Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние наноструктурирования поверхности медицинских полимерных материалов на их физико-химические и биологические свойства

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние наноструктурирования поверхности медицинских полимерных материалов на их физико-химические и биологические свойства"

На правах рукописи УДК 577 3

РЕМЕЕВА Евгения Анваровна

ВЛИЯНИЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАНИЯ ПОВЕРХНОСТИ МЕДИЦИНСКИХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

03 00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Работа выполнена в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ «Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий» и на кафедре физики живых систем Московского физико-технического института (государственного университета)

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Севастьянов Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Назаров Виктор Геннадьевич,

доктор биологических наук, профессор Иткин Георгий Пинкусович

Ведущая организация:

"МАТИ" - Российский Государственный Технологический Университет им К Э Циолковского

Защита диссертации состоится 25 октября 2007 г в 10 часов на заседании Диссертационного совета К 212 156 03 при Московском физико-техническом институте (ГУ) (141700, г Долгопрудный, Институтский пер, д 9)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (ГУ)

Автореферат разослан «_» сентября 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212 156 03 канди дат физико-математических наук

Братин В Е

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Несмотря на то, что имплантируемые медицинские изделия из биоматериалов искусственного и природного происхождения достаточно широко применяются в различных областях современной медицины, актуальной остается проблема улучшения их функциональных характеристик

Одним из основных требований к медицинским изделиям является их соответствие необходимым биологическим свойствам Так, в случае протезов кровеносных сосудов, дренажей, катетеров, искусственных хрусталиков глаза, биосенсоров и др взаимодействие поверхности изделия с биологической средой должно быть минимально, а для ортопедических и стоматологических имплантатов, напротив, требуется прорастание окружающей ткани в объем изделия

Разработки медицинских изделий с улучшенными био- и гемосовместимыми свойствами ведутся по двум основным направлениям создание новых материалов и модифицирование уже существующих материалов и изделий

Реакция организма на имплантат определяется, в основном, его поверхностными свойствами химическим составом, структурой и морфологией В связи с этим, существующие способы регулирования биологических свойств медицинских изделий направлены на изменение физико-химических свойств поверхности (химический состав, степень гидрофильности, заряд, морфология и яр) с использованием физических, химических и физико-химических методов модифицирования Особый интерес представляют методы модифицирования, которые позволяют изменять физико-химические, структурные и функциональные свойства поверхности, не влияя на объемные характеристики изделия, такие как прочность, эластичность, коэффициент пропускания, показатель преломления, электрофизические параметры и т.д.

Одним из перспективных путей улучшения биологических свойств медицинских изделий является модифицирование их поверхности различными физико-химическими методами (травление, обработка плазмой тлеющего разряда, ионная бомбардировка, литография и др )

В 2001-2005 гг в Центре по исследованию биосовместимых материалов ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов был проведен сравнительный анализ химических, физических и физико-химических методов модифицирования медицинских материалов и изделий из синтетических полимерных материалов, направленных на улучшение их медико-технических свойств Результатом работы явилось доказательство перспективности двух подходов к созданию биосовместимых поверхностей технологий,

основанных на ионно-плазменных методах и метод вакуумной ультрафиолетовой (ВУФ) обработки Было доказано, что выбранные способы модифицирования позволяют создавать на поверхности гидрофильно-гидрофобные микро- и наноструктуры, имитирующие структуры белков и клеточных мембран Однако детального анализа влияния ионно-плазменной и ВУФ обработки поверхности на изменение ее структурных характеристик и биологических свойств не проводилось Кроме того, исследования ограничивались только синтетическими биостабильными полимерными материалами

Цель работы

Цель работы заключалась в исследовании физико-химических и биологических свойств поверхности биополимерного материала (сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата) и синтетических полимерных материалов (политетрафторэтилена, полиэтилентерефталата), наноструктурированных различными физическими методами

Основные задачи работы

Исходя из поставленной цели, задачи работы сводились к следующему

1) доказать возможность применения магнетронного, ионно-плазменного метода и метода ВУФ-обработки для наноструктурирования поверхности синтетических и природных медицинских полимерных материалов,

2) изучить влияние наноструктурирования пленочных образцов полимерных материалов на химический состав, морфологию и гидрофильность их поверхности,

3) исследовать в условиях т vitro биологические свойства полимерных материалов и найти оптимальные условия наноструктурирования поверхности, приводящие к улучшению биологических свойств модифицированных образцов

Научная новизна

1 Доказана возможность применения ВУФ-обработки для улучшения био- и гемосовместимых свойств бактериального сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата, предназначенного для замещения дефектов мяпшх тканей, в том числе, в качестве имплантируемого носителя для трансплантации клеток

2 Доказано, что обработка пленок политетрафторэтилена, полиэтилентерефталата и сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата выбранными для них способами модифицирования, приводит к изменению наноразмерной шероховатости, гидрофильности и химического состава поверхности

3 Проведен сравнительный анализ влияния микро- и наноструктуры гладкой и пористой поверхности полиэтилентерефталата, полученных, соответственно, ионно-плазменным методом с последующим нанесением алмазоподобного углеродного

покрытия и магнетронным нанесением высокопористого алюминия/оксида алюминия в сочетании с ионно-плазменным методом, на биологические свойства образцов

4 Для каждого вида полимерного материала и выбранного способа наноструктурирования поверхности исследовано влияние наноразмерной шероховатости и гидрофильности поверхности на ее гемо- и биосовместимые свойства

Практическая значимость

Найдены оптимальные режимы обработки ионно-шгазменными методами для политетрафторэтилена (ПТФЭ, 30 мин травления, 100 нм а-С Н) и полиэтилентерефталата (ПЭТ, 10 мин травления, 100 нм а - С Н, ПЭТ/АКАЬОз), 3 мин травления, 50 нм а-С Н), а также оптимальные режимы ВУФ-облучения образцов сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ, 30 мин облучения, 2 5 торр), улучшающие их гемо- и биосовместимые свойства на белковом и клеточном уровне

Результаты работы рекомендуются к использованию в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов», Федеральном государственном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт им П А Герцена», Научном центре сердечно-сосудистой хирургии имени АН Бакулева, Федеральном государственном учреждении «Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им НН Приорова»

Апробация работы

Основные материалы, изложенные в диссертации, доложены и обсуждены на следующих семинарах и конференциях

- межинститутский семинар Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий (2005, 2006, 2007 гг),

- 45,46 и 49-ая научные конференции МФТИ (Долгопрудный, 2002,2003,2006 гг ),

- 31-й Европейский Конгресс по искусственным органам ESAO (г Варшава, Польша, 2004 г ),

- 11-ая научно-техническая конференция «Вакуумная наука и техника» (г Судак, Украина, 2004г ),

- 19-ая Европейская Конференция по биоматериалам ESB (г Сорревто, Италия, 2005 г ),

- 4-й Московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г ),

- IX-й Российско-китайский Симпозиум «Новые материалы и технологии» (Астрахань, 2007 г )

Публикации

Результаты проведенных исследований отражены в 13 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом

Структура и объём диссертапии

Диссертация состоит из введения, трех глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты и их обсуждение, а также заключения и выводов

Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков, таблицы и список литературы из наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

§ 1. Материалы

политетрафторэтилен (ПТФЭ) в виде плёнок, ГОСТ 5-1078-71, толщина 50

мкм, Россия,

полиэтилентерефталат (ПЭТ) в виде пленок ПЭТ-Э ГОСТ 24234-80, толщина 30 мкм, Россия

Для исследования адсорбции белков использовали

лиофилизованный сывороточный альбумин человека (САЧ, 99%, ММ 66500), Sigma Chemical, США,

флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ, ММ 389 4), Sigma Chemical, США, фосфатный буфер (0 1 М NaCl, 0 086 М КН2Р04, 0 041 М Na2HP04, рН = 7 4) Для исследования адгезии тромбоцитов получали свежеприготовленную тромбоцитарную плазму крови человека

Основным компонентом биодеградируемого матрикса был высокоочищенный двухкомпонентный сополимер 3-оксибутирата и 3-оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ) с долей оксивалерата 20-30 мол %, полученный в лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Института биофизики СО РАН (зав лаб д б н, проф Т Г Волова) Полимеры синтезированы бактериями Ralstonia eutropha В5786 в автотрофных стерильных условиях роста Молекулярная масса ПОБ-со-ПОВ, ММ = 295 000-360 000 Да, кристалличность 50-

-760% При приготовлении образцов в качестве растворителя использовали метилен хлорид (дихлорметан, СНгСЬ) ОСЧ (Синтактон, Россия)

§ 2. Методы модифицирования поверхностей полимерных материалов

Исходя из природы полимерных материалов, для обработки поверхности ПТФЭ был привлечен двухстадийный ионно-плазменяый метод, включающий в себя ионно-плазменную обработку поверхности ионами СЕ, с последующим нанесением алмазоподобного углеродного покрытия Поверхность ПЭТ модифицировали двумя способами ионно-плазменным методом с последующим нанесением алмазоподобного углеродного покрытия и методом магнетронного нанесения А1(А120з) в сочетании с ионно-плазменным методом Пленки бактериального сополимера поли(оксибутират-со-оксивалерат) подвергали вакуумному ультрафиолетовому излучению

2.1. Ионно-плазменная обработка

Модифицирование поверхностей ПТФЭ и ПЭТ алмазоподобным углеродным покрытием (а-С Н) проводили в лаборатории микроэлектроники «МАТИ»-РГТУ (зав лаб д т н , проф Елинсон В М ) Первый этап модифицирования заключался в обработке (травлении) исходной поверхности пучком ионной плазмы в атмосфере активных газов (СР^ и воздуха) в течение 1-30 мин, что приводило к образованию наноструктурированной поверхности На втором этапе (а-С Н)- покрытие формировали двумя способами

1 осаждением углерода непосредственно на поверхность обработанных образцов из направленных ионно-плазменных потоков паров углеводородов (циклогексан),

2 осаждением углерода на слой высокопористого алюминия, предварительно нанесенный магнетронным методом на поверхность обработанного ПЭТ

Общий вид шифра исследуемых образцов имеет вид Е-контр и Иобро/С,, где

Я - вид материала (ПТФЭ, ПЭТ, ПЭТ/А1(А1203)),

обр(1) - время обработки материала (в минутах) в ионной плазме Ср4 и воздуха для ПТФЭ и ПЭТ соответственно,

] - толщина а-С Н - покрытия (в нм)

2.2. Облучение вакуумным ультрафиолетовым излучением

Установка для модифицирования полимеров медицинского назначения (УМП-1) вакуумным ультрафиолетовым излучением была изготовлена в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО совместно с ФГУП НИИ физических проблем им Ф В Лукина Установка позволяет облучать образцы монохроматическим излучением с

длиной волны 147 нм и интенсивностью ЗхЮ15 квант с"1 см"2, в диапазоне рабочих давлений 0 02 - 25 торр

§ 3 Методы исследования физико-химических свойств наноструктурированной поверхности полимерных материалов

3.1. Метод сканирующей электронной микроскопии

Для исследования морфологии поверхности образцов использовали сканирующий электронный микроскоп JSM 6360LA (JEOL, Япония) Элементный состав поверхности анализировали методом энергетического дисперсионного рентгеновского анализа с использованием СЭМ JSM 6360LA (JEOL, Япония)

3 2 Метод атомно-силовой микроскопии

Наноструктуру поверхности оценивали с помощью атомно-силового микроскопа «ФемтоСкан» («Центр перспективных технологий», МГУ, Москва) и зондового микроскопа NTegra Tomo (NT-MDT, Москва) Поле сканирования от 0,2x0,2 до 10x10 мкм Для каждого образца были получены снимки поверхности в разных точках и при различном увеличении На основе данных сканирования находили совокупность характеристик микрорельефа поверхности Основным определяемым параметром являлась наношероховатость поверхности (среднеквадратичное отклонение R<¡), рассчитываемое по всем точкам скава

3.3. Метод рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии

Рентгеновские фотоэлектронные спектры регистрировали на спектрометре XSAM800 фирмы Kratos (Великобритания) Источником возбуждения служил магниевый анод с энергией характеристического излучения MgKa= 1253 6 эВ Мощность, выделяемая на аноде во время регистрации спектров, не превышала 90 Вт Измерения проводили при давлении ~5* 10"'° торр

3.4. Метод краевого угла смачивания

Степень гидрофильности поверхности пленочных образцов определяли по изменению краевого угла смачивания по воде Исследуемый образец располагался на дне оптической кюветы С помощью микрошприца на поверхность образца наносится капля смачивающей жидкости ~ 2 мкл Для аппроксимирования формы капли дугой окружности и вычисления краевого угла смачивания (по воде) изображение капли с телекамеры передавалось в компьютер с необходимым программным обеспечением

§ 4 Методы исследования биологических свойств наноструктурированной поверхности полимерных материалов

41. Методика регистрации количества необратимо адсорбированного белка методом флуоресценции полного внутреннего отражения (ФПВО).

В качестве параметра, определяющего характер взаимодействия поверхности с сывороточным альбумином человека (САЧ), было выбрано количество необратимо адсорбированного белка

Мечение САЧ раствором ФИТЦ проводили по стандартной методике, разработанной в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Адсорбцию белка на поверхность исходных и модифицированных образцов проводили из раствора фосфатного буфера с 0,1 мг/мл САЧ-ФИТЦ в пластиковых кюветах (объем 3 мл) в течение 60 минут в статических условиях с последующей отмывкой ФБ (5 мин ) Максимальное значение сигнала флуоресценции меченого белка САЧ-ФИТЦ (X = 523 нм) регистрировали на спектрометре Perkin Elmer LS55 (США) при длине волны возбуждения 495 нм

Абсолютное количество необратимо адсорбированного белка Ссачюо6р вычисляли по следующей формуле

СсАЧНе°бР = (СсАЧ-1ш"е0бР )пэнп / (I фл)пэнп) * (I фл)обр»

где (ССАч-ш1ни>бр)пэнп вычисляли по значениям количества необратимо адсорбированного САЧ с помощью метода ФПВО для оптически прозрачных образцов ПЭНП на спектрофлуориметре SLM 4800, Perkin Elmer, США

Согласно адсорбционному критерию гемосовместямости, поверхность материала должна адсорбировать минимальное количество прочно связанного белка, то есть должна легко обмениваться с белками плазмы крови Следовательно, чем ниже значение Ссачнсо5р, тем выше вероятность гемосовместимости медицинского изделия

4.2. Количество и морфология адгезированных тромбоцитов

Для проведения экспериментов по изучению взаимодействия тромбоцитов с поверхностью материалов использовали кровь здоровых взрослых доноров мужского пола в возрасте 20-50 лет Исследования проводили с информированного согласия доноров

Плазму, обогащенную тромбоцитами (ПОТ), получали из крови, стабилизированной 3 8 % цитратом натрия, центрифугированием при 100 g в течение 20 мин Концентрация тромбоцитов в ПОТ составляла (3,0 ± 0,5)* 105 мкл"3

Исследуемые образцы инкубировали с ПОТ в статических условиях 15 минут, фиксировали в 2 5% растворе глутарового альдегида и обезвоживали в растворах

этилового спирта возрастающих концентраций Визуализацию адгезированных клеток проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM 6360LA, (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 5 кВ и увеличениях до х2000 - 3500

Количество адгезированных тромбоцитов оценивали по значению относительного показателя адгезированных тромбоцитов - ОПАТ N

ОПАТ=—,

где N0$p тл°¥!контр - количества клеток, адгезированных на поверхности образца и контроля соответственно В качестве контрольной поверхности использовался медицинский полиэтилен низкой плотности (ПЭНП) Чем выше значение ОПАТ, тем выше возмущающее действие материала на тромбоциты

Кроме того, определяли процент сильно активированных тромбоцитов на поверхности образцов по показателю степени активации на поверхности - Кжг по формуле

N +N

агр ' раса

акт

"общ

где Ыобщ — общее количество клеток, адгезированных на поверхность материала, Nobp - количество агрегатов среди них, Npacn - количество распластанных тромбоцитов Чем ниже значение К^,-, тем меньше доля сильно активированных форм в общем количестве адгезированных тромбоцитов, а, следовательно, выше вероятность гемосовместимости образца

4.3. Оценка адгезии фибробластсв мыши линии NIH ЗТЗ

Стерильные образы исследуемых материалов площадью 1 5 см2 помещали на дно лунок 24 - луночной планшеты (d = 15 мм), фпбробласты засевали в концентрации ~5х 103 клеток/см2 Клетки культивировали при 37°С в СОг- инкубаторе, во влажной (95% влажности) атмосфере, содержащей 5 ± 1 % COj в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 0 58 г/л глутамина, 50 мкг/л гентамицина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Perbio-Plerce, Бельгия) и 10 мМ HEPES (ПанЭко, Россия)

Для анализа количества, морфологии и процессов пролиферации культивируемых на поверхности образцов фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ использовали СЭМ JSM 6360LA (JEOL, Япония) Интенсивность пролиферации оценивали по увеличению количества фибробластов, адгезированных на поверхность исходного и модифицированного материала на 1, 3 и 6 сутки культивирования клеток

Статистическая обработка результатов исследования

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel Находили средние значения вариант и

среднеквадратичные отклонения. Достоверность различий определяли, используя критерий t- Стьюден га с уровнем значимости 0.05 и 0.01.

§ 5. Результаты и их обсуждение

5.1. Физико-хи.нические свойства наноструктурированной поверхности образцов ПТФЭ, ПЭТ и ПОЕ-со-ПОВ

5.1.1. Сканирующая электронная микроскопия

Поверхность образцов ПТФЭ. модифицированных и о нно-плазменным метолом, (Рис, 1, б-г), в отличие от исходной поверхности (Рис. 1, а), имеет четко выраженные упорядоченные фибриллярные микроструктуры с размером фибрилл порядка 0.2 + 0.5 мкм. Размер микронеоднородностей не зависе.1 от наличия и толщины углеродного покрытия, т.е., характерная рельефная микроструктура поверхности задавалась уже Fia первой стадии обработки ПТФЭ.

в) ПТФЭоедиуСю г) ПТФЭоброо/Сюо

Рисунок 1 Микрофотографии поверхности исходного и модифицированного ПТФЭ.

Маркер - 2 мкм. Сканирующий электронный микроскоп .КМ-6360 ЬА (,1Е01„ Япония).

В отличие от ПТФЭ иои но-плазме иная обработка поверхности ПЭТ в атмосфере воздуха не изменяла микроструктуру образцов (Рис. 2 а, б)

Магнетронное нанесение высоко пористых пленок алюминия на поверхность ПЭТ приводит к формированию глобулярной микроструктуры ~ 0.5 мкм, параметры которой остается неизменной при напылении углерода (Рис. 2 в, г).

—-Л* . .'V X IЛ 1 т

в) ПЭТ,'А1(А1,0э) г) ПЭГ/Л1(А1;Оэ)«6изУС50

Рисунок 2. Микрофотографии поверхности исходного и модифицированного ПЭТ. Маркер - 2 мкм. Сканирующий электронный микроскоп 18М 6360ЬА (1ЕОЬ, Япония).

Исследования поверхности сополимера ПОБ-Со-ПОВ методом СЭМ не выявили наличия упорядоченной микроструктуры на поверхности исходного и ВУФ-облученного полимеров.

5.1.2. Атомно-силовая микроскопия

АС М-анализ наноструктуры поверхности образцов ПТФЭ показал, что нано размерная шероховатость (Ту поверхности после обработки ПТФЭ иошю-нлазменным травлением изменяется с (24 ± )) нм для исходного образца до (31 ± 2) нм дгея образца ПТФЭ^зочни)- При нанесение углеродного покрытия значения ^ достоверно увеличиваются до (37 ± 2) нм и (67 ± 4) нм для толщины «-С:Н 50 и 100 нм, соответственно.

Ионно-плазменнад обработка поверхности Г1ЭТ также ведет к росту К^ от (2,7 ± 0,3) нм до (10,3 ± 0.8) нм. Последующее напыление а-С:П-покрытия вызывает незначительный рост шероховатости до (12.4 ± 1.1) им и (12.2 ± 1.0) нм для образцов ПЭТоброоу'Сю и ПЭТое^ю/Сюо соответственно, рис. 3 а.

Нанесение высокопористого алюминиевого слоя на поверхность ПЭТ, естественно, вызывает резкий рост шероховатости (1^) с 2,7 ±0.3 нм для исходного ПЭТ до 148 ± 15 нм для образна ПЭТ/А1(А120з). После ионно-плазменной обработки поверхности в атмосфере воздуха и напыление слоя углерода было обнаружено снижение величины шероховатости равно 125 ± 13 нм для образца ПЭТ/А!(АI гОз)об[>г Iу'С<о (рис. 3 б) и 93 ± 8 нм для образца ГОТ/А1(АЬ<Ъ)оС[>а/См),

I i

Рисунок 3, Микрофотографии поверхностей образцов ПЭТ с «гладкой» и «глобулярной» структурой. Атомно-силовой микроскоп «ФемтоСкан» («Центр перспективных технологий», МГУ, Москва). Размер изображения 10x10x2 мкм.

а) ПЭТобрпо/Сщп

б) ПЭТ/А1(АЬОз).вр<1УС5о

Наноразмерная шероховатость поверхности исходных образцов ПОБ-со-ПОВ составляла 81 ± 8 нм. После ВУФ-обработки при давлении рабочей камеры 0.02 торр значение снижалось до 57 ± 6 им. При увеличении давления до 2.5 торр шероховатость продолжала снижаться, принимая свое минимальное значение (1^=22 ± 2 нм).

в) 2.5 торр г) 10 торр

Рисунок 4. Микрофотографии поверхностей образцов исходного и ВУФ-облученного при разных давлениях ПОБ-со-ПОВ. Размер изображений 12x12x3 мкм. Зондовый микроскоп N Те gra Tomo (NT-MDT, Москва).

Последующий рост давления до 10 торр приводит к росту R<, до 40 ± 4 нм и увеличению ее периодичности.

Таким образом, зависимость величины R¡¡ от давления, при котором проходило ВУФ-о б лучение ПОБ-со-ПОВ, имеет нелинейный характер. Минимальное значение было отмечено для поверхности, облученной при давлении 2.5 торр.

5 1.3 Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

Результата РФС-аналнза исследования поверхности ПТФЭ и ПЭТ, наноструктурированных ионно-плазменным обработкой, представлены в таблице 1.

J

Таблица 1 Элементный состав поверхностей исследуемых и модифицированных синтетических полимерных материалов

С, ат % И, ат % О, ат %

ПТФЭкошр 35 2±0 3 64 8 ± 0 3 -

ПТФЭовР(зо) 33.9 ± 0 1 66 1 ± 0 3 -

ПТФЭобрОо/Сю 61 9±02 28 2 ± 0 1 9 9 ± 0 2

ПТФЭобр(зо/Сюо 81 0 ± 0 4 8 5± 0 2 10 5 ± 0 3

ПЭТкоетр 76 4 ± 0 1 - 23 6 ± 0 2

ПЭТобр(Ю) 73 8 ± 0 1 - 22 5 ± 0 4

ПЭТоброо/Сюо 86 8±0 1 - 13 2 ±0.3

Для поверхности ПТФЭ при обработке ионами С?4 и нанесении а - С Н покрытия отмечено увеличение процентного содержания углерода и уменьшение процентного содержания фтора При ионно-плазменной обработке в атмосфере воздуха поверхности ПЭТ наблюдали увеличение процентного содержания углерода и уменьшение процентного содержания кислорода

Для образцов ВУФ-облученного сополимера ПОБ-со-ПОВ установлено, что при

разложении пика С15 (285 эВ) можно выделить три составные части, отвечающие

следующим химическим связям С-С, С-Н (285 эВ), С-О-С, С-ОН (286 5 эВ) и С=0

(289 эВ) Общее количество этих связей для данного спектра принято за 100%

Процентное содержание химических связей, образующихся при обработке вакуумным

ультрафиолетовым излучением, от величины остаточного давления воздуха для ПОБ-со-

ПОВ представлено на рисунке 5 60

-р яя

й 50 £ о

40

V Я

§ 30 И

ъ

В 20 л

в

5 ю

о

о

Рисунок 5 Зависимость относительного количества функциональных групп на поверхности ПОБ-со-ПОВ от величины давления остаточного воздуха в реакционной ячейке при 30 минутах ВУФ-облучения

Р0, торр

Таким образом, для ВУФ-облученных образов сополимера при всех значениях давления отмечено снижение относительного количества связей С-С, С-Н, С=0 и повышение относительного количества связей С-О-С, С-ОН, что и является причиной гидрофилизации поверхности Наибольший эффект наблюдается при давлении 2 5 торр

5 14 Краевой угол смачивания

Обработка ионной плазмой CF4 приводит к еще большей гидрофобизации поверхности ПТФЭ Краевой угол смачивания по воде 6° возрастал от (111 ± 2)° до (138 ± 4)° Следующее за травлением нанесение углеродного покрытия толщиной 10 нм ведет к незначительной гидрофилизации поверхности (й° = 123 5 ± 4), что, вероятно, обусловлено наличием непокрытых углеродом участков ПТФЭ При толщине углеродного слоя 100 нм краевой угол смачивания изменяется до 86 ± 6°

Известно, что значения краевого угла смачивания по воде для сплошных углеродных покрытий на основе ПЭНП составляют (81 7 - 92 8)° Следовательно, в отличие от образца ПТФЭ0бр(зо/Сю, при толщине углеродного слоя 100 нм на поверхности обработанного ионной плазмой ПТФЭ формируется сплошное гидрофильное покрытие

Ионно-плазменная обработка поверхности ПЭТ в атмосфере воздуха также приводит к гидрофобизации поверхности краевой угол смачивания растет с (66 ± 3)° до (93 ± 6)° Последующее нанесение углеродного покрытия толщиной 10 нм практически не меняет значения краевого угла смачивания б°(ПЭТобр(1оУСю) = (88 ± 5)" При увеличении углеродного слоя до 100 нм значение краевого угла смачивания уменьшается до уровня исходного ПЭТ (71 ± 5)°

При ВУФ-облучении образцов ПОБ-со-ПОВ и минимальном давлении (0 02 торр) в рабочей камере изменения краевого угла смачивания поверхности (82 ± 3)" статистически не достоверны Увеличение давления в рабочей камере ведет к гидрофилизации поверхности (в" = 62 ± 6 для 2 5 торр и в°=10 ± 4" для 10 торр) Следовательно, максимальное значение гидрофильности поверхности выявлено для обработки сополимера при давлении 2 5 торр, что соответствует данным РФС

5.2. Биологические свойства наноструктурированной поверхности образцов ПТФЭ, ПЭТ и ПОБ-со-ПОВ

5 2 1 Адсорбция белка

Обработка поверхности ПТФЭ плазмой CF4 ведет к росту количества необратимо адсорбированного САЧ (ССАч"с°бр) с (63 6 ± 5 8) нг/см2 до (106 4 ± 12,0) нг/см2 Формирование углеродного покрытия уменьшает количества адсорбированного белка с

(50 9 ± 12 1) нг/см2 для покрытий толщиной 10 нм до (10 8 ± 2 2) нг/см2 для углеродного слоя 100 нм

Наименьшее количество альбумина (10 8 ± 2 2 нг/см2) адсорбируется на поверхность (ПТФЭ^зо/Сюо) с наибольшими значениями гидрофильности (в° = 86 ± 6), рис 6 и наношероховатости Я, = (67 ± 4) нм в ряду исследуемых образцов ПТФЭ

Рисунок 6 Зависимость количества необратимо адсорбированного сывороточного альбумина человека от краевого угла смачивания поверхности

Ионно-плазменная обработка поверхности ПЭТ в атмосфере воздуха ведет к уменьшению ССАчвя)6р с (49 8 ± 5 8) нг/см2 до (14 7 ± 4,1) нг/см2 Нанесение а-С Н -покрытия толщиной 100 нм вызывает понижение количества необратимо адсорбированного САЧ до (5 4 ± 2 2) нг/см2 В ряду модифицированных поверхностей ПЭТ образец ПЭТобрею/Сюо имеет наибольшую гидрофильностъ

Известно, что гидрофилизация гидрофобной поверхности приводит как к уменьшению общего количества адсорбированного белка, так и доли необратимо адсорбированных молекул Действительно, наименьшие значения необратимо адсорбированного САЧ для поверхности ПТФЭ и ПЭТ обнаружены для образцов с наименьшим краевым углом смачивания, 6° = 86 ± б и в" = 71 ± 5, соответственно

Количество необратимо адсорбированного САЧ уменьшается с нанесением на поверхность ПЭТ слоя А1(А1203) с (49 8 ± 5 8) нг/см2 до (21 7 ± 4 7) нг/см2 Последующая обработка в ионной плазме воздуха и напыление алмазоподобного покрытия толщиной 50

нм ведет к еще более заметному уменьшению количества САЧ (12 5 ± 1 3) нг/см2 и (10 9 ±2 6) нг/см2 для 1 и 3 мин обработки соответственно

ВУФ-облучение поверхности ПОБ-со-ПОВ ведет к понижению количества необратимо адсорбированного альбумина с (63 4 ± 7 3) нг/см2 до (35 6 ± 4 7) нг/см2 при всех значениях давления в рабочей камере При этом, наименьшее Ссачни>6р было отмечено также для наиболее гидрофильного образца с в" = 62 ± 6, облученного при давлении 2 5 торр, с наименьшим значением значением = (22 ± 2) нм в ряду исследуемых образцов сопочимера

Кроме того, из рисунка 5 видно, что зависимость количества С=0-групп на поверхности ВУФ-облученного ПОБ-со-ПОВ от давления воздуха в реакционной ячейке принимает максимальное значение при давлении 2 5 торр Таким образом, можно сделать вывод, что минимизация адсорбции альбумина человека обусловлена наличием на поверхности сополимера С=0-групп Можно предположить, что наличие минимума связано с тем, что в результате генерации на гидрофобной поверхности полярных С=0-групп достигается гидрофобно-гидрофильный баланс, обеспечивающий минимальное взаимодействие поверхности с белковыми и клеточными элементами крови

5 2 2 Адгезия тромбоцитов

Морфологический анализ образцов показал, что доля сильно активированных форм (распластанных и агрегатов) тромбоцитов одинакова для исходной и травленой поверхности ПТФЭ, Каш- = 0 73 ± 0 07 и Какт = 0 71 ± 0 07, соответственно В то же время, нанесение а-С Н покрытия уменьшает количество распластанных тромбоцитов и агрегатов, но увеличивается число клеток с псевдоподиями (Какт = 0 56 ± 0 06 для образца ПТФЭ обР(зомин)/С1о и Какг = 0 42 ± 0 04 для образца ПТФЭ Овроошш/Сюо) Полученные результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о преобладании слабо активированных форм в общем количестве адгезированных тромбоцитов и отсутствии перераспределения в сильно активированные формы на углеродные фибриллярные структуры (в сравнении с гладкими и глобулярными)

Из данных исследования можно сделать вывод, что поверхность ПТФЭ после 30-минутной обработки ионной плазмой Ср4 и последующего нанесения углеродного слоя толщиной 100 нм в наименьшей степени провоцирует поверхностную агрегацию тромбоцитов человека (р < 0 05), что говорит о ее лучшей гемосовместимости относительно других образцов ПТФЭ

Было обнаружено, что ионно-плазменная обработка поверхности ПЭТ в плазме воздуха с последующим нанесением а-С Н - покрытия не влияет на значение ОПАТ

(0,73 ± 0.И) по сравнению с 0.65 ± 0.09 для исходного ПЭТ), но, в то же время, понижает количество сильно активированных клеток. Наименьшее значение параметра К^ отмечено для образца с толщиной углеродного покрытия 100 нм (0.45 ± 0.06 по сравнению с 0.72 ± 0.11 для исходного ПЭТ).

Наличие слоя высокопористого алюминия на поверхности ПЭТ ведет к увеличению общего количества адгезировапных тромбоцитов (ОПАТ растет от 0.65 ± 0.09 до 0.81 ± 0.12), что можно объяснить ростом истинной шюшади поверхности ПЭТ/А1(А1;Оз), контактирующей с тромбоцитарной плазмой. Последующая ионно-плазменпая обработка поверхности ПЭТ/А1(А1;Оз) и нанесение о^С:Н - покрытия не влияет на значения ОПАТ. Однако морфологический анализ адгезированных на поверхности тромбоцитов показал, что количество сильно активированных тромбоцитов уменьшается после микро- и нанострухтурирования поверхности (Кжт — 0,60 ± 0.09 по сравнению с 0.72 ± 0.11 ДЛЯ исходного ПЭТ),

Для всех ВУФ-модифицированных образцов ПОБ-со-ПОВ было установлено достоверное снижение значения ОПАТ. Наименьшее количество адгезированных тромбоцитов по сравнению с поверхностью исходного сополимера (рис. 7 а) (ОПАТ = 0.81 ±0,12) наблюдалось на поверхностях, облученных при 2.5 (рис. 7 б) и 10 торр (ОПАТ = 0,12 ± 0,02 и 0.16 ± 0.02 соответственно).

а) ПОБ-со-ПОВ

Рисунок 7. Микрофотографии адгезированных тромбоцитов на поверхности исходного и ВУФ-облученного ПОБ-со-ПОВ. Маркер - 10 мкм. Сканирующий электронный микроскоп .ШМ-бЗбО 1,А (ЛЮЦ Япония).

Морфологический анализ адгезированных тромбоцитов показал, что ВУФ-обработка приводит к достоверно значимому уменьшению количества сильно активированных форм адгезированных тромбоцитов при всех значениях давления в рабочей камере (Какт = 0.30 ± 0.05 для облученных образцов по сравнению с 0.75 ± 0.12 для исходного ПОБ-со-ПОВ).

б) 2.5 торр

5.2.3. Культивирование фиоробластов мыши линии К1Н ЗТЗ Иг данных лктериуры известно, что поверхность ПТФЭ обладает низкой I истоеовместимостью, т.е. клетки тканей плохо адгезируют на псе и медленно растут. Это свойство, в частности, вызывает затруднение при изготовлении сосудистых протезов из ПТФЭ. Было установлено, что разработанный двух стадийный способ модифицирования поверхности ПТФЭ улучшает ее биосовместнмые свойства на клеточной уровне. Для этих образцов отмечено быстрое прикрепление и рост клеток, причем фиброб ласты были распластаны и имели полигональную форму (Рис. 8, в, г), а не веретенообразную и треугольную как для исходного ПТФЭ (Рис. 8, а).

Рисунок 8. Микрофотографии адгезированных фнбробластов мыши линии Kill ЗТЗ на поверхности исходного и модифицированного ПТФЭ. Время культивирования - 3 суток. Маркер - 50 мкм. Сканирующий электронный микроскоп JSM-6360 LA (JEOL, Япония).

В отличие от образцов ПТФЭ. ионно-ляазменная обработка поверхности ПЭТ в атмосфере воздуха незначительно улучшала пролиферацию фнбробластов.

Было показано, что наличие слоя высокопористого Al(AbOj) увеличивает адгезию и пролиферацию фнбробластов мыши линии NfflC ЗТЗ к поверхности ПЭТ (Рис. 9 б, а). Последующая обработка поверхности ионной плазмой воздуха и нанесение а^С:Н -покрытия ускоряет рост клеток и улучшает их распластывание (Рис, 9 в, г).

в) ПТФЭ^зоУСю г) ПТФЭ^оС,*

в) ПЭТ/А 1( А Ь Оз)^ I /сГо" " г) ПЭТ/А1(АЬОзир(з/С,о

Рисунок 9, Микрофотографии адгезированных фибробластов мыши линии №Н ЗТЭ на поверхности исходного и модифицированного ПЭТ. Время культивирования - 3 суток. Маркер - 50 мкм. Сканирующий электронный микроскоп .¡БМ-бЗбО LA (ЛЕОЬ. Япония).

В экспериментах по культивированию фибробластов на поверхности сополимера ПОБ-со-ПОВ, а также его модификаций, полученных с помощью В УФ-обл учения показали, через 3 часа после посева клетки хорошо прикреплялись к поверхности всех субстратов, кроме поверхности исходного ПОЕ-со-ПОВ. На 3-и сутки наблюдали визуальное увеличение количества фибробластов на поверхности сополимера, облученного при давлении рабочей камеры 2.5 торр по сравнению с поверхностью необработанного ПОБ-со-ПОВ

Результаты культивирования фибробластов мыши линии №Н ЗТЗ на исследуемых паи структурированных образцах в условиях ш \'~аго показали, что модифицирование полимерных материалов положительно влияет на их биосовместимые свойства. Это дает основание предположить перспективность использования предложенных методов наноструктурирования поверхности для разработки имплантируемых изделий с высокими гемо- и биосовместимыми характеристиками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основным результатом проведенной работы явилась изучение взаимосвязи между физнко -химическими и биологическими свойствами полимерных материалов искусственного и биологического происхождения с наностру курированной поверхностью, полученной двумя методами модифицирования: применением ионно-Плазменных технологий и вакуумного ультрафиолетового облучения.

Проведенные исследования физико-химических и биологических свойств модифицированных поверхностей ПТФЭ, ПЭТ, а также сополимера ПОБ-со-ПОВ бактериального происхождения позволили найти оптимальные условия модифицирования физико-химических свойств поверхности полимерных материалов методами ионно-плазменной обработки с последующим нанесением углеродных покрытий и вакуумным ультрафиолетовым излучением Модифицирование полимерных материалов данными методами изменяет степень гидрофильности их поверхности и размер наяоразмерной наношероховатости, кроме того, приводит как к уменьшению степени необратимости адсорбции альбумина, так и к снижению относительной доли сильно активированных клеток, что свидетельствует об улучшении гемосовместимых свойств выбранных объектов исследования Исследования адгезии, роста и пролиферации фибробластов мыши линии №Н ЗТЗ показали, что наноструктурирование поверхности ведет к быстрому прикреплению клеток, их активному росту и высокой степени распластанности, что говорит об улучшении биосовместимых свойств поверхности

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что каждый материал проявляет наилучшие биологические свойства при определенном значении наноразмерной шероховатости

Найдены оптимальные режимы обработки ионно-плазменной методами поверхностей политетрафторэтилена и полиэтилентерефталата, а также оптимальные режимы ВУФ-облучения образцов сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата, улучшающие их гемо- и биосовмесгимые свойства на белковом и клеточном уровне

ВЫВОДЫ

1 Показано, что модифицирование пленок ПТФЭ и ПЭТ, соответственно, ионно-плазменной обработкой поверхности ионами С?4 и в атмосфере воздуха с последующим нанесением алмазоподобного углеродного покрытия сопровождается увеличением наноразмерной шероховатости поверхности и ее гидрофильности Для сополимера ПОБ-ПОВ гидрофилизирующее действие ВУФ-обработки сопровождается уменьшением наношероховатости поверхности

2 Установлено, что гидрофилизация поверхности ПТФЭ, ПЭТ и ПОБ-ПОВ положительно влияет на их биологические свойства, однако наилучшие гемо- и биосовместимые свойства наноструктурированных образцов достигаются при различных значениях наноразмерной шероховатости

-223 Обнаружено, что наименьшее количество сывороточного альбумина человека, необратимо адсорбированного на поверхности ПОБ-со-ПОВ, соответствует максимальной поверхностной концентрации кислородсодержащих групп

4 Наноструктурирование поверхности ПТФЭ, ПЭТ и ПОБ-со-ПОВ уменьшает количество необратимо адсорбированного сывороточного альбумина человека и долю сильно активированных тромбоцитов (распластанных и агрегатов) по сравнению с исходными образцами, что свидетельствует о повышение их гемосовместимости

5 Процессы прикрепления и пролиферации фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ на поверхностях трех исследованных наноструктурированных полимерных материалов протекают активнее, чем на исходных поверхностях, что доказывает повышение их биосовместимости

6 Показано, что предварительное формирование на поверхности ПЭТ слоя высокопористого алюминия способствует увеличению адгезии и пролиферации клеточной культуры фибробластов

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 При выборе способа наноструктурирования поверхности необходимо учитывать природу полимерных материалов

2 Найденные для каждого способа наноструктурирования оптимальные режимы обработки поверхности могут бьггь рекомендованы для разработки технологий физического модифицирования с целью улучшения медико-технических свойств имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии (системы искусственного и вспомогательного кровообращения, катетеры, протезы кровеносных сосудов и др)

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Е А Ремеева, Влияние чужеродной поверхности на реакцию высвобождения АТФ из тромбоцитов человека Материалы XLV научной конференции МФТИ (секция физики живых систем), 2002, С 7

2) IВ Rozanova, Е A Nemets, Е A Remeeva, VI Sevastianov, Influence of biomatenals surface on platelets release ATP m vitro The International Journal of Artificial Organs, 2003, 26, № 7, P 634

3) EA Ремеева, EA Немец, И Б Розанова, В И Севастьянов, Влияние различных олигосилоксанов на реакцию высвобождения АТФ из тромбоцитов человека Материалы XLVI научной конференции МФТИ (секция физики живых систем), 2003, С 93

-234) Е А Ремеева, Е А Немец, И Б Розанова, В И Севастьянов, Методика измерения активации тромбоцитов в присутствии чужеродной поверхности Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2004, № 1 С 19-23

5) Б A Remeeva, ЕА Nemets, IB Rozanova, VI Sevastianov Platelet activation aggregation, ATP release and adhesion induced by biomatenal surface The International Journal of Artificial Organs, 2004,27, № 7, P 605

6) E О Дуплякин, E А Ремеева, И Б Розанова Методы исследования взаимодействия тромбоцитов с чужеродной поверхностью Материалы IX Научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника», изд МГИЭМ, 2004, С 250-255

7) ЕА Ремеева, И Б Розанова, ЕА Немец, В И Севастьянов, Роль гидрофильности органосилоксанов в процессах взаимодействия поверхности материалов с тромбоцитами человека Перспективные материалы, 2005, № 5, С 60-67

8) Е A Remeeva, Е A Nemets, IВ Rozanova, VI Sevastianov, The Study of Platelet Haemostatic Reactions in the Presence of the Model Surfaces with Different Hydrophilicity Degree Proceedings of 19th Conference on Biomatenals, 2005, P 516

9) E A Remeeva, IВ Rozanova, V M Elmson, VI Sevastianov, Platelet adhesion on nanostructured surfaces (NSS) formed by ion-plasma methods The International Journal of Artificial Organs, 2005, 28, № 9, P 89

10)EA Ремеева, И Б Розанова, ВМ Елинсон, В И Севастьянов, Влияние способа формирования углеродного покрытия на физико-химические и биологические свойства полиэтилентерефталата Перспективные материалы, 2006, № 2, с 56-62

11) Е А Ремеева, В М Елинсон, И Б Розанова, В И Севастьянов, Исследование адсорбции белка, адгезии тромбоцитов и роста фибробластов на поверхности ПТФЭ, модифицированного ионно-плазменяой обработкой с последующим нанесением углеродных пленок Материалы 4 Московского Международного Конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития», Экспо-биохим-технологии, 2007, с 119-121

12)ЕА Ремеева, И Б Розанова, ВМ Елинсон, В И Севастьянов, Влияние физико-химических свойств наноструктурированной поверхности политетрафторэтилена на характер его взаимодействия с сывороточным альбумином и тромбоцитами человека Перспективные материалы, 2007, № 5, с 56-64

13)ЕА Remeeva, АЕ Efimov, VM Elmson, ЕА Nemets, AG Tonevitsky, VI Sevastianov, Nanoscale modification of synthetic and biological polymer surface via ion-plasma treatment and vacuum ultraviolet irradiation Материалы 9-го Российско-китайского Симпозиума «Новые материалы и технологии», 2007, с 493-497

Подписано в печать 17 09 2007 г Исполнено 18 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 729 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 \vw\v аикм^ега! ги

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Ремеева, Евгения Анваровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

§ 1.1. Разработка биомедицинских материалов.

§ 1.2. Классификация материалов медицинского назначения.

1.2.1. Синтетические полимеры и изделия из них.

1.2.2. Биодеградируемые полимерные материалы и области их применения. ПОБ и его сополимеры.

§ 1.3 Методы модифицирования полимерных материалов.

1.3.1. Наноструктурирование поверхности полимеров ионно-плазменными методами.

1.3.2. Модификация поверхности методом вакуумного ультрафиолетового облучения.

1.4. Влияние наноструктурирования на физико-химические и биологические свойства полимерных материалов.

1.4.1. Поверхностная энергия.

1.4.2. Формирование регулярных поверхностных структур.

1.4.3. Адсорбция белков.

1.4.4. Адгезия тромбоцитов.

1.4.5. Взаимодействие клеток тканей организма с поверхностью биоматериала.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

§2.1. Материалы.

§ 2.2. Методы модифицирования поверхностей полимерных материалов.

2.2.1. Ионно-плазменная обработка.

2.2.2. Облучение вакуумным ультрафиолетовым излучением.

§ 2.3. Методы исследования физико-химических свойств наноструктурированной поверхности полимерных материалов.

2.3.1. Метод сканирующей электронной микроскопии.

2.3.2. Метод атомно-силовой микроскопии.

2.3.3. Метод рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии.

2.3.4. Метод краевого угла смачивания.

§ 2.4. Методы исследования биологических свойств наноструктурированной поверхности полимерных материалов.

2.4.1. Методика регистрации количества необратимо адсорбированного белка методом флуоресценции полного внутреннего отражения

ФПВО).

2.4.2. Количество и морфология адгезированных тромбоцитов.

2.4.3. Оценка адгезии фибробластовмыши линии NIH ЗТЗ.

Статистическая обработка результатов исследования.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

§ 3.1. Физико-химические свойства наноструктурированной поверхности образцов ПТФЭ, ПЭТ И ПОБ-со-ПОВ.

3.1.1. Сканирующая электронная микроскопия.

3.1.2. Атомно-силовая микроскопия.

3.1.3. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия.

3.1.4. Краевой угол смачивания.

§ 3.2. Биологические свойства наноструктурированной поверхности образцов ПТФЭ, ПЭТ И ПОБ-со-ПОВ.

3.2.1. Адсорбция белка.

3.2.2. Адгезия тромбоцитов.

3.2.3. Культивирование фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ.

§ 3.3. Обобщение и сравнительный анализ проведенных экспериментальных исследований.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние наноструктурирования поверхности медицинских полимерных материалов на их физико-химические и биологические свойства"

Актуальность темы

Имплантируемые медицинские изделия из биоматериалов искусственного и природного происхождения достаточно широко применяются в различных областях современной медицины, однако проблема улучшения их функциональных характеристик остается актуальной.

Одним из основных требований к медицинским изделиям является их соответствие необходимым биологическим свойствам. Так, в случае протезов кровеносных сосудов, дренажей, катетеров, искусственных хрусталиков глаза, биосенсоров и др. взаимодействие поверхности изделия с биологической средой должно быть минимально, а для ортопедических и стоматологических имплантатов, напротив, требуется прорастание окружающей ткани в объем изделия.

Разработки медицинских изделий с улучшенными био- и гемосовме-стимыми свойствами ведутся по двум основным направлениям: создание новых материалов и модифицирование уже существующих материалов и изделий.

Реакция организма на имплантат определяется, в основном, его поверхностными свойствами: химическим составом, структурой и морфологией. В связи с этим, существующие способы регулирования биологических свойств медицинских изделий направлены на изменение физико-химических свойств поверхности (химический состав, степень гидрофиль-ности, заряд, морфология и др.) с использованием физических, химических и физико-химических методов модифицирования. Особый интерес представляют методы модифицирования, которые позволяют изменять физико-химические, структурные и функциональные свойства поверхности, не влияя на объёмные характеристики изделия, такие как прочность, эластичность, коэффициент пропускания, показатель преломления, электрофизические параметры и т.д.

Одним из перспективных путей улучшения биологических свойств медицинских изделий является модифицирование их поверхности различными физико-химическими методами (травление, обработка плазмой тлеющего разряда, ионная бомбардировка, литография и др.).

В 2001-2005 гг. в Центре по исследованию биосовместимых материалов ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов был проведен сравнительный анализ химических, физических и физико-химических методов модифицирования медицинских материалов и изделий из синтетических полимерных материалов, направленных на улучшение их медико-технических свойств. Результатом работы явилось доказательство перспективности двух подходов к созданию биосовместимых поверхностей: технологий, основанных на ионно-плазменных методах и метод вакуумной ультрафиолетовой (ВУФ) обработки. Было доказано, что выбранные способы модифицирования позволяют создавать на поверхности гидрофильно-гидрофобные микро- и наноструктуры, имитирующие структуры белков и клеточных мембран. Однако детального анализа влияния ионно-плазменной и ВУФ обработки поверхности на изменение ее структурных характеристик и биологических свойств не проводилось. Кроме того, исследования ограничивались только синтетическими биостабильными полимерными материалами.

Цель работы

Цель работы заключалась в исследовании физико-химических и биологических свойств поверхности биополимерного материала (сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата) и синтетических полимерных материалов (политетрафторэтилена, полиэтилентерефталата), наноструктурированных различными физическими методами.

Основные задачи работы

Исходя из поставленной цели, задачи исследования сводились к следующему:

1) доказать возможность применения магнетронного, ионно-плазменного метода и метода ВУФ-обработки для наноструктурирования поверхности синтетических и природных медицинских полимерных материалов;

2) изучить влияние наноструктурирования пленочных образцов полимерных материалов на химический состав, морфологию и гидрофильность их поверхности;

3) исследовать в условиях in vitro биологические свойства полимерных материалов и найти оптимальные условия наноструктурирования поверхности, приводящие к улучшению биологических свойств модифицированных образцов.

Научная новизна

1. Доказана возможность применения ВУФ-обработки для улучшения био- и гемосовместимых свойств бактериального сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата, предназначенного для замещения дефектов мягких тканей, в том числе, в качестве имплантируемого носителя для трансплантации клеток.

2. Доказано, что обработка пленок политетрафторэтилена, полиэтилентерефталата и сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата выбранными для них способами модифицирования, приводит к изменению наноразмерной шероховатости, гидрофильности и химического состава поверхности.

3. Проведен сравнительный анализ влияния микро- и наноструктуры гладкой и пористой поверхности полиэтилентерефталата, полученных, соответственно, ионно-плазменным методом с последующим нанесением алмазоподобного углеродного покрытия и магнетронным нанесением высокопористого алюминия/оксида алюминия в сочетании с ионно-плазменным методом, на биологические свойства образцов.

4. Для каждого вида полимерного материала и выбранного способа наноструктурирования поверхности исследовано влияние наноразмерной шероховатости и гидрофильности поверхности на ее гемо- и биосовместимые свойства.

Практическая значимость

Найдены оптимальные режимы обработки ионно-плазменными методами для политетрафторэтилена (ПТФЭ, 30 мин травления, 100 нм а-С:Н) и полиэтилентерефталата (ПЭТ, 10 мин травления, 100 нм а - С:Н; ПЭТ/А1(А1203), 3 мин травления, 50 нм а-С:Н), а также оптимальные режимы ВУФ-облучения образцов сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ, 30 мин. облучения, 2.5 торр), улучшающие их гемо- и биосовместимые свойства на белковом и клеточном уровне.

Результаты работы рекомендуются к использованию в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов», Федеральном государственном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена», Научном центре сердечнососудистой хирургии имени А.Н. Бакулева, Федеральном государственном учреждении «Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова». Апробация работы

Основные материалы, изложенные в диссертации, доложены и обсуждены на следующих семинарах и конференциях:

- межинститутский семинар Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Рос-медтехнологий (2005, 2006, 2007 гг.),

- 45, 46 и 49-ая научные конференции МФТИ (Долгопрудный, 2002, 2003,2006 гг.),

- 31-й Европейский Конгресс по искусственным органам ESAO (г. Варшава, Польша, 2004 г.),

- 11-ая научно-техническая конференция «Вакуумная наука и техника» (г. Судак, Украина, 2004г.),

- 19-ая Европейская Конференция по биоматериалам ESB (г. Сорренто, Италия, 2005 г.),

- 4-й Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.),

- IX-й Российско-Китайский Симпозиум «Новые материалы и технологии» (Астрахань, 2007 г.).

Публикации

Результаты проведенных исследований отражены в 13 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом. Структура и объём диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Ремеева, Евгения Анваровна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что модифицирование пленок ПТФЭ и ПЭТ, соответственно, ионно-плазменной обработкой поверхности ионами CF4 и в атмосфере воздуха с последующим нанесением алмазоподобного углеродного покрытия сопровождается увеличением наноразмерной шероховатости поверхности и ее гидрофильности. Для сополимера ПОБ-ПОВ гидрофилизирующее действие ВУФ-обработки сопровождается уменьшением наношероховатости поверхности.

2. Установлено, что гидрофилизация поверхности ПТФЭ, ПЭТ и ПОБ-ПОВ положительно влияет на их биологические свойства, однако наилучшие гемо- и биосовместимые свойства наноструктурированных образцов достигаются при различных значениях наноразмерной шероховатости.

3. Обнаружено, что наименьшее количество сывороточного альбумина человека, необратимо адсорбированного на поверхности ПОБ-со-ПОВ, соответствует максимальной поверхностной концентрации кислородсодержащих групп.

4. Наноструктурирование поверхности ПТФЭ, ПЭТ и ПОБ-со-ПОВ уменьшает количество необратимо адсорбированного сывороточного альбумина человека и долю сильно активированных тромбоцитов (распластанных и агрегатов) по сравнению с исходными образцами, что свидетельствует о повышении их гемосовместимости.

5. Процессы прикрепления и пролиферации фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ на поверхностях трех исследованных наноструктурированных полимерных материалов протекают активнее, чем на исходных поверхностях, что доказывает повышение их биосовместимости.

6. Показано, что предварительное формирование на поверхности ПЭТ слоя высокопористого алюминия способствует увеличению адгезии и пролиферации клеточной культуры фибробластов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При выборе способа наноструктурирования поверхности необходимо учитывать природу полимерных материалов.

2. Найденные для каждого способа наноструктурирования оптимальные режимы обработки поверхности могут быть рекомендованы для разработки технологий физического модифицирования с целью улучшения медико-технических свойств имплантатов для сердечнососудистой хирургии (системы искусственного и вспомогательного кровообращения, катетеры, протезы кровеносных сосудов и др.).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Ремеева, Евгения Анваровна, Москва

1. Биосовместимость, Под ред. В.И. Севастьянова, М., «ИЦ ВНИИ геосистем», 1999, 366 с.

2. Волков А., Синтетические биоматериалы на основе полимеров органических кислот в тканевой инженерии, обзоры on-line, 7 февраля, 2005, http://celltranspl.ru/iournal/publications/.

3. Волова Т.Г., Калачева Г.С., Константинова В.М., Способ получения гетерополимера (3-оксимасляной и (3-оксивалериановой кислот, Патент РФ, № 2051968 (приоритет от 08.01.1992), БИ., 1996, №3.

4. Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И., Полиоксиалканоа-ты (ПОА) биоразрушаемые полимеры для медицины (под ред. В.И. Шумакова), Новосибирск, Изд. СО РАН, 2003, 330 с.

5. Волынец Л.И., Немец Е.А., Бельков А.В., Севастьянов В.И. Использование биопротезов кровеносных сосудов малого диаметра с гепаринсодержащим покрытием. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2004, № 2, с. 41-44.

6. Елинсон В.М., Слепцов В.В., Лямин А.Н. и др. Ионно-плазменные методы формирования наноструктурированных поверхностей для целей медицины и биотехнологии Материалы научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника», сентябрь 2004, с. 214218.

7. Ю.Немец Е.А., Порунова Ю.В., Друшляк И.В., Беломестная З.М., Севастьянов В.И. Влияние природы функциональных химических групп поверхности на медико-биологические свойства материалов для контакта с кровью. Перспективные материалы, 1999, № 6, с. 36-41.

8. Ремеева Е.А., Розанова И.Б., Немец Е.А., Севастьянов В.И. Роль гидрофильности органосилоксанов в процессах взаимодействия поверхности материалов с тромбоцитами человека. Перспективные материалы, 2005, № 5, с. 60-67.

9. П.Севастьянов В.И. Биоматериалы для искусственных органов. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2001, №3-4, с. 123-131.

10. Н.Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Они-щенко Н.А., Биодеградируемый биополимерный материал Эла-стоПОБ™ для клеточной трансплантации, Перспективные материалы, 2004, №3, с. 35-41.

11. Суздалев И.П. Нанотехнология: физико-химия нанокластеров, наноструктур и наноматериалов. Серия "Синергетика: от прошлого к будущему", 2006. Москва.

12. Титушкин И.А., Васин СЛ., Алехин А.П., Розанова И.Б., Исаев В.И., Севастьянов В.И. Влияние структурных и энергетических свойств углеродных покрытий на адгезию тромбоцитов человека. Медицинская техника, 1999, №5, с. 43-51.

13. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир; 1975.

14. Е. А. Черницкий, Люминесценция и структурная лабильность белков в растворе и клетке, Минск, «Наука и техника», 1972.

15. Шитикова А.С. Тромбоцитарный гемостаз. Санкт-Петербург: Издательство СПб ГМУ; 2000.

16. Alanazi A., Nojiri С., Noguchi Т., Kido Т., Komatsu Y., Hirakuri К., Funakubo A., Sakai К. and Fukui Y. Improved Blood Compatibility of DLC Coated Polymeric Material, ASAIO, 2000, Vol. 46(4), p. 440443.

17. Allen M., Law F. and Rushton N. The Effects of Diamond Like Carbon Coatings on Macrophages, Fibroblasts and Osteoblast-like Cells In Vitro, Clin. Mater., 1994, Vol. 17, p. 1.

18. Allen M., Myer B. and Rushton N. In Vitro and In Vivo Investigations into Biocompatibility of Diamond-like Carbon (DLC) Coatings for Orthopedic Applications, J. Biomed. Mater. Res., 2001, Vol. 58, p. 319.

19. Assero G., Satriano C., Lupo G., Anfuso C.D., Marietta G., Alberghina M. Pericyte adhesion and growth onto polyhydroxymethylsiloxane surfaces nanostructured by plasma treatment and ion irradiation Microvasc Res., 2004, Vol. 68(3), p. 209-220.

20. Boeree R., Dove J., Knowles J., Hastings G., Development of a degrad-able composite for orthopedic use: mechanical evaluation of a hy-droxyapatite polyhydroxybutyrate composite material, Biomaterials, 1993, Vol. 14, p. 793-796.

21. Bohnert J.L., Fowler B.C., Horbett T.A., Hoffman A.S.J. Plasma gas discharge deposited fluorocarbon polymers exhibit reduced elutability of adsorbed albumin and fibrinogen. Biomater Sci Polym Ed., 1990, Vol. 1(4), p. 279-297.

22. Brien F.J.O. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials, 2005, Vol. 26, p. 433-441.

23. Cezeaux J.L., Romoser C.E., Benson R.S., Buck C.K., Sackman J.E. VUV modification promotes endothelial cell proliferation on PTFE vascular grafts. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, B, 1998, Vol. 141, № 1-4, p. 193-196.

24. Chen M, Zamora PO, Som P, Pena LA, Osaki S. Cell attachment and biocompatibility of polytetrafluoroethylene (PTFE) treated with glow-discharge plasma of mixed ammonia and oxygen. J Biomater Sci Polym Ed., 2003, Vol. 14(9), p. 917-935.

25. Clark P., Connolly P., Curtis A.S.G., Dow J.A.T., Wilkinson C.D.W., Cell guidance by ultrafine topography in vitro, J. Cell Sci., 1991, Vol. 99, p. 73-77.

26. Cui F.Z. and Li D.J. A Review of Investigations on Biocompatibility of Diamond-like Carbon and Carbon Nitride Films, Surface and Coatings Technology, 2001, Vol. 131, p. 481-187.

27. Dalby M.J.et al. Nonadhesive nanotopography: fibroblast response to poly(n-butyl metacrylate)-poly(styrene) demixed surface features. JBMR, 2003, Vol. 67A, № 3, p. 1025-1032.

28. Dalby M.J., Riehle M.O., Johnstone H.J.H., Affrossman S., Curtis A.S.G., Polymer demixed nano-topography: control of fibroblast spreading and proliferation, Tissue Engineering, 2002, Vol. 8, p. 10991108.

29. Davies S., Tighe В., Cell attachment to gel-spun polyhydroxybutyrate fibers, Polym. Prepr. (Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem.), 1995, Vol. 36, p. 103-104.

30. Dekker A., Reitsma K., Beugeling Т., Bantjes A., Feijen J., van Aken W.G. Adhesion of endothelial cells and adsorption of serum proteins on gas plasma-treated polytetrafluoroethylene. Biomaterials, 1991, Vol. 12(2), p.130-138.

31. Di Silvio L, Dalby MJ, Bonfield W Osteoblast behaviour on HA/PE composite surfaces with different HA volumes. Biomaterials, 2002, Vol. 23, p. 101-107.

32. Dion I., Roques X., Baquey C.H., Baudet E., Basse Cathalinat B. and More N. Hemoeompatibility of Diamond-like Carbon Coating, Bio-Medical Materials and Engineering, 1993, Vol. 3, p. 51-55.

33. Duvernoy 0., Malm Т., Ramstrom J., Bowald S. A biodegradable patch used as pericardial substitute after cardiac surgery: 6- and 24- month evaluation with CT, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1995, Vol. 43(5), p. 271-274.

34. Goodman S.L. Sheep, pig, and human platelet-material interactions with model cardiovascular biomaterials. J. Biomed. Mater. Res., 1999, Vol. 45(3), p. 240-250.

35. Grande D.A., Halberstadt C., Naughton G., Schwart R., Manji R. Evaluation of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts, J. Biomed. Mater. Res., 1997, Vol. 34 (2), p. 211-220.

36. Griffith L.G., Mclntire L.V., Greisler H., Johnson P.C., Mooney D.J., Mrksich M., Parenteau N.L., Smith D. Biomaterials, Chapter 2, WTEC Panel on Tissue engineering research, Final report, January, 2002, p. 7-11.

37. Grunkemeier J.M., Tsai W.B., Horbett T.A. Hemoeompatibility of treated polystyrene substrates: Contact activation, platelet adhesion, and procoagulant activity of adherent platelets, J. Biomed. Mater. Res., 1998, Vol. 41, p. 657-671.

38. Jain R. et al. Fibroblast attachment to smooth and microtextured PET and thin cp-Ti films, J. Biomed. Mater. Res., 2004, Vol. 68A, № 2, p. 296-304.

39. Heitz J., Niino H., Yabe A. Chemical surface modification on polytetrafluoroethylene films by vacuum ultraviolet Excimer lamp irradiation in ammonia gas atmosphere. Appl. Phys Lett., 1996, Vol. 68(19), p. 2648-2650.

40. Horbet T.A., Brash J.L., Proteins at Interface II. Fundamentals and Applications. ASC Symposium Ser. 602, ASC, Washington, 1995.

41. Hubbell J.A., Heuberger M., Voros J., Textor M. Course: Biomaterial Surfaces: Properties and Characterization, ETH Zurich Department of Materials, 2002/2003.

42. Jones J.I., McColl I.R., Grant D.M., Parker T.L. Protein Adsorption and Platelet Attachment and Activation, on TiN, TiC, and DLC Coatings on Titanium for Cardiovascular Applications, J. Biomed. Mater. Res., 2000, p. 413-421.

43. Joseph G., Sharma C.P. Platelet adhesion to surface treated with glow discharge and albumin, J. Biomed. Mater. Res., 1986, Vol. 20(5), p. 677-682.

44. Karp J.M., Shoichet M.S., Davies J.E. Bone formation on two-dimentional poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) films and three-dimentional PLGA tissue engineering scaffolds in vitro, J Biomed Mater Res, 2003, Vol. 64(2), p. 388-396.

45. Kato K., Vasilets V.N., Fursa M.N., Meguro M., Ikada Y., Nakamae K. Surface Oxidation of Cellulose Fibers by Vacuum Ultraviolet Radiation, Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 1999, Vol. 37, p. 357.

46. Kiaei D., Hoffmann A.S., Horbett T.A. Tight binding of albumin to glow discharge treated polymers, J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 1992 Vol. 4(1), p. 35-44.

47. Kostopoulos I., Karring T. Guide bone regeneration in mandibular defects in rats using bioresorbable polymer, Clin. Oral. Impl. Res., 1994, Vol. 5, p. 66-74.

48. Lerouge S., Fozza A.C., Werteimer M.R., Marchand R., Yahia L.H. Sterilization by low-pressure plasma: the role of vacuum-ultraviolet radiation. Plasmas and polymers, 2000, Vol. 5(1), p. 31-46.

49. Liliensiek S.J., Campbell S., Nealey P.F., Murphy C.J. The scale of substratum topographic features modulates proliferation of corneal epithelial cells and corneal fibroblasts, J. Biomed. Mater. Res., 2006, Vol. 79(1), p. 185-192.

50. Lindner S., Pinkowski W., Aepfelbacher M. Adhesion, Cytoskeletal Architecture and Activation Status of Primary Human Macrophages on a Diamond-like Carbon Coated Surface, Biomaterials, 2002, Vol. 23, p. 767-773.

51. Loty C., Sautier J.M., Boulekbache H., Kokubo Т., Kim H.M., Forest N. In vitro bone formation on a bonelike apatite layer prepared by a biomimetic process on a bioactive glass-ceramic, J. Biomed. Mater. Res., Vol 15, p. 423-434.

52. Lukinska Z.B., Bonfield W. Morphology and ultrastructure of the interface between hydroxyapatite polyhydroxybutyrate composite implant and bone, J. of Mater. Sci.: Materials and Medicine, 1997, Vol. 8, p. 379-383.

53. Malm Т., Bowald S., Bylock A., Buch C. Prevention of postoperative pericardial by closure of the pericardium with absorbable polymer parches. An experimental study, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1992, Vol. 104(3), p. 600-607.

54. Mills C.A., Navarro M., Engel E., Martinez E., Ginebra M.P., Planell J., Errachid A., Samitier J. Transparent micro- and nanopatterned poly(lactic acid) for biomedical applications, J. Biomed. Mater. Res., 2006, Vol. 76(4), p. 781-787.

55. Meyerl U., Buchter A., Wiesmann H.P., Joos U., Jones D.B. Basic reactions of osteoblasts on structured material surfaces, European Cells and Materials, 2005, Vol. 9, p. 39-49.

56. M6ller K., Meyer U., Szulczewski D.H., Heide H., Priessnitz В., Jones D.B. The influence of zeta potential and and interfacial tension on os-teoblast-like cells, Cells and Materials, 1994, Vol. 4, p. 263-268.

57. Monties J.R., Dion I., Havlik P., Rouais F., Trinkl J., Baquey C. Cora Rotary Pump for Implantable Left Ventricular Assist Device, Biomate-rial Aspects, Artificial Organs, 1997, Vol. 21(7), p. 730-734.

58. Niino H., Yabe A. Excimer laser ablation of polyethersulfone derivatives: periodic morphological micro-modification on ablated surface, J. Photobiol. Chem., 1992, Vol. 65, p. 303-312.

59. Pierres A., Benoliel A.M., Bongrand P. Interactions between biological surfaces. Curr. Opin. Colloid Interface, 1998, Vol. 3, p. 525-533.

60. Pokidysheva E.N., Maklakova I.A., Belomestnaya Z.M., Perova N.V, Bagrov S.N., Sevastianov V.I. Comparative analysis of human serum albumin adsorption and complement activation for intraocular lenses, Artificial Organs, 2001, Vol. 25, p. 453-458.

61. Price R.L., Gutwein L.G., Kaledin L., Tepper F., Webster T.J. Osteoblast function on nanophase alumina materials: Influence of chemistry, phase, and topography, J. Biomed. Mater. Res., 2003, Vol. 15(4), p. 1284-1293.

62. Ratner B.D., Hoffman A.S., Schoen F.J., Lemons J.E. Eds., Biomate-rials science: an introduction to materials in medicine, Academic Press, San Diego, 1996.

63. Ruoslanti E., Obrink B. Common Principles in cell adhesion. Review, Exp. Cell Res. J., 1996, Vol. 227, p. 1-11.

64. Satriano C., Marietta G., Carnazza S., Guglielmino S. Protein adsorption and fibroblast adhesion on irradiated polysiloxane surfaces, J. Mater. Sci. Mater. Med., 2003, Vol. 14(8), p. 663-670.

65. Satriano C., Manso M., Gambino G.L., Rossi F., Marietta G. Adsorption of a cell-adhesive oligopeptide on polymer surfaces irradiated by ion beams, Biomed. Mater. Eng., 2005, Vol. 15(1-2), p. 87-99.

66. Schneider G.B., Perinpanayagam H., Clegg M., Zaharias R., Seabold D., Keller J., Stanford C. Implant surface roughness affects osteoblast gene expression, J. Dental Res., 2003, Vol. 82, p. 372-376.

67. Schwartz Z., Boyan D.B. Underlying mechanisms at the bone-biomaterial interface, J. Cell Biochem., 1994, Vol. 56, p. 340-347.

68. Sheppard J.I., McClung W.G., Feurstein I.A. Adherent platelet morphology on adsorbed fibrinogen: effects of protein incubation time and albumin addition, J. Biomed. Mater. Res., 1994, Vol. 28, p. 1175-1186.

69. Shih H.-N., Fang J.-F., Chen J.-H., Yang Ch.-L., Chen Y.-H., Sung T.-H., Shih L.-Y. Reduction in experimental peridural adhesion with the use of crosslinked hyaluronate/collagen membrane, J Biomed Mater Res, 2004, Vol. 71B(2), p. 421-428.

70. Singhvi R., Stephanopoulos G., Wang Daniel I.C. Effects of substratum morphology on cell physiology, Biotechnol. and Bioeng., 1994, Vol. 43(8), p. 764-771.

71. Steinbuchel A., Valentin H.E. Diversity of bacterial polyhydroxyalka-noic acids, FEMS Microbiol. Lett., 1995, Vol. 128, p. 219-228.

72. Szycher M., Westport C.T. (eds.). Biocompatible polymers, metals and composites, Technom. Publ. Co., Inc., New York, 1983.

73. Sweitzer R., Scholz C. Evaluation of Subretinal Implants Coated with Amorphous Aluminum Oxide and Diamondlike Carbon, J. of Bioact. and Compat. Polym., 2006, Vol. 21, p. 5-22.

74. Thomson L.A., Law F.C., Rushton N., Franks J. Biocompatibility of Diamond-like Carbon Coating, Biomaterials, 1991, Vol. 12, p. 37-40.

75. Titushkin I.A., Vasin S.L., Rosanova I.B., Pokidysheva E.N., Alekhin A.P., Sevastianov V.I. Carbon-coated polyethylene: effect of surface energetic and topography on human platelet adhesion, ASAIO Journal, 2001, Vol. 47, p. 11-17.

76. Tran H.S, Рис M.M., Hewitt C.W., Soli D.B., Marra S.W., Cilley J.H., Del Rossi A.J. Diamond-like Carbon Coating and Plasma or Glow Discharge Treatment of Mechanical Heart Valves, J. Investigat. Surg., 1999, Vol. 12, p. 133-140.

77. Vasilets V.N., Hirata I., Iwata H., Ikada Y. Photolysis of a Fluorinated Polymer Film by Vacuum Ultraviolet Radiation, Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 1998, Vol. 36, p. 2217-2223.

78. Vasilets V.N., Kuznetsov A.V., Sevastianov V.I. Vacuum ultraviolet treatment of polyethylene to change surface properties and characteristics of protein adsorption, J. Biomed. Mater. Research, Part A, 2004, Vol. 69A, p. 428-435.

79. Vitte J., Benoliel A.M., Pierres A., Bongrand P. Is there a predictable relationship between surface physical-chemical properties and cell behaviour at the interface?, European Cells and Materials, 2004, Vol. 7, p. 52-63.

80. Wagner C.D., Naumkin A.V., Kraut-Vass A. NIST X-ray Photoelec-tron Spectroscopy Database. NIST Standard Reference Database 20, Version 3.4 (Web Version), 2004.

81. Wang H.B., Dembo M., Hanks S.K., Wang Y.L. Focal adhesion kinase is involved in mechanosensing during fibroblast migration, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, Vol. 98, p. 11295-11300.

82. Waples L.M., Olorundare O.E., Goodman S.L., Lai Q.J., Albrecht R.M. Platelet-polymer interactions: morphologic and intracellular free calcium studies of individual human platelets, J. Biomed. Mater. Res., 1996, Vol. 32, p. 65-76

83. Wertheimer M.R., Fozza A.C., Hollander A. Industrial Processing of Polymers by Low-pressure Plasmas: the Role of VUV radiation, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, 1999, Vol. 151, p. 72

84. Wojciak-Stothard В., Curtis A., Monaghan W., Macdonald K., Wilkinson C., Guidance and activation of murine macrophages by nanometric scale topography, Cell Res., 1996, Vol. 223, p. 426-435.