: 14,3

где, фактор А - растение-тестер; фактор В - предварительное поранение листа; фактор С — способ инокуляции патогена; с/к — суспензия конидий; и.м. - инфекционно-мицелиальный блок.

Исходя из полученных данных (табл. 4) видно, что не все растения с одинаковой интенсивностью поражались фитопатогенным грибом А.аИегпШа. Наибольшую агрессивность гриб проявлял на листьях пеларгонии (ИИА равен 5,03), а наименьшую - на листьях шлюмбергеры (ИИА равен 0,02). На фикусе также была отмечена реакция сверхчувствительности (СВЧ).

Рисунок 9. Инфицирование шлюмбергеры без поранения (слева) и фикуса с предварительным поранением листа (справа) инфекционно-мицельным блоком фитопатогенного гриба Л. аНетШа.

Максимальную агрессивность гриб В. $огокт1апа проявлял на листьях пеларгонии инфицированной суспензией конидий с предварительным поранением листа (рис. 10).

Рисунок 10. Инфицирование пеларгонии суспензией конидий фитопатогенного гриба В. вогокМапа с поранением.

Таблица 5. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного _гриба В. яогокМапа в отношении ряда декоративных растений_

Средние по фактору А: П 1,25 А 0,28 Ф 0,0 Ш 0,67 Гиб 0,0 НСР05 но фактору А: 0,24 (+;РФ = 29,52)

Средние по фактору В: с/п 1,43 б/п 0,23 НСРог но фактору В: 0,42 (+;РФ = 29,25)

Средние по фактору С: с/к 1,67 и.м. 0,63 НСР05 по фактору С: 0,42 (+; Рф= 21,77)

ля А и В: 0,42 (+; Рф = 21,42) Для А и С: 0,24 (+; Рф = 29,81) Для В и С: 0,42 (+; Рф = 10,51) Для частных различий: 0,60

где, фактор А - растение-тестер; фактор В - предварительное поранение листа; фактор С - способ инокуляции патогена; с/к - суспензия конидий; и.м. - инфекционно-мицелиальный блок.

Рисунок 11. Инфицирование фикуса инфекционно-мицелиальным блоком фитопатогенного гриба В. вогокШапа с поранением.

Исходя из полученных данных (табл. 5) видно, что наибольшую агрессивность гриб В. sorokmiana проявлял на листьях пеларгонии (ИИА равен 1,25), а наименьшую - на листьях акалифы (ИИА равен 0,28). На гибискусе, фикусе и шлюмбергере отмечалась реакция сверхчувствительности (СВЧ) (рис. 11).

Максимальную агрессивность гриб В. cinerea проявлял на листьях пеларгонии и акалифы при инфицировании их инфекционно-мицелиальным блоком или суспензией конидий как при поранении, так и без поранения листа (рис. 12).

Рисунок 12. Инфицирование пеларгонии (слева) и акалифы (справа) суспензией конидий и инфекционно-мицелиальным блоком В. cinerea с

поранением.

Таблица 6. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного

Средние по П А Ф Ш Гиб HCPos по фактору А:

фактору А: 13,059 180,005 7,500 0,000 0,320 9,94 (+; 680,93)

Средние по с/п б/п HCPos по фактору В:

фактору В: 67,605 62,115 17,22 (+; Ft= 665,21)

Средние по с/к и.м. HCPos по фактору С:

фактору С: 3,251 163,986 17,22 (-; Рф= 0,71)

Для А и В:

17,22 (+; Бф = 709,48)

Для А и С:

9,94 (-; Рф= 0,45)

Для В и С:

17,22 (-; Рф= 0,56)

Для частных различий:

24,36

где, фактор А - растение-тестер; фактор В - предварительное поранение листа; фактор С - способ инокуляции патогена; с/к - суспензия конидий; и.м. - инфекционно-мицелиальный блок.

Исходя из полученных данных видно, что наибольшую агрессивность гриб В. cinerea проявлял на листьях акалифы (ИИА равен 180) и пеларгонии

(ИИА равен 13), а наименьшую - на листьях гибискуса (ИИА равен 0,32). На фикусе и шлюмбергере отмечены распространение гриба сапротрофно по поверхности листа, а также реакция сверхчувствительности (СВЧ).

Максимальную агрессивность гриб Т7. оху.чрогит проявлял на листьях пеларгонии и шлюмбергеры, как при инфицировании инфекционно-мицелиальным блоком, так и суспензией конидий с поранением листа (рис. 13).

Рисунок 13. Инфицирование пеларгонии (слева) и шлюмбергеры (справа) инфекционно-мицелиальным блоком фитопатогенного гриба К охухрогит с

поранением листа.

Таблица 7. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного _гриба К оху.чрогит в отношении ряда декоративных растений_

Средние по фактору А: П А 37,6 0,0 Ф 0,0 Ш Гиб НСР05 по фактору А: 27,8 0,0 3,37 (+; Бф= 113,80)

Средние по фактору В: с/п 52,6 б/п 10,2 НСР05 по фактору В: 5,83 (+; Рф= 25,23)

Средние по фактору С: с/к 48,0 и.м. 27,4 НСР05 по фактору С: 5,83 (+; Рф= 35,06)

Для А и В: 5,83 (+; Рф = 10,69) Для А и С: 3,37 (+; Рф = 73,37) Для В и С: 5,83 (+; Рф=4,91) Для частных различий: 8,25

где, фактор А - растение-тестер; фактор В - предварительное поранение листа; фактор С - способ инокуляции патогена; с/к - суспензия конидий; и.м. — инфекционно-мицелиальный блок.

Исходя из полученных данных (табл. 7) видно, что наибольшую агрессивность гриб проявлял на листьях пеларгонии (ИИА равен 37,6) и шлюмбергеры (ИИА равен 27,8). Во всех остальных вариантах опыта, либо отмечалась реакция сверхчувствительности (СВЧ), либо гриб Р. охуБрогит развивался на поверхности листа сапротрофно (рис. 14).

Рисунок 14. Инфицирование фикуса (слева) и шлюмбергеры (справа) инфекционно-мицелиальным блоком фитопатогенного гриба F. oxysporum с и

без поранения листа.

7. Оценка активности экстрактов растительного происхождения из звездчатки средней и ежовника обыкновенного в отношении А. alternata, В. sorokiniana, В. cinerea, F. oxysporum

В проведённых нами экспериментах экстракты растительного происхождения из звездчатки средней и ежовника обыкновенного показали разнонаправленные эффекты действия.

Экстракт из звездчатки средней оказывал ингибирующий эффект на развитие А. alternata и В. cinerea (табл. 8). Причём, если в отношении А. alternata ингибирующий эффект был слабо выражен, то в эксперименте с В. cinerea итоговый индекс агрессивности вариантов опыта в 2-3 раз был ниже, чем в его контроле.

Таблица 8. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного гриба В. cinerea Pers. при обработке экстрактом из _звездчатки средней (Stellaria media (L.) Vill.)_

Средние по фактору А: К 1080 2 540 1 540 0,5 315 0,25 540 HCPos по фактору А: 33,86 (+; Ft= 287,84)

Средние по фактору В: 2 648 0 558 НСР05 по факгору В: 53,53 (+; Бф= 36,16)

Для А и В: 33,86 (+; F«b= 36,16) Для частных различий: 75,71

где, фактор А - концентрация экстракта, мг/мл; фактор В - экспозиция экстракта с суспензией конидий гриба, ч; К - контроль; с/эксп - с экспозицией; б/эксп - без экспозиции.

Был показан стимулирующий эффект действия экстракта из звездчатки средней на развитие В. вогокМапа (табл. 9) и Р. охухрогит (рис. 15). Причём, как в случае с В. эогоктапа, так и в случае с Г. охухрогит практически по

каждому из вариантов опыта итоговый индекс агрессивности был почти в 10 раз выше контрольного.

Таблица 9. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного гриба В. sorokiniana Shoem. при обработке экстрактом из звездчатки средней _ (Stellaria media (L.) Vill.j _

Средние по фактору А: К 7,84 2 52,50 1 76,25 0,5 75,00 0,25 76,25 HCPos по фактору А: 9,30 (+; F,j,= 42,4*1)

Средние по фактору В: 2 45,95 0 52,61 HCPos по фактору В: 16,12 (-; Рф= 2,49)

Для А и В: Для частных различий: 9.30 (-; Рф= 2,74) 22,79

где, фактор А — концентрация экстракта, мг/мл; фактор В — экспозиция экстракта с суспензией конидий гриба, ч; К - контроль; с/эксп — с экспозицией; б/эксп - без экспозиции.

Рисунок 15. Стимулирующий эффект экстракта из звездчатки средней на фитопатогенный гриб /\ охуярогит в концентрации 0,5 мг/мл (слева) без предварительной его экспозиции с конидиями гриба и контрольный вариант заражения данным грибом (справа).

Экстракт из ежовника обыкновенного показал разнонаправленный эффект в зависимости от концентрации. Он ингибировал развитие В. cinerea в концентрациях 2 и 0,25 мг/мл (рис. 16). Однако в концентрациях 1 и 0,5 мг/мл этот же экстракт оказывал стимулирующее воздействие на данный гриб (табл. 10).

Таблица 10. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного гриба В. cinerea Pers. при обработке экстрактом из ежовника обыкновенного __ (Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) _

Средние по фактору А: К 360,0 2 564,0 1 195,0 0,5 143,8 0,25 652,5 HCPos по фактору А: 42,99 (+; Бф= 109,93)

Средние по фактору В: 2 396,6 0 369,5 НСР05 по фактору В: 67,97 (-; Рф = 2,03)

Для А и В: 42,99 (+; F6= 254,92) Для частных различий: 96,13

где, фактор А - концентрация экстракта, мг/мл; фактор В — экспозиция экстракта с суспензией конидий гриба, ч; К - контроль; с/эксп - с экспозицией; б/эксп - без экспозиции.

Рисунок 16. Ингибирующий эффект экстракта из ежовника обыкновенного на

фитопатогенный гриб В. cinerea в концентрации 2 мг/мл (слева) с предварительной его экспозицией с конидиями гриба и контрольный вариант заражения данным грибом (справа).

Влияние экстракта из ежовника обыкновенного на развитие В. sorokiniana было разнонаправленным по каждому из вариантов опыта (рис. 17). Следовательно, можно сделать вывод об отсутствии какого-либо эффекта со стороны данного экстракта на этот гриб.

Рисунок 17. Разнонаправленный эффект экстракта из ежовника обыкновенного на фитопатогенный гриб В. БогокМапа (слева направо: контроль, 0,5 мг/мл, 1 мг/мл).

Экстракт из ежовника обыкновенного оказывал стимулирующий эффект на развитие A. altérnala и F. oxysporum. Причём, как в случае с А. alternata, так и в случае с F. oxysporum по каждому из вариантов опыта итоговый индекс агрессивности был в 2-20 раз выше контрольного.

Проведённые исследования показали, что агрессивность фитопатогенных грибов, в большинстве случаев, была ниже при предварительной экспозиции суспензии конидий с экстрактом, чем без неё, либо оставалась практически на том же уровне.

8. Оценка бутонов петунии садовой на возможность заражения их

В. cinerea

Исходя из полученных данных (табл. 11) видно, что бутоны петунии хорошо поражались фитопатогенным грибом В. cinerea в каждом варианте инфицирования. Однако наибольшая агрессивность гриба проявилась в варианте мелкодисперсного опрыскивания (мдо) (ИИА равен 180).

Таблица 11. Бальные значения основных критериев учёта искусственного инфицирования бутонов петунии фитопатогенным грибом В. cinerea, а также показатель итогового индекса агрессивности

Вариант опыта ЧИ РХ РН ИС ИП-1 ИП-2 ЛП ИА ИИА

П, б/п, К 5 1 36 5 2 2 4 900 56,3

П, с/п, К 5 1 36 5 4 4 5 900 11,3

П, мдо, B.c. 5 1 36 5 1 1 5 900 180

П, с/к, B.c. 5 1 36 6 3 3 4 1080 30

П, и.м., B.c. 5 1 36 6 2 2 3 1080 90

НСР05 # # # # # 0,88 # 159,5 32,29

где, ЧИ - частота инфекции, РХ - размер хлороза, РН — размер некроза, ИС -интенсивность спороношения, ИП-1 - инкубационный период 1, ИП-2 -инкубационный период 2, ЛП - латентный период, ИА - индекс агрессивности, ИИА - итоговый индекс агрессивности; П - петуния; б/п - без предварительного поранения, с/п - с предварительным поранением; мдо -мелкодисперсное опрыскивание, с/к - суспензия конидий, и.м. -инфекционно-мицелиальный блок.

9. Оценка активности экстракта растительного происхождения из звездчатки средней в отношении фитопатогенного гриба В. cinerea в испытаниях in vitro и in vivo на петунии садовой

Растительный экстракт из звездчатки средней оказывал ингибирующий эффект на развитие В. cinerea на петунии in vitro (рис. 18, табл. 12).

Рисунок 18. Ингибирующий эффект экстракта из звездчатки средней на фитопатогенный гриб В. cinerea в концентрации 0,5 мг/мл (слева) с предварительной его экспозицией с конидиями гриба и контрольный вариант заражения данным грибом (справа).

Таблица 12. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного гриба В. cinerea Pers. при обработке экстрактом из звездчатки средней (Stella-_ ria media (L.) Vill.) в опытах на петунии in vitro_

Средние по фактору А: К 81,3 2 50,7 1 45,0 0,5 10,0 0,25 8,8 HCPos по фактору А: 9,19 (+; Рф = 41,28)

Средние по фактору В: 2 41,5 0 50,8 НСРоз по фактору В: 15,92 (+; 4,95)

Для А и В: 9,19 (+;Ft= 30,78) Для частных различии: 22,51

где, фактор А - концентрация экстракта мг/мл; фактор В - экспозиция экстракта с суспензией конидий гриба, ч.

В испытаниях in vivo влияние этого же экстракта на развитие В. cinerea было разнонаправленным по каждому из вариантов опыта (табл. 13). Следовательно, можно сделать вывод об отсутствии какого-либо эффекта со стороны данного экстракта на этот гриб в испытаниях in vivo.

Таблица 13. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного гриба В. cinerea Pers. при обработке экстрактом из звездчатки средней (Stella-_ ría media (L.) Vill.) в опытах на петунии in vivo_

Средние по К 1 0,5 0,25 HCPos по фактору А:

фактору А: 11,0 14,4 17,2 10,2 2,15 (+; Рф= 12,12)

Средние по р Ц HCPos по фактору В:

фактору В: 11,5 14,9 3,04 (+; Рф = 13,50)

Для А и В: Для частных различий:

2,15 (+; Бф = 5,61) 4,30

где, фактор А — концентрация экстракта мг/мл; фактор В — поражение всего растения (Р) и его бутонов (Ц).

Выводы

1. Установлено, что изменение температуры, состава питательного раствора и среды инкубирования существенно влияло на образование и прорастание конидий грибных факультативных паразитов.

По результатам проведённых исследований количество образовавшихся конидий A. alternata и В. cinerea было выше при 26-28° С, чем при 20-22° С. Количество конидий гриба В. cinerea на картофельно-морковном агаре было выше, чем на овсяной среде. Конидии изолятов A. alternata сохраняли способность образовывать колонии после инкубирования их маточной культуры в различных температурных условиях. Причём рост колонии A. alternata был выше после инкубирования его маточной культуры при -19--21°С или при 26-28° С, чем после инкубирования её при 5-7° С или при 18-20° С. В случае контаминации маточной культуры гриба, после её инкубирования при -19—21°С, контаминация растущей колонии существенно снижалась (особенно на овсяном агаре) по сравнению с инкубированием маточной культуры при различных положительных температурах.

Помещённые на минимальную среду («голодный» агар) конидии В. cinerea и F. oxysporum хорошо прорастали как при 20-22° С, так и при 26-28° С. Между тем, конидии В. cinerea, инкубируемые при 5-7°С, прорастали слабо, а конидии F. oxysporum в данных условиях разрушались. Также при инкубировании конидий В. cinerea и F. oxysporum при 20-22° С и 26-28° С наблюдалась агрегация их конидий между собой, а в случае с F. oxysporum также происходило образование вздутий на проросших гифах, которые затем преобразовывались в конидиеносцы с макроконидиями данного гриба.

2. Доказано, что из ряда исследованных декоративных растений грибными факультативными паразитами в большей степени поражалась пеларгония щитовидная {Pelargonium peltatum (L.) L'Her.), а в случае с

В. cinerea и F. oxysporum — акалифа гаитянская (Acalypha hispaniolae Urb.) и шлюмбергера Бакли (Schlumbergera х buckleyi Hunt) соответственно. Напротив, фикус Бенджамина (Ficus benjamina L.) и гибискус китайский (Hibiscus rosa-sinensis L.) не поражались или поражались в незначительной степени всеми протестированными грибами. Также при инфицировании данных растений по всем тестируемым патогенам наблюдалась реакция сверхчувсвительности, а также развитие мицелия грибов сапротрофно по поверхности листьев. Установлено, что обязательным условием инокуляции грибными факультативными паразитами растений являлось предварительное поранение листьев. В большинстве проведённых нами опытов инокуляция патогена суспензией конидий была эффективнее, чем инфекционно-мицелиальным блоком.

3. Выявлена разнонаправленная активность растительных экстрактов из звездчатки средней (Stellaria media (L.) Vill.) и ежовника обыкновенного {Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) по отношению к грибным факультативным паразитам. Экстракт из звездчатки средней оказывал ингибирующий эффект на проявление агрессивности A. alternata и В. cinerea, в то время как стимулировал проявление агрессивности В. sorokiniana и F. oxysporum. Экстракт из ежовника обыкновенного оказывал стимулирующий эффект на проявление агрессивности A. alternata и F. oxysporum, а также на В. cinerea в концентрациях 1 и 0,5 мг/мл. В концентрациях 2 и 0,25 мг/мл этот же экстракт оказывал на В. cinerea ингибирующий эффект. Воздействие экстракта из ежовника обыкновенного в отношении В. sorokiniana было разнонаправленным. Следовательно, его эффективность по отношению к данному патогену не установлена.

4. Установлено, что в условиях in vitro и in vivo поражение петунии садовой фитопатогенным грибом В, cinerea достигало 100 % через неделю после инокуляции. Максимальную агрессивность гриба на цветках петунии садовой выявляли при инокуляции её мелкодисперсным опрыскиванием суспензии конидий гриба. Показан ингибирующий эффект (снижение итогового индекса агрессивности в 1,5-10 раз по сравнению с контролем) действия экстракта из звездчатки средней при поражении В. cinerea петунией садовой (Petunia х hybrida (Vilm.) Hort. in vitro, а также отсутствие какого-либо эффекта данного экстракта в испытаниях in vivo с этим патогеном.

Практические рекомендации

Использовать пеларгонию как универсальное тест-растение для исследований проявления агрессивности Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schi, и выявления стимулирующей или ингибирующей активности веществ различной природы, доступных в ограниченных количествах, против данных фитопатогенов.

Список публикационных работ по теме диссертации

1. Рогожин, Е. А. Биологическая активность пептидных экстрактов лекарственных растений против фитопатогенных грибов и оомицетов / Е. А. Рогожин, И. И. Тепкеева, Д. В. Зайцев, В. П. Демушкин, А. Н. Смирнов // Доклады РАСХН. - 2011. - № 4. - С. 34-37.

2. Рогожин, Е. А. Микрометод определения фунгистатической активности белков растительного происхождения [Сравнительное тестирование активности 28-альбуминов одуванчика в отношении ряда фитопатогенных грибов] / Е. А. Рогожин, Д. В. Зайцев, А. Н. Смирнов // Известия ТСХА. -2011,-№5.-С. 79-84.

3. Золфагари, А. Фитофтороз и альтернариоз картофеля и томата при аномальных погодных условиях в Московской области / А. Золфагари, В. В. Антоненко, Д. В. Зайцев, А. А. Игнатенкова, А. Г. Мамонов, Р. В. Пенкин, А. Ю. Понггаренко, А. Н. Смирнов // Защита и карантин растений.-2011.-№ 12.-С. 40-42.

4. Зайцев, Д. В. Использование микологических технологий для оптимизации тест-систем испытаний биологически активных веществ / Д. В. Зайцев, А. Золфагари, Е. А. Рогожин // Междунар. науч. конф. молодых учёных и специалистов / Рос. гос. аграр. ун-т - МСХА им. К. А. Тимирязева. — 2012. — том I,-С. 31-32.

5. Зайцев, Д. В. Оптимизация способности конидий фитопатогенного гриба Alternaria alternata к образованию колонии, в зависимости от температурных условий инкубирования и среды выращивания // Междунар. науч. конф. молодых учёных и специалистов, посвящ. 125-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова / Рос. гос. аграр. ун-т - МСХА им. К. А. Тимирязева. -2013.-С. 31-32.

6. Рогожин, Е. А. Методология оценки эффективности действия различных веществ на грибы - факультативные паразиты - по прорастанию конидий / Е. А. Рогожин, Д. В. Зайцев, А. Н. Смирнов // Доклады ТСХА / Рос. гос. аграр. ун-т - МСХА им. К.А. Тимирязева. - 2011. - выпуск 283 часть 1. - С. 243-246.

Подписано к печати 15.11.2013. Формат 60х84/16. Усл.-печ. л. 1,6. Тираж 100 экз. Заказ №458.

Отпечатано в издательском центре ФГБОУ ВПО МГАУ: 127550, Москва, Тимирязевская, 58

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Зайцев, Дмитрий Викторович, Москва

ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева

На правах рукописи

04201451700

Зайцев Дмитрий Викторович

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМ ИСПЫТАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

РАСТЕНИЙ ПРОТИВ НЕКОТОРЫХ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ ИЗ ОТДЕЛА

ВЕиТЕКОМУСОТА

Специальность: 06.01.07-Защита растений

Научный руководитель -д. б. н., профессор Смирнов Алексей Николаевич

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

Содержание диссертации

1. Введение.....................................................................................6

2. Цели и задачи исследования............................................................9

3. Обзор литературы:

а) Описание декоративных растений..................................................10

б) Описание некоторых фитопатогенных грибов из отдела Несовершенные грибы (Anamorphic fungi)..........................................17

в) Методы работы с фитопатогенными несовершенными грибами в лабораторных условиях...............................................................24

г) Методы оценки активности веществ различной природы против фитопатогенных грибов и бактерий................................................25

д) Некоторые методики испытаний веществ различной природы против фитопатогенных грибов...............................................................30

е) Агрессивность фитопатогенных грибов и связанные с ней показатели.....33

4. Место проведения исследований.........................................................35

5. Материалы, использованные в работе:

а) Искусственные питательные среды................................................35

б) Культуры фитопатогенных грибов, используемые в опытах..................37

в) Декоративные растения, используемые в опытах...............................37

г) Сорта роз, используемые в опытах.................................................38

д) Экстракты растительного происхождения, используемые в опытах........38

6. Методики проведения экспериментов:

а) Оптимизация условий прорастания конидий фитопатогенных грибов

Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem.

{Helminthosporium sativum Pam.), Botrytis cinerea Pers.,

Fusarium oxysporum Sehl...............................................................39

б) Оптимизация условий роста колонии и образования конидий фитопатогенных грибов Alternaria alternata (Fr.) Keissl. и Botrytis cinerea Pers., в зависимости от среды выращивания и температурныхусловий......................................................................40

в) Оптимизация способности конидий фитопатогенного гриба Alternaria alternata (Fr.) Keissl. к образованию колонии, в зависимости от температурных условий инкубирования и среды выращивания............................................................................41

г) Определение влияния минимальной среды («голодного» агара) на рост и развитие конидий фитопатогенных грибов Botrytis cinerea

Pers. и Fusarium oxysporum Sehl......................................................42

д) Оценка лепестков различных сортов роз на возможность

заражения их фитопатогенным грибом Botrytis cinerea Pers..................43

е) Оценка листьев различных сортов роз, на возможность

заражения их фитопатогенным грибом Botrytis cinerea Pers..................44

ж) Оценка ряда декоративных растений на возможность заражения их фитопатогенными грибами Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem. (Helminthosporium sativum Pam.),

Botrytis cinerea Pers., Fusarium oxysporum Sehl..................................45

з) Оценка активности экстрактов растительного происхождения из звездчатки средней {Stellaria media (L.) Vill.) и ежовника обыкновенного {Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) в отношении фитопатогенных грибов Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris

sorokiniana Shoem. {Helminthosporium sativum Pam.), Botrytis cinerea

Pers., Fusarium oxysporum Sehl.......................................................46

и) Оценка бутонов петунии садовой (гибридной) (Petunia х hybrida (Vilm.) Hort.) на возможность заражения их фитопатогенным

грибом Botrytis cinerea Pers...........................................................48

к) Оценка активности экстракта растительного происхождения из звездчатки средней (,Stellaria media (L.) Vill.) в отношении фитопатогенного гриба Botrytis cinerea Pers в лабораторных и природных испытаниях на петунии садовой (гибридной) {Petunia х hybrida (Vilm.) Hort.).................................................................49

7. Результаты и обсуждение: а) Оптимизация условий прорастания конидий фитопатогенных грибов

Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem. (Helminthosporium sativum Pam.), Botrytis cinerea Pers.,

Fusarium oxysporum Sehl...............................................................52

б) Оптимизация условий роста колонии и образования конидий фитопатогенных грибов Alternaria alternata (Fr.) Keissl. и Botrytis cinerea Pers., в зависимости от среды выращивания и

температурныхусловий......................................................................65

в) Оптимизация способности конидий фитопатогенного гриба Alternaria alternata (Fr.) Keissl. к образованию колонии, в зависимости от температурных условий инкубирования и среды выращивания............................................................................78

г) Определение влияния минимальной среды («голодного» агара) на рост и развитие конидий фитопатогенных грибов Botrytis cinerea

Pers. и Fusarium oxysporum Sehl......................................................95

д) Оценка лепестков различных сортов роз на возможность

заражения их фитопатогенным грибом Botrytis cinerea Pers.................108

е) Оценка листьев различных сортов роз, на возможность

заражения их фитопатогенным грибом Botrytis cinerea Pers.................114

ж) Оценка ряда декоративных растений на возможность заражения их фитопатогенными грибами Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem. (Helminthosporium sativum Pam.),

Botrytis cinerea Pers., Fusarium oxysporum Sehl.................................117

з) Оценка активности экстрактов растительного происхождения из звездчатки средней {Stellaria media (L.) Vill.) и ежовника обыкновенного {Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) в отношении фитопатогенных грибов Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem. {Helminthosporium sativum Pam.), Botrytis cinerea

Pers., Fusarium oxysporum Sehl......................................................143

и) Оценка бутонов петунии садовой (гибридной) {Petunia х hybrida (Vilm.) Hort.) на возможность заражения их фитопатогенным

грибом Botrytis cinerea Pers..........................................................171

к) Оценка активности экстракта растительного происхождения из звездчатки средней {Stellaria media (L.) Vill.) в отношении фитопатогенного гриба Botrytis cinerea Pers в лабораторных и природных испытаниях на петунии садовой (гибридной) {Petunia х hybrida (Vilm.) Hort.)...............................................................175

8. Выводы....................................................................................184

9. Практические рекомендации.........................................................186

Введение

Фитопатогенные несовершенные грибы из родов Alternaría, Bipolaris (Helminthosporium), Botrytis, Fusarium являются очень опасными патогенами, поражающими множество сельскохозяйственных и декоративных культур. В годы эпифитотий потери от этих грибов достигают от 40 до 100%.

Между тем, существуют трудности и проблемы, возникающие при лабораторной работе с фитопатогенными несовершенными грибами:

1. Проблема с образованием конидий. Известно, что по мере субкультивирования несовершенных грибов способность к образованию конидий ослабевает и теряется. Грибы переходят исключительно к вегетативному росту.

2. Проблема с прорастанием конидий. Отслеживать прорастание конидий на стандартных питательных средах не представляется возможным. При этом прорастание конидий - это принципиальный ключевой этап, непосредственно с которого начинается инфекционный процесс. Прорастание конидий возможно в водных каплях и специальных растворах. Но следует учитывать, что в этом случае конидии попадают в анаэробную среду, и процесс их прорастания может нарушаться. В этой связи, с методической точки зрения не понятно как тестировать антифунгальную активность веществ на основе сравнительного изучения ингибирования прорастания конидий.

3. Проблема с контаминацией. Рост колоний несовершенных грибов на стандартных питательных средах сопровождается контаминацией другими грибными и бактериальными организмами, которые нередко проходят свой жизненный цикл быстрее основной культуры. Это приводит к подавлению или полному ингибированию роста основной культуры, что делает не возможным дальнейшее проведение экспериментов с ней.

4. Проблема с подбором и инфицированием растений-хозяев. В отличие от облигатных паразитов, факультативные паразиты не способны к

стабильному инфицированию растений-хозяев, их органов и тканей. Если облигатные паразиты эффективно поражают определённый спектр растений-хозяев, то факультативные паразиты такой выраженной детерминированной способностью не обладают. С одной стороны, потенциальный спектр растений-хозяев весьма широк. С другой стороны, растения-хозяева инфицируются факультативными паразитами в разной степени, этот процесс зависит от многих факторов (экологических и физиологических). Поэтому подобрать тест-набор растений-хозяев и определённые условия для инокуляции данным факультативным паразитом бывает достаточно сложно.

5. Проблема с тестированием веществ различной природы в очень малых количествах. Повсеместно вырабатывается множество веществ различной природы, потенциально пригодных в различных сферах защиты растений. Однако на этапах первичного синтеза и скрининга количество этих веществ не превышает нескольких десятков или сотен микрограмм, что препятствует их эффективному тестированию на предмет выявления антимикробных свойств.

Для устранения этих трудностей и проблем мы оптимизировали некоторые факторы и методики проводимых экспериментов.

Оптимизируемые факторы

1. Условия образования конидий:

- температурные условия;

- агаризованные среды.

2. Условия прорастания конидий:

- агаризованные среды.

3. Контаминация субстратов.

4. Подбор тест-растений.

5. Подбор условий и способов инфицирования тест-растений.

6. Эффективность тестирования различных веществ, находящихся в очень малых количествах, против грибных факультативных паразитов.

Оптимизация методик. Заключалась в комплексном использовании стандартных методик с учётом оптимизируемых факторов для возможности проведения первичного лабораторного скрининга веществ, находящихся в очень ограниченных количествах, на предмет выявления их активности против некоторых фитопатогенных несовершенных грибов.

Научная новизна. Усовершенствованы методики определения агрессивности грибных факультативных паразитов на растениях-тестерах, позволяющие оценивать интенсивность роста, спороношения и токсичность данных грибов. Выявлены различные эффекты (от ингибирующего до стимулирующего) белковых и органических экстрактов, выделенных из звездчатки средней (Stellaria media (L.) и ежовника обыкновенного (Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) на развитие Alternaría alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schl.

Практическая ценность работы. Предложенный нами комплексный подход, объединяющий и оптимизирующий различные методики определения прорастания конидий и инфекционного потенциала Alternaría alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schl. в лабораторных условиях, существенно облегчает проведение данных исследований и тестирований. Выявлен in vitro существенный фунгистатический эффект экстракта из звездчатки средней (Stellaria media (L.) Vill.) на рост и развитие Botrytis cinerea Pers.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - провести комплексные лабораторные исследования, направленные на оптимизацию методик определения активности веществ, доступных в очень малых количествах, против Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schi..

Для выполнения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Оптимизация образования и прорастания конидий, а также роста колоний некоторых, использованных в работе, грибных факультативных паразитов при различных условиях инкубирования.

2. Оценка агрессивности Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schi, в отношении ряда декоративных растений.

3. Выявление эффекта растительных экстрактов белковой и органической природы из звездчатки средней {Stellaria media (L.) и ежовника обыкновенного {Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) на Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schi.

Обзор литературы

1. Описание декоративных растений

1. Акалифа дубравиколистная {Acalypha chamaedrifolia (Lam.) Mull. Arg.). Более известна под именем Акалифа гаитянская (Acalypha hispaniolae Urb.). Представитель семейства Молочайные (Euphorbeaceae).

Произрастает в Латинской Америке (Сааков, 1985).

Стелющееся растение, побеги раскидистые поникающие. Листья светло-зелёные, сердцевидные, длиной до 4 см, очередные, край листа зубчатый. Соцветия колосовидные, опушённые, ярко-красные, поникающие от 3 - 4 см до 10 см.

Выращивается как почвопокровное и ампельное растение.

Растение часто поражается тлёй, белокрылкой, паутинным клещом, а также различными пятнистостями (Сааков, 1985).

2. Гибискус китайский (китайская роза) {Hibiscus rosa-sinensis L.). Представитель семейства Мальвовые (Malvaceae).

Произрастает в Юго-Восточной Азии, Китае (Eden, 1986).

Вечнозелёный кустарник или вечнозелёное дерево, достигающее в природе 3 - 6 м в высоту. Листья темно-зелёные, блестящие, удлиненно-овальные и удлиненно-яйцевидные, гофрированные, зубчатые по краю. Цветки одиночны, узкие бутоны превращаются в широкие чашечки 8 - 14 см в диаметре, простые или махровые, с 5 лепестками. Тычинки собраны в длинную трубочку. В культуре встречаются разновидности с белой, жёлтой, оранжевой, розовой и красной окраской цветков. Каждый цветок живёт всего 1-2 дня, но при правильном уходе новые цветки будут появляться с ранней весны до глубокой осени (Дюваль-Строев, 1986).

Гибискус китайский используют для различных типов озеленения внутреннего интерьера.

Растение поражается белокрылками, паутинным клещом, трипсами (Eden, 1986).

3. Ежовник обыкновенный (Echinochloa crusgalli (L.) Beauv.). Представитель семейства Злаки (Gramineae) или Мятликовые (Роасеае).

Произрастает почти повсеместно. Широко распространён во многих районах европейской части России, в Сибири и на Дальнем Востоке. (Kucewicz, Holdynski, 2003)

Стебель высотой 15 - 100 см, от основания ветвистый, с прямостоячими или коленчато изогнутыми в нижних узлах утолщёнными стеблями. Листья до 2,5 см ширины, голые, по краям острошероховатые. Соцветие метельчатое, густое, часто однобокое, длина до 20 см. Колоски одноцветковые, яйцевидные, сидящие по 2 - 4 на коротких ножках по одну сторону веточек. Колосковых чешуй большей частью три, из них две верхние, часто с длинной остью. Цветёт в июле - сентябре. Размножается и распространяется семенами. (Kucewicz, Holdynski, 2003)

На полях - злостный сорняк. Хорошее пастбищное и сенокосное растение, может служить кормом для домашнего скота и птицы. (Wesolowski, Kokoszka, 2007)

4. Звездчатка средняя (мокрица) {Stellaria media (L.) Vill.). Представитель семейства Гвоздичные (Caryophyllaceae).

Распространена в европейской части СНГ, на Дальнем Востоке, Кавказе, в Западной и Восточной Сибири. Растёт в тенистых местах, по лесным опушкам, по берегам рек и ручьев, на пашнях, как сорняк в садах и огородах. Это растение всегда влажное, так как впитывает воду не только корнями, но и стеблем (Соколова, Будревская, 2012).

Однолетнее или двулетнее травянистое растение. Имеет тонкий корень. Стебель лежащий или приподнимающийся, слабый, тонкий, ветвистый, высотой 10 — 30 см. Листья супротивные, цельнокрайние, яйцевидные, коротко заострённые. Нижние листья черешковые, верхние -сидячие. Цветки белые, правильные, обоеполые, мелкие, на длинных

11

цветоножках, с двухраздельными лепестками, располагаются в пазухах и на верхушках стеблей. Цветёт в мае - октябре. Размножается семенами. Созревание плодов начинается в июле. Плод представляет собой коробочку с многочисленными округлыми или почковидными семенами (Дудкин, Шмат, 2008).

Звездчатка средняя широко используется в медицине, в пищу и на корм скоту. Она обладает противовоспалительным, антисептическим, ранозаживляющим, кровоостанавливающим, рассасывающим,

противоцинготным, тонизирующим свойствами (Guil et al., 1996).

5. Роза. Розой называют дикорастущие и выведенные в культуру виды и сорта представителей рода Шиповник {Rosa L.). Представитель семейства Розовые (Rosaceae).

Произрастает практически во всех областях земного шара, но основная их часть сконцентрирована в умеренной и субтропической зонах Северного полушария. Встречаются виды, растущие в условиях сурового климата (Заурембеков, 2010).

Основная природная форма - куст. Форма куста может быть от раскидистой до узкопирамидальной. Высота куста от 30 до 90 см (чайно-гибридные и флорибунды); 30 - 45 см (полиантовые), 25 - 35 см (миниатюрные). Также существует группа плетевидных роз, представляющих собой кустарники с плетевидными, дугообразными стелющимися побегами от 2,5 до 6 м длиной (Аксенова, 2007).

Корневая система дикорастущих, ботанических видов состоит из главного стержневого корня и отходящих от него боковых корней. У растений, размножаемых вегетативным путем (т.е. черенками), корневая система не имеет главного корня, а представляет собой несколько разветвлённых боковых корней (Аксенова, 2007).

Надземная часть розового куста у дикорастущих видов - это побеги, выросшие из нижних почек корневой шейки. У выведенных сортов роз они

тянутся из привитой части культуры и бывают разными по возрасту, толщине и длине.

Листья у розы непарноперистые, с различным числом листочков: обычно их бывает 5 - 7 у ботанических видов европейского происхождения и 5-9-у гибридов (Аксенова, 2007).

Прилистники у роз являются важным признаком при определении их вида. Например, �