Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Постнатальный морфогенез органов иммунной системы и кожи потомства самок мышей, подвергшихся иммуностимуляции в ранние сроки беременности
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат диссертации по теме "Постнатальный морфогенез органов иммунной системы и кожи потомства самок мышей, подвергшихся иммуностимуляции в ранние сроки беременности"
На правах рукописи
ОБЕРНИХИН Сергей Станиславович
ПОСТНАТАЛЬНЫЙ МОРФОГЕНЕЗ ОРГАНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И КОЖИ ПОТОМСТВА САМОК МЫШЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ ИММУНОСТИМУЛЯЦИИ В РАННИЕ СРОКИ БЕРЕМЕННОСТИ
03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Москва - 2014
Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН
Научный консультант:
доктор медицинских наук Яглова Наталья Валентиновна
Официальные оппоненты:
Профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, доктор медицинских наук, доцент Бороиихнна Татьяна Владимировна
Ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации доктор медицинских наук, профессор Ванько Людмила Викторовна
Ведущий научный сотрудник лаборатории метаболизма и иммунитета ФГБУ ГНЦ РФ Института медико-биологических проблем РАН, доктор медицинских наук Рыкова Марина Петровна
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1)
Защита состоится 25 декабря 2014г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д.З.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д.З. и на сайте института www.morfolhum.ru
Автореферат разослан «_»_2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук
Л. П. Михайлова
bit.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последние десятилетия педиатры и иммунологи отмечают увеличение заболеваемости детей, в том числе и первого года жизни, аллергическими, аутоиммунными, инфекционными и онкологическими заболеваниями, что связано с нарушениями функционирования иммунной системы [Barker D. et al., 2002; Fowden A. et al., 2006; Hodyl N. et al., 2011]. По мнению многих специалистов, изменения функционирования иммунной системы детей могут являться следствием нарушения её развития во внутриутробном периоде, обусловленного действием различных факторов на организм матери во время беременности, таких как заболевания, приём лекарственных препаратов, воздействие экологических и производственных факторов, психоэмоциональный стресс и т.д. [Bellinger D. et al.., 2001; McDade Т. et al., 2001; Merlot E. et al.., 2007; McGill J. et al., 2009; Palmer A., 2011). Развитие иммунной системы организма определяется комплексом эндогенных и экзогенных факторов, действующих на организм во внутриутробном периоде развития, а также после рождения особи. Результаты исследований гистологов, эмбриологов и иммунологов подтверждают, что действие различных факторов во втором и третьем триместрах беременности приводит к изменениям функционального состояния иммунной и эндокринной систем матери и оказывает отрицательное влияние на развивающиеся органы иммунной системы плода [Villamor Е. et al., 2002; Warner М. et al., 2002; Huizink A. et al., 2004]. Наименее изученным аспектом этой проблемы является влияния различных факторов на развитие иммунной системы зародыша в ранние сроки беременности, а точнее в течение первых четырёх недель. Это наиболее уязвимый период для действия экзогенных факторов, так как ранний период беременности является критическим для развития особи [Landreth К., 2002; Holsapple М. et al., 2003]. В связи с этим, наибольший интерес и научно-практическую значимость представляет исследование следующих трёх проблем: возможность изменения формирования органов иммунной системы плода вследствие действия стрессорных факторов в ранние сроки беременности до появления зачатков этих органов; существование связи между определёнными реакциями иммунной системы матери и изменениями развития органов иммунной системы плода; длительность этих изменений и способность их к регрессированию. Исследования в этой области необходимы для установления причинно-следственных связей между состоянием иммунной системы матери, её реакциями на действие различных факторов во время беременности и развитием иммунной системы ребёнка. Они позволили бы не только существенно расширить представления об эмбриогенезе и гистогенезе органов иммунной системы и кроветворения, но и выявить причины и механизмы развития тех или иных нарушений иммунной системы, создать научно-обоснованную стратегию профилактики и лечения заболеваний у детей, подвергшихся пренатальному воздействию экзогенных и эндогенных факторов.
Цель исследования: изучение постнатального морфогенеза органов иммунной системы и барьерного органа кожи потомства самок, подвергшихся однократной иммуностимуляции в ранние сроки беременности.
Задачи исследования:
1. Изучить морфологические и функциональные изменения тимуса и селезёнки самок мышей после однократного иммуностимулирующего воздействия, оказанного на 7-ыс сутки беременности.
2. Изучить динамику морфологических и функциональных показателей по-стнатального развития тимуса потомства самок мышей, подвергшихся на 7-ые сутки беременности иммуностимулирующему воздействию, в препубертатном, пубертатном и постпубертатном периодах.
3. Изучить динамику морфологических и функциональных показателей постнатального развития селезёнки потомства самок мышей, подвергшихся на 7-ые сутки беременности иммуностимулирующему воздействию, в препу-бертатном, пубертатном и постпубертатном периодах.
4. Изучить возрастные изменения секреции цитокинов клетками тимуса и селезёнки при воздействии Т- и В-клегочных митогенов in vitro для оценки функциональной активности клеток иммунной системы.
5. Изучить морфологические и гистофизиологичсские изменения тимуса и селезёнки при развитии системного воспалительного ответа, обусловленного введением сублетальной дозы эндотоксина грамотрицательных бактерий ли-пополисахарида для выявления особенностей функционирования иммунной системы потомства в препубертатном периоде.
6. Изучить течение опухолевого процесса после введения сингенной культуры клеток меланомы в препубертатном периоде и цитотоксическую активность клеток селезёнки для выявления особенностей реагирования иммунной системы потомства в препубертатном, пубертатном и постпубертатном периодах.
7. Изучить динамику морфологических показателей постнатального развития кожи потомства самок мышей, подвергшихся на 7-ые сутки беременности иммуностимулирующему воздействию, в препубертатном, пубертатном и постпубертатном периодах.
Научная новизна:
Впервые показана возможность влияния активации иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности до начала формирования зачатков органов иммунной системы эмбриона на их постнатальный морфогенез и функционирование.
Впервые показаны проявления и длительность морфологических и функциональных изменений тимуса и селезёнки:
Впервые установлено, что изменения постнатального морфогенеза тимуса заключаются в ускорении развития органа в первые недели жизни за счёт более высокой пролиферации и дифференцировки тимоцитов, с последующим снижением дифференцировки тимоцитов в пубертатном периоде и замедлением инволютивных процессов в постпубертатном периоде, обусловленным сохранением более высокой способности к секреции ИЛ-2, сниженной продукцией антипролиферативных цитокинов ИЛ-10 и ТФР-Р, усиленной пролиферативной активностью тимоцитов и уменьшением численности тучных клеток в периоде полового созревания.
Впервые установлено, что активация иммунной системы материнского организма изменяет содержание не только Т-клеток, но и минорных фракций лимфоцитов (NK-, NKT-, В- и В1-клеток) тимуса.
Впервые установлено, что особенностью постнатального развития селезёнки потомства самок, подвергшихся иммуностимулирующему воздействию в ранние сроки беременности, является замедление её превращения из органа кроветворения в орган иммунной системы, что обусловливает её функциональную незрелость.
Показано участие популяции тучных клеток в замедлении постнатального морфогенеза селезёнки.
Впервые установлено, что стимуляция иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности вызывает отставание функционального развития иммунной системы потомства, что проявляется замедленной реакцией тимуса и селезёнки при развитии системного воспалительного ответа, меньшей его выраженностью, снижением продукции ФНО-а при воздействии липополисахарида и контакте с опухолевыми клетками и снижением противоопухолевого иммунитета.
Впервые показано, что активация иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности вызывает нарушения постнатального развития кожи и ее придатков у потомства, проявляющиеся закладкой меньшего количества волосяных фолликулов и сальных желёз в пренатальном периоде и замедлением формирования дермы в постнатальном периоде.
Впервые описано развитие транзиторной очаговой алопеции у потомства самок мышей, перенесших цитокиновый "всплеск" в ранние сроки беременности, и установлена связь между нарушениями развития дермы и очаговой алопецией.
Научно-практическая значимость:
Экстраполяция полученных данных о замедлении развития иммунной системы и снижении её функциональной активности в постнатальном развитии вследствие активации пролиферативных и секреторных процессов в иммунной системе материнского организма в ранние сроки беременности на человека с учётом более длительного пренатального периода его развития представляет значительный интерес для педиатров при планировании вакцинации детей, исследовании причин нарушения формирования поствакцинального иммунитета и определении тактики лечения инфекционных и воспалительных заболеваний.
Отставание развития кожи и уменьшение численности волосяных фолликулов и сальных желёз вследствие иммуностимулирующего воздействия в ранние сроки беременности может учитываться как фактор риска более тяжёлого течения пиодермий, аллергических и воспалительных заболеваний кожи у детей.
Связь между воздействием на иммунную систему материнского организма в первые недели беременности и иммунной системы потомства указывает на необходимость тщательного сбора анамнестических данных педиатрами, а также внесении в амбулаторные карты детей всех данных о перенесённых матерью заболеваниях и действии других повреждающих факторов
во время беременности при постановке на поликлинический учёт и госпитализации детей независимо от их возраста.
Полученные данные об изменениях постнатального морфогенеза органов иммунной системы и кожи потомства вследствие однократного иммуностимулирующего воздействия на материнский организм в ранние сроки беременности могут использоваться в преподавании гистологии, цитологии и эмбриологии в медицинских и биологических высших учебных заведениях, а также при проведении научных исследований.
Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре гистологии, эмбриологии ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов».
Положения, выносимые на защиту:
1. Усиление пролиферации и секреции цитокинов лимфоцитами в ранние сроки беременности до начала формирования зачатков тимуса и селезёнки плода вызывает нарушения постнатального развития центральных и периферических органов иммунной системы потомства в препубертатном, пубертатном и постпубертатном периодах.
2. Изменения постнатального морфогенеза тимуса заключаются в ускорении развития органа в первые недели жизни за счёт более высокой пролиферации и дифференцировки тимоцитов, с последующим снижением процессов дифференцировки в пубертатном периоде. В постпубертатном периоде происходит замедление инволютивных процессов вследствие более высокой способности тимоцитов к секреции фактора роста ИЛ-2, сниженной продукции антипролиферативных цитокинов ИЛ-10 и ТФР-р, усиленной пролифе-ративной активности тимоцитов. Изменения постнатального морфогенеза селезёнки заключаются в замедлении её превращения из органа кроветворения в орган иммунной системы.
3. Морфологические и гистофизиологические изменения тимуса и селезёнки при развитии системного воспалительного ответа характеризуются меньшей выраженностью и более медленным развитием. Недостаточное количество клеток врождённого иммунитета, а затем и приобретённого иммунитета, функциональная незрелость селезёнки в препубертатном и пубертатном периодах обусловливает снижение противоопухолевого иммунитета.
4. Усиление пролиферации и секреции цитокинов лимфоцитами на ранних сроках беременности нарушает пренатальный и постнатальный морфогенез кожи мышей и вызывает развитие транзиторной очаговой алопеции в возрасте 17-ти суток.
Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на XIX, XX, XXI, XXII Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Ялта, Украина, 2011, 2012, 2013, Ялта, Россия, 2014гг.), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012г.), научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2012г.), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Морфология в теории и практике» (Чебоксары, 2012г.), VI Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные ас-
пекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2013г.), VII Международном конгрессе по интегративной антропологии» (Винница, Украина, 2013г.), Международной научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2014г.). Публикации: По материалам диссертации опубликовано 24 работы, из них 12 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 258 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 63 рисунками и 12 таблицами. Список литературы включает 356 источников, из них 15 отечественных и 341 зарубежный.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на 486 мышах С57В1/6, из них 126 самок и 360 самцов (питомник «Столбовая»), Содержание животных и эксперименты были выполнены в соответствии с приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.1977г., «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985г.), правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 №267) и законом «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 10, 4679-ГД от 01.12.1999г. На проведение исследования получено разрешение биоэтического комитета ФГБУ «НИИМЧ» РАМН. Иммуностимулирующее воздействие на беременных самок
Беременность датировали по наличию сперматозоидов во влагалищном мазке и копулятивной пробки. В качестве иммуностимулирующего воздействия беременным самкам однократно вводили в орбитальный синус Кон А в дозе 5 мг/кг. Данная доза усиливает секрецию цитокинов лимфоцитами и пролиферацию лимфоцитов [Lei Н., Chang С., 2007] и не влияет на течение беременности. В качестве групп сравнения использовали небеременных самок и интактных беременных самок с аналогичным сроком беременности.
Проводили исследование спонтанной, in vitro индукцированной Кон А и ЛПС секреции основных провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов ФНО-а, ИЛ-2 и ИЛ-10 клетками селезёнки через 72 ч после введения Кон А. Через 7 сут после введения Кон А, то есть на 14-ые сутки беременности проводили гистологическое исследование тимуса и селезёнки самок и определяли пролиферацию клеток тимуса и селезёнки. Исследование постнатального морфогенеза органов иммунной системы и кожи потомства
Объектом исследования было потомство мужского пола (п=360). Первую опытную группу составило потомство самок, которым вводили Кон А на 7-ые сутки беременности (группа Кон А, п=147). Для подтверждения эффектов действия цитокинов и устранения возможных эффектов непосредственного воздействия Кон А на зародыш была сформирована вторая опытная группа из потомства беременных самок, которым на 7-ые сутки вводили активированные in vivo сингенные клетки селезёнки (группа «активированные клетки», п=54). Для этого небеременным интактным самкам вводили Кон А в
дозе 20 мг/кг, через 2 ч выделяли клетки селезёнки, и вводили в объёме 0,2 мл (10 млн клеток) самкам на 7-ые сутки беременности. Рассчитанное максимально возможное количество Кон А, вводимого с клетками было в 10 млн раз меньше, чем минимальная эффективная доза. Ввиду того, что между потомством интактных самок и самок, которым вводили неактивированные клетки селезёнки, не было найдено достоверных различий по исследуемым параметрам, они были объединены в общую контрольную группу (п=159).
Исследования проводили на 17-ые сутки постнатального развития (препубертатный период), в возрасте 1,5 месяцев (пубертатный период) и 2,5 месяцев (постпубертатный период, начало активного репродуктивного периода). Определяли относительную массу тимуса и селезёнки, проводили исследование гистологических препаратов тимуса, селезёнки и кожи, определяли субпопуляционный состав лимфоцитов тимуса и селезёнки, спонтанной секреции ИЛ-2, ИЛ-10, ФНО-а и ТФР-Р и секреции после стимуляции Т-клеточным митогеном Кон А и В-клеточным митогеном ЛПС in vitro клетками тимуса и селезёнки, пролиферацию клеток тимуса и селезёнки ex tempore. Исследование изменений органов иммунной системы потомства при развитии системного воспалительного ответа
Потомству мышей контрольной группы и группы Кон А в возрасте 17-ти сут. однократно внутрибрюшиино вводили ЛПС Е. coli штамм 0111 :В4 («Difco», США) в дозе 15 мг/кг. Оценивали выживаемость животных в течение 48 ч. Проводили определение концентрации ФНО-а в сыворотке крови через Зч. Определяли содержание лейкоцитов и лейкоцитарную формулу крови через 24 ч после введения ЛПС. Остальных животных выводили из эксперимента через 24 и 48 чч после введения ЛПС. Проводили морфологическое исследование тимуса и селезёнки.
Исследования реагирования иммунной системы потомства при развитии опухолевого процесса
Исследовали цитотоксическую активность клеток селезёнки мышей контрольной группы и самок, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы Кон А на ранних сроках беременности, в возрасте 17-ти суток па линии опухолевых клеток L929.
Для исследования реагирования иммунной системы на длительно протекающий патологический процесс было проведено моделирование опухолевого процесса. Животным опытной и контрольной групп была привита подкожно сингенная опухоль мелапома В16. В связи с высоким процентом развития меланомы после прививки, для снижения приживаемости количество вводимых опухолевых клеток мышам было уменьшено до 10* [Cui N. et al., 2012]. Оценивали приживаемость опухоли, размеры подкожной опухоли и продолжительность жизни животных-опухоленосителей в каждой группе.
Протоколы исследований Животных выводили из эксперимента передозировкой золетила ("Virbac Santé Animale", Франция), вводимого внутримышечно в дозе 50мг/кг. У мышей в возрасте 17-ти суток забирали кожный лоскут в зоне алопеции (межлопаточная область спины) и в пограничной зоне, а также в шейной области и с головы. Также производили определение зоны расша-
тайных волос, указывающей на переход волос в стадию телогена, с помощью пинцета и дополнительно исследование корней удалённых волос для определения стадии цикла роста волос с помощью лупы с увеличением 10. У мышей в возрасте 1,5 и 2,5 месяцев производили забор кожного лоскута с межлопаточной области спины. После вскрытия брюшной и грудной полостей удаляли тимус и селезёнку.
Тимус и селезёнку взвешивали на аналитических весах («МВ120», «Сартогосм», Россия). Так как мыши контрольной и опытной групп статистически значимо не отличались по массе тела, рассчитывали относительную массу тимуса и селезёнки как отношение их массы к массе тела.
Кусочки тимуса, селезёнки, кожи фиксировали в жидкости Буэна. После стандартной автоматизированной гистологической проводки с помощью гистопроцессора «Tissue-Tek VIP 5 Jr» ("Hygeco", Франция) кусочки органов заливали в парафин, изготавливали срезы на микротоме «Thermo Scientific Microm HM 340E» ("Microm Gmbh", Германия). Депарафинированные срезы тимуса, селезёнки и кожи окрашивали гематоксилином и эозином ("Biovitrum", Россия), 1% раствором толуидинового синего pH 2,0 ("Sigma", США), в срезах кожи проводили ШИК-реакцию ("Biovitrum", Россия).
Изучение препаратов проводили на световом микроскопе Leica DM2500 ("Leica mycrosystems CMS Gmbh", Австрия). Морфометрическис исследования гистологических препаратов органов выполняли с помощью морфометрических программ "Image Scope M" ("Leica mycrosystems CMS Gmbh", Австрия). В гистологических препаратах тимуса рассчитывали долю коркового вещества, измеряли ширину субкапсулярного слоя, численность лимфоцитов в мм2 площади среза мозгового и коркового вещества, количество тимических телец в мм2 площади среза мозгового вещества, количество ретикулярных эпителиоцитов, входящих в тимическое тельце и стадии развития тимических телец. В гистологических препаратах селезёнки рассчитывали долю белой пульпы, измеряли ширину маргинальной зоны в мкм, подсчитывали количество клеток в мм2 маргинальной зоны и красной пульпы, процентное содержание в них нейтрофилов, количество мегакариоцитов в мм2. В вертикальных срезах кожи измеряли толщину мальпигиева слоя эпидермиса в мкм, толщину дермы, подсчитывали количество клеток в мм2 среза дермы. В горизонтальных срезах кожи подсчитывали количество волосяных фолликулов и сальных желёз в мм2 среза.
В препаратах, окрашенных толуидиновым синим, выявляли и изучали цитофизиологические характеристики тучных клеток по Н.В. Ягловой (2009). Определяли число выявляемых клеток в мм2 среза тимуса, селезёнки, дермы, их средний гистохимический коэффициент (СГК), индекс дегрануляции (ИД) и соотношение степеней дегрануляции.
Для определения субпопуляционного состава лимфоцитов тимуса и селезёнки использовали следующие конъюгаты антител с флюорохромами ("eBioscience, Inc.") к антигенам мыши: CD3, CD4, CD8, NK1.1, aGalactosylceramidc CDld, CD19, CD5-FITC, CD23. СйЗ-позитивные клетки определяли как Т-клетки. В гейте CD3+ определяли содержание Т-хелперов как CD4+CD8"-icneTKH, Т-цитотоксических лимфоцитов как CD4"CD8+, дубль-
позитивных CD4+CD8+, а также дубльнегативных CD4 CD8' (в тимусе). Рассчитывали иммунорегуляторный индекс как соотношение долей Т-хелперов к Т-цитотоксическим лимфоцитам (в селезёнке). Определяли содержание NK-клеток как СОЗ»К1.Г-клеток, NKT-клеток как CTtf'NKl.l'aGcCDld*-клегок, B-клеток как CD19+, В1-клеток как CD19+CD5+ клеток, активированных В- и В1-клеток, несущие низкоаффинный рецептор иммуноглобулина Е FcyRII, как CD 19+CD23+ и С019+СТ>5+СТ)23+-клеток, соответственно [Хайду-ков C.B. и др., 2011]. Определение процентного содержания клеток проводили с использованием проточного цитофлуориметра "Cytomix FC 500" ("Beckman Coulter"). В пробах анализировали не менее 100000 случаев.
Для определения пролиферативной активности ex tempore [Рахмилевич AJ1. с соавт.,1990] клетки тимуса и селезёнки в количестве 2х105 вносили в 96-луночные планшеты для определения 4-х часовой пролиферации, добавляли 3Н-тимидин 1мкКи/лунку (удельная активность 25 Ки/моль). После инкубации клетки снимали на харвсстрс, метку просчитывали на ß-счетчике ("LKB" Швеция).
Определяли концентрацию ФНО-а, ИЛ-2, ИЛ-10, ТФР-ß в супернатан-тах клеток тимуса и селезёнки, а также ФНО-а в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью коммерческих наборов реактивов ("Bender Medsystems", Австрия).
Абсолютное количество лейкоцитов в крови подсчитывали с помощью гематологического анализатора "Celltac alpha МЕК-6400" ("Nikon Kohden", Япония). Лейкоцитарную формулу определяли подсчётом клеток в мазках крови (не менее 500 клеток в мазке), окрашенных по Романовскому-Гимза.
Определение цитотоксической активности клеток селезёнки проводили на высоко чувствительной к фактору ФНО-а культивируемой клеточной линии фибросаркомы L-929, модифицированным методом, описанным Baarsh M. et al., 1991. Процент цитолиза просчитывали по формуле: К1/К2 х100%, где К1 - оптическая плотность контрольных, а К2 - опытных образцов.
Статистическую обработку проводили с помощью программы STATISTICA 7.0 ("Statsoft Inc.", США). Проводили анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса, Шапиро-Уилка. Центральные тенденции и рассеяния количественных признаков, имеющих приближенно нормальное распределение, описывали средним значением M и стандартной ошибкой среднего значения т. Сравнение независимых групп по количественному признаку проводили с помощью t-критерия Стьюдента с учетом значений критерия Левена о равенстве дисперсий, критериев Мапна-Уитни и х2. Статистически значимыми различия считали при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Морфофункциональные изменения органов иммунной системы самок мышей после однократной стимуляции иммунной системы в ранние сроки беременности
У самок контрольной группы на 14-ые сутки беременности наблюдали акцидентальпую инволюцию тимуса 1-ой стадии. В селезёнке отмечали увеличение размеров органа, уменьшение доли белой пульпы, снижение количе-
ства лейкоцитов в красной пульпе и увеличение пролиферативной активности клеток селезёнки (табл. 1), что соответствует литературным данным об изменениях тимуса и селезёнки во время беременности [Kendall М. et al., 2000; Bustamante J. et al., 2008].
Введение Т-клеточного митогена самкам на 7-ые сутки беременности приводило к изменениям морфофункциональных характеристик, как тимуса (табл.1), так и селезёнки (табл. 1). В тимусе наблюдалась акцидентальная инволюция 3-ей стадии, снижение пролиферативной активности тимоцитов (табл. 1), а в селезёнке - значительное увеличение размеров органа и резкое повышение пролиферативной активности клеток (табл. 1).
Выявленные изменения в тимусе и селезёнке после однократного введения Т-клеточного митогена на 7-ые сутки беременности указывали на усиление им процессов, развивающихся в органах иммунной системы во время физиологической беременности. Однократная стимуляция Т-клеточного звена иммунной системы на ранних сроках беременности не нарушала физиологическое течение беременности и не влияла на ее исход.
Табл.1
Морфологические и функциональные характеристики тимуса и селезёнки небеременных самок, интактных беременных и беременных, стимулированные Кон А самок мышей 14-ые сутки беременности, (М±ш)_
Показатель Небеременные самки Интактные беременные самки Беременные самки, стимулированные Кон А
Доля коркового вещества тимуса, % 72,86±2,53 78,31±3,53 51,69±5,99*#
Количество тимиче-ских телец /мм2 площади мозгового вещества 16,83±2,41 4,85±1,12* 8,38±1,56*#
Кол-во лимфоцитов/мм2 мозгового вещества тимуса 14084,0±990,0 17000,0±1266,0 19133,0±444,0*#
Пролиферативная активность тимоцитов, имп/мин 2846,0± 140,0 23319,0±1660,0* 2673,0±135,0#
Масса селезёнки, г 0,13±0,015 0,17±0,02* 0,55±0,05*#
Доля белой пульпы, % 34,80±3,41 22,48±2,14* 24,86±2,56
Кол-во клеток в мм2 красной пульпы 21811,0±552,0 15033,0±662,0* 19500,0±720,0#
Пролиферативная активность клеток селезёнки, имп/мин 1882,0±342,0 4844,0±240,0* 120330,0±6050,0*#
Примечание: * - статистически значимые отличия от группы небеременных самок, # - статистически значимые отличия от группы интактных беременных самок.
Через трое суток после введения Кон А беременным самкам наблюдался повышенный уровень спонтанной выработки цитокинов клетками селе-
эёнки, а дополнительное стимулирование клеток Кон А и ЛПС in vitro не вызывало повышения продукции цитокинов, то есть повышение продукции ци-токинов продолжалось в течение нескольких дней. Повышенной уровень пролиферативной активности сохранялся через 7 дней после введения Кон А.
Таким образом, однократное введение Кон А беременным самкам являлось адекватной моделью изменений в иммунной системе матери, вызванных увеличением продукции цитокинов, наблюдаемым при инфекционных процессах, стрессовых реакциях и др.
Морфофункцнональные изменения органов иммунной системы потомства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, в разные периоды постнатально-
го онтогенеза Морфофункционапьные изменения тимуса
Исследование тимуса потомства мышей опытных групп показало, что его развитие к 17-ти дневному возрасту соответствовало параметрам контрольной группы, таким как относительная масса, доля коркового вещества и ширина субкапсулярного слоя, но отмечалось меньшее содержание лимфоцитов в мозговом веществе и увеличение числа тимических телец, особенно 2-ой стадии (табл. 2). Клетки тимуса потомства мышей опытных групп обладали повышенной пролиферативной активностью. Также наблюдали более высокие темпы дифференцировки лимфоцитов тимуса, о чём свидетельствовало более высокое содержание СОЗ+-клеток и В1-клеток, играющих важную роль в негативной селекции тимоцитов [Perera J. et al., 2013]. Среди CD3-позитивных клеток процентное содержание дифференцированных CD4+ и CD8+ не отличалось, дифференцирующихся дубльпозитивных было ниже, а дубль-негативных выше, чем в контрольной группе. Однако отмечалось уменьшение содержания NK- и NKT-субпопуляций лимфоцитов в тимусе (табл. 3).
К периоду полового созревания тимус мышей достиг максимальных показателей развития. Тимус мышей опытных групп не отличался от тимуса мышей контрольной группы по относительной массе и степени развития коркового вещества. У мышей контрольной группы в субкапсулярном слое наблюдали большое количество клеток с меньшими размерами ядер и более высоким содержанием гетерохроматина, что по литературным данным характерно для дифференцирующихся лимфоцитов, а не лимфобластов [Yagi Н., et al., 1997]. У мышей опытных групп ширина субкапсулярного слоя была меньше, но в нем содержалось большее количество лимфобластов с крупными ядрами с низким содержанием гетерохроматина. В мозговом веществе содержание лимфоцитов не снижено по сравнению с предыдущим сроком исследования и равно значениям контрольной группы. Количество тимических телец не отличалось от значений контрольной группы, за исключением группы «активированные клетки», но происходило увеличение содержания тимических телец 4-ой стадии развития (табл. 2). Пролиферативная активность клеток тимуса снижена по сравнению с предыдущим сроком исследования, но была статистически значимо выше.
Морфологические характеристики тимуса потомства самок после однократного воздействия Кон А, активированными __клетками на 7-ые сутки беременности и контрольной группы (М±т)_
Группы Параметр Контрольная Кон А Активированные клетки
17-ые сутки 1,5 мес 2,5 мес 17-ые сутки 1,5 мес 2,5 мес 17-ые сутки 1,5 мес 2,5 мес
Относительная масса тимуса, % 0,67±0,11 0,39± 0,02# 0,20± 0,02# 0,63±0,03 0,40±0,02# 0,39± 0,02* 0,64±0,04 0,39± 0,04# 0,22± 0,02»#
Доля коркового вещества, % 73,31± 3,68 73,54± 2,12 72,83± 2,54 77,35± 3,51 79,03± 3,69 80,20± 1,09* 74,21± 2,91 75,99± 3,22 72,43± 2,20*
Ширина субкапсуляр-ного слоя, мкм 58,48± 3,47 50,45± 2,17# 48,50± 2,33 53,01± 3,58 36,51± 2,07*# 26,01± 1,43*# 55,27± 2,11 45,30± 2,08 *♦# 19,68± 0,96 *♦#
Кол-во лимфоцитов/мм2 мозгового вещества 22180,00± 818,00 16572,70± 695,80# 14084,50± 990,60# 17440,00± 668,00* 18380,00± 1388,30 21250,00± 526,70*# 17088,00± 794,20* 17116,70± 1068,20 17420,00± 526,70*4
Кол-во тимических телец/мм2 мозгового вещества 10,27± 0,53 9,70± 1,12 16,84± 0,82# 12,25± 0,68* 8,45± 0,85# 7,98± 0,67* 12,75±0,75" 11,05± 0,85* 7,98± 0,46 *#
Кол-во клеток в тимических тельцах 3,39±0,18 4,39± 0,31# 4,37± 0,16 4,00± 0,21* 4,18± 0,25* 4,84±0,26 4,15±0,35* 5,47± 0,27**#" 4,91 ±0,28
Кол-во выявляемых ТК/мм2 среза тимуса 0,07± 0,003 0,15± 0,01# 0,26± 0,03# 0,13± 0,01* - 0,13± 0,01*# 0,11±0,01* 0,07± 0,01**# 0**#
СГК тучных клеток 2,00±0,00 1,50± 0,15# 2,00±0,00# 1,50±0,15* - 2,00±0,00 1,50±0,13* 2,00±0,00*# -
ИД тучных клеток 0 0 33,33± 4,45# 50,00±6,06* — 50,00± 10,00 50,00± 2,75* 0# —
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы, ♦ - статистически значимые отличия группы
«Кон А» от группы «активированные клетки», # - статистически значимые отличия от предыдущего срока исследования.
Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов тимуса, его возрастной динамики у потомства самок мышей, подвергшихся однократному иммуностимулирующему воздействию на ранних сроках беременности (М±т)__
Субпопуляции лимфоцитов, % 17 суток 1,5 месяца 2,5 месяца
СОЗ+-кпетки Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 29,47±3,96 39,13±2,43* 33,13±3,15 43,97±2,25* 35,32±2,31* 32,90±3,35* 43,70±2,61 28,71±1,45* 29,48±2,71*
С04+СЭ8" (% от СОЗ+) Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 44,20±1,90 46,95±Э,70 47,80±2,85 49,95±3,32 45,65±3,45 51,75±3,25 37,15±1,11# 42,15±2,25* 41,20±1,12*"
СЕ)4"С08+ (% от СОЗ+) Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 10,63±0,75 11,00±0,33 13,50± 1,22* 17,87±1,33* 14,95±0,45*" 14,60±0,36* 10,60±0,44* 11,70±0,45* 12,50±0,55*
СЕ)4+С08+ (% от СЭЗ+) Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 43,26±1,08 35,45±2,95* 34,50±2,75* 30,43±3,23* 34,95±3,15 29,80±1,98 50,55±2,1б" 44,10±2,25** 44,91 ±2,17*"
С04'С08" (% от СОЗ+) Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 2,40±0,17 6,65±0,45* 4,25±0,65** 2,47±0,22 4,05±0,35*" 3,90±0,18* 1,20±0,08* 2,15±0,11 ** 3,10±0,15**
СОЗ"1МК1.14 Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 1,11 ±0,19 1,07±0,18 0,64±0,05*' 0,47±0,03* 1,54±0,16** 0,30±0,03** 0,83±0,18* 0,80±0,02* 1,02±0,08#
СОЗ+ЫК1.1 +сЮсСО 1 (Г Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 0,75±0,06 0,31 ±0,01* 0,56±0,03** 0,25±0,02* 0,20±0,01** 0,04±0,001**# 0,36±0,02# 0,26±0,01* 0,14±0,01*'#
СЭ19+-клетки Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 0,19±0,009 0,30±0,002* 0,18±0,008* 0,33±0,07# 0,22±0,04** 0,12±0,08*' 0,32±0,05 0,64±0,03*# 0,24±0,02*'
С019+С05+ Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 0,09±0,004 0,11 ±0,008* 0,15±0,009*' 0,11 ±0,02 0,08±0,01 0,02±0,002*'* 0,10±0,002 0,26±0,002** 0,10*0,003'"
С019+СЭ23+ Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 0,12±0,01 0,11 ±0,01 0,11 ±0,01 0,17±0,04 0,14±0,02 0,12±0,02 0,15±0,01 0,39±0,02*# 0,08±0,01 **
С019+С05+СЭ23+ Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 0,09±0,005 0,05±0,001* 0,08±0,002ф 0,06±0,002" 0,04±0,001* 0,02±0,001**" 0,05±0,001 0,09±0,001** 0,02±0,002*
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы, - статистически значимые отличия группы «Кон А» от группы «активированные клетки»," - статистически значимые отличия в группах от предыдущего срока исследования.
В отличие от контрольной группы, у которой количество дифференцированных тимоцитов увеличилось, у потомства мышей опытных групп значительно снизились темпы дифференцировки лимфоцитов в тимусе, о чем свидетельствовало более низкое содержание CD3+- и В1-клеток. Отмечали пониженное содержание С08+-клеток и увеличение численности низкодиф-ференцированных дубльнегативных клеток. Появилась тенденция к увеличению содержания NK- клеток в тимусе, но содержание NKT-клеток оставалось пониженным (табл. 3).
После наступления полового созревания у мышей опытной группы в отличие от контрольной не наблюдали возрастной инволюции тимуса. Корковое вещество было развито сильнее, но субкапсулярный слой был уже. В мозговом веществе выявляли большее количество зрелых лимфоцитов, ти-мических телец было значительно меньше, особенно телец первой стадии развития (табл. 2). Все выявленные изменения свидетельствуют о замедлении инволютивных процессов в тимусе. Пролиферация клеток тимуса снижена и не превышала значения контрольной группы. Содержание СОЗ+-клеток так и не достигло уровня контрольной группы. Отмечали повышение CD44-клеток и дубльнегативных клеток среди CD34-клеток. Отмечено повышенное содержание В1-клеток, но содержание NKT-клеток в тимусе оставалось стабильно пониженным (табл. 3).
Таким образом, однократное иммуностимулирующее воздействие в ранние сроки беременности до начала формирования зачатка тимуса приводило к усилению пролиферации, дифференцировки и миграции Т-клеток в препубертатном периоде, а затем, к снижению темпов дифференцировки и миграции клеток, что замедляло постнатальное развитие органа и в том числе его возрастную инволюцию. Второй особенностью было снижение содержания в тимусе NK- и NKT-клеток. Морфофункциональные изменения селезёнки
У мышей селезёнка является органом кроветворения и органом иммунной системы [Sasaki К. et al., 1988]. У мышей опытной группы в возрасте 17-ти суток не отмечали существенных отличий по массе и развитию белой пульпы селезёнки, но значительно отставало формирование маргинальной зоны. Второй особенностью было отсутствие миграции нейтрофилов в маргинальную зону, которое начинается после колонизации кишечника микрофлорой [Puga I. et al., 2012]. В красной пульпе селезёнки гемопоэз происходил более активно, о чём свидетельствует более высокое содержание клеток крови и гемопоэтических клеток. Наблюдали увеличение содержания тучных клеток в селезёнке. Они располагались не только в красной пульпе, но и маргинальной зоне и отличались высоким содержанием секреторных продуктов (табл. 4). Пролиферативная активность клеток селезёнки была значительно выше. Усиленная дифференцировка и миграция Т-клеток из тимуса обусловливала их повышенное содержание в селезёнке. Соотношение CD4+, CD8+ и дубльпозитивных клеток не отличалось. Также в селезёнке содержалось большее число В-клеток и в том числе активированных В-клеток, в то время
Морфологические характеристики селезёнки потомства самок после однократного воздействия на 7-ые сутки беременно-
Группы Параметры Контрольная Кон А Активированные клетки
17-ые сутки 1,5 мес 2,5 мес 17-ые сутки 1,5 мес 2,5 мес 17-ые сутки 1,5 мес 2,5 мес
Относительная масса селезёнки, % 0,64±0,06 0,53±0,05# 0,52±0,05 0,57±0,04 0,41±0,03*# 0,39±0,02* 0,59±0,03 0,37±0,03*# 0,31 ±0,02*#»
Доля белой пульпы, % 26,61 ±4,83 59,40±0,85# 34,80±3,41# 19,62±2,02 47,83±5,08*# 48,15±4,78* 20Д5±1,22 32,61 ±1,43*#» 53,11 ±0,99*#
Ширина маргинальной зоны, мкм 60,72±3,51 98,02±3,65Й 64,58±1,63 45,55±6,35* 85,06±8,42*# 71,59±1,35*# 44,75±2,75* 58,49± 2,09*#* 81,15 ±4,11*#
Кол-во лейкоцитов в мм' маргинальной зоны 21375,00± 781,21 23335,00± 3360,81 20311,10 ±1803,73 26962,50± 868,99* 18150,00± 163,66# 22150,00 ±1265,24# 27105,50 ±789,33* 22100,00 ±1257,64#* 26375,00 ±695,07*#»
% нейтрофилов от общего количества лейкоцитов в маргинальной зоне 1,04±0,05 2,05±0,16# 1,39±0,11# 0,13±0,01* 1,55±0,09*# 1,02±0,08*# 0,14±0,02* 1,42±0,11*# 1,62±0,08*
Кол-во клеток в мм" красной пульпы 24175,00± 803,29 20750,00± 805,56# 21811,10 ±552,10 27275,00± 1076,16* 23450,00± 737,52*# 18325,00± 1053,90*# 27392,00 ±1102,33* 22350,00 ±1586,66# 14625,00 ±497,40*#4
% нейтрофилов от общего количества лейкоцитов красной пульпы 0,27±0,02 2,79±0,22# 2,89±0,22 0,09±0,005* 1,64±0,08*# 0,88±0,04*# 0,10±0,01* 1,62±0,12*# 2,09±0,12#»
Кол-во мегакариоцитов в мм~ красной пульпы 16,00±2,48 21,10±4,69 25,10±1,86 25,50±3,26* 17,66±1,85# 3,87±0,51*# 23,25±2,15* 20,04±2,08 9,07 ±0,95*#»
Кол-во тучных клеток в мм" красной пульпы 1,09±0,08 1,31 ±0,07 1,17±0,29 5,13±0,23* 9,97±0,51*# 6,15±0,29*# 4,75±0,21* 3,04±0,22#» 1,96±0,08#*
СГК тучных клеток 0,75±0,04 2,00±0,01# 2,00±0,01 1,46±0,06* 1,58±0,04* 2,00±0,01# 1,50±0,07* 1,73±0,04* 2,00±0,01#
ИД тучных клеток 0 75,00±6,06# 42,51±5,10# 0 39,39±2,85*# 58,80±6,18# 0 53,33±3,23*#» 45,45±5,85
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы, ♦ - статистически значимые отличия группы «Кон А» от группы «активированные клетки», # - статистически значимые отличия от предыдущего срока исследования.
как активированных В1-клеток, !ЧК- и МКТ-клеток, принимающих участие в реализации реакций врожденного иммунитета, было меньше (табл. 5).
К периоду полового созревания селезёнка отставала по темпам развития, что подтверждалось меньшей относительной массой органа, долей белой пульпы, шириной маргинальной зоны, содержанием в ней нейтрофилов (табл. 4). Процессы кроветворения происходили более астивно. Выявляли значительно большее количество тучных (слеток. Пролиферативная активность клеток снижалась, но была выше, чем в контрольной группе. Снижение дифференцировки и миграции Т-клеток в тимусе приводило к снижению их содержания в селезёнке. Также уменьшилось содержание В-клеток в селезёнке, в том числе и В1-клеток. Параллельно снижалась экспрессия активацион-ного антигена СЭ23, но на В1-клетках она увеличивалась. Содержание МК-клеток оставалось пониженным, а содержание МКТ-клеток начало повышаться (табл. 5).
В постпубертатном периоде относительная масса селезёнки мышей всё еще была меньше, чем у мышей контрольной группы, но наблюдали увеличение доли белой пульпы и расширение маргинальной зоны, в то время как у мышей контрольной группы эти показатели были снижены по сравнению с предыдущим сроком исследования. Несмотря на это, ширина маргинальной зоны так и не достигла значений контрольной группы. Содержание нейтрофилов в маргинальной зоне повысилось. Развитие белой пульпы сопровождалось значительным обеднением красной пульпы, но содержание в ней тучных клеток оставалось повышенным (табл. 4). Пролиферативная активность клеток селезёнки уменьшилась. Содержание СОЗ-позитивных клеток соответствовало значениям контрольной группы, но у потомства самок, получавших Кон А, отмечалось замедление дифференцировки дубльпозитивных клеток в С08+позитивные клетки, а у потомства самок, которым вводили активированные клетки, наоборот, ускорение этого процесса. Увеличилось содержание В-клеток, а также В1-клеток, наметившееся в предыдущем сроке исследования. Подавляющее большинство В-клеток экспрессировали рецептор к 1§Е как и в контрольной группе, но активация В1-клеток была резко снижена. Отмечали увеличение числа МК-клеток, особенно у потомства самок, получавших Кон А, и МКТ-клеток у потомства самок, которым вводили активированные клетки селезенки (табл. 5).
Таким образом, в постнатальном периоде развития селезёнки потомства самок, подвергшихся однократному иммуностимулирующему воздействию в ранние сроки беременности, наблюдалось замедление её роста и трансформации из органа кроветворения в орган иммунной системы. Изменения посгна-тального развития тимуса отражались в развитии селезенки. Повышенная численность популяции тучных клеток селезёнки являлась одним из маркеров замедленного развития паренхимы органа.
Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов селезбнки, его возрастной динамики у потомства самок мышей, подвергшихся однократному иммуно-
стимулирующему воздействию на ранних сроках беременности (М±т)
Субпопуляции лимфоцитов, % 17 суток 1,5 месяца 2,5 месяца
СОЗ*-клетки Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 8,52*0,31 12,27*1,74* 9.27±0,44 34,31*0,69' 18,42*1,37*' 34,93*1,04" 48,28*2,09" 43.95*2.17" 44.93*1,15"
CD4*CD8" (% от CD3+) Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 52,78*1,76 54,40*2,08 54,80*2,78 52,05*3,45 52,00±2,50 54,82*2,34 50,62*2,88 50,17*2,25 47,00*2,15
CD4CD8* (% or CD3+) Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 31,97*2,28 30,55* 1,31 33,40*2,05 37,52-t4,30* 34,12*2,65 36,75*0,49 27,32*1,78*' 44,55*2,15*"
CD4*CD8* (% от CD3+) Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клтпеи» 13,12*1,53 14,3±1,11 11,83*1,05 10,55*1,05 10,85±0,05' 8,12*0,55" 12,65*1,69 22,61*0,71*' 8,52*0,62*
Иммунорегуляторный индекс Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 1,65*0,05 1,78*0,11 1,64±0,09 1,39*0,08" 1,39*0,09" 1,61*0,09** 1,38*0,08 1,84*0,09*' 1,05*0,04*"
CD3m.11* Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 1,81*0,02 0,98*0,03* 0,62±0,04*' 3,73*0,15* 2,28*0,12*" 3,01 ±0,15* 3,53*0,45 7,01*0,01*' 1,63*0,08*"
CDS^NKI.l^aGcCDld* Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 0,06*0,006 0,05*0,008 0,02*0,002* 0,08*0,003' 0,12*0,01*' 0,03*0,004*' 0,013*0,001' 0,07*0,001*' 0,28*0.02*"
С019*-клетки Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 39,76*1,44 44,68*2,49 51,72*3,12* 39.80*2,11 33,00*0,43»' 23,41*2,05*" 38.64*3,52 37,78*1,68 44,10*3.11'
CD19*CD5f Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 0,30±0,07 0,17*0,01* 0,41 ±0,03* 0,67*0,08« 0,62*0,06# 0,за*0,02*" 0,61*0,04 0,60*0,03 1,52*0,12*"
CD19*CD23* Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 11.57*1,08 16,00*0,88* 16,11*0,77* 28,96*2,86' 21.47*0,99*' 16,36*1,01* 31,64*2,18 29,67*1,45' 39,35*2,26*"
CD19*CD5+CD23* Контрольная группа Группа Кон А Группа «активированные клетки» 0,06*0,003 0,02*0,001* 0,05*0,004* 0.11*0,01' 0,14*0,02' 0,17*0,03 *" 0,05*0,002' 0,02*0,001*' 0,02*0,002*'
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы, *
• статистически значимые отличия группы «Кон А» от группы «активирован-
ные клетки», * - статистически значимые отличия в группах от предыдущего срока исследования.
Изменения продукции цитокинов in vitro клетками тимуса и селезёнки потомства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, в разные периоды постна-тального онтогенеза в ответ на стимуляцию Т- и В- клеточными
митогенами
У мышей контрольной группы максимальное увеличение продукции тимоцитами ИЛ-2 и ФНО-а при действии Т-клеточного митогена Кон А наблюдали в возрасте 1,5 месяцев, а ТФР-Р - в 2,5 месяцев. У мышей опытной группы максимальное увеличение продукции всех цитокинов отмечали в возрасте 17-ти суток, затем секреция цитокинов снижалась. Воздействие В-клеточного митогена ЛПС вызывало наибольшую продукцию цитокинов у мышей контрольной и опытной групп в возрасте 17-ти суток, но в опытной группе продукция цитокинов была более выраженной. Эти данные указывают на наличие в тимусе мышей опытной группы большего количества функционально зрелых клеток в возрасте 17-ти суток, что согласуется с результатами анализа субпопуляционного состава лимфоцитов тимуса (рис.1) .
ТФР-Р
у спонтанная секреция в индуцированная КонА риидуцироваиная лпс]
и спонтанная секреция я индуцированная КонА п индуцированная ЛПС |
Рис.1. Продукция цитокинов клетками тимуса in vitro при стимуляции митогенами
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы," -статистически значимые отличия в группах от предыдущего срока исследования.
При сравнении возрастных особенностей продукции цитокинов клетками селезёнки в ответ на стимуляцию Т- и В-клеточными митогенами у мышей опытной группы также как и в тимусе отмечали более высокую секреторную активность в возрасте 17-ти суток, что указывает на большее количество зрелых Т- и В- клеток. В 1,5 месяца продукция цитокинов была ниже, чем в кон-
19
трольной группе, что подтверждало выявленное снижение числа дифференцированных лимфоцитов в селезёнке (рис.2).
спонтанная секреция в индуцированная КонА П индуцированная ЛПС
ТФР-Р
Рис. 2. Продукция цитокинов клетками селезёнки in vitro при стимуляции ми-тогенами
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы," -статистически значимые отличия в группах от предыдущего срока исследования.
Морфофункциональные изменения органов иммунной системы потомства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, при развитии системного воспалительного ответа
Развитие системного воспалительного ответа после введения сублетальной дозы ЛПС у потомства самок, подвергшихся однократной иммуностиму-ляции на 7-ые сутки беременности, было менее выраженным, о чем свидетельствовала значительно меньшая по сравнению с контрольной группой концентрация ФНО-а в сыворотке через 3 ч после введения ЛПС , а также статистически значимо меньшее количество лейкоцитов в периферической крови с большим содержанием моноцитов и меньшим содержанием лимфоцитов и меньшая гибель животных через 24 ч (30% и 70%, соответственно).
Морфофункциональные изменения тимуса мышей
Через 24 ч после введения ЛПС у мышей контрольной группы наблюдали уменьшение относительной массы тимуса (табл. 10), выявляли массивную гибель лимфоцитов в корковом и в мозговом веществе, что проявлялось пик-нозом и распадом ядер клеток, появлением множественных очагов опустошения коры, уменьшение толщины субкапсулярного слоя, количества лимфоцитов и тимических телец в мозговом веществе (табл. 6).
Морфофункциональные характеристики тимуса мышей контрольной и опытной групп в разные сроки после введения ЛПС (М±т) _
Морфологические показатели До введения ЛПС Через 24ч после введения ЛПС Через 48ч после введения ЛПС
Относительная масса тимуса, % Контрольная группа Опытная группа 0,67±0,11 0,63±0,03 0,21±0,02# 0,76±0,03* 0,13±0,01* 0,21±0,02Ф*
Доля коркового вещества, % Контрольная группа Опытная группа 73,31±3,68 77,35±3,51 72,02±5,27 78,47±5,73 72,04±3,08 67,90±1,84
Ширина субкапсу-лярного слоя, мкм Контрольная группа Опытная группа 58,48±4,46 53,01±3,36 22,15±1,35# 12,53±0,78#* 15,90±0,97Ф 9,87±0,49**
Количество тимиче-ских телец в мм" среза мозгового вещества Контрольная группа Опытная группа 10,27±0,53 12,25±0,68* 5,06±0,65# 13,49±1,25* 8,39±0,75* 18,91±0,094*
Количество ретикуло-эпителиоцитов в ти-мическом тельце Контрольная группа Опытная группа 3,39±0,18 4,0±0,21 2,79±0,30 3,12±0,21# 3,12±0,21 2,40±0,51
Количество лимфоцитов в мм" мозгового вещества Контрольная группа Опытная группа 22180,0±818,0 17440,0±668,0+ 12860,0±814,6# 17516,7±2137,3* 18116,7±530,7Ф 13700,0±1306,6**
Количество лимфоцитов в мм" коркового вещества Контрольная группа Опытная группа — — 4515,0±267 2841,3±221,6*
Примечания: * - статистически значимые различия между опытной и контрольной группами; # - статистически значимые различия между значениями до введения ЛПС и через 24ч после введения ЛПС; ♦ - статистически значимые различия между значениями через 24ч после введения ЛПС и через 48ч после введения ЛПС.
В отличие от контрольной группы через 24 ч после введения ЛПС масса и размер тимуса мышей опытной группы не изменены (табл. 6). При исследовании гистологических препаратов в долях тимуса границы между корковым
и мозговым веществом были чёткими. В корковом веществе наблюдали пик-нотизацию ядер лимфоцитов, краевую конденсацию хроматина, распад ядер, но эти процессы были выражены меньше, чем в контрольной группе. Однако ширина субкапсулярного слоя была уменьшена в большей степени, нежели в контрольной группе (табл. 6). Количество лимфоцитов и тимических телец в единице площади мозгового вещества не изменено после введения ЛПС и превышало значения контрольной группы (табл. 6).
Через 48 ч после введения ЛПС масса тимуса мышей контрольной группы уменьшена по сравнению с предыдущим сроком исследования (табл. 6). При исследовании гистологических препаратов в долях тимуса наблюдали опустошение коркового вещества, резкое истончение и фрагментацию субкапсулярного слоя (табл. 6), а также появление митотически делящихся клеток. В мозговом веществе количество лимфоцитов и тимических телец увеличено по сравнению с предыдущим сроком исследования (табл. 6).
Относительная масса тимуса через 48 ч после введения ЛПС у мышей опытной группы уменьшена. Она превышала значения контрольной группы аналогичного срока исследования и соответствовала значениям контрольной группы, наблюдаемым через 24 часа после введения ЛПС (табл. 6). При гистологическом исследовании наблюдали большее опустошение коркового вещества (табл. 6). Выявлено статистически значимое уменьшение ширины субкапсулярного слоя как по сравнению с предыдущим сроком исследования, так и значениями контрольной группы, вплоть до исчезновения в отдельных случаях (табл. 6). В корковом веществе часто встречали тимоциты с пикнотизи-рованными ядрами, фрагменты распавшихся ядер, единичные нейтрофилы. В отличие от контрольной группы митотически делящиеся клетки практически не выявляли. В мозговом веществе количество лимфоцитов уменьшено, было статистически значимо ниже, чем в контрольной группе через 48 часов, и соответствовало значениям контрольной группы через 24 часа после введения ЛПС (табл. 6). Количество тимических телец в единице площади мозгового вещества увеличено и значительно превышало значения контрольной группы (табл. 6). Общим для опытной и контрольной групп было отсутствие тучных клеток в тимусе.
Морфофункциональные изменения селезёнки мышей
Через 24 ч после введения ЛПС у мышей контрольной группы наблюдали увеличение относительной массы селезёнки, доли белой пульпы и уменьшение ширины маргинальной зоны (табл. 7). В маргинальной зоне общее количество лейкоцитов уменьшено, но резко увеличено процентное содержание нейтрофилов (табл. 7). В лимфатических узелках выявляли апоптотически измененные лимфоциты с пикнотизированными и фрагментированными ядрами. Количество гемопоэтических клеток и клеток крови в красной пульпе также уменьшено, а доля нейтрофилов увеличена. Также выявляли тучные клетки с высокой насыщенностью секреторным материалом (табл. 7).
При исследовании селезёнки мышей опытной группы через 24 ч после введения ЛПС выявляли увеличение массы органа и доли белой пульпы аналогичное таковому в контрольной группе (табл. 7). Общей чертой было и
уменьшение ширины маргинальной зоны и количества клеток в ней, но, тем не менее, последний показатель превышал значения контрольной группы. Нейтрофилы в маргинальной зоне практически отсутствовали (табл. 7). Известно, что при попадании антигенов в организм усиливается миграция ней-трофилов в маргинальную зону селезёнки, где они трансформируются в В-клеточные хелперные нейтрофилы. Синтезируемые ими В-стимулирующие молекулы инициируют антиген-независимую секрецию иммуноглобулинов В-клетками маргинальной зоны [Магйоуаш А. е! а1., 2011; Сепйй А. й а!., 2012]. Таким образом, снижение миграции нейтрофилов в маргинальную зону может приводить к снижению выраженности иммунного ответа. В лимфатических узелках селезёнки гибель лимфоцитов была более выражена. Количество клеток в красной пульпе уменьшено, но превышало значения контрольной группы. Нейтрофильные гранулоциты в красной пульпе встречали крайне редко (табл. 7). Количество выявляемых тучных клеток значительно уменьшено и не отличалось от значений контрольной группы. Треть тучных клеток выделяла секреторный материал путем дегрануляции (табл. 7). Изменения ци-тофизиологических характеристик тучных клеток селезёнки согласуются с данными о миграции тучных клеток из органов кроветворения и иммунной защиты в органы-мишени, а также усиление секреции ими биологически активных веществ при внедрении в организм бактериальных антигенов [Яглова Н.В., 2009; СпуеНаЮ Е. й а1., 2010]. Это свидетельствует о сохранности защитных функций тучных клеток у потомства мышей, подвергшихся "цитоки-новому шторму" на ранних сроках беременности.
Через 48 ч после введения ЛПС у мышей контрольной группы отмечали прогредиентное увеличение относительной массы селезёнки, доли белой пульпы и уменьшение ширины маргинальной зоны (табл. 7). Количество клеток в маргинальной зоне и красной пульпе не претерпевало количественных изменений, но наблюдали значительное снижение содержания нейтрофилов (табл. 7). Тучные клетки не были выявлены (табл. 7). Расширения кровеносных сосудов красной пульпы не наблюдали.
Через 48 ч после введения ЛПС масса селезёнки мышей опытной группы уменьшена в отличие от контрольной группы и не отличалась от значений до введения ЛПС (табл. 7). Доля белой пульпы меньше, чем в контрольной группе (табл. 7). Ширина маргинальной зоны уменьшена и не отличалась от контрольной группы. Количество клеток в маргинальной зоне также уменьшено, и было немногим больше, чем в контрольной группе, нейтрофилы практически не выявляли. Наблюдали прогрессирующее опустошение красной пульпы. В отличие от контрольной группы в ней выявляли крайне низкое число нейтрофилов, но встречали единичные тучные клетки с пониженным содержанием секреторных гранул (табл. 7).
Таким образом, стимуляция иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности приводит к менее выраженной реакции тимуса и селезёнки потомства при развитии системного воспалительного ответа, что связано с функциональной незрелостью иммунной системы.
Морфофункциональные характеристики селезенки мышей контрольной и опытной групп в разные сроки после введения ЛПС (М±ш)
Морфологические показатели
До введения ЛПС
Через 24ч после введения ЛПС
Через 48ч после введения ЛПС_|
Относительная масса селезенки, % Контрольная группа Опытная группа
0,64*0,06 0,57*0,04
0,72*0,06* 0,71*0,06*
0,97*0,08» 0,64*0,05»
Доля белой пульпы, % Контрольная группа Опытная группа
26,5Й4,6б 19,62*2,75*
30.74*0,04* 26,61*1,28«*
42,38*3.25» 30,45*2,33»
Ширина маргинальной зоны, мкм Контрольная группа Опытная группа
Количество клеток в мм2 среза маргинальной зоны Контрольная группа Опытная группа
60,72*3,51 45.55*6.35»
36,76*2,27* 34,63*1,73*
25,0*1,75» 21.97AI.91»
21375,00*781,20 29652,50*868,90*
9922,50*1256,50* 19468,30*1522,00»*
9290,004461,50 11802.50*787.80*»
% нейтрофилов от общего количества клеток в маргинальной зоне Контрольная группа Опытная группа
1,04*0,05 0,13*0,01»
20,15*2,57* 0,63*0,07»*
3,41*0,31» 0,21*0,01»*»
Количество клеток в ми' красной пульпы Контрольная группа Опытная группа
24175,00*803,30 27275.00*1076,20*
11391,40*450,40# 18144,40*491,00»*
11252,90*1224,90 14362,50*602.Ю'»
% нейтрофилов от общего количества клеток в красной пульпе Контрольная группа Опытная группа
Количество тучных клеток в мм2 площади среза селезенки Контрольная группа Опытная группа
0,27*0,02 0,09*0.005»
6,28*0.89* 0.98*0,11»*
2,65*0,54» 0,21*0,09*»
0,92*0,31 5,49*0,25*
0,49*0,15 0,55*0,11*
1.02*0,36»
СГК тучных клеток Контрольная группа Опытная группа
0,75*0,04 1,46*0,06»
2,23*0,23* 2,67*0.33*
1,88*0,12»
ИД тучных клеток Контрольная группа Опытная группа
33,33*2,50**
0»
Примечания: * - статистически значимые различия между опытной и контрольной группами; # - между значениями до введения ЛПС и через 24ч после введения ЛПС;» - между значениями через 24ч после введения ЛПС и через 48ч после введения ЛПС.
Реагирование иммунной системы потомства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, при развитии опухолевого процесса
При исследовании цитотоксической активности супернатантов, полученных при культивировании клеток селезёнки с клетками опухоли, обнаруживали дозозависимый лизис клеток Ь929 как в опытной, так и в контрольной группах. Однако, процент цитолиза в контрольной группе животных был статистически значимо выше, чем у мышей рождённых от самок, получавших Кон А (рис. 3).
Исследование развития опухолевого процесса у мышей контрольной группы и потомства самок, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы на ранних сроках беременности
При ежедневном исследовании животных, которым подкожно вводили клетки меланомы В16, на 21-ые сутки после введения опухолевых клеток пальпируемая опухоль обнаруживали у 18,2% животных контрольной группы и 8,3% животных опытной группы. В дальнейшем в опытной группе наблюдали резкое увеличение приживаемости опухоли в отличие от контрольной группы. На 28-ые сутки этот показатель достиг максимального значения -75%. В контрольной группе животных опухоль привилась у 36,4% мышей.
Рис. 3. Цитотоксическая активность клеток селезёнки мышей, родившихся от самок, получавших КонА, и мышей контрольной группы в отношении клеток фибросаркомы L929 (М±т)
Примечание: * - статистически значимые отличия от значений контрольной группы, 0 по оси абсцисс - без разведения.
Исследования темпов приживаемости среди мышей, у которых она привилась, выявляли более высокие значения этого показателя у мышей опытной группы (рис. 4а). Размеры опухоли у животных обеих групп статистически значимо не отличались в течение исследуемого периода вплоть до гибели животных (рис. 46).
-контрольная группа
опытная группа
21 25 27 31 33 38 41 | контрольная группа ~т— опытная группа |
а б
Рис. 4. Приживаемость меланомы В16 (а) и темпы роста подкожной опухоли меланомы В16 (М±т) (б) у мышей опытной и контрольной групп
Темпы гибели животных-опухоленосителей опытной группы были выше. Так гибель 50% мышей в опытной группе наступила на 7 сут. раньше, а гибель 75% - 17 сут. раньше, чем в контрольной группе (рис. 5). При вскрытии погибших животных во всех случаях обнаруживали прорастание опухоли в органы брюшной полости.
Рис. 5. Продолжительность жизни мышей-опухоленосителей, родившихся от самок, получавших Кон А, и контрольной групп
Таким образом, стимуляция иммунной системы материнского организма на ранних сроках беременности приводит к ослаблению противоопухолевого иммунитета у потомства вплоть до периода полового созревания. Одним из механизмов снижения противоопухолевого иммунитета является уменьшение цитотоксической активности лимфоцитов, уменьшение количества NK- и NKT-клеток и снижение способности синтезировать ФНО-а в ответ на опухолевые антигены.
Морфофункциональные изменения кожи и её производных потомства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, в разные периоды постнатального
морфогенеза
На 17-ые сутки постнатального развития, когда происходит первое цикличное изменение роста волос у мышей [Muller-Rover S. et al., 2001; Fuchs E.,
2007] у потомства самок, перенесших иммуностимулирующее воздействие, развивалась транзиторная очаговая алопеция. Утрата шерстного покрова, начиналась со спины и распространялась на брюхо, но не затрагивала кожу головы, лап и основания хвоста (рис. 6). Большинство волос вокруг очага алопеции находились в стадии телогена. При исследовании гистологических препаратов участка кожи спины, находящегося рядом с очагом выпадения волос и сохранившем шерстный покров, выявляли утолщение мальпигиева слоя эпидермиса (табл. 8), очаговое снижение интенсивности ШИК-реакции в базаль-ной мембране, размытость базальной мембраны. Толщина дермы практически не отличалась от значений контрольной группы (табл. 8). Отмечали уменьшение количества аморфного вещества межклеточного матрикса по всей толщине дермы, благодаря чему она имела рыхлое сетчатое строение, волосяных фолликулов и сальных желёз (табл. 8). Выявлены уменьшение числа волосяных фолликулов и сальных желёз. Большинство волосяных фолликулов содержало терминальные волосы, количество пуховых волос было уменьшено. Многие волосяные фолликулы были деформированы, имели кистообразный вид и содержали неправильно ориентированные, изогнутые волосы с неравномерным распределением пигмента в стержне волоса. У многих волосяных фолликулов дермальное корневое влагалище характеризовалось слабо положительной ШИК-реакцией. Общее количество клеток в дерме было меньше (табл. 12). Также было меньшим число выявляемых тучных клеток (табл. 9). Большинство их отличалось высокой насыщенностью секреторным материалом. В целом, интенсивность выделения секреторных гранул за пределы клеток была ниже, чем в контрольной группе. Изменена и локализация тучных клеток в дерме и гиподерме. Многие тучные клетки располагались вдоль волосяных фолликулов. Изменений сосудистого русла не наблюдали.
При макроскопическом исследовании участка кожи с утраченным шерстным покровом отмечали сохранение единичных терминальных волос и отсутствие пуховых волос. Кожа имела бледно-розовую окраску. При микроскопическом исследовании кожа имела те же особенности строения эпидермиса и дермы, что и в пограничной зоне. В дерме выявляли большее число нейтрофилов, которое не наблюдали ни в пограничной зоне, ни в контрольной группе. Количество тучных клеток не отличалось от значений в контрольной группе. Их насыщенность секреторным материалом была выше, а интенсивность дегрануляции ниже (табл. 9). Сохранялась связь тучных клеток с волосяными фолликулами. Таким образом, окружение тучными клетками волосяных фолликулов и выделение ими секреторных продуктов предшествовало выпадению волос, что согласуется с данными о роли тучных клеток в развитии алопеции [Xu X. et al., 2003; Won С. et al., 2008; Vandrford D. et al., 2010]. В течение последующих 2-3 суток отмечали прогрессирующую утрату волосяного покрова спины и брюха. Волосяной покров сохранялся на голове, лапах и у основания хвоста. При гистологическом исследовании кожи головы наблюдали топографическое изменение структуры дермы. Фронтально расположенный участок кожи головы имел строение дермы аналогичное дерме животных контрольной группы. По направлению к цервикальному отделу в дер-
ме содержание аморфного компонента межклеточного матрикса уменьшалось, но было больше, чем в коже спины. В коже спины отмечали пониженное содержание клеток по сравнению с контрольной группой и уменьшение числа нейтрофилов. Волосяные фолликулы были резко увеличены в размерах, имели кистообразное строение и не имели содержимого или содержали деформированные волосы. Всё вышесказанное позволяет сделать вывод, что выпадение и нарушение роста новых волос является результатом аномального морфогенеза как самих волосяных фолликулов и волос, так и дермы.
Рис. 6. Очаговая алопеция у потомства самок мышей, которым на 7-ые сутки беременности вводили Кон А или активированные клетки селезёнки (слева). Справа - мышь контрольной группы.
Выявленные отличия гистологического строения кожи потомства контрольных и опытных самок указывали на то, что, во-первых, изменениям подвергаются как производные эктодермы, так и мезодермы, во-вторых, изменения развиваются как во внутриутробном периоде развития, так и после рождения особи. Известно, что формирование волосяных фолликулов и сальных желёз происходит во внутриутробном периоде развития [Peters Е., 2002], следовательно, уменьшение их численности является нарушением развития кожной эктодермы в пренатальном периоде. Особенности строения кожи позволяют предположить, что в их основе лежало нарушение Wnt-сигналинга, приведшее к уменьшению формирования волосяных фолликулов и дермы, так как активация Wnt-сигналинга вызывает формирование из эктодермы кожного эпителия и способствует ингибированию костных морфогенетических белков, препятствующих развитию волосяных фолликулов [Jung H. et al., 1998; Noramly S. et al., 1998; ; Petiot A. et al., 2003; Atit R., 2006]. Следовательно, воздействие избыточного количества цитокинов на эмбрион способно приводить к нарушению активации транскрипционных факторов.
Через 2 недели у животных начиналось восстановление шерстного покрова. В дальнейшем в коже мышей опытной и контрольной групп наблюда-
лись сходные возрастные изменения: уменьшение толщины мальпигиева слоя эпидермиса к 2,5 месяцам, увеличение толщины дермы, усиление ШИК-реакции аморфного вещества межклеточного матрикса, а также уменьшение количества клеток в дерме, в том числе и выявляемых тучных клеток.
Табл. 8
Морфологические хара!сгеристики кожи и её производных самок, перенесших иммуностимулирующее воздействие в ранние сроки беременности, и мышей контрольной группы в различные периоды постнатального развития (М±т)
-... Возраст Показатели ' ------ 17 суток 1,5 месяца 2,5месяца
Толщина мальпигиева слоя, мкм Контрольная группа Опытная группа 12,60±1,06 17,48±0,45* 19,69±0,64# 16,17±1,07* 15,97±0,75# 10,56±0,65*#
Толщина дермы, мкм Контрольная группа Опытная группа 211,47±7,24 222,45±6,11 501,92±13,46# 383,45±16,52,|,# 307Д5±6,82# 162,34±9,03*#
Количество волосяных фолликулов в мм2 кожи Контрольная группа Опытная группа 255,58±6,13 163,58±13,42* 130,49±11,93# 92,92±11,61# 122,05±10,44 86,40±2,10*
Количество сальных желез в мм2 кожи Контрольная группа Опытная группа 92,92±5,74 64,13±7,89* 45,13±3,11# 46,95±7,50 56,41 ±9,24 43,28±7,99
Доля волосяных фолликулов с сальными железами, % Контрольная группа Опытная группа 36,37±2,13 39Д6±4,79 34,58±3,43 50,63±1,00# 46,72±6,99 50,09±6Д7
Доля волосяных фолликулов, содержащих пуховые волосы,% Контрольная группа Опытная группа 65,72±4,20 3,72±0,64* 86,67±7,31# 96,00±2,64# 88,17±2,70 83,00±0,88#
Количество клеток в мм2 среза дермы Контрольная группа Опытная группа 7049,51 ±1005,25 4272,67 ±293,55* 2353,33 ±801,44# 2930,0±250,0# 1923,77±233,08 3467,11 ±450,16*
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы, # - статистически значимые отличия от предыдущего срока исследования.
При исследовании гистологических препаратов кожи спины мышей опытной группы в возрасте 1,5 месяцев толщина эпидермиса была меньше, чем у мышей контрольной группы (табл. 8). По сравнению с предыдущим сроком исследования базальная мембрана на всём протяжении была чётко выражена, характеризовалась резко положительной ШИК-реакцией. Толщина дермы меньше, чем у животных контрольной группы аналогичного возраста (табл. 8). Гиподерма умеренно развита. В дерме значительно увеличено количество ШИК-положителыюго аморфного вещества межклеточного матрикса.
Пространственная ориентация волокон в дерме не отличалась от контрольной группы. Количество волосяных фолликулов в мм2 площади дермы было меньше, чем у мышей контрольной группы (табл. 8). Большинство волосяных фолликулов содержало пуховые волосы, но в отличие от контрольной группы фолликулов, содержащих два волоса, было крайне мало. Количество сальных желёз существенно не изменено по сравнению с предыдущим сроком исследования (табл. 8). Количество клеток в дерме также уменьшено и существенно не отличалось от значений контрольной группы (табл. 8). Нейтрофи-лы в дерме встречали редко. Численность популяции тучных клеток была относительно стабильна. По цитофизиологическим характеристикам тучные клетки не отличались от значений контрольной группы (табл. 9).
Табл. 9
Цитофизиологические характеристики тучных клеток кожи потомства самок, перенесших иммуностимулирующее воздействие в ранние сроки беременности, и мышей контрольной группы в различные сроки постнатального разви-
Возраст Показатели ' -— 17 суток 1,5 месяца 2,5 месяца
Количество тучных клеток в мм среза дермы Контрольная группа Опытная группа: участок с волосяным покровом участок без волосяного покрова 189,67±13,60 153,87*11,21* 190,43± 16,77 124,42±2,84 157,23±17,74* 170,89±15,51 149,62±17,77
СГК тучных клеток Контрольная группа Опытная группа: участок с волосяным покровом участок без волосяного покрова 1,93±0,02 1,89±0,02 2,03±0,02 1,89±0,06 2,02±0,02ф 2,09±0,05 1,95±0,07
ИД тучных клеток Контрольная группа Опытная группа: участок с волосяным покровом участок без волосяного покрова 49,51±5,09 30,56±4,08* 17,66±1,89* 28,98±6,34 38,89±5,97 24,24±3,75 35,76±2,01
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы.
Исследование кожи спины мышей опытной группы в возрасте 2,5 месяцев выявило меньшую толщину мальпигисного слоя эпидермиса и дермы по
сравнению со значениями мышей контрольной .группы (табл. 8). Базальная мембрана характеризовалась хорошо выраженной ШИК-положительной реакцией, как и в предыдущем сроке исследования. Волокна в дерме располагались преимущественно параллельно поверхности кожи. Количество клеток превышало значения контрольной группы. Количество тучных клеток не изменено и соответствовало значениям контрольной группы. Насыщенность тучных клеток секреторным материалом была высокая. Выделение секреторных гранул наблюдали у трети клеток (табл. 8). Большинство волосяных фолликулов содержали пуховые волосы, но фолликулов, содержащих два волоса, было крайне мало. Существенных отличий в строении гиподермы и сосудистого русла не наблюдали.
Таким образом, у потомства самок мышей, подвергшихся однократной иммуностимуляции в ранние сроки беременности, наблюдали замедление по-стнатального развития кожи.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное исследование впервые выявило связь между реакциями иммунной системы матери в ранние сроки беременности до формирования зачатков органов иммунной системы эмбриона и развитием этих органов и кожи потомства и показало, что однократное иммуностимулирующее воздействие способно вызывать изменения развития органогенеза потомства, длительно наблюдающиеся в постнатальном периоде. Анализ полученных данных показывает, что повышенная пролиферация и секреция цитокинов вследствие активации лимфоцитов Кон А на 7-ые сутки беременности усиливает физиологические изменения в органах иммунной системы беременной самки оказывает влияние на развивающийся эмбрион. Цитокиновый шторм влияет на диф-ференцировку зародышевых листков, так как изменения постнатального развития наблюдаются у производных энтодермы, мезенхимы зародышевой мезодермы, дерматомов сомитов, а у производных эктодермы (волосяные фолликулы, сальные железы) выявлены также и изменения пренатального развития.
Цитокиновая атака до начала закладки тимуса и селезёнки значительно изменяет последующий морфогенез этих органов. Из центральных органов иммунной системы тимус начинает формироваться первым. Воздействие цитокинов вызывает изменение темпов его постнатального развития. В норме в постнатальном развитии тимуса мыши выделяется три этапа: развития органа, расцвета и инволюции (рис. 7). В первые недели после рождения особи в тимусе происходили более активные процессы пролиферации, дифференциров-ки и миграции Т-клеток в периферические органы иммунной системы. Затем происходил дисбаланс между процессами пролиферации и дифференцировки за счёт снижения темпов последней. В постпубертатном периоде снижалась пролиферативная активность, медленно дифференцирующиеся клетки скапливались в тимусе, вызывая увеличение доли коркового вещества. Таким образом, наблюдалось замедление морфогенстических процессов, атрофические изменения не развивались (рис. 7).
В постнатальном развитии сслезснки отмечаются изменения, обусловленные пренатальным воздействием, но также и прослеживаются последствия изменений морфогенеза тимуса. Постнатальное развитие селезёнки мыши протекает в три этапа: формирование лимфатических узелков и ПАЛМ и угасание кроветворения в красной пульпе; увеличение белой пульпы и расширение маргинальной зоны; уменьшение доли лимфоидпых образований и сужение маргинальной зоны (рис. 7). У потомства самок, перенесших цитокиновый шторм на ранних сроках беременности, в препубертатном периоде происходило более активное заселение белой пульпы Т- и В-клетками, но значительно отставало формирование маргинальной зоны и протекали активные процессы кроветворения. Затем снижалась миграция дифференцированных Т- и В-клеток в селезёнку, замедлялось увеличение белой пульпы и маргинальной зоны. А в постпубертатном периоде их развитие достигало максимума (рис. 7). Таким образом, постнатальное развитие селезёнки как органа иммунной системы было замедлено.
| ntpinapawtmn |
|ч>«п 'OqiiirnkA 1
| ny<kpTii»rtj
Ржшпиепшуся 1кхде1шыу|10спшутфуки1кгойО1дсЛст*]1я в р ан»(с ср oui вер «шмюсп i
I
Уапавк прмшффпдш Yan«n дц^юифоиа Уапони »трштт-кллок
I
Уапаша пралнфсрацш СмиВВМЯКфффСЯЦфОШ! и ыпграикпт-нкток
I
Скшяи пралиферялн За и ипик диффер «дпровш Т-кпеток
I
Р1ШЛК ca«b«l поа1с11Ш1>'Ш1Сп1и)11нр>'Ю1цегово1дейспия лрлмкфошбсрекапопи
Бале» »кпвяо« »оетмкТ-иВ-клепами ОкгПШИр»ШН1|ВрПП11К|КЙ10П| Аклвиьй 1пшпоээ
(^шияк шгрвцдаТ- II В-клеток Зв ыедлвиеувсшявии белой пульпы и шрппаипшйзош Активный геиопом
ЫжсшмлыъЛобьСилнифоцднык обрмамй 1Ъепп<мкшрлтлыкЙ1ти
Т"
I
J
| постпуОдшпый аншапаммвампоциоргю» |----' | 3»ысдл«нср«анпиорто |
Рис. 7. Изменения постнатапьного морфогенеза тимуса и селезёнки потомства самок мышей, подвергшихся иммуностимулирующему воздействию в ранние сроки беременности.
Исследование секреции цитокинов клетками тимуса и селезёнки, индуцированной Кон А и ЛПС in vitro в разные периоды постнатального развития, выявило большую секреторную активность клеток в возрасте 17-ти суток. Дальнейшее снижение продукции цитокинов также свидетельствовало об уменьшении содержания дифференцированных клеток в этих органах. Но после введения сублетальной дозы ЛПС мышам в возрасте 17-ти суток морфо-
логические и функциональные изменения тимуса и селезёнки характеризовались меньшей степенью выраженности и более поздним развитием. Причиной этого является вторая особенность клеточного состава центральных и периферических органов иммунной системы - уменьшение содержания клеток-участников реакций врожденного иммунитета ЫКТ, В1-клеток, в том числе и активированных В1-клеток. Это приводило к меньшей выраженности системного воспалительного ответа. Второй причиной была функциональная незрелость селезёнки как органа иммунной системы. Отставание развития маргинальной зоны нарушало кооперацию клеток, обеспечивающих ранние фазы иммунного ответа. Ярким проявлением этого было отсутствие миграции нейтрофилов в селезёнку. Дисбаланс постнатального морфогенеза, более слабая реакция на бактериальный антиген и снижение противоопухолевого иммунитета в препубертатном и пубертатном периодах подтверждают замедление функционального становления иммунной системы (рис. 8).
Одновременно с нарушениями развития иммунной системы наблюдаются и нарушения развития барьерного органа кожи. Цитокиновый шторм приводил к уменьшению числа волосяных фолликулов и сальных желёз, закладывающихся в позднем пренатальном периоде, а в постнатальном периоде к замедлению формированию дермы (рис. 9). Наиболее вероятным механизмом действия цитокинов было нарушение >Уп1-сигналинга.
Рис. 8. Взаимосвязь между нарушением развития органов иммунной системы и особенностями иммунного ответа потомства самок мышей, подвергшихся иммуностимулирующему воздействию в ранние сроки беременности, в разные периоды постнатального развития.
Развитие алопеции было обусловлено резким переходом волос в стадию телогена и нарушением роста новых волос вследствие незрелости дермы кожи спины и брюха. Изменение структуры дермы в каудальном направлении, наблюдаемое при сравнении кожи головы и шеи, где сохранялся шерстный покров, и спины, где он отсутствовал, а также восстановление шерстного покрова параллельно с увеличением толщины дермы и содержания в ней аморфного компонента межклеточного матрикса подтверждают патогенетическую роль незрелости дермы в нарушении роста волос (рис. 9).
Рис. 9. Изменения морфогенеза кожи потомства самок мышей, подвергшихся иммуностимулирующему воздействию на ранних сроках беременности.
Результаты исследования расширяют представления о закономерностях и особенностях постнатального развития органов иммунной системы и кожи и показывают значительную роль, которую играет стимулирующее воздействие на иммунную систему матери в ранние сроки беременности до начала формирования органов иммунной защиты и кожи эмбриона на их дальнейшее развитие, а также функционирование. Полученные данные дают новое направление исследованиям влияния пренатальных факторов в различные конкретные сроки эмбрионального развития на постнатальный морфогенез и функциональную активность органов и систем.
ВЫВОДЫ
1. Иммуностимулирующее воздействие на материнский организм, вызывающее усиление пролиферации лимфоцитов и секреции ими цитокинов, в ранние сроки беременности до начала формирования зачатков тимуса и селезёнки зародыша оказывает отдаленные последствия в виде длительных, на-
блюдаемых даже в постпубертатном периоде, нарушений темпов развития этих органов иммунной системы, а также барьерного органа кожи потомства.
2. Стимуляция иммунной системы в ранние сроки беременности приводит к усилению физиологических изменений в органах иммунной системы материнского организма, происходящих во время беременности, и не влияет на исход беременности.
3. Иммуностимулирующее воздействие, оказанное на материнский организм в ранние сроки беременности, приводит к изменениям постнатального морфогенеза тимуса, заключающимся в ускорении развития органа в первые недели жизни, о чём свидетельствует более высокая пролиферативная активность ти-моцитов, содержание СЭЗ-позитивных клеток и продукция фактора роста лимфоцитов ИЛ-2 клетками тимуса, с последующим снижением дифференци-ровки тимоцитов в пубертатном периоде и замедлением инволютивных процессов в иостпубертатном периоде.
4. В основе замедления инволютивных процессов в тимусе лежит сохранение более высокой способности к секреции ИЛ-2, сниженная продукция антипро-лиферативных цитокинов ИЛ-10 и ТФР-Р, усиленная пролиферативная активность тимоцитов и уменьшение численности тучных клеток в периоде полового созревания.
5. Усиленная продукция цитокинов в ранние сроки беременности до формирования зачатка селезёнки зародыша приводит к замедлению превращения селезёнки потомства из органа гемопоэза в орган иммунной системы в постна-тальном развитии. Одним из маркеров этих изменений развития селезёнки являются тучные клетки.
6. Следствием стимуляции иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности является изменение субпопуляционного состава лимфоцитов селезёнки потомства с более высоким содержанием Т-клеток вследствие их усиленной миграции из тимуса, а также В-клеток, и уменьшением содержания эффекторных ЫК- и ЫКТ-клсток в препубертатном периоде.
7. Замедленная трансформация селезёнки в орган иммунной системы, проявляющаяся меньшим содержанием дифференцированных Т- и В-клеток, ней-трофилов, отставанием развития маргинальной зоны в пубертатном периоде обусловливает её функциональную незрелость, что проявляется пониженной способностью лимфоцитов селезёнки реагировать на воздействие липополи-сахарида и на контакт с опухолевыми клетками секрецией фактора некроза опухоли-а.
8. Структурно-функциональные изменения тимуса при развитии системного воспалительного ответа в препубертатном периоде свидетельствуют о менее выраженной акцидентальной инволюции и замедлении миграции зрелых тимоцитов вследствие более медленной его реакции на стресс.
9. Особенностью гистофизиологических изменений селезёнки при развитии системного воспалительного ответа является их меньшая выраженность, а также крайне низкая миграция нейтрофилов в маргинальную зону, что способно нарушать межклеточные взаимодействия, лежащие в основе развития
ранней стадии иммунного ответа - Т-независимому синтезу иммуноглобулинов B-клетками маргинальной зоны.
10. Функциональное отставание в развитии иммунной системы потомства приводит к снижению противоопухолевого иммунитета и более слабому развитию системного воспалительного ответа на бактериальный антиген, что может способствовать хронизации течения бактериальных инфекций.
11. Усиление пролиферации лимфоцитов материнского организма и секреции ими цитокинов в ранние сроки беременности приводит к нарушению пре- и постнатального морфогенеза кожи и её производных у потомства, проявляющемуся закладкой меньшего количества волосяных фолликулов и сальных желёз в пренатальном периоде и замедлением формирования дермы в постна-тальном периоде.
12. IIa 17-ые сутки постнатального развития в коже потомства развиваются патологические изменения в структуре волосяных фолликулов и стержней волос, инфильтрация дермы нейтрофилами, окружение тучными клетками волосяных фолликулов и выделение ими секреторного материала, приводящие к выпадению волос на туловище. Одной из причин нарушения роста волос является замедление формирования дермы. Очаговая алопеция носит обратимый характер.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ
1. Яглова Н.В., Обернихин С.С., Богданова И.М. Снижение противоопухолевого иммунитета у потомства как следствие активации и мунной системы материнского организма в ранние сроки беременности. // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т.6 (15). - №4. - С.357-362.
2. Яглова Н.В., Обернихин С.С. Влияние активации иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности на постнатальный морфогенез органов иммунной системы потомства. // Проблемы репродукции. -2013.-Т.19.-№1,- С.73-77.
3. Яглова Н.В., Обернихин С.С. Морфофункциональные изменения тимуса у потомства мышей в период полового созревания и у взрослых особей после однократного иммуностимулирующего воздействия на материнский организм в ранние сроки беременности. // Иммунология. - 2013. - Т.34. - №1. - С.15-19.
4. Яглова Н.В., Обернихин С.С. Морфофункциональные изменения селезенки потомства мышей в разные периоды постнатального онтогенеза после однократного иммуностимулирующего воздействия на материнский организм в ранние сроки беременности. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156. -№10. - С.499-502.
5. Яглова Н.В., Обернихин С.С. Морфофункциональное состояние органов иммунной системы потомства мышей после однократного иммуностимулирующего воздействия на материнский организм в ранние сроки беременности. // Российский медико-биологический вестник.- 2013. -№4. - С.24-28.
6. Обернихин С.С. Различия в морфологических изменениях тимуса у потомства самок мышей, подвергшихся на ранних сроках беременности иммуностимулирующему вохдействию, после введения эндотоксина фамогрицатель-
ных бактерий. II Вестник новых медицинских технологий. - 2013. - .20. -№4.
- С .95-99.
7. Обернихин С.С., Яглова Н.В. Очаговая алопеция у потомства мышей как следствие активации иммунной системы материнского организма на ранних сроках беременности. // Фундаментальные исследования. - 2013. - №12. -вып.2,- С.273-278.
8. Обернихин С.С. Влияние активации иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности на состояние противоопухолевого иммунитета потомства. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.
- 2013. - Т.156. -№7. - С.78-81.
9. Обернихин С.С., Яглова Н.В. Структурно-функциональные изменения органов иммунной системы при развитии системного воспалительного ответа у потомства самок мышей, перенесших стимулирующее воздействие на иммунную систему в ранние сроки беременности. // Иммунология. - 2014. - Т.35. -№1.-С.8-12.
10. Обернихин С.С. Морфофункциональные изменения селезёнки потомства самок мышей, перенесших стимулирующее воздействие на иммунную систему в ранние сроки беременности, при системном воспалительном ответе. // Морфологические ведомости. — 2014. — №1. - С.79-84.
11. Обернихин С.С., Яглова Н.В. Возрастная динамика субпопуляционного состава лимфоцитов селезенки потомства самок мышей, подвергшихся однократному иммуностимулирующему воздействию на ранних сроках беременности. // Российский иммунологический журнал. - 2014. - Т.8.(17). - №1. -С.10-15.
12. Обернихин С.С., Яглова Н.В. Морфофункциональные изменения тимуса и селезенки при развитии системного воспалительного ответа у потомства самок мышей, на ранних сроках беременности подвергшихся однократному иммуностимулирующему воздействию. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - Москва. - 2014. - Т.157. - №6. - С.786-790.
Другие публикации
13. Обернихин С.С., Яглова Н.В., Яглов В.В. Морфофункциональные изменения репродуктивной системы мышей во время беременности при однократном иммуностимулирующем воздействии. // «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии»: Труды XIX международной конференции и дискуссионного научного клуба. - Украина, Ялта. - 2011.
- С.163-165.
14. Яглова Н.В., Обернихин С.С. Морфофункциональные особенности тимуса и селезенки потомства мышей С57В1/6 после однократного введения беременным самкам конканавалина А. // Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии: Сборник научных трудов научной конференции. - Москва, 2012. -С. 152-156.
15. Обернихин С.С., Яглова Н.В. Влияние пренатального воздействия конканавалина А на пролиферативную активность клеток селезенки и тимуса у потомства в пубертатном периоде и у половозрелых особей. // XIX Российский
национальный конгресс «Человек и лекарство»: Сборник материалов. Москва, 2012. -С. 545-546.
16. Обернихин С.С., Яглова Н.В. Влияние активации клеток иммунной системы матери на развитие органов иммунной системы плода. //«Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии»: Труды XX международной конференции и дискуссионного научного клуба. - Украина, Ялта. - 2012. - С. 77-78.
17. Обернихин С.С., Яглова Н.В. Воздействие конканавалина А в пренаталь-ный период на постнатальный развитие тимуса потомства.// II Всероссийская научно-практическая конференции с международным участием «Морфология в теории и практике»: международным участием «Морфология в теории и практике»: Сборник материалов и тезисов. - Чебоксары. - 2012. - С.241-243.
18. Обернихин С.С. Постнатальный морфогенез органов иммунной системы потомства самок, подвергшихся иммуностимулирующему воздействию в ранние сроки беременности. // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции. - Новосибирск. - 2013. - С.119-120.
19. Обернихин С.С., Яглова Н.В. Состояние противоопухолевого иммунитета у потомства самок мышей, подвергшихся иммуностимулирующему воздействию в ранние сроки беременности. //«Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии»: Труды XXI международной конференции и дискуссионного научного клуба. - Украина, Ялта. - 2013. - С.
20. Яглова Н.В., Обернихин С.С. Регуляторная роль тучных клеток в морфо-генетических процессах органов иммунной системы потомства мышей, перенесших активацию иммунной системы в ранние сроки беременности. // Клиническая и экспериментальная морфология. - 2013. -№2. - С.62-68.
21. Обернихин С.С. Изменения постнатального морфогенеза иммунной системы потомства как следствие активации иммунной системы матери в раннс-ие сроки беременности. // VII М1жнародний Конгрес з 1нтегративноТ Антропологии: Сборник научных трудов. - Украина, Винница. - 2013. - С.124-125.
22. Обернихин С.С., Яглова Н.В. Активация иммунной системы материнского организма на ранних сроках беременности как фактор риска развития транзи-торной наследуемой очаговой алопеции у потомства. // Международная научная конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии»: Сборник научных трудов. - 2014. - С. 213-216.
23. Обернихин С. С., Яглова И. В. Очаговая алопеция у потомства самок С57В1/6 как результат активации иммунной системы материнского организма на ранних сроках беременности. // «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии»: Труды XXII международной конференции и дискуссионного научного клуба. - Крым, Ялта, - 2014. - С. 45-
24. Яглова Н.В., Обернихин С.С. Развитие кожи и её производных у потомства самок мышей, перенесших активацию иммунной системы в ранние сроки беременности. // Клиническая и экспериментальная морфология. - 2014. - №2. -
80-81.
47.
С. 50-57.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИД - индекс дегрануляции ИЛ - интсрлейкин Кон А - конканавалин А ЛПС - липополисахарид
ПАЛМ - периартериальная лимфатическаяе муфта
СГК — средний гистохимический коэффициент
ТФР-р - трансформирующий фактор роста р
ФНО-а - фактор некроза опухоли а
ШИК - Шифф-йодная кислота
aGc - aGalactosylceramide, а-галактозилцерамид
CD - cluster of differentiation, кластер дифференцировки
NK - natural killer, естественный киллер
NKT - natural killer T-cell, NKT-клетка
Wnt - wingless+INT, сигнальный путь Wnt
и-1 7 ?99
Подписано в печать: 02.10.2014
Заказ № 10254 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferal.ru
2014157506
-
Обернихин, Сергей Станиславович
-
доктора медицинских наук
-
Москва, 2014
-
ВАК 03.03.04
- Морфологические изменения головного мозга, надпочечников и гонад потомства крыс, перенесших эмоциональный стресс
- Эффекты воздействия электромагнитного поля радиочастотного диапазона на систему крови и репродуктивную функцию экспериментальных животных
- Физиологические аспекты влияния углеродного наноструктурного материала "Таунит" на организм самок белых мышей и их потомство
- Биологические эффекты пролонгированного антенатального γ-облучения на фоне экспериментально индуцированных тиреопатий
- Биологические эффекты пролонгированного антенатального облучения на фоне экспериментально индуцированных тиреопатий
