Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика биологического действия полимерных и гетероциклических соединений, углеродных нанотрубок на микроорганизмы и разработка технологии создания на их основе инновационных препаратов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Характеристика биологического действия полимерных и гетероциклических соединений, углеродных нанотрубок на микроорганизмы и разработка технологии создания на их основе инновационных препаратов"
005538949
На правах рукописи
НЕЧАЕВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА
ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИМЕРНЫХ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК НА МИКРООРГАНИЗМЫ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ СОЗДАНИЯ НА ИХ ОСНОВЕ ИННОВАЦИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ
03.02.03 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
г і ноя 2013
Саратов 2013
005538949
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.»
Научный консультант: Тихомирова Елена Ивановна,
доктор биологических наук, профессор
Официальные Щербаков Анатолий Анисимович,
оппоненты: доктор биологических наук, профессор,
ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова», профессор кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии
Кравцов Александр Леонидович,
доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник лаборатории вакцинологии и профилактики отдела иммунологии
Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна,
доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», заведующая курсом микробиологии кафедры общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микробиологии Российской академии наук
Защита диссертации состоится «19» декабря 2013 года в 13°° часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» (410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова».
Автореферат диссертации разослан « ноября 2013 года.
Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Актуальными задачами современной прикладной микробиологии являются поиск, разработка и внедрение новых препаратов как антимикробного действия, так и способствующих сохранению и восстановлению жизнеспособности коллекционных штаммов микроорганизмов, в том числе и штаммов - продуцентов.
Важнейшим достижением медицины второй половины XX в. стало открытие антибиотиков, без которых в настоящее время невозможно лечение инфекционных заболеваний (Сазыкин, 1999; Тец, 2006). За последние десятилетия создано большое количество высокоэффективных антибиотиков и химиотерапевтических препаратов (Егоров, 1999; Страчунский и др., 2001; Яковлев и др., 2003). Развитию химиотерапии способствовали достижения в области биотехнологии, общей и клинической микробиологии, выявление механизмов действия антимикробных препаратов и резистентности микроорганизмов.
Важной проблемой, возникающей при химиотерапии, является формирование устойчивости микроорганизмов к лекарственным препаратам. Различают природную и приобретенную лекарственную устойчивость. Актуальной проблемой является именно приобретенная устойчивость, которая возникает у микроорганизмов в процессе этиотропной терапии (Сидоренко, 2002).
В последние годы повышение эффективности применения антимикробных препаратов связывают с преодолением лекарственной устойчивости микроорганизмов. Согласно «Декларации по борьбе с антимикробной резистентностью» (Торонто, 2000) и разработанной ВОЗ «Глобальной стратегии по сдерживанию роста устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам» (Женева, 2001), преодоление лекарственной устойчивости может быть достигнуто благодаря следующим мероприятиям: рациональной химиотерапии и контролю назначения химиотерапевтических препаратов, мониторингу антибиотикорезистентных микроорганизмов в лечебно-профилактических учреждениях, разработке и внедрению в лечебную практику новых антимикробных препаратов. В этой связи поиск новых химических соединений, обладающих выраженной антимикробной активностью, является актуальным. Необходимость новых препаратов связана также с расширением их антимикробного спектра, повышением активности в отношении полирезистентных возбудителей, снижением токсических свойств.
Одним из перспективных направлений отбора новых препаратов, обладающих антимикробной активностью, является направленный синтез химических соединений с заданными биологическими свойствами (Дубровина, 2009). Это связано с выявлением зависимости химической структуры синтетических соединений с их противо-микробной активностью (Ботаева и др., 2008; Чернов и др., 2008).
Многие гетероциклические соединения помимо антимикробной активности характеризуются выраженными антиоксидантными свойствами. Поэтому еще одним перспективным направлением использования гетероциклических соединений в медико-биологической практике является их включение в состав сред для повышения жизнеспособности коллекционных штаммов микроорганизмов, находящихся в условиях окислительного стресса в процессе хранения (Плотников и др., 1993; Липатова и др., 1995; Новикова и др., 2001).
На современном этапе развития науки особую значимость приобретают нано-технологии, которые внедряются практически во все сферы деятельности человека, в том числе в медицинскую и биологическую практику. Развитию нанотехнологии
способствовали открытие и исследование областей применения углеродных наноструктур: фуллеренов, углеродных нанотрубок и графена. Имеется большое количество разработок использования наноструктур в медицине, ветеринарии и биологии в качестве диагностических и лекарственных средств. На основе углеродных нанотрубок создаются биосенсоры, позволяющие определять специфические вещества внутри клеток или видоизмененные клетки, что играет важную роль в диагностике онкологических заболеваний. Создаются наноконтейнеры на основе углеродных нанотрубок для адресной доставки терапевтических генов и лекарственных препаратов, что способствует повышению их биодоступности и эффективности лечения. Нанотехнологические препараты находят свое применение в диагностике и лечении инфекционных заболеваний. Ведутся разработки в области создания наноносителей антигенных компонентов для формирования длительного иммунного ответа против респираторных вирусов. Однако в литературе практически отсутствуют сведения о применении наноструктур в микробиологической практике и их влиянии на функциональную активность представителей микробоценозов организма человека и животных.
Большой научный интерес представляют в настоящий момент исследования антимикробных свойств биосовместимых полимеров и их наноструктурированных форм (Заярский и др., 2012). Это связано с возможностью создания инновационных препаратов с заданной структурой по типу «ядро-оболочка», позволяющих избежать патологической реакции макроорганизма и обеспечить адресное специфическое действие.
Степень разработанности проблемы.
Исследованиями ряда авторов показана перспективность использования в качестве антимикробных средств различных гетероциклических соединений (Мельников, 1994; Маркова, 1996; Вишняков, 2001; Селезнева, 2001; Кравченко, 2003; Шуб и др., 2003; Корженевич и др., 2004; Райкова и др., 2004; Жандарев и др., 2006; Пименова и др., 2006; Пермякова и др., 2009; Зинина и др., 2012).
Вопросы использования гетероциклических соединений в качестве антиокси-дантов, входящих в состав стабилизационных сред защиты в процессе консервации микроорганизмов и изменяющих уровень собственных антиокислительных систем бактериальной клетки, рассмотрены в работах О.П. Плотникова и др. (1993, 1999), Е.В. Липатовой и др. (1995), Н.С. Смирновой и др. (1995), А.И. Осадчей и др. (2002), О.В. Нечаевой (2004, 2010), Н.Ф. Пермяковой и др. (2010).
Результаты исследований по использованию углеродных наноструктур в медико-биологической практике представлены в работах следующих авторов: М. Марк-ман, Дж.Л. Уалкер (2006), В.П. Терещенко и др. (2010), М. Kumar et al. (2003), W. Wu et al. (2005), J.S. Kim et al. (2007), D. Perr et al. (2007), S.C. McMain et al. (2008), K. Welsher et al. (2008), G.A. Zelada-Guillen et al. (2009), B. Kang et al. (2010).
В связи с актуальностью и востребованностью решения указанных выше вопросов целью работы явилось исследование действия наноструктур на основе биосовместимых полимеров, углеродных нанотрубок и вновь синтезированных гетероциклических соединений на референс-штаммы и клинические изоляты микроорганизмов, отбор веществ с выраженными антимикробными и антиоксидантными свойствами и обоснование технологии создания на их основе инновационных препаратов.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Изучить действие многостенных углеродных нанотрубок на биологические свойства референс-штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий;
определить способность бактерий использовать многостенные углеродные нано-трубки в качестве единственного источника углерода.
2. Установить влияние многостенных углеродных нанотрубок на выживаемость микроорганизмов при воздействии синего светодиодного излучения (405 нм).
3. Изучить антимикробную активность и токсичность полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов, и его наноструктурированных вариантов.
4. Изучить биологическую активность гетероциклических соединений нового ряда и отобрать соединения с выраженными антибактериальными, фунгицидными, противовирусными и антиоксидантными свойствами.
5. Исследовать зависимость проявления антимикробных и антиоксидантных свойств от особенностей химической структуры гетероциклических соединений.
6. Определить токсичность перспективных гетероциклических соединений с антимикробными и антиоксидантными свойствами методами биотестирования с использованием комплекса тест-объектов (дафний и хлореллы) и лабораторных животных.
7. Обосновать использование гетероциклических соединений с антиоксидантными свойствами в составе сред стабилизации для повышения жизнеспособности лиофилизированных референс-штаммов бактерий.
8. Разработать технологию создания структур «ядро-оболочка» на основе нано-агрегатов флавоноидов, гетероциклических соединений и наноструктурированного органобентонита с биосовместимым полимером.
9. Обосновать перспективность использования в медико-биологической и ветеринарной практике разработанных инновационных препаратов.
Научная новизна. Впервые изучено влияние многостенных углеродных нанотрубок на морфологические, культуральные, биохимические и адгезивные свойства референс-штаммов бактерий. Показано их стимулирующее действие на рост и размножение грамотрицательных бактерий; повышение адгезивной активности грампо-ложительных и грамотрицательных бактерий.
Впервые установлено, что сочетанное воздействие синего светодиодного излучения (405 нм) и многостенных углеродных нанотрубок приводит к выраженному ингибированию роста клинических изолятов Staphylococcus aureus № 92 и Staphylococcus epidermidis 11 и Staphylococcus epidermidis 19e, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных фотосенсибилизаторов для усиления эффекта действия синего излучения на возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний.
Впервые дана характеристика антимикробной активности гетероциклических соединений разных классов: фенилпентендионов, халконов, полифункционально-замещенных эфиров, енаминов, семикарбазонов в отношении референс-штаммов микроорганизмов Escherichia coli 113-13, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus 209 P и Candida albicans 18. Отобраны перспективные соединения с антистафилококковым действием из ряда халкона, полифункционально замещенных эфиров, енаминов и семикарбазонов; с фунгицидной активностью - из ряда енаминов. Установлено, что соединение 2,4-дихлор-1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион ряда фенил-пентендион обладает широким спектром антимикробного действия по отношению к клиническим изолятам грамположительных и грамотрицательных бактерий и подавляет репродукцию штамма «ВН-96» вируса ТГЭС.
Отобраны соединения ряда кумаринов, енаминов, кетонов, циклических конденсированных тиопиранов, конденсированных дигидропиридинов и пиридинов, обладающие низкой антифаговой и высокой антиоксидантной активностью, которые способны локализоваться на поверхности бактериальных клеток, повышать целостность мембранных и внутриклеточных структур, снижать уровень собственных антиокислительных ферментов. Эти соединения могут быть успешно использованы для повышения жизнеспособности и стабилизации свойств популяций коллекционных культур микроорганизмов как компоненты защитных сред.
Установлена зависимость антимикробной и антиоксидантной активности гетероциклических соединений нового ряда от значений их молекулярной массы, пространственных характеристик молекул, распределения электронных зарядов и наличия определенных химических функциональных групп для комплексного взаимодействия с мембраной бактериальной клетки.
Показана высокая антимикробная активность полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов, в отношении референс-штаммов и клинических изолятов грамотрицательных и грамположительных бактерий, микроскопических грибов и вируса ТГЭС.
Получены новые экспериментальные данные о зависимости биологической активности гетероциклических соединений от их химической структуры, представленные в монографии «Перспективы использования гетероциклических соединений в медико-биологической практике» (Нечаева и др., 2013).
Впервые разработана технология создания структур «ядро-оболочка» на основе биосовместимого полимера - полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов, и наноагрегатов флавоноидов, гетероциклического соединения адамантилметилен-циклогексен-дикарбоксилата и наноструктурированного орга-нобентонита.
Теоретическая и практическая значимость работы. Обобщены и систематизированы данные о зависимости антимикробных и антиоксидантных свойств гетероциклических соединений от их химической структуры. Результаты проведенных исследований являются основанием для проведения направленного синтеза новых гетероциклических соединений с антимикробной активностью в ряду фенилпентенди-она, халкона, полифункционально замещенных эфиров, семикарбазонов и енамина. Разработаны биотехнологические аспекты конструирования структур «ядро-оболочка» и получены экспериментальные образцы препаратов на основе исследуемых соединений.
Результаты проведенных исследований позволили отобрать перспективные соединения с антимикробной активностью в отношении референс-штаммов Е coli 113-13, В. cereus 8035, S. aureus 209 Р и С. albicans 18 и клинических изолятов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, не обладающие токсичностью по отношению к биотест-объектам. Полученные результаты открывают перспективы создания новых химиотерапевтических средств для этиотропной терапии инфекционных заболеваний. Соединения с лабораторным шифром ПНВ-1, ХА-44, ХА-46 и Е-4 являются перспективными антистафилококковыми препаратами.
Получен в соавторстве с Н.П. Коновым, Ю.П. Волковым и О.С. Кузнецовым патент РФ на полезную модель (№ 40318, 2004 г.).
Полученные данные используются при чтении лекций по дисциплинаи «Общая микробиология», «Санитарная микробиология», «Экология микроорганизмов» в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет имени Гага-
рина Ю.А.», в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» и в ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского».
Результаты исследований были использованы при подготовке курсовых и дипломных работ и проектов на кафедре микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, кафедре экологии Саратовского государственного технического университета имени Гагарина Ю.А.
Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных ученых по вопросам поиска и отбора перспективных гетероциклических соединений с антимикробной и антиоксидантной активностью, применения наноструктур в медико-биологической практике, способам повышения эффективности и биодоступности биологически активных веществ. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы.
При проведении исследования и изложении материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа. Применение указанных методов, а также детальный статистический анализ фактического материала позволили обеспечить объективность и достоверность полученных результатов и выводов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Многостенные углеродные нанотрубки оказывают стимулирующее действие на рост и размножение грамотрицательных бактерий Е. coli 113-13, менее значительное - на грамположительные В. cereus 8035 и S. aureus 209 Р; вызывают изменение биологических свойств всех изученных бактерий. В. cereus 8035 может использовать многостенные углеродные нанотрубки в качестве единственного источника углерода, способствуя их утилизации.
2. Многостенные углеродные нанотрубки являются перспективными фотосенсибилизаторами для усиления эффекта действия на возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний синего светодиодного излучения (405 нм), используемого для фотодинамической терапии.
3. Из 120 изученных гетероциклических соединений антимикробной активностью по отношению к референс-штаммам и клиническим изолятам грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий, к низшим грибам обладали 11 представителей классов фенилпентендиона, халкона, полифункционально замещенных эфиров, семи-карбазонов, енаминов; антиоксидантной активностью характеризовались представители ряда кумаринов, циклических конденсированных тиопиранов, конденсированных дигидропиридинов и пиридинов, конденсированных диазобициклонондиенов, енаминов и кетонов.
4. Проявление антимикробной и антиоксидантной активности гетероциклических соединений нового ряда зависит от пространственных характеристик молекул, значений их молекулярной массы, распределения электронных зарядов и наличия определенных химических функциональных групп для комплексного взаимодействия с мембраной бактериальной клетки.
5. Полиазолидинаммоний, модифицированный гидрат-ионами галогенов, обладает выраженной антибактериальной активностью в отношении референс- штаммов и клинических изолятов грамположительных и грамотрицательных бактерий, которая зависит преимущественно от концентрации гидрат-ионов йода.
s
6. Структуры «ядро-оболочка» на основе полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов, с наноагрегатами флавоноидов, гетероциклическими соединениями и органобентонитом характеризуются антимикробными и ранозаживляющими свойствами и являются инновационными препаратами, перспективными для использования в медико-биологической и ветеринарной практике.
Апробация результатов исследования. Основные результаты исследования были доложены на: Международном симпозиуме восточно-азиатских стран по полимерным композиционным материалам и передовым технологиям «Композиты XXI века» (Саратов, 2005); межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2008); XI Международном конгрессе по антимикробной терапии (Москва, 2009); Общероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные медицинские технологии» (Москва, 2009); Всероссийской молодежной выставке-конкурсе прикладных исследований, изобретений и инноваций (Саратов, 2009); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2010); 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование 2010» (Воронеж, 2010); Первых Международных Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010); VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010); Международном форуме по нано-технологиям «Rusnanotech 2010» (Москва, 2010); Научно-практическом семинаре с международным участием «Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности» (Ульяновск, 2011); Всероссийской молодежной конференции «Наукоемкие технологии и интеллектуальные системы в наноинженерии» (Саратов, 2012); Всероссийской молодежной конференции «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине - 2012» (Саратов, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 2013); 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2013).
Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведены анализ литературных источников по теме диссертации, планирование экспериментальных исследований и подбор методов для достижения поставленной цели. Экспериментальные исследования выполнялись автором лично или при непосредственном участии в составе научной группы при выполнении НИР. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. Основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость, сформулированы совместно с научным консультантом.
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.» на кафедре «Экология».
Публикации. По теме диссертации опубликованы 36 работ, из них 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, имеется 1 монография и 1 патент РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов исследования, 6 глав с изложением результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 257 страницах машинописного текста, включает 16 рисунков и 24 таблицы. Список литературы включает в себя 367 источников.
Собственные исследования
Объект, материалы и методы
Объектом исследования явились референс-штаммы и клинические изоляты микроорганизмов, перечень которых представлен в таблице 1.
Таблица 1 - Микроорганизмы, используемые в работе
Штамм Характеристика Источник получения
Yersinia pestis EV НИИЭГ вакцинный штамм Государственная коллекция патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб»
Escherichia coli В референс-штамм -II-
Бактериофаг Т4 дикий тип -II-
Escherichia coli 113-13 референс-штамм ГИСК им. Л.А. Тарасевича, г. Москва
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 референс-штамм -II-
Bacillus cereus 8035 референс-штамм -II-
Staphylococcus aureus 209 P референс-штамм -II-
Staphylococcus aureus № 2 клинический изолят МЭБА Музей культур кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии СГМУ им. В.И. Разумовского
Staphylococcus aureus № 6 клинический изолят М88Д -II -
Staphylococcus aureus № 21 клинический изолят МББА -II -
Staphylococcus aureus №23 клинический изолят МЗБА -II -
Staphylococcus aureus № 92 клинический изолят МЯЭА -II-
Staphylococcus aureus № 430 клинический изолят МЯБЛ -II-
Staphylococcus epidermidis № 11 клинический изолят MR.SE
Staphylococcus epidermidis № 19e клинический изолят МЗЭЕ -II-
Candida albicans 18 референс-штамм -II-
Aspergillus fumigatus референс-штамм -II-
Mucor raceniosus референс-штамм -II -
Экспериментальные животные: 350 белых беспородных мышей (самцов), массой 18-20 г. Животные содержались на стандартном рационе вивария. Все эксперименты выполнялись в соответствии с требованиями Федерального закона от 01.01.1997 г. «О защите животных от жестокого обращения» и предписаниями Женевской конвенции «International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals» (Geneva, 1990).
Изучение культурально-морфологических и тинкториальных свойств исследуемых микроорганизмов на фоне действия препаратов проводили по общепринятым методикам (Лабинская, 2008). Бактерии культивировали на мясопептонном бульоне (МПБ) и мясопептонном агаре (МПА); при работе с микроскопическими грибами использовали жидкую и плотную среды Сабуро. Из суточных культур микроорганизмов готовили взвеси в физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности 10 или 5 Ед (ГИСК им. Тарасевича) и титровали до необходимых концентраций м.к./мл.
Морфологию бактериальных клеток изучали путем световой микроскопии под масляной иммерсией при помощи цифровой камеры-окуляра для микроскопа 8СОРЕТЕК БСМ 35 с выведением изображения на экран компьютера (увеличение х900).
Для изучения влияния наноструктур на биологические свойства микроорганизмов были использованы многостенные углеродные нанотрубки диаметром 10-20 нм и длиной 0,5-1 мкм, полученные СУБ-методом, предоставленные Саратовским филиалом Института радиоэлектроники им. В.А. Котельникова РАН.
Способность бактерий использовать многостенные углеродные нанотрубки в качестве единственного источника углерода оценивалась по способности роста бактерий на минимальной синтетической среде М-9 (Маниатис и др., 1984).
Адгезивную способность бактерий определяли при помощи методов Брилис с соавторами (Брилис и др., 1986) и Гизатулиной с соавторами (Гизатулина и др., 1991).
В экспериментах по облучению микробных клеток в качестве источников синего излучения использовали светодиод с максимумом спектра испускания >„=405±20 нм, плотность мощности излучения - 23 мВт/см2, а также экспериментальный прибор «СЬагиЬ» с максимумом спектра испускания Х=405, плотность мощности излучения - 5-80 мВт/ см2 (ТисЫпа Й а1., 2006). Из суточных культур исследуемых микроорганизмов готовили взвесь в физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности 5 Ед (ГИСК им. Тарасевича). Взвесь титровали до конечной концентрации 100 м.к./мл и вносили по 0,1 мл в пробирки с 0,9 мл физиологического раствора. В опытные пробирки были добавлены нанотрубки. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 часов. Из каждой контрольной и опытной пробирки забирали по 0,1 мл взвеси и вносили в ячейки планшета, которые подвергали воздействию синего излучения в течение 30 мин. Затем из каждой ячейки делали высев по 0,1 мл взвеси на чашки Петри с МПА. Параллельно на чашки высевали по 0,1 мл взвеси исследуемых микроорганизмов, не подвергавшихся облучению, из контрольных и опытных пробирок. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 часов. Оценку влияния излучения на микроорганизмы проводили путем подсчета КОЕ.
В работе по исследованию влияния на микроорганизмы были исследованы гетероциклические соединения, представленные кумаринами, конденсированными пи-ридинами и дигидропиридинами, циклическими конденсированными пиранами и тиопиранами, кетонами, селенорганическими и таллийорганическими соединениями, замещенными конденсированными диазобицикло-нондиенами, комплексом меди с органическими лигандами, а также соединениями ряда фенилпентендиона, гидро-индазола, оксимов, халконов и полифункционально замещенных эфиров, гидрокси-циклогексанонов, енаминов, циклогексенонов, тетрагидротриазолохиназолинов, се-микарбазонов, которые были синтезированы на кафедре органической и биоорганической химии Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, а также в Энгельсском технологическом институте СГТУ. Перечень соединений представлен в таблице 2.
Антимикробную активность исследуемых соединений изучали с использованием метода серийных разведений (МУК 4.2.1890-04), с помощью которого определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) каждого препарата. Образцы исследуемых соединений титровали в стерильной дистиллированной воде до получения рабочей концентрации 1000 мкг/мл. Затем получали ряд двойных разведений препаратов в МПБ, в которые вносили взвеси микроорганизмов.
Таблица 2 - Перечень исследованных соединений
N Лабораторный шифр Полное название соединения
1 2 3
Гидроиндазолы
1. ГИД-5 3,6-дигидрокси-6-метш1-5-ацетил-4-(3-нитрофенил)-2-фенил-4,5,6,7-тетрагидро-2Н-индазол
2. ГИД-6 3,6-дигидрокси-4-(4-метоксифенил)-5-ацетил-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-2Н-индазол
3. ГИД-7 3,6-дигидрокси-4-(4-метоксифенил)-5-ацетил-6-метил-2-фенил-4,5,6,7-тетрагидро-2Н-индазол
4. ГИД-10 3,6-дигидрокси-6-метил-5-ацетш-2,4-дифенил-4,5,6,7-тетрагидро-2Н-индазол
5. ГИД-13 Этил 4,5-дигидро-3-гидрокси-6-метил-4-фенил-2Н-индазол-5-карбоксилат
6. ГИД-14 Этил 4,5-дигидро-3-гидрокси-6-метил-4-(3-нитрофенил)-2Н-индазол-5-карбоксилат
7. ГИД-25 3,6-дигидрокси-4-(3-нитрофенил)-5-ацетил-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-2Н-индазол
8. ГИД-27 3,6-дигидрокси-4-фенил-5-ацетил-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-2Н-индазол
9. ГИД-57 3,6-дигидрокси-6-метил-5-ацетил-4-фенил-4,5,6,7-тетрагидро-2Н-индазол
10. ГИД-5 8 3,6-дигидрокси-6-метил-5-ацетил-4-(4-метоксифенил)-4,5,6,7-тетрагидро-2Н-индазол
Гидроксициклогексаноны
11. ГЦГ-1 Этил 3-ацетил-4-гидрокси-2-(4-метоксифенил)-4-метил-6-оксоциклогексанкарбоксилат
12. ГЦГ-2 Этил 3-ацетил-4-гидрокси-4-метил-6-оксо-2-фенилциклогексанкарбоксилат
13. ГЦГ-3 Этил 3-ацетил-4-гидрокси-4-метил-2-(3-нитрофенил)-6-оксоциклогексанкарбоксилат
14. ГЦГ-4 4,6-диацетил-5-(4-метоксифенил)-3-метилциклогекс-2-енон
15. ГЦГ-3 8 Диэтил 2-(3,4-диметоксифенил)-4-гидрокси-4-метил-6-оксоциклогексан-1,3-дикарбоксилат
16. ГЦГ-39 Диэтил 2-(3-метокси-4-гидроксифенил)-4-гидрокси-4-метил-6-оксоциклогексан-1,3-дикарбоксилат
17. ГЦГ-40 2,4-диацетил-3-(3-этокси-4-гидроксифенил)-5-гидрокси-5-метилциклогексанон
18. ГЦГ-41 Диэтил 2-(3-этокси-4-гидроксифенил)-4-гидрокси-4-метил-6-оксоциклогексан-1,3-дикарбоксилат
19. ГЦГ-42 Диэтил 4-гидрокси-4-метил-5-метилен-6-оксо-2-фенилциклогексан-1,3-карбоксилат
Конденсированные замещенные диазобицикло-нондиены
20. НД-1 5,9-диметил-7-фурил-6-ацетил-5-гидрокси-1-окса-2-азабицикло(4,3,0) нон-диен 2,8
21. НД-2 5,9-диметил-7-(3-нитрофенил)-6-ацетил-5-гидрокси-1,2-диазабицикло(4,3,0) нондиен 2,8
22. нд-з 7-(3-нитрофенил)-5-гидрокси-1,2-диазабицикло(4,3,0) нондиен 2,8
Азотсодержащие гетероциклические соединения -конденсированные дигидропиридины
23. ГГХ-1 2,4-ди(4-метоксифенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин
24. ГГХ-2 2-фенил-4(4-нитрофенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин
25. ГГХ-3 2-(Ьенил-4(,4-метоксифенил1-5-оксо-1.4.5.6.7.8-гексагидрохинолин
Продолжение таблицы 2
1 2 3
26. ГГХ-4 7,7-диметил-2-фенил-4(4-метоксифенил)- 5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин
27. ГГХ-5 7,7-диметил-2,4-дифенил-4(4-метоксифенил)- 5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин
28. ГГХ-6 5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин
29. ГГХ-7 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин
Енамины
30. Е-4 Этил 2-метил-4-( 1 -пиперидил)-6-(3-нитрофенил)циклогекса-1,3-диенкарбоксилат
31. Е-5 Диэтил 4-аллиламино-6-гидрокси-6-метил-2-фенилциклогекс-3-ен-1,3-дикарбоксилат
32. Е-6 Диэтил 4-аллиламино-6-гидрокси-6-метил-2-(4-метоксифенил)-циклогекс-3-ен-дикарбоксилат
33. Е-13 Диэтил 4-(адамантилметиленамино)-6-гидрокси-6-метил-2-фенилциклогекс-3-ен-1,3-дикарбоксилат
34. Е-14 Диэтил 4-(адамантилметиленамино)-6-гидрокси-6-метил-2-(4-метоксифенил)-циклогекс-3-ен-1,3-дикарбоксилат
35. Е-15 Диэтил 4-(адамантшшетиленамино)-6-гидрокси-6-метил-2-(3-нитрофенил)-циклогекс-3-ен-1,3-дикарбоксилат
36. ФДЕ Фенил-диэтоксикарбонил-ениламин
37. А-1 Адамантилметилен-аминоциклогексен-дикарбоксилат
38. А-2 Адамат-илметилен-циклогексен-дикарбоксилат
39. А-3 Адамантилметилен-енамин
40. Т-1 Тетрагидро[ 1,2,41-триазолоГЗ ,4-Ь1хиназолин
41. Т-2 Триазолохиназолин
42. ДФЦ Диэтоксикарбонил-(фенил)-циклогексадиениламин
43. ФДТ Фурил-диэтоксикарбонил-(толил)-циклогекса-1,5-диениламин
Кетоны
44. ЦГД-1 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександион-1,3
45. ЦГД-2 2-(1 -метил-3-фенил-3чжсопропил)-циклогексацдион-1,3
46. ЦГД-3 2- циклогексил-циклогександион-1,3
47. ЦГД-4 1 -оксопропилциклогександион
Кислородсодержащие гетероциклы - Кумарины
48. КМ-1 7-амино-4-метилкумарин
49. КМ-2 6,7-диоксикумарин
50. КМ-3 3-карбоксикумарин
51. КМ-4 3-ацетамидокумарин
52. КМ-5 4-метил-7-оксикумарин
53. КМ-6 4-метил-7,8-диоксикумарин
54. КМ-7 4-метил-6,7-диоксикумарин
55. КМ-8 4-метил-6-оксикумарин
Комплекс меди с органическими лигандами
56. Комплекс меди (II) Комплекс меди (II) с 5,7-диокси Си(6,7-ДК) кумарином
Оксимы
57. 0-8 Этил 5-ацетил-4-гидрокси-4-метил-6-фенил-2-(фениламино)циклогекс-1-ен-карбоксилат
58. 0-20 Этил 3-ацетил-4-гидрокси-6-(гидроксиимино)-2-(4-метоксифенил)-4-метилциклогексанкарбоксилат
59. 0-21 Этил 3-ацетил-4-гидрокси-6-(гидроксиимино)-2-фенил-4-метилциклогексанкарбоксилат
Продолжение таблицы 2
1 2 3
60. 0-24 Диэтил 6-(гидроксиимино)-2-(4-метоксифенил)-4-метилциклогекс-4-ен-1,3-карбоксилат
61. 0-28 Этил 3-ацетил-4-гидрокси-6-(гидроксиимино)-2-(3-нитрофенил)-4-метилциклогексанкарбоксилат
62. 0-52 3-(4-метоксифенил)-2,4-ацетил-1-(гидроксиимино)-5-метилциклогекс-5-ен
63. 0-56 9-(4-метоксифенил)-4,8-диметилбицикло[3.3.11нон-3,7-диен-2,6-дион диоксим
Конденсированные пираны
64. ТГХ-1 7,7-диметил-2,4-дифенил-5-окси-5,6,7,8-тетрагидро-4Н-хромен
65. ТГХ-2 77-диметил-2-феши^-(4-метоксифешт)-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидро^Н-хромен
66. ОХ 5-оксо-4Н-хромен
Конденсированные пиридины
67. гх 7,7-диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолин
Селенорганические соединения
68. хцс Хлорцинкат2-фенил-5,6-тетраметиленселенопириллия
Семикарбазоны
69. С-7 Диэтил 4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-фенилциклогексан-1,3-дикарбоксилат
70. С-8 Диэтил 4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-(3,4-диметоксифенил)-циклогексан-1,3-дикарбоксилат
71. С-9 Диэтил 4-гидрокси-4-метил-2-(4-метоксифенил)-6-семикарбазоноциклогексан-1,3-Дикарбоксилат
72. С-10 Диэтил 4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-(2-тиенил)-циклогексан-1,3 -дикарбоксилат
73. С-11 Диэтил 4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-(3-нитрофенил)-циклогексан-1,3-дикарбоксилат
74. С-12 Диэтил 6-метил-4-тиосемикарбазидо-2-фенилциклогекс-3,6-дигн-1,3- ' дикарбоксилат
Тетрагидротриазолохиназолины
75. ТГТ-1 7-ацетил-8-гидрокси-5,8-диметил-6-фенил-6,7,8,9-тетрагидро-[1.2.4]тризоло[3,4-61хиназолин
76. ТГТ-2 Этил 5,8-дигидрокси-6-(3-нитрофенил)-6,7,8,9-тетрагидро-[1,2,4]-триазоло[3,4-в1хиназолин-7-карбоксилат
77. ТГТ-3 Этил 5,8-дигидрокси-8-метил-6-фенил-6,7,8,9-тетра- гидро-[1,2,4]-триазолоГЗ,4-в1хиназолин-7-карбоксилат
Серусодержащие гетероциклические соединения -циклические конденсированные тиопираны
78. ГТХ-1 7,7-диметил-2,4-дифенил-5-окси-5,6,7,8-тетрагидро-4Н-тиохромен
79. ГТХ-2 5,7,7-триметил-2,4-дифенил-5-окси-5,6,7,8-тетрагидро-4Н-тиохромен
80. ГТХ-3 7,7-диметил-2.4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидротиохромен
81. ГТХ-4 7,7-диметил-2-фенил-4-(4-метоксифенил)- 5-оксо-5,6,7,8-тетрагидротиохромен
Таллийорганические соединения
82. 1Г Дифенилталлийбромид
83. 2Г Пивалат дифенил таллия
84. ЗГ Бис-(трифторацетат) фенил таллия
85. 4Г п- Толилталлий бис-(трифторацетат)
86. 5Г Ди-(4-третбутилфенил) таллий трифторацетат
87. 6Г Ди-(п-толил) таллий трифторацетат
88. 7Г Ди-(4-карбометоксифенил)-таллий хлорид
89. 8Г 4-бромфенилталлий-бис-(трифторацетат)
Окончание таблицы 2
1 2 3
90. 9Г Фенилталлий бис-(пивалат)
91. ЮГ Фенилталлий бис-(ацетат)
92. 11Г Дихлорид фенилталлия
93. 12Г Бис-(пентабромбензоат)-фенил таллия
94. 13Г Ди-(ацетил)-таллий трифторацетат
95. 14Г Ди-(пентафторфенолят) фенил таллия
Соединения ряда фенилпентендиона
96. ПНВ-1 2,4-дихлор-1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион
97. ПНВ-Б 1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион
98. ПНВ-1 А 2,4-дифенилбицикло[3.3.11нон-2-ен-9-он
99. ПНВ-1 Б 2-(4'-метоксифенил)-4-фенилбициклоГ3.3.1]нон-2-ен-9-он
100. ПНВ-1 В 2-фенил4-(4'-метоксифенил)бициклоГ3.3.11нон-2-ен-9-он
Соединения ряда халкона
101. ХА-35 Этил-3-бензилиден-2,4-диоксопентанон
102. ХА-36 3-(4-метоксибензилиден)-пентан-2,4-дион
103. ХА-37 3-(3-нитробензилиден)-пентан-2,4-дион
104. ХА-44 3(4-(диметиламино)бензилиден)пенган-2,4-дион
105. ХА-47 Этил 2-<4-гидроксибешилвден)-Зоксобутанкарбоксилат
Циклогексеноны
106. ЦГ-11 Диэтил 4-метип-6-оксо-2-фенилциклогекс-4-ен-1,3-карбоксилат
107. ЦГ-15 Диэтш12-(4-метоксифенш1)-4-метал-6-оксоциклогекс-4-ене-1,3-карбоксилат
108. ЦГ-16 Диэтил 2-(3-ншрофенилМ-мешл-6-оксоциклогекс-4-ене-1,3-карбоксилат
109. ЦГ-17 Диэтил 2-метил-4-метил-6-оксоциклогекс-4-ене-1,3-карбоксилат
110. ЦГ-18 Этил 5-ацетил-6-(4-метоксифенил)-4-метшт-2-оксоциклогекс-3-енкарбоксилат
111. ЦГ-22 4,6-диацетил-3-метил-5ЧЗ-ни1рофенил)циклогекс-2-енон
112. ЦГ-23 5-(2,6-бис(этоксикарбон1п)-3-мет1гт-5ч)ксоциклогекс-3-енил)-2-метоксибензенсульфо кислота
ИЗ. ЦГ-30 Этил 5-ацетил-6-фенил-4-метил-2-оксоциклогекс-3-енкарбоксилат
114. ЦГ-48 Диэтил 2-(3,4-диметоксифенил)-4-метил-6-оксоциклогекс-4-ене-1,3-карбоксилат
115. ЦГ-53 Диэтил 2-(3-гидрокси-4-метоксифенил)-4-метил-6-оксоциклогекс-4-ен-1,3-карбоксилат
Полифункционально замещенные эфиры
116. ПЭ-43 2,2'-ди-(3-(3-метоксифенил)-2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-диэтиловый эфир
117. ПЭ-45 2,2'-ди-(3-фенил-2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-диэтиловый эфир
118. ПЭ-46 2,2'-ди-(3-(3-метокси-4-гидроксифенил)-2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-диэтиловый эфир
119. ПЭ-49 2,2'-ди-(3-(3-нитрофенил)-2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-диэтиловый эфир
120. ПЭ-50 Тетраэтил-4,4'-(2,2'-оксибис(этан-2,1-диилбис(окси))бис(6-гидрокси-2-(4-метоксифенил))-6-метициклогекс-3-ен-1,3-карбоксилат)
Посевы бактерий инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 часов, а затем высевали по 0,1 мл бульонной культуры на поверхность МПА в чашки Петри для определения характера действия препарата путем подсчета количества выросших колоний (КОЕ).
Определение антиокеидантной активности исследуемых соединений проводили на хемилюминометре в системе свободнорадикального окисления, инициированного перекисью водорода в растворе нормальной лошадиной сыворотки (Архипова, 1988), предварительно отобрав препараты с низкой биологической агрессией в системе бактериофага Т4 - штамм Escherichia coli В (Фонштейн, Сурайкина, Таль, 1975).
Лиофильное высушивание Y. pestis EV НИИЭГ осуществляли на коллекторном аппарате системы К.Е. Долинова на базе Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» (Инструкция по лиофильному высушиванию..., 1979).
Для изучения влияния полимерного соединения на биологические свойства микроорганизмов использовали полиазолидинаммоний, модифицированный гидрат-ионами галогенов (ПААГ), а также его комплексы с растительными биофлавоноида-ми (пр-во ООО НПО «Альтернатива», г. Саратов).
Исследование токсичности гетероциклических соединений с антимикробной активностью и полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов, проводили в два этапа по общепринятым методикам: биотестирование на тест-объектах Daphnia magna и определение острой токсичности на лабораторных животных (Гуськова, 1990; Лойт, 1992; Методическое руководство по биотестированию воды, 2002; Гуськова, 2003; Хабриев, 2005).
Формирование субмикронных агрегатов флавоноидов велось из пчелиного прополиса (Заярский и др. Патент РФ № 2446852). Распределение по размерам субмикронных агрегатов флавоноидов было определено Д.А. Заярским (2012) методами динамического рассеянья света. Измерения проведены с помощью установки для ха-рактеризации наночастиц Marven Zetasizer Nano ZS.
Оценку ранозаживляющего действия структур «ядро-оболочка», содержащих наноагрегаты флавоноидов, покрытые ПААГ, проводили на модели экспериментальных полнослойных ран. Для оценки эффективности лечения ран рассчитывали ежесуточное уменьшение площади ран в % по общепринятой методике (Кузин, Костю-ченок, 1990; Gui et al., 2008).
Статистическая обработка всех полученных данных проводилась по общепринятым методикам (Ашмарин, Воробьев, 1986). Расчёт результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (for Windows; «Stat Soft Inc.», США), Statgraph (Version 2.6; Coulter), Microsoft Excel 2003 (for Windows XP). Статистические результаты считались достоверными при р<0,05.
Влияние многостенных углеродных нанотрубок на биологические свойства
бактерий
Для изучения влияния многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) на биологические свойства бактерий использовали референс-штаммы Е. coli 113-13, S. aureus 209 Р, В. cereus 8035, которые отличались морфологическими свойствами и особенностью строения клеточной стенки. Взвесь суточной культуры исследуемых микроорганизмов вносили в пробирки с МПБ; в опытные образцы были добавлены нанотрубки, в качестве первого контроля использовали культивирование бактерий в МПБ. Поскольку МУНТ представляют собой одну из форм углерода, то в качестве второго контроля проводили культивирование бактерий в МПБ с добавлением графита. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 часов, а затем высевали на МПА. После инкубации в течение 24 часов подсчитывали число КОЕ, оце-
нивали морфологию колоний и рассчитывали жизнеспособность бактерий. Получен ные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Влияние многостенных углеродных нанотрубок на жизнеспособность __исследуемых микроорганизмов_
Исследуемые микро- Число КОЕ (М ± т)
организмы Контроль 1 -МПБ Контроль 2 - Опыт —
МПБ+графит МПБ+УНТ
Е. coli 113-13 1072±23 1120±19* 1568±29*
В. cereus 8035 716±25 860±21* Агрегация
S. aureus 209 Р 1136±15 1018±31* 1264±22*
Примечание - * наличие достоверности при уровне значимости р < 0,05 по отношению к контролю.
Анализ полученных результатов показал, что внесение графита (контроль 2) в МПБ с тестовыми бактериями достоверно не влияло на их рост и размножение. Добавление нанотрубок в МПБ с Е coli 113-13 приводило к стимуляции роста культуры, т.к. число КОЕ при последующем высеве на МПА было достоверно больше по сравнению с обоими контролями. При оценке влияния нанотрубок на морфологию колоний кишечной палочки была отмечена их агрегация в опытных образцах; изолированные колонии были непрозрачными и имели беловатый оттенок, их размеры были более крупные (5-6 мм) по сравнению с контрольными полупрозрачными и бесцветными колониями диаметром 2-3 мм (рисунок 1).
При культивировании S. aureus 209 Р в МПБ с МУНТ количество колоний увеличивалось незначительно. Однако внесение нанотрубок в МПБ приводило к диссоциации колоний S. aureus 209 Р с преобладанием пигментированных желтых, в отличие от контрольных образцов, в которых все колонии были белого цвета (рисунок 2).
Влияние нанотрубок на рост бацилл оценить было сложно, поскольку в чашках на поверхности МПА с посевами наблюдалась агрегация колоний. Изучение культу-ральных свойств В. cereus 8035 показало изменение морфологии колоний в опытных образцах: усиление складчатости поверхности колоний, диаметр которых достигал 8 мм. В посевах из контрольных образцов наблюдались однотипные округлые колонии с бугристой поверхностью диаметром 3-4 мм. Кроме того, колонии бацилл из опытных образцов образовывали большое количество корневидных отростков, что способствовало агрегации колоний (рисунок 3).
При изучении мазков, приготовленных из опытных и контрольных образцов Е coli 113-13 и 5. aureus 209 Р, не было выявлено каких-либо отличий: клетки бактерий имели сходные размеры и характерное взаимное расположение. В мазках, приготовленных из опытных образцов В. cereus 8035, наблюдались цепочки бацилл, которые в 3-4 раза превышали длину цепочек в контрольных образцах, что, вероятно, и способствовало возникновению агрегированных колоний.
а) б)
Рисунок 1 - Колонии Е. coli 113-13, выросшие на МПА а) контроль 1 - пересев с МПБ; б) опыт - пересев с МПБ+МУНТ
а) б)
Рисунок 2 - Колонии 51. aureus 209 Р, выросшие на МПА а) контроль 1 - пересев с МПБ; б) опыт - пересев с МПБ+МУНТ
а) б)
Рисунок 3 - Колонии В. сегеия, выросшие на МПА а) контроль 1 - пересев с МПБ; б) опыт - пересев с МПБ+МУНТ
На следующем этапе работы была изучена способность исследуемых микроорганизмов утилизировать МУНТ и использовать их в качестве единственного источника углерода. Для этого взвесь суточной культуры бактерий инкубировали в пробирках с МПБ в течение 24 часов, после чего добавляли по 0,1 мл в пробирки с безуглеродной средой М-9: в опытные образцы добавляли МУНТ в концентрации
1 мкг/мл. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 часов и высевали на поверхность МПА в чашки Петри; через сутки подсчитывали количество выросших КОЕ.
Было выявлено, что нанотрубки не оказывают влияния на рост Е. coli 113-13 и S. aureus 209 Р (таблица 4), так как и в контрольных, и в опытных образцах наблюдались колонии с характерными для данных бактерий культуральными свойствами, а количество колоний в опытных образцах достоверно не отличалось от контрольных значений. Установлено, что внесение в среду М-9 МУНТ приводило к увеличению количества колоний В. cereus 8035 по сравнению с контролем приблизительно на 62 %, что позволило считать возможным использование бациллами МУНТ в качестве единственного источника углерода.
Таблица 4 — Оценка способности исследуемых бактерий использовать многостенные
углеродные нанотрубки в качестве единственного источника углерода
Исследуемые микроорганизмы Число КОЕ (М ± т) на МПА
После культивирования на среде М-9 После культивирования на среде М-9+МУНТ
Е. coli 113-13 1218±21 1227±19
S. aureus 209 Р 1122±17 1128±24
В. cereus 8035 623±14 1020±18*
Примечание - * наличие достоверности при уровне значимости р < 0,05 по отношению к контролю.
На следующем этапе исследования были изучены адгезивные свойства рефе-ренс-штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий В. cereus 8035, S. aureus 209 Р, Е. coli 113-13 после инкубации с МУНТ в течение 1 и 7 суток в МПБ. В качестве контроля использовали бульонную культуру микроорганизмов. Адгезивные свойства бактерий оценивали по трем показателям: среднему показателю адгезии (СПА), коэффициенту адгезии (КА) и индексу адгезии микроорганизма (ИАМ). Полученные результаты представлены в таблице 5.
Было установлено, что внесение в МПБ МУНТ не влияет на адгезивные свойства В. cereus 8035, поскольку как в опытных, так и в контрольных мазках отсутствовали эритроциты, имеющие на своей поверхности бактериальные клетки.
Таблица 5 — Влияние многостенных углеродных нанотрубок на адгезивные свойства референс-штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов
СПА КА, % ИАМ
1 сут. 7 сут. 1 сут. 7 сут. 1 сут. 7 сут.
В. cereus 8035
МПБ 0 0 0 0 - -
МПБ+МУНТ 0 0 0 0 - -
S. aureus 209Р
МПБ 1,44±0,57 0 64,70±11,4 0 2,2±0,26 -
МПБ+МУНТ 2,65±0,86* 3,21±0,64 72,46±10,8 76,24±8,62 3,6±0,72 4,2±0,62
Е. coli 113-13
МПБ 0 1,24±0,16 0 58,26±6,82 - 2,1±0,34
МПБ+МУНТ 1,57±0,65 1,82±0,42 65,23±9,8 69,18±8,4 2,4±0,56 2,8±0,38
Примечание — * наличие достоверности при уровне значимости р < 0,05 по отношению к контролю.
Культивирование S. aureus 209P и E. coli 113-13 с добавлением МУНТ приводило к увеличению значений основных показателей, что свидетельствовало об увеличении адгезивных свойств исследованных микроорганизмов. На повышение адгезивной активности бактерий влияла также длительность совместного культивирования микроорганизмов и МУНТ. Так, по показателям ИАМ клетки золотистого стафилококка через сутки культивирования с добавлением МУНТ характеризовались среднеадгезивным уровнем, а через 7 дней - высокоадгезивным.
Внесение МУНТ в питательную среду с Е. coli 113-13 оказывало меньшее влияние на адгезивные свойства клеток: по показателю ИАМ они характеризовались как низкоадгезивные. При совместном культивировании бактерий кишечной палочки в течение недели с МУНТ показатель ИАМ повышался до среднеадгезивного."
Далее было исследовано влияние МУНТ на клинические изоляты стафилококков в процессе воздействия некогерентного светодиодного излучения (405 нм; 23,5 -80 мВт/см2). По данным литературы именно такой диапазон излучения обладает анальгетическим, противовоспалительным, а также бактериостатическим действием и используется в медицинской практике для фотодинамической терапии (Корсунская и др., 2010; Мумладзе и др., 2011). Также эти параметры излучения составляют максимальный спектр поглощения для МУНТ. Для воздействия были выбраны клинические изоляты золотистого и эпидермального стафилококков, которые играют важную роль в этиологии кожных форм стафилококковой инфекции: S. aureus № 92 (MRSA), S. epidermidis 19е (MSSE), S. epidermidis 1 l(MRSE).
В ходе проведенных исследований было выявлено стимулирующее действие МУНТ, т.к. происходило достоверное увеличение численности и жизнеспособности всех исследуемых микроорганизмов (таблица 6).
Наибольший стимулирующий эффект МУНТ наблюдался в отношении клеток S. aureus № 92 - увеличение количества КОЕ было в 2 раза по сравнению с контролем. В отношении S. epidermidis стимулирующее действие МУНТ было выражено слабее и составило 24 % для S. epidermidis № 19е и 11 % для S. epidermidis №11.
Воздействие синего светодиодного излучения (405 нм) приводило к незначительному подавлению роста исследуемых микроорганизмов.
Таблица б — Влияние светодиодного излучения на выживаемость стафилококков
Исследуемые микроорганизмы Число КОЕ (M ± m)
Контроль (высев с МПБ) МПБ+МУНТ Излучение МУНТ+излучение
S. aureus № 92 515±23 1098±16* 413±9* 215±12*
S. epidermidis № 19е MSSE 621±18 815±21* 517±23* 12±3*
S. epidermidis № 11 MRSE 823±11 925±14* 627±21* 52±8*
Примечание - * наличие достоверности при уровне значимости р < 0,05 по отношению к контролю.
Сочетанное воздействие синего светодиодного излучения (405 нм) и МУНТ сопровождалось более выраженным ингибированием роста исследуемых микроорганизмов: количество КОЕ снизилось в 2,5 раза и в 16 раз для S. aureus № 92 и S. epidermidis № 11 соответственно. Наиболее чувствительными оказались клетки S. epidermidis № 19е, т.к. число КОЕ снизилось в 52 раза по сравнению с контролем.
Таким образом, проведенные исследования по оценке влияния МУНТ на биологические свойства микроорганизмов позволили установить их достоверное стимулирующее действие на рост и размножение преимущественно грамотрицательных бактерий (на примере Е. coli 113-13) и способность вызывать изменения культуральных свойств всех исследованных микроорганизмов. Полученные результаты по сочетан-ному воздействию некогерентного светодиодного излучения и МУНТ позволяют рассматривать их в качестве перспективных фотосенсибилизаторов для усиления эффекта действия синего излучения на возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний. Установлена способность клеток B.cereus 8035 использовать МУНТ в качестве единственного источника углерода, что позволяет рассматривать его в качестве перспективного микроорганизма, использующего МУНТ в метаболических реакциях, способствуя их утилизации.
Выявлено, что МУНТ повышают адгезивную способность референс-штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий, что позволяет рекомендовать их для предварительного совместного культивирования с бактериями, входящими в состав пробиотиков. Это позволит повысить эффективность и биодоступность препаратов.
Изучение биологической активности полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов, и его аналогов в отношении
микроорганизмов
Биологическую активность ПААГ в отношении референс-штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов S. aureus 209 Р, В. cereus 8035, Е. coli 113-13 и Р. aeruginosa АТСС 27853 определяли методом серийных разведений для установления МПК препарата. Была определена минимальная бактерицидная концентрация (МБК) ПААГ путем мерного высева на МПА материала из тех пробирок, в которых отсутствовал видимый рост бактерий. Посевы инкубировали в термостате при 37 °С в течение 24 часов, после чего подсчитывали КОЕ в контрольных и опытных образцах. Полученные результаты представлены в таблице 7.
Таблица 7 — Биологическая активность полиазолидинаммония, модифицированного
гидрат-ионами галогенов, в отношении стандартных штаммов микроорганизмов
ПААГ Концентрация, мкг/мл
S. aureus 209 Р В. cereus 8035 Е. colil 13-13 P.aeruginosa АТСС 27853
МПК МБК МПК МБК МПК МБК МПК МБК
- 16 - 32 - 32 64 -
При культивировании S. aureus 209 Р, В. cereus 8035 и Е. coli 113-13 во всех пробирках видимый рост микроорганизмов отсутствовал, что не позволило нам установить МПК препарата. В контрольных пробирках наблюдался рост бактерий в виде равномерного помутнения. МПК ПААГ для Р. aeruginosa АТСС 27853 составила 64 мкг/мл, однако при воздействии соединения в концентрации 32 мкг/мл сине-гнойная палочка утрачивала способность к пигментообразованию.
МБК ПААГ для S. aureus 209 Р составила 16 мкг/мл, а для В. cereus 8035 и Е. coli 113-13 - 32 мкг/мл. Более низкие концентрации препарата оказывали частичное бактерицидное действие, так как в опытных образцах на МПА наблюдался рост
культуры в виде единичных колоний (в отличие от контрольных образцов с равномерным ростом по всей поверхности питательной среды).
Концентрации ПААГ от 250 до 64 мкг/мл оказывали бактериостатическое действие на P. aeruginosa АТСС 27853, т.к. отмечен рост на МПА, как в контрольных образцах. Рост в виде единичных колоний наблюдался при концентрации ПААГ 1000 и 500 мкг/мл, что свидетельствовало о частичном бактерицидном действии препарата на P. aeruginosa.
Поскольку ПААГ проявил выраженную антимикробную активность в отношении референс-штамма S. aureus 209 Р, представляло интерес изучить антимикробную активность соединения в отношении клинических изолятов S. aureus. Полученные результаты представлены в таблице 8.
Таблица 8 — Биологическая активность полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов, в отношении референс-штамма и клинических изолятов S. aureus
Концентрация, мкг/мл
S. aureus S. aureus S. aureus ■ S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus
209 Р № 2 №6 №21 №23 № 92 №430
МПК МБК МПК МБК МПК МБК МПК МБК МПК МБК МПК МБК МПК МБК
ПААГ - 16 - 32 - 16 8 32 16 64 32 64 - 16
При культивировании референс-штамма S. aureus 209 Р, а также клинических изолятов S. aureus № 2, S. aureus № 6 и S. aureus № 430 с ПААГ во всех пробирках видимый рост микроорганизмов отсутствовал. Поэтому для этих бактерий не удалось установить МПК. В контрольных пробирках наблюдался рост бактерий в виде равномерного помутнения.
МБК ПААГ в отношении клинических изолятов золотистого стафилококка оценивали по росту бактерий на поверхности МПА. Установлены значения МБК ПААГ для референс-штамма S. aureus 209 Р и клинических изолятов S. aureus № 6 и № 430 -16 мкг/мл; для S. aureus № 2 и № 21 - 32 мкг/ мл, а для S. aureus № 23 и № 92 - 64 мкг/мл. Более низкие концентрации препарата характеризовались частично бактерицидным действием на исследованные микроорганизмы (рост бактерий в виде единичных изолированных колоний).
Была изучена также биологическая активность ПААГ в отношении референс-штаммов микроскопических грибов Candida albicans 18, Aspergillus fumigatus и Mucor raceniosus, оценку которой проводили методом серийных разведений на жидкой среде Сабуро с последующим посевом на среду Сабуро для определения минимальной фун-гицидной концентрации. Полученные результаты представлены в таблице 9.
Таблица 9 — Биологическая активность полиазолидинаммония, модифицированного
гидрат-ионами галогенов, в отношении стандартных штаммов микроскопических грибов
ПААГ МПК, мкг/мл
С. albicans 18 A. fumigatus М. raceniosus
125 250 250
В ходе проведенных исследований было установлено, что МПК ПААГ для С. albicans 18 составляет 125 мкг/мл, адля A. fumigatus и М. raceniosus -250 мкг/мл.
Концентрации ПААГ от 1000 до 250 мкг/мл оказывали частично фунгицидное действие на С. albicans 18, так как на среде Сабуро наблюдался рост в виде единичных изолированных колоний в отличие от контрольных высевов, где исследуемый микроорганизм давал сплошной рост.
Для A. fumigatus и М. raceniosus не удалось определить минимальную фунги-цидную концентрацию, так как концентрации ПААГ 1000 и 500 мкг/мл оказывали частично фунгицидное действие.
На следующем этапе исследования была изучена биологическая активность ПААГ в зависимости от концентрации гидрат-ионов йода, входящих в его состав, которые являются основным активным компонентом исследуемого полимерного соединения. В качестве экспериментальной модели использовали референс-штаммы S. aureus 209 Р и P. aeruginosa АТСС 27853, поскольку в последние годы в клинической практике эти микроорганизмы приобретают все большую значимость как возбудители внебольничных и нозокомиальных гнойно-воспалительных заболеваний.
В работе использовали четыре варианта полимера: в ПААГ-2 концентрация гидрат-ионов йода составляла 100 мкг/мл, в ПААГ-4 - 200 мкг/мл, в ПААГ-10 -500 мкг/мл и в ПААГ-15 - 750 мкг/мл. Предварительное исследование острой токсичности всех вариантов полимера позволило отнести его к IV классу токсичности. Полученные результаты представлены в таблице 10.
Было установлено, что грамположительные бактерии оказались более чувствительными к ПААГ. В ходе исследований не удалось определить МПК соединения для стандартного штамма S. aureus 209 Р, поскольку во всех пробирках видимый рост бактерий отсутствовал (в контрольных образцах наблюдался рост в виде равномерного помутнения).
Таблица 10 —Биологическая активность полиазолидинаммония, модифицированного
Концентрация мкг/мл ПААГ-2 ПААГ-4 ПААГ-10 ПААГ-15
S. aureus P. aeruginosa S. aureus P. aeruginosa S. aureus P. aeruginosa о S. aureus P. aeruginosa
1000 - - - - - - - -
500 - - - - - - - -
250 - - - - - - - -
125 - - - - - - - -
64 - - - - - - - -
32 - + - - - - - -
16 - + - + - - - -
8 - + - + - - - -
4 - + - + - + - -
2 - + - + - + - -
К + + + + + + + +
Примечание - «+» - наличие роста, «-» - отсутствие роста.
Чувствительность референс-штамма P. aeruginosa АТСС 27853 к йодсодержа-щему полимеру была ниже и зависела от содержания гидрат-ионов йода. Так, МПК ПААГ-2 в отношении стандартного штамма синегнойной палочки составила 64 мкг/мл, ПААГ-4 - 32 мкг/мл, ПААГ-10 - 8 мкг/мл. Для ПААГ-15 не удалось определить МПК, так как во всех опытных пробирках видимый рост отсутствовал; в контрольных пробирках наблюдался рост в виде равномерного помутнения с пленкой на поверхности и интенсивным пигментообразованием.
Далее была проведена сравнительная оценка влияния различных концентраций раствора диоксида хлора и ПААГ, а также их комплекса на выживаемость санитар-но-показательных микроорганизмов воды. Это связано с необходимостью поиска безопасных химических соединений с антимикробными свойствами в качестве альтернативы раствора диоксида хлора, который в настоящее время чаще всего применяют для обеспечения биологической безопасности водных ресурсов.
В качестве экспериментальной модели использовали стандартный штамм гра-мотрицательных бактерий E.coli 113-13. Антимикробные свойства препаратов исследовали с помощью метода серийных разведений. Через 24 часа инкубации бактерий и исследуемых соединений во всех пробирках видимый рост микроорганизмов отсутствовал. Далее проводили мерные высевы на чашки Петри с МПА и после инкубации при температуре 37 °С в течение 24 часов подсчитывали КОЕ. Полученные результаты представлены в таблице 11.
Таблица 11 — Влияние исследуемых веществ на выживаемость E.coli 113-13
Количество КОЕ
Концентрация веществ, мкг/мл 1000 500 250 120 60 30 15 К
Диоксид хлора - - - - CP CP CP CP
ПААГ - - - - - - 15±4 CP
Диоксид хлора+ПААГ — — — — - — CP CP
Примечание - СР - сплошной рост.
Было выявлено, что МБК раствора диоксида хлора составила 120 мкг/мл. Концентрации 60, 30 и 15 мкг/мл этого препарата оказывали на клетки кишечной палочки бактериостатическое действие, так как на МПА наблюдался равномерный рост по всей поверхности питательной среды. МБК ПААГ составила 30 мкг/мл, а его более низкие концентрации оказывали частично бактерицидное действие. При воздействии комплекса диоксида хлора и ПААГ на E.coli 113-13 МБК составила 30 мкг/мл; а концентрация комплекса 15 мкг/мл характеризовалась бактериостатическим действием.
Проведенные исследования позволили установить, что раствор диоксида хлора, ПААГ и комплекс этих препаратов являются эффективными бактерицидными препаратами в отношении кишечной палочки, как санитарно-показательного микроорганизма воды. Более эффективным в использовании оказался ПААГ, поскольку его МПК была в 4 раза ниже, чем у раствора диоксида хлора. Еще одним неоспоримым преимуществом этого препарата является его безопасность: ПААГ относится к IV классу токсичности и является малоопасным соединением, в отличие от раствора диоксида хлора, который относится к III классу токсичности и считается умеренно-опасным. Следовательно, ПААГ может быть рекомендован в качестве перспективно-
го соединения для обеззараживания воды от микроорганизмов на различных этапах водоподготовки.
Таким образом, изучение биологической активности ПААГ и его модификаций в отношении микроорганизмов позволило установить выраженное антимикробное действие в отношении референс-штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также клинических изолятов коагулазопозитивных стафилококков, которое зависит от концентрации гидрат-ионов йода. Более чувствительными к действию ПААГ оказались грамположительные бактерии. Бактерицидное действие на грамот-рицательные бактерии проявлялось в более высоких концентрациях, что, вероятно, связано с особенностью строения их клеточной стенки. Исследуемые препараты обладали фунгиостатическим и частично фунгицидным действием в отношении стандартных штаммов С. albicans 18, A. fumigatus и М. raceniosus в более высоких концентрациях по сравнению с их бактерицидным действием. ПААГ может быть использован как дезинфектант для профилактической и текущей дезинфекции.
Изучение биологической активности гетероциклических соединений
На первом этапе работы по изучению биологической активности гетероциклических соединений были изучены их антимикробные свойства. Среди 120 новых гетероциклических соединений различных классов был проведен отбор перспективных химических соединений, обладающих антимикробной активностью, на модели референс-штаммов микроорганизмов. Полученные результаты представлены в таблице 12.
Таблица 12 — Антимикробная активность исследуемых гетероциклических соединений
№ Лабораторный шифр вещества МПК, мкг/мл
E.coli 113-13 S. aureus 209 Р В. cereus 8035 С. albicans 18
Енамины
1. А-2 100 25 50 —
2. Е-4 - 1,60 — 6,75
Полифункционально замещенные эфиры
3. ПЭ-45 — 0,80 — —
4. ПЭг46 - 0,80 — —
5. ПЭ-49 - 0,80 — —
Семикарбазоны
6. С-9 - 1,60 — —
7. С-10 — 1,60 — —
Соединения ряда фенилпентендиона
8. ПНВ-1 1,00 6,75 6,75 —
9. ПНВ-Б - 100 — —
Халконы
10. ХА-44 — 1,60 — —
11. ХА-47 - 1,60 - -
Примечание — «-» - отсутствие активности
В ходе проведенных исследований было установлено, что выраженной антимикробной активностью характеризовались гетероциклические соединения ряда енамина, полифункционально замещенных эфиров, фенилпентендиона, халкона и
семикарбазона. Среди четырнадцати исследованных представителей ряда енамина антимикробной активностью обладали два препарата с лабораторным шифром Е-4 - этил-2-метил-4-(1-пиперидил)-6-(3-нитрофенил)-циклогекса-1,3-диен-карбо-ксилат и А-2 - адамантилметилен-циклогексен-дикарбоксилат. Соединение Е-2 характеризовалось выраженной антистафилококковой активностью и его МПК для S. aureus 209 Р составила 1,6 мкг/мл. Соединение А-2 проявляло антимикробную активность в отношении референс-штаммов исследуемых бактерий, однако, значения МПК были высокими и составили для E.coli 113-13, В. cereus 8035 и S. aureus 209 Р 100, 50 и 25 мкг/мл соответственно.
Из пяти представителей ряда полифункционально замещенных эфиров установлены бактерицидные концентрации в отношении S. aureus 209 Р трех соединений: 2,2'-ди-(3-(3-метокси-4-гидроксифенил)-2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-диэтиловый (ПЭ-46), 2,2'-ди-(3-фенил-2,4-ди-ацетил-5-гидрокси-5-метил-циклоген-1-ил)-диэтиловый (ПЭ-45) и 2,2'-ди-(3-(3-нитрофенил)-2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-этиловый (ПЭ-49), МПК которых составила 0,8 мкг/мл. В отношении Е. coli 113-13 и В. cereus 8035 исследованные препараты антимикробной активностью не обладали.
Среди шести соединений ряда семикарбазона была выявлена высокая антистафилококковая активность двух представителей: С-9 - диэтил-4-гидрокси-4-метил-6-семи-карбазоно-2-(4-метоксифенил)-циклогексан-1,3-дикарбоксилат и С-10 - ди-этил-4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-тиенилциклогексан-1,3-ди-карбоксилат. Эти соединения обладали бактерицидным характером действия на клетки S. aureus 209 Р в концентрации 1,60 мкг/мл.
Из пяти соединений ряда фенилпентендиона только два препарата обладали антимикробной активностью по отношению к референс-штаммам микроорганизмов. Препарат ПНВ-1 (2,4-дихлор-1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион) характеризовался бактерицидным характером действия в отношении грамположительных бактерий — S. aureus 209 Р и В. cereus 8035, МПК для которых составила 6,75 мкг/мл. Наибольшую антимикробную активность ПНВ-1 проявлял в отношении референс-штамма Е. coli 113-13 и его бактерицидная концентрация составила 1 мкг/мл. Препарат ПНВ-Б (1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион) проявил низкую антимикробную активность в отношении референс-штаммов бактерий по сравнению с ПНВ-1: установлено бактерицидное действие только в отношении S. aureus 209 Р, для которого МПК составила 100 мкг/мл.
Среди пяти исследованных соединений ряда халкона были отобраны два представителя: 3(4-(диметил-амино)бензилиден)пентан-2,4-дион (ХА-44) и этил-2-(4-гидроксибензилиден)-3-оксобутаноат (ХА-47), которые проявляли антистафилококковую активность в отношении S. aureus 209 Р, а МПК этих препаратов составила 1,6 мкг/мл. Однако эти вещества не проявили антимикробной активности в отношении Е. coli 113-13 и В. cereus 8035.
Из всех протестированных соединений только один представитель ряда енами-нов Е-4 проявил выраженную активность в отношении референс-штамма С. albicans 18, при этом значение его МПК составило 6,75 мкг/мл.
Таким образом, скрининг гетероциклических соединений позволил отобрать 11 представителей различных классов, которые обладали антимикробной активностью по отношению к референс-штаммам грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также к низшим грибам. Для дальнейших исследований были выбраны препараты, для которых значения МПК составляли не более 10 мкг/мл.
На следующем этапе работы была проведена оценка представителей различных классов по показателям биологической агрессии и антиоксидантной активности. Установлено, что наименьшей биологической агрессией и наибольшей антиоксидантной активностью обладали соединения ряда конденсированных замещенных ди-азобицикло-нондиенов, кумаринов, конденсированных дигидропиридинов, циклических конденсированных тиопиранов, енаминов и кетонов. Для дальнейших исследований были отобраны 14 представителей гетероциклических соединений, показатели биологической активности которых представлены в таблице 13.
Таблица 13 - Биологическая активность гетероциклических соединений
№ Лабораторный шифр соединения Выживаемость бактериофага, % (М ± т) Антиоксидантная активность, у.е. (М ± т)
1. ЦГД-1 104±5,6* 2,77±0,14*
2. ЦГД-3 114,5±17,1* 1,60±0,04*
3. ЦГД-4 97±4,8* 1,71±0,06*
4. КМ-1 66±2,4* 0,86±0,01*
5. КМ-2 108±14,7* 1,34±0,06*
6. ОХ 81±3,8* 1,95±0,08*
7. ГТХ-4 78±3,4* 1,76±0,08*
8. ГТХ-5 33±2,7* 2,41±0,09*
9. ГГХ-6 47±4,3* 3,06±0,11*
10. ГХ 59±3,2* 4,30±0,16*
11. нд-3 58±2,8* 1,64±0,08*
12. ФДЕ 37±2,1* 1,85±0,11*
13. ДФЦ 87±5,1* 1,65±0,07*
14. ФДТ 88±4,6* 1,70±0,04*
Примечание - * наличие достоверности при уровне значимости р < 0,05 по отношению к контролю.
Те соединения, в которых сочетались низкая биологическая агрессия и высокая антиоксидантная активность, использовали для создания экспериментальных сред защиты референс-штаммов бактерий, подвергнутых лиофильному высушиванию.
Влияние химической структуры гетероциклических соединений на их биологическую активность
Представляло интерес выявить зависимость биологической активности гетероциклических соединений от их химической структуры. Был рассмотрен механизм ингибирующего действия исследованных производных кумарина, структурные формулы которых представлены на рисунке 4.
Наибольшую ингибирующую активность проявляют молекулы, содержащие «плоские заместители» в гетероциклическом фрагменте, например, карбоксикумарин (рисунок 4,а). Метилирование пиранового цикла кумарина в положении 4, в целом, сопровождается существенным ослаблением антифаговой активности испытуемых соединений. К усилению этого эффекта также приводит и включение электроноак-цепторных заместителей в положения 6, 7, 8. Причем, если заместителем является только ОН-группа в положении 7, то ингибирующее действие производного возрастает в 1,5 раза, по сравнению с ситуацией, когда в этом положении находится объемный электроноакцепторный заместитель (в нашем случае, ЫН-группа) или планарная ОН-группа, сопряженная водородной связью с ОН-группами либо в положении 8,
либо в положении 6. Антифаговой активностью на уровне соединений метилкумари-на (рисунок 4,в) и 7,8-диоксикумарина (рисунок 4,е) обладает и другой метилированный аналог кумарина со свободной ОН-группой в положении 6 - 6-оксикумарин (рисунок 4,д).
а) карбоксикумарин
НО
б) 6,7-диоксикумарин
в) метилкумарин НО
д) 6-оксикумарин
е) 7,8-диоксикумарин
ж) ацетамидокумарин
НО. о
г) 7-оксикумарин
з) диоксикумарин
Рисунок 4 - Структурные формулы производных кумарина
Отличительная взаимосвязь структуры ингибитора с антифаговой активностью позволяет предположить, что инактивирующее действие метилированных производных кумарина обусловлено не только способностью этих молекул к стекинг-взаимодействиям с ДНК бактериофага Т4 благодаря плоской структуре кумариново-
го ядра, но и возможностью стабилизации стекинг-структур водородными связями электроноакцепторных заместителей.
Определение токсичности гетероциклических и полимерных соединений
Параллельно с изучением биологической активности исследуемых гетероциклических и полимерных соединений было проведено их предварительное биотестирование на токсичность по общепринятым методикам с использованием тест-объекта Daphnia magna Straus. По результатам исследований были отобраны соединения с наименьшей токсичностью: 4 гетероциклических соединения (ПНВ-1 из ряда фенил-пентендиона, ХА-44 из ряда халконов, ПЭ-46 из ряда полифункционально замещенных эфиров и Е-4 из ряда диенаминов), ПААГ и его модифицированные аналоги.
Далее провели оценку острой токсичности отобранных соединений по стандартной методике на лабораторных белых мышах (самцах) с внутрибрюшинным и пероральным способами введения препаратов.
Значение показателя LD50 для ПНВ-1 составило 420 мкг/кг; для соединений ХА 44, ПЭ 46 и Е 4 - 500 мкг/кг, что позволило отнести данные соединения к умеренно-опасным (III класс токсичности). Для ПААГ и его модифицированных аналогов не удалось установить значение LD50, т.к. даже введение максимально возможной концентрации препаратов (2000 мг/кг) не вызывало изменения общего состояния животных. Поэтому ПААГ и его модифицированные аналоги были отнесены к малоопасным соединениям IV класса токсичности.
Создание инновационных препаратов на основе гетероциклических соединений и полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов
Создание инновационных препаратов для медико-биологической и ветеринарной практики предполагает использование современных технологий и методических подходов при их конструировании. Одним из перспективных направлений является создание структур «ядро-оболочка».
В исследованиях была изучена биологическая активность структур «ядро-оболочка», созданных из наноагрегатов флавоноидов (ядро) и ПААГ (полиэлектролитной оболочки). Антимикробную активность полученных структур изучали в сравнении с нестабилизированными наноагрегатами флавоноидов и полиэлектролитом в отношении референс-штаммов и клинических изолятов бактерий. Рабочие концентрации наноагрегатов флавоноидов составили от 10 до 2,5 мг/мл.
Установлено отсутствие антимикробной активности в отношении исследуемых микроорганизмов наноагрегатов флавоноидов (рост микроорганизмов с характерными культуральными признаками отмечен во всех опытных образцах).
Результаты антимикробной активности структур «ядро-оболочка», полученных путем модификации наноагрегатов флавоноидов ПААГ, представлены в таблице 14. Было установлено, что полимер ПААГ и структуры «ядро - оболочка», созданные на его основе, обладали выраженной антимикробной активностью, однако показатели МПК достоверно не отличались друг от друга.
Таким образом, было установлено, что структуры «ядро - оболочка», состоящие из наноагрегатов флавоноидов, покрытых полимерной оболочкой ПААГ, характеризуются антимикробными свойствами. По данным литературы, биофлавонои-ды, содержащиеся в прополисе, обладают выраженной регенерирующей способностью. Поэтому в качестве перспективного направления использования структур «ядро-оболочка», созданных на основе наноагрегатов флавоноидов и биосовместимого
полимера ПААГ, обладающего антимикробной активностью, можно рассматривать создание инновационного препарата для лечения неосложненных и гнойных ран.
Таблица 14 - Влияние структур «ядро-оболочка» на выживаемость исследуемых
микроорганизмов
№ Исследуемые микроорганизмы МПК, мкг/мл
1. S. aureus 209 Р -
2. S. aureus № 2 -
3. S. aureus № 6 -
4. S. aureus № 21 -
5. S. aureus № 23 -
6. S. aureus № 92 -
7. aureus № 430 -
8. B. cereus 8035 -
9. E. coliU-n -
10. P.aeruginosa ATCC 27853 64
Поскольку поиск химических соединений, обладающих выраженной антимикробной активностью и низкой токсичностью для макроорганизма, является актуальным и востребованным в медико-биологической и ветеринарной практике, представляло интерес изучить биологическую активность структур «ядро-оболочка», созданных на основе некоторых гетероциклических соединений, в сравнении с их немоди-фицированными аналогами, в отношении референс-штаммов и клинических изоля-тов бактерий. В исследованиях были использованы соединения ряда енаминов, поскольку они являются структурными аналогами противовирусных препаратов. Соединения А-1, А-3, Т-1 и Т-2 плохо растворялись даже при высокой концентрации диметилсульфоксида и их рабочие разведения представляли собой суспензии, в которых через некоторое время выпадал осадок. Из всех исследованных соединений лучшая растворимость была у соединения А-2, которое и было отобрано в качестве «ядра» для создания препарата. Антимикробная активность соединения А-2 представлена в таблице 15.
Таблица 15 — Антимикробная активность адамантилметилен-циклогексен-дикарбоксилата
№ Исследуемые микроорганизмы МПК, мкг/мл
1. S. aureus 209 P 25
2. S. aureus № 2 50
3. S. aureus № 6 100
4. S. aureus № 21 25
5. S. aureus № 23 50
6. 5. aureus № 92 100
7. S. aureus № 430 100
8. B. cereus 8035 50
9. E. coli М-17 100
10. P.aeruginosa ATCC 27853 -
В ходе проведенных исследований было установлено, что МПК соединения А-2 для референс-штамма S. aureus 209 Р и клинического изолята S. aureus № 21 составила 25 мкг/мл; для клинических изолятов S. aureus № 2 и № 23 - 50 мкг/мл, S. aureus № 92 и № 430 - 100 мкг/мл.
МПК А-2 для В. cereus 8035 составила 50 мкг/мл, а для Е. coli 113-13 - 100 мкг/мл. Для Р. aeruginosa АТСС 27853 не удалось определить МПК, т.к. во всех пробирках наблюдался рост в виде равномерного помутнения со слизистой пленкой на поверхности; при концентрации соединения А-2 100 мкг/мл наблюдалось нарушение пигментации.
При создании структуры «ядро-оболочка», в которой в качестве ядра было использовано соединение А-2, путем последовательной адсорбции формировалась полиэлектролитная оболочка из 1%-го ПААГ. Биологическую активность данной структуры оценивали методом серийных разведений. Полученные результаты представлены в таблице 16.
Таблица 16 —Биологическая активность структуры «ядро-оболочка» адамантилметилен-
№ Исследуемые микроорганизмы МПК, мкг/мл
1. S. aureus 209 Р 0,4
2. S. aureus № 2 1,6
3. S. aureus № 6 1,6
4. S. aureus № 21 0,8
5. S. aureus № 23 0,8
6. S. aureus № 92 3,2
7. S. aureus № 430 6,4
8. B. cereus 8035 3,2
9. E. coli M-17 50
10. P. aeruginosa ATCC 27853 25
Установлено повышение биологической активности соединения А-2 после его модификации полимером ПААГ. На рисунке 5 представлены диаграммы МПК соединения А-2 и его модификации ПААГ в виде структуры «ядро-оболочка» в отношении референс-штаммов бактерий. Отмечено повышение антимикробной активности структуры «ядро-оболочка» в отношении S. aureus 209 Р — в 62 раза, В. cereus 8035 - в 16 раз, Е. coli 113-13 - в 2 раза. МПК модифицированного соединения А-2 для Р. aeruginosa АТСС 27853 составила 25 мкг/мл.
На рисунке 6 представлены диаграммы МПК соединения А-2 и структуры «ядро-оболочка» на его основе в отношении референс-штамма и клинических изолятов золотистого стафилококка. Выявлено повышение антимикробной активности созданного препарата в отношении S. aureus № 2, № 21 и № 92 - в 32 раза, S. aureus №430-в 16 раз.
Отмечен синергидный эффект взаимодействия гетероциклического соединения с полимером, который в итоге приводил к повышению антимикробных свойств ПААГ. Особенно ярко это проявлялось в отношении Р. aeruginosa АТСС 27853, поскольку происходило увеличение значения МПК в 2,5 раза.
Проведенные исследования позволили установить антимикробную активность структуры «ядро-оболочка» на основе соединения А-2 и ПААГ, которая в большей степени выражена в отношении референс-штаммов и клинических изолятов грампо-ложительных бактерий. Более высокие значения МПК в отношении референс-штаммов грамотрицательных бактерий, вероятно, связаны с особенностями строения их клеточной стенки.
Таким образом, полученные результаты позволяют рассматривать соединение ряда енаминов адамантилметилен-циклогексен-дикарбоксилат в комплексе с ПААГ
как перспективный антимикробный препарат, а созданные комплексы «ядро-оболочка» на основе гетероциклических соединений и биосовместимых полимеров — эффективными для повышения биологической активности синтетических препаратов.
Рисунок 5 — МПК А-2 и структуры «ядро-оболочка» ПААГ+А-2 в отношении референс-штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий: 1- S. aureus 209 Р; 2 -В. cereus 8035; 3 - Е. coli 113-13; 4 -P. aerugenosa АТСС 27853
0 А2 Ш ПААГ+А2
Рисунок 6 — МПК А-2 и структуры «ядро-оболочка» ПААГ+А-2 в отношении референс-нггамма и клинических изолятов коагулазоположительных стафилококков: 1 - S. aureus 209 Р; 2 - S. aureus № 2; 3 - S. aureus № 6; 4 - S. aureus № 21; 5 - S. aureus № 23; 6 - iS1. aureus № 92; 7 - S. aureus № 430
На следующем этапе работы была изучена ранозаживляющая способность наноагрегатов флавоноидов и структур «ядро-оболочка», созданных на их основе путем обработки ПААГ. Оценку ранозаживляющих свойств препаратов проводили по
ежесуточному уменьшению площади полнослойных ран. Полученные результаты представлены на диаграмме (рисунок 7).
Было установлено, что в опытной группе животных наблюдается статистически достоверное уменьшение площади раневой поверхности, начиная со вторых суток эксперимента, а полное заживление ран происходит на 8-е сутки. В контрольной группе животных, раны которых не обрабатывали, полное заживление ран наступало на 14-е сутки от начала эксперимента. Полное заживление ран контрольной группы мышей, раны которых обрабатывали суспензией, содержащей наноагрегаты флаво-ноидов, происходило на 11-е сутки.
Дни
—■— Раны, обработанные препаратом - ■ Контроль 1 Контроль 2
Рисунок 7 — Динамика изменения площади экспериментальных ран
Полученные результаты позволяют предположить, что большая эффективность структур «ядро-оболочка» по сравнению с нестабилизированными агрегатами био-флавоноидов связана с синергидным эффектом и большей биодоступностью созданных инновационных препаратов. Помимо этого, наличие в составе структур «ядро-оболочка» ПААГ, для которого ранее была установлена выраженная антимикробная активность, снижает риск развития воспаления и контаминации раневой поверхности различными микроорганизмами. Следовательно, препарат, содержащий структуры «ядро-оболочка», созданные на основе наноагрегатов флавоноидов, покрытых биосовместимым полимером ПААГ, может быть рекомендован как эффективное рано-заживляющее средство.
Далее были изучены фильтрующие свойства гранул органобентонита и созданных на их основе структур «ядро-оболочка», модифицированных полимером ПААГ, в отношении санитарно-показательных микроорганизмов воды. Исследование перспектив использования ПААГ в качестве компонента фильтрующих систем проводили с использованием гранул органобентонита, которые были предоставлены ООО НПП «Лисскон» (г. Саратов).
В качестве экспериментальной модели использовали грамотрицательные бактерии Е. coli 113-13, как санитарно-показательный микроорганизм воды. Из суточной культуры исследуемого микроорганизма готовили взвесь в физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности 10 Ед (ГИСК им. Тарасевича), а затем титровали ее до рабочей концентрации 1 х 103 м.к./мл.
В качестве фильтра использовали гранулы органобентонита в чистом виде, а также после обработки 1%-м раствором ПААГ. Гранулы помещали в стеклянную колонку высотой 30 см. Фильтрование осуществляли путем пропускания трех объемов по 100 мл взвеси микроорганизмов через колонку с гранулами. Затем отбирали по 0,1 мл фильтрата из каждой пробы, вносили в чашку Петри с МПА и с помощью шпателя распределяли по всей поверхности плотной питательной среды. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 24 часов, после чего подсчитывали количество выросших колоний в 1 мл фильтрата. В качестве контроля проводили посев рабочей концентрации взвеси.
Было проведено фильтрование взвеси Е.соИ 113-13 с концентрацией микробных клеток, близкой по содержанию в сточных бытовых водах, через фильтрующие системы, содержащие гранулы органобентонита и гранулы, обработанные 1%-м раствором ПААГ, которые представляли собой структуру «ядро-оболочка». Полученные результаты представлены в таблице 17.
Таблица 17 - Влияние полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами _галогенов, на выживаемость E.coli 113-13_
Контроль Фильтрат, КОЕ/мл (М±т)
Гранулы органобентонита Гранулы органобентонита+полимер
586±67 473±51 37±1,9*
Примечание - * наличие достоверности при уровне значимости р < 0,05 по отношению к контролю.
При проведении фильтрации через гранулы органобентонита наблюдалась частичная механическая задержка бактерий кишечной палочки, а количество КОЕ/мл достоверно не отличалось от контрольных значений. При этом в посевах фильтрата отмечено появление колоний, отличающихся по морфологическим свойствам от колоний E.coli 113-13, что свидетельствовало о присутствии в гранулах органобентонита посторонней микрофлоры.
При посеве фильтрата из системы с обработанными полимером гранулами органобентонита, отмечено уменьшение количества КОЕ/мл в среднем в 15 раз по сравнению с контролем. Было установлено также, что на степень обеззараживания влияет скорость фильтрации.
Для определения сохранения клеток Е coli 113-13 на гранулах, обработанных полимером, через 24 часа после фильтрования взвеси через фильтр пропускали стерильный физиологический раствор. Затем 0,1 мл полученного фильтрата высевали на поверхность плотной питательной среды аналогично вышеприведенным экспериментам. Через 24 часа культивирования наблюдалось отсутствие роста исследуемого микроорганизма на поверхности МПА.
Было установлено, что ПААГ, адсорбированный на гранулах органобентонита, обладает бактерицидными свойствами в отношении E.coli 113-13. Создание структур «ядро-оболочка» на основе органобентонита и полимера ПААГ может рассматриваться как перспективное направление в создании инновационных эффективных фильтрующих систем.
Таким образом, проведенные исследования показали, что созданные на основе ПААГ инновационные препараты являются более эффективными по сравнению с исходными, что позволяет рекомендовать их к внедрению в медико-биологической и ветеринарной практике.
Создание инновационных сред защиты на основе гетероциклических соединений с антиоксидантной активностью для микроорганизмов, находящихся в условиях действия стрессовых факторов в процессе хранения в коллекциях культур
Для оценки влияния гетероциклических соединений, обладающих антиоксидантной активностью, на выживаемость микроорганизмов, находящихся в условиях стресса, проводили лиофильное высушивание вакцинного штамма У ЕУ
НИИЭГ. Выращенную культуру смывали средой высушивания - сахарозо-желатиновой средой (среда Файбича), состоящей из 10% сахарозы, 1,5 % желатины и 0,1% агара (рН 7,1-7,2) - СЖА. В опытные образцы в состав защитных сред вносили те гетероциклические соединения, в которых сочетались низкая биологическая агрессия и высокая антиоксидантная активность. Оптимальная концентрация исследуемых соединений была подобрана экспериментальным путем и составляла 5-100 мкг/мл. Приготовленную взвесь бактерий разливали в стерильные ампулы по 0,2 мл и лиофилизировали. Для оценки влияния синтетических антиоксидантов на выживаемость исследуемых бактерий, подвергнутых лиофилизации, использовали методику ускоренного определения сроков хранения У рея^я ЕУ НИИЭГ (Методика определения термостабильности..., 1985).
Для проведения лиофилизации были отобраны 14 соединений из ряда конденсированных замещенных диазобицикло-нондиенов (НД-1), кумаринов (КМ-1, КМ-2), конденсированных дигидропиридинов (ГГХ-5, ГГХ-6), енаминов (ФДЕ, ДФЦ, ФДТ), циклических конденсированных тиопиранов (ГТХ-4), кетонов (ЦГД-1, ЦГД-3, ЦГД-4), конденсированных пиранов (ГХ) и пиранов (ОХ). Согласно методике, был проведен расчет превышения сроков хранения лиофилизированных культур опытных образцов по сравнению с контролем. Полученные результаты представлены в таблице 18.
Установлено, что внесение в состав сред защиты исследованных гетероциклических соединений различных классов, обладающих антиоксидантной активностью, приводило к увеличению сроков хранения вакцинного штамма чумного микроба. Наименьшее увеличение сроков хранения (в 1,25-1,6 раза) наблюдалось при внесении в состав сред защиты соединений с лабораторным шифром ФДЕ, ГТХ-4, КМ-1 и КМ-2. Введение в состав сред соединений с лабораторным шифром ЦГД-4, Нд-3, ГГХ-5, ТГХ-6, ДФЦ и ФДТ увеличивало срок хранения У рейШ ЕУ НИИЭГ более чем в 2,5 раза по сравнению с контролем.
Наибольшим защитным действием характеризовались гетероциклические соединения с лабораторным шифром ГГХ-5, ОХ и ЦГД-1, введение которых в состав СЖА приводило к увеличению сроков хранения клеток вакцинного штамма чумного микроба в 4,20, 4,45 и 4,62 раза соответственно по сравнению с контролем. Следовательно, гетероциклические соединения, обладающие низкой биологической агрессией и высокой антиоксидантной активностью, могут быть использованы в качестве компонентов защитных сред в процессе лиофилизации референс-штаммов микроорганизмов для повышения их жизнеспособности в условиях стресса.
Таблица 18 — Влияние сред стабилизации, содержащих новые классы АО,
на сроки хранения клеток вакцинного штамма Г. рслг/и ЕУ НИИЭГ _в лиофилизированном состоянии_
№ Лабораторный шифр соединения Растворитель Оптимальная концентрация антиоксиданта, мкг/мл Превышение срока хранения над контролем
1. ЦГД-1 0,1 %ДМСО 20 4,62
2. цгд-з 0,1 %ДМСО 20 1,75
3. ЦГД-4 0,1 %ДМСО 10 2,4
4. КМ-1 0,1 % этанол 5 1,25
5. КМ-2 0,1 %ДМСО 40 1,6
6. ОХ 0,1 %ДМСО 20 4,45
7. ГТХ-4 0,1 %ДМСО 100 1,17
8. ГТХ-5 0,1 % ДМСО 20 4,20
9. ГГХ-6 0,1 %ДМСО 20 2,83
10. ГХ 0,1 %ДМСО 10 2,5
И. НД-3 0,1 %дмсо 10 2,44
12. ФДЕ 0,1 %ДМСО 10 1,49
13. ДФЦ 0,1 %ДМС О 20 2,37
14. ФДТ 0,1 %ДМСО 20 2,22
Примечание — * наличие достоверности при уровне значимости р < 0,05 по отношению к контролю.
Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что наноструктуры, представленные МУНТ, оказывают влияние на основные биологические свойства исследуемых микроорганизмов, что может быть использовано для повышения эффективности фотодинамической терапии, действия пробиотических препаратов, а также для создания комплексов микроорганизмов-деструкторов, необходимых для утилизации наноматериалов. Отобранные гетероциклические соединения с антимикробной активностью и низкими показателями острой токсичности могут рассматриваться как перспективные химиотерапевтические препараты. Гетероциклические соединения, характеризующиеся высокой антиоксидантной активностью, являются перспективными компонентами сред защиты, предохраняющими микробные клетки от окислительного стресса и повышающими их жизнеспособность в процессе лиофилизации. Созданные структуры «ядро-оболочка» на основе биосовместимого полимера ПААГ и отобранных соединений являются эффективными инновационными препаратами, которые могут быть использованы в медико-биологической и ветеринарной практике для повышения эффективности химиотерапевтических и раноза-живляющих средств, а также как компоненты фильтрующих систем нового поколения.
выводы
1. Установлено стимулирующее действие многостенных углеродных нанотрубок на рост и размножение Е. coli 113-13, что выражается в увеличении количества КОЕ в 1,5 раза по сравнению с контролем. Показатели КОЕ B.cereus 8035 и S. aureus 209 Р достоверно не отличались от контрольных значений.
2. Показано изменение культурально-морфологических свойств микроорганизмов при совместном культивировании исследуемых бактерий с многостенными углеродными нанотрубками — отмечены агрегация и увеличение размеров колоний Е. coli 113-13 и B.cereus 8035, восстановление пигментации колоний S. aureus 209 Р. Внесение наноструктур в питательную среду повышает адгезивную способность бактерий: по показателям индекса адгезии микроорганизмов клетки Е. coli 113-13 становятся среднеадгезивными, a S. aureus 209 Р — высокоадгезивными.
3. Выявлено увеличение на 62% числа КОЕ референс-штамма B.cereus 8035 при росте на синтетической среде М-9 с добавлением многостенных углеродных нанотрубок по сравнению с контролем, что свидетельствует о способности этих бацилл использовать нанотрубки в качестве единственного источника углерода.
4. Сочетанное воздействие синего светодиодного излучения (405 нм) и многостенных углеродных нанотрубок способствовало ингибированию роста клинических изолятов S. aureus № 92 и S. epidermidis № 11 и № 19е в 16, 11 и 52 раза соответственно по сравнению с контролем, что позволяет рассматривать данные наноструктуры в качестве перспективных фотосенсибилизаторов.
5. Доказано антимикробное действие на референс-штаммы и клинические изо-ляты грамположительных и грамотрицательных бактерий и микроскопических грибов гетероциклических соединений из ряда фенилпентендиона семикарбазона, халкона и полифункционально замещенных эфиров, МПК которых составила 0,80-6,75 мкг/мл. Соединения ряда кумаринов, енаминов, кетонов, циклических конденсированных тиопиранов, конденсированных дигидропиридинов и пиридинов обладали высокой антиоксидантной активностью; их использование в качестве компонентов сред защиты при лиофилизации повышало сроки хранения вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ в 1,5-4,6 раза по сравнению с контролем.
6. Квантово-химические расчеты габаритных пространственных размеров молекул исследуемых соединений позволили установить зависимость проявления антимикробных и антиоксидантных свойств от пространственных характеристик молекул, значений их молекулярной массы, распределения электронных зарядов и наличия определенных химических функциональных групп.
7. Установлена высокая антимикробная активность полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов, в отношении референс-штаммов и клинических изолятов грамположительных и грамотрицательных бактерий и микроскопических грибов: для S. aureus 209 Р, В. cereus 8035 и Е. coli 113-13 значения МПК были ниже 2 мкг/мл, для Р. aeruginosa АТСС 27853 МПК составила 64 мкг/мл, а для микроскопических грибов - 125-250 мкг/мл. Доказано, что антимикробная активность ПААГ зависит от концентрации гидрат-ионов йода; по показателям острой токсичности (LD50 >500 мг/кг) он относится к IV классу токсичности.
8. Обоснована технология создания структур «ядро-оболочка» с использованием в качестве «ядра» различных биологически активных носителей и «оболочки» из биосовместимого полимера - полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов.
9. Экспериментальные препараты на основе структур «ядро-оболочка», содержащие в качестве ядра наноагрегаты флавоноидов, характеризовались антимикробными и ранозаживляющими свойствами. Использование в качестве «ядра» ада-мантилметилен-циклогексен-дикарбоксилата приводило к увеличению его антимикробной активности в отношении исследуемых бактерий.
10. Доказана эффективность использования экспериментальных фильтрующих систем с антимикробными свойствами на основе структур «ядро-оболочка» с «ядром» из наноструктурированного органобентонита для комплексной водоочистки.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ
1. Трехмерная микроскопия бактериальной клетки с высоким пространственным разрешением / Н.П. Коннов, Ю.П. Волков, О.В. Новикова (Нечаева) [и др.] /У Проблемы особо опасных инфекций. - 2002. - Вып. I (83). - С. 86-90.
2. Антифаговая и антиоксидантная активность замещенных кумаринов / О.В. Нечаева, Е.И. Тихомирова, О.П. Плотников [и др.] // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология. - 2007. - Т. 7, Вып. 2. - С. 3-7.
3. Изучение антимикробной активности некоторых карбо- и гетероциклических соединений / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева, Ю.А. Алексеева [и др.] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2009. - Т. 11, № 2. - С. 30.
4. Изучение влияния углеродных нанотрубок на водную и биологические среды / О.В. Нечаева, Г.В. Торгашев, O.E. Глухова [и др.] //Биомедицинская радиоэлектроника - 2009. - № 9. - С. 59-63.
5. Пермякова Н.Ф. Антимикробная активность некоторых новых карбо- и гетероциклических соединений / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева, Е.И. Тихомирова // Естественные и технические науки. - 2009. - № 5. - С. 93-97.
6. Оценка противомикробного действия некоторых новых карбо- и гетероциклических соединений / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева, MC. Карнаухова [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2009. -Ks 8. - С. 32-35.
7. Пермякова Н.Ф. Перспективные гетероциклические соединения с антимикробной активностью / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева, Е.И. Тихомирова // Фундаментальные исследования. - 2009. - № 9. - С. 66-67.
8. Пермякова Н.Ф. Использование синтетических антиоксидантов для сохранения жизнеспособности бактерий при действии стрессовых абиотических факторов / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева, А.Н. Кушнаренко // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. - 2010. - Т. 10, Вып. 2. - С. 60-62.
9. Изучение влияния углеродных нанотрубок на водную и биологическую среды / М.В. Самарский, О.В. Нечаева, Н.Ф. Пермякова [и др.] // Нелинейный мир. -2010. - Т. 8, № 2. - С. 74-75.
10. Антимикробная активность К-адамантил-метиленаминоциклогексендикарбоксилатов / Е.А. Зинина, Н.Ф. Шуршалова, О.В. Нечаева [и др.] // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. - 2012. - Т. 12, Вып. 2. - С. 8-9.
11.Изучение фильтрующих свойств модифицированных органобентонитовых гранул в отношении санитарно-показательных микроорганизмов воды / Н.В. Веденеева, О.В. Нечаева, ДА. Заярский [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 6 (часть 4). - С. 906-908.
Публикации в других изданиях:
12. Универсальный малогабаритный комплекс СЗМ для работы в полевых условиях / Н.П. Коннов, В.Б. Байбурин, О.В. Новикова (Нечаева) [и др.] // Тезисы докладов XVIII Российской конференции по электронной микроскопии. - Черноголовка, 2000. - С. 74.
13. Volkov Y.P. Bacterial cell ultra structure three-dimensional image / Y.P. Volkov, O.V. Novikova (Nechaeva), N.P. Konnov // SPIE proceedings. - 2001. - Vol. 4434. - P. 251-255.
14. Volkov Y.P. Transmission electron microscopy study of thin sections of ultrasmall quantity of cell / Y.P. Volkov, O.V. Novikova (Nechaeva), N.P. Konnov // SPIE proceedings. -2001. - Vol. 4434. - P. 256-259.
15. Plague and anthrax bacteria cell ultra structure 3D images / Y.P. Volkov, N.P. Konnov, R.A. Yakinienko, O.V. Novikova (Nechaeva) // SPEI proceedings. - 2001. - Vol. 4707. -P. 371-374.
16. Transmission electron microscopy study of flea lymph cell thin sections I Y.P. Volkov, N.P. Konnov, RA. Yakimenko, O.V. Novikova (Nechaeva) // SPEI proceedings. - 2001. - Vol. 4707. - P. 367-370.
17. Волков Ю.П. Трехмерная визуализация ультраструктуры бактериальных клеток / Ю.П. Волков, О.В. Новикова (Нечаева), Н.П. Коннов // РЭМ 2001: Тезисы докладов XII Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. — Черноголовка, 2001. - С. 33.
18. Волков Ю.П. Электронно-микроскопическое исследование структуры сверхмалых количеств клеток / Ю.П. Волков, О.В. Новикова (Нечаева), Н.П. Коннов // РЭМ 2001: Тезисы докладов XII Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. - Черноголовка, 2001. - С. 34.
19. The combination of the electrophoretic and electronic microscopy methods for determination of localization of the thallium-containing synthetic antioxidants on the surfase of the plague microbe cells / V.N. Korsukov, O.V. Novikova (Nechaeva), N.P. Konnov [et al.] // International School for Young Scientists от Optics, Laser Physics & Biophysics: Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine 1П. - Saratov, 2001. - P. 111-117.
20. Локализация в клетках чумного микроба антиоксидантов, синтезированных на основе таллийорганических соединений / В.Н. Корсуков, О.В. Нечаева, Н.П. Коннов [и др.] // Композиты XXI века: Тезисы Международного симпозиума восточно-азиатских стран по полимерным композиционным материалам и передовым технологиям. - Саратов, 2005.—С. 42-45.
21. Алексеева Ю.А. Перспективы использования новых гетероциклических соединений, обладающих антимикробной активностью / Ю.А. Алексеева, О.В. Нечаева, Н.Ф. Пер-мякова // Молодежь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2008.-С. 58-59.
22. Нечаева О.В. Влияние углеродных наноструктур на биологические свойства бактерий / О.В. Нечаева, Н.Ф. Пермякова, А.Н. Кушнаренко // Молодежь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2008. - С. 85.
23. Антимикробная активность некоторых новых карбо- и гетероциклических соединений / Н.В. Поплевина, В.Е. Субботин, Н.Ф. Пермякова, Е.С. Зуйкова, А.Н. Кушнаренко, М.С. Карнаухова, H.H. Кузнецова, О.В. Нечаева // Сборник материалов Всероссийской молодежной выставки-конкурса прикладных исследований, изобретений и инноваций. - Саратов, 2009.-С.78.
24. Оценка антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений / H.H. Кузнецова, Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева [и др.] // Биология наука XXI века: Сборник тезисов 14-й Международной Путинской школы-конференции молодых ученых: в 2 т. -Пущино, 2010. - Т. 2. - С. 238-239.
25. Влияние углеродных нанотрубок на биологические свойства бактерий / А.Н.Кушнаренко, Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева [и др.] // Биология наука XXI века: Сборник тезисов 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых: в 2 т. -Пущино, 2010. -Т. 2. - С. 240.
26. Синтез и биологическая активность некоторых карбо- и гетероциклических соединений / В.В. Сорокин, В.Е. Субботин, Н.В. Поплевина, А.П. Кривенько, Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева [и др.] // Фармобразование 2010. Часть II. Научные основы создания новых лекарственных средств: Материалы 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции. - Воронеж, 2010. - С. 367-368.
27. Влияние углеродных нанотрубок на биологические свойства бактерий / Н.В. Петрова, А.Н. Кушнаренко, Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева // Первые Международные Бекке-ровские чтения: Сборник трудов - Волгоград, 2010. - Часть II. - С. 148-149.
28. Оценка острой токсичности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений с антимикробной активностью / Н.Ф. Пермякова, М.С. Карнаухова, О.В. Нечаева [и др.] // Фундаментальные науки и практика: Межвузовский сборник научных трудов с материалами 2-й Международной телеконференции. - 2010. - Т. 1, №2. - С. 98.
29. Нечаева О.В. Влияние гетероциклических соединений, обладающих антиоксидант-ной активностью, на собственные антиокислительные системы бактериальной клетки / О.В. Нечаева, О.П. Плотников // Биоантиоксидант: Тезисы докладов VIII Международной конференции. -М., 2010. - С. 327-329.
30. Нечаева О.В. Изучение морфологических и культуральных свойств условно-патогенных бактерий при действии многостенных углеродных нанотрубок / О.В. Нечаева, Н.Ф. Пермякова, Е.И. Тихомирова // Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности: Сборник научных трудов Научно-практического семинара с международным участием. - Ульяновск, 2011. -С.186-188.
31. Заярский Д.А, Исследование антимикробной активности структур «ядро-оболочка» на основе наноразмерных агрегатов флавоноидов / Д.А. Заярский, О.В. Нечаева, Н.В. Беспалова // Наукоемкие технологии и интеллектуальные системы в наноинженерии: Сборник материалов Всероссийской молодежной конференции. - Саратов, 2012. - С. 92-96.
32. Исследование антимикробной и ранозаживляющей активности структур «ядро-оболочка» на основе наноразмерных агрегатов флавоноидов / Д.А. Заярский, О.В. Нечаева, Г.М. Шуб [и др.] // Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине - 2012: Материалы Всероссийской молодежной конференции. — Саратов, 2012. - С. 278-280.
33. Биологическая активность наноразмерных агрегатов флавоноидов, стабилизированных полидиметилдиаллиламмонием йодида сахарозы / М.М. Вакараева, О.В. Нечаева, Д.А. Заярский [и др.] // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве: Материалы Международной научно-практической конференции - Саратов, 2013. - С. 13-15.
34. Изучение фильтрующих свойств модифицированных органобентонитовых гранул в отношении санитарно-показательных микроорганизмов воды / Н.В. Веденеева, О.В. Нечаева, Д.А. Заярский [и др.] // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве: Материалы Международной научно-практической конференции. - Саратов, 2013. — С. 245246.
35. Вакараева М.М. Влияние полидиметилдиаллиламмония йодида сахарозы на выживаемость коагулазоположительных стафилококков / М.М. Вакараева, О.В. Нечаева, Д.А. Заярский // Экологические проблемы промышленных городов: Сборник научных трудов по материалам 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием: в 2 т. - Саратов, 2013. -Т.2. - С. 40-42.
36. Разработка инновационной фильтрующей системы на основе органобентонита и биополимера Униконс / Н.В. Веденеева, О.В. Нечаева, Д.А. Заярский [и др.] // Экологические проблемы промышленных городов: Сборник научных трудов по материалам 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием: в 2 т. - Саратов, 2013.-Т.2.-С. 42-46.
Патент
Устройство для осаждения и заливки в эпоксидную смолу сверхмалых количеств клеток: Патент на полезную модель № 40318 / Н.П. Коннов, Ю.П. Волков, О.С. Кузнецов, О.В. Нечаева. Патентообладатель: Федеральное государственное учреждение Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Заявка №2004113812, Приоритет полезной модели 06.05.2004 г.
Монография
Перспективы использования гетероциклических соединений в медико-биологической практике / О.В Нечаева, Н.Ф. Шуршалова, Е.И. Тихомирова, О.П. Плотников. - Саратов: ИД «Райт-Экспо», 2013. - 123 с.
Благодарности
Выражаю искреннюю благодарность своему научному консультанту доктору биологических наук, профессору Тихомировой Елене Ивановне за ценные советы, всестороннюю поддержку и помощь в выполнении работы.
Я глубоко признательна сотрудникам кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского, лично заведующему кафедрой, доктору медицинских наук, профессору Шубу Геннадию Марковичу и профессору кафедры, доктору медицинских наук Швиденко Инне Григорьевне за понимание, поддержку и всестороннюю помощь.
Выражаю благодарность профессору кафедры органической и биоорганической химии Института химии СГУ, доктору химических наук Сорокину Виталию Викторовичу за предоставленные для наших исследований синтезированные гетероциклические соединения и ценные консультации.
Особую благодарность выражаю доктору ветеринарных наук, Заслуженному ветеринарному врачу РФ, директору ГНУ «Саратовский НИВИ» Россельхозакадемии Ласкавому Владиславу Николаевичу за предоставленную базу и помощь в проведении микробиологических исследований и экспериментов на лабораторных животных по ранозаживляющей способности исследованных препаратов.
Я искренне признательна доктору медицинских наук, старшему научному сотруднику, заведующему лабораторией коллекционных штаммов Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора Плотникову Олегу Петровичу за всестороннюю помощь в проведении исследований, ценные консультации и моральную поддержку.
Выражаю признательность сотрудникам кафедры экологии Саратовского государственного технического университета имени Гагарина Ю.А. за бескорыстную практическую помощь в проведении исследований на базе научной биологической лаборатории и НОЦ «Промышленная экология», искреннюю поддержку и доброе отношение.
Подписано в печать 01.11.2013 Формат 60x84 1/16
Бум. офсет. Усл. печ. л. 2,0 Уч.-изд. л. 2,0
Тираж 100 экз. Заказ 32
ООО «Издательский Дом «Райт-Экспо»
410031, Саратов, Волжская ул., 28 Отпечатано в ООО «ИД «Райт-Экспо» 410031, Саратов, Волжская ул., 28, тел. (8452) 90-24-90
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Нечаева, Ольга Викторовна, Саратов
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.»
На правах рукописи
05201450336
НЕЧАЕВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА
ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИМЕРНЫХ И ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК НА МИКРООРГАНИЗМЫ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ СОЗДАНИЯ НА ИХ ОСНОВЕ ИННОВАЦИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ
03.02.03 - микробиология
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна
Саратов - 2013
Содержание работы
Введение 5
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Проблемы современной антибиотикотерапии 16
1.1.1. Антибиотикорезистентность микроорганизмов и генетические механизмы ее формирования 21
1.1.2. Микробные биопленки как фактор развития устойчивости к антимикробным препаратам 31
1.1.3. Проблемы противовирусной химиотерапии 3 5
1.1.4. Основные методы преодоления антибиотикорезистентности 3 8
1.2. Использование гетероциклических соединений в медико-биологической практике 40
1.2.1. Гетероциклические соединения
с антимикробной активностью 41
1.2.2. Гетероциклические соединения
с антиоксидантной активностью 46
1.3. Фотодинамическое воздействие на возбудителей инфекционных заболеваний 56
1.4. Использование наноструктур в медико-биологической практике 59 1.4.1. Создание и практическое применение нанобиотехнологических препаратов 64 1.4.2 Проблемы безопасности работы с наноматериалами и загрязнения окружающей среды 68 Собственные исследования
Глава 2. Объект, материалы и методы 75
2.1. Экспериментальные модели 75
2.2. Химические соединения, использованные в работе 77
2.3. Методы микробиологических исследований 85
2.4. Определение противовирусной активности
химических соединений 87
2.5. Определение биологической активности гетероциклических соединений 89
2.6. Методы консервации микроорганизмов и определение продолжительности их хранения 92
2.7. Методы токсикологических исследований 93
2.7.1. Биотестирование на тест-объектах дафниях больших
(Daphnia magna Straus) 94
2.7.2. Определение острой токсичности на белых мышах 97
2.8. Исследование ранозаживляющих свойств препаратов 98
2.9. Статистическая обработка результатов 99 Глава 3. Влияние многостенных углеродных нанотрубок на биологические свойства бактерий 100
3.1. Изучение влияния многостенных углеродных нанотрубок на морфологические, культуральные и биохимические
свойства референс-штаммов бактерий 100
3.2. Оценка возможности использования микроорганизмами многостенных углеродных нанотрубок
в качестве единственного источника углерода 104
3.3. Исследование влияния многостенных углеродных нанотрубок на клинические изоляты S. aureus
на фоне действия некогерентного светодиодного излучения 106
3.4. Изучение влияния многостенных углеродных нанотрубок
на адгезивные свойства референс-штаммов бактерий 107
Глава 4. Изучение биологической активности полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами галогенов,
и его аналогов в отношении микроорганизмов 112
4.1. Исследование биологической активности полиазолидинаммония и его модификаций
в отношении референс-штаммов микроорганизмов 112
4.2. Изучение биологической активности полиазолидинаммония в отношении клинических изолятов коагулазоположительных стафилококков 114
4.3. Изучение биологической активности полиазолидинаммония
в отношении микроскопических грибов 115
4.4. Исследование зависимости биологической активности полиазолидинаммония от концентрации гидрат-ионов йода 117
4.5.Сравнительная оценка действия полиазолидинаммония и раствора диоксида хлора на санитарно-показательные микроорганизмы воды 119 Глава 5. Изучение биологической активности
гетероциклических соединений 122
5.1. Оценка антимикробной активности гетероциклических соединений различных классов 122
5.2. Изучение антиоксидантных свойств гетероциклических соединений различных классов 133
5.3. Влияние химической структуры гетероциклических соединений
на их биологическую активность 144
Глава 6. Определение токсичности гетероциклических и
полимерных соединений 157
6.1. Определение острой токсичности гетероциклических и полимерных соединений на биотест-объектах
Daphnia magna Straus 157
6.2. Определение острой токсичности гетероциклических и полимерных соединений на белых лабораторных мышах 160 Глава 7. Исследование противовирусной активности
гетероциклических и полимерных соединений 163
Глава 8. Создание инновационных препаратов на основе полиазолидинаммония, модифицированного
гидрат ионами галогенов, и гетероциклических соединений 167
8.1. Обоснование технологии создания структур
«ядро-оболочка» и конструирование препаратов 167
8.2. Изучение антимикробной активности структур «ядро-оболочка»
на основе наноразмерных агрегатов флавоноидов 170
8.3. Изучение антимикробной активности соединений ряда енаминов
и инновационных препаратов их на основе 173
8.4. Изучение антимикробных свойств фильтрующих систем, созданных на основе структур «ядро-оболочка»,
в отношении санитарно-показательных микроорганизмов воды 178
8.5. Изучение ранозаживляющих свойств наноагрегатов флавоноидов
и созданных на их основе инновационных препаратов 183
8.6. Создание инновационных сред защиты на основе гетероциклических соединений с антиоксидантной активностью для микроорганизмов, находящихся в условиях действия
стрессовых факторов в процессе хранения в коллекциях культур 191
Заключение 194
Выводы 210
Список сокращений и условных обозначений 213
Список литературы 215
ВВЕДЕНИЕ
Одной из актуальных задач современной прикладной микробиологии является поиск, разработка и внедрение новых препаратов как антимикробного действия, так и способствующих сохранению и восстановлению жизнеспособности коллекционных штаммов микроорганизмов, в том числе и штаммов - продуцентов.
Важнейшим достижением медицины второй половины XX века стало открытие антибиотиков, без которых в настоящее время невозможно лечение инфекционных заболеваний (Сазыкин, 1999; Тец, 2006). За последние десятилетия создано большое количество высокоэффективных антибиотиков и химиотерапевтических препаратов (Егоров, 1999; Страчунский, Козлов, 2001; Яковлев, Яковлев, 2003). Развитию химиотерапии способствовали достижения в области биотехнологии, общей и клинической микробиологии, выявление механизмов действия антимикробных препаратов и резистентности микроорганизмов.
Важной проблемой, возникающей при химиотерапии, является формирование устойчивости микроорганизмов к лекарственным препаратам. Различают природную и приобретенную лекарственную устойчивость. Актуальной проблемой является именно приобретенная устойчивость, которая возникает у микроорганизмов в процессе этиотропной терапии (Сидоренко, 2002).
В последние годы повышение эффективности применения антимикробных препаратов связывают с преодолением лекарственной устойчивости микроорганизмов. Согласно «Декларации по борьбе с антимикробной резистентностью» (Торонто, 2000) и разработанной ВОЗ «Глобальной стратегии по сдерживанию роста устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам» (Женева, 2001) преодоление лекарственной устойчивости может быть достигнуто благодаря следующим мероприятиям: рациональной химиотерапии и
контролю назначения химиотерапевтических препаратов, мониторингу антибиотикорезистентных микроорганизмов в лечебно-профилактических учреждениях, разработке и внедрению в лечебную практику новых антимикробных препаратов. В этой связи поиск новых химических соединений, обладающих выраженной антимикробной активностью, является актуальным. Необходимость в новых препаратах связана также с расширением их антимикробного спектра, повышением активности в отношении полирезистентных возбудителей, снижением токсических свойств.
Одним из перспективных направлений отбора новых препаратов, обладающих антимикробной активностью, является направленный синтез химических соединений с заданными биологическими свойствами (Дубровина, 2009). Это связано с выявлением зависимости химической структуры синтетических соединений с их противомикробной активностью (Ботаева и др., 2008; Чернов и др., 2008).
Многие гетероциклические соединения помимо антимикробной активности характеризуются выраженными антиоксидантными свойствами. Поэтому еще одним перспективным направлением использования гетероциклических соединений в медико-биологической практике является их включение в состав сред для повышения жизнеспособности коллекционных штаммов микроорганизмов, находящихся в условиях окислительного стресса в процессе хранения (Плотников и др., 1993; Липатова и др., 1995; Новикова и др., 2001).
На современном этапе развития науки особую значимость приобретают нанотехнологии, которые внедряются практически во все сферы деятельности человека, в том числе в медицинскую и биологическую практику. Развитию нанотехнологии способствовало открытие и исследование областей применения углеродных наноструктур: фуллеренов, углеродных нанотрубок и графена. Имеется большое количество разработок использования наноструктур в медицине, ветеринарии и биологии в
качестве диагностических и лекарственных средств. На основе углеродных нанотрубок создаются биосенсоры, позволяющие определять специфические вещества внутри клеток или видоизмененные клетки, что играет важную роль в диагностике онкологических заболеваний. Создаются наноконтейнеры на основе углеродных нанотрубок для адресной доставки терапевтических генов и лекарственных препаратов, что способствует повышению их биодоступности и эффективности лечения. Нанотехнологические препараты находят свое применение в диагностике и лечении инфекционных заболеваний. Ведутся разработки в области создания наноносителей антигенных компонентов для формирования длительного иммунного ответа против респираторных вирусов. Однако в литературе практически отсутствуют сведения о применении наноструктур в микробиологической практике и их влиянии на функциональную активность представителей микробоценозов организма человека и животных.
Большой научный интерес представляют на настоящий момент исследования антимикробных свойств биосовместимых полимеров и их наноструктурированных форм (Заярский и др., 2012). Это связано с возможностью создания инновационных препаратов с заданной структурой по типу «ядро-оболочка», позволяющих избежать патологической реакции макроорганизма и обеспечить адресное специфическое действие.
Степень разработанности проблемы
Исследованиями ряда авторов показана перспективность использования в качестве антимикробных средств различных гетероциклических соединений (Мельников, 1994; Маркова, 1996; Вишняков, 2001; Селезнева, 2001; Кравченко, 2003; Шуб и др., 2003; Корженевич и др., 2004; Райкова и др., 2004; Жандарев и др., 2006; Пименова и др., 2006; Пермякова и др., 2009; Зинина и др., 2012).
Вопросы использования гетероциклических соединений в качестве антиоксидантов, входящих в состав стабилизационных сред защиты в
процессе консервации микроорганизмов и изменяющих уровень собственных антиокислительных систем бактериальной клетки, рассмотрены в работах О.П. Плотникова и др. (1993, 1999), Е.В. Липатовой и др. (1995), Н.С. Смирновой и др. (1995), А.И. Осадчей и др. (2002), О.В. Нечаевой (2004,2010), Н.Ф. Пермяковой и др. (2010).
Результаты исследований по использованию углеродных наноструктур в медико-биологической практике представлены в работах следующих авторов: М. Маркман, Дж.Л. Уалкер (2006), В.П. Терещенко и др. (2010), М. Kumar et al. (2003), W. Wu et al. (2005), J.S. Kim et al. (2007), D. Perr et al. (2007), S.C. McMain et al. (2008), K. Welsher et al. (2008), G.A. Zelada-Guillen et al. (2009), B. Kang et al. (2010).
В связи с актуальностью и востребованностью решения указанных выше вопросов целью работы явилось исследование действия наноструктур на основе биосовместимых полимеров, углеродных нанотрубок и вновь синтезированных гетероциклических соединений на референс-штаммы и клинические изоляты микроорганизмов, отбор веществ с выраженными антимикробными и антиоксидантными свойствами и обоснование технологии создания на их основе инновационных препаратов.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Изучить действие многостенных углеродных нанотрубок на биологические свойства референс-штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий; определить способность бактерий использовать многостенные углеродные нанотрубки в качестве единственного источника углерода.
2. Установить влияние многостенных углеродных нанотрубок на выживаемость микроорганизмов при воздействии синего светодиодного излучения (405 нм).
3. Изучить антимикробную активность и токсичность полиазолидинаммония, модифицированного гидрат ионами галогенов, и его наноструктурированных вариантов.
4. Изучить биологическую активность гетероциклических соединений нового ряда и отобрать соединения с выраженными антибактериальными, фунгицидными, противовирусными и антиоксидантными свойствами.
5. Исследовать зависимость проявления антимикробных и антиоксидантных свойств от особенностей химической структуры гетероциклических соединений.
6. Определить токсичность перспективных гетероциклических соединений с антимикробными и антиоксидантными свойствами методами биотестирования с использованием комплекса тест-объектов (дафний и хлореллы) и лабораторных животных.
7. Обосновать использование гетероциклических соединений с антиоксидантными свойствами в составе сред стабилизации для повышения жизнеспособности лиофилизированных референс-штаммов бактерий.
8. Разработать технологию создания структур «ядро-оболочка» на основе наноагрегатов флавоноидов, гетероциклических соединений и наноструктурированного органобентонита с биосовместимым полимером.
9. Обосновать перспективность использования в медико-биологической и ветеринарной практике разработанных инновационных препаратов.
Научная новизна. Впервые изучено влияние многостенных углеродных нанотрубок на морфологические, культуральные, биохимические и адгезивные свойства референс-штаммов бактерий. Показано их стимулирующее действие на рост и размножение грамотрицательных бактерий; повышение адгезивной активности грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Впервые установлено, что сочетанное воздействие синего светодиодного излучения (405 нм) и многостенных углеродных нанотрубок
приводит к выраженному ингибированию роста клинических изолятов Staphylococcus aureus № 92 и Staphylococcus epidermidis 11 Staphylococcus epidermidis 19e, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных фотосенсибилизаторов для усиления эффекта действия синего излучения на возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний.
Впервые дана характеристика антимикробной активности гетероциклических соединений разных классов: фенилпентендионов, халконов, полифункционально замещенных эфиров, енаминов, семикарбазонов в отношении референс-штаммов микроорганизмов Escherichia coli 113-13, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus 209 P и Candida albicans 18. Отобраны перспективные соединения с антистафилококковым действием из ряда халкона, полифункционально замещенных эфиров, енаминов и семикарбазонов; с фунгицидной активностью - из ряда енаминов. Установлено, что соединение 2,4-дихлор-1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион ряда фенилпентендион обладает широким спектром антимикробного действия по отношению к клиническим изолятам грамположительных и грамотрицательных бактерий, и подавляет репродукцию штамма «ВН-96» вируса ТГЭС.
Отобраны соединения ряда кумаринов, енаминов, кетонов, циклических конденсированных тиопиранов, конденсированных дигидропиридинов и пиридинов, обладающие низкой антифаговой и высокой антиоксидантной активностью, которые способны локализоваться на поверхности бактериальных клеток, повышать целостность мембранных и внутриклеточных структур, снижать уровень собственных антиокислительных ферментов. Эти соединения могут быть успешно использованы для повышения жизнеспособности и стабилизации свойств популяций коллекционных культур микроорганизмов как компоненты защитных сред.
Установлена зависимость антимикробной и антиоксидантной активности гетероциклических соединений нового ряда от значений их
и
молекулярной массы, пространственных характеристик молекул, распределения электронных зарядов и наличия определенных химических функциональных групп для комплексного взаимодействия с мембраной бактериальной клетки.
Показана высокая антимикробная активность полиазолидинаммония, модифицированного гидрат ионами галогенов, в отношении референс-штаммов и клинических изолятов грамотрицательных и грамположитель
-
Нечаева, Ольга Викторовна
-
доктора биологических наук
-
Саратов, 2013
-
ВАК 03.02.03
- Взаимодействия вирусов с детонационными наноалмазными материалами и композитами на основе полианилина
- Оценка токсичности наноматериалов с использованием микроорганизмов
- Исследование морфо-функциональной реакции бактерий на различные воздействия с использованием атомно-силовой микроскопии
- Утилизация попутных нефтяных газов методом каталитического разложения легких углеводородов с получением углеродных наноматериалов и водорода
- Физиологические аспекты влияния углеродного наноструктурного материала "Таунит" на организм самок белых мышей и их потомство
