Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие ультрафиолетового излучения на гемоглобин человека

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Действие ультрафиолетового излучения на гемоглобин человека"

19 ИЗ В'

ТП7Т ГТГГ Т. * ГГГ^

г • '' ' ' М X Л-'-Ч^Г^А-!

ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРГДСЭЗГО Х?ЛС""ГО СШ-'ЯШ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕКЕЕРйЛЕЧ

На правах ^г-.опг.с:* УДК 577.344:541.14:612.111

ТАЮГСККЛ-ВАЛЕРИЙ ИВАНОВИЧ

ДЕТСТВЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО иаллЕ^ш НА ГЗ.ЮГЛОЕШ ЧЕЗОЗЕКА.

03.00.С2 - Биофизика

Автореферат тпссэртацпн на соистслшз

кандидата йиолгтескгх

ЛЕНИНГРАД 128Э

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Ленинградского ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственного университета г кафедре физиологии человека и гпвотных химико-бколо-пгческого факультета Сыктывкарского государственного ушзерситета та.50-летия СССР-

Научше руководители:

доктор биологических наук, профессор Л.И.Иряак кандидат биологических наук, доцент А.В.Лонекий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор М.Н.Маслова доктор биологических наук, профессор Ю.Я.Кисляков

Еедуцач организация - Институт гематологии и переливания крови ЫЗ РСССР (г.Ленинград)

Защита диссертации состоится й нр • I10 часов на заседании специализированного Совета К 063.57.09 по присуждении ученой степени кандидата биологических наук при Ленинградском государственном университете (199034, Ленинград, Университетская наб. 7/9).

С диссертацией могно ознакомиться в библиотеке Ленинградского государственного университета.

Автореферат разослан /А,!^'

Ученый секретарь специализированного Совета доктор биологических наук

В.К.Павленко

»ртаций

ОЩЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность- проблемы. Гемоглобин человека относится к наиболее изученные белкам (Иргак, 1375; , йшлич1, 1571;

, 1982). Возможность соотнесения конечных эффектоз различных воздейстннй, изменяющих функциональные свойства гемоглобина, с изменениями его структурной организация имеет большое теоретическое и практическое значение для выявления взаимосвязи структуры и функций но только гемоглобина, но я других белков.

Ультрафиолетовое излучение (УСИ) является постоянным экологическим фактором. Предполагается, что УФИ мозет воздействовать на кровь непосредственно через колу (Самойлова, Дуткевнч, 1965). До сосочкового слоя дермы проникает от 10 до 30? излучения с длиной волны от 230 до 315 вм, а длинноволновое УФИ могет проникать и з еде более глубокие слои дермы • (Ер ^ Г е с и- , 1377; Р п-•иък е^л. 1978). Непосредственному воздействии УФИ подвергается кровь, которуэ извлекают из организма человека в ходе лечения различных заболеваний методом реинфузии облученной ультрафиолетом аутокрови (Дуткевич и др., 1986; Карандалоз, Петухов, 1985; Потапов, Че.'яинаьа, 1982; Трещлнсхнй и др., 1984; Холмогоров и др., 1988). В этой связи представляет больше значение анализ тех структурных и функциональных изменений, которые происходят з крови з целом и з отдельных бе компонентах под действием УТИ до возвращения облученной крови в" кровяное русло.

Одной из важнейших функций крови является связывание и перенос кислорода и углекислого газа. Этот процесс обеспечивается гемоглобином, содержащимся в красных клетках крови - эритроцитах. Под действием 7®1 происходит изменение структуры и ряда физико-химических свойств гемоглобина (Артпхоз, 1978;1965; Ар-тахоз, Шмелев, 1970; 1972; 1973; Тимофеев и др., 1980; Холмогоров и др., 1962; 1960) и мембран эритроцитов (Пеленицын и др., 1975; Рощушин и др., 1988; Савельев и др., 1981; Самойлова, Дуткевлч, 1986; Холмогоров и др., 1988; Соок, 1975). Однако к настоящему времени практически не изучен вопрос об изменении функциональных свойств гемоглобина под действием У®, в первую очередь его основной функции - обратимого присоединения кислорода. Эти изменения можно озядать, исходя из имеющихся данных о структурных нарушениях, вызываемых действием УФИ. Большой интерес представляет изучение изменений конечного эффекта

этого воздействия на гемоглобин, характеризующийся разной сте пеньо окспгенации или помещенный в среду с разными значениями рН. Имеющиеся в литературе данные (Иркак к др., 1985; Ирсак, Тюрнин, 1985) указывают на зависимость функциональных свойств гемоглобина от структурно-функционального состояния мембраны эритроцитов. Можно предполагать, что при УО-облученик эритроцитов конечный эффект 7® на гемоглобин будет опосредоваться изменением структуры и функциональных свойств эритроцитарной мембраны.

Цель исследования. Цель исследования состояла в изучении изменений структуры и функциональных свойств гемоглобина чело века под действием Уй1.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. изучить влияние различных доз УФК на сродство гемоглобина к кислороду при облучении крови и растворов гемоглобина.

2. исследовать спектрофотометрическк.ш метода.«. (абеорбци онная и разностная спектрофотометрия) в видимой и УФ областях спектра структурные изменения гемоглобина под действие;.: УФК ж сопоставить эти изменения с кгслородосвязувдаш свойствами этого белка.

3. определить влияние исходного состояния гемоглобина (за висячего от степени оксигенацЕЕ, ыеста локализации, величинк и состава раствора) на измененио структурно-функциональных от пений в гемоглобине под действием УФИ.

Научная ЕЭЕкзка габотк. Впервые показаны изменения сродст гемоглобина человека к кислороду под действием УФИ и выявлены два варианта этих изменений в зависимости от того, находится гемоглобин во время облучения в эритроцитах или в раствора, Знзрдке установлена зависимость структуры и кислородосЕязукщ свойств гемоглобина под действием У'И от степени окскгенацги гемоглобина, от места его локализации (в эритроцитах или вне. от величины рН и состава раствора гемоглобина.

Нзгчп:',я, д .крзкткчсокас значимость работы заключается в то что в ней представлены данные о зависимости структурно-фупкцк еельных. свойств гемоглобина человека от дозы УФ", от моста лс калЕзации гемоглобина ъо гремя облучения, от рН и состава сро да е от степени сксЕгепациЕ колеяулы гемоглобина. Прздлэ.тгн способ (Авторское свидетельство & 1522917) увеличения сродзтл

гемоглобина к кислороду путец облучения крозз улътрафиолэтошггн лучами, который мояэт найти применение з практике лабораторных исследований для моделирования различных структурно-фуняцзоналъ-ных состояний молекулы гемоглобина.

Результаты изучения действия 7<К1 па структуру и функциональные сзойства гемоглобина вхлэтеш в темы учебных занятий по курсам биофизики и физиологии системы крови на кафедре физиологии человека и зевотных Сыктывкарского государственного университета и могут быть использованы з соответствующих курсах з других зыс-елх учебных заведениях.

!га заттт? выносятся слодузетв основные положения диссертационной работы:

1. 75И вызывает в гемоглобине человека ряд структурно-функциональных изменений, глубина которых зависит от исходного кои-формаписЕного состояния молекулы гемоглобина, которое определяется степенна его оксягеизцаи, рЗ и составом среды, а такге местом локализации гемоглобина во время облучения (внутри эритроцитов зли вне их).

2. Под влиянием 7Л1 крош и растворов .гемоглобина происходит увеличение сродства гемоглобина к кислороду. 7"»-сблучеппе гемоглобина в растворе приводит к "замораживания" молекулы гемоглобина в конформалии, которая характеризуется повнзвннагл сродством к кислороду. Увеличение сродства гемоглобина к кислороду происходит езо за счет частичного окисления гемоглобина до метгемоглобина. При 7Ф-облученип эритроцитов увеличение сродства гемоглобина к кислороду опосредуется изменением внутриэрит-роцитарноЗ среды, з частности, увеличением величины рН.

3. Увеличение сродства гемоглобина к кислороду при 7Ф-облу-ченяи крови мояет вносить' определенный вклад в паблзздаему з клинической практике и в лабораторных исследованиях сксигенаишз венозной крови во время ее облучения.

Аппобапия работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуздены на Всесоюзных рабочих совещаниях по проблема "Газотранспортная функция крови з механизмы ее регулирования" (Сыктывкар, 1984, Гродно 1985, 1987, 1989, Нальчик -1983), Еа Всесоюзном симпозиуме "Кровообращение в условиях высокогорной и экспериментальной гипоксии" (Фрунзе 1986), на съезде Всесоюзного физиологического общества им.Павлова (Кишинев 1957), на Всесоюзной конференции "Биохимия - медицине" (Ленинград 1988), на научных семинарах кафедры биофизики Ленинградского государственного

университета и кафедры физиологии человека е животных Сыктывкарского государственного университета им.50-летия СССР.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ.

Обт>ем у, сттт7кт7Т>я лисс^тутятцтч. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов п методов исследований, изложения собственных результатов и их обсуждения. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 13 таблицами. Список литературы Еключает 127 отечественных и 174 иностранных источника.

МАТЕРИАЛЫ К МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследований служила донорская кровь к раствори гемоглобина, приготовленные из этой крови. Для изучения др*ствия УСИ на функциональные свойства гемоглобина использовали растворы гемоглобина, имегеяе концентрацию 150 мкМ/л. Исследование динамики различиях фор,: гемоглобина под действием УС-'' и разностных спектров гемоглобина проводили на растворах гемоглобина с концентрацией 35 мкМ/л. Otísiyio концентрацию гемоглобина в' PS.otkoji.2x определяли цлагглеггекогаобиаорьтй методом.

Облучение крови р. растворов гемоглобина проводили полшл: ссектрои ртутно-кварцлвой лампк ДРТ-400. Дозу облучения определяла <^рр"оксалат)гл.1 ачтгномотро:.-: по Паркеру (Паркер, IS72). 06-лтчепе в точение одно' иогутк соответствовало дозе 17.2 кД",/м^. Дозу облучена варгпровали, пзкоек? вро'в? облучения образцов. Образ:.'!; крови и растворов го^оглоЛпиа облучали в откротом гогос-i:o~o:rjo!í ессудс црл пс^наткс.* тег.иорагурз, Пс-рсглсзтпЕалпо образце.- производили пр:: помощи иепштяо* ¡¿егалк::'.

Спектр;.: погло!?еюк крови и гемолиза гоз получали на регистрируй^.- скзктро.*стс:.!отро Cí-IC. Спектр;; йс-пто^енгк растворов гемоглобина получали на автоматическом регистрирующем споктрофотсмет-pe T-jifícrd !' 40 (ГДР). На ном so получали разкосткке спектрг: ГГ-облучсцíkí растворов гекоглобпва постов необлучешшх растворз

Коадегтгздлз с::сп~, дезонси- и «етге^глобииа определяли, измерял оптическую плотность растворе?. гемоглобина ггри 550, '576 и 630 на на спектрофотометре Cí-26 ( Rc.inh е1 к., 1973).

Процесс установления равновесия мезэду эритроцитами и 0.145 М раствором хлорзда натрия изучали по методу, описанному в работе ( К'лсеу 4 7 с , 1978).

Для определения сродства гемоглобина к кислороду получала

кривые дезоксигенадии сксзгемоглобина спектрофотометрическим методом (бе пегA e-i о., 1965) при 680 ем. Измерение оптйЧЗСЕСЙ четности растворов гемоглобина при различных значениях р02 производили в специальной спектрофотометрической ответе с десатуратором (Воронова, Гладилов, 1976) на спектрофотометре СФ-26. На основании полученных значений оптической плотности при заданных р02 строили кривые дезоксигенации оксигемоглобина, из которых определяли величину р02, при котором насыщение гемоглобина составляло 502.

Щелочной эффект Бора в интактннх и УФ-облученных растворах гемоглобина определяли, исходя из величины сродства гемоглобина к кислороду в 0.1 М фосфатных буферных растворах гемоглобина с рН 6.72 и рН 7.37 при температуре 37°С.

Значения рН, р02 и рС02 в крови измеряли на микроанализаторе крови EME (Дания). Степень насыщения крови кислородом измеряли на оксиметре OSM-I (Дания).

Полученный экспериментальный материал подвергался статистической обработке. Достоверность отличий между средними значениями оценивали с помощью критерия Стьвдента.. Различия признавали достоверными при уровне значимости меньше 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Присутствие в вашшх для функционирования молекулы гемоглобина на местах остатков ароматических аминокислот, которые являются акцепторами энергии УЭД, позволяет предположить, что результатом действия У®1 на гемоглобин должны быть изменения его функциональных свойств, в том числе и его сродства к кислороду. Действительно, наши эксперименты подтвердили это предположение. УФ-облучение водных незабуференных растворов гемоглобина приводит к сдвигу кривых дезоксигенации оксигемоглобина влево, то есть к увеличению его сродства к кислороду, причем тем в большей степени, чем выше доза облучения (рис.1). УФ-облучение растворов гемоглобина сопровождалось небольшим (на 0.1 ед. рН при дозе 68.8 ¡сДж/м2) увеличением рН облученных растворов гемоглобина. Однако, ааблвдаемые изменения сродства УФ-облученных растворов гемоглоби-ía нельзя объяснить увеличением величины рН этих растворов. Попытка вычисления боровских коэффициентов для облученного гемоглобина тоивела к необычно высоким значениям (-2.38 при дозе 68.8 кДз/м2). Ложно предположить, что результатом действия УФИ на гемоглобин шляется нарушение структуры игленно тех участков молекулы гемог-

Рис Л. Изменение сродства гемо- Рис.2. Зависимость прироста глобина к кислороду при УФ-об- сродства к кислороду (отнесен-лучении растворов гемоглобина. ного к приросту концентрации

МетНв) от концентрации НетНв.

лобина, которые несут ответственность за нормальный щелочной эффект Бора, вследствие чего изменяется зависимость сродства к кислороду от концентрации протонов.

Для проверки этого предположения мы определили величину щелочного эффекта Бора при облучении растворов гемоглобина дозой 34.4 кД*/м . Эффект Бора под действием УФ-облучения растворов гемоглобина снизился почти на треть, с -0.44£0.03 в контроле до -0.3Ci0.02 в опыте. Таким образом, увеличение сродства к кислороду гемоглобина, облученного в растворе, не может быть объяснено увеличением рН растворов гемоглобина, происходящего при УФ-облу-чении растворов.

Одной из возможных причин изменения кислородосвязующих свойств гемоглобина под действием УФИ, приводящих к увеличению его сродства к кислороду, могут быть те фотохимические превращения в молекуле. которые приводят к переходу атомов железа гемов из ферро-в феррисостояние, то есть к образованию метгемоглобина. УФ-облу-чение иезабуферекшс растворов ге/.юглобина (35 мк-"/л) показало, . что при увеличении дозы облучоппя до 6Б.8 кДя/м2 линейно возрастает концентрация метгемоглобина от 1.3+0.2 до 27.5+1.0?. Одновременно с увеличением кокцентрапии метгемоглобина линейно падает концентрация оксигемоглобина от 33.7+1.2/5 в контроле до в6.9+1.1£ при облучении дозой 68.6 кДж/м".

Из Бес т но (Ссис.^ , Лечении, 1942; (.Ч :1Л ^ <л.. 1965, 1956), что присутствие в растворе оксигемоглобина других (Тори гемоглобина, таких как метгемоглобин, оказывает влияние на равновесие гемоглобина к кислорода. Так. при частичном окислошж

оксигемоглобина феррицианидом кадия кривая равновесия оставшегося неокисленным гемоглобина сдвигается влево, что означает увеличение сродства неокисленного гемоглобина к кислороду. В этом случае зависимость прироста сродства гемоглобина к кислороду (л р50), отнесенная к приросту концентрации метгемоглобина (д МетНв), от концентрации метгемоглобина линейна (йсига^ , КоиоИги, 1942). Зависимость, полученная нами при фотохимическом окислении оксигемоглобина под действием У® носит иной характер. По мере увеличения концентрации метгемоглобина, образующегося при росте дозы облучения, величина д р50/л МотНв сначала растет, а затем снижается с максимумом при 23 2Ъ% метгемоглобина (рис.2). Подобная зависимость прироста сродства к кислороду от кощентрации метгемоглобина, образовавшегося под действием У'2", свидетельствует о слозных процессах, протекающих внутри белковой молекулы, в частности в местах контактов ме.тду глобином и гемовшет группами. Изменения в области этих контактов приводят к серьезным последствия, таким, ках усиленное метгемоглобинообразовашхз и изменение сродства гемоглобина к кислороду, о чем свидетельствует призеры аномальных гомоглобинов,

Нарушения структуры молекулы гемоглобина з областях контактов ме-тду глобином и гемами под действием У'-'И могут проявляться во время <5ункцяонгроБ21й!л гемоглобина, то ость з процессе отдачи и прпсоззаЕекяя кяслорога. 72-облучение растворов гемоглобина вызывает снижение устой-сив эети гемоглобина :: окисления при переходе оксигемоглобина в дезот-.пигемогдобпн при снижении сорциаяьЕОГо напряжения кислорода в растворе. В иктактном растворе гемоглобина при снижении р02 (например, до 20 мм рт.ст.) увеличения кон-центршил метгемоглобина при превращении скспгемогяебпка з дез-оксигемоглобин не происходит. Снижение величины рС9 до 20 мм рт. ст. з облученных разными доза-,я УГП растворах приводит к дополнительному образованию метгемоглобина по сравнение с тем- его количеством, которое образовалось при атмосферном р02, что свидетельствует о том, что в процессе перехода УФ-облученного оксигемоглобина в дезоксигемоглобин проявляется скрытые до этого повреждения в молекуле гемоглобина, вызванные воздействием 7"А. Так, при облучении растворов оксигемоглобина (35 мкМ/л) дозой 137.6 кДд/м2 образуется 41.8+1.6$ метгемоглобина. При скн.-онии РО2 в этом раствора до 20 мм рт.ст. концентрация метгемоглобина оказалось равной 53.8+1.4$.

Таким'образом, структурные перестройки, индуцированные У?-

облучением гемоглобина в растворе, приводят к изменению его функциональных свойств, а также к образованию мэтгемоглобина. Дезорганизация связей между глобином и темами в результате фотомодификации остатков ароматических аминокислот, которые участвуют в формировании этих связей, создает благоприятные предпосылки для окисления атомов железа гемов продуктами свободнорадикальной природа, образующимися при фотодеструкции ароматических аминокислот и в результате взаимодействия гидратированннх электронов с молекулами кислорода и воды. Разрушение старых и образование новых связей приводит к стабилизации, "замораживанию" молекулы гемоглобина в конформации, характеризующейся повышенным сродством к кислороду.

Изменение кислогюдосвязтших свойств гемоглобина после ультрафиолетового облучения крови

Ультрафиолетовое облучение крови приводит к изменению кисло-родосвязующих свойств гемоглобина, а именно к увеличению сродства гемоглобина к кислороду (табл.1), причем при увеличении дозы облучения увеличивается и сродство к кислороду (снижается величина р50). Из таблицы видно, что одновременно растет рН незабуференных растворов гемоглобина (150 мкМ/л), приготовленных из облученной крови, что свидетельствует об увеличении величины рН внутриэрит-роцитарпой среды. Последнее обстоятельство наводит на мысль о том, что наблюдаемое увеличение сродства гемоглобина к кислороду при ультрафиолетовом облучении крови может происходить по механизму щелочного эффекта Бора, что позволяет вычислить значения воровских коэффициентов (табл.1). Обращает на себя внимание тот факт, что полученные значения боровских коэффициентов оказались меньше по абсолютной величине, чем это характерно для нормального гемоглобина при физиологических условиях. Однако, наши эксперименты по изучению влияния Yffl. на щелочной эффект Бора показали снижение боровских коэффициентов дня гемоглобина, облученного в растворе до-8ой 34.4 кДх/м2. По-видимому, п при облучении крови также изменяется зависимость между .сродством гемоглобина к кислороду и концентрацией протонов.(эффект Бора), вследствие чего величина боров-скях коэффициентов уменьшается до таких же значений, что и при облучении растворов гемоглобина. Облучение крови дозой 68.8 кДд/м приводит к тому, что щелочной эффект Бора, оставаясь ниже по своей величина, чем в контроле, отличается от него на меньшую величину. Аналогичная картина наблгщается и при УФ-облучении растворов гемоглобина с разными значеьлага рН той же дозой 68.8 кДя/м'. Тают образом, наблюдается определенное сходство в изменения

щелочного эффекта Бора под влиянием ультрафиолетового излучения на кровь и растворы гемоглобина при разных значениях рН. Увеличение сродства гемоглобина к кислороду при облучении крови происходит по механизму эффекта Бора, сниженного по абсолютной величине в результате воздействия УФИ на кровь.

Таблица I

Изменение рН, р50 и дГГ1" гемоглобина после ультрафиолетового облучения крови (г\,= 8)

; Доза облучения, кДж/м

0 ! 34.4 ! 68.8 ! 137.6

р50 мм рт.ст. РН 20.5+0.8 7.27+0.04 -0.44+0.03 19.2+0.9 7.37+0.07 -0.29+0.06° 17.1+0.7° 14.8+0.4° 7.49+0.05° 7.62+0.07° -0.35+0.07 -0.41+0.07

различия достоверны, р «' О.Оо

Вклад метгемоглобинообразования в увеличение сродства гемоглобина к кислороду при действии УФИ на кровь незначителен по сравнению с УФ-облучением растворов гемоглобина, поскольку количество метгемоглсбина, образующегося при УФ-облучении крови, невелико. Так, при облучении крови дозой 68.8 кДж/м^ образуется всего 6.3$ метгемоглобина, тогда как при облучении такой же дозой растворов гемоглобина образуется 27.5£ метгемоглобина.

Изучая спектры поглощения крови, характеризующейся различным насыщением гемоглобина кислородом, мы установили, что венозная кровь (с пониженной концентрацией оксигемоглобина) менее чувствительна к воздействию УФИ, чем крова, содержащая преимущественно оксигемоглобин (искусственно артериализованнаэ). Облучение окси-генированной крови приводит к снижению оптической плотности при 548 и 576 нм. Одновременно с'этил происходит рост оптической плотности в области 500-505 и 620-630 нм, что свидетельствует о нарастании концентрации метгемоглобина. УФ-облучение венозной крови такими же дозами также приводит к модификации спектров поглощения, но характер изменений иной. Облучение дозой 8.6 кДг/м^ приводит к снижению оптической плотности при 548 и при 576 - 578 ям. Одновременно наблюдается угглмцешго небольшого пика при 576 км, который приобретает форму плеча. Увеличение дозы до 17.2 кДз/м2

приводит к еще больше:,ту падению оптической плотности в этой области. Дальнейшее увеличение дозы облучения вызывает сдвиг максимума поглощения при 548-550 нм, который все более уплощается и весь спектр приобретает черты, характерные для дезоксигениро-ванноЗ крови. На фоне этих изменений наблюдается небольшой рост поглощения в области 620-630 нм. Облучение полностью дезоксиге-инрованной крови такими не дозами (до 68.8 кДж/м) не приводит к заметным изменениям параметров спектров поглощения ни при 5555-30 нм, ни з области 620-630 нм. Эти наблюдения позволяют пред-яолозить различную УО-чувствителькость оке и- к дезоксигемогло-бпка, которые характеризуются различны,»; конйоркацпоншыи сос-тол;ня:.п:.

Различая з кокбормацкя оксигемоглобина и дззокслгекоглобвка прояэдязгся в раонсстншс спектрах. РазносткнЛ спектр оксигемоглобина против дезокспгемсглобпна в ультрафиолетово;- облает;: спектра демонстрирует узкил пик при 283 и при 291 н.1, нало.мен-ныл на широкую полосу с максимумом при 275 ¡и. Возгакповеше узкого максимума при 291 ш приписывается пертурбациям в мпкро-оздешоя Три 37 ¡ъ , расположенному в области I- ¿>2-мбЗзубге;з-шяшп контактов и играадвму клячевус р(ш» в контор: квдюкьзх переходах молекулы гемоглобина в процессе оксигелгхж - дезоксгг9~ нагцги (йшЫ , , 1370; Ьча; , 1973; 1,»ч„. Л «.Г. , 1972).

Обнаружена тесная корреляция мезду амплитудо.'; разностного спектра оксигемоглобина против дезокспге.чоглобина и параметрам кривой связывания гемоглобином кислорода.

Ультрафиолетовое облученпо оксигемоглобина приводит к изменению разностных спсггров облученного оксигемоглобина против но облученного дозоксигемсглобина. С ростом дозы от 8.6 до 25.8

наблюдается уменьшение амплитуд;! широкой полосы с максимумом при 275 им и узгаэс пиков при 283 и 291 ел. Изменения разнос тш-гх спектров облученного оксигемоглобина против пнтактного в области пика при 291 ел свидетельствует об изменении микроок-ружешш остатков Три 37р, происходящим при ультрафиолетовом облучении оксигемоглобина.

Различия конформацлл океи- и дезоксигемоглобина, характеризующиеся, в частности, наличием в последнем сетки солезых мостиков, в результате чего конформашя дезоксигемоглобина является ботсе жесткой, напряденной, обусловливают различную чувствительность гемоглобина, находящегося з различных конформациошшх сос-

тояниях, к воздействии ультрафиолетового излучения. Сравнение изменений в разностных спектрах облученного окспгемоглобнна против нооблучешюго и облученного дезоксигемоглобина против необлу-ченного дезоксигемоглобпна в области поглощения метгемоглобяна (627-630 нм) отчетливо указывает на большую чувствительность с-сиконфорлации к воздействию ультрафиолетового излучения.

■ Столь яе отчетливые различия в действии ультрафиолетового излучения демонстрирует гемоглобин, помещенный в буферные растворы с различными значениями рН. В таблице 2 представлены результаты определения некоторых функциональных свойств гемоглобина под действием ультрафиолетового излучения (доза 34.4 кДя/м2) в зависимости от рН раствора гемоглобина б 0.1 фосфатном буфере.

Таблица 2

Изменение р50 и константа Халла гемоглобина под действий.

У'3-излученпя (34.4 кДк/м^) при различ1шх рН облучаемого раствора в 0.1 М фосфатном буфере (д-= 5)

Доза ! р50, мм рт.ст. ! п- 50

кДя/м2 ! рН 6.72 ! рН 7.37 ! рН 6.72 ! рН 7.37

0 34.2+0.8^ 17.7+0.5 3.09+0.IIя 2.33+0.16

34.4 24.9+1.6 16.0+1.2 2.02+0,06 2.60+0.05

" - различия достоверны, р < 0.001

Из таблицы видно, что изменения под действием ультрафиолетового излучения сродства гемоглобина к гаслороду и константы Хилла сильно зависят от р1Г облучаемого раствора. ТТрп облучении раствора с рН 7.37 сродство к кислороду гемоглобина увеличивается в среднем на д.5%, в то время как при облуч<Аин раствора гемоглобина с рЛ 6.72 приводит к увеличению сродства на 27.б*. Такие se заметные отличия в зависимости от plî облучаемого раствора гемоглобина. наблюдается и в отношении константы Хилла. Обучение раствора с рН G.72 приводит к снижению величины это! константы почти на 35%, тогда как в щелочном растворе с plî ?.?7 "онстапта Хилла. возрастает.

Конформацлонное состояние молекулы бэшл мо~ет изменять его чувствительность к ультраЗдо/.егог-.тлу излучения двумя путями: чэ-рез кодификация ^отохжзг-ос:^ o.-.vr.': лрзосса и через изменение устойчивости белковой молекулы н ета'плг.ггим фотопродуктам.

В настоящее время невозможно с определенностью сказать, какой из указанных путей реализуется в случае действия ультрафиолетового излучения на гемоглобин, находящийся в различных конформацгонных состояниях, в результате чего по разному изменяются его кислород' связующие свойства. Однако можно предполагать, что конкретный путь изменения фоточувствительности в зависимости от исходного конформационного состояния будет реализоваться в связи с тем, каково окружение гемоглобина во время его облучения.

Таким образом, ультрафиолетовое облучение крови приводит к изменению структуры и функциональных свойств гемоглобина. Фотохимические реакции в молекуле гемоглобина изменяют валентное состояние части атомов лелеза гемов, что ведет к увеличению сродства к кислороду оставшихся неокисленными гемов в результате кон-фсрмацконных перестроек в тетрамерной молекуле гемоглобина. Определенный вклад в изменение структурно-функциональных взаимоотношении в гемоглобине под влиянием ультрафиолетового излучения вносит сдвиг конформационного равновесия между окси- и дезокси-конформацшзми в сторону оксиконформации, характеризующейся повышенным сродством к кислороду. Глубина фотохимических изменений, приводящих к модификации кислороде вязуюцих свойств гемоглобина, облученного ультрафиолетом, находится в зависимости от исходного конформационного состояния молекул гемоглобина, которое определяется степенью оксигенации, рН и солевым составом мккроокру-кения. При облучении крови, где гемоглобин находится в эритроцитах, мембраны которых под действием излучения претерпевают ряд структурно-функциональных превращений, микроокружение гемоглобина, зависящее от барьерной и транспортной функций эритроцитар-ных мембран, может модифицировать определенные стадии фотохимических реакций, приводящих в конечном итоге к инактивации гемоглобина, которая проявляется в выключении части гемов из процесса обратимого присоединения кислорода, однако вклад процесса мотгемоглобинообразования в изменение кислородсвязующих свойств гемоглобина при ультрафиолетовом облучении крови невелик. Определяющим процессом, приводящим к увеличению сродства гемоглобина к кислороду при облучении крови, по нашему мнению, является процесс подщелачивания взутриэритроцитарной среды с последующим увеличением сродства к кислороду по механизму щелочного эффекта Бора.

- 15 -

БЫЕОДй

I. Впервые обнаружено, что ультрафиолетовое облучение- крови

"'л) ь Д!'.аП-;Зоне до;- от 17.2 до

рода, причем, чем больна доза обяучо:вм, т^-м боль?» у«:.~:чпваз?-оя сродство гемоглобина к кислороду.

2. Выявлено, что непосредственная причина уволзчегк« сродства гемоглобина к кислороду под дс-Лсг.-ие.1 у.пдрзф..одетое о^ е излучения зависит от места локализации гкюглобяна во :ре:;д облучения: если гемоглобин во время облучения находится г. эритроцитах, то его сродство к кислород? позгаст?"? за счет уестпгстят величина рН внутриэритроцитр.рноЛ среда по ь:еязишу ¡цзлетпого эффекта Бора; если гемоглобин во время облуче-де находится в растворе, то его сродство к кислороду. Бтзедста-ji за сче. чгс.::,ч::ого фо-гоокисления гемоглобина д. ме~де; дедобп

3. Впервые установлено, чю зави,.". зелъ уззлпдоддл сродства гемоглобина к кислороду от конце.дтеее" • огт-моглзбзнп, образующегося под действием ультре^дееегел-е э .ол/чепня, иосг.г иней характер, чем при хиилчесх«® iiou;¿<¡ns гееог^обипа.

4. Показано, что ультра^ ..одедзег^ с ч^-.екг.е раегззрев гемоглобина (150 шс.5/л) диз&Л З-i.-í vw д-д; едд: л судеотводному (болэо чем яа 30^) сни£екша щвдечныч» lopa.

5. Анализ абсорбционных крлси и разностных одздтрзз растворов гемоглобина б области 420-050 им, доказал, что чем мзнь-ие степень оксигенацдд ге-ялоб^п«, :с: :с::е,'дз мстгемсглобппа образуется под действием улътраТ-полетсвсгз получения.

6. Показано, что др:: рЛ сол} ¿сексго дезед 34.4 иДт/м' раствора гемоглобина, раыюм С.72, уде.дл-;д.::е средства г. ддсдорзду происходит яа больную вод::длиу, пр.: 7.37. Таддс в с::дьдл": степени от рЛ облучаемы:: растворов ге'мегдеепдд зазпепт измс-иг.™: геп-стакты Хилла.

7. Установлено, что сб-г^едле растворов гегдеглойша дозе"

в два раза иокьиое средами к кислороду, чем о'дуде-

гд:е нозабуферешп:;:. ¿.сотд'.р-.л та:ед :." е.дденерапди и ГТЬ

сродства гемоглобина л кпело-

зтдем бу.'.сре, тдддд

- IG -

(RiSCZ i^GT, {^JEOKOBÄHHU» ПО TEE ДИССЕРТАЦИИ

1. Ир^ак Л."., Vsi;]-c:<3:I B.II. Изменение сродства к кислороду гемоглобина человека и кролика под действием ультрафиолетового излучения // Сизяол. rjpii.CCCP. - I28S. - Ii 10. - C.I402-I405.

2. Ирнак I.И., Тазрзкий В.И. Изменение свойств гемоглобина ин витро // Редкол. :*урн. "Биол.науки". '<!.: I9S5. -7 с.-Еибл.: 6 назв. - Деп. в КП21ТЛ 16.05.86, JS I4I4-B86.

0. Тазрскпй В.И., Ирга:: Д.И. Гипоксия и ультрафиолетовое облучение крови // ¿Кровообращение в условиях высокогорной и экспериментальной гипоксии. Тез. П Бсесоюзн.симп. - Зрунзе, 1383. -С.173-174.

4. "ржак Л. П., Тагрский Б.'Л., Сафронов В.Б., Еубунин A.B., Луппог-а Л.Г. Действие ультрафиолетового облучения и прогрева-1П1Л на эритроциты и гемоглобин // 1У съезд Бсесоюзн. физиол. общества им.Павлова. Тез. докл. - Кишинев, 1987. - Т.2. -

С.436-437.

5. Таарсхий В.И., Иржак Л.К. Ультрафиолетовое облучение крови с различной степенью насыщения кислородом // Биохимия - медицине. Молекулярные- механизмы формирования па-.¡логических состояний. Тез. докл. Бсесоюзн. конф. - Л., 1988. -- C.I8S.

о. Иржак Л.И., Тапрсклй В.П., Сафроноз В.З., Здробилко Л.В. Общие принципы действия некоторых факторов среды на эритроциты и гемоглобин // Ускорение социально-экономического развития Урала. Тез. докл. научно-практ. конф. - Свердловск, 1989. -4.2. - С.52.

7. Иргах Л.И., Таврский В.И. Способ определения сродства гемоглобина крови к кислороду // Авторское свидетельство ü I522917, 1989.