Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли эпигенетических механизмов в модификации поведения, определяемой условиями выращивания потомства мышей линии 129SV

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли эпигенетических механизмов в модификации поведения, определяемой условиями выращивания потомства мышей линии 129SV"

На правах рукописи

Буренкова Ольга Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ В МОДИФИКАЦИИ ПОВЕДЕНИЯ, ОПРЕДЕЛЯЕМОЙ УСЛОВИЯМИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПОТОМСТВА МЫШЕЙ ЛИНИИ 1298У

03.03.01 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

20 сдр?::/,

____Москва-2014

005546073

005546073

Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина» РАМН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент, заведующая

лабораторией системогенеза поведения ФГБУ «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина» РАМН Зарайская Ирина Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии

человека и животных биологического факультета ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» Дубынин Вячеслав Альбертович

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией нейроиммунопатологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН Морозов Сергей Георгиевич

Ведущая организация: ФГБУН Институт Высшей Нервной Деятельности и

Нейрофизиологии РАН

Защита диссертации состоится «15» мая 2014 года в 11.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.008.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина» РАМН по адресу: 125009, г. Москва, ул. Моховая, д. 11, стр. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина» РАМН. Автореферат разослан «14» марта 2014 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Кубряк О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Ранний постнатальный опыт оказывает долговременное влияние на формирование поведенческого фенотипа. Предполагается, что в основе этого лежат эпигенетические модификации генома нервных клеток (Colvis С.М. et al., 2005), играющие важную роль в пластичности нервной системы новорожденных и взрослых животных (Liu D. et al., 1997; Francis D. et al., 1999; Caldji C. et al., 2000; Liu D. et al., 2000; Bredy T.W. et al., 2003; Bredy T.W. et al., 2004; Weaver I.C.G. et al., 2004; Weaver I.C.G. et al., 2006; Pedersen C.A. et al., 2011; Lindeyer C.M. et al., 2013). К наиболее изученным эпигенетическим модификациям, возникающим в ответ на воздействия среды, относятся метилирование ДНК и посттрансляционные модификации гистонов, определяющие транскрипционную активность генов (Dulac С., 2010). В связи с этим исследование эпигенетических механизмов модификаций поведения - актуальная проблема современной нейробиологии и физиологии ЦНС. Настоящее исследование направлено на изучение влияния средовых эпигенетических стимулов посредством модификации гистонов в мозге на долговременную модификацию поведения.

Поведение незрелорождающихся млекопитающих формируется под постоянным материнским контролем (Ciaessens S.E. et al., 2011). Закономерно, что отношения мать-детеныш определяют физическое развитие и формирование поведения у грызунов (Fleming A.S. et al., 1999; Cameron N.M. et al., 2005) и человека (Heim С., Nemeroff C.B., 2001; Hedges D.W., Woon F.L., 2011). Это было продемонстрировано с помощью моделей пре- и постнатального стресса, депривации потомства от матери, хэндлинга, вариации уровня материнского ухода за потомством у грызунов (Anisman H. et al., 1998; Francis D. et al., 1999; Caldji C. et al., 2000; Champagne F. et al., 2003; Cirulli F. et al., 2003; Colvis C.M. et al., 2005; Pryce C.R. et al., 2005; Champagne D.L. et al., 2008; Franklin T.B. et al., 2010).

Хэндлинг (3-15-минутное отсаживание детенышей от самки, сопровождающееся тактильной стимуляцией) в раннем постнатальном периоде оказывает благоприятное воздействие на эмоциональные и когнитивные характеристики взрослых животных (Levine S., 1956; Denenberg V.H., Haltmeyer G.C., 1967; Levine S. et al., 1967; Meaney M.J. et al., 1988; Meerlo P. et al., 1999; Caldji C. et al., 2000; Kosten T.A. et al., 2007). Противоположное, отрицательное, действие оказывает длительная депривации потомства от самки (3-24 ч) (Huot R.L. et al., 2002; Kalinichev M. et al., 2002; Uysal N. et al., 2005; Aisa B. et al., 2007, 2008, 2009), приводящая к снижению уровня ацетилирования гистонов в мозге выросшего потомства (Tesone-Coelho С. et al., 2013).

Наблюдения за детско-материнскими отношениями лабораторных крыс и мышей в первую неделю жизни показали, что в их популяции имеют место естественные вариации

уровня материнского ухода за потомством (Meaney M.J., 2001; Champagne F. et al., 2003; Wei L. et al., 2010; Pedersen C.A. et al., 2011). Эти различия сильно сказываются на экспрессии генов и поведении потомства в будущем (Liu D. et al., 1997; Caldji С. et al., 1998; Francis D. et al., 1999; Champagne F. et al., 2001; Meaney M.J., 2001; Champagne F. et al., 2003; Pedersen C.A. et al., 2011). Показано, что механизмом, определяющим поведенческий фенотип потомства самок с различным уровнем материнского ухода, является различие в уровне метилирования ДНК промотора гена глюкокортикоидных рецепторов в нейронах гиппокампа и в уровне ацетилирования гистона НЗ в области этого же промотора (Weaver I.C.G. et al., 2004). Экспериментальная модуляция молекулярных эпигенетических механизмов в этой модели приводит к изменению поведенческого фенотипа крыс (Weaver I.C.G. et al., 2004; Weaver I.C.G. et al., 2006).

Одним из методов вмешательства в эпигенетические механизмы является блокада гистондеацетилаз (HDAC - histone deacetylases), приводящая к увеличению уровня ацетилирования гистонов в мозге. К изученным и доступным ингибиторам HDAC относятся трихостатин А, бутират натрия, вальпроевая кислота и ряд других, каждый из которых обладает различной степенью селективности к классическим изоформам HDAC (Roth T.L., Sweatt J.D., 2009).

Таким образом, эпигенетические механизмы, в том числе ацетилирование гистонов, играют важную роль в пластичности нервной системы как новорожденных, так и взрослых животных, и одним из главных инструментов для исследования этих механизмов является блокада гистоновых деацетилаз.

Однако попытка исследования влияния введения блокаторов гистоновых деацетилаз в первую неделю жизни, являющуюся критическим периодом для формирования будущего эпигенетического статуса животных, на модификацию поведенческого фенотипа животных до сих пор не предпринималась. В литературе отсутствуют данные о роли эпигенетических стимулов в формировании поведенческого фенотипа в раннем постнатальном периоде, в частности, результативности обучения лабораторных мышат, о соотношении результатов этого обучения с поведенческим фенотипом взрослых животных в зависимости от условий выращивания в раннем онтогенезе, о влиянии эпигенетических стимулов на результаты обучения детенышей следующего поколения.

Удобным объектом для исследования долговременной модификации поведения, определяемой условиями выращивания потомства мышей, а также роли эпигенетических механизмов в этом процессе являются мыши линии 129Sv, поскольку в раннем постнатальном периоде они характеризуются высокой поведенческой пластичностью при изменении уровня материнского ухода (Александрова Е.А. с соавт., 2005).

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение влияния изменения уровня ацетилирования гистонов в мозге мышей линии 129Бу в первую неделю жизни на формирование их поведенческого фенотипа в двух поколениях

В соответствии с поставленной целью конкретными задачами работы были:

1. Исследование влияния блокады гистоновых деацетилаз у мышат линии 1298у на фоне депривации от матери в первую неделю жизни на раннее обонятельное обучение мышат, непосредственно подвергавшихся воздействию, и мышат следующего поколения;

2. Исследование влияния блокады гистоновых деацетилаз и депривации от матери в первую неделю жизни самок мышей линии 129Бу на стиль их материнского поведения;

3. Исследование влияния блокады гистоновых деацетилаз и депривации от матери в первую неделю жизни самцов мышей линии 1298у на их поведенческий фенотип во взрослом возрасте.

Научная новизна работы

Впервые показано, что 45-60-минутная депривация от матери в раннем постнатальном периоде, сопровождающаяся тактильной стимуляцией, ухудшает результаты раннего обонятельного обучения. Установлено, что влияние эпигенетических стимулов на формирование поведенческого фенотипа лабораторных мышей, в том числе на раннее обучение, имеет зависящий от пола характер: под влиянием многократных инъекций вальпроата натрия избирательное улучшение результатов раннего обонятельного обучения наблюдается у самцов, а у самок к этому эффекту приводят многократные инъекции физиологического раствора. В работе впервые дана характеристика долговременного влияния блокатора гистоновых деацетилаз на формирование поведенческого фенотипа потомства: изменение уровня материнского ухода у самок и эмоционального профиля у самцов. Также впервые показано влияние введения блокатора гистоновых деацетилаз в раннем постнатальном возрасте на результаты раннего обонятельного обучения детенышей следующего поколения.

Научно-практическая значимость работы

Результаты этой работы позволят расширить представления о механизмах долговременных модификаций поведения, обусловленных эпигенетическими воздействиями на организм. Исследование биологических механизмов, лежащих в основе долговременного влияния условий окружающей среды в раннем постнатальном периоде, имеет важное прикладное значение, поскольку их знание может быть использовано в терапевтических целях для профилактики и лечения последствий неблагоприятных событий в раннем возрасте. Так, поскольку исследуемые эпигенетические механизмы долговременной модификации поведения

могут лежать в основе различных форм заболеваний (формирование зависимости к алкоголю и наркотикам, невротические и постстрессорные состояния) и являться объектом для создания новых подходов к их коррекции, большое значение имеют показанные в данной работе гендер-зависимые особенности влияния эпигенетических стимулов, свидетельствующие о необходимости применения различных подходов при работе с особями каждого пола.

Положения, выносимые на защиту

1. Ежедневная депривация от матери продолжительностью 45-60 мин в течение первой недели жизни приводит к изменению фенотипа животных. Наибольшее влияние этих условий выращивания на модификацию поведения показано в раннем онтогенезе. Долговременные эффекты депривации на поведенческий фенотип взрослых животных выражены слабее.

2. Вмешательство в эпигенетические механизмы модификации поведения путем блокады гистоновых деацетилаз в раннем постнатальном периоде развития мышей оказывает гендер-зависимое действие на раннее обонятельное обучение. Данная экспериментальная процедура также оказывает долговременные эффекты на фенотип взрослых животных обоих полов, как и на фенотип детенышей следующего поколения.

3. Воздействие блокады гистоновых деацетилаз приводит к коррекции модификаций поведенческого фенотипа детенышей и взрослых самок, вызванных такими манипуляциями в раннем постнатальном периоде, как депривация от матери и введение физраствора.

Апробация работы

Результаты исследования доложены и обсуждены на XXI Съезде физиологического общества им. Павлова (Калуга, 2010); 8м Международном конгрессе по нейронаукам IBRO (Флоренция, 2011); Конференции молодых ученых «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2011); V Всероссийской конференции по поведению животных (Москва, 2012); 8м Форуме FENS (Барселона, 2012); конференциях Отдела системогенеза НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (2010-2013); Итоговых сессиях НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (2011-2014).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методики экспериментов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 155 страницах, содержит 27 рисунков, 5 таблиц и 11 приложений. Библиографический указатель содержит 217 источников, из них 12 на русском и 205 на иностранных языках.

Публикации

Основное содержание диссертации отражено в 3 статьях, опубликованных в журналах, входящих в «Перечень российских рецензируемых научных журналов ...» ВАК РФ, и 13 тезисах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены в соответствии с требованиями приказа № 267 МЗ РФ (19.06.2003 г.), «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (этическая комиссия НИИ нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН, протокол №1 от 03.09.2005г.).

В работе было использовано 540 детенышей обоих полов из 92 пометов и 60 взрослых самцов мышей инбредной линии 129Sv. Мышей содержали совместно по 2-3 особи (1 самец и 1-2 самки) в стандартных пластиковых клетках размером 18x24x14 см (П|хДхВ) с подстилкой из древесных опилок, при свободном доступе к воде и корму, при естественном световом режиме и температуре 20-24°С. Самок с видимыми признаками беременности отсаживали в клетки размером 23x40x18 см. За несколько дней до ожидаемых родов ежедневно в одно и то же время проверяли наличие новорожденных мышат. День их обнаружения принимали за 1-е постнатальные сутки (ПС). Перед началом всех ежедневных манипуляций с потомством самку отсаживали от помета. На 2ПС определяли пол и массу мышат, наносили и затем поддерживали индивидуальные метки. В гнездовом периоде в экспериментах использовали мышат обоих полов.

Определение уровня ацетилирования гистона НЗ в мозге мышей линии 129Sv после их выращивания в разных условиях на первой неделе жизни

В качестве блокатора гистоновых деацетилаз был выбран вальпроат натрия, поскольку его подкожное введение в дозировке 50 мг/кг на 1ПС хорошо переносится мышатами и в то же время ведет к значимому повышению уровня ацетилирования гистона НЗ в их мозге (Murray Е.К. et al., 2009). Это вещество также известно как противосудорожный препарат, однако при введении малых доз, к которым относится и выбранная нами (50 мг/кг), эти эффекты не наблюдаются (Johannessen C.U., Johannessen S.I., 2003).

На 7ПС животные всех экспериментальных групп подвергались декапитации, мозг извлекали без мозжечка и немедленно замораживали в парах жидкого азота. Образцы мозга хранились при температуре -80°С.

Анализ уровня ацетилирования гистона НЗ в мозге детенышей производили методом Вестерн Блоттинга по протоколу Мюррэй с коллегами (Murray Е.К. et al., 2009).

Для анализа влияния производившихся экспериментальных процедур на уровень ацетилирования гистона НЗ в мозге детенышей использовали следующие группы животных:

1. «интактные» — без экспериментального воздействия;

2. «депривация» - процедура депривации от матери, сопровождающаяся тактильной стимуляцией (непродолжительное выкладывание на гладкую поверхность, поглаживание в руках), с ЗПС по 6ПС общей продолжительностью 45 мин/сут;

3. «физраствор многократный» - процедура депривации от матери общей продолжительностью 60 мин/сут, сопровождающаяся инъекциями физраствора один раз в сутки подкожно в область спины с помощью микрошприца в объеме 25 мкл с ЗПС по 6ПС;

4. «вальпроат многократный» — процедура депривации от матери, сопровождающаяся инъекциями вальпроата натрия, растворенного в физрастворе в дозировке 50 мг/кг, по той же схеме.

Влияние депривации от матери, сопровождающейся тактильной стимуляцией, в раннем постнаталыюм периоде на результаты раннего обонятельного обучения

Экспериментальная серия была проведена для выяснения влияния процедуры депривации от матери в первую неделю жизни на результаты раннего обонятельного обучения как раннего маркера запуска процесса изменения поведенческого фенотипа животных.

Процедура депривации от матери проводилась по вышеописанному протоколу. Интактных мышат впервые брали в руки на 8ПС, до этого никаких манипуляций с ними не производили.

Процедура обонятельного обучения с имитацией материнского подкрепления

На 8ПС мышат, как подвергавшихся, так и не подвергавшихся процедуре депривации, включали в одну из 3-х экспериментальных групп: «обучение», «мятный контроль», «контроль без запаха». Обучение проводили в боксах с двойным дном размером 10x10 см и высотой бортика 6 см. Под перфорированным полом бокса находились опилки, смоченные спиртовой настойкой мяты перечной - источником нового запаха. Каждое животное группы «обучение» помещали в бокс и поглаживали кисточкой в течение 10-ти 30-секундных интервалов с перерывами в 30 сек, имитируя тактильную стимуляцию, получаемую при материнском груминге. Каждого мышонка из группы «мятный контроль» помещали в такой же бокс на 10 мин без поглаживания. Каждого мышонка из группы «контроль без запаха» на 10 мин помещали в бокс с чистыми опилками.

Спустя 24 часа проводили тестирование на обонятельную дискриминацию с помощью пластиковой камеры с двойным дном размером 20x20 см и высотой бортика 6 см. Под перфорированным полом камеры со сплошной («нейтральной») полосой шириной 10 мм по

центру находилось два равных отсека, один из которых был заполнен чистыми опилками, другой — опилками, смоченными настойкой мяты (тестовый отсек). Мышонка помещали на «нейтральную» полосу площадки и в пяти 60-секундных попытках с перерывами в 60 сек регистрировали время нахождения над каждым отсеком площадки. Рассчитывали процентную долю времени, проведенного каждым животным над тестовым отсеком в течение 300 секунд, составлявших 5 попыток.

Влияние введения вальпроата натрия в раннем постнатальном периоде на долговременную модификацию фенотипа

Рис. 1. Общая схема экспериментальной серии

исследования влияния введения вальпроата натрия в раннем постнатальном периоде на долговременную модификацию поведенческого фенотипа.

Стрелки указывают на дни, в которые были сделаны инъекции.

В одном экспериментальном помете, как правило, присутствовали детеныши всех групп: «физраствор многократный» и «вальпроат многократный» (см. вышеописанный протокол, Рисунок 1), «физраствор однократный» и «вальпроат однократный» (однократные инъекции на ЗПС), «депривация без инъекций» («депривация б/и») (отсаживание от самок одновременно с детенышами остальных групп до начала манипуляций с ними, но без инъекций). Инъекции физраствора как растворителя вальпроата натрия служили контролем к инъекциям вальпроата. Однократная инъекция вальпроата служила контролем к многократной, поскольку известно, что вызываемое введением вальпроата натрия увеличение уровня ацетилирования гистонов в мозге детенышей наблюдается в течение 24 ч (Murray Е.К. et al., 2009).

На 5ПС, либо 6ПС через полчаса после проведения экспериментальных процедур часть мышат возвращали в гнездо, а часть помещали в наиболее удаленную от гнезда область домашней клетки. В клетку возвращали самку, начинали 30-минутную видеозапись, первые 5 мин которой занимал тест переноса: регистрировали длительность переноса самкой каждого детеныша в гнездо.

На Рисунке 1 приведена общая схема экспериментов.

р.. Материнское поведение <л. самок F0 ° —I-1—I—ММ-1-1-р

И

дни после рождения: РО депривация без иньекций | однократное введение э физ.раствора ц многократное введение " физ.раствора я однократное введение ■ вальпроата натрия

■ многократное введение вальпроата натрия

РЗ РА Р5 Р6 t

t t t t t

t t t t

Ссаживание самцов F1 с самками

Обучение Тест на Т - лабиринт Т - лабиринт УРЗ контекст день 1 день 2

РО РТ РЛ PR PR

В программе «Segment Analyzer» на полученных видеозаписях выделяли отдельные поведенческие акты. Всего выделяли 21 акт, который относили к нескольким категориям, которые представлены в Таблице 1.

Табл. 1. Классификация поведенческих актов самок в домашней клетке с потомством.

Поведение, не связанное с потомством

Поведение вне гнезда, не связанное с потомством

Исследовательское поведение

Поведение самообеспечения

Поведение в гнезде, не связанное с потомством

Поведение, связанное с потомством

Поведение в

гнезде, связанное с потомством

Поведение вне гнезда, связанное с потомством

Другое

Активное

обследование — самка перемещается по клетке.

Рытье опилок — самка роет опилки, не составляющие непосредственно гнездо.

Стойки — самка стоит только на задних лапах. Пассивное обследование — самка сидит вне гнезда, обследование ограничивается поворотами головы. Лазание по решетке — самка лазает по решетке клетки.

Чистка себя — самка чистит себя.

Еда, питье — самка ест корм или пьет воду. Отдых - самка лежит вне гнезда одна, глаза

закрыты.

Вход в гнездо и выход из

гнезда.

Самка не делает ничего определенного в гнезде — самка не

вовлечена в контакт с потомством, осматривается, перемещается по гнезду, становится в стойки.

Чистка себя в гнезде - самка чистит себя.

Обследование детенышей в гнезде — самка обследует детенышей, находящихся в гнезде,

рассматривает и обнюхивает их.

Груминг детенышей — самка чистит детенышей. Кормление — самка лежит почти

неподвижно, детеныши в основном находятся под ней.

Кормление с чисткой — самка кормит детенышей и одновременно чистит их.

Краткие контакты с детенышами вне гнезда — самка

приближается к детенышам, выложенным из гнезда,

обнюхивает их, но не чистит и не переносит. Перенос по клетке — самка переносит детеныша.

Нахождение под опилками — самка вместе с детенышами находится под опилками в гнезде, так что в ее поведении нельзя строго выделить какие-либо акты. Чистка себя или детенышей — не понятно, себя или

детенышей самка чистит. Занятие гнездом - самка подгребает к гнезду опилки, находясь как внутри, так и вне гнезда, приносит опилки из

других участков клетки.

У каждой самки рассчитывали показатель процентной доли продолжительности каждого типа актов и каждой категории от общей продолжительности наблюдения, равной 30 минутам, и показатель числа актов (%) каждого типа и каждой категории от общего числа актов, наблюдавшегося у данной самки.

Процедура обонятельного обучения с имитацией материнского подкрепления

Процедура обучения мышат в этой экспериментальной серии была идентична процедуре, описанной ранее, за исключением отсутствия группы «мятный контроль». Дополнительно рассчитывали число животных (в процентах) в каждой группе, предпочитающих отсек с мятой (т.е. животных, у которых процент времени, проведенного над отсеком с мятой, суммарно по 5-и попыткам превышал 50%).

Батарея развитийных тестов

Перед началом всех тестов самку отсаживали в отдельную клетку, а детенышей - в индивидуальные боксы на 30 мин. Сроки проведения тестов представлены на Рисунке 2.

Для проведения теста достижения гнезда часть помета отсаживали на противоположный от гнезда конец клетки, а остальных возвращали в гнездо. Регистрировали длительность достижения детенышами гнезда в течение 300 сек.

В тесте достижения опоры горизонтальной перекладины каждого детеныша помещали передними лапами на горизонтальную гладкую деревянную цилиндрическую перекладину диаметром 0,3 см и длиной 15,5 см, горизонтально закрепленную на двух вертикальных опорах на высоте 15,5 см от поверхности стола. В течение 120 сек регистрировали длительность достижения опоры.

Непосредственно после проведения этого теста проводили тест спуска в чистую клетку. На платформу размером 9x9 см и высотой 9,5 см, помещенную в чистую пустую клетку для мышей, высаживали каждого мышонка и в течение 120 сек регистрировали длительность спуска с платформы. Сразу после тестирования всего помета проводили тест спуска в домашнюю клетку. Тест был аналогичен предыдущему, но платформа располагалась в домашней клетке каждого помета.

У животных также отмечали степень открывания глаз: балл «1» присваивали, если оба глаза были полностью открыты, а балл «0» в остальных случаях.

На 21-22ПС пометы отсаживали от самок в клетки размером 18x24x14 см, на 30-35ПС животных рассаживали по полу в такие же клетки, а на 60-65ПС ссаживали в пары: всех самок ссаживали с самцами, не принадлежащими к вальпроатным группам, а самцов, принадлежащих к вальпроатным группам, ссаживали с самками, не принадлежащими к экспериментальной серии.

Постнатальные сутки 1 Однократные инъекции Многократные инъекции Обучение обонятельному предпочтению Тестирование обонятельного предпочтения Тест переноса Тест достижения гнезда Тест достижения опоры перекладины Тест спуска в чистую клетку Тест спуска в домашнюю клетку Анализ открытия глаз

Рис. 2. Схема сроков проведения различных экспериментальных манипуляций.

2 3 4 5 6 7 8 Э 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Исследование поведения взрослых самцов, подвергавшихся в раннем постнатальном периоде различным экспериментальным воздействиям

Взрослых самцов всех вышеописанных групп тестировали сначала в Открытом поле (ОП) (в возрасте 102-111ПС), на следующий день в Приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ), спустя неделю их обучали условнорефлекторному замиранию (УРЗ), на следующий день проводили тестирование условнорефлекторного замирания на обстановку, спустя еще неделю тестировали в Т-лабиринте.

Открытое поле

Данный тест служил для оценки уровня тревожности животных (Prut L., Beizung С., 2003). Каждого самца помещали в центр установки, диаметр которой составлял 100 см, высота бортика 42 см. Сразу после помещения животного в установку с помощью программы «Easy Track Light» в течение 15 минут вели видеорегистрацию, сопровождавшуюся регистрацией траектории перемещения животного. Рассчитывали отношение длины траекторий в периферической (начиная от бортика и на расстоянии 10 см от него) и центральной зоне (радиусом 15 см от центра арены) к общей длине траектории.

Приподнятый крестообразный лабиринт

Данный тест также служил для оценки уровня тревожности животных (Carobrez А.Р., Bertoglio L.J., 2005). Длина каждого рукава составляла 28 см, ширина 5 см, высота стенок закрытых затемненных рукавов 16 см, высота бортика открытых рукавов 0,5 см, высота лабиринта над полом 55 см, размер центральной площадки 5Х5 см. Самца помещали в центр установки ПКЛ и в течение 10 мин, как и в предыдущем тесте, вели регистрацию перемещения животного. Рассчитывали отношение длины траекторий в закрытых и открытых рукавах к общей длине траектории.

Обучение условнорефлекторному замиранию на обстановку

Данная модель служила для исследования гиппокамп-зависимой долговременной ассоциативной памяти (Fanselow M.S., 1980; Rudy J.W. et al., 2004). Каждого самца помещали в пластмассовую экспериментальную камеру размером 25x32x30 см с тремя непрозрачными и одной прозрачной стенкой и электродным полом. Схема эксперимента представлена на Рисунке 3.

120

Рис. 3. Схема протокола обучения условнорефлекторному замиранию и тестирования условнорефлекторного замирания на обстановку.

обучение

I 24 ч

300

сек

тестирование

Т-лабиринт

Модель спонтанного чередования рукавов Т-лабиринта использовали для оценки рабочей пространственной памяти (Dudchenko P.A., 2004; Deacon R.M.J., Rawlins J.N.P., 2006). Высота Т-образного лабиринта составляла 15 см, ширина всех рукавов - 10 см, длина стартового рукава - 32 см, боковых рукавов - по 30 см каждый. Самца помещали в стартовый отсек лабиринта и в течение 90 сек регистрировали время пересечения животным границ левого или правого тестовых рукавов, оставляя животного в выбранном рукаве на 30 сек. Через 60 сек после окончания попытки самца возвращали в стартовый отсек для второй попытки и вновь регистрировали латентный период входа в тот или иной тестовый рукав. В течение 2-х дней каждый самец проходил по три пробы по две попытки в каждой. По результатам шести проб рассчитывали процентную долю верного чередования - проб с последовательным посещением различных рукавов в двух попытках одной пробы.

Исследование поведения взрослых самок (FI), подвергавшихся в раннем постнатальном периоде различным экспериментальным воздействиям

С соблюдением описанных выше правил от каждой самки Fl получали пометы, которые на 2-ЗПС взвешивали и метили. На 5ПС, либо 6ПС проводили тест переноса и видеорегистрацию материнского поведения по описанной выше схеме.

Процедура обучения мышат второго поколения (F2)

Процедура обучения и тестирования мышат второго поколения была аналогична процедуре обучения и тестирования мышат первого поколения.

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «STAT1STICA 6.0». Поскольку не все данные имели нормальное распределение, использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни и критерий Вальда-Вольфовитца (WaldWolfowitz Runs Test), а также анализ эмпирических и теоретических частот (observed vs expected frequency, у2). Показатели числа животных (в процентах), предпочитающих тестовый отсек, оценивали с помощью непараметрического критерия х2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В связи с растущим числом исследований, посвященных эпигенетическим механизмам влияния раннего опыта на формирование поведенческого фенотипа животных, нами была поставлена задача исследования влияния изменения уровня ацетилирования гистонов в мозге мышей линии 129Sv в первую неделю жизни путем блокады деацетилирования гистонов на модификацию поведенческого фенотипа животных как в раннем онтогенезе, так и во взрослом возрасте.

Манипуляции с детенышами в раннем постнатапьном периоде сопряжены с вмешательством в отношения матери с потомством. Результирующий эффект таких манипуляций (в частности, введения блокатора гистоновых деацетилаз) определяется несколькими факторами: а) депривацией потомства от матери и хэндлингом потомства; б) влиянием изменения уровня материнского ухода в ответ на экспериментальные манипуляции и в) собственно эффектом вводимого вещества.

В нашем исследовании мы использовали протокол воздействия, промежуточный между протоколом хэндлинга (3-15 мин) и протоколом депривации (3-24 ч): продолжительность манипуляций с потомством во всех группах, за исключением «интактной», составляла 45-60 мин. Именно столько времени требовалось для проведения экспериментальных процедур в гнездовом периоде.

Использование нами данного протокола депривации привело к изменению поведенческого фенотипа детенышей уже на ранних этапах постнатального развития. Обучение предпочтению нового запаха, которое мы использовали как ранний маркер изменения поведенческого фенотипа, было нарушено у животных, подвергавшихся депривации от матери в раннем онтогенезе (Рисунок 4).

Рис. 4. Процентная доля времени, проведенного над тестовым отсеком (% от 300 сек) (среднее значение ± стандартная ошибка). Белые столбики - «контроль без запаха», заштрихованные - «мятный контроль», черные - «обучение». * - р<0,05 (и-критерий Манна-

Уитни). интактные депривация

Определение уровня ацетилирования гистона НЗ показало, что выявленное нами снижение его в мозге детенышей из группы «депривация» к концу первой недели могло быть причиной нарушения обучения (Рисунок 5). Это свидетельствует о модуляции эпигенетических молекулярных механизмов в мозге, вызванной нашей процедурой депривации. В работе 2013 г. (ТеБопе-СоеШо С. е1 а1., 2013) авторы продемонстрировали, что депривация крысят от матери с 1ПС по 14ПС также приводила к снижению уровня ацетилирования гистонов НЗ и Н4 в дорзальном стриатуме и сердцевине прилежащего ядра мозга животных во взрослом возрасте.

2,5

Рис. 5. Уровень ацетилирования гистона НЗ, пронормированный на содержание актина в мозге мышат (7ПС) и усредненный по обоим полам. * - р<0,05 (критерий Вапьда-Вольфовитца).

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

физраствор вальпроат

интактные депривация

мног

мног

Известно, что повышение уровня ацетилирования гистонов в мозге при введении взрослым животным блокаторов гистоновых деацетилаз улучшает обучение (Levenson J.M. et al., 2004; Yeh S.-H. et al., 2004; Vecsey C.G. et al., 2007). К аналогичным результатам приводит высокий уровень материнского ухода в первую неделю жизни (Bredy T.W. et al., 2003). В гиппокампе взрослого потомства самок крыс с высоким уровнем материнского ухода наблюдается повышенный уровень ацетилирования гистона НЗ (Weaver I.C.G. et al., 2004).

В нашей работе при многократных инъекциях вальпроата натрия была выявлена различная чувствительность самцов и самок потомства мышей к блокаде гистоновых деацетилаз в первую неделю жизни. Число предпочитающих запах мяты обученных самцов в группе «вальпроат многократный» было значимо выше, чем необученных (Рисунок 6А). Подобного различия у самок не наблюдалось. Эти результаты могли свидетельствовать о восстановлении вальпроатом уровня обучения у самцов до исходного значения, характерного для интактных мышат линии 129Sv и сниженного различными манипуляциями с детенышами в раннем постнатальном периоде (депривацией от матери, введением физраствора). У самок положительное влияние на раннее обонятельное обучение наблюдалось при многократном введении физраствора (Рисунок 6Б).

Эти результаты могли быть обусловлены половыми различиями в уровне ацетилирования гистонов и в эпигенетических процессах в мозге самцов и самок на раннем этапе развития (Tsai Н. et al., 2009; Matsuda K.I. et al., 2012).

Полученные нами максимальные средние значения ацетилирования гистона НЗ наблюдались в группах «интактные» и «вальпроат многократный». Эти данные соответствовали результатам раннего обонятельного обучения самцов. Максимальная результативность раннего обучения наблюдалась в группе «интактные» и у самцов в группе «вальпроат многократный» (Рисунки 4 и 6), что говорит о прямой связи уровня ацетилирования гистона НЗ в мозге мышей в раннем онтогенезе и результативности раннего обонятельного обучения с материнским подкреплением. Такая закономерность была показана впервые.

ша

депр

б/и

ф/р одн

ы

ф/р вальп вальп мног одн мног

Рис. 6. Число мышат первого поколения (Fl), предпочитающих тестовый отсек (%): А - самцы, Б - самки. Белые столбики - контроль, черные - обучение. * - р<0,05. Крестом обозначены межполовые различия (р<0,05) (непараметрический критерий х2)-

Многократное введение вальпроата натрия благоприятно сказывалось также на координационных навыках при тестировании достижения опоры перекладины и поиска гнезда в тесте достижения гнезда (Рисунок 7). Это соответствует литературным данным о положительном влиянии вальпроата не только на когнитивные, но и на моторные функции. Известно, что использование блокаторов гистоновых деацетилаз ослабляет выраженность когнитивных и моторных нарушений, характерных для такого нейродегенеративного заболевания, как болезнь Хангтингтона (Abel Т., Zukin R.S., 2008).

В ДЕПР Б/И (Ш Ф/Р ОДН ES) ф/р мног И ВАЛЬП ОДН П ВАЛЬП мног

Рис. 7. Длительность достижения гнезда на 13ПС и 15ПС у самцов (А) и самок (Б) и достижения опоры перекладины на 19ПС у самцов (В) (среднее значение ± стандартная ошибка) (сек). * - р<0,05

(и-критерий Манна-Уитни).

13 15 19

Результаты теста переноса на 5-бПС показали, что самки осуществляли перенос детенышей различных групп в гнездо с одинаковой скоростью. По-видимому, поведение самок в данном тесте принадлежало к наиболее консервативной форме материнского поведения, проявление которой не зависело от состояния детенышей, либо данный тест оказался недостаточно чувствителен к изменениям уровня материнского ухода, происходившим в ответ

на экспериментальные воздействия, производимые нами в раннем постнатапьном периоде мышей первого поколения (Fl).

Структура материнского поведения самок всех экспериментальных групп была организована сходным образом. После возвращения самок в домашнюю клетку с потомством и обследования ими клетки, в том числе детенышей в гнезде, самки возвращали выложенных из гнезда детенышей обратно, собирали их вместе, приводя в порядок гнездовой материал, и начинали вылизывать детенышей, после чего принимали практически неподвижную позу кормления, нависая над пометом. Кормление периодически сопровождалось непродолжительными эпизодами вылизывания потомства и занимало большую часть 30-минутного наблюдения.

Материнское поведение интактных самок соответствовало поведению, характерному для самок линии 129Sv, описанному в литературе. В работе Шампань (Champagne F. et al., 2007) продолжительность кормления составляет у самок 70% от общего времени наблюдения, а по нашим данным - 58,9%.

Депривация от матери (группа «депривация б/и») по нашему протоколу не оказывала долговременного влияния на поведенческий фенотип выросших самок. Их поведение не отличалось от поведения самок, не подвергавшихся в раннем постнатапьном периоде депривации (интактных самок F0) (Рисунок 8).

* *

Р0 Р1 Р1 Р1 ЯО Р1 Р1 Р1 Р1 Р1

Рис. 8. Показатели актов и категорий поведения, связанного с потомством: А -продолжительность актов «кормление с чисткой» (%), Б - суммарное число актов из категории «поведение, связанное с потомством» (%) (среднее значение ± стандартная ошибка). * - р<0,05

(и-критерий Манна-Уитни).

Несмотря на снижение уровня ацетилирования гистона НЗ в мозге детенышей после депривации от матери, у них наблюдалось воспроизведение материнского поведенческого

фенотипа интактных самок. Это могло быть обусловлено недостаточной силой вмешательства, поскольку эффектом долговременной депривации от матери в раннем постнатальном периоде, как правило, является снижение уровня материнского ухода у выросших самок (Ьоую V. е1 а1., 2001).

Полученные результаты устойчивости материнского поведения выросших самок к ежедневной 60-минутной депривации, которой они подвергались в детстве, дают возможность сделать заключение о том, что наблюдаемые изменения в материнском поведении у выросших самок, подвергавшихся различным инъекциям, были обусловлены характером инъекций и вводимыми веществами. Анализ материнского поведения выявил долговременные изменения материнского поведенческого фенотипа в ответ на экспериментальные воздействия в раннем постнатальном периоде. Многократное введение физраствора с ЗПС по 6ПС привело к снижению уровня ацетилирования гистона НЗ в мозге детенышей (Рисунок 5), а во взрослом возрасте - к снижению уровня материнского ухода у самок линии 1295у по сравнению с интактными самками (Рисунки 8, 9).

8.5

мног Р1

Поведение в гнезде, ггтт, Поведение в гнезде,

^^ связанное с потомством не связанное с потомством г. -.

I:::! Другое

== Поведение вне гнезда, гт. Поведение вне гнезда,

связанное с потомством не связанное с потомством

Рис. 9. Диаграммы процентной доли продолжительности актов категорий поведения самок (%) (среднее значение).

Многократное введение вальпроата натрия привело к компенсации снижения уровня материнского ухода и ацетилирования гистона НЗ в мозге детенышей в результате депривации и инъекций физраствора до уровня, наблюдаемого у интактных животных (Рисунки 5, 8, 9). В частности, продолжительность актов поведения самок в гнезде, связанного с потомством, у интактных самок составляла 62,5%. У самок из группы «физраствор многократный» она снижалась и составляла 56,8%, а в группе «вальпроат многократный» она возрастала и достигала 72,9% (Рисунок 9). Полученные нами результаты увеличения уровня материнского

ухода в ответ на многократные инъекции вальпроата натрия в раннем онтогенезе согласуются с литературными данными (Francis D. et al., 1999; Weaver I.C.G. et al., 2004).

Процедура депривации не повлияла на уровень тревожности самцов в тестах ОП и ПКЛ (Рисунок 10). Ранее было показано, что депривация потомства мышей от матери в течение 180 мин на 0-1ЗПС, как и процедура 15-минутного хэндлинга в эти же сроки не сказывается на уровне тревожности взрослых самцов потомства мышей линии 129Sv (Millstein R.A, Holmes A., 2007). Многократное введение вальпроата привело к формированию поведенческого фенотипа с повышенным уровнем тревожности (Рисунок 10).

Рис. 10. Длина траектории, отнесенная к общей длине траектории (среднее значение ± стандартная ошибка): А - в периферической зоне Открытого поля, Б - в закрытых рукавах Приподнятого крестообразного лабиринта. * - р<0,05 (и-критерий Манна-Уитни).

Наши результаты свидетельствуют о том, что процедура депривации в детстве повлияла на результаты обучения взрослых самцов в модели УРЗ. Она приводила к снижению уровня замирания после обучения условнорефлекторному замиранию на обстановку во всех группах, кроме интактной, что может свидетельствовать о возможном нарушении обучения.

Эти результаты говорят также об отсутствии влияния введения вальпроата в 1-ю неделю жизни на данный вид обучения (Рисунок 11).

интакт де"Р

б/и

ф/р одн

ф/р мног

вальп вальп одн мног

интакт депР

б/и

вальп вальп одн мног

Рис. 11. Процент замирания (среднее значение ± стандартная ошибка): А - в течение 30 сек после последнего удара током, Б - в течение 5 минут при тестировании на обстановку спустя 24 ч. * - р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни).

Отсутствие влияния в нашем исследовании введения вапьпроата натрия в раннем онтогенезе на уровень обучения взрослых животных в модели УРЗ показано впервые и не противоречит литературным данным. Известно, что облегчающее действие блокаторов гистоновых деацетилаз на обучение наблюдается при небольшом интервале времени между введением блокатора и обучением (Yeh S.-H. et al., 2004; Vecsey C.G. et al., 2007; Kwon В., Houpt T.A., 2010). В нашем же исследовании он составил более 3-х месяцев. Известно также, что повышенный уровень обучения, наблюдаемый у взрослого потомства самок с высоким уровнем чистки и вылизывания детенышей и пребывания в позе кормления, продемонстрирован в моделях, не связанных со значительным воздействием стресса (Liu D. et al., 2000), в отличие от использованной нами модели УРЗ, чем также могли быть обусловлены отличия от полученных нами данных.

Показатель верного чередования в Т-лабиринте не отличался достоверно у самцов, принадлежащих к разным группам. Таким образом, на кратковременную пространственную память, оценивавшуюся нами в Т-лабиринте, не влияло ни одно из производившихся нами в раннем онтогенезе воздействий.

Полученные нами результаты поведения взрослых самцов в батарее тестов говорят о долговременных изменениях эмоционального, но не когнитивного профиля животных в ответ на введение вапьпроата натрия, которое усиливало тревожность взрослых животных. Эта манипуляция была в нашей модели аналогом воспитания детенышей самками с высоким уровнем материнского ухода, поскольку оба эти воздействия увеличивают уровень ацетилирования гистонов в мозге детенышей. Известно, что самцы крыс, потомки матерей с высоким уровнем ухода за потомством характеризуются сниженной тревожностью и

повышенным уровнем ацетилирования гистона НЗ в области промотора гена глюкокортикоидных рецепторов (Weaver I.C.G. et al., 2006), поэтому мы предполагали, что под воздействием инъекций вальпроата натрия может произойти снижение уровня тревожности. Однако полученные нами результаты свидетельствовали о высокой тревожности животных из группы «вальпроат многократный», что не соответствовало этим литературным данным.

В связи с этим следует отметить, что в процитированном выше исследовании была использована модель вариации уровня материнского ухода о потомстве у крыс, в которой использовали матерей, принадлежащих по уровню материнского ухода (вылизывания/груминга и позы кормления) к крайним точкам нормального распределения. Однако в этой же модели, но с использованием мышей, было показано, что тревожность самцов, воспитывающихся самками линии C57BI/6 с высоким уровнем материнского ухода, либо с низким его уровнем, не различается, а изменения эмоционального профиля наблюдаются лишь у взрослых самок Fl (Pedersen С.А. et al., 2011).

В нашем исследовании были использованы животные линии 129Sv, не проходившие предварительный отбор по этим показателям. В работе, проведенной также без предварительного отбора самок по уровню их материнского ухода, было показано, что выращивание мышат линии 129Sv самками С57В1/6, которые демонстрировали высокий уровень вылизывания и груминга, не приводит к изменению уровня тревожности взрослых мышей линии 129Sv обоих полов (Curley J.Р. et al., 2010).

Наблюдаемое в нашем исследовании повышение уровня тревожности, вероятно, обусловлено не изменением уровня материнского ухода в раннем онтогенезе, поскольку скорость переноса детенышей различных групп в гнездо не отличалась, а непосредственным действием вальпроата натрия на механизмы, не связанные напрямую с увеличением уровня ацетилирования в мозге: в первую неделю жизни его введение не привело к увеличению уровня ацетилирования гистона НЗ в мозге относительно уровня ацетилирования у интактных животных. Введение вальпроата натрия в первую неделю жизни помимо блокирующего действия на гистоновые деацетилазы, по-видимому, запускало другие механизмы, которые могли быть связаны с изменением как активности ГАМК-эргической системы (Johannessen С.U., Johannessen S.I., 2003), так и уровня метилирования ДНК (Detich N. et al., 2003; Milutinovic S. et al., 2007).

Результаты раннего обонятельного обучения мышат поколения F2 свидетельствуют о том, что экспериментальные воздействия, производившиеся в раннем постнатальном периоде с детенышами первого поколения (Fl), оказывали отставленное действие на уровень раннего обучения детенышей в следующем поколении (Рисунок 12). Дизайн нашего исследования и анализ сравнения материнского поведения самок F0 и самок Fl после однократного введения

им вальпроата в детстве указывает на возможность влияния вальпроата на уровень ацетилирования гистона НЗ в ооцитах самок Б1, подвергавшихся его инъекциям. Косвенным образом в пользу этого говорят данные о значении уровня ацетилирования гистона НЗ в постнатальном оогенезе у самок мышей (Kageyama в. е1 а1., 2007). Однако эта гипотеза требует дальнейшего самостоятельного исследования.

депр б/и

ф/р одн

Рис. 12. Процентная доля времени, проведенного над тестовым отсеком (% от 300 сек) мышатами женского пола второго поколения (Б2) (среднее значение ± стандартная ошибка) (А) и число мышат женского пола второго поколения (Р2), предпочитающих тестовый отсек (%) (Б). Белые столбики - «контроль», черные - «обучение». * — р<0,05 (А: и-критерий Манна-

Уитни, Б: непараметрический критерий х2)-

Вопреки распространенному мнению, согласно которому мыши линии 129ву характеризуются низким уровнем материнского ухода и слабыми когнитивными способностями, нами было продемонстрировано, что в действительности уровень материнского ухода самок этой линии, как и уровень раннего обонятельного обучения, был достаточно высок в отсутствие вмешательства в отношения мать-детеныш в раннем онтогенезе. Однако при наличии такого вмешательства (депривация потомства от самок, однократные и многократные инъекции физраствора) происходило снижение показателей уровня материнского ухода и раннего обучения, т.е. формирование поведенческого фенотипа мышей линии 129ЭУ, соответствующего общепринятым представлениям. Многократное введение вальпроата натрия приводило к формированию поведенческого фенотипа животных, характерного для интактных мышей линии 129ву, что могло свидетельствовать о коррекции изменений, происходивших в ответ на вмешательство в отношения матери с потомством.

Ниже приведена таблица, в которой задачи настоящего исследования сопоставлены с исходными рабочими гипотезами о предполагаемых результатах и полученными нами данными.

Табл. 2. Сводная таблица ожидаемых и полученных результатов.

Задачи исследования Ожидаемые результаты и обоснование Соответствие полученных результатов ожидаемым

раннее обучение депривация от матери (П) ухудшение: предположительно посредством снижения уровня материнского ухода и уровня ацетилирования гистонов +

многократное введение вальпроата натрия №1) улучшение: посредством увеличения уровня ацетилирования гистонов +

депривация от матери (Р2) ухудшение: предположительно посредством снижения уровня материнского ухода, а затем посредством воспроизведения стиля материнского поведения у самок Р1 +

многократное введение вальпроата натрия №2) улучшение: предположительно посредством увеличения уровня материнского ухода у самок Р1 -: отсутствие долговременного эффекта многократного введения вальпроата

материнское поведение депривация от матери (Р1) ухудшение: посредством снижения уровня ацетилирования гистонов -: отсутствие эффекта предположительно из-за недостаточной силы 60-минутной депривации

многократное введение вальпроата натрия улучшение: посредством увеличения уровня ацетилирования гистонов +

фенотип взрослых самцов депривация от матери (Р1) увеличение тревожности: предположительно посредством снижения уровня материнского ухода -: отсутствие эффекта предположительно из-за недостаточной силы 60-минутной депривации

многократное введение вальпроата натрия №1) снижение тревожности: предположительно посредством увеличения уровня ацетилирования гистонов во взрослом возрасте -: увеличение тревожности предположительно из-за вовлечения других механизмов

Примечания: «+» обозначено соответствие ожидаемым данным, «—» обозначено несоответствие ожидаемым данным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа была продиктована необходимостью исследования вклада эпигенетических механизмов в долговременную модификацию поведения мышей 1295у, определяемую условиями выращивания потомства. Для этого были использованы модель вмешательства в отношения мать-детеныш путем депривации потомства от матери, а также модель блокады гистоновых деацетилаз в раннем постнатапьном периоде у мышей линии 129Яу. Эти манипуляции привели к изменению поведенческого фенотипа животных на ряде уровней: в раннем постнатапьном периоде согласно результатам раннего обонятельного обучения, во взрослом возрасте согласно изменению уровня тревожности у самцов и уровня материнского ухода у самок, а также в следующем поколении потомства.

Введение физраствора, которое первоначально рассматривалось нами как стандартная контрольная процедура, оказалось важным эпигенетическим фактором и требует дальнейшего самостоятельного исследования.

Также предстоит более детальный анализ молекулярно-клеточных перестроек в мозге взрослых животных после наших воздействий в раннем онтогенезе, а также в мозге животных следующих поколений.

ВЫВОДЫ

1. Модификация уровня ацетилирования гистонов в мозге мышей линии 1298у в первую неделю жизни оказывает влияние на формирование их поведенческого фенотипа в двух поколениях.

2. Депривация от матери в 1-ю неделю жизни приводит к ухудшению результатов раннего обонятельного обучения с имитацией материнского груминга в качестве подкрепления у потомства мышей линии 1298у и снижению уровня ацетилирования гистона НЗ в мозге 7-суточных мышат.

3. Процедура многократных инъекций блокатора гистоновых деацетилаз в 1-ю неделю жизни приводит к избирательному восстановлению уровня обучения самцов, а процедура многократных инъекций физиологического раствора - самок.

4. Многократное введение блокатора гистоновых деацетилаз в 1-ю неделю жизни приводит к увеличению уровня тревожности и не влияет на когнитивные способности взрослых самцов по сравнению с животными интактной группы.

5. Многократное введение физраствора в 1-ю неделю жизни приводит к снижению уровня материнского ухода мышей линии 1298у в условиях домашней клетки по сравнению с интактными самками, а многократное введение блокатора гистоновых деацетилаз приводит к восстановлению исходного уровня.

6. Однократное введение блокатора гистоновых деацетилаз, производившееся в раннем постнатальном периоде самкам первого поколения, не влияет на их уровень раннего обучения, но оказывает отставленное положительное действие на обучение самок следующего поколения.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОП - Открытое поле;

ПКЛ - Приподнятый крестообразный лабиринт;

ПС - постнатальные сутки;

УРЗ - условнорефлекторное замирание;

НОАС - ЫБШпе <1еасе1у1а5е (гистоновая деацетилаза).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1) Буренкова О.В., Александрова Е.А., Зарайская И.Ю. Депривация потомства мышей 129Sv от матери в раннем онтогенезе ухудшает обонятельное обучение с имитацией материнского груминга // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. -Т. 153. - № 5. - С. 724-726.

2) Буренкова О.В., Александрова Е.А., Зарайская И.Ю. Гендер-зависимое действие блокатора гистоновых деацетилаз вальпроата натрия на обонятельное обучение мышей линии 129Sv в раннем постнатальном периоде // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2013. - Т. 99. - № 2. - С. 212-220.

3) Буренкова О.В., Александрова Е.А., Зарайская И.Ю. Введение блокатора гистоновых деацетилаз в неонатальном онтогенезе меняет эмоциональность взрослых самцов мышей линии 129Sv // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156. -№ 11.-С. 561-564.

Публикации в других изданиях

4) Буренкова О.В., Зоц М.А., Соловьева H.A., Александрова Е.А., Зарайская И.Ю. Материнский уход как эпигенетический фактор долговременной модификации поведения мышей // Материалы XXI съезда Физиологического общества им. И.П.Павлова, Калуга, 2010, с. 92.

5) Александрова Е.А., Соловьева H.A., Лазуткин А.А, Иванова A.A., Зоц М.А., Буренкова О.В., Зарайская И.Ю. Эпигенетические механизмы в процессах системогенеза // Материалы Первой международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций», Сафага, Египет, 2010, с. 8-10.

6) Burenkova O.V., Aleksandrova Е.А., Zarayskaya I.Y. Early postnatal learning and development of adult maternal behavioral phenotypes in 129Sv mice following blockade of histone deacetylase // Proceedings, 8th IBRO World Congress of Neuroscience, Florence, Italy, 2011.

7) Буренкова O.B., Александрова E.A., Зарайская И.Ю. Модель формирования измененного материнского поведенческого фенотипа лабораторных мышей // Материалы V Всероссийской конференции по поведению животных, Москва, 2012, с. 23.

8) Буренкова О.В., Иванова A.A., Александрова Е.А., Зарайская И.Ю. Анализ материнского поведения лабораторных мышей с помощью видеорегистрации и поактовой сегментации взаимодействий мать-потомство в домашней клетке // Материалы Международной научно-практической конференции «Экология, эволюция и систематика животных», Рязань, 2012, с. 202-203.

9) Burenkova O.V., Aleksandrova E.A., Zarayskaya I.Y. Single injection of histone deacetylase inhibitor exerts long-term cross-generational effects on early olfactory learning // Proceedings, 8th FENS Forum, Barcelona, Spain, 2012, p.l 18.04.

10)Буренкова O.B., Александрова E.A., Зарайская И.Ю. Влияние блокады гистоновых деацетилаз на формирование раннего постнатального и взрослого материнского поведенческого фенотипа мышей линии 129Sv // Материалы Второй международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций», Бодрум, Турция, 2012, с. 26-29.

11) Александрова Е.А., Лазуткин A.A., Иванова A.A., Буренкова О.В., Зарайская И.Ю. Эпигенетические механизмы в процессах системогенеза // Материалы Пятой международной конференции по когнитивной науке, Калининград, 2012, т.1, с. 199-200.

12) Буренкова О.В., Александрова Е.А., Зарайская И.Ю. Роль эпигенетических стимулов в формировании измененного материнского поведенческого фенотипа мышей линии 129Sv // Материалы XXII съезда Физиологического общества им. И.П.Павлова, Волгоград, 2013, с. 84.

13) Александрова Е.А., Буренкова О.В., Зарайская И.Ю. Эпигенетические механизмы в формировании поведенческого фенотипа мышей // Материалы XXII съезда Физиологического общества им. И.П.Павлова, Волгоград, 2013, с. 17-18.

14) Буренкова О.В., Александрова Е.А., Зарайская И.Ю. Гендер-зависимое транс-генерационное действие эпигенетических стимулов на формирование фенотипа лабораторных мышей линии 129Sv // Материалы Третьей международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций», Лимассол, Кипр, 2013, с. 25-28.

15) Буренкова О.В., Александрова Е.А., Зарайская И.Ю. Модификация материнского поведенческого фенотипа мышей линии 129Sv под влиянием блокады гистоновых деацетилаз в раннем постнатальном периоде // Материалы IV Конференции молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология», Москва, 2013, с. 6-7.

16) Буренкова О.В., Александрова Е.А., Зарайская И.Ю. Влияние блокады гистоновых деацетилаз на формирование раннего постнатального и взрослого материнского поведенческого фенотипа мышей линии 129Sv // Труды научного совета по экспериментальной и прикладной физиологии «Экспериментальная и прикладная физиология». Судаков К.В. и др. (ред.). М., НИИНФ РАМН, 2013. Т. 18. 282 е., с. 165-167.

Заказ № 42-Р/03/2014 Подписано в печать 13.03.14 Тираж 110 экз. Усл. пл. 1,2

^ ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 ' ч .....Ч www.cfr.ru ; е-таИ: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Буренкова, Ольга Владимировна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина» РАМН

На правах рукописи

04201457186

УДК 591.1 Буренкова Ольга Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ В МОДИФИКАЦИИ ПОВЕДЕНИЯ, ОПРЕДЕЛЯЕМОЙ УСЛОВИЯМИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПОТОМСТВА МЫШЕЙ

ЛИНИИ 1298У

03.03.01 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. Зарайская Ирина Юрьевна

Москва, 2014

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................12

2.1. Долговременные модификации поведения, определяемые условиями выращивания потомства в раннем постнатальном периоде..........................................................................................................12

2.1.1. Роль материнского ухода за потомством в формировании поведенческого фенотипа незрелорождающихся лабораторных животных......................................................................................................12

2.1.2. Долговременные модификации поведения, опосредованные изменением уровня материнского ухода за потомством в раннем постнатальном периоде...............................................................................13

2.2. Роль эпигенетических механизмов в долговременных модификациях поведения, определяемых условиями выращивания потомства в раннем постнатальном периоде............................................18

2.2.1. Характеристика эпигенетических механизмов..............................18

2.2.2. Роль эпигенетических механизмов в долговременных модификациях поведения, определяемых условиями выращивания потомства в раннем постнатальном периоде............................................22

2.2.3. Значение эпигенетических механизмов в пластичности нервной системы и введение блокаторов гистоновых деацетилаз как инструмент для их исследования........................................................25

2.3. Характеристика поведенческого фенотипа мышей линии 1298у как потенциальной модели для исследования роли эпигенетических механизмов в долговременной модификации поведения, определяемой условиями выращивания потомства.............31

2.3.1. Ранний постнатальный период.........................................................31

2.3.2. Поведение взрослых животных - сенсомоторные показатели.....32

2.3.3. Поведение взрослых животных - эмоциональные показатели ....32

2.3.4. Поведение взрослых животных - когнитивные показатели.........33

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................36

3.1. Условия содержания животных..........................................................36

3.2. Определение уровня ацетилирования гистона НЗ в мозге мышей линии 129Бу сразу после их выращивания в разных условиях на первой неделе жизни.............................................................37

3.3. Влияние депривации от матери, сопровождающейся тактильной стимуляцией, в раннем постнатальном периоде на результаты раннего обонятельного обучения..........................................40

3.4. Влияние введения вальпроата натрия в раннем постнатальном периоде на модификацию поведенческого фенотипа..............................42

3.4.1. Регистрация материнского поведения интактных самок (Б0)

на 5-6 постнатальные сутки их потомства................................................43

3.4.2. Влияние введения вальпроата натрия в раннем постнатальном периоде на результаты раннего обонятельного обучения.......................................................................................................48

3.4.3. Батарея развитийных тестов.............................................................48

3.4.4. Исследование поведения взрослых самцов, подвергавшихся в раннем постнатальном периоде различным экспериментальным воздействиям................................................................................................50

3.4.4.1. Открытое поле.................................................................................51

3.4.4.2. Приподнятый крестообразный лабиринт.....................................52

3.4.4.3. Обучение условнорефлекторному замиранию на обстановку....................................................................................................52

3.4.4.4. Т-лабиринт.......................................................................................53

3.4.5. Исследование поведения взрослых самок (Р1), подвергавшихся в раннем постнатальном периоде различным экспериментальным воздействиям............................................................55

3.4.6. Процедура обучения мышат второго поколения (Р2)...................55

3.5. Статистическая обработка данных.....................................................55

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................................56

4.1. Анализ контрольных параметров.......................................................56

4.1.1. Определение уровня ацетилирования гистона НЗ в мозге мышей линии 1298у сразу после их выращивания в разных условиях на первой неделе жизни.............................................................56

4.1.2. Масса мышат первого поколения (Р1) и их сенсомоторное развитие в гнездовой период......................................................................57

4.1.3. Масса мышат второго поколения (¥2)............................................64

4.2. Анализ основных параметров.............................................................65

4.2.1. Влияние депривации от матери, сопровождающейся тактильной стимуляцией, в раннем постнатальном периоде на результаты раннего обонятельного обучения..........................................65

4.2.2. Влияние введения вальпроата натрия в раннем постнатальном периоде на модификацию фенотипа...............................66

4.2.2.1. Результаты анализа обучения мышат первого поколения (Р1).................................................................................................................66

4.2.2.2. Анализ поведения взрослых самцов.............................................69

4.2.2.2.1. Открытое поле..............................................................................69

4.2.2.2.2. Приподнятый крестообразный лабиринт..................................71

4.2.2.2.3. Соотношение времени, проводимого в каждой из зон открытого поля и приподнятого крестообразного лабиринта................73

4.2.2.2.4. Обучение условнорефлекторному замиранию и тестирование на обстановку.......................................................................74

4.2.2.2.5. Т-лабиринт....................................................................................77

4.2.2.3. Материнское поведение интактных самок (БО) и самок, подвергавшихся в раннем постнатальном периоде экспериментальным воздействиям (Б!)....................................................78

4.2.2.3.1. Поведение самок БО и с потомством в домашней клетке............................................................................................................78

4.2.2.3.2. Корреляции в структуре поведения самок БО и с потомством в домашней клетке.................................................................87

4.2.2.3.3. Сопоставление результатов переноса мышат двух поколений.....................................................................................................91

4.2.2.4. Результаты анализа корреляции поведения самцов в раннем постнатальном периоде, а также во взрослом возрасте с материнским поведением воспитывавших их самок...............................92

4.2.2.5. Результаты анализа обучения мышат второго поколения (Б2).................................................................................................................93

4.2.2.6. Сопоставление результатов обучения мышат двух

поколений.....................................................................................................95

4.2.3. Поведенческий фенотип мышей линии 1298у, выращенных в различных условиях....................................................................................96

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................................................98

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................116

7. ВЫВОДЫ......................................................................................................117

8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.........................................................................118

9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................120

10. ПРИЛОЖЕНИЯ.........................................................................................143

Приложение 1. Количество животных, использованных для

анализа уровня ацетилирования гистона НЗ в мозге.............................143

Приложение 2. Количество использованных животных в исследовании влияния депривации от матери, сопровождающейся тактильной стимуляцией, в раннем постнатальном периоде на

результаты раннего обонятельного обучения........................................143

Приложение 3. Количество использованных животных в исследовании влияния введения вальпроата натрия в раннем

постнатальном периоде на долговременную модификацию

поведенческого фенотипа.........................................................................144

Приложение 4. Классификация поведения самок с потомством в

домашней клетке с указанием анализируемых параметров..................146

Приложение 5. Показатели поведения взрослых самцов F1 в

различных тестах.......................................................................................147

Приложение 6. Латентный период актов поведения самок..................150

Приложение 7. Процентная доля времени, занимаемого каждым

типом актов поведения самок с потомством в домашней клетке.........151

Приложение 8. Число актов каждого типа в поведении самок............152

Приложение 9. Наблюдаемое и теоретически возможное число корреляций между оцениваемыми показателями поведения самок ...Л53 Приложение 10. Латентный период переноса мышат первого (F1) и

второго (F2) поколений в гнездо в возрасте 5-6ПС...............................154

Приложение 11. Процентная доля времени, проведенного над тестовым отсеком мышатами второго поколения (F2), и доля мышат второго поколения (F2), предпочитающих тестовый отсек.....155

1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования

В многочисленных исследованиях была доказана тесная взаимосвязь между условиями окружающей среды в детском возрасте, формированием когнитивных способностей, эмоционального профиля и манифестацией генетически обусловленных заболеваний (Kaplan G.A. et al., 2001; Jirtle R.L., Skinner M.K., 2007; Nelson C.A. et al., 2007; Hanson M.A., Gluckman P.D., 2008; Chao M.J. et al., 2009; Waterland R.A., 2009).

Выяснение механизмов предполагаемых долгосрочных эффектов условий окружающей среды в раннем постнатальном периоде на поведенческий и нейрофизиологический статус взрослого организма в настоящее время является важной задачей, однако у человека оно затруднено наличием неконтролируемых переменных, таких как наследственность и влияние окружающей среды, а также этическими соображениями.

Использование животных дает преимущества в исследовании причинно-следственных связей между условиями окружающей среды в раннем постнатальном периоде и их долговременным влиянием на взрослый организм.

Несмотря на большое число исследований, посвященных механизмам влияния условий окружающей среды в раннем постнатальном периоде на формирование поведенческого фенотипа взрослых животных, многие вопросы в этой области остаются нерешенными. Так, в литературе отсутствуют данные о роли эпигенетических стимулов в формировании поведенческого фенотипа, в частности, результативности обучения лабораторных мышей в раннем постнатальном периоде, о соотношении результатов этого обучения с поведенческим фенотипом взрослых животных в зависимости от условий выращивания в раннем онтогенезе, о влиянии эпигенетических стимулов на результаты обучения детенышей следующего поколения.

Под эпигенетическими стимулами при этом понимаются внешние влияния, действие которых приводит к запуску эпигенетических механизмов. В последних

определяющую роль играют эпигенетические сигналы - молекулярные процессы, мишенью которых являются ДНК и связанные с ней гистоновые белки.

Особого внимания заслуживает проблема соотношения эпигенетических стимулов и сигналов в случае вмешательства в эпигенетические механизмы с помощью фармакологических препаратов, например, блокаторов гистоновых деацетилаз, увеличивающих уровень ацетилирования. Это связано с тем, что данное воздействие в раннем онтогенезе не только оказывает влияние на молекулярные мишени, к которым оно обращено, но и может затрагивать материнское поведение самок, с потомством которых производятся манипуляции и измененный уровень которого принадлежит к хорошо изученному типу эпигенетических стимулов.

Представленная работа направлена на исследование вышеперечисленных вопросов.

Цель и задачи исследования

Целью работы стало изучение влияния изменения уровня ацетилирования гистонов в мозге мышей линии 1298у в первую неделю жизни на формирование их поведенческого фенотипа в двух поколениях Задачи:

1. Исследование влияния блокады гистоновых деацетилаз у мышат линии 129Бу на фоне депривации от матери в первую неделю жизни на раннее обонятельное обучение мышат, непосредственно подвергавшихся воздействию, и мышат следующего поколения;

2. Исследование влияния блокады гистоновых деацетилаз и депривации от матери в первую неделю жизни самок мышей линии 1298у на стиль их материнского поведения;

3. Исследование влияния блокады гистоновых деацетилаз и депривации от матери в первую неделю жизни самцов мышей линии 1298у на их поведенческий фенотип во взрослом возрасте.

Научная новизна работы

Впервые показано, что депривация от матери в раннем постнатальном периоде, сопровождающаяся тактильной стимуляцией, ухудшает результаты раннего обонятельного обучения. Установлено, что влияние эпигенетических стимулов на формирование поведенческого фенотипа лабораторных мышей, в том числе на раннее обучение, имеет зависящий от пола характер: под влиянием многократных инъекций вальпроата натрия избирательное улучшение результатов раннего обонятельного обучения наблюдается у самцов, а у самок к этому эффекту приводят многократные инъекции физиологического раствора. В работе впервые дана характеристика долговременного влияния блокатора гистоновых деацетилаз на формирование поведенческого фенотипа потомства: изменение уровня материнского ухода за потомством у самок и эмоционального профиля у самцов. Также впервые показано влияние введения блокатора гистоновых деацетилаз в раннем постнатальном возрасте на результаты раннего обонятельного обучения детенышей следующего поколения. Научно-практическая значимость работы

Результаты этой работы позволят расширить представления о механизмах долговременных модификаций поведения, обусловленных эпигенетическими воздействиями на организм. Исследование биологических механизмов, лежащих в основе долговременного влияния условий окружающей среды в раннем постнатальном периоде, имеет важное прикладное значение, поскольку их знание может быть использовано в терапевтических целях для профилактики и лечения последствий неблагоприятных событий в раннем возрасте. Так, поскольку исследуемые эпигенетические механизмы долговременной модификации поведения могут лежать в основе различных форм заболеваний (формирование зависимости к алкоголю и наркотикам, невротические и постстрессорные состояния) и являться объектом для создания новых подходов к их коррекции, большое значение имеет показанные в данной работе гендер-зависимые особенности влияния эпигенетических стимулов, свидетельствующие о

необходимости применения различных подходов при работе с особями каждого пола.

Положения, выносимые на защиту

1. Ежедневная депривация от матери продолжительностью 45-60 мин в течение первой недели жизни приводит к изменению фенотипа животных. Наибольшее влияние этих условий выращивания на модификацию поведения показано в раннем онтогенезе. Долговременные эффекты депривации на поведенческий фенотип взрослых животных выражены слабее.

2. Вмешательство в эпигенетические механизмы модификации поведения путем блокады гистоновых деацетилаз в раннем постнатальном периоде развития мышей оказывает гендер-зависимое действие на раннее обонятельное обучение. Данная экспериментальная процедура также оказывает долговременные эффекты на фенотип взрослых животных обоих полов, как и на фенотип детенышей следующего поколения.

3. Воздействие блокады гистоновых деацетилаз приводит к коррекции модификаций поведенческого фенотипа детенышей и взрослых самок, вызванных такими манипуляциями в раннем постнатальном периоде, как депривация от матери и введение физраствора.

Апробация работы

Результаты исследования доложены и обсуждены на XXI Съезде физиологического общества им. Павлова (Калуга, 2010); 8м Международном конгрессе по нейронаукам IBRO (Флоренция, 2011); Конференции молодых ученых «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2011); V Всероссийской конференции по поведению животных (Москва, 2012); 8 м Форуме FENS (Барселона, 2012); конференциях Отдела системогенеза НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (2010-2013); Итоговых сессиях НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (2011-2014).

Публикации

Основное содержание диссертации отражено в 3 статьях, опубликованных в журналах, входящих в «Перечень российских рецензируемых научных журналов ...» ВАК РФ и 13 тезисах.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методики экспериментов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 155 страницах, содержит 27 рисунков, 5 таблиц и 11 приложений. Библиографический указатель содержит 217 источников, из них 12 на русском и 205 на иностранных языках.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Долговременные модификации поведения, определяемые условиями выращивания потомства в раннем постнаталыюм периоде

2.1.1. Роль материнского ухода за потомством в формировании поведенческого фенотипа