Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические аспекты влияния углеродного наноструктурного материала "Таунит" на организм самок белых мышей и их потомство

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологические аспекты влияния углеродного наноструктурного материала "Таунит" на организм самок белых мышей и их потомство"

На правах рукописи

ГОРШЕНЁВА ЕКАТЕРИНА БОРИСОВНА

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЛИЯНИЯ УГЛЕРОДНОГО НАНОСТРУКТУРНОГО МАТЕРИАЛА «ТАУНИТ» НА ОРГАНИЗМ САМОК БЕЛЫХ МЫШЕЙ И ИХ ПОТОМСТВО

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.03.01 - физиология

2ЬШ2Ш

005550165

Тамбов-2014

005550165

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина»

Научный руководитель: Османов Эседулла Маллаалиевич,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: Любин Николай Александрович,

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой морфологии, физиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина»

Еремеев Александр Михайлович, кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии человека и животных ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) Федеральный университет»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Пензенский государст-

венный университет»

Защита состоится «18» сентября 2014 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220.034.02 при ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» по адресу: 420029, г. Казань, Сибирский тракт, 35; тел. / факс (843) 273-97-84.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана».

Автореферат разослан «_»_2014 года и размещен на сайтах

http: //www.vak.ed.gov.ru/ и //www.ksavm.senet.ru/

Учёный секретарь

диссертационного совета, —

доктор биологических наук, Гильмутдинов

профессор ¿Р""' Рустам Якубович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Атуальность темы исследования. Развитие нанотехнологий и создание наноматериалов, являясь важнейшим направлением научно-технического прогресса будущего, в то же время ставит вопрос взаимодействия последних с живым организмом. В течение последних десятилетий создано более 2000 разновидностей наноматериалов, в связи с чем возросла возможность воздействия наночастид на животных, человека и окружающую среду (Powers K.W., Brown S.C., 2006; Гусев A.A., Емельянов A.B., 2008; Пиотровский Л.Б., 2008). Такие антропогенные источники, как металлургическая, цементная промышленность; сгорание каменного угля, полимерных соединений, нефти, пса, дизельного топлива и другие процессы значительно увеличили содержание наночастиц в окружающей среде (Sahoo S.K. et al., 2007; Инша-ков, О.В., Фесюн A.B., 2009). В процессе производства наноматериалов, их транспортировки, производственных процессах, ремонте, а также утилизации объектов, содержащих наночастицы, все чаще имеет место контакт и воздействие наноматериалов на животный организм.

Общепризнано, что изменения физических свойств вещества при переходе в форму наночастиц закономерно сопровождаются изменениями его биологических эффектов. В частности, установлена существенная задержка наночастиц в легких, поскольку из-за малых размеров этих частиц, механизмы выведения их респираторной системой организма неэффективны. Показана способность наночастиц проникать через легкие в другие системы и проходить кожные барьеры; наличие у них так называемого «воспалительного потенциала» (Русаков Н.В., 2008; Takeda К. et al., 2011). Небольшие размеры и разнообразие их форм способствуют связыванию с нуклеиновыми кислотами и белками; встраиванию в мембраны клеток, изменяя функции биоструктур. Наличие у многих наноматериалов гидрофобных свойств и электрического заряда усиливает как процессы адсорбции на них различных веществ, так и способность проникать через барьеры организма. Важным свойством наночастиц является высокая способность к аккумуляции, поскольку вследствие малых размеров эти вещества могут не распознаваться защитными системами организма, и, следовательно, не подвергаться биотрансформации (Сычева Л.П., 2008; Miyawaki J. et al., 2008; Gomes S.I. et al., 2013).

Перечисленное свидетельствует о высокой актуальности изучения влияния наноматериалов, в том числе углеродных, на животный организм с оценкой состояния различных органов и систем, в частности, репродуктивной.

Степень разработанности темы. В настоящее время усилия исследователей сосредоточены преимущественно на изучении начальных этапов процесса взаимодействия животного организма с наночастицами: идентификации и характеристике последних на основе биологических и фармакологических эффектов, полученных на моделях животных. Изучаются пути проникновения наночастиц в организм - респираторный, чрескожный, пероральный;

критические органы-мишени (легкие, кожа, сердечно-сосудистая и нервная системы); оценивается влияние наноматериалов на физиологическое состояние и исследуются специфические механизмы действия некоторых наноча-стиц (Радилов А.С. и др., 2009; Lim D. et al., 2012). Ведутся работы по обоснованию и разработке санитарно-гигиенических требований к содержанию наночастиц в воздухе (Малышева А.Г., 2008).

В то же время, превалируют сообщения, посвященные изучению свойств наноматериалов in vitro на уровне молекул (селективная адсорбция высокомолекулярных соединений, стабилизация и изменение с их помощью активности ферментов) и клеточных культур (выявление механизмов взаимодействия с клеточной мембраной, влияние на экспрессию отдельных генов) (Barua S. et al., 2013; Gomes S.I. et al., 2013).

Исследования эффектов различных наноматериалов на организменном уровне единичны и несистематизированы, практически отсутствуют работы по изучению влияния многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) на биосистемы, их фармакокинетике и фармакодинамике; не установлены четко органы-мишени, не описан генез изменений, происходящих при поступлении в организм наночастиц, механизмы развивающихся при этом компенсаторно-приспособительных реакций. В зарубежной научной литературе имеются лишь отдельные сообщения о воздействии МУНТ на репродуктивную функцию организма (Erna М. et al., 2010; Keelan J.A., 2011; Gao G. et al., 2012;), тогда как отечественные работы такого плана вообще отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось определение физиологических аспектов влияния углеродного наноструктурного материала (УНМ) «Таунит» (многостенных углеродных нанотрубок) на организм самок белых мышей и их потомство первого поколения при перораль-ном введении.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Оценить физиологические эффекты у самок белых мышей при введении различных доз УНМ «Таунит» (дозозависимый эффект).

2. Изучить структурно-функциональные изменения систем крови, выделительной, пищеварительной, сердечно-сосудистой и иммунной у белых мышей под воздействием многостенных углеродных нанотрубок.

3. Исследовать поведенческие реакции самок белых мышей и их потомства при пероральном поступлении многостенных углеродных нанотрубок.

4. Определить влияние УНМ «Таунит» на репродуктивную функцию самок белых мышей и показатели развития их потомства первой генерации.

5. Сравнить эффекты перорального поступления УНМ «Таунит» и углеродного наноматериала другой структуры.

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка физиологических эффектов УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в животный организм. Получены новые данные о состоянии внутренних органов и систем

организма; его функциональных и морфологических изменениях в условиях

длительного поступления МУНТ.

Выявлен дозозависимый эффект наноматериала «Таунит» при поступлении в организм белых мышей, проявлявшийся отклонениями массы внутренних органов; продемонстрированы реактивные изменения иммунной системы.

Впервые получены данные о влиянии УНМ «Таунит» на репродуктивную систему самок мышей, в частности, увеличении массы соответствующих органов (матки с яичниками), а также количества особей в приплоде, их мор-фометрических показателей; снижении смертности молодняка, числа неро-дивших самок и доли самцов в потомстве.

Показано отсутствие изменений в гамето- и эмбриогенезе белых мышей, постимплантационной гибели, развитии плодов и потомства первой генерации при поступлении в организм УНМ «Таунит».

Теоретическая н практическая значимость работы. Получены данные о развитии компенсаторно-приспособительных реакций и морфофунк-циональных аспектах взаимодействия наночастиц с органами и тканями белых мышей.

Результаты опытов могут быть использованы для дальнейшего совершенствования нормативной базы по работе с наноматериалами. Они расширяют существующие знания о воздействии на организм нанодисперсных материалов, позволяют совершенствовать подходы к гигиеническому нормированию при использовании этих веществ.

Представленные сведения позволяют разработать стратегию оптимизации действия наноразмерных веществ на животный организм.

По результатам исследования получен грант по проекту № 07-03/2012 «Состояние дисперсной фазы в водных суспензиях нанопорошков для разработки методик тестирования наноматериалов в физиологических жидкостях» в рамках проведения III Межвузовского конкурса исследовательских проектов (15.03.2012-15.11.2012 гг.); проект «Разработка инструкции по безопасному применению углеродного наноструктурного материала в качестве компонента дактилоскопических порошков для судебной медицины и криминалистики» получил поддержку ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» по программе «У.М.Н.И.К.» (2011-2013 гг.).

Информации, полученные в результате экспериментального исследования, используются в учебном процессе на кафедре физиологии ФГБОУ ВПО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина» при чтении лекций и проведении семинарских занятий. Разработан и внедрён факультативный курс лекций «Нанотехнологии и безопасность» в 10 классах

МОУ COIII № 30 г. Тамбова.

Методология и методы исследования. Методология исследования включала оценку физиологического влияния МУНТ на организм самок белых

мышей. Эксперименты проведены с соблюдением всех принципов доказательной медицины (рандомизация и формирование групп подопытных животных, обработка результатов методами вариационной статистики). Подробно методики описаны в разделе 3.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в организм мышей вызывает дозозависимые морфофункциональные изменения в сердечно-сосудистой, пищеварительной, выделительной и иммунной системах.

2. В условиях поступления УНМ «Таунит» в организм самок белой мыши на 14 сутки потенцируются процессы возбуждения, что проявляется в виде снижения порога эмоциональных реакций и увеличения количества локо-моций с последующим их восстановлением и угнетением общей двигательной активности к концу 45 суток потребления наноматериала.

3. При пероральном введении УНМ «Таунит» у самок белых мышей изменяется морфофункциональное состояние репродуктивной системы (увеличиваются масса репродуктивных органов (матки с яичниками), количество особей в приплоде, морфометрические показатели потомства; снижаются количество неродивших самок, смертность молодняка и доля самцов в помете). При этом эмбриогенез и постимплантационная гибель плодов не меняются.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов исследований определяется адекватным количеством биологических объектов, рандомизацией; корректным формированием групп экспериментальных животных и адекватными методами исследования; длительными сроками наблюдения и объективными методами вариационно-статистической обработки результатов экспериментов. Сформулированные выводы, положения и рекомендации аргументированы и логически вытекают из системного анализа результатов выполненной работы.

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред» (Тамбов, 2009); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2010); Ш-м Международном форуме по нанотех-нологиям Ки5папо1есЬ 2010, (Москва, 2010); 2-й Международной школе «На-номатериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наноме-дицина» (Московская обл., 2011); У-й Международной научно-практической конференции «Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред» (Тамбов, 2012); 17-й Международной Пущинской школе -конференции молодых ученых (Пущино, 2013).

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования РФ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Организация работы

Исследование проведено на базе кафедры физиологии, Центра медицинской экологии и нанотоксикологии и Научно-образовательного центра «На-нотехнологии и наноматериалы» ФГБОУ ВПО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина».

В течение всех этапов исследования были изучены показатели у 93 особей контрольной и 149 особей экспериментальной групп животных. Все мыши содержались в стандартных условиях (ГОСТ Р 50258-92). Карантин составлял 10 дней. У самок экспериментальной группы воду для поения заменяли заранее приготовленным коллоидным раствором УНМ «Таунит» различных концентраций. Животные контрольной группы получали питьевую воду.

1 этап работы был посвящен оценке дозозависимого эффекта УНМ «Таунит». Формировалось 4 экспериментальных и контрольная (п=10) группы животных. Дозировка УНМ «Таунит» составляла 1,2 мг/кг (п=10), 6 мг/кг (п=10), 30 мг/кг (п=10) и 150 мг/кг (п=10). Продолжительность эксперимента -65 дней. Оценивали динамику массы и длины тела, морфологические характеристики внутренних органов.

На 2 этапе концентрация УНМ «Таунит» составляла 450 мг/кг. Продолжительность эксперимента - 45 дней. У контрольной (п=15) и экспериментальной групп (п=15) оценивались общее состояние, метрические и весовые характеристики, состояние периферической крови, выделительная и поглотительная функции печени, поведенческие реакции, морфологические характеристики (макро- и микроскопическое исследование органов).

На следующем этапе работы изучали действие УНМ «Таунит» в концентрации 450 мг/кг на репродуктивную функцию самок (контроль п=20; эксперимент п=20) и развитие потомства первого поколения (контроль п=38; эксперимент п=64). Продолжительность эксперимента составляла 55 суток. В конце в нутриутробного периода оценивали пред- и постимплантационную смертность эмбрионов, степень развития органов и скелета, краниокаудаль-ный размер, массу тела и количество живых плодов. Показателями постна-тального развития потомства и репродуктивных функций самок служили: размер помета (плодовитость самок), доля неродивших самок, число живых и мертвых особей в потомстве, летальность (в течение 21 суток постнаталь-ного развития), масса тела, биологическое созревание (сроки отлипания ушных раковин, появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз), созревание сенсорно-двигательных рефлексов, поведенческие реакции, половой состав потомства.

На заключительном этапе работы проводили сравнение эффектов пе-рорапьного поступления УНМ «Таунит» и углеродного наноматериала дру-

гой структуры (сажа). Были сформированы 3 группы самок белой мыши: одна контрольная (п=10) и две экспериментальных (п=10). Для поения животных экспериментальной группы (№ 1) использовали 0,02 %-й коллоидный раствор УНМ «Таунит», в группе № 2 - 0,02 %-ю суспензию сажи (УНМ). Продолжительность эксперимента — 65 суток. Оценивались метрические и весовые характеристики, морфология внутренних органов.

2 Характеристика исследуемого материала

Объект исследования - углеродный наноматериал «Таунит» (многостенные углеродые нанотрубки), производимый в промышленных масштабах ООО «НаноТехЦентр» (г. Тамбов). Материал представляет собой одномерные, наномасштабные, нитевидные образования поликристаллического графита, цилиндрической формы с внутренним каналом, в виде сыпучего порошка черного цвета. Гидрофобен, химически инертен, чистота - более 98%. Гранулы УНМ микрометрических размеров имеют структуру спутанных пучков многостенных трубок (рисунок 1).

Рисунок 1 - Электронные микрофотографии углеродного наноструктурного материала «Таунит»

УНМ «Таунит» является перспективным материалом для авиационной, атомной и космической промышленности, медицины, фармацевтики, для производства суперкомпьютеров, видеотехники, плоских экранов, мониторов, фильтров широкого назначения (Ткачев А.Г., Золотухин И.В., 2007).

3 Методы исследования

Общее состояние подопытных животных оценивали по внешнему виду, поведенческим реакциям и интегральным показателям (потребление корма и воды).

Метрические измерения проводились с помощью штангенциркуля в миллиметрах и включали замеры общей длины тела самок, длину задней правой лапы, хвоста, головы.

Весовые измерения. Определяли массу тела белых мышей в начале, на каждые 7 сутки и в конце эксперимента, а после вскрытия - массу отдельных органов (сердца, легких, ЖКТ, селезенки, матки с яичниками, печени, почек, тимуса, щитовидной железы). Исследование проводили на медицинских электронных весах «Digital scale 300» (Китай) с точностью до тысячных долей грамма.

О состоянии периферической крови судили по количеству эритроцитов и лейкоцитов (подсчет в камере Горяева), тромбоцитов (подсчет в мазках крови, окрашенных бриллиантовым крезиловым синим), лейкограмме (подсчет в мазках крови, окра шенных по Романовскому-Гимзе), гемоглобина (измерение на гемоглобинометре ГФ-3, Санкт-Петербург), глюкозы (измерение на глюкометре «Accu Check Active», Roche Diagnostics GmbH, Швейцария) (Меньшиков В.В., 1987).

Функцию печени изучали по бромсульфалеиновой (БСФ) пробе (Израйлет Л.И., 1976).

Оценка влияния наноматериала на поведенческие реакции мышей была выполнена по спонтанной двигательной активности (на актометре «Ugo basile», Италия), порогу эмоциональных реакций, а также в тесте «открытое поле (Сперанский C.B., 1975; Буреш Я. и др., 1991).

Морфологические исследования. От животных всех групп были взяты образцы следующих органов: головной мозг, сердце, лимфатические узлы, селезенка, щитовидная и паращитовидная железы, тимус, надпочечники, гипофиз, желудок, тонкий и толстый кишечник, поджелудочная железа, печень, легкие, почки, яичники. Гистологический материал фиксировали в 10%-м формалине:, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Изучение эмбриогенеза. Показателями служили: пред- и постимплантацион-ная эмбриональная смертность, количество живых плодов, краниокаудальный размер, а также анатомические особенности развития (Оншценко Г.Г., 2007)

Изучение репродуктивной функции самок и постнатального развития потомства Fl генерации под влиянием УНМ «Таунит» проводили по выше описанным показателям (раздел 1. Организация работы).

4 Результаты собственных исследований 4.1 Дозозависимые эффекты УНМ «Таунит» на организм самок белых мышей

При поступлении в организм УНМ «Таунит» отмечаются дозозависимые изменения в динамике массы тела. Низкие дозы УНМ «Таунит» (1,2 мг/кг) оказывают угнетающий эффект, который наиболее выражено проявляется в снижении массы тела (на 7,7 %) на 28 сутки эксперимента (рисунок 2). Увеличение дозы УНМ «Таунит» до 150 мг/кг приводит к скачкообразному возрастанию данного показателя, который на 28 и 63 сутки экспозиции достигает максимальных значений (+6,0... +6,2 %) (р<0,05).

Рисунок 2 - Динамика среднегрупповых значений массы тела самок экспериментальных групп по сравнению с контрольной (в %)

Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) но сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.

Следует отметить, что 28-и суточная экспозиция является критической, что выражается в достоверном изменении показателей (р<0,05). Возможно к этому сроку УНМ «Таунит» аккумулируется в достаточном количестве в органах и тканях.

Оценка динамики длины тела выявила увеличение показателя, сходное у всех животных, при этом только в группе № 1 (УНМ «Таунит» 1,2 мг/кг) длина тела была ниже (на 0,23-0,34 см.) (р<0,05), чем в других группах (УНМ 6; 30 и 150 мг/кг), начиная с 28 суток и до окончания эксперимента.

В результате поступления в организм УНМ «Таунит» в различных концентрациях у самок белой мыши наблюдаются дозозависимые изменения показателей массы сердца (-8,99...+15,6 %) (р<0,01), ЖКТ (4,6...16,5 %) (р<0,05), печени (-13,9...+2 %) (р<0,05), почек (-14...+10%) (р<0,05), матки с яичниками (27,5...65,49%) (р<0,05...0,01) в виде снижения массы органов при малых концентрациях (1,2 мг/кг) и ее увеличении при максимальных дозах вещества (150 мг/кг) по сравнению с контрольной группой. Обратная зависимость наблюдается в отношении селезенки, масса которой уменьшается, по мере возрастания дозы УНМ «Таунит» (-6,8...-19,45 %) (р<0,01).

4.2 Анатомо-морфологические изменения у белых мышей при воздействии УНМ «Таунит»

Для дальнейшего исследования эффектов УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в организм самок белых мышей нами использовалась дозировка 450 мг/кг, исходя из предварительных экспериментов на других тест-объектах, результатов, полученных на 1 этапе работы и литературных данных о подобных

опытах (Гусев А.А, 2009; Горшенёва Е.Б, 2011; Убогов А.Ю., 2011). Исследование показало, что суточное потребление сухого корма и воды подопытными животными при поступлении в организм УНМ «Таунит» (450 мг/кг) не отличалось от показателей контрольной группы (р>0,05).

На момент окончания эксперимента у подопытных самок показатели длины хвоста (87,3± 1,42 мм), туловища (60,0+2,5 мм), головы (28,9+1,2 мм), тела (89,0+3,7 мм) и задней правой лапы (16,3±0,3) не отличались от соответствующих характеристик (хвост - 82,2+0,7 мм; туловище - 59,3±1,4 мм; голова - 28,7±0,4 мм; тело - 88,4+1,5 мм; задняя правая лапа - 16,2+0,1 мм) контрольных животных (р>0,05). Е> то же время, среднегрупповые показатели массы тела самок белых мышей в момент окончания эксперимента имели межгрупповые отличия: в экспериментальной группе она составляла 26,73+1,16 г., а в контрольной группе была ниже - 23,99±0,63 г. (р<0,05). Отмеченное значимое (на 2,7 г.) повышение массы тела само!; белых мышей в условиях поступления в организм УНМ «Таунит» (450 мг/кг), обусловлено, как показали дальнейшие исследования, увеличением массы внутренних органов экспериментальных животных. На рисунке 3 продемонстрировано, что в опытной группе выше, чем в контрольной масса тела (+12,8 %, р<0,05), сердца (+28,6 %, р<0,01), ЖКТ (+31,2 %, р<0,05), почек (+20 %, р<0,05) и репродуктивных органов (матки с яичниками) (+65,7 %, р<0,001). Однако, у экспериментальных животных масса селезёнки оказалась значительно снижена (на 45,8 %) (р<0,01).

8,7 "" селезенка

матка с яичниками Е печень почка тимус в: щитовид.железа

Рисунок 3 - Среднегрупповые характеристики массы тела и внутренних органов мышей экспериментальной группы по отношению к контрольной (%)

Примечание: * - различия достоверны р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.

При микроскопическом исследовании внутренних органов мышей, которые получали МУНТ, наибольшие изменения были обнаружены в ткани печени. У всех мышей получавших УНМ «Таунит» с питьевой водой отмечалась инфильтрация печёночной паренхимы, чего не наблюдалось в контрольной группе животных. Так, при концентрации УНМ «Таунит» в растворе 0,3 % (450 мг/кг) наблюдалась очаговая инфильтрация портальных трактов лимфоидными клетками в количестве до 200-250 клеток (рисунок 4). Учитывая высокие компенсаторные возможности печени, можно сделать вывод о достаточно выраженном действии УНМ «Таунита» в отношении ткани данного органа.

А Б

Рисунок 4 - Микропрепарат печени самки белой мыши при поступлении УНМ «Таунит»

Примечание: А - экспериментальная группа; Б - контрольная группа.

Микроскопическое исследование яичников показало, что у всех самок в контрольной и экспериментальной группах в корковом веществе яичников хорошо визуализируются группы примордиальных фолликулов, многочисленные растущие фолликулы, а также единичные граафовы пузырьки и атре-тические тела. Тека-клетки крупные, со светлой цитоплазмой, формируют скопления с нечеткими очертаниями. Таким образом, поступление УНМ «Таунит» в организм подопытных животных не приводило к изменениям в отношении гаметогенеза.

Также, у самок подопытной группы наблюдались умеренные или слабо выраженные изменения в виде венозного полнокровия. У всех мышей экспериментальной группы отмечены реактивные изменения иммунных органов (макрофагальная реакция фолликулов и синусов лимфоузлов, селезенки и коркового слоя тимуса, стертость границ между корковым и мозговым слоями в тимусе, размытость контуров фолликулов селезенки (рисунок 5)).

Рисунок 5 - Микропрепарат селезенки самки белой мыши при поступлении УНМ «Таунит» (стрелкой обозначен лимфатический фолликул с реактивным центром, окраска гематоксилином и эозином, х 60)

Примечание: А - экспериментальная группа; Б - контрольная группа.

4.3 Состояние периферической крови и печени мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит»

В периферической крови мышей не изменялось большинство оцениваемых показателей - количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина (р>0,05). Отмечались изменения в лейкоцитарной формуле в сторону повышения уровня лимфоцитов на 5,9% (р<0,01) и нейтрофильный сдвиг в сторону снижения количества сегментоядерных форм на 5,1 % (р<0,01) в экспериментальной группе мышей по сравнению с соответствующими показателями в контроле (таблица 1).

Таблица 1 - Показатели лейкоцитарной формулы при поступлении в организм мышей УНМ «Таунит» (через 45 суток) (М±т)

Группа животных Нейтрофилы, % Лимфоциты % Моноциты % Эозинофилы, %

п/я с/я

Экспериментальная (п=15) УНМ «Таунит» 450 мг/кг 5,2±0,08 30,9±3,72* 63,6±4,22* 0,3±0,13 0

Контрольная (п=15) 5,3±0,09 35,0±3,10 57,7±3,48 0,21 ±0,03 0

Примечание: * - различия достоверны (р<0,01) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.

Исследование функции печени подопытных мышей с помощью пробы с бромсульфалеином (БСФ) показало, что поступление УНМ «Таунит» (450 мг/кг) в организм не влияло на выделительно-поглотительную и бело-ксинтезирующую функции печени подопытных животных (р>0,05).

Одним из параметров при оценке состояния поджелудочной железы является уровень глюкозы в пуле сыворотки крови. Полученные результаты свидетельствуют, что данный показатель не отличался у контрольных (5,74±0,29 ммоль/л) и экспериментальных самок (5,93±0,32 ммоль/л) (р>0,05), тем не менее, наблюдалась тенденция к повышению уровня глюкозы у мышей подопытной группы на 14 сутки и в конце эксперимента.

4.4 Влияние УНМ «Тауиит» на поведенческие реакции белых мышей

Поступление УНМ «Таунит» в течение 2 недель в организм мышей приводит к повышению спонтанной двигательной активности, что проявляется увеличением количества локомоций в экспериментальной группе самок на 32,6 % (р<0,01), по сравнению с животными контрольной группы (таблица 2).

Также отмечалось снижение порога эмоциональных реакций на 26,4 % (р<0,05), что потенцирует процессы возбуждения в нервной системе подопытных животных (таблица 3).

Таблица 2 - Влияние поступления в организм мышей УНМ «Таунит» на спонтанную двигательную активность животных (М ± ш)

Группа животных Количество локомоций, усл.ед.

До начала эксперимента Через 14 суток Через 45 суток

Экспериментальная (УНМ «Таунит» 450 мг/кг) (п=15) 222,4±11,0 298,10±10,4* 204,70±12,8

Контрольная (п=15) 206,7±13,4 201,13±9,6 212,50±8,3

Примечание: * - различия достоверны (р<0,01) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.

Таблица 3 - Влияние поступления в организм мышей УНМ «Таунит» на порог эмоциональных реакций (М ± ш)

Группа животных Порог эмоциональных реакций, Вольт

До начала эксперимента Через 14 суток Через 45 суток

Экспериментальная (УМН «Таунит» 450 мг/кг) (п=15) 12,4±0,8 8,9±0,4* 13,7*0,4

Контрольная (п=15) 13,9±0,9 12,1±0,5 12,0±0,9

Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.

К концу эксперимента (45 сутки) количество локомоций и порог эмоциональных реакций у мышей подопытной группы не отличались от контроля (р>0,05), но прослеживалась тенденция к их изменению в сторону угнетения спонтанной двигательной активности и возбудимости.

При оценке показателей теста «открытое поле» было установлено, что поступление в организм УНМ «Таунит» существенно не изменяет поведение мышей, однако через 45 суток его потребления наблюдается снижение общей двигательной активности на 16% (р<0,05) и тенденция к снижению показателей исследовательского поведения.

4.5 Особенности репродуктивной функции самок белых мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит»

Исследования показали, что в контрольной группе самок количество молодняка в потомстве (6,0±0,15 шт.) было меньше, чем в экспериментальной (9,3±0,14 шт.) (р<0,05). При оценке репродуктивной функции обращал на себя внимание низкий уровень смертности в помете подопытных животных. Таким образом, доля гибели молодняка в приплоде экспериментальных самок (15%) оказалась ниже, чем данный показатель в контроле (27%) (р<0,05). Количество неродивших особей у животных контрольной группы составляло 40 %, у экспериментальной - 33 %. Можно предположить, что эффект действия УНМ «Таунит», поступающего во время беременности и периода молочного вскармливания, выражается в снижении смертности молодняка в течение первых 21 суток постнатального развития и тенденции к повышению частоты наступления беременности.

На рисунке 6 представлен половой состав потомства первого поколения самок белых мышей. Отмечено снижение доли самцов в приплоде экспериментальной группы по сравнению с контрольной на 19 % (р<0,05).

Самцы

Самки

40%

Самцы

Самки

Рисунок 6 - Распределение потомства белых мышей по полу Примечание: А - экспериментальная группа; Б - контрольная группа; * - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.

В целом результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что при поступлении в организм белых мышей УНМ «Таунит» уменьшается количество неродивших самок, снижается смертность молодняка, также воз-

растает количество особей в приплоде, их весоростовые показатели. Кроме того, возможно, влияние УНМ «Таунит» на репродуктивную функцию мышей, проявляющееся увеличением в потомстве доли самок, является индикатором воздействия среды обитания (Геодакян В.А., 1974).

При воздействии МУНТ на самок белых мышей не выявлено значимых отличий в эмбриогенезе в сравнении с контрольной группой. Пред- и пост-имплантационная смертность у экспериментальных и контрольных самок не отличалась (р>0,05). Однако в подопытной группе можно отметить тенденцию к увеличению количества живых плодов (7,9±0,3), по сравнению с контролем (6,9±0,2), что согласуется с полученными ранее данными при изучении плодовитости экспериментальных самок (9,3±0,14*).

Внешне плоды выглядели одинаково, у всех имелись правильно сформированные голова, туловище, конечности и хвост, отклонения в развитии отсутствовали. При изучении состояния окрашенных ализарином скелетов видимых изменений развития и различий между плодами, изъятыми от мышей различных групп, не обнаружено. Точки окостенения костей запястья и плюсны видны в виде симметрично расположенных ядер, в количестве 9,26±1,4 у плодов контрольной группы и 10,0± 1,6 - экспериментальной группы (р>0,05).

Таким образом, можно констатировать, что УНМ «Таунит» не влияет на эмбриогенез; не вызывает постимплантационной гибели, задержки развития плодов, анатомических изменений, в том числе костной системы.

Изучение влияний УНМ «Таунит» на постнатапьное развитие потомства первой генерации проводили на мышатах, родившихся от самок контрольной и экспериментальной групп. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4 — Физическое развитие потомства мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит» (М±т)___

Показ агтели Контрольная группа (п=38) Экспериментальная группа (УНМ «Таунит» 450 мг/кг) (п=64)

Всего мышат в группе, шт. 38 64

Число живых новорожденных, % 100 100

Число мертвых новорож-х, % 0 0

Средний размер помета, шт. 6,0±0,!5 9Д±0,14*

Средний срок отлипания ушей, сут. 2,17±0,28 2,14±0,24

Средний срок появления первичного волосяного покрова, сут. 5,17±0,56 5,29±0,61

Средний срок прорезывания резцов, сут. 10,50±0,50 10,57±0,61

Средний срок открытия глаз, сут. 14,83±0,83 14,29±0,61

Постнатальная гибель молодняка (в течение 21 сут.), % 27 15*

Кол-во самок в потомстве, % 35 59*

Кол-во самцов в потомстве, % 65 41*

Примечание: * — различия достоверны (р<0,05) относительно показателя контрольной группы.

Наблюдения за физическим развитием потомства мышей обеих групп в течение 21 суток позволило заключить, что по числу живых и мертвых новорожденных, сроку отлипания ушей, прорезывания резцов, открытия глаз и появления первичного волосяного покрова отличий не наблюдалось (р>0,05).

Отмечены различия по среднему размеру помета, гибели молодняка, количеству самок и самцов в приплоде (р<0,05) (таблица 4). Такие «качественные» тесты, как «избегание обрыва», «реакция на акустический стимул» и «переворачивание в свободном падении» продемонстрировали, что в обеих группах потомства данные рефлексы сформировались у всех мышат вовремя, на 9, 13 и 20 сутки соответственно, различий между экспериментальными и контрольными животными не наблюдалось.

Таким образом, УНМ «Таунит» при поступлении в организм самок мышей во время беременности и в период молочного вскармливания потомства не влиял отрицательно на физическое развитие, сроки созревания сенсорно-двигательных рефлексов и эмоционально-двигательное поведение потомства первой генерации.

При наблюдении за постнатальным развитием мышат экспериментальной группы с 5 по 23 сутки отмечался быстрый набор массы тела (рисунок 7).

Рисунок 7 - Среднегрупповые характеристики динамики массы тела у потомства самок контрольной и экспериментальной групп

Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.

К концу 3 недели постнатального развития метрические показатели потомства экспериментальных животных (длина хвоста - 59,8±1,5 мм.; туловища -37,9±2,0 мм.; головы - 22,5±1,1 мм. и задней правой лапы - 16,5±0,4 мм.)

не отличались от параметров в контроле (хвост - 53,9±2,8 мм.; туловище -30,9±1,9 мм.; голова - 21,1±1,3 мм.; задняя правая лапа - 14,5±1,0 мм.). Однако показатель общей длины тела у потомства подопытной группы (60,4±1,3 мм.) по сравнению с контрольной (52,0±1,5 мм.) был выше (р<0,05). По достижению половозрелого возраста мышей умерщвляли, после чего проводилось морфологическое исследование внутренних органов. В потомстве самок экспериментальной группы показано увеличение массы тела (37,3 %) и всех исследуемых органов, а именно: сердца (на 30,1 %), легких (на 53,2%), ЖКТ (на 33,3 %), селезёнки (20,0 %), печени (на 29,0 %), почек (на 40,3 %), тимуса (на 57,3 %), семенников (на 53,8 %), матки с яичниками (на 61,9 %) (р<0,05... 0,001).

Таким образом, УНМ «Таунит» (450 мг/кг), поступая в организм на стадии его формирования и развития, приводит к увеличению массы и длины тела, а также внутренних органов. К тому же, морфофункциональные изменения у потомства экспериментальной группы оказались более выраженными, по сравнению с эффектами у самок, в организм которых УНМ «Таунит» поступал уже в половозрелом возрасте, как было показано ранее (рисунок 3).

4.6 Сравнительная оценка биоэффектов УНМ «Таунит» и углеродного наноматериала другой структуры

При оценке динамики массы тела у исследуемых групп животных было отмечено, что на 56 и 63 сутки эксперимента масса тела в опытной группе № 2 (УНМ сажа) увеличилась на 1,15 г. и 1,23 г. относительно контроля и на 1,55 и 2,28 г. по отношению к группе № 1 (УНМ «Таунит») (р<0,05). Таким образом, можно сделать вывод, что УНМ (сажа) оказывает более выраженный эффект в отношении показателей массы тела и ее динамики по сравнению с УНМ «Таунит», вводимым в аналогичной концентрации (0,02 %).

При изучении показателей массы внутренних органов у животных группы № 1 было показано увеличение массы ЖКТ (р<0,05) и матки с яичниками (р<0,01) на 16,5 и 65,49% соответственно, также наблюдалась тенденция к повышению массы легких, печени, сердца и тела по сравнению с контролем, Оценка изменений в группе № 2 (УНМ сажа) показала повышение массы тела (на 8,94 %) (р<0,01) и всех внутренних органов, наиболее выраженное в отношении легких (на 17,18 %), ЖКТ (на 13,21 %), матки с яичниками (на 26,78 %), по сравнению с контрольной группой животных (р<0,05...0,01) (рисунок 8). Это свидетельствует о том, что наночастицы сажи оказывают более сильный эффект на экспериментальных животных, по сравнению с УНМ «Таунит», вводимым в аналогичной дозировке.

26,78*

УНМ сажа

■ тело матка с яичниками сердце легкие ЖКТ селезенка печень почка(лев) почка(прав)

Рисунок 8 - Среднегрупповые характеристики массы тела и внутренних органов мышей экспериментальной группы № 2 по отношению к контрольной группе (%)

Примечание: * - различия достоверны р<0,05; ** - р<0,01 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами выполнены исследования по изучению физиологических аспектов влияния УНМ «Таунит» на организм самок белых мышей и развитие их потомства первого поколения. Цель достигнута, поставленные задачи решены, по итогам можно сделать следующие выводы:

1. Поступление в организм белых мышей УНМ «Таунит» сопровождается дозозависимым эффектом, проявляющимся снижением массы сердца (на 8,9 %), печени (на 13,9 %) и почек (на 14,0 %) (р<0,05) при поступлении малых доз УНМ «Таунит» (1,2 мг/кг) и увеличением массы тела (на 12,8 %), желудочно-кишечного тракта (на 31,2%), почек (на 20,0%), матки с яичниками (на 65,7%) и сердца (на 28,6%) (р<0,05...0,001) у животных получавших наноматериал в дозировке 450 мг/кг. В то же время, обратная зависимость наблюдается в отношении селезёнки, масса которой уменьшается по мере увеличения дозировки УНМ «Таунит» (на 45,8 %) (р<0,01 %) что, видимо, обусловлено предшествующей длительной активацией иммунной системы и развитием в дальнейшем гипотрофии органа.

2. У мышей, получавших УНМ «Таунит» в дозировке 450 мг/кг в течение 45 суток наблюдается инфильтрация печёночной паренхимы, а также умеренная или слабая формы венозного полнокровия. У всех подопытных мышей отмечаются реактивные изменения в иммунных органах.

3. В условиях поступления УНМ «Таунит» в организм самок белых мышей увеличивается количества лимфоцитов (на 5,9%) и снижается содержание сегментоядерных нейтрофилов (на 5,1 %) (р<0,01).

4. При поступлении в организм самок белых мышей УНМ «Таунит» в дозировке 450 мг/кг в течение 14 суток происходит увеличение показателей спонтанной двигательной активности на 32,6% (р<0,01), снижение порога эмоциональных реакций на 26,4% (р<0,05), что косвенно потенциирует процессы возбуждения в нервной системе подопытных животных. На 45 сутки введения наноматериала поведенческие реакции возвращаются к исходному уровню. Более того, тенденция нарастает и происходит угнетение общей двигательной активности самок на 16 % (р<0,05).

5. УНМ «Таунит» влияет на репродуктивную систему мышей, а именно, уменьшаются количество неродивших самок на 7 %, смертность молодняка на 12% (р<0,05) и доля самцов в потомстве первой генерации на 19% (р<0,05); возрастают количество особей в приплоде (плодовитость) на 34,4 % (р<0,05) и величины их морфометрических показателей.

6. МУНТ не влияет на гамето- и эмбриогенез (на постимплантационную гибель, формирование анатомических структур, в том числе костной системы, у плодов первого поколения).

7. УНМ «Таунит» при поступлении в организм самок мышей во время беременности не влияет на физическое развитие (средний срок отлипания ушей, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, открытия глаз), сроки созревания сенсорно-двигательных рефлексов (отрицательный геотаксис, маятниковый рефлекс, переворачивание на плоскости, обонятельный рефлекс, избегание обрыва, реакция на акустический стимул и переворачивание в свободном падении) и поведенческие реакции (спонтанная двигательная активность, горизонтальная и вертикальная активность, груминг, норки) потомства первого поколения.

8. УНМ «Таунит» оказывают менее выраженный эффект на организм белых мышей по сравнению с УНМ (сажа), имеющим другую наноструктуру и вызывающим значительное возрастание массы тела (на 8,9 %), легких (на 17,2 %), ЖКТ (на 13,2 %), матки с яичниками (на 26,8 %) (р<0,05...0,01).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Данные о влиянии УНМ «Таунит» целесообразно использовать при разработке норм содержания углеродных наноматериалов в средах, контактирующих с животными и человеком, а также при создании на основе многостенных углеродных нанотрубок лекарственных препаратов нового поколения.

2. С учётом представленного экспериментального материала, рекомендуется разработать систему мероприятий по контролю за состоянием здоро-

вья женских особей репродуктивного возраста, контактирующих с материалами на основе углеродных нанотрубок.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гусев, А. А. Влияние углеродных нанотрубок на ранние стадии онтогенеза мышей (Mus Domestica Linnaeus, 1758) / А.А. Гусев, А.В. Емельянов, С.В. Шутова, А.Г. Ткачев, А.П. Поздняков, Э.М. Османов, А.В. Зрютина, Е.Б. Папина // Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред / Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Тамбов, 2009. - С. 78-79.

2. Гусев, А.А. Влияние углеродного наноструктурного материала на мышей / А.А. Гусев, С.В. Шутова, А.П. Поздняков, Э.М. Османов, А.Г. Ткачев, А.В. Емельянов, А.В. Зрютина, Е.Б. Панина, И.А. Полякова // Биология -наука XXI века / Материалы 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2010. - С. 24.

3. Гусев, А.А. Исследование репродуктивной токсичности многостенных углеродных нанотрубок на лабораторных мышах / А.А. Гусев, Э.А. Сне-гин, И.А. Полякова, Е.Б. Горшенёва, А.Г. Ткачев, А.В. Емельянов, С.В. Шутова, О.Н. Зайцева, А.В. Шуклинов, А.В. Федоров, Т.В. Васильева // Rusnanotech 2010 / Материалы III Международного форума по нанотехноло-гиям.-М., 2010.-С. 98.

4. Гусев, А.А. Половые различия физиологического эффекта углеродного наноструктурного материала — перспективного носителя лекарственных препаратов в эксперименте на лабораторных мышах / А.А. Гусев, И.А. Полякова, Е.Б. Горшенёва, А.Г. Ткачев, А.В. Емельянов, С.В. Шутова, О.Н. Зайцева, А.В. Федоров, Т.В. Васильева // Научные ведомости Белогородского государственного университета. Серия: Естественные науки. — Белгород, 2010. -Т. 21. — № 13.-С. 107-112.*

5. Гусев, А.А. Предварительные результаты комплексного биотестирования углеродного наноматериала - перспективного носителя лекарственных препаратов / А.А. Гусев, О.Н. Зайцева, И.А. Полякова, Е.Б. Горшенёва // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. - Тамбов, 2010. — Т. 15.-№ 5.-С. 1538-1541.*

6. Горшенёва, Е.Б. Углеродный наноструктурный материал - перспективный вектор доставки лекарственных препаратов меняет некоторые функциональные показатели самок Mus musculus L. при пероральном введении / Е.Б. Горшенёва, А.А. Гусев, С.В. Шутова, А.В. Емельянов, А.Г. Ткачев // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки.-Тамбов, 2011.-Т. 16.-№ 1.-С. 273-277.*

7. Горшенёва, Е.Б. Влияние углеродных нанотрубок на репродуктивные функции самок лабораторной мыши и постнатальный период развития её потомства / Е.Б. Горшенёва, A.A. Гусев, А.Г. Ткачёв // Наноматериалы и на-нотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина / Материалы 2-й Международной школы. - М., 2011. - С. 69-70.

8. Убогов, А.Ю. Углеродные нанотрубки как фактор развития воспалительного процесса в печени мышей / А.Ю. Убогов, И.А. Полякова, A.A. Гусев, Е.Б. Горшенёва, А.Г. Ткачев // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. — Тамбов, 2011. - Т. 16. - № 5 — С. 1338-1343.*

9. Горшенёва, Е.Б. Влияние углеродного наноструктурного материала на репродуктивные функции самок мыши при пероральном введении / Е.Б. Горшенёва, A.A. Гусев, А.Г. Ткачев // Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред / Материалы V Международной (очной) научно-практической конференции. - Тамбов, 2012. - С. 89-91.

10. Горшенёва, Е.Б. Влияние углеродного наноматериала на морфо-функциональные показатели самок лабораторной маши при пероральном введении / Е.Б. Горшенёва, A.A. Гусев И Материалы 17-й Международной Пущинской школы - конференции молодых ученых. - Пущино, 2013. -С. 407-408.

11. Gusev, A.A. Reproductive toxicity of carbon nanostructured material -a promising carrier of drugs in laboratory mice / A.A. Gusev, E.A. Snegin, I.A. Po-lyakova, E.B. Gorsheneva, A.G. Tkachev, A.V. Emeliyanov, S.V. Shutova, O.N. Zayceva, A.V. Shuklinov, A.V. Fedorov, T.V. Vasilieva, E.A. Smirnova, E.M. Lazareva, G.E. Onishenko // Journal of Physics: Conference Series. - 2011. -T. 291. — № l.-P. 1-9.

12. Горшенёва, Е.Б. Дозозависимый эффект многостенных углеродных нанотрубок и частиц сажи при пероральном введении лабораторным мышам / Е.Б. Горшенёва // Нанотехнологии и охрана здоровья. - М., 2014 - № 1. — С. 48-55.*

* Публикации в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.

Подписано в печать 22.05.2014 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,28. Тираж 100 экз. Заказ № 1222. Бесплатно.

Издательский дом ТГУ имени Г.Р. Державина. 392008, Тамбов, ул. Советская, 190г. Отпечатано в типографии Издательского дома ТГУ имени Г.Р. Державина

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горшенёва, Екатерина Борисовна, Тамбов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина»

На правах рукописи

0^201460434

ГОРШЕНЕВА ЕКАТЕРИНА БОРИСОВНА

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЛИЯНИЯ УГЛЕРОДНОГО НАНОСТРУКТУРНОГО МАТЕРИАЛА «ТАУНИТ» НА ОРГАНИЗМ САМОК БЕЛЫХ МЫШЕЙ И ИХ ПОТОМСТВО

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -Османов Эседулла Маллаалиевич доктор медицинских наук, профессор

Тамбов-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

1. ВВЕДЕНИЕ......................................................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................12

2.1. Общие сведения о наноматериалах.....................................................12

2.2. Оценка воздействия нанотехнологий и наноматериалов на

биообъекты окружающей среды................................................................18

2.3. Характеристика влияния наноматериалов на животный организм...............24

2.3.1. Пути проникновения в организм и основные механизмы

действия наночастиц.............................................................................24

2.3.2. Влияние отдельных наноматериалов на ткани и органы..........................30

2.3.2.1. Особенности эффектов на организм углеродных наноматериалов..........35

2.3.2.2. Воздействие наноматериалов на репродуктивную систему...................40

3. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.................................................46

3.1. Организация работы.........................................................................46

3.2. Характеристика исследуемого материала................................................49

3.3. Методы исследования........................................................................50

3.4. Методы вариационно-статистического анализа полученных данных............55

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ................................56

4.1. Дозозависимые эффекты УНМ «Таунит» на организм самок белых мышей...56

4.2. Анатомо-морфологические изменения у белых мышей при воздействии УНМ «Таунит»....................................................................................70

4.2.1. Морфометрические показатели тела....................................................70

4.2.2. Гистологическая картина паренхиматозных органов..............................73

4.3. Состояние периферической крови и печени мышей при поступлении

в организм УНМ «Таунит».....................................................................78

Стр.

4.4. Влияние УНМ «Таунит» на поведенческие реакции белых мышей.................81

4.5. Особенности репродуктивной функции самок белых мышей

при поступлении в организм УНМ «Таунит»...............................................84

4.6. Постнатальное развитие потомства первой генерации белых мышей, подвергшихся воздействию УНМ «Таунит»..............................................89

4.7. Сравнительная оценка биоэффектов УНМ «Таунит» и углеродного

наноматериала другой структуры............................................................96

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................99

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................112

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ....................................................114

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................115

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................116

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Развитие нанотехнологий и создание наноматериалов, являясь важнейшим направлением научно-технического прогресса будущего, в то же время ставит вопрос их взаимодействия с живым организмом. В течение последних десятилетий создано более 2000 разновидностей наноматериалов, в связи с чем возросла возможность воздействия наночастиц на животных, человека и окружающую среду (Powers, K.W. Characterization of nanoscale particles for toxicological evaluation / K.W. Powers, S.C. Brown // Toxicol. Science. - 2006. - Vol. 90, N 2. - P. 296-303; Гусев, A.A. Оценка воздействия наносодержащего материала «Таунит» на живые системы / А.А.Гусев, A.B. Емельянов, А.Г. Ткачев и др. // Сборник материалов 8-ой Международной научно-практической конференции «Экология и безопасность жизнедеятельности» - Пенза, 2008. - С. 28-29; Пиотровский, Л.Б. Будьте осторожны — следующая остановка «НАНО ЭРА» или проблема токсичности наночастиц / Л.Б. Пиотровский // Экологический вестник России. - 2008. - № 11. - С. 31). Такие антропогенные источники, как металлургическая, цементная промышленность; сгорание каменного угля, полимерных соединений, нефти, газа, дизельного топлива и другие процессы значительно увеличили содержание наночастиц в окружающей среде (Sahoo, S.K. The present and future of nanotechnology in human health care / S.K. Sahoo, S. Parveen, J.J. Panda // Nanomedicine: Nanotechnology in human health care. - 2007. - Vol.3. - P. 20-31; Иншаков, O.B. Государственная политика развития нанотехнологий: российский и зарубежный опыт / О.В. Иншаков, A.B. Фесюн. - Волгоград: Изд-во ВолГУ, 2009. - 48 е.). В процессе производства наноматериалов, их транспортировки, производственных процессах, ремонте, а также утилизации объектов, содержащих наночастицы, все чаще имеет место контакт и воздействие наноматериалов на животный организм.

Общепризнано, что изменения физических свойств вещества при переходе в форму наночастиц закономерно сопровождаются изменениями его биологических эффектов. В частности, установлена существенная задержка наночастиц в легких, поскольку из-за малых размеров этих частиц, механизмы выведения их респираторной системой организма неэффективны. Показана способность наночастиц проникать через легкие в другие системы и проходить кожные барьеры; наличие у них так называемого «воспалительного потенциала» (Русаков, Н. В. Эколого-гигиенические проблемы отходов наноматериалов / Н. В. Русаков // Гигиена и санитария. - 2008. - № 6. - С. 20-21; Takeda, К. Health effects of nanomaterials on next generation / K. Takeda, Y. Shinkai, K. Suzuki et al. // Yakugaku Zasshi. - 2011. - Vol.131, N 2. - P. 229-236). Небольшие размеры и разнообразие их форм способствуют связыванию с нуклеиновыми кислотами и белками; встраиванию в мембраны клеток, изменяя функции биоструктур (Miyawaki, J. Toxicity of Single-Walled Carbon Nanohorns / J. Miyawaki, M. Yudasaka, T. Azami et al. // Acsnano. - 2008. - Vol.2. - P. 213-226; Сычева, Л. П. Оценка мутагенных свойств наноматериалов / Л.П. Сычева // Гигиена и санитария. - 2008. - № 6. - С. 26-28; Gomes, S.I. Mechanisms of response to silver nanoparticles on Enchytraeus albidus (Oligochaeta): Survival, reproduction and gene expression profile / S.I. Gomes, A.M. Soares, J.J. Scott-Fordsmand, M.J. Amorim // Hazard Mater. - 2013. - Vol.15. - P. 254-255). Наличие у многих наноматериалов гидрофобных свойств и электрического заряда усиливает как процессы адсорбции на них различных веществ, так и способность проникать через барьеры организма. Важным свойством наночастиц является повышенная способность к аккумуляции, поскольку вследствие малых размеров эти вещества могут не распознаваться защитными системами организма, и, следовательно, не подвергаться биотрансформации (Cedervall, Т. Detailed identification of plasma proteins adsorbed on copolymer nanoparticles / T. Cedervall, I. Lynch, T. Berggard // Angew Chem. Int. Ed. Engl. - 2007. - Vol. 46, N 30. - P. 5754-5756; Hooper, H.L. Comparative chronic toxicity of nanoparticulate and ionic zinc to the earthworm Eisenia

veneta in a soil matrix / L.H. Hooper, K. Jurkschat, A.J. Morgan et al. // Environ. Int. -2011.-Vol. 37, N6. -P. 1111-1117).

Перечисленное свидетельствует о высокой актуальности изучения влияния наноматериалов, в том числе углеродных, на животный организм с оценкой состояния различных органов и систем, в частности, репродуктивной.

Степень разработанности темы. В настоящее время усилия исследователей сосредоточены преимущественно на изучении начальных этапов процесса взаимодействия животного организма с наночастицами: идентификации и характеристике последних на основе биологических и фармакологических эффектов, полученных на моделях животных. Изучаются пути проникновения наночастиц в организм - респираторный, чрескожный, пероральный; критические органы-мишени (легкие, кожа, сердечно-сосудистая и нервная системы); оценивается влияние наноматериалов на физиологическое состояние и исследуются специфические механизмы действия некоторых наночастиц (Радилов, A.C. Экспериментальная оценка токсичности и опасности наноразмерных материалов / A.C. Радилов, A.B. Глушкова, С.А. Дулов // Нанотехнологии. Экология. Производство. - 2009. - № 1. - С. 86-88; Lim, D. Oxidative stress-related РМК-1 Р38 МАРК activation as a mechanism for toxicity of silvernanoparticles to reproduction in the nematode Caenorhabditis elegans / D. Lim, J.Y. Roh, H.J. Eom et al. // Environ. Toxicol. Chem. - 2012. - Vol. 31, N 3. - P. 585592). Ведутся работы по обоснованию и разработке санитарно-гигиенических требований к содержанию наночастиц в воздухе (Малышева, А.Г. Проблемы химико-аналитических исследований при гигиенической оценке наноматериалов и нанотехнологий / А. Г. Малышева // Гигиена и санитария. - 2008. - № 6. — С. 16-20).

В то же время, превалируют сообщения, посвященные изучению свойств наноматериалов in vitro на уровне молекул (селективная адсорбция высокомолекулярных соединений, стабилизация и изменение с их помощью активности ферментов) и клеточных культур (выявление механизмов взаимодействия с клеточной мембраной, влияние на экспрессию отдельных генов)

(Barua, S. Non-hazardous anticancerous and antibacterial colloidal 'green' silver nanoparticles / S. Barua, R. Konwarh, S. Bhattacharya et al. // Colloids Surf. В Biointerfaces. - 2013. - Vol. 105. - P. 37-42; Gomes, S.I. Mechanisms of response to silver nanoparticles on Enchytraeus albidus (Oligochaeta): Survival, reproduction and gene expression profile / S.I. Gomes, A.M. Soares, J.J. Scott-Fordsmand, M.J. Amorim // HazardMater. -2013.-Vol. 15. - P. 254-255).

Исследования эффектов различных наноматериалов на организменном уровне единичны и несистематизированы, практически отсутствуют работы по изучению влияния многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) на биосистемы, их фармакокинетике и фармакодинамике; не установлены четко органы-мишени, не описан генез изменений, происходящих при поступлении в организм наночастиц, механизмы развивающихся при этом компенсаторно-приспособительных реакций. В зарубежной научной литературе имеются лишь отдельные сообщения о воздействии МУНТ на репродуктивную функцию организма (Ema, М. Reproductive and developmental toxicity studies of manufactured nanomaterials / M. Ema, N. Kobayashi, M. Naya et al. // Reprod. Toxicol. - 2010. -Vol. 30, N 3. - P. 343-352; Keelan, J.A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta / J.A. Keelan // Nat. Nanotechnol. - 2011. - Vol. 6, N 5. - P. 263-264; Gao, G. Ovarian dysfunction and gene-expressed characteristics of female mice caused by long-term exposure to titanium dioxide nanoparticles / G. Gao, Y. Ze, B. Li et al. // J. Hazard Mater. - 2012. - Vol. 243. - P. 19-27), тогда как отечественные работы такого плана вообще отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось определение физиологических аспектов влияния углеродного наноструктурного материала (УНМ) «Таунит» (многостенных углеродных нанотрубок) на организм самок белых мышей и их потомство первого поколения при пероральном введении.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Оценить физиологические эффекты у самок белых мышей при введении различных доз УНМ «Таунит» (дозозависимый эффект).

2. Изучить структурно-функциональные изменения систем крови, выделительной, пищеварительной, сердечно-сосудистой и иммунной у белых мышей под воздействием многостенных углеродных нанотрубок.

3. Исследовать поведенческие реакции самок белых мышей и их потомства при пероральном поступлении многостенных углеродных нанотрубок.

4. Определить влияние УНМ «Таунит» на репродуктивную функцию самок белых мышей и показатели развития их потомства первой генерации.

5. Сравнить эффекты перорального поступления УНМ «Таунит» и углеродного наноматериала другой структуры.

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка физиологических эффектов УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в животный организм. Получены новые данные о состоянии внутренних органов и систем организма; его функциональных и морфологических изменениях в условиях длительного поступления многостенных углеродных нанотрубок.

Выявлен дозозависимый эффект наноматериала «Таунит» при поступлении в организм белых мышей, проявлявшийся отклонениями массы внутренних органов; продемонстрированы реактивные изменения иммунной системы.

Впервые получены данные о влиянии УНМ «Таунит» на репродуктивную систему самок мышей, в частности, увеличении массы соответствующих органов (матки с яичниками), а также количества особей в приплоде, их морфометрических показателей; снижении смертности молодняка, числа неродивших самок и доли самцов в потомстве.

Показано отсутствие изменений в гамето- и эмбриогенезе белых мышей, постимплантационной гибели, развитии плодов и потомства первой генерации при поступлении в организм УНМ «Таунит».

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены данные о развитии компенсаторно-приспособительных реакций и морфофункциональных аспектах взаимодействия наночастиц с органами и тканями белых мышей.

Результаты опытов могут быть использованы для дальнейшего совершенствования нормативной базы по работе с наноматериалами. Они

расширяют существующие знания о воздействии на организм нанодисперсных материалов, позволяют совершенствовать подходы к гигиеническому нормированию при использовании этих веществ.

Представленные сведения позволяют разработать стратегию оптимизации действия наноразмерных веществ на животный организм.

По результатам исследования получен грант по проекту № 07-03/2012 «Состояние дисперсной фазы в водных суспензиях нанопорошков для разработки методик тестирования наноматериалов в физиологических жидкостях» в рамках проведения III Межвузовского конкурса исследовательских проектов (15.03.201215.11.2012 гг.); проект «Разработка инструкции по безопасному применению углеродного наноструктурного материала в качестве компонента дактилоскопических порошков для судебной медицины и криминалистики» получил поддержку ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» по программе «У.М.Н.И.К.» (2011-2013 гг.).

Информации, полученные в результате экспериментального исследования, используются в учебном процессе на кафедре физиологии ФГБОУ ВПО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина» при чтении лекций и проведении семинарских занятий. Разработан и внедрён факультативный курс лекций «Нанотехнологии и безопасность» в 10 классах МОУ СОШ № 30 г. Тамбова.

Методология и методы исследования. Методология исследования включала оценку физиологического влияния многостенных углеродных нанотрубок на организм самок белых мышей. Эксперименты проведены с соблюдением всех принципов доказательной медицины (рандомизация и формирование групп подопытных животных, обработка результатов методами вариационной статистики). Подробно методики описаны в разделе 3.3.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в организм мышей вызывает дозозависимые морфофункциональные изменения в сердечнососудистой, пищеварительной, выделительной и иммунной системах.

2. В условиях поступления УНМ «Таунит» в организм самок белой мыши на 14 сутки потенцируются процессы возбуждения, что проявляется в виде снижения порога эмоциональных реакций и увеличения количества локомоций с последующим их восстановлением и угнетением общей двигательной активности к концу 45 суток потребления наноматериала.

3. При пероральном введении УНМ «Таунит» у самок белых мышей изменяется морфофункциональное состояние репродуктивной системы (увеличиваются масса репродуктивных органов (матки с яичниками), количество особей в приплоде, морфометрические показатели потомства; снижаются количество неродивших самок, смертность молодняка и доля самцов в помете). При этом эмбриогенез и постимплантационная гибель плодов не меняются.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов исследований определяется адекватным количеством биологических объектов, рандомизацией; корректным формированием групп экспериментальных животных и адекватными методами исследования; длительными сроками наблюдения и объективными методами вариационно-статистической обработки результатов экспериментов. Сформулированные выводы, положения и рекомендации аргументированы и логически вытекают из системного анализа результатов выполненной работы.

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред» (Тамбов, 2009); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2010); Ш-м Международном форуме по нанотехнологиям Кшпагк^есИ 2010, (Москва, 2010); 2-й Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Московская обл., 2011); У-й Международной научно-практической конференции «Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред» (Тамбов, 2012); 17-й Международной Пущинской школе - конференции молодых ученых (Пущино, 2013).

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования РФ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие сведения о наноматериалах

Пусковым фактором интенсивного развития биологии наноматериалов, наблюдаемого в последние годы, явился прогресс технологий направленного получения и использования веществ и материалов в диапазоне размеров менее 100 нм (Алферов, Ж.И. За нанотехнологиями будущее. И это не обсуждается / Ж. И. Алферов // Нанотехнологии. Экология. Производство. - 2009. - № 1. - С