Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные изменения некоторых транспортных белков в пленке, индуцированные ВУФИ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные изменения некоторых транспортных белков в пленке, индуцированные ВУФИ"

РГБ (Ь *«С€И8ГГ

На правах рукописи

ПАНТЯВИН АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ В ПЛЕНКЕ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ВАКУУМНЫМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 1999

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Артюхов В.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Санкт-Петербургский госуниверситет

Зашита диссертации состоится 29 июня 1999 года в 1322 на заседании диссертационного совета Д 063. 48. 11 при Воронежском государственном университете по адресу: 394693, г. Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан 28 мая 1999 года Ученый секретарь диссертационного совета,

Рощупкин Д.И.,

кандидат физико-математических наук, ст. научн. сотрудник Додонова Н.Я.

доктор биологических наук, доцент

Ковалева Т.А.

0.13

о

20

40

60

80

кДж/мг

Рис. 1. Дозовые кривые изменения оптической плотности гемоглобина 1 - при 576 нм; 2 - при 630 км

1.61,4г

1.2Ь

!

1г

!

0.8 Ь 0.6 0.4 0.2 0

278 нм 190 нм

Ряс. 2. Эффект снижения оптической плотности сывороточного альбумина при переходе белка из раствора в состояние пленки 1 - раствор; 2 - пленка

спираль) к 1535 см-' (беспорядочная структура). Однако при увеличении энергети ческой экспозиции до 300 кДж/м2 наблюдается достоверное уменьшение этого со отношения в полосе Амид II, что свидетельствует в пользу представления о кон формационном переходе белка из состояния спирали в форму статистической клубка, обусловленном разрывом слабых внутримолекулярных связей в белковы: молекулах (табл. 4).

Таблица

Соотношение иитенсивностей 1546/1535 см-1 полосы Амид II в условиях ВУФ-

облучения молекул бычьего сывороточного альбумина

Необлученная пленка бычье- Энергетическая экспозиция барьерной

го сывороточного криптоновой лампы, кДж/м:

альбумина 100 150 300

1.16+0,02 1,1510,02 1,1410,02 1,1110,01

Таким образом, проанализированные результаты указывают на нарушени типов вторичной структуры молекул сывороточного альбумина под влиянием в;: куумного ультрафиолетового излучения.

ГЛАВА 5. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СВОЙСТВА ВУФ-ОБЛУЧЕННЫХ МС ЛЕКУЛ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА

С целью проверки предположения о модификации состояния ароматически аминокислот в составе белковой макромолекулы после воздействия ВУЗ излучения были изучены флуоресцентные свойства молекул сывороточного альб; мина в растворе и после растворения его тонких пленок. Показано, что положен! максимума при А=:342 нм и его интенсивность в спектре флуоресценции образц: полученного после перевода интактнои пленки в раствор, не изменяется.

Под влиянием вакуумного ультрафиолетового излучения 30-144 кДж/м: пр< исходит уменьшение интенсивности флуоресценции при 342 нм, обусловленное и менением состояния триптофан и лов в молекуле альбумина.

Падение квантового выхода флуоресценции при рН>8 связано, по-видимом с "разворачиванием" белковой глобулы и фотодеструкцией триптофанила под во действием ВУФ-юлучения (рис. 3).

Анализ полученных результатов позволяет нам выдвинуть предположение том, что при ВУФ-облучении альбумина в сухом виде преобладающим процессе дезактивации высоковозбужденного состояния молекул белка является ионизацн

ервичные нарушения молекулы реализуются, по-видимому, при последующем 1створении белка, когда происходят разрыв химических связей триптофанилов и «личные конформационныг перестройки белковых молекул.

ГЛАВА 6. ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕ-КИЕ СВОЙСТВА ВУФ-ОБЛУЧЕННЫХ МОЛЕКУЛ БЕЛКОВ

Показано, что при облучении молекул альбумина в дозе 72 кДж/мг в изучае-ой системе накапливается хроматографическая фракция с молекулярной массой, ревышающей молекулярную массу, соответствующую димерной форме молекулы, [ри увеличении энергетической экспозиции до 300 кДж/м2 происходит дальнейшее «ижение содержания мономерной фракции и накопление продукта с большим эффективным объемом, что свидетельствует в пользу представления об ассоциации олекул белка под действием ВУФ-излучения (рис. 4).

Получены сведения о характере изменения поверхностного заряда макромо-екулы под влиянием вакуумного ультрафиолета.

Установлено, что изменение электрофоретнческих свойств альбумина после ;УФ-облучения обусловлено разворачиванием белковой молекулы за счет ослаб-ения и разрыва слабых внутримолекулярных связей (в частности, водородных), зменением общего числа ионогенных групп.

При облучении пленок альбумина в диапазоне длин волн 131-161 нм с энерге-ической экспозицией 24-30 кДж/м2 не происходит статистически достоверных избиений в количестве и характере распределения эяехтрофореткческих фракций табл. 5).

Таблица 5

Величины электрофоретической подвижности фракций иеоблученных и

ВУФ-модифицированных молекул бычьего сывороточного альбумина (рН 6,0)

Доза облучения, Относительная электро форетическая подвижность

кДж/м2 Первая фракция Вторая фракция Третья фракция

0 0,46±0,02 0,63+0,01 0,86±0,02

24 0,44±0,01 0,62+0,01 0,87±0,01

30 0,44+0,01 0,60+0,02 0,84+0,02

72 - 0,65+0,01 0,94±0,01

0.5г

.Ис

0,4 Ь

0.3^

[ рН 6,0

]

0.2 г

0.1 г

0'-

г рН 3,3

п

I !

Рис. 3. Изменение квантового выхода флуоресценции ВУФ-облученных молекул сывороточного альбумина при различных значениях рН среды I - после ВУФ-облучения в дозе 30 кДж/м2; 2 - после ВУФ-облучення в дозе 144 кДж/м:

О

1.5 г

0.5

3 9 15 21 27 33 39 45 51 57 63 мл

Ряс. 4. Профили злюшш молекул бычьего сывороточного альбумина при ВУФ-облученни его образцов

! - контроль (необлученный образец); 2 - после ВУФ-облучения в дозе 72 кДж/м; - после ВУФ-облучения в дозе 300 кДж/м2

а

Однако при увеличении энергетической экспозиции до 72 кДж/м- наблюдается уменьшение количества электрофоретических фракций до двух и увеличение подвижности самой быстрой из этих фракций, обусловленное возрастанием величины отрицательного заряда молекулы сывороточного альбумина. Эти данные, по нашему мнению, свидетельствуют об ассоциации молекул белка под действием ВУФ-излучения.

При изучении электрофоретических свойств ВУФ-облученных молекул сывороточного альбумина в услоьиях различного микроокружения (температура 40сС, рН среды 8,3) наблюдали сходные изменения в характере распределения и количестве фракций после ВУФ-облучення в дозе 30 кДж/м2, что, по-видимому, свидетельствует в пользу представления о процессах ассоциации, протекающих под влиянием УФ-света (рис. 5).

Таким образом, при ВУФ-облучении сывороточного альбумина повышается его кажущаяся молекулярная масса, причем при облучении дозами, не превышающими 72 кДж/м2, происходят конформационные перестройки в молекулах белка, а при больших дозах происходит образование белковых агрегатов.

Анализ собственных результатов выявил факт увеличения степени фотомоди-фикационных изменений в молекуле сывороточного альбумина с возрастанием дозы ВУФ-излучения в области светологлощения пептидными группами белка (131-161 нм).

Сравнение данных, полученных различными методами, свидетельствуют в пользу представления о том, что ассоциация бычьего сывороточного альбумина сопровождается глубокими структурными изменениями белковых макромолекул.

ГЛАВА 7. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ВУФ-ОБЛУЧЕННЫХ МОЛЕКУЛ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА И ГЕМОГЛОБИНА Облучение комплекса альбумин-краситель при значениях рН 2,8; 6,0 светом криптоновой барьерной лампы в дозе 30 кДж/м2 вызывает уменьшение соотношения интенсивностей флуоресценции при 465 к 400 им. При изменении величины рН падал выход флуоресцентно-связанного АНС, что можно объяснить снижением константы скорости связывания АНС с белковыми макромолекулами (рис. 6).

Указанные изменения эффективности фотопроцессов, происходящих в белковых молекулах под действием ВУФ-излучения (131-161 нм), могут быть связаны с разрушением одного из трипгофанилов, находившегося на поверхности белковой

облучении его образцов

1 - контроль (необлученный образец); 2 - после ВУФ-облучения в дозе 72 кДж/м2; - после ВУФ-облучения в дозе 30 кДж/м2 при температуре 40 °С

I

50-

Рис. 6. Спектры флуоресценции ВУФ-облученных молекул сывороточного альбумина в комплексе с АНС при рН 6,0

1 - контроль (необлученный образец); 2 - после ВУФ-облучения в дозе 6 кДж/м2; 3 после ВУФ-облучения в дозе 24 кДж/м2; 4 - после ВУФ-облучения в дозе 30 кДж/м

>булы при получении пленки, и сохранением другого, который при растворении )еходитв слой структурированной воды.

ВУФ-облучение пленок белка светом криптоновой барьерной лампы в дозе 30 ж/м2 вызывает смещение кривой кислотно-основного титрования в область чьших значений рН, что свидетельствует в пользу представления о повышении верной емкости облученного белка (рис. 7). Наблюдаемые изменения кислотно-ювных свойств ВУФ-облученной макромолекулы сывороточного альбумина гут быть связаны с ее разворачиванием л экспонированием титруемых зарядов поверхность белковой глобулы.

Это означает, что ВУФ-излучение индуцирует разрыв слабых внутримолеку-рных связей и увеличение объема белковой макромолекулы, сопровождаемое зрушением ее гидрофобного ядра.

При исследовании кислородсвязывающих свойств молекул гемоглобина пока-но, что минимальная из выбранных экспозиционных доз 6 кДж/м2 приводит к ггистически достоверному уменьшению величины Рм кривой диссоциации окси-иоглобина до 14,17±1,11 мм рт. ст. по сравнению с контролем (необлученный об-зец белка), что указывает на увеличение сродства гембелка к кислороду (рис. 8). эи этом взаимодействие субъединиц в олигомере характеризуется отрицательной оперативностью (константа Хилла составляет величину 0,9 ¡±0,04), означающей груднение связывания молекул лиганда каждой последующей субъединицей ге-»протеида.

Анализ полученных результатов позволяет сделать заключение о взаимо-йствии молекул полученных форм гемоглобина и возможном образовании ассо-1атов гембелка.

Таким образом, структурно-функциональная модификация сухих белков под ^действием ионизирующего ВУФ-излучения происходит как в результате пря-лх химических изменений в макромолекуле, так и вследствие дезорганизации 1сших типов ее пространственной организации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Методами спектрофотометрии, регистрации кривых диссо-тации оксигемоглобина и кислотно-основного титрования, диск-электрофореза, :ль-хроматотрафии, люминесцентного анализа и флуоресцентных зондов изучены •руктурно-функциональные изменения молекул бычьего сывороточного альбу

Рис. 7. Кривые кислотно-основного титрования молекул сывороточного альбумина

1 - контроль (необлученная пленка белка); 2 - после ВУФ-облучения в дозе 6 кДж/м1; 3 - после ВУФ-облучения в дозе 30 кДж/м2 % НЮ? 100

80

60

40

20

0

0 20 40 60 80 100 Ро2, ммрт.ст. Рис. 8. Кривые диссоциации оксигемоглобина

I - контроль (необлученный образец); 2 - после ВУФ-облучения в дозе 6 кДж/м2

1ина и гемоглобина человека, индуцированные воздействием вакуумного ультра-)иолетового излучения в диапазоне длин волн 131-187 нм в дозах 6-600 кДж/мг, в словиях различного микроокружения.

В результате комплексного изучения действия ВУФ-излучения на структуру и руакции альбумина и гемоглобина обнаружено, что ВУФ-свет в интервале длин юлн 131-161 нм и диапазоне доз (6-400) кДж/м2 индуцирует изменение функцио-)альных свойств белков. Степень структурно-функциональных нарушений опреде-шется структурным состоянием белковых макромолекул, их наибольшая фотола->ильность проявляется при значениях рН среды, экстремальных для проявления ши своей функциональной активности (рН 2,8 и 8,3), а также в случае предварительной инкубации молекул белков при повышенных температурах.

Под влиянием ионизирующего ВУФ-излучения наблюдается конформацион-шй переход белковых молекул из состояния спирали в форму статистического слубка, что находит отражение в изменении ИК-спектров поглощения их тонких хленок.

При ВУФ-облучении происходят конформационные превращения молекул эычьего сывороточного альбумина, что находит отражение в изменении оптических, флуоресцентных, электрофоретических, гель-хроматографических и буферных свойств фотомодифицированного белка. Нами показано, что наблюдаемые при воздействии ВУФ-света изменения структурно-функциональных свойств альбумина являются следствием разворачивания белковой глобулы, а также фотомодификации ароматических аминокислот в составе молекулы белка.

Влияние ВУФ-излучения на сывороточный альбумин проявляется в ассоциации его молекул вследствие преобладания процессов фотоионизации над процессами фотодиссоциации в исследуемой системе.

Степень структурных нарушений белковых молекул больше при облучении светом криптоновой лампы с энергией квантов 7,7-9,4 эВ по сравнению с действием лампы барьерного разряда в ксеноне за счет фотодеструкции различных электронных состояний пептидных групп, а также повышения роли фотоионизационных процессов в изменении состояния аминокислотных остатков в белке.

Анализ экспериментальных данных позволил нам предложить схему процессов, приводящих к структурным перестройкам и модификации функциональных свойств транспортных белков крови (рис. 9). В соответствии с этой схемой ВУФ-свет в области поглощения пептидных связей белковых молекул индуцирует нару-

шения высших типов их пространственной организации, что приводит к изменению функциональных свойств белковых макромолекул.

Схема возможных процессов фотомодификаций молекул транспортных белков

ВУФ-издучение (7,7-9,4 эВ)

I

Интактное состояние молекулы

4-

Поглощение энергии ВУФ-света алифатическими аминокислотами, боковыми группами ароматических аминокислот и пептидными группами белка

4- I

Конформационные изменения: разворачивание Миграция энергии на геи белковой молекулы за счет ослабления и разрыва (Ре+- Ре+3)

слабых внутримолекулярных связей

д, 1

Модификация состояния Ассоциация молекул белка

ароматических аминокислот 1

Изменение функциональных свойств белковой макромолекулы

Рис. 9.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что степень снижения оптической плотности бычьего сыворо точного альбумина при переходе белка из раствора в состояние пленки составляем 5-16% при 190 и 280 нм, что связано с созданием регулярной пространственно{ структуры в молекулах белка при высушивании его образцов.

2. Установлено, что вакуумное ультрафиолетовое излучение (6 хДж/м2) вызы вает спад интенсивности полосы поглощения бычьего сывороточного альбумин; при 278 нм, вплоть до ее полного исчезновения с увеличением энергетической экс

юзиции до 144 кДж/м2, что может быть связано с глубокими деструктивными провесами в ароматических аминокислотах белка.

3. С помощью метода ИК-спектроскопии выявлено, что уменьшение соотношения интенсивности полос поглощения при )546 см-1 к 1535 см-1 после облучения 1 дозе 300 кДж/м2 свидетельствует в пользу конформационного перехода белка из ;остояния спирали в форму статистического клубка.

4. Вакуумное ультрафиолетовое облучение образцов бычьего сывороточного шьбумина в дозе 30 кДж/м2 сопровождается ассоциацией молекул белка.

5. Фотофлуоресцентным методом установлено, что под влиянием вакуумного ультрафиолетового излучения (30 кДж/м2) происходит снижение интенсивности флуоресценции при 342 нм, обусловленной изменением состояния триптофанилов з составе молекулы сывороточного альбумина.

6. Показано, что ВУФ-облучение,(72 кДж/м2) вызывает увеличение кажущейся молекулярной массы сывороточного альбумина.

7. Степень структурных изменений белковых молекул повышается под влиянием вакуумного ультрафиолетового излучения с энергией квантов, превышающей потенциалы ионизации белка и его компонентов (8 эВ).

В. Вакуумное ультрафиолетовое излучение (131-161 нм) в дозе 72 кДж/м2 индуцирует переход оксигемоглобина в метгемоглобин.

9. Показано, что вакуумное ультрафиолетовое облучение (6 кДж/м3) обусловливает взаимодействие молекул окси- и метгемоглобина, что проявляется в обра-¡о.вании ассоциатов гембелка.

10. Структурно-функциональная модификация сухих белков под воздействием тонизирующего ВУФ-излучения происходит как в результате химических изменений в макромолекуле, так и вследствие дезорганизации высших типов ее простран-:твенной организации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пантявин A.A., Артюхов В.Г., Вашанов Г.А. Исследование фотопроцессов з пленках гемоглобина и сывороточного альбумина под действием вакуумного ультрафиолетового излучения //Физ.-хим. основы функц. белков и их компл: Тез. докл. - Воронеж: ВГУ, 1995.- С.99-100.

2. Пантявин A.A., Артюхов В.Г., Вашанов Г.А., Лавриненко И.А. О структурных изменениях молекул бычьего сывороточного альбумина, индуцированных ва-

куумным ультрафиолетовым излучением 1/1 Всероссийская конференция фотоби логов: Тез. докл. - Пущино, 1996.- С.84.

3. Артюхов В.Г., Пантявин A.A., Вашанов Г.А. О структурных изменени: молекул бычьего сывороточного альбумина и оксигемоглобина человека, индуц рованных вакуумным ультрафиолетовым излучением //Первичные фотофизичесю и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации: М териалы Совещания - семинара заведующими кафедрами биофизики и преподав телей, читающих курс "Биофизика". - Воронеж: ВГУ, 1996. - С.7-11.

4. Артюхов В.Г., Вашанов Г.А., Лавриненко И.А., Пантявин A.A. Молекуля ные механизмы воздействия у- и УФ-радиации на гемоглобин в растворе и в сост ве эритроцитарной клетки //Антенно-фидерные устройства. Системы и средст! радиосвязи: Материалы III Международной научно-технической конференцш Воронеж: ВГУ, 1997,- Т. 1.- С. 256-263.

5. Артюхов В.Г., Пантявин A.A., Вашанов Г.А., Гаврюшкин О.В. Изменен! оптических свойств молекул гемоглобина, индуцированные вакуумным ультр фиолетовым излучением //Светоизлучающие системы. Эффективность и примен ние,-Саранск: МордГУ, 1997.-С.112-114.

6. Пантявин A.A., Артюхов В.Г., Горбунова И.А., Вашанов Г.А. Изменен! гель-фильтрационных свойств молекул бычьего сывороточного альбумина, инд цированные вакуумным ультрафиолетовым излучением //Физиология и психоф зиология мотиваций: Материалы межрегиональной научной конференции, поев щенной 80-летию со дня рождения проф. А.И. Лакомкина и 80-летию Воронежск го госуниверситета.- Воронеж: ВГУ, 1997,-С. 109-111.

7. Пантявин A.A., Артюхов В.Г., Вашанов Г.А. Анализ электрофоретическ! свойств молекул бычьего сывороточного альбумина после воздействия вакуумнь ультрафиолетовым излучением //Эколого-физиологические и физико-химичесю основы взаимодействия биосистем с окружающей средой /Под общ. ред. В.Г. А тюхова.- Воронеж: ВГУ, 1998,- С.118-123.

8. Пантявин A.A., Вашанов Г.А., Артюхов В.Г. Спектрофотометрическ; оценка фотопревращений ВУФ-облученных молекул гемоглобина //Материалы съезда фотобиологов России.- Пущино, 1998,- С. 246-247.

9. Пантявин A.A., Артюхов В.Г., Вашанов Г.А., Малюженко Е.В. Конформ ционные изменения молекул сывороточного альбумина при различных значени:

, индуцированные вакуумным ультрафиолетом //Физико-химические основы жционирования белков и их комплексов: Материалы II Международного сим-иума,- Воронеж: ВГУ, 1998,- C.I68-172.

10. Артюхов В.Г., Пантявин A.A., Вашанов Г.А. Изучение структурно-1хциональных изменений ВУФ-облученных молекул сывороточного альбумина годом флуоресцентных зондов //Физиология и психофизиология мотиваций: »региональный сборник научных работ, посвященный 80-летию Воронежского университета,- Воронеж: ВГУ, 1998.- Вып. 2.- 59-61.

11. Пантявин A.A., Артюхов В.Г., Малюженко Е.В., Вашанов Г.А. Флуорес-пные свойства молекул бычьего сывороточного альбумина: воздействие ваку-кого ультрафиолетового излучения //Организация и регуляция физиолого-эхимических процессов.- Воронеж: ВГУ, 1998.- С.108-111.

12. Артюхов В.Г., Пантявин A.A., Вашанов Г.А. Изменения структурного со->яния молекул гемоглобина под действием вакуумного ультрафиолетового об-1ения //Тез. доп. II зЪду Украшського б'юф1зичного товариства.- XapKiB, 1998.->35.

13. Артюхов В.Г., Пантявин A.A., Вашанов Г.А. Физико-химические основы шмодействия вакуумного ультрафиолета с молекулами сывороточного альбу-на //Альбумин сыворотки крови в клинической медицине /Под ред. Ю.А. Гры-юва и Г.Е. Добрецова,- М.: ГЭОТАР, 1998,- С.202-205.

14. Пантявин A.A., Артюхов В.Г., Вашанов Г.А. Структурно-функциональные менения молекул гемоглобина человека, индуцированные вакуумным ультра-олетовым излучением //Актуальные вопросы экологии и охраны природы эко-стем южных регионов России и сопредельных территорий,- Краснодар: КубГУ, Э9.-С.150-151.

15. Пантявин A.A., Артюхов В.Г., Вашанов Г.А. Структурно-функциональные менения молекул сывороточного альбумина, индуцированные вакуумным уль-афиолетовым излучением //Физика в биологии и медицине,- Екатеринбург: Ур-

1999,- С.86-87.

Заказ Jf«22 Я атЗ?. SJ999 г. Тир. fOO экз. Лаборатория оперативной полиграфим ВГУ

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пантявин, Андрей Александрович, Воронеж

о

Воронежский государственный университет

На правах рукописи

Пантявин Андрей Александрович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ В ПЛЕНКЕ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ВАКУУМНЫМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ

03.00.02 - Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

^ < I/ Научный руководитель

Ни доктор биологических

наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Артюхов В.Е.

Воронеж - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структура и физико-химические свойства некоторых транспортных белков крови...................................................................................13

1.1. Структурно-функциональные и физико-химические свойства сывороточного альбумина..................................................................................13

1.1.1. Структура молекулы сывороточного альбумина.......................13

1.1.2. Оптические свойства молекул сывороточного альбумина.........20

1.1.3. Функциональные свойства сывороточного альбумина..............24

1.2. Структурно- функциональные и физико-химические свойства гемоглобина.......................................................................................................27

1.2.1. Структура молекулы гемоглобина..............................................27

1.2.2. Спектральные характеристики гемоглобина..............................34

1.2.3. Связывание и перенос лигандов гемоглобином..........................36

Глава 2. Действие вакуумного ультрафиолетового излучения на аминокислоты и белковые системы......................................................................45

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ....................................................50

Глава 3. Объекты и методы исследования............................................50

3.1. Объекты исследования....................................................................50

3.2. Методы исследования.....................................................................51

3.2.1. Методика облучения тонких пленок белков...............................51

3.2.2. Регистрация спектров поглощения белковых образцов в УФ- и видимой областях...........................................................................................54

3.2.3. Регистрация ИК-спектров поглощения белковых образцов......55

3.2.4. Методы разделения веществ (электрофорез, гель-хроматография)...............................................................................................56

3.2.5. Флуоресцентный анализ..............................................................60

3.2.6. Регистрация спектров флуоресценции зонда 1-анилинонафталин-8-сульфоната (АНС)........................................................63

3.2.7. Регистрация кривых диссоциации оксигемоглобина (КДО).....66

3.2.8. Регистрация кривых кислотно-основного титрования белков..68

3.3. Статистическая обработка результатов.........................................68

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Оптические свойства ВУФ-облученных молекул сывороточного альбумина и гемоглобина......................................................................69

4.1. УФ-спектры поглощения ВУФ-облученных молекул альбумина.69

4.2. ИК-спектры поглощения ВУФ-облученных молекул альбумина.78

4.3. Спектры поглощения гемоглобина в видимой области................80

4.4. ИК-спектры поглощения ВУФ-облученных молекул гемоглобина......................................................................................................................84

Глава 5. Флуоресцентные свойства ВУФ-облученных молекул бычьего сывороточного альбумина.........................................................................88

5.1. Флуоресцентные свойства ВУФ-облученных молекул бычьего сывороточного альбумина при рН 6,0...............................................................88

5.2. Флуоресцентные свойства ВУФ-облученных молекул бычьего сывороточного альбумина при рН 2,8...............................................................92

5.3. Флуоресцентные свойства ВУФ-облученных молекул бычьего сывороточного альбумина при рН 8,3...............................................................94

Глава 6. Гель - хроматографические и электрофоретические свойства ВУФ-облученных молекул белков..................................................................98

6.1. Гель - хроматографические свойства ВУФ-облученных молекул сывороточного альбумина.............................................................................98

6.2. Электрофоретические свойства ВУФ-облученных молекул сывороточного альбумина....................................................................................102

Глава 7. Функциональные свойства ВУФ-облученных молекул сывороточного альбумина и гемоглобина..........................................................108

7.1. Функциональные свойства ВУФ-облученных молекул сывороточного альбумина.............................................................................................108

7.1.1. Флуоресцентные свойства ВУФ-облученных молекул бычьего сывороточного альбумина в комплексе с красителем 1-анилинонафталин-8-сульфонатом (АНС)......................................................................................108

7.1.2. Кислотно-основные свойства ВУФ-облученных молекул сывороточного альбумина...................................................................................111

7.2. Кислород связывающие свойства ВУФ-облученных молекул ге-

моглобина.....................................................................................................11

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................120

ВЫВОДЫ.............................................................................................123

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................125

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Исследования фотопроцессов, происходящих в белках и их компонентах под влиянием вакуумного УФ-излучения (А,<200 нм), имеют важное значение для выяснения физико-химических основ его биологического действия, а также связаны с проблемой абиогенного фотосинтеза биологических молекул в космическом пространстве и в период биохимической эволюции на Земле. Основными процессами дезактивации высоковозбужденных состояний молекул после поглощения квантов ВУФ-излучения являются люминесценция, фото диссоциация (ФД), фотоионизация (ФИ). Люминесценция Si-» So связана с процессом внутренней конверсии при переходе электрона без обращения спина Sn~-»Si, конкурирующим с ФД, ФИ и др. Возможны также фотохимические реакции, связанные с деструкцией или синтезом биомолекул. Знание их эффективности, определяемой величиной квантового выхода, может быть использовано для выяснения механизмов фотопревращений биомолекул при ВУФ-облучении. Большинство работ, посвященных биологическому действию вакуумного ультрафиолета на молекулярном уровне, выполнено с использованием в качестве объектов исследования нуклеиновых кислот и их компонентов (Д.А. Сухов и соавт., 1976; N.Ya. Dodonova et al., 1982; A. Ito et al, 1986; H.M. Цыганенко и соавт., 1987; E.B. Хорошилова и соавт., 1991; НЛ. Додонова и соавт., 1994). Особенностям взаимодействия ВУФ-излучения с белковыми системами

уделено гораздо меньшее внимание со стороны исследователей. В литературе практически не обсуждался вопрос о взаимосвязи дозозависимых структурных перестроек молекул белка с изменением их функциональной активности после ВУФ-облучения, не определено соотношение вкладов тех или иных фотохимических процессов в эффектах ВУФ-модификации белковых макромолекул. Поэтому анализ экспериментальных данных, касающихся фотохимических изменений белковых молекул, индуцированных вакуумным ультрафиолетовым излучением, позволит наметить некоторые модельные подходы к установлению возможных путей эволюции структуры этих биологически важных молекул и выяснить особенности проявления белками своих функциональных свойств в условиях различного микроокружения.

Фотохимические процессы, происходящие в белках и их компонентах под действием УФ-света в спектральной области 200-400 нм, изучались многими авторами (C.B. Конев, И.Д. Волотовский, 1979; Д.И. Рощупкин, 1979; И.И. Сапежинский, 1981; Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко, 1989; В.Г. Артюхов, 1995). В вакуумной УФ-области спектра с Х<200 нм эти процессы практически не исследованы. Действие УФ- и ВУФ-излучения на белковые системы может различаться первичными фотофизическими процессами, что может привести к образованию неодинаковых конечных фотопродуктов и к инактивации белковых молекул (R. Settlow, 1960). Обладая значительной энергией квантов (до 120 эВ), ВУФ-излучение способно вызывать ионизацию биологических молекул, поэтому расширение спек-

трального диапазона исследований в область вакуумного ультрафиолета позволит получить ценную информацию о механизмах биологического действия этого ионизирующего излучения при его взаимодействии с белковыми системами. Исходя из вышеизложенного, нами проведены систематические исследования структурно-функциональных фотомодификаций транспортных белков (гемоглобина и сывороточного альбумина) под влиянием вакуумного УФ-света. Это обусловлено их значительным содержанием среди всех белковых компонентов крови, известной структурной организацией молекул и важностью функции, которую выполняют эти белки,- транспорта различных низкомолекулярных лигандов.

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей действия ВУФ-излучения на структурно-функциональное состояние молекул некоторых транспортных белков крови в условиях различного микроокружения.

Задачи работы предусматривали:

1) разработку методики получения тонких пленок белков и создание установки для их ВУФ-облучения;

2) изучение влияния ВУФ-света на физико-химические свойства гемоглобина и сывороточного альбумина;

3) определение эффективности действия на белковые макромолекулы ионизирующего ВУФ-излучения с энергией квантов 6,6 - 9,4 эВ;

4) исследование природы фотопревращений молекул белков после ВУФ-облучения в условиях различного микроокружения;

5) оценку взаимосвязи между структурными изменениями, индуцированными воздействием ВУФ-квантов, и проявлением исследованными белками функциональных свойств.

Научная новизна

Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу взаимосвязи между структурным и функциональным состояниями транспортных белков крови. Впервые изучено влияние ВУФ-света на положение и форму кривых диссоциации оксигемоглобина, степень гем-гемового взаимодействия.

Выявлен эффект инактивации молекул сывороточного альбумина вследствие дезорганизации высших типов пространственной организации белковых макромолекул.

Показано, что наряду с деструкцией ароматических аминокислот наблюдаются также нарушения вторичной структуры бычьего сывороточного альбумина. Установлено, что изменения электрофоретических свойств молекул альбумина после вакуумного ультрафиолетового облучения в уело-

виях различного микроокружения свидетельствуют о преобладании процессов ассоциации в исследуемой системе.

Влияние ВУФ-излучения на гемоглобин проявляется в изменении конформации его молекул вследствие протекания реакций фотодиссоциации и фотоионизации в изучаемой системе.

Разработаны схемы процессов ВУФ-индуцированных превращений молекул альбумина и гемоглобина.

Практическая значимость

Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления об особенностях фотохимических превращений транспортных белков крови под действием вакуумного ультрафиолетового излучения.

Результаты работы вскрывают первичные механизмы ответной реакции биосистем на воздействие ВУФ-света в условиях различного микроокружения. Полученные данные могут быть использованы при изучении вопроса о роли высоковозбужденных электронных состояний в белках и происходящих в них фотопроцессов.

Выявленная дозовая зависимость характера протекания тех или иных фотохимических процессов в различных компонентах крови может явиться теоретическим фундаментом эволюционной биологии, касающейся вопросов фото- и радиоустойчивости макромолекул, а также позволит регулиро-

вать степень фотомодификационных изменений макромолекул сывороточного альбумина быка и, следовательно, эффективность их функционирования в условиях различного микроокружения.

Материалы диссертационной работы используются при чтении общего курса "Биофизика" и спецкурса "Фотобиология" для студентов биолого-почвенного факультета Воронежского госуниверситета.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: I и II Международных симпозиумах "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995, 1998); I и II Всероссийских съездах фотобиологов (Пущино, 1996, 1998); Совещании - семинаре "Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации" (Воронеж, 1996); III Международной научно-технической конференции "Антенно-фидерные устройства. Системы и средства радиосвязи" (Воронеж, 1997); II Всероссийской научно-технической конференции с международным участием "Светоизлучающие системы. Эффективность и применение" (Саранск, 1997); Межрегиональных научных конференциях, посвященных 80-летию со дня рождения проф. А.И. Лакомкина и 80-летию Воронежского госуниверситета "Физиология и психофизиология мотиваций" (Воронеж, 1997, 1998); Межрегиональной научной конференции, посвященной памяти проф. A.A. Землянухина

"Организация и регуляция физиолого-биохимическйх процессов" (Воронеж, 1998); II съезде Украинского биофизического общества (Харьков, 1998); XII Межреспубликанской научно-практической конференции (Краснодар, 1999); Уральской конференции молодых ученых "Физика в биологии и медицине" (Екатеринбург, 1999); Научных сессиях Воронежского госуниверситета (Воронеж, 1996, 1998, 1999).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 статей и 3 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Степень структурных изменений исследованных белковых молекул повышается под влиянием вакуумного ультрафиолетового излучения с энергией квантов, превышающей потенциалы ионизации белка и его компонентов.

2. Изменение функциональных свойств сывороточного альбумина при действии ВУФ-излучения в дозе 30 кДж/м2 является результатом процессов разворачивания белковой глобулы. Фоточувствительность бычьего сывороточного альбумина определяется структурным состоянием его молекулы.

3. Фотомодификация сухих белков под воздействием ионизирующего ВУФ-излучения происходит как в результате прямых химических измене-

ний в белковой макромолекуле, так и вследствие дезорганизации ее высших типов пространственной организации.

4. Схема возможных процессов фотомодификации альбумина и гемоглобина под воздействием вакуумного ультрафиолета.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа включает 142 страницы машинописного текста, 11 таблиц, 38 рисунков. Состоит из введения, семи глав, заключения и выводов. Список литературы содержит 143 работы, из них 86 отечественных и 57 зарубежных.

Глава 1. Структура и физико-химические свойства некоторых транспортных белков крови

1.1. Структурно-функциональные и физико-химические свойства сывороточного альбумина

1.1.1. Структура молекулы сывороточного альбумина

Сывороточный альбумин - один из белков плазмы крови, содержание которого составляет 55-60% от их общего количества. Молекулярная масса бычьего сывороточного альбумина (БСА) составляет 66700±400 Да, а сывороточного альбумина человека (СA4) - 67000 Да (С.Е. Бреслер, 1973). При нейтральных значениях pH молекула альбумина представляет собой компактную глобулу, по форме напоминающую эллипсоид вращения, диаметр которого равен 3-4 нм, длина 14-15 нм, отношение осей 4:1, причем размеры САЧ и БСА очень близки (А.К. Wright, M.R. Thompson, 1975).

Аминокислотные составы САЧ и БСА также довольно близки. В настоящее время определена последовательность всех аминокислот для обеих молекул (J.R. Brown, 1975; В. Meloun et al., 1975).

Молекула альбумина содержит одну N-концевую а-аминогруппу (NTh). Остаток, содержащий эту группу, является остатком аспарагиновой кислоты. В БСА он связан с треонином, а в человеческом - с аланином. С-концевой аминокислотой является лейцин. В состав молекулы сывороточного альбумина входит 20 типов наиболее важных аминокислот (Т. Peters, 1985).

Молекула бычьего сывороточного альбумина (БСА) состоит из одной полипептидной цепи, которая построена из 582 аминокислотных остатков (рис.1). Стоит отметить относительно низкое содержание глицина и триптофана, высокое содержание глутаминовой кислоты и лизина (табл.1).

Молекула содержит 17 остатков гистидина и 35 остатков цистеина, 34 из которых образуют 17 дисульфидных связей. Распределение этих связей и локализация специфических остатков позволяют предположить, что молекула альбумина свернута таким образом, что образует 3 сходных структурных домена - центрального с диаметром 5,3 нм и двух симметрично расположенных по отношению к нему и имеющих меньший диаметр 3,8 нм; каждый из которых содержит три петли Брауна (V. Bloomfield, 1966). К тому же, каждый из доменов содержит приблизительно одинаковое количество аргининовых и лизиновых остатков, но третий домен имеет меньшее число аспарагиновых и глутаминовых остатков и практически нейтральный заряд. Число тирозиновых остатков уменьшается при переходе от домена один к домену три (табл.2). В среднем каждый из доменов содержит фрагмент цепи, состоящий из 150 аминокислотных остатков. Рентгеноструктур-ный анализ показал, что домены соединены между собой гибкими полипептидными отрезками.

В настоящее время существует несколько моделей молекулы сывороточного альбумина,