Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модифицирование физико-химических и биологических свойств синтетических полимерных материалов вакуумным ультрафиолетовым излучением

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Модифицирование физико-химических и биологических свойств синтетических полимерных материалов вакуумным ультрафиолетовым излучением"

На правах рукописи УДК 678.011:66.085.3

КУЗНЕЦОВ Артбм Викторович

МОДИФИЦИРОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ ВАКУУМНЫМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ

03.00.02 -Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА-2005

Работа выполнена в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ Научно-исследовательского института Трансплантологии и искусственных органов Росздрава и кафедре Физики живых систем Московского физико-технического института (государственного университета)

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Севастьянов Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук

доктор биологических наук Ведущая организация:

Штанский Дмитрий Владимирович Перова Надежда Викторовна

Научно-исследовательский институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН

Защита диссертации состоится « 2005 г. в часов

на заседании Диссертационного совета К.212.156.03. при Московском физико-техническом институте (ГУ) (141700, г. Долгопрудный, Институтский пер, д. 9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (ГУ).

Автореферат разослан « ¿Г »

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.03. кандидат физико-математических наук

Братин В. Е.

/Г/Ы

-з-

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Проблема улучшения медико-биологических свойств медицинских изделий остается актуальной и практически важной задачей.

Известно, что поверхность клеточных мембран имеет микрогетерогенную структуру и включает в себя заряженные гидрофильные и гидрофобные участки. Нами было высказано предположение, что имитирование такой структурной неоднородности или гидрофильно-гидрофобной мозаичности, или и того и другого позволит существенно уменьшить взаимодействие поверхности с белками и клетками и, в результате, повысить вероятность биосовместимости изделий.

Основными путями повышения био- и гемосовместимых свойств изделий медицинского назначения является создание новых материалов или модифицирование про-мышленно выпускаемых материалов и изделий. Второй путь является наиболее распространённым подходом к улучшению медико-технических свойств медицинских изделий, так как позволяет целенаправленно изменять только физико-химические и биологические свойства поверхности.

Среди различных методов модифицирования поверхностных свойств полимеров фотохимическое регулирование поверхностных свойств полимеров с использованием вакуумного ультрафиолетового (ВУФ) излучения привлекает всё больший интерес исследователей. Для большинства полимеров высокоэнергегачное излучение с длиной волны < 180 нм (так называемое вакуумное ультрафиолетовое излучение) поглощается в тонком поверхностном слое толщиной 100 - 500 нм, вызывая диссоциацию практически любых химических связей в полимерной молекуле и образование на поверхности свободных радикалов и других продуктов фотолиза. По сравнению с плазмохимической обработкой, обычно сопровождающейся многочисленными трудно управляемыми многоканальными процессами, фотолиз резонансным ВУФ-излучением в присутствии различных газов позволяет избирательно и целенаправленно менять физико-химические поверхностные свойства полимеров. Выбором состава газа в реакционной камере и условий облучения можно управлять процессами образования специфических групп на поверхности полимера и добиться направленной функционализации изделия. При этом механические, оптические и другие объемные свойства полимера, отвечающие соответствующему медицинскому применению, остаются неизменными в силу малой глубины проникновения ВУФ-

излучения.

-4В работах Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава ранее была показана принципиальная возможность использования ВУФ-излучения для улучшения медико-биологических свойств интраоку-лярных линз из силиконовых материалов. Однако исследователи ограничились только констатацией факта положительного влияния изменения морфологии поверхности силиконовой резины на ее биосовместимые свойства без объяснения возможных механизмов данного эффекта.

Цель работы

Цель работы заключалась в исследовании взаимосвязи между физико-химическими и биологическими свойствами синтетических полимерных материалов, модифицированных вакуумным ультрафиолетовым излучением.

Основные задачи работы

Исходя из поставленной цели, задачи исследования сводились к следующему:

1) разработать метод модифицирования поверхности полимерных материалов с использованием вакуумного ультрафиолетового излучения;

2) изучить физико-химические свойства модифицированных поверхностей полиэтилена низкой и высокой плотности, полиэфируретана и политетрафторэтилена;

3) исследовать процессы адсорбции альбумина и адгезии тромбоцитов человека для модифицированных ВУФ-излучением поверхностей полимерных материалов;

4) найти оптимальные режимы ВУФ-облучения для направленного изменения поверхностных физико-химических характеристик, определяющих биологические свойства исследуемых полимерных материалов.

Научная новизна

1) Предложена новая область применения ВУФ-излучения, связанная с регулированием биологических свойств синтетических полимерных материалов медицинского назначения.

2) Доказано, что содержание кислородсодержащих групп на поверхности ВУФ-об лученных полимерных материалов влияет как на относительную долю необратимо адсорбированного альбумина, так и на количество и морфологию адгезированных тромбоцитов.

3) Для каждого вида исследуемого полимерного материала найдены режимы ВУФ-об лучения, позволяющие целенаправленно влиять на концентрацию кислородсодер-

жащих групп, определяющих характер взаимодействия поверхности с сывороточным альбумином и тромбоцитами человека. 4) Показана возможность использования ВУФ-излучения для обогащения поверхности синтетических полимерных материалов различными функциональными химическими группами.

Практическая значимость

Собрана и отлажена установка для модифицирования полимеров медицинского назначения вакуумным ультрафиолетовым излучением УМП-1. Метод вакуумной ультрафиолетовой обработки поверхности полимерных материалов внедрен в практику работы Центра по исследованию биоматериалов как способ регулирования физико-химических и биологических свойств поверхности для решения фундаментально-прикладных задач в области биоматериалов.

Возможное практическое применение метода вакуумной ультрафиолетовой обработки поверхности полимерных материалов связано с улучшением био- и гемосовмести-мых свойств медицинских изделий (искусственные хрусталики глаза, катетеры, протезы кровеносных сосудов и т.д.).

Опытное производство по обработке искусственных хрусталиков глаза предполагается наладить в ФГУП НИИ Физических проблем им. Ф.В. Лукина Минпромэкономики РФ в г. Зеленограде.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих семинарах и конференциях:

- межинститутский семинар Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИ

Трансплантологии и искусственных органов Росздрава (2003 г., 2004 г., 2005 г.),

- IX научно-техническая конференция «Вакуумная наука и техника» (сентябрь

2002 г., Судак, Украина),

- XI научно-техническая конференция «Вакуумная наука и техника» (сентябрь

2004 г., Судак, Украина),

- II всероссийская конференция (с приглашением специалистов стран СНГ) «Прикладные аспекты химии высоких энергий» (октябрь 2004 г., Москва),

- 4-й Международный симпозиум по теоретической и прикладной плазмохимии (май

2005 г., Иваново).

Публикации

Результаты проведённых исследований отражены в 8 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.

Структура и п<п.8м диссертации

Диссертация состоит из введения, трёх глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты и их обсуждение, а также заключения и выводов.

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков, 2 таблицы и список литературы из 73 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы

- полиэтилен низкой плотности (ПЭНП) в виде плёнок, ГОСТ 10354-82, партия 65, толщина 60 мкм, ЗАО Синтоист, Россия;

- полиэтилен высокой плотности (ПЭВП) в виде плёнок, Showa Denko Co. Ltd, Япония;

- политетрафторэтилен (ПТФЭ) в виде плёнок, ГОСТ 5-1078-71, Россия;

- полиуретан (ПУ) «Витур» в виде трубок, Т-0533-90, толщина 150 мкм, производство НПО Полимерсинтез, Россия.

Для исследования адсорбции белков использовали:

- лиофшшзованный сывороточный альбумин человека (САЧ, 99%, ММ 66500), Sigma Chemical, США;

- флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ, ММ 389.4), Sigma Chemical, США;

- раствор альбумина человека с радиоизотопной меткой 13'I, Нуклон, г. Обнинск, Россия.

Методы исследования

Облучение вакуумным ультрафиолетовым излучением

Установка дня модифицирования полимеров медицинского назначения (УМП-1) вакуумным ультрафиолетовым излучением была смонтирована в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава совместно с ФГУП НИИ физических проблем им. Ф.В. Лукина Минпромэкономики РФ. Установка позволяет облучать образцы моно-

хроматическим светом с длиной волны 147 нм и интенсивностью ЗхЮ" квант-с''-см"2, в диапазоне рабочих давлений 0.02 - 25 торр.

Адсорбция белков

Кинетические кривые адсорбции САЧ на поверхности модифицированного полиэтилена исследовали методом флуоресценции полного внутреннего отражения (ФПВО) по следующей схеме После сборки, кювету ФПВО устанавливали в иоветное отделение и подключали к потоку фосфатного буфера (ФБ) (0.1 М №С1, 0.086 М КН2РО4, 0.041 М №2НР04, рН 7.4). Затем кювету подключали к протоку раствора белка, и регистрировали сигнал флуоресценции (суммарное количество адсорбированного белка). После этого в кювету снова подавали ФБ и регистрировали сигнал флуоресценции (количество необратимо адсорбированного белка). Разность между этими двумя сигналами соответствует сигналу флуоресценции обратимо адсорбированного белка. Для наглядности был введён параметр 0, характеризующий необратимость адсорбированного белка и равный отношению количества необратимо адсорбированного бежа к суммарному количеству адсорбированного белка (обратимо и необратимо).

Приготовление плазмы, обогащенной тромбоцитами

Для проведения экспериментов по изучению взаимодействия тромбоцитов с поверхностью материалов использовали кровь здоровых доноров мужского пола в возрасте 20-50 лет. Исследования проводили с информированного согласия доноров.

Венозную кровь отбирали в стеклянные силиконизированные пробирки объемом 10 мл, содержащие 1 мл антикоагулянта. Сразу после забора содержимое пробирок механически перемешивали и помещали в центрифугу.

Выделение плазмы, обогащенной тромбоцитами (ПОТ), производили по стандартной методике. Для этого кровь в пробирках центрифугировали при 100£ в течение 20 мин для осаждения эритроцитов и лейкоцитов. Затем верхний слой ПОТ отбирали пипеткой с пластиковым наконечником в стеклянный силиконизированный бюкс. Полученную ПОТ использовали в экспериментах не позднее, чем через 60 минут после забора крови.

Приготовление образцов для исследования методом сканирующей электронной микроскопии

Образцы материалов, предназначенные для контакта с ПОТ, предварительно отмывали в растворе этилового спирта и диметилового эфира (1:1) в течение 10 минут, после чего образцы промывали 10 минут в дистиллированной воде и сушили на воздухе.

Калли тромбоцитарной плазмы объемом 50 мкл наносили с помощью микропипетки на поверхность каждого образца. Время инкубации с ПОТ во влажной атмосфере составляло от 15 до 30 минут.

После инкубации образцы интенсивно промывали в физиологическом растворе для удаления обратимо адгезированных тромбоцитов и не адсорбированных белков плазмы, фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида в течение 2 часов и обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающих концентраций. Готовые образцы сушили на воздухе и монтировали на столики для электронной микроскопии.

Необходимое для электронно-микроскопических исследований токопроводящее покрытие получали методом ионного напыления золота. Для исследования структуры поверхности образцов и наблюдения адгезированных тромбоцитов использовали сканирующий электронный микроскоп JSM Т-ЗЗО (JEOL, Япония) и установку для получения оцифрованных изображений AN-10000 (Link Analytical, Англия).

Визуализацию адгезированных тромбоцитов проводили при ускоряющем напряжении 5 кВ и токах пучха около Ю'ПА.

Обработка полученных изображений

Для проведения количественного анализа адгезии тромбоцитов на поверхности каждого из образцов произвольным образом выбирали 20 полей размером 28x28 мкм (увеличение Х3500). В каждом поле объекты разбивали на классы по их морфологическим признакам. Было выбрано четыре морфологических класса объектов, наиболее четко отражающих степень активации тромбоцитов:

1. Одиночные неактивироваиные клетки. К ним относятся недеформированные тромбоциты, практически сохранившие круглую форму.

2. Клетки с псевдоподиями или в ранней стадии распластывания. Подобные изменения в морфологии тромбоцитов связаны с активацией клеток.

3. Полностью распластанные тромбоциты. Они имеют очень большой диаметр по сравнению с одиночными клетками и малую толщину, так что полностью повторяют структуру поверхности образца.

4. Агрегаты. Они могут образовываться в объёме или непосредственно на поверхности.

Для каждого образца суммировали по всем полям общее количество объектов, а также количество клеток в каждом из классов. Статистическую обработку данных и построение диаграмм и графиков проводили с помощью программы Microsoft Excel*. При подсчете адгезированных тромбоцитов на 20 различных выбранных случайным образом

полях одного образца стандартная ошибка для общего числа объектов не превышала 15%,

а стандартная ошибка для кспичества клеток в каждом классе составляла 20%

Фурье-ИК спектроскопия многократно нарушенного почного внутреннего отражения

Метод ИК МНПВО позволяет регистрировать спектры тонких (порядка длины волны) приповерхностных слоев материала в диапазоне от 4000 до 400 см"1 Наиболее важной является часть спектра от 1800 до 500 см"1, в которой практически все химические связи имеют характеристические полосы поглощения - так называемые «отпечатки пальцев» ("Гц^егрпгиз") ИК-спектр в этом диапазоне позволяют идентифицировать такие химические связи как транс-вини.кновые -СН=СН- (полоса поглощения 966 см*1), виниль-ные -СН=СН2 (910 см"1), винилиденовые ЯДгСН^Нг (885 см'1), и сопряженные диеновые -СН=СН-СН=СН связи (985 см"1) и другие.

Рисунок 1. ИК-спектры необлучённого ПЭНП и ВУФ-модифицированного при 2.5 торр в течение 30 минут.

Результаты и их обсуждение

06лучение образцов ПЭНП и ПЭВП проводили вакуумным ультрафиолетовым излучением с длиной волны 147 им при различных значениях давления воздуха в рабочей камере, при этом время обработки составляло 30 минут. Основными продуктами при таких условиях обработки являются карбоксильные группы (С=0) и двойные связи двух типов: транс-виниленовые (-НС=СН-) и концевые винильные (-НС=СНг). Относительное количество продуктов ВУФ-фотолиза измеряли методом Фурье-ИК спектроскопии МНПВО по отношению оптической плотности пика С=0 или С=С к оптической плотности характеристического пика полиэтилена С-Н (Рис. 1).

Кривые зависимости относительного количества транс-виниленовых двойных связей, образующихся при обработке вакуумным ультрафиолетовым излучением, от величины остаточного давления воздуха для обоих типов полиэтилена имеют в-образный вид (Рис. 2). Основные изменения приходятся на значения 1-10 торр, где доля ВУФ-излучения, дошедшего до поверхности образца, составляет 5-90%.

Р0, торр

Рисунок 2. Зависимость относительного количества транс-виниленовых двойных связей (С=С) от величины давления остаточного воздуха в реакционной ячейке при 30 минутах ВУФ-облучения.

При образовании С=0-групп наблюдается другой характер зависимости их количества от остаточного давления. С увеличением давления относительное количество С=0-групп растёт и достигает максимума в районе 3 торр, а затем убывает (Рис. 3). Наличие экстремума можно объяснить тем, что с ростом давления в реакционной ячейке с одной стороны растёт количество кислорода, участвующего в образовании С=0-групп, а с другой стороны - уменьшается доля ВУФ-излучения, достигающего поверхности образца и вызывающего образование радикалов на поверхности.

Рисунок 3. Зависимость относительного количества С=0-групп от величины давления остаточного воздуха в реакционной ячейке при 30 минутах ВУФ-облучения.

Данные, полученные методом Фурье-ИК спектроскопии многократно нарушенного полного внутреннего отражения, согласуются с результатами, полученными методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС). Метод РФЭС даёт количественные данные по содержанию кислорода (Рис. 4). Из графика видно, что в оптимальных условиях доля кислорода на поверхности образца ПЭНП составляет 50% по отношению к углероду, то есть на два атома углерода приходится один атом кислорода. Также видны следовые количества азота.

При рассмотрении зависимости относительной концентрации кислорода и азота на поверхности ВУФ-облучённого в течение 30 минут ПТФЭ от давления воздуха в реакци-

онной ячейке было обнаружено, что при давлении менее 1 торр на поверхности появляется существенное количество функциональных химических групп, содержащих кислород и азот (Рис. 4). Согласно литературным данным время жизни радикалов, образовавшихся на поверхности ПТФЭ при ВУФ-облучении, значительно больше чем для ПЭ, поэтому окисление происходит не в реакционной ячейке, а во время последующего хранения облученных образцов на воздухе.

о о

X 19 X О

х р

X

¡г

о о

о

X

о

Рисунок 4. Зависимость относительной концентрации кислорода и азота на поверхности ПЭНП и ПТФЭ от давления остаточного воздуха в реакционной ячейке при 30 минутах ВУФ-облучения.

На рисунке 5 представлены микрофотографии поверхности необработанных образцов ПЭНП и ПЭВП, а также ВУФ-облучённых при давлении 4.7 торр в течение 30 минут, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа. Видно, что ПЭВП имеет более развитую поверхность, чем ПЭНП, что, по-видимому, связано с различиями в технологии производства полимеров. На снимках также отчётливо видны результаты фотохимического травления: проявление внутренней периодической надмолекулярной структуры полиэтилена с периодом порядка 1 мкм, вследствие удаления слабосвязанного поверхностного слоя полимера.

Взаимодействие ВУФ-обработанного полиэтилена с белками плазмы крови исследовали на примере сывороточного альбумина человека (Со=0.1 мг/мл) методом флуорес-

ценцин полного внутреннего отражения (ФПВО). На рисунке 6 представлены кинетические кривые адсорбции альбумина на необработанные и ВУФ-облучённые поверхности ПЭНПиПЭВП.

Рисунок 5. Микрофотографии поверхности исходных образцов ПЭНП и ПЭВП, а также ВУФ-обработанных при давлении 4.7 торр в течение 30 минут. Сканирующий электронный микроскоп ^М Т-330 ^ЕО!., Япония).

Как видно из рисунков (см Рис. 6), вследствие большей шероховатости общее количество адсорбированного белка на поверхности ПЭВП в два раза больше, чем на ПЭНП. После 600 секунд адсорбции проводили десорбирование адсорбировавшегося белка фосфатным буфером. Отношение сигнала от несмывающегося белка к сигналу до смывки определяет долю необратимо адсорбированного белка.

Согласно одному из критериев гемосовместимости, поверхность материала должна адсорбировать минимальное количество прочно связанного белка, то есть должна легко обмениваться с белками плазмы крови.

Врвмя, е«к

Рисунок 6. Кинетические кривые адсорбции САЧ (Со=0.1 м7„л) на ПЭНП и ПЭВП.

Р0, торр

Рисунок 7. Зависимость доли необратимо адсорбированного САЧ на ПЭ от величины давления остаточного воздуха в реакционной ячейке.

На рисунке 7 приведены кривые зависимости доли необратимо адсорбированного альбумина от величины давления остаточного воздуха в реакционной ячейке. Видно, что зависимость доли необратимо адсорбированного белка носит экстремальный характер и в районе 3 торр практически равна нулю, то есть адсорбция белка становиться полностью обратимой. Такой режим адсорбции характерен для нативных тканей организма.

На рисунке 8 сопоставлена доля необратимо адсорбированного белка и концентрация образующихся вследствие ВУФ-облучения карбоксильных групп на поверхности ПЭНП. Видно, что доля не обратимо адсорбированного альбумина коррелирует с концентрацией С=0-групп. Обращает на себя внимание тот факт, что доля необратимо адсорбированного белка становится равной нулю в максимуме концентрации С=0 групп.

-*-Р(ПЭНП) -й-0(С=0)ПЭНП

6 8 10 Р0,торр

Рисунок 8. Зависимость доли необратимо адсорбированного САЧ на ПЭНП и относительного количества С=0-групп от величины давления остаточного воздуха в реакционной ячейке при 30 минутах ВУФ-облучения.

Аналогичную корреляцию обратимости адсорбции с количеством С=0 групп наблюдали при сопоставлении соответствующих временных зависимостей (Рис. 9). Можно предположить, что образование полярных карбоксильных групп на гидрофобной поверхности ПЭНП приводит к формированию гидрофильно/гидрофобной структуры, которая характерна для биологических структур (белки, клеточные мембраны), что способствует минимизации количества необратимо адсорбированного белка.

-4-0 (ПЭНП)

-й-О(С-О) пэнп

Рисунок 9 Зависимость доли необратимо адсорбированного САЧ на ПЭ и относительного количества С=0-групп от времени ВУФ-облучения.

Для изучения стабильности эффекта снижения доли необратимо адсорбированного белка часть образцов ПЭНП хранили 2,5 месяца в растворе фосфатного буфера (рН 7.4), а часть - на воздухе В экспериментах по адсорбции альбумина обнаружено, что доля прочно связанного белка для образцов сразу после облучения в 17 раз меньше, чем до облучения (Табл. 1). После хранения на воздухе в 4 раза меньше, а после хранения в фосфатном буфере в 8 раз меньше, так как в водной среде не происходит переориентация гидрофильных групп внутрь образца.

Таблица 1.

Значения доли необратимо адсорбированного САЧ (0.1 мг/мл) в зависимости от способа

Образец Доля необратимо адсорбированного САЧ, %

ПЭНП необработанный 11.4 ±0.01

ВУФ-облучвнный ПЭНП (2.5 торр, 20 мин) 11.3 ±0.04

ВУФ-об лучённый ПЭНП (2.5 торр, 20 мин) после хранения в ФБ 78 дней 4.8 ±0.01

ВУФ-облучённый ПЭНП (2.5 торр, 20 мин) после хранения на воздухе 78 дней 1.5 ±0.003

ВУФ-обработка полимеров оказывает существенное влияние на процесс адгезии тромбоцитов человека. Изменение химического состава поверхности исследуемых полимерных материалов после ВУФ-обработки меняет как характер процессов активации тромбоцитов на поверхности (образование псевдоподий, распластывание клеток, агрегация), так и общее число адгезированных клеток.

Были проведены исследования по влиянию временя ВУФ-облучения поверхности ПЭНП на параметры адгезии тромбоцитов человека. Особое внимание было уделено таким условиям облучения, при которых реализуется минимальное количество необратимо адсорбированного альбумина на поверхности полимера после ВУФ-обработки.

Как видно из рисунка 10, облучение образца ПЭНП в течение 30 минут при давлении 2.5 торр не меняет количество одиночных тромбоцитов, но уменьшает количество псевдоподийных клеток в 4 раза, распластанных - в 30 раз, агрегатов - в 20 раз. Таким образом, ВУФ-облучённый ПЭ приводит к значительно меньшей активации тромбоцитов, чем необлучённый.

во

пэнпчкобравот. ПЭНП-ВУФ (2.9 торр,30 мин.)

Рисунок 10. Распределение тромбоцитов человека по классам на поверхности ПЭНП до и после ВУФ-облучения.

Нами были также проведены исследования по влиянию ВУФ-облучения на параметры адгезии тромбоцитов человека на поверхности ПТФЭ. Количество и степень активации адгезированных тромбоцитов измеряли до и после ВУФ-облучения при давлении 2.5 торр, когда 50% излучения достигает поверхности образца.

Как следует из рисунка 11, облучение образца ПТФЭ в течение 45 минут при давлении 2 5 торр уменьшает количество одиночных тромбоцитов в 2 раза, количество псев-доподийных клеток увеличивает в 1.7 раза, число распластанных тромбоцитов уменьшает - в 1.7 раза, агрегатов - в 3 раза. Таким образом, ВУФ-облучбнный ПТФЭ слабее активирует тромбоциты, чем необлучбнный.

■ один

ПТФЭ-необработ. ПТФЭ-ВУФ (2.3 торр, 43 мин.)

Рисунок 11 Распределение тромбоцитов человека по классам на поверхности ПТФЭ до и после ВУФ-облучения.

В качестве ещё одного объекта исследования был выбран медицинский полиэфи-руретан (ПУ). Параметры адгезии тромбоцитов человека на поверхности ПУ были исследованы до и после ВУФ-облучения при давлении 10 торр.

Как видно из рисунка 12, облучение образца ПУ в течение 30 минут при давлении 10.0 торр не меняет количество одиночных тромбоцитов, но уменьшает количество псев-доподийных клеток в 3 раза, распластанных - в 10 раз, агрегатов - в десятки раз. Таким образом, ВУФ-облучбнный ПУ приводит к значительно меньшей активации тромбоцитов, чем необ лучённый.

Известно, что различные области применения полимерных материалов предъявляют различные требования к ним. В частости, материал, предназначенный для контакта с кровью, должен минимально воздействовать на её белковые и клеточные компоненты. Для применения полимера в других областях, например для использования в качестве клеточного матрикса, может понадобиться, чтобы его поверхность максимально адгезиро-

вала клетки. Было предположено, что, варьируя условия ВУФ-облучения, можно изменять характер взаимодействия материалов с клетками органов и тканей.

ПУ-необработ.

ПУ-ВУФ (10.0 тарр, 30 мин.)

Рисунок 12. Распределение тромбоцитов человека по классам на поверхности ПУ до и после ВУФ-облучения.

Для демонстрации возможности регулирования количества адгезированных тромбоцитов, было проведено ВУФ-облучение плёнок ПЭНП через металлическую сетку в двух различных режимах: 0.02 торр и 2.5 торр. При таких условиях облучения на одном образце можно получить участки необлучбнной и ВУФ-модифицированной поверхности. Как видно из рисунка 1 ЗА на образце ПЭНП, облученном 30 минут при давлении 2.5 торр, тромбоциты предпочитают прикрепляться на участки, закрытые сеткой во время обработки. Участки полимера, обогащённые кислородсодержащими группами, остаются практически свободными от клеток. Напротив, на поверхность, облучённую в течение 30 минут при давлении 0.02 торр, тромбоциты прикрепляются в основном на не закрытые сеткой участки ПЭНП (Рис. 13Б). Затенённые участки образца пленки ПЭНП остаются свободными от клеток.

Рисунок 13. Микрофотографии поверхности ПЭНП, ВУФ-облучённого через сетку в течение 30 минут при давлении 2.5 торр (А) и 0 02 торр (Б). Сканирующий электронный микроскоп ,Ш01. Т-330 (иЕОЦ Япония).

Заметим, что механизм влияния условий обработки на характер взаимодействия ВУФ-обработанной поверхности полимерных материалов с клетками требует дальнейших исследований Можно только предположить, что кислородсодержащие группы влияют не только на процессы адсорбции альбумина, но и на количество и морфологию аогезиро-ванных тромбоцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для модифицирования физико-химических и биологических свойств синтетических полимерных материалов предложен и экспериментально обоснован метод обработки поверхности вакуумным ультрафиолетовым излучением.

Преимуществом метода является универсальность, так как в результате ВУФ-облучения можно наблюдать окисление поверхности практически всех известных полимерных материалов, доступность применяемого оборудования и методов контроля параметров процесса. Немаловажную роль играет также стабильность свойств модифицированных поверхностей полимерных материалов. Недостатком метода является то, что из-за размеров реактора ВУФ-установки, он позволяет модифицировать полимерные изделия малого размера (не более 20 мм) и несложной конфигурации, такие как пленки, искусственные хрусталики глаза, а также внешнюю сторону катетеров, магистралей и протезов кровеносных сосудов.

Проведенные исследования физико-химических и биологических свойств модифицированных поверхностей ПЭНП, ПЭВП, ПТФЭ и ПУ позволили найти оптимальные условия модифицирования физико-химических свойств поверхности полимерных материалов вакуумным ультрафиолетовым излучением. Модифицирование полимерных материалов данным методом увеличило гидрофильность их поверхности при ВУФ-облучении, кроме того, привело к уменьшению общего количества и степени необратимости адсорбции сывороточного альбумина человека, что свидетельствует об улучшении биологических свойств выбранных объектов исследования. Морфологический анализ адгезирован-ных тромбоцитов по классам показал уменьшение как общего количества, так и количества сильно активированных клеток (распластанных тромбоцитов и агрегатов) на поверхности ВУФ-облучённых образцов по сравнению с необработанными.

В перспективе, разработанный метод модифицирования поверхности полимеров может быть весьма эффективным для улучшения медико-биологических свойств про-мышленио выпускаемых изделий медицинского назначения, например, организовав многостадийный процесс, состоящий из последовательности различных операций. Первая стадия состоит из стерилизации, за которой следует функционализация поверхности (генерация кислородсодержащих, аминогрупп и других функциональных групп), далее направленное изменение морфологии поверхности с помощью фотолитографии и, наконец, целевая иммобилизация биологически активных соединений на поверхность полученной структуры. В результате такой многоступенчатой обработки открываются перспективы создания комплексных многофункциональных систем нового поколения.

выводы

1. Создана установка по облучению образцов в диапазоне рабочих давлений 0.02 - 25

торр монохроматическим светом с длиной волны 147 нм и интенсивностью ЗхЮ15 кванте"1 см"2.

2. Методами Фурье-ИК спектроскопии МНПВО и РФС показано, что ВУФ-облучение

плёночных образцов ПЭНП и ПТФЭ приводит к образованию на поверхности преимущественно кислородсодержащих групп и двойных связей. Относительная концентрация кислорода по отношению к углероду достигает величины 50% при обработке в оптимальных условиях. 3 Методом ФПВО установлено, что доля молекул сывороточного альбумина, необратимо адсорбированных на поверхности ПЭНП и ПЭВП, уменьшается с увеличением поверхностной концентрации кислородсодержащих групп.

4. Показано, что ВУФ-облучение образцов в течение 30 мин. при 2.5 торр приводит к

снижению необратимо адсорбированного альбумина для ПЭНП от 11.4 % до 0.6±0.4%, а для ПЭВП от 3.4 % до 0.25±0.1%, соответственно.

5. Методами СЭМ и РФС показано, что количество адгезированных тромбоцитов и сте-

пень их морфологических изменений тем выше, чем больше относительная концентрация кислородсодержащих групп на поверхности ПЭНП, ПТФЭ и ПУ.

6. Найдены оптимальные режимы ВУФ-облучения для ПЭНП (45 мин., 2.5 торр), ПТФЭ

(45 мин., 2.5 торр) и ПУ (30 мин., 10 торр), обеспечивающие наименьшую в условиях in vitro активацию тромбоцитов, обусловленную контактом клеток с поверхностью полимерных материалов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанный способ модифицирования физико-химических свойств поверхности полимерных материалов вакуумным ультрафиолетовым излучением может быть использован для:

гидрофилизации поверхности медицинских изделий с целью повышения их имплан-тационных характеристик (искусственные хрусталики глаза и другие имплантаты из полимерных материалов);

снижения адсорбции бежов с целью улучшения функциональных свойств биосенсоров;

создания амфифильных структур на поверхности гидрофобных медицинских полимеров с целью имитации гидрофильно-гидрофобной микроструктуры поверхности нативных тканей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Севастьянов В.И., Василец В.Н., Кузнеиов A.B.. Полухина О.С. //Использование вакуумного ультрафиолетового излучения для модифицирования поверхности полимеров биомедицинского назначения. «Вакуумная наука и техника». Материалы IX научно-технической конференции с участием зарубежных специалистов (Судак, Украина) / Под ред. Д.В. Быкова. М.: МИЭМ. 2002. С. 260-262.

2. Немец Е.А., Полухина О.С., Егорова В.А., Кузнеиов A.B.. Василец В.Н., Севастьянов

B. И. // Современные подходы к созданию биосовместимых материалов для искусственных органов. / Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2002. №3. С. 116.

3. Василец В.Н., Кузнеиов A.B.. Полухина О.С., Севастьянов B.K II Модифицирование полимерных биоматериалов вакуумным ультрафиолетовым излучением. / Материалы XI научно-технической конференции с участием зарубежных специалистов «Вакуумная наука и техника» (Судак, Украина) / Под ред. Д.В. Быкова. М.: МИЭМ. 2004. С. 260-262.

4. Кузнеиов A.B.. Василец В Н., Севастьянов В.И II Модифицирование поверхности полимеров медицинского назначения вакуумным ультрафиолетовым излучением. / Тезисы П всероссийской конференции (с приглашением специалистов стран СНГ) «Прикладные аспекты химии высоких энергий» (Москва, Россия). М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева. 2004.

C. 58-59.

5. Кузнеиов A.B.. Василец В.Н., Севастьянов В.И. II Модифицирование физико-химических и биологических свойств медицинских полимеров вакуумным ультрафиоле-

товым излучением. / Сборник трудов IV Международного симпозиума по теоретической и прикладной плазмохимии (Иваново, Россия). 2005. Т. 2, С. 387-390. 6 Vasilets VN, Hirose А, Yang Q, Singh A, Sammynaiken R, Shulga Yu.M., Kuznetsov A V.. Sevastianov VIII Hot Wire Plasma Deposition of Doped DLC Films on Fluorocarbon Polymers For Biomedical Applications. / In: R. d'Agostino, P. Favia, C. Oehr, M.R. Wertheimer (editors), 16th International Symposium on Plasma Chemistry "Plasma Processes and Polymers" (Taormina/Italy). WILEY-VCH. 2003. P. 65-75.

7. Немец E.A., Егорова B.A., Кузнецов A.B. Севастьянов В.И II Влияние сульфирования поверхности полиэтилена на адсорбцию белков плазмы и активацию внутреннего пути свёртывания крови. / Перспективные материалы. 2001. №6. С. 70-75.

8. Vasilets VN, Kuznetsov А. V. Sevastianov VI И Vacuum ultraviolet treatment of polyethylene to change surface properties and characteristics of protein adsorption. / Journal of Biomedical Materials Research. 2004. Vol. 69A(3). P. 428-435.

РПБ Русский фонд

2006-4 15142

Заказ №821. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш» г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Кузнецов, Артем Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 11 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Разработка биомедицинских материалов.12.

1.2. Влияние физико-химических^ свойств: поверхности; на^ процессы; адсорбции белков и адгезии клеточных компонентов крови.19

1.2.1. Адсорбция белков.

1.2.2. Адгезия тромбоцитов

1.3. Воздействие вакуумного ультрафиолетового! излучения; на поверхность полимерных материалов.

1.3.Г. Химический состав и структура полимерных материалов.29*

1.3.2. Морфология и физико-химические свойства поверхности полимера.

1.3:3. Кинетика и механизм взаимодействия вакуумного ультрафиолетового излучения с полимерами в вакууме и в присутствии кислорода.

1.4. Влияние ВУФ-облучения на физико-химические и биологические свойства полимерных материалов.

1.4.1. Поверхностная энергия.

1.4.2. Сшивание и микротвёрдость полимеров.

1.4.3. Формирование регулярных поверхностных структур.

1.4.4. Комбинированное использование ВУФ-излучения и методов < химической иммобилизации для модифицирования полимерных материалов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы и реагенты.

2.2. Экспериментальная установка; для^ модифицирования полимеров вакуумным ультрафиолетовым излучением.

2.2.1. Описание установки.

2.2.2. Методика ВУФ-облучения.

2.3. Методы измерения адсорбции белков:.

2.3.1. Метод флуоресценции полного внутреннего отражения.

2.3.2. Радиоизотопный метод.

2.4. Исследование параметров адгезии тромбоцитов.

2.4.1. Приготовление плазмы, обогащенной тромбоцитами.

2.4.2., Приготовление образцов для исследования методом сканирующей электронной микроскопии.

2.4.3: Обработка полученных изображений.

2.5. Методы исследования физико-химических характеристик поверхностного слоя полимеров.

2.5.1. Фурье-ИК спектроскопия многократно нарушенного полного внутреннего отражения.

2.5.2. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия.

2.5.3. Измерение краевого угла смачивания.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

З.1. Изменения химического состава; поверхностного слоят ПЭНП и ПЗВП вследствие ВУФ-облучения.54?

3.1.1. Фурье-ИК спектроскопия многократно нарушенного полного внутреннего отражения.

3.1.2. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия.

3.2. Изменения морфологии поверхности ПЭНП и ПЭВП.

3.3. Гидрофильность поверхности ВУФ-облучённых образцов.

3.4. Характер кинетики адсорбции сывороточного альбумина человека на необработанных и: ВУФ-облучённых полимерных поверхностях.

3.5. Взаимосвязь параметров адсорбции САЧ с изменениями химического состава поверхностного слоя полимера при ВУФфотолизе.

3.6. Стабильность ВУФ-модифицированных материалов при хранении в водной среде и на воздухе

3.7. Химическое модифицирование ВУФ-облучённых образцов.

3.8. Параметры адгезии: тромбоцитов для полимерных материалов различного строения (ПЭНЩ ПЭВП, ПТФЭ, ПУ)

3.8.1. Адгезия тромбоцитов на образцах ПЭ.

3.8.2. Адгезия тромбоцитов на образцах ПТФЭ!.

3.8.3. Адгезия тромбоцитов на образцах ПУ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модифицирование физико-химических и биологических свойств синтетических полимерных материалов вакуумным ультрафиолетовым излучением"

Актуальность темы!

Проблема улучшения медико-биологических свойств, медицинских изделий остается актуальной и практически важной задачей;

Известно, что поверхность, клеточных: мембран: имеет микрогетерогенную структуру и включает в себя; заряженные гидрофильные и гидрофобные участки. Нами; было высказано предположение, что имитирование такой структурной неоднородности или гидрофильно-гидрофобной мозаичности, или и того и другого позволит существенно уменьшить взаимодействие: поверхности с белками; и: клетками: и, в; результате, повысить, вероятность биосовместимости изделий.

Основными путями повышения био- и гемосовместимых: свойств, изделий медицинского назначения является создание новых материалов или модифицирование промышленно выпускаемых материалов и изделий. Второй ^ путь является;наиболее распространённым подходом! к улучшению» медико-технических свойств медицинских изделий; так как, позволяет целенаправленно- изменять только физико-химические и биологические свойства поверхности.

Среди различных методов модифицирования г характеристик ; поверхности; полимеров, таких как, обработка: коронным разрядом, плазмой тлеющего разряда, озонирование и; ультрафиолетовое облучение, фотохимическое: регулирование; поверхностных свойств; полимеров: с использованием: вакуумного ультрафиолетового (ВУФ) излучения; привлекает, всё* больший интерес исследователей. Для: большинства: полимеров высокоэнергетичное излучение с длиной волны < 180 нм (так; называемое: вакуумное: ультрафиолетовое: излучение)- поглощается в тонком поверхностном слое толщиной« 100 — 500 нм, вызывая диссоциацию практически любых химических связей в полимерной молекуле и; образование на поверхности свободных радикалов и других продуктов фотолиза. По сравнению с плазмохимической обработкой, обычно сопровождающейся многочисленными- трудно управляемыми многоканальными процессами; фотолиз резонансным ВУФ-излучением в присутствии^ различных газов • позволяет избирательно и; целенаправленно г менять физико-химические поверхностные свойства г полимеров. Выбором? состава газа в реакционной» камере и условий облучения можно управлять процессами>образования специфических групп на поверхности полимера и таким образом добиваться направленной функционализации изделия. При этом: механические, оптические и другие объёмные свойства; полимера, отвечающие соответствующему медицинскому применению,- остаются неизменными в силу малой глубины проникновения=ВУФ-излучения:

В работах Центра по исследованию* биоматериалов ранее: была показана принципиальная возможность использования ВУФ-излучения для улучшения медико-биологических свойств интраокулярных линз из силиконовых материалов. Однако исследователи ограничились только > констатацией факта положительного влияния изменения морфологии« поверхности силиконовой; резины на ее биосовместимые свойства без объяснения возможных механизмов данного эффекта.

Цель работы?

Цель работы» заключалась в исследовании; взаимосвязи между физико-химическими и биологическими» свойствами- синтетических полимерных материалов, модифицированных вакуумным ультрафиолетовым излучением.

Основные задачи работы?

Исходя из поставленной цели, задачи: исследования- сводились, к следующему:

1) разработать метод модифицирования; поверхности; полимерных материалов? с использованием? вакуумного ультрафиолетового? излучения;

2) изучить физико-химические свойства^ модифицированных; поверхностей полиэтилена: низкой и высокой? плотности,, полиэфируретана и политетрафторэтилена;

3) исследовать процессы адсорбции альбуминам и адгезии тромбоцитов человека для модифицированных ВУФ-излучением поверхностей полимерных материалов;

4) найти оптимальные режимы ВУФ-облучения для направленного изменения поверхностных физико-химических: характеристик, определяющих биологические свойства; исследуемых: полимерных: материалов.

Научная новизна

1) Предложена новая область применения ВУФ-излучения, связанная; с регулированием биологических; свойств синтетических: полимерных материалов медицинского назначения:

2) Доказано, что содержание кислородсодержащих групп на поверхности ВУФ-облученных полимерных материалов влияет как и на относительную долю необратимо адсорбированного альбумина, так на количество и морфологию адгезированных тромбоцитов.

3) Для каждого вида исследуемого полимерного материала найдены режимы ВУФ-облучения, позволяющие целенаправленно влиять на концентрацию кислородсодержащих групп, определяющих характер взаимодействия поверхности с сывороточным альбумином и тромбоцитами человека. 4) Показана возможность использования ВУФ-излучения для обогащения! поверхности синтетических полимерных; материалов различными функциональными химическими группами.

Практическая значимость

Собрана; и отлажена установка для модифицирования полимеров? медицинского назначения вакуумным; ультрафиолетовым: излучением У МП-1. Метод вакуумной; ультрафиолетовой обработки поверхности: полимерных материалов; внедрен в практику работы; Центра по исследованию; биоматериалов как способ регулирования физико-химических и биологических свойств поверхности- для решения^ фундаментально-прикладных задачу направленных на повышение; биологической безопасности полимерных материалов.

Область, возможного практического применения метода вакуумной ультрафиолетовой; обработки поверхности полимерных материалов связана с улучшением био- и гемосовместимых свойств медицинских изделий (искусственные хрусталики глаза, катетеры, протезы кровеносных сосудов и т.д.).

Опытное производство по обработке искусственных хрусталиков глаза предполагается наладить в Федеральном Государственном Унитарном предприятии Научно-исследовательском институте физических проблем; им. Ф.В. Лукина Минпромэкономики РФ в г. Зеленограде.

Апробация работы;

Основные положения диссертации; доложены и обсуждены на следующих семинарах и конференциях:

- межинститутский семинар Центра по • исследованию биоматериалов ¡ ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных: органов Росздрава (2003 г., 2004 г., 2005 г.),

- IX научно-техническая конференция «Вакуумная: наука и техника» (сентябрь 2002 г., Судак, Украина),

- XI научно-техническая конференция «Вакуумная? наука и техника» (сентябрь 2004 г., Судак, Украина),

- II всероссийская конференция (с приглашением специалистов стран СНГ) «Прикладные; аспекты химии высоких энергий» (октябрь 2004 г., Москва),

- 4-й Международный симпозиум по теоретическою и прикладной! плазмохимии (май 2005 г., Иваново).

Публикации;

Результаты проведённых исследований отражены в: 8 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.

Структура и объём диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Кузнецов, Артем Викторович

ВЫВОДЫ

1. Создана установка по облучению образцов в диапазоне рабочих давлений 0.02 - 25 торр монохроматическим светом с длиной волны 147 нм и интенсивностью 3х Ю15 квант-с"'-см"2.

2. Методами Фурье-ИК спектроскопии МНПВО и РФС показано, что

ВУФ-облучение плёночных образцов ПЭНП и ПТФЭ приводит к образованию на поверхности преимущественно кислородсодержащих: групп и двойных связей. Относительная концентрация кислорода по отношению к углероду достигает величины 50% при обработке в оптимальных условиях.

3. Методом ФПВО установлено, что доля молекул сывороточного альбумина, необратимо адсорбированных на поверхности ПЭНП и ПЭВП, уменьшается с увеличением поверхностной концентрации кислородсодержащих групп.

4. Показано, что ВУФ-облучение образцов в течение 30 мин. при 2.5 торр' приводит к снижению необратимо адсорбированного альбумина для; ПЭНП от 11.4 % до-0.6±0.4% , а для ПЭВП от 3.4 % до 0.25±0.1%, соответственно.

5. Методами СЭМ и РФС показано, что количество адгезированных тромбоцитов и степень их морфологических изменений тем ниже, чем больше относительная концентрация кислородсодержащих групп на поверхности ПЭНП, ПТФЭ и ПУ.

6. Найдены оптимальные режимы ВУФ-облучения для ПЭНП (45 мин.,

2.5 торр), ПТФЭ (45 мин., 2.5 торр) и ПУ (30 мин., 10 торр), обеспечивающие наименьшую в условиях in vitro активацию тромбоцитов, обусловленную контактом клеток с поверхностью полимерных материалов.

Доказана возможность применения В УФ-излучения для ре1улирования биологических свойств синтетических полимерных материалов медицинского назначения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанный способ модифицирования физико-химических свойств поверхности полимерных материалов вакуумным ультрафиолетовым излучением может быть использован для: гидрофилизации поверхности медицинских изделий с целью повышения их имплантационных характеристик (искусственные хрусталики глаза и другие имплантаты из полимерных материалов); снижения адсорбции белков с целью улучшения функциональных свойств биосенсоров; создания амфифильных структур на поверхности гидрофобных медицинских полимеров с целью имитации гидрофильно-гидрофобной микроструктуры поверхности нативных тканей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Кузнецов, Артем Викторович, Москва

1. Sariri R. Protein interaction with hydrogel contact lenses. Journal of Applied Biomaterials & Biomechanics, 2004, № 2, p. 1-19.

2. Севастьянов В.И. Биосовместимые материалы медицинского назначения. Перспективные материалы, 1997, № 5, стр. 41-55.

3. Belanger M.S., Marois Y. Hemocompatibility, biocompatibility, inflammatory and: in vivo studies of primary reference?materials: low-density polyethylene and; polydimethylsiloxane: A review. Journal of Biomed Mater Res, 2001, 58 (5), p. 467-477.

4. Адамян A.A. Основные направления; и перспективы; в создании; и клиническом? применении» полимерных материалов. Биосовместимостъ, 1994, № 2, стр. 97-106.

5. Anderson J.M. Biomaterials and medical implant science: Present and future: perspectives: A summary report: Journal of Biomed. Mater. Res., 1996, 32, p. 143-147.

6. Биосовместимость, под ред. Севастьянова В.И., М.\ ПУП «Информационный центр ВНИИгеосистем», 19991

7. Севастьянов В:И. Биоматериалы, для искусственных органов. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2001, №3-4, стр. 123-131.

8. Титушкин И.А., Васин СЛ., Алехин А.П., Розанова ИБ.,. Исаев В.И., Севастьянов В.И. Влияние структурных и энергетических свойств углеродных покрытий; на адгезию тромбоцитов человека. Медицинская техника, 1999, №5, с. 43-51.

9. Titushkin I.A., Vasin S.L., Rosanova I.В., Pokidysheva E.N., Alekhin A.P., Sevastianov V.Il Carbon-coated polyethylene: effect of surface energetic and topography on human platelet adhesion. ASAIO Journal, 2001, Vol. 47, p. 11-17.

10. Vasilets: V.N., Kuznetsov A.V., Sevastianov V.I. Vacuum ultraviolet treatment of polyethylene to change surface properties and characteristics of protein adsorption. J. Biomed. Mater. Research, Part A, 2004, V: 69A, p. 428-435:

11. Немец Е.Л., Порунова Ю.В., Друшляк И.В., Беломестная* З.М., Севастьянов В.И. Влияние: природы функциональных химических групп поверхности;на медико-биологические свойства материалов для контакта с кровью. Перспективные материалы, 1999, № 6, стр. 36-41.

12. Шитикова А.С. Тромбоцитарный гемостаз. Санкт-Петербург: Издательство СПб ГМУ; 2000.

13. Grunkemeier J.M., Tsai W.B., Horbett Т.А. Hemocompatibility of treated polystyrene substrates: Contact activation, platelet adhesion; and procoagulant activity of adherent platelets. J. Biomed. Mater. Res., 1998, Vol. 41, p. 657-671.

14. Waples L.M., Olorundare O.E., Goodman S.L., Lai Q.J., Albrecht R.M. Platelet-polymer interactions: morphologic and; intracellular free calcium studies of individual human platelets. /. Biomed. Mater. Res., 1996, Vol. 32, p. 65-76.

15. Nagaoka S., Nakao A. Clinical application of antithrombogenic hydrogel with long poly (ethylene oxide) chains. Biomaterials, 1990, №1 lrp. 119-121.

16. Sagnella S, Kvvok J, Marchant RE, Kottke-Marchant K. Shear-induced platelet activation and adhesion: on human pulmonary artery endothelial cells seeded onto hydrophilic polymers. J. Biomed. Mater. Res., 2001, Vol. 57, p. 419-431.

17. Ratner B.D. The: blood? compatibility catastrophe, editorial. J. Biomed; Mater: Res., 1993, Vol. 27. p. 283-287.

18. Kato К., Vasilets V.N., Fursa M.N., Meguro М., Ikada Y., Nakamae К. Surface Oxidation of Cellulose Fibers by Vacuum Ultraviolet Radiation.

19. Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 1999, Vol. 37, p. 357.

20. Wertheimer M.R., Fozza A.C., Holländer A. Industrial Processing of Polymers by Low-pressure Plasmas: the Role of VUV radiation; Nuclear Instruments and Methods in Physics Research; B, 1999, №151, p. 72.

21. Hudis M., Prescott L.E., Polym. Lett., 1972, №20, p. 179-183.

22. Hudis M., Surface crosslinking of polyethylene using hydrogen glow discharge J. Polym. Sei., 1972, №16, p. 2397-2415.

23. Дорофеев 10.И., Городецкий И.Г., Скурат В.Е., Тальрозе В Л. Образование двойных; связей: в; полиэтилене под действием! света; 1470 Â. Химия высоких энергий, \916,1. 10, №5, стр. 456-4581

24. Дорофеев Ю.И., Скурат В.Е. Температурный- эффект в фотолизе1 полиэтилена светом 1470 и 1236 Ä. ДАН СССР, Физическая химия, 1978; т. 227, №3; стр. 652-655.

25. Дорофеев Ю.И., Скурат В.Е. Сшивание некоторых полимеров при действии света 147 и 123.6 нм. Измерение доз гелеобразования. ДАН СССР: Физическая химия, 1979; стр. 1142-1146.

26. Дорофеев Ю.И., Скурат В.Е.', Итоги; науки и техники, серия Радиационная химия. Фотохимия, М.: ВИНИТИ, 1983, т. 3, стр. 66.

27. Benson R.S. Use of radiation in biomaterials science Nucl. Instr; and; Meth. in Phys. Res. B, 2002, №191, p. 752-757.

28. Truica-Marasescu F., Jedrzejowski P., Wertheimer M.R. Hydrophobic Recovery of Vacuum Ultraviolet Irradiated Polyolefin Surfaces. Plasma Process. Polym. , 2004, №1, p. 153-163.

29. Niino H., Yabe A. Excimer laser ablation of polyethersulfone derivatives: periodic: morphological micro-modification on ablated surface. J. Phototiiol. A: Chem:, 1992, №65, p. 303-312.

30. Yabe A., Niino H. Polymer Ablation with! Excimer Laser. Moll Cryst. Liq. Cryst. , 1993, Vol. 224, p. 111-121.

31. Grasel T.G., Cooper S.L. J. Biomed. Mater. Res., 1989, Vol. 23, p. 311338.

32. Ebert C.D., Lee E.S., Kim S.W. Adv. CHem. Series., 1982, №. 199, p. 161-176.

33. Немец E.A., Егорова B.A., Кузнецов A.B., Севастьянов В.И. Влияние сульфирования поверхности полиэтилена на; адсорбцию белков плазмы и активацию внутреннего пути свёртывания крови. Перспективные материалы., 2001, №6, стр. 70-75.

34. Titushkin I.A., Vasin S.L., Rozanova I.BI et ah Carbon Coated

35. Polyethylene: Effect: of Surface Energetic and Topography on Human

36. Platelet Adhesion. ASAIO Journal, 2001,,Vol; 47, p. 11-17.

37. Уикли Б. Электронная! микроскопия для начинающих. Mi: Мир\1975.

38. Goodman S.L. Sheep, pig, and human platelet-material interactions with model cardiovascular biomaterials. J. Biomed. Mater: Res., 1999, Vol; 45(3), p. 240-250:

39. Sheppard. J.I.,. McClung W.G., Feurstein I.A. Adherent platelet morphology on: adsorbed; fibrinogen: effects of protein incubation time; and albumin addition. Biomed. Mater. Res., 1994, Vol. 28, p. 11751186.

40. Неницеску К. Д. Органическая химия, М.: «Иностранная литература», 1963, т. 1, стр. 514.